ISOLASI DAN KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF PADA DAUN KELOR ( Moringa oleifera Lamk.) YANG BERPOTENSI SEBAGAI ANTIBAKTERI TERHADAP Staphylococcus aureus Rini Sulistyawati, Beta Ria Marika Erita Delima, Eni Kartika Sari Akademi Analis Farmasi Makanan dan Minuman Al Islam Yogyakarta
ABSTRAK Akhir-akhir ini banyak penyakit yang disebabkan oleh bakteri. Selama ini penanganan penyakit yang disebabkan oleh bakteri lebih banyak menggunakan obat-obat sintetik yang membutuhkan biaya yang tidak sedikit dan tentunya banyak menimbulkan efek samping. Untuk itu perlu adanya alternatif untuk mengatasi masalah tersebut, salah satunya dengan memanfaatkan tanaman obat yang mengandung senyawa bioaktif yang berkhasiat sebagai antibakteri. Salah satu tumbuhan obat yang berpotensi sebagai senyawa obat adalah kelor atau Moringa oleifera lamk. Sehingga perlu dilakukan penelitian isolasi dan karakterisasi senyawa bioktif pada daun kelor yang berpotensi sebagai antibakteri. Fraksi etil asetat merupakan fraksi teraktif sebagai antibakteri pada kadar 20% b/v. Isolat yang diperoleh secara kromatografi lapis tipis preparatif dinyatakan murni secara KLT. Karakterisasi isolat dengan menggunakan HPLC menunjukkan kromatogram yang mirip dengan kuersetin sebagai senyawa standar. Kata kunci: isolasi, Moringa oleifera lamk., kuersetin, antibakteri
PENDAHULUAN Banyak penyakit disebabkan
bahan-bahan alamiah di sekitar kita.
oleh bakteri ditemukan di Indonesia
Pemanfaatan
terutama disebabkan oleh kurangnya
merupakan warisan nenek moyang
kebersihan.
sejak dulu kala.
Penanganan
penyakit
tanaman
Eksplorasi dan
yang disebabkan oleh bakteri selama
budidaya
ini lebih banyak menggunakan obat –
dikembangkan dengan tujuan jangka
obat sintetik dengan berbagai efek
panjang mengurangi impor bahan
samping yang ditimbulkan. Oleh
baku obat sintetik demi menghemat
sebab itu perlu adanya alternatif salah
devisa negara. Salah satu tanaman
satunya
yang berkhasiat obat adalah kelor.
dengan
memanfaatkan
tanaman
obat
obat
terus
Kandungan kimia pada daun kelor
menggunakan HPLC menunjukkan
adalah fenol, hidrokuinin, flavonoid
kromatogram yang mirip dengan
steroid, triterpenoid, tanin alkaloid
kuersetin sebagai senyawa standar.
dan saponin (Kiswandono, 2008). Berbagai
penelitian
membuktikan
bahwa
telah kandungan
METODOLOGI Bahan dan Alat
bioaktif dalam daun kelor berpotensi
Bahan utama yang digunakan adalah
sebagai senyawa obat diantaranya
daun kelor, etanol 80% sebagai
sebagai antiinflamasi (Sashidara, et
larutan
al, 2007), antifungi (Chuang, et al,
fraksinasi ekstrak adalah n-heksan,
2006),
(Jayaardhanan,
etil asetat dan aquades. Bahan uji
2004), hepatoprotektif (Hamza, 2007,
antibakteri antara lain media BHI
Uma et al, 2007) serta antioksidan
(Brain Heart Infusion), median BHI
(Benabdeselam,
DS ( Brain Heart Infusion) Double
antikanker
2007;
Chumark,
penyari.
Bahan
2007). Penelitian ini dilakukan untuk
Strength,
menguji aktivitas antibakteri ekstrak
pertumbuhan agar darah, aquadest
etanol daun kelor dengan metode
steril, standar McFarland, biakan
dilusi cair dengan perhitungan Kadar
murni Staphylococcus aureus. Alat
Hambat Minimal (KHM) dan Kadar
yang digunakan meliputi: alat-alat
Bunuh Minimal (KBM)
(Jawetz,
gelas, perangkat ekstraksi, rotary ev
1996) selanjutnya dilakukan isolasi
aporator, chamber, blender, neraca
senyawa
analitik,
bioaktif
berkhasiat
NaCl
untuk
0,9%,
perangkat
media
KLT,
almari
antibakteri. Identifikasi senyawa yang
pendingin.
dihasilkan menggunakan HPLC.Hasil
Ekstraksi Sampel
penelitian menunjukkan fraksi Fraksi
Sebanyak 1 kg daun kelor dimaserasi
etil asetat merupakan fraksi teraktif
dengan 7 L etanol 80% selama 5 hari
sebagai antibakteri pada kadar 20%
terlindung dari cahaya sambil diaduk
b/v. Isolat yang diperoleh secara
berulang-ulang.
kromatografi lapis tipis preparatif
disaring dengan penyaring vakum
dinyatakan
KLT.
dan residu dimaserasi kembali dengan
dengan
2 L etanol 80% selama 24 jam.
Karakterisasi
murni
secara
isolat
Setelah
5
hari
Maserat yang didapat dipekatkan
selanjutnya ditambahkan etilasetat
sampai pekat dengan vacuum rotary
dicampur
evaporator pada suhu 60oC dan hasil
membentuk 2 lapisan yaitu fraksi
yang didapat adalah ekstrak kental
etilasetat dan fraksi
etanol daun kelor.
etilasetat.
Fraksinasi Ekstrak Etanol Daun
Uji Antibakteri
Kelor
Penentuan
Sebelum difraksinasi ekstrak etanol
Minimum (KHM)
dideteksi senyawa fenolik dan fla
Diambil sebanyak 0,5 ml suspensi
vonoid dengan metode Kromatografi
bakteri
Lapis Tipis (KLT). Analisis kualitatif
106CFU/ml dan dimasukkan ke dalam
senyawa
KLT
tabung uji yang berisi 0,5 ml ekstrak
menggunakan fase diam silika gel
etanol pada konsentrasi 62,5%; 60%;
F254
57,5%; 55%; 52,5% dan 50 %
fenolik
dengan
dengan
fase
asetat:metanol:air
gerak
(100:13,5:10
etil /)
dan
disentrifuge
tidak larut
Kadar
Hambat
Staphylococcus
Konsentrasi
ekstrak
aureus
etanol
dengan pereaksi semprot FeCl3 dan
ditentukan
berdasarkan
uji
sebagai baku pembanding digunakan
pendahuluan.
Konsentrasi
akhir
asam
kualitatif
setelah dicampur menjadi 31,25%;
senyawa flavonoid dengan KLT
30%; 28,75%; 27,5%; 26,25% dan
menggunakan fase diam silika gel
25%. Selanjutnya tabung diinkubasi
F254 dengan fase gerak BAW ( 4:5:1)
pada suhu 370C selama 18-24 jam.
dan metanol:air dengan pereaksi
Diamati ada tidaknya kekeruhan
sitroborat dan uap amonia. Sebagai
larutan dan dibandingkan dengan
baku pembanding digunakan fla
larutan kontrol untuk menentukan
vonoid rutin. Tahapan selanjutnya
pada mulai konsentrasi berapa ekstrak
adalah fraksinasi ekstrak etanol daun
etanol
kelor. Ekstrak etanol ditambahkan
pertumbuhan bakteri. Larutan kontrol
aquadest dan n-heksan kemudian
yang
disentrifuge dan akan membentuk 2
pelarut yaitu aquadest dalam media
lapisan yaitu fraksi larut air dan fraksi
BHI DS, kontrol media yaitu kontrol
larut n-heksan. Pada fraksi larut air
BHI DS, kontrol ekstrak yaitu kontrol
galat.
Analisis
mampu
digunakan
menghambat
adalah
kontrol
ekstrak etanol daun kelor dalam
Penentuan uji KHM dan KBM
media BHI DS dan kontrol suspensi
dilakukan untuk semua larutan uji
bakteri 106 CFU/ml.
meliputi ekstrak etanol daun kelor,
Penentuan
Kadar
Bunuh
hasil dari fraksinasi ekstrak etanol
Minimum (KBM)
daun kelor (fraksi n-heksan, fraksi
Penentuan KBM dilakukan dengan
aquadest, fraksi etil asetat), dan isolat
cara larutan ekstrak etanol hasil uji
fraksi teraktif.
dilusi cair pada KHM digoreskan pada
media
agar
darah
untuk
Staphylococcus aureus. Dilihat ada tidak adanya pertumbuhan bakteri dan dibandingkan dengan kontrol untuk
menentukan
konsentrasi
terendah ekstrak etanol daun kelor yang
mampu
menghambat
pertumbuhan bakteri (KBM). Bagan penentuan KHM dan KBM sebagai berikut:
Gambar 2. Skema kerja penelitian
HASIL DAN PEMBAHASAN Sebelum
dilakukan
uji
aktivitas antibakteri terlebih dahulu dilakukan skrining fitokimia untuk mengetahui kandungan kimia yang berhubungan
dengan
aktivitas
biologinya. Sehingga dengan skrining Gambar 1. Skema uji KHM dan KBM
fitokimia diharapkan akan didapatkan gambaran kandungan
kimia
yang
antibakteri.
berpotensi Hasil
uji
sebagai
fitokimia
skrining
berikut:
disajikan
dalam
tabel
Tabel 1. Hasil uji skrining fitokimia ekstrak etanol daun kelor
Hasil
uji
skrining
fitokimia
Identifikasi senyawa polifenol
menunjukkan kandungan senyawa
Hasil kromatogram yang didapat
golongan polifenol dan flavonoid
setelah KLT disemprot dengan FeCl3
sehingga
dilakukan
didapat bercak berwarna hitam pada
identifikasi polifenol dan flavonoid
sampel. Hal ini menunjukkan adanya
secara kromatografi lapis tipis (KLT).
polifenol dalam sampel.
selanjutnya
Gambar 3. Profil kromatografi identifikasi polifenol Keterangan: Fase diam : silika gel F254 Fasegerak : etilasetat:metanol:air (100:13,5:10) Urutan sampel dari kiri ke kanan: pembanding asam galat;fraksi heksan; fraksi etilasetat; ekstrak etanol daun kelor 1. Penampak bercak UV 254 2. Penampak bercak UV 366 3.Pereaksi semprot FeCl3 pada sinar tampak Tabel 2. Nilai Rf identifikasi polifenol
Identifikasi senyawa flavonoid Flavonoid melalui
diidentifikasi
terbentuknya
bercak
amonia (basa) menyebabkan gugus hidroksil pada flavonoid terionisasi sehingga terjadi pergeseran panjang
berwarna kuning pada kromatogram
gelombang
yang
gelombang
semakin
intensif
setelah
kearah yang
lebih
panjang besar
dilewatkan uap amonia. Hal ini
menyebabkan warna kuning yang
disebabkan dengan penambahan uap
terbentuk lebih intensif.
Gambar 4. Profil kromatografi identifikasi flaonoid Keterangan: Fase diam : silika gel F254 Fase gerak : metanol:kloroform Urutan sampel dari kiri ke kanan: pembanding rutin;fraksi heksan; fraksi etilasetat; ekstrak etanol daun kelor 1. Sinar tampak pereaksi uap ammonia 2. Penampak bercak UV 254 3.Penampak bercak UV 366
Pada gambar kromatogram
pembanding rutin dan fraksi etilasetat
terlihat bahwa rutin tidak terelusi
dikarenakan pada uji awal diketahui
sempurna
hanya
sehingga
dilakukan
fraksi
etilasetat
perubahan fase gerak dengan BAW
memberikan
(butanol:asamasetat:air)
dengan pembanding rutin.
penotolan
hanya
dan
diulangi
warna
yang
yang sama
untuk
Gambar 5. Profil identifikasi flavonoid dengan fase gerak BAW Keterangan: Fase diam : silika gel F254 Fase gerak : BAW (4:1:5) Urutan sampel dari kiri ke kanan: pembanding rutin;fraksi etilasetat 1. Sinar tampak pereaksi uap ammonia 2. Penampak bercak UV 254 3.Penampak bercak UV 366
pada media MH. Pada gambar 6 dan 7
Uji Aktivitas Antibakteri Uji
aktivitas
antibakteri
terlihat
fraksi
pada
telah
dapat
dilakukan terhadap ekstrak etanol
konsentrasi
daun kelor, fraksi n-heksan dan fraksi
membunuh bakteri S. aureus yang
etilasetat
20%
mana pada kadar tersebut sudah tidak
berdasarkan hasil uji pendahuluan.
ada koloni bakteri sehingga dapat
Untuk
aktivitas
dikatakan bahwa fraksi etilasetatlah
antibakteri ekstrak etanol daun kelor,
yang paling poten terhadap bakteri S.
fraksi n-heksan dan fraksi etilasetat
aureus.
pada
konsentrasi
mengetahui
maka larutan sampel yang telah diujikan dengan S. aureus digoreskan
20%
etilasetat
Gambar 6. Hasil goresan pada media agar MH untuk kelompok kontrol Keterangan: KM : Kontrol Media KP : Kontrol Pelarut KFE : Kontrol Fraksi etilasetat KFH : Kontrol Fraksi n-heksan KE : Kontrol Ekstrak etanol KS : Kontrol Suspensi Bakteri
Gambar 7. Hasil goresan pada media agar MH untuk kelompok sampel Keterangan: E : Ekstrak etanol daun kelor FH : Fraksi n-heksan FE : Fraksi etilasetat
Isolasi dan Karakterisasi senyawa
(KLTP).
Bioaktif
dilakukan uji KLT. Karakterisasi
Isolasi dilakukan terhadap fraksi
isolat
etilasetat
dengan pembanding kuersetin.
dengan
metode
Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Isolat
dilakukan
yang
didapat
dengan
HPLC
Gambar 8. Kromatogram standar kuersetin
Gambar 9. Kromatogram isolat daun kelor
Pada gambar 9 menunjukkan isolat daun kelor tidak memisah
kemungkinan disebabkan isolat yang belum murni.
sempurna, namun jika dibandingkan dengan
kromatogram
standar
kuersetin memberikan waktu retensi
KESIMPULAN Dari penelitian dapat diambil
yang mirip. Waktu retensi isolat 1,315
beberapa kesimpulan:
sedangkan waktu retensi standar
1. Fraksi teraktif dari ekstrak etanol
kuersetin
1,672.
Perbedaan
ini
daun kelor adalah fraksi etilasetat
yang
pada
konsentrasi
mampu membunuh bakteri aureus
ditandai
dengan
20%
secara
KLT
ditandai
dengan
S.
adanya satu bercak pada plat KLT
tidak
3. Karakterisasi isolat dengan HPLC
adanya pertumbuhan koloni 2. Hasil isolasi dengan Kromatografi
dengan
baku
pembanding
kuersetin
memberikan
waktu
Lapis Tipis Preparatif (KLTP)
retensi yang mirip menunjukkan
menunjukkan isolat telah murni
bahwa isolat merupakan kuersetin.
DAFTAR PUSTAKA Benabdesselam FM. Et.al., 2007, Antioxidant activities of alkaloid extracts of two Algerian species of Fumaria : Fumaria capreolata and Fumaria bastardii, ACG Publication Rec. Nat. Prod., 1:2-3 (2007) 28-35 Chuang PH et al., 2006, Anti-fungal activity of crude extracts and essential oil of Moringa oleifera Lam., Journal of Bioresource Technology 98 (2007) 232–236 Chumark P et al. 2007. The in vitro and ex vivo antioxidant properties, hypolipidaemic and antiatherosclerotic activities of water extract of Moringa oleifera Lam. Leaves. Journal of Ethnopharmacology 116(2008) 439-446. Hamzah AA. 2007. Curcuma longa, Glycyrrhiza glabra and Moringa oleifera ameliorate diklofenacinduced hepotoxicity in rats. American Journal of Phamocology and Toxycology 2(2) 80-88.
Jawetz, E., Melnick, Y.I., Adelberg, E.A., 1996, Mikrobiologi Kedokteran, XX, Alih Bahasa Edi Nugroho dan RF Maulany, Penerbit EGC, Jakarta. Jayavardhanan KK, Suresh K, Panikkar KR. & Vasudevan DM. 1994, Modulatory potency of drumstick lectin on the host defense system. Exp.Clin.Cancer Res., 13 (3) pp205-209 Kiswandono, A.A., 2008, Pengaruh Proses Maserasi dan Refluks Pada Daun dan Biji Kelor (Moringa oleifera lamk.) Terhadap Identifikasi dan Rendeman Senyawa Bioaktif yang Dihasilkan, Hasil Penelitian, Uniersitas Tri Karya, Medan Sashidhara KV et.al., 2008, Rare dipeptide and urea derivatives from roots of Moringa oleifera as potential anti-inflammatory and antinociceptive agents, Short communication, European Journal of Medicinal Chemistry xx (2008) 1e5
