Rh systém Rh systém
• Nejkomplexnější a nejvíce polymorfní • Rh antigeny patří k nejvíce imunogenním
Mgr. HanaTereza Bolcková
RH lokus - 1.chromozóm
Geny • 2 Geny geny kódující Rh proteiny vysoce homologní – na 1.chromozómu (1p34-36) – RHCE gen - Rh CcEe protein – RHD gen - Rh D protein • Příbuzný gen (cca 40% sekvenční homologie) RHAG – na 6.chromozómu (6p11-21) – Rh glykoprotein
Počet exonů: RHD 10, RHCE 10, RHAG 10
1
Rh protein family
Rh protein family
• RhAG protein – předek Rh proteinů – 40% sekvenční homologie s Rh proteiny
• RhCcEe protein – antigeny C c E e Cw • RhD protein – antigen D
Neil.D.Avent, Marion E.Reid: The Rh blood group systém, Blood 2000, 95,2
Rh komplex – Rh proteiny (RhD protein, RhCcEc protein) – všechny Rh antigeny – Rh glykoprotein (RhAG) – 2 Rh proteiny (RhD, RhCcEe) +2 Rh glykoproteiny (RhAG) uspořádány v tetramerickou strukturu +Rh související proteiny: – LW-glykoprotein-adhezivní molekula ICAM4,ligand pro integrin LFA-1 – Integrin asociovaný protein (IAP-CD47) – Glykophorin B – nesoucí antigeny S,s,U (u Rhnull redukována hlavně exprese U antigenu) – Fy glykoprotein – pouze částečná souvislost, z Duffy antigenů u Rhnull chybí pouze Fy5 – Bílkovina pásu 3 (Band 3; anion exchanger,AE1 – nesoucí antigeny systému Diego – pouze částečná souvislost (vzájemné ovlivnění optimální exprese obou systémů)
2
Exprese struktur Rh systému během erytropoezy
Exprese struktur Rh systému
Rozpustná forma: ne Tkáně: erytroidně specifické
• Rh antigeny se objevují již v rané erytropoeze • Anti-D se váže na asi 3% BFU-E, 68% CFU-E a na všechna pozdější vývojová stádia • síla vazby postupně zesiluje – 25% proerytroblasty, 50-60% erytroblasty, 75% normoblasty, 100% maturované erytrocyty • Na fetálních buňkách jsou Rh antigeny prokazovány od šestého gestačního týdne.
Rh antigeny
Antigeny Rh systému
• Jsou lokalizovány na proteinech RhD a RhCcEe • Frekvence výskytu se někdy liší podle dané populace
Počet antigenů: 45 D, C, E, c, e, Cw f, Ce, G, CG, CE, c-like, cE, Ce-like HFA: Hr0, Hr, hrS, Rh29, hrB, HrB, C-like, Nou, Sec, Dav, • LFA: V, Cx, Ew, VS, hrH,Rh35, Bea, Rh42Thornton, Crawford, JAL, STEM, MAR, • LFA u variantních D: Dw, Goa, Rh32, Har, Evans, Tar, Riv, FPTT, BARC • • • •
3
Rh antigeny • Počty antigenů na erytrocyt: – u normální exprese D 10 000-30 000; C/c a E/e cca 40 000 – Jsou závislé na geno-a fenotypovém uspořádání (např. při C v trans pozici je exprese D slabší, než při C v cis pozici; CcEe antigeny jsou exprimovány ve větším počtu u D- než u D+) – A dále na homo- nebo heterozygocii pro daný antigen (tzv. efekt dávky) – Zvýšené počty D antigenu jsou nalézány na krvinkách s chyběním některých nebo všech C/c a E/e antigenů (D-/ D-- 100 000 – 200 000) – Snížené počty (v řádů tisíců až stovek) jsou u slabých D antigenů a u některých typů D variant
Slabé a variantní RhD antigeny a monoklonální protilátky
Rozšíření poznatků o membránovém uspořádání RhD proteinu a stále dochází (s produkcí nových monoklonálních protilátek) k upřesňování klasifikace RhD variant
D antigen • soubor epitopů na povrchu extramembranózní části Rh D proteinu. • Epitopem je určité seskupení několika aminokyselin polypeptidového řetězce, konformačně závislé na prostorovém uspořádání celého proteinu • Monoklonálními protilátkami je v současné době rozeznáváno více než.30 různých epitopů
D antigen Ostatní erytrocytové antigeny většiny proteinových systémů • výskyt v alelických párech • rozdílem většinou jediná aminokyselina • podstatně nižší imunogenicita antigen pozitivních krvinek pro antigen-negativní jedince
4
D antigen Výskyt v populacích: Kavkazská 85% Černošská 92% Asijská 99% Am.indiáni 99%
Počet molekul na erytrocytu: Běžné D fenotypy 10 000 – 33 000 Slabé D fenotypy 200 – 10 000 Zesílené D fenotypy 75 000 – 200 000
D antigen – efekt enzymů Ficin/Papain Trypsin α-Chymotrypsin Pronáza Sialidáza DTT 200 mM Cloroquine (RT) Kyselé prostředí
D antigen
Resistentní (↑ ↑ ) Resistentní (↑ ) Resistentní (↑ ) Resistentní (↑ ↑ ) Resistentní (↑ ) Resistentní Resistentní Resistentní
D antigen Klinický význam aloprotilátek: Transfuzní reakce: mírné až těžké/akutní nebo pozdní HON: mírné až těžké
5
D antigen
D antigen
In vitro charakteristika aloprotilátek:
Autoprotilátky
Třída Ig: většina IgG, některá IgM (IgA vzácně) Optimální technika: NAT, enzymy Vazba komplementu: velmi vzácně
Ano, mohou působit jako mimikující aloprotilátky
Rh D gen Více než 200 RhD alel • variantní D • slabé D • DEL • D negativní • nefunkční alely
Variantní D antigeny • Změny RHD genu, které se promítají do extramembranózní části RhD proteinu – Lineární změna D epitopů – Změna 3-dimezionální konformace smyčky
6
Variantní D antigeny – Chybí některé epitopy (proti kterým mohou jedinci s D variantou vytvářet protilátky) – Dochází k novému tvaru RhD proteinu, který někdy bývá rozeznáván imunitním systémem jedinců s normálními antigeny jako nový antigen (LFA)
Variantní D antigeny • Definovány variantní D II až VII příčina • substituce jedné extracelulární aminokyseliny – DII a DVII (DMH, DFW, DHR, DMHI, DNU, DNB)
• hybridní RHD-CE-D alely – DIII, IV, V, VI – každá obsahuje několik subtypů
Variantní D antigeny Síla exprese D variant je velice rozdílná Od téměř normálních počtů kopií RhD(var)proteinu (DNB,DIII,DVItypIII) Až po značnou redukci (DVItypI) • v závislosti na tom, zda daná změna proteinu ovlivní jeho zabudování do membránového tetrameru s RhAG či nikoliv
Variantní D antigeny Osoby s variantním D proteinem mohou tvořit alloanti-D Nejčastější a zřejmě klinicky nejvýznamnější (popsány potransfuzní reakce i těžké HON) je varianta DVI.
7
Variantní D antigeny
Variantní D antigeny
Mapování RhD epitopů
Mapování RhD epitopů
• Dříve byly variantní antigeny identifikovány testováním erytrocytů dobře charakterizovanými polyklonálními anti-D tvořené osobami s variantním D • A také testováním anti-D pacienta proti erytrocytům se známým variantním antigenem
Nyní • Lidské monoklonální protilátky se používají ke klasifikaci variantních D antigenů podle exprimovaných epitopů • Původní model – 8 a 9 epitopů rozšířen na 16, 30, 37 epitopů • Většina epitopů konformačně závislých
Slabé a variantní RhD antigeny a monoklonální protilátky
Slabé a variantní RhD antigeny a monoklonální protilátky
Na povrchu RhD proteinu se nachází velké množství D epitopů – vazebných míst pro jednotlivé monoklonální protilátky Velikost jednoho epitopu může odpovídat cca 5 aminokyselinám Epitopy určeny jednak sekvencí aminokyselin (primární strukturou), ale také vzájemným prostorovým uspořádáním extramembranózních smyček RhD proteinu (sekundární a terciální strukturou)
Monoklonální protilátky – reagují pouze s jedním epitopem - pokud je u D varianty bodová mutace ve vazebném místě monoklonální protilátky – negativní reakce
8
D antigen • Imunologická jedinečnost a velmi silná imunogenicita D antigenu – u D-jedinců chybí celý RhD protein – mají pouze RhCcEeproteiny, které se liší od RhD 30-35 aminokyselinami. – jejich imunitní systém dobře rozpoznává D+ erytrocyty (které mají „navíc“RhDprotein) – cca D-80% jedinců po kontaktu s D+erytrocyty vytváří anti-D protilátky.
Variantní D antigeny
Variantní D antigeny • téměř u všech D variant již byl definován monoklonálními protilátkami příslušný „epitopový deficit“ (chybění reakce) • pouze varianta DIII může prozatím být serologicky detekována pouze na základě nereaktivity s polyklonální protilátkou antiD produkovanou jedincem s variantou DIII.
Variantní D
D varianty • zpočátku rozpoznávány na základě anti-D aloimunizace • v poslední době jsou častěji zjišťovány při zjištění slabých a diskrepantních nálezů při stanovování Rh(D) a následném testování panelem monoklonálních protilátek ve specializovaných laboratořích
9
Charakteristika variantních D fenotypů Fenotyp II IIIa IIIb IIIc IVa IVb (heterogenní)
Asociovaný D epitopy haplotyp Ce epD1,(2),3,5 ,6/7,8 Ce G+ epD1-9 Ce GepD1-9 Ce epD1-9 ce epD4,5,6/7, 8 Ce,cE epD5,6/7,8
Etnický původ Kavkazský Černošský Černošský Kavkazský Černošský Kavkazský, Japonský
Charakteristika variantních D fenotypů Fenoty p VII DFR DBT
R0Har
Asociovaný D epitopy haplotyp Ce epD1,2,3,4,5.6/7,9 Ce>cE epD(1),(2),3,4,(5),6 /7,9 Ce>(C)(e) epD (6/7),8 a ce c(e)
epD(5),(6/7)
Charakteristika variantních D fenotypů Fenotyp
Asociovaný D epitopy Etnický haplotyp původ Va ce, Ce,cE epD2,3,4,6/7,8,9 Kavkazský, Černošský, Japonský Vb Cwe Neznámo VI type I cE epD3,4,9 Kavkazský VI type II Ce epD3,4,9 Kavkazský, Japonský VII Ce epD1,2,3,4,5.6/7 Kavkazský ,9
Slabé a variantní D antigeny
Etnický původ Kavkazský Kavkazský Kavkazský Černošský Japonský Kavkazský
Frekvence výskytu abnormálních D antigenů: • 1% všech D+ • z toho 10% představují D varianty
10
Slabé D antigeny • Změny RHD genu, které se promítají do transmembránové a intracelulární části RhD proteinu
Slabé D antigeny • Původně popsáno 16 typů Dweak • V současnosti počet Dweak typů včetně subtypů: 80
– exprese sníženého množství D antigenů (obvykle méně než 5000 D antigenů na erytrocyt) – D antigen nezměněn
Slabé D antigeny • Nejčastější D weak v evropské a kavkazské populaci – D weak typ 1, 2, 3, 4.0/4.1 – 95% všech typů D weak
Slabé D antigeny • Jedinci se slabými D antigeny se neimunizují normálním D antigenem • Výjimky: D weak typ 15, D weak typ 4.2 (DAR), D weak typ 7 • Nebyla zaznamenána aloimunizace u Dweak typ 1 až 4.1 • Pozorovány nízkotitrové autoprotilátky
11
DEL • Velmi slabě exprimovaný D antigen – 200 nebo méně kopií D antigenu na RBC • Vzácné v evropské populaci • Až 30% D-negativních ve východoasijské populaci
Vzácné delece fenotypů Dc• Chybí E e D-• chybí C,c,E,e – u fenotypu D--/D-- je tak vysoký počet D antigenů, že dochází k aglutinaci těchto krvinek i účinkem inkompletních (IgG) anti-D protilátek
D negativní • Nejběžnější D negativní haplotyp ve všech populacích je způsoben delecí RDH genu – v kavkazské populaci téměř výhradně
• Existují i jiné D negativní haplotypy: – nefunkční RhD alely – částé v Afrických populacích
Zvláštní formy Rh fenotypů
Rhnull • Na membráně ery chybí RhD i RhCE protein Příčina: • 2 nefunkční RHCE alely spolu s RHD deletovaným haplotypem – amorfní typ • Defekt v RHAG alelách - regulátorový typ – exprese Rh proteinů vyžaduje přítomnost RhAG proteinu
12
Zvláštní formy Rh fenotypů
Rhmod • Rh antigeny jsou velmi zeslabené a prokazatelné jen nejcitlivějšími metodami (Rhmod)
Polymorfismus RhC/c a RhE/e
alelické páry antigenů - mají podklad ve změnách nukleotidů RHCE genu Substituce nukleotidů v RHCE: E/e – 6 substitucí – změna 4 aminokyselin C/c - 1 substituce – změna 1 aminokyseliny Variantní E antigeny: I, II, III, Dv type III Neil.D.Avent, Marion E.Reid: The Rh blood group systém, Blood 2000, 95,2
C/c a E/e antigeny
G antigen pravděpodobný mechanismus vzniku genů je rozdílný • RHCE (Ce)gen vznikl zřejmě rekombinací s nahrazením prvních dvou exonů RHCE(ce) exony z RHD • RHCE(cE) gen vznikl.bodovou mutací (ce) genu
• RhD a RhC proteiny nesou G antigen, který souvisí s částí na druhé extracelulární smyčce kódované exonem 2 • Konformačně závislý • Klinický význam: – Transfuzní reakce: žádné až těžké – HON: žádné až těžké
13
f antigen • složený antigen • exprimovaný na ery majících „c“ a „e“ ve stejném haplotypu (cis) např. R1r (DCe/dce), R0R0 Dce/Dce • není exprimován pokud „c“ a „e“ se vyskytují na oddělených haplotypech (trans) např. R1R2 (DCe/DcE) • anti-f je častou součástí anti-c nebo anti-e sér • Klinický význam:
Rh u pacientů s myeolidní leukémií • Pacienti s akutní nebo chronickou myeloidní leukemií, myeloidní metaplasií, polycytémií nebo myelofibrózou – Příležitostně mají 2 populace ery s různým Rh
– Transfuzní reakce: mírné/pozdní/hemoglobinurie – HON: mírné
Ostatní Rh antigeny • Většinou buď antigeny o vysoké frekvenci výskytu (HFA-high frequency antigen) • Nebo antigeny o nízké frekvenci výskytu (LFA-low frequency antigen) • Některé z nich jsou závislé na určité kombinaci jiných antigenů RhCcEe proteinu, což svědčí o jejich konformační povaze • Některé jsou společné všem Rh antigenům (chybí pouze u Rhnull), jsou tedy lokalizovány na identických aminokyselinových sekvencích RhD a RhCcEe proteinů.
Detekce RhD antigenů antigenů
14
Slabé a variantní RhD antigeny vyšetřování Detekce slabých a variantních RhD antigenů • je velmi závislá na použitých diagnostických sérech • a vzhledem k množství možných reakcí u variantních antigenů nemůže být v každém případě stoprocentně informativní • Kompromis mezi možnostmi diagnostiky, rutinní proveditelností testu a klinickou významností výsledků
Detekce RhD antigenů Dárce krve: • Detekce pokud možno všech typů RhD antigenu – normální, variantní i slabé antigeny – – –
Dvojí určení aglutinačním testem (2 různá séra, monoklonální diagnostika- proti různým epitopům) Určení slabých D pomocí IgG protilátek a NAT Pokud jsou používány monoklonální IgG protilátky, mělo by být užito více klonů a kombinace antiepitopových specifit použitých IgG a IgM by měla pokrýt celé spektrum RhD variant)
Detekce RhD antigenů Současná doporučení požadují při určování RhD zohlednit účel, pro který je prováděno, zda je o: • dárce krve • novorozence • příjemce transfuze • těhotnou ženu
Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components 14th edition 2008
Chapter: Blood group serology Směrnice pro přípravu, použití a kontrolu kvality krevních produktů Kapitola: serologie krevních skupin
15
2. Kontrola kvality pro stanovení krevních skupin Kontrolovaný parametr: 3.
Imunohematologická vyšetření v těhotenství a po porodu
stanovení RhD
Minimální požadavky pro testování • Dvojí testování s použitím dvou anti-D reagentů různých klonů nebo šarží • použití NAT pro potvrzení D weak (slabé D) u dárců, kde to je požadováno. • Musí být zajištěno, že systém rozeznává nejdůležitější D varianty (zejména D varianty kategorie DVI) jako Rh (D) positivní ♣ ♣ pokud ABO a RhD je již známo, je dostatečný jeden test
Doporučení Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP š. STL2010_06 ze dne 1.3.2010 verze 3 (2010_06) Pracovní skupina STL: Dušková D., Kubánková H., Masopust J., Pejchalová A., Písačka M. Zpracování pro účely této přednášky Mgr. Hana Tereza Bolcková
4.1.3 Vyšetření plodu
Detekce RhD antigenů Novorozenec:
Test
Metoda a diagnostika (min. požadavky)
ABO Aglutinogeny 2x. 2 různé klony pro každé dg. Sérum.
D
Dw
2 monoklonální dg. séra anti-D třídy IgM s různými klony, která nedetekují variantu DVI. Není vhodné dg. sérum antiCDE.
Komentář Jen v případě kordocentézy prováděné u susp. anémie způsobené HON a před IUT. Jen v případě kordocentézy prováděné u susp. anémie způsobené HON a před IUT
Nevyšetřuje se
16
Detekce RhD antigenů Příjemce transfuze, těhotná • Možnost imunizace D- i D variant • Ideálně – – –
zachytit všechny varianty jako D- nebo na základě diskrepantních reakcí dvou diagnostik Detekovat všechny osoby s Dweak (bez rizika imunizace) jako D positivní Není možno zajistit vzhledem k velké heterogenitě reakcí slabých a variantních RhD antigenů
2.2 Stanovení krevní skupiny AB0 a antigenu D (AB0, RhD) dle doporučení STL2011_07.
2 Antigen D (RhD) – u příjemce transfuze • Každý vzorek se vyšetřuje dvojmo různými monoklonálními diagnostickými séry anti-D třídy IgM, která by neměly detekovat variantu DVI. Pro určení antigenu D se nepoužívá antiglobulinový test.
Detekce RhD antigenů Příjemce transfuze, těhotná • Požadavek – Prevence imunizace u varianty nejčastější současně nejvíce disponované k tvorbě protilátek – DVI • •
použití takových aglutinačních diagnostik, která nereagují s variantou DVI u negativních výsledků aglutinačních anti-D diagnostik se u příjemců a těhotných již nepokračuje testem na určení slabých D
Doporuč Doporučení ení STL
Imunohematologická vyšetřování v těhotenství a po porodu Vstupní vyšetření • 12. týden AB0 (AG+AGI; opak. AG) D (2x IgM, IgM, ne antianti-DVI, ne Dw) (diskrepance → ref. ref. laboratoř laboratoř) Screening Ab (LISS(dg. ery) (LISS-NAT) ery) Identifikace Ab (dg. ery) ery) [fenotyp] fenotyp]
17
2.2 Stanovení krevní skupiny AB0 a antigenu D (AB0, RhD) dle doporučení STL2011_07.
2.2 Stanovení krevní skupiny AB0 a antigenu D (AB0, RhD) dle doporučení STL2011_07.
2 Antigen D (RhD)
2 Antigen D (RhD)
Při vyšetření antigenu D rozlišujeme 3 kategorie výsledků: RhD pozitivní = jasně pozitivní reakce se všemi použitými diagnostickými séry anti-D RhD negativní = jasně negativní reakce se všemi použitými diagnostickými séry anti-D Dw/v (slabý antigen D/varianta antigenu D)
Dw/v (slabý antigen D/varianta antigenu D) = na slabý antigen D či variantu antigenu D je vhodné myslet u:
Transfuzní význam D variant a slabých D antigenů • Příjemcům s D variantami – by měly být podávány Dsubstituce (prevence anti-D imunizace) • Není možné z důvodu značné heterogenity D variant použít při rutinním testování takový postup, který by zaručil detekci všech typů – prevence vyhrazena pro variantu DVI – (výběr takových anti-D aglutinačních diagnostik – IgM, která s touto variantou nereagují) • D varianty se silnou expresí a minimální změnou epitopů však budou i nadále určovány jako D+ a budou v riziku aloimunizace (například DNB) • Rodinná studie, preventivní opatření u dosud neimunizovaných osob, zejména mladých žen • Slabě exprimované varianty jsou chráněny před rizikem podání D+ tím, že u příjemců není indikováno stanovení slabých antigenů antiglobulinovým testem
slabší reakce všech použitých diagnostických sér anti-D zcela diskrepantních reakcí použitých diagnostických sér (pozitivní x negativní) rozdílu v síle reakcí použitých diagnostických sér anti-D nečekaného nálezu anti-D imunizace bez autoreakce u osoby se zdánlivě normálním antigenem D diskrepance mezi anamnestickým údajem a současným vyšetřením diskrepance mezi výsledky vyšetření jedince postupy doporučenými pro dárce a příjemce krve.
Transfuzní význam D variant a slabých D antigenů • Příjemci se slabými D antigeny – imunizace nehrozí, protože však rutinní diagnostika dosud nedovoluje jednoznačné rozlišení obou kategorií, měli by též dostávat D- substituce (zejména pokud jde o mladé osoby ženského pohlaví a není-li akutní nedostatek D- transuzních přípravků) • Pro těhotné ženy s D variantami jsou doporučována stejná opatření jako pro D- matky • Pro dárce krve a novorozence platí, že určení přítomnosti D antigenu (slabého či variantního) má být co nejcitlivější a jedince takto určené je třeba považovat za D+
18
Určení Rh genotypu erytrocytů pacienta •
CE certifikované diagnostické molekulárněgenotypovací postupy (diagnostické soupravy PCR-SSP, microarray BloodChip)
ID-karta „Typizace Rh D varianty“
ID-karta „Typizace Rh D varianty“ Obsahuje: • ID-Karty • ID-Anti-D 1-6
Děkuji za pozornost
19
Použitá literatura Marion E. Reid, Christine Lomas-Francis: THE BLOOD GROUP ANTIGEN, Academic Press 1997 Avent.N.D., Reid, M.E.: The Rhe blood group systém: a review. Blood, 2000,č,95,s375-387 Písačka M: Současné pozantky o Rh systému, Transfuze dnes 6, 78-87 Flegel W.A.: Molecular genetics and clinical applications for RH. Transfus Apher Sci. 2011 February; 44(1): 81-91
20
