RETROVIRÁLIS BIOKÉMIA 2. RETROVÍRUSOK BELÉPÉSE A SEJTBE: KÖT DÉS ÉS PENETRÁCIÓ. Burokkal rendelkez vírusok belépése a sejtbe általában fúzióval történik, míg a burok nélküli vírusoké tipikusan receptor-mediált endocitózissal, de ilyen mechanizmus burokkal rendelkez vírusok esetében is van. A retrovírusok köt dése: receptor-antireceptor kölcsönhatás, ami alapvet en befolyásolja a vírus sejttropizmusát. I. Retrovírus burokfehérjék szerkezete: Replikáció-kompetens retrovírusok burokfehérje-komplexe két részb l áll: egy küls glikozilált hidrofil polipeptidb l (SU) valamint egy transzmembrán fehérjéb l (TM) melyek komplexe jellegzetes elektronmikroszkópos képet ad. Mindkét fehérje az env génen van kódolva, és polipeptid formában szintetizálódnak (Env), mely proteolitikusan hasad. A retrovírusok "érett" burokfehérjék nélkül nem fert z képesek. A retrovírusok burokfehérjéi analógiát mutatnak az influenza vírus burokfehérjéivel (HA) és a VSV burokfehérjéivel (G) is. Ez utóbbi sejtfelszíni sziálsavakhoz köt dik, igen széles tropizmust eredményezve.
2.1. ábra: Retrovírusok burokfehérje-génjének funkcionális szervez dése
II. Retrovírus burokfehérjék szintézise és "érése". A retrovírus burokfehérjék poliprotein prekurzora (Env) illesztett, szubgenom méret RNS-r l szintetizálódik. Az illesztés következtében a start Met közel kerül a mRNS 5' végéhez. Az ASLV kivétel: az illesztés következtében az Env els hat aminosavja megegyezik a Gag 1
fehérje els hat aminosavjával. A transzláció membrán-kötött riboszómán történik, a szignálpeptidet az SRP (signal recognition particle) felismeri és transzportálja az ER-be. A retrovirális Env fehérje szintézise követi a szekretórikus fehérjék szintézisének útvonalát. Az Env 1. es tipusú glikoprotein: az N-terminális vég van kívül. A Golgi-ban celluláris proteináz hasítja az Env-et SU és TM fehérjékre. A hasítási hely konszenzus szekvenciája: Arg-X-Lys/Arg-Arg-↓-. Ugyanilyen konszenzus szekvencia van számos prohormonban, receptor profehérjében és plazmafehérjékben is. Ezen fehérjék processzálását eml s szubtilizin-szer proteázok (proprotein konvertázok, PC) végzik, ezek közül els sorban a furin vesz részt az Env processzálásában. III. Retrovírus receptorok: Az els azonosított retrovírus receptor a CD4, a HIV receptora. Immunoglobulin szupercsaládba tartozik, és nagyon szük gazdaspecifikusságot biztosít: els sorban T helper/inducer sejtek felületén van.
2.2. ábra: A HIV-1 vírus receptorainak, a CD4 és kemokin receptor molekuláknak a vázlatos szerkezete
Nemrég megklónozott receptorok: MuLV receptor (ecoR) : aminosav transzporter, MuLV receptor (amfotróp, Ram-1): foszfát transzporter. GALV receptor (galvr1): foszfát transzporter, BLV receptor: nem ismert a funkciója. ALSV: az A tipusú receptor LDL homológ, LDL receptor család tagja. Receptor polimorfizmus: galvr1, galvr2 (=Ram-1) Köt dés önmagában nem elegend az internalizációhoz és így a fert zéshez: tropizmus (azaz van-e receptor) nem azonos a permisszivitással.
2.3. Retrovírus receptorok: az ekotróp MuLV és a GALV/FeLV B receptor vázlatos szerkezete.
2
IV. HIV-1 koreceptorok A CD4-hez köt dés önmagában képes az Env konformáció-változását el idézni, azonban ez nem elegend a vírus sejtbe törten belépéséhez. 1996-ban fedezték fel a HIV koreceptorokat, melyek szükségesek a vírusok sejtbe történ belépéséhez. Ezek mind kemokin receptorok (hét transzmembrán hélixet tartalmazó, Gfehérje kapcsolt receptorok). T-tróp vírusok (szincícia indukáló, SI vírusok) koreceptora: CXCR4 (fuzin). Ligandja, SDF-1, illetve CXCR4 elleni antitest képes a T-tróp vírusok fert zését blokkolni (M-tróp vírusokét nem!) M-tróp vírusok (nem szincícia indukáló, NSI vírusok) koreceptora: CCR5, ligandjai kemoattraktív β-kemokinek: RANTES, MIP-1α, MIP-1β. A receptor-használat alapján megkülönböztetünk R5, X4 és R5X4 HIV-1 vírusokat. Egyéb β-kemokin receptorok, pl. CCR2b és CCR3 szintén képesek R5 és R5X4 vírusok koreceptoraként m ködni, ez az útvonal azonban általában nem jelent s. A β-kemokinek képesek M-tróp vírusokkal történ fert zést gátolni a receptorhoz köt dés vagy “downreguláció“ útján. Azt is megfigyelték már korábban, hogy egyes emberek HIV-vírussal törten többszöri “találkozás” ellenére sem fert z dnek meg. Ezekr l kiderült, hogy M-tróp vírusokra rezisztensek (T-tróp vírusokra nem), és egy hibás CCR5 receptorra homozigóták. Az európai populáció kb. 20%-ban heterozigóta erre a receptorra, és a fert zési adatok arra utalnak, hogy heterozigótaság részleges védelmet eredményez HIV fert zéssel szemben. V. A retrovírus fert zés influenza-modellje: Az SU (vagy HA1) felismeri a celluláris receptort, és dokkolja a vírust a sejt felületén. A receptor-antireceptor kölcsönhatás a receptor konformáció-változását váltja ki, mely következtében a TM (HA2) korábban rejtett N-terminális fúziós peptideje hozzáférhet vé válik. "Envelope shedding": feltételezik, hogy a CD4-hez köt dés után a gp120 eltávolódik a gp41-t l, és így annak fúziós doménje exponálódik. Ebben segíthetnek a koreceptorok is. Az exponált fúziós peptid kölcsönhat a sejtmembránnal, destabilizálja azt, és így lehet vé válik a vírus-sejt fúzió.
2.4. ábra: a retrovírus fert zés influenza modellje.
3
2.5. ábra: a HIV-1 vírus fúziója a sejt membránjával
A retrovirológiában napjainkig elfogadott az az általános vélekedés, hogy szemben a legtöbb burokkal rendelkez vírussal, és néhány retrovírussal, melyek receptor-mediált endocitotiks útvonalon fert znek, a HIV pH-függettlen módon, direct fúzióval fert z. Nemrég azonban kiderült, hogy a vírusok belépésének pH-függ és pH független módja nem teljesen korrelál a kétféle belépési lehet séggel. Számos pH-független virus (pl. Epstein-Barr virus, egyes Rhinovírusok) endocitózist igényel a produktív fert zéshez. Az amfotróp és ekotróp MuLV szintén endocitózissal lép be, de pH-független módon. Bár azt már korábban tudták, hogy a HIV-1 vírus jelent s része is endocitózissal kerül be a sejtbe, a legutóbbi id kig úgy tartották, hogy ez abortív belépési folyamat az endoszómában történ “csapdába kerülés” következtében. Nemrég azonban kimutatták, hogy az endocitotikus út integrációhoz és génexpresszióhoz vezethet. Úgy tünik, hogy a direkt fúziós vagy endocitotikus útvonal használata a HIV-1 esetében a vírustermel sejt és a megfert zend sejt tulajdonságaitól, valamint a virus szekvenciájától is függ. Az is kiderült újabban, hogy a primer makrofágok a HIV-1 vírust valójában receptor-független módon, makropinocitózissal veszik fel. gp120 köt dése CD4-hez, vagy alternatív receptorhoz CD4 V1 régiójához köt dik a vírus (CDR2 domén). Ez lép kölcsönhatásba a gp120 Cterminális részén lév antireceptor régióval. A gp120 denaturált formában nem köt dik a CD4hez. Térszerkezete lényeges: nem lineáris epitóp, más régiók is szerepet játszanak. Kísérletek azt mutatják, hogy kismérték változások az Env variábilis régióiban befolyásolhatják a CD4 molekulához való köt dést és a sejt-tropizmust. Ugy t nik, hogy a CD4 V1 régiójának gp120 köt része részben átfed az MHC II. köt hellyel. A CD4 molekulának a gp120 kötésén túlmen en is szerepe lehet a HIV fert zésben: a gp120 köt désének hatására bekövetkez konformáció változás segítheti a fúziót. sCD4-el történ kisérletek: HIV-1 törzsek fert z képességét sCD4 többé-kevésbé gátolja, míg néhány HIV-2 törzsét, és különösen az SIVagm -ét növeli, els sorban alacsony sCD4 koncentrációnál. Ennek magyarázata a különböz gp120-akkal szemben megnyilvánuló eltér affinitás. Inaktiváció: Az sCD4 eltávolítja a gp120-at a vírus felületér l. Kisebb affinitás esetén 4
nem távolítja el, viszont konformációváltozást indukálhat, a gp41 fúziós doménje exponálódhat, és kölcsönhatásba léphet a sejtmembránnal. Egy további hatás lehet a V3 hurokba történ behasítás el segítése. Szintén lényeges lehet a CD4-gp120 kölcsönhatásban a glikozilációs mintázat. Nem glikozilált gp120 nem köt dik a CD4-hez. A glikoziláció mértéke befolyásolhatja a makrofág ill. T-sejtes tropizmust. Sejt-sejt fúzió anélkül is kialakulhat, hogy teljesen kialakult részecskék keletkeznének. Ez neutralizáló antitestek jelenlétében is megtörténhet (szincícia képz dés). Ez fert zött és nem fert zött CD4+ sejtek közt jöhet létre. Ált. ez az els jele a fert zésnek in vitro, kb. két nappal az infekció után. Citopatikus hatással jár együtt, valószínüleg változik a membrán permeábilitás. Antibody dependent enhancement (ADE): Egy nem-neutralizáló antitest köt dik a vírushoz, FAB része köt dhet a T sejt Fc és makrofág komplement Fc receptorhoz, és internalizálódhat. Ebben az útvonalban lehet szerepe a herpeszvírus fert zésnek, mert indukálja az Fc receptort a fert zött sejtek felületén. Ez lehet az egyik módja az anális epitélium fert zésének az ondófolyadékban lév vírus-antitest komplexekkel.
VI. Interferencia és szuperinfekció: 1. Interferencia a sejt szintjén: a legtöbb retrovírus esetén a már megfert zött sejt szuperinfekcióval szemben rezisztenssé válik. Ez a receptor eliminációját, vagy lefedését jelenti. Az "entry" szintjén történ szabályozásra utal az, hogy az ilyen sejtek is transzfektálhatóak, azaz a permisszivitás megmarad. A CD4 leregulálódásának mértéke függ a vírusreplikáció mértékét l és a gp120 szekvenciájától. Ált. a fert zést követ néhány napon belül történik meg. Ennek a következ okai vannak: receptor maszkírozás gp120-al, CD4 mRNS transzkripció valamint a transzláció gátlása, intracelluláris gp160-CD4 komplex képz dés, CD4 eltávolítása a sejtek felületér l a replikálódó virionok által. Az interferencia hiánya vagy viszonylagos lassú kifejl dése lehet az egyik oka egyes HIV törzsek citopatikus hatásáért: folyamatos infekció történik, még miel tt a CD4 leregulálódna: nem integrált DNS akkumulálódása sejthalálhoz vezet. 2. Szuperinfekció a gazdaszervezeten belül: Leírtak betegeket, melyekben mind a HIV-1 mind a HIV-2 el fordult. Általában egy domináns törzs fejl dik ki, még akkor is, ha a kezdetekkor többféle vírus egyidej fert zése fordul el , valószín leg a domináns vírus elnyomja a többi vírus szaporodását. Fenotipus keveredés: ez szintén egy lehetséges mechanizmus HIV fert zésre. Ebben az esetben a virális genom egy másik vírus burkában van, ami megváltoztatja a megfert zhet sejt típusát. El fordulhat a HIV-1 és HIV-2 között, valamint a HIV és HTLV között. Hasonló fenotípusos keveredés fordulhat el in vitro az MuLV, VSV és herpeszvírussal is. Arra nincs jelenleg bizonyíték, hogy ez utóbbiak in vivo is el fordulnának.. Els sorban állatmodellek (pl. egér) alkalmazása esetén az endogén vírusokkal törten fenotipus keveredést is figyelembe kell venni. VII. Fert zéssel szembeni rezisztencia: 1./ Nincs, vagy hibás a receptor, pl. glikozilálás gátlása vagy polimorfizmus. Ett l még lehet permisszív a sejt. A permisszivitás hiánya lehet például azért, mert egy LTR-en m köd esszenciális transzkripciós faktor az adott sejtben nem expresszálódik. 5
Korai fázis tanulmányozása: Pszeudotipusú vírusokkal. Pl. egyszerre fert znek retrovírussal és VSV-vel, mely fenotípus keveredéshez vezet: VSV membránproteinek plusz retrovírus ENV proteinek, és VSV kapszid/genom szerkezet. Legátolják antitestekkel a VSV membránfehérjét: "plack" esszével mérik hogy van-e vírusfert zés. 2./ A sejt már fert zött, exogén vagy endogén vírussal: az Env fehérjék telítik a receptort. Interferencia csoportokat lehet így megállapítani. ASLV: 5 csoport, MuLV: 6 csoport. MuLV csoportosítás "host range", interferencia és antitest neutralizáció alapján: ecotróp: csak murine sejteket tud megfert zni, xenotróp: csak nem-murine sejteket tud megfert zni, amphotróp: mindkett t tudja. amphotróp vírus: (4070A) igen széles specifitás: csomagoló vírus vektorokhoz. Ajánlott irodalom: Clapham, P.R. and McKnight, A. (2002) Cell surface receptors, virus entry and tropism of primate lentiviruses. J. Gen. Virol. 83, 1809-1829. Marsh, M. and Pelchen-Matthews, A. (2000) Endocytosis in viral replication. Traffic 1, 525532. Katen, L.J., Januszeski, M.M., Anderson, W.F., Hasenkrug, K.J. and Evans, L.H. (2001) Infectious entry by amphotropic as well as ecotropic murine leukemia viruses occurs through an endocytic pathway. J. Virol. 75, 5018-5026. Maréchal, V., Prevost, M.C., Petit, C., Perret, E., Heard, J.M. and Schwartz, O. (2001) Human immunodeficiency virus type 1 entry into macrophages mediated by macropinocytosis. J. Virol. 75, 11166-11177. Fackler, O.T. and Peterlin, B.M. (2000) Endocytic entry of HIV-1. Curr. Biol. 10, 1005-1008.
6
