REKOMBINÁNS FEHÉRJÉK IPARI MÉRETŰ ELŐÁLLÍTÁSA I

„Az élettudományi-klinikai felsőoktatás gyakorlatorientált és hallgatóbarát korszerűsítése a vidéki képzőhelyek nemzetközi versenyképességének erősítésére” TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

REKOMBINÁNS FEHÉRJÉK IPARI MÉRETŰ ELŐÁLLÍTÁSA I. 6. előadás PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM ÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNYI KAR GYÓGYSZERÉSZI BIOTECHNOLÓGIA TANSZÉK

TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

A REKOMBINÁNS FEHÉRJÉK IPARI ELŐÁLLÍTÁSÁNAK FŐ LÉPÉSEI:

 Az előállítani kívánt fehérje klónozása  Az ideális expressziós vektor kiválasztása  Az expressziós biológiai rendszer optimalizálása  Bioreaktorok/fermentorok beállítása  A rekombináns fehérjék kémiai és/vagy enzimatikus módosítása  Tisztítás  Tesztelés, minőségbiztosítás

A REKOMBINÁNS FEHÉRJÉK IPARI ELŐÁLLÍTÁSÁNAK ALAPJA A FEHÉRJE KLÓNOZÁSA

TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

KLÓNOZÁS ÖSSZEFOGLALÓ LÉPESEI:

Plazmid DNS

A plazmid DNS szekvencia Felnyitása endonukleázzal

Beillesztett DNS

A DNS szekvencia beillesztése, ligálása

A plazmid a baktériumban felszaporodik Baktérium transzformálás

Baktérium kolóniák

Számos DNS kópia

A FEHÉRJE TULAJDONSÁGAINAK MÓDOSÍTÁSA

TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

FEHÉRJE MÓDOSÍTÁSOK

 Diszulfidhidak – szerkezet stabilizálása  Hőstabilitás növelése – aszparagin, glutamin oldalláncok lecserélése (pl. treoninra, izoleucinra)  Intermolekuláris diszulfidhidak létrejöttének gátlása – az enzim felszínén lévő cisztein oldalláncok pl. szerinre cserélése  Proteáz hasító helyek megszüntetése

TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

HOGYAN CSÖKKENTSÜK A MAKROMOLEKULÁK MÉRETÉT A SZÖVETBE ÉS SEJTBE VALÓ BEJUTÁS ÉRDEKÉBEN

 Ismernünk kell a fehérje működési folyamatát  Ismernünk kell a fehérje minimális funkcionális egységét  Az előállításakor csak a minimális funkcionális szakaszt kell klónozzuk, vagy az egész molekula előállítása után enzimatikusan „méretre vágjuk”

TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

PROTEÁZ-REZISZTENS MINIMÁLIS MÉRETŰ KÖTŐHELY TERVEZÉSE

 A proteáz hasítóhelyének ismeretében, megváltoztathatjuk a fehérje szekvenciáját úgy, hogy a proteáz ne tudja hasítani, de a fehérje aktív helye funkcióképes maradjon Hasító hely Szubsztrát

C-terminus

N-terminus

Proteáz aktív hely

TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

DOMAIN MÓDOSÍTÁS A GYÓGYSZERHATÁS NÖVELÉSE ÉRDEKÉBEN

 Aminosav szekvencia módosítás  Poszttranszlációs módosítás

TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

CÉLZOTT MUTAGENEZIS (A) DNS lánc szintézise

Egy-láncú DNS

Mismatch

A mismatched Oligonukleotid hozzákötése

Mismatch

Lánc szintézis

Kettős-láncú DNS

(B) Mutáns fágok azonosítása

Blot, próba

Fertőzött E. coli

Bakteriofágok kiszélesztése, hogy plaque-k keletkezzenek

Hibridizáció szignál – mutáns fág plaque

TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

CÉLZOTT MUTAGENEZIS SZÁMOS MÓDSZERREL KIVITELEZHETŐ

 Delíció  Inzerció  Indukált mutáció (1 vagy több aminósav cseréje)

AZ EXPRESSZIÓS RENDSZER MEGVÁLASZTÁSA

TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

AZ IDEÁLIS EXPRESSZIÓS RENDSZER KIVÁLASZTÁSA Expressziós rendszer

Sejtmentes

Előnyei    

Növelhető lépték Egyszerű Gyors expresszió, direkt a plazmidból Nyitott rendszer—easily add components to enhance solubility or functionality

Problémái  Nagy mennyiségű expresszió > 3 mg

Bakteriális

 Növelhető lépték  Alacsony ár  Egyszerű

 Protein oldhatóság  Minimális poszttranszlációs módosulás  Sokszor nehéz funkcionális emlős fehérjéket expresszáltatni

Élesztő

 Eukarióta fehérjék  Méret/mennyiség növelhető fermentációval (grams/ liter)  Egyszerű médium

 Fermentáció szükséges a magas kitermelés elérésére  Növekedési kondíciók optimalizálást igényelnek

Alga Rovar Emlős

 Genetikai módosítás és expressziós rendszer fotoszintetikus mikroalgák számára  Tökéletes kísérletes kontroll biohajtóanyagok, stb számára  Optimális rendszer erőteljes és stabil szelekcióra és expresszióra  Postranslational modifications similar to mammalian systems  Nagyobb kitermelés, mint emlős rendszerekben

 Nehezen előállítható tenyésztési körülmények

 Multimilligram/ liter kitermelés csak  Korrekt poszt-transzlációs módosulás szuszpenziós kultúrákban érhetők el  A legvalószínűbb, hogy működőképes emberi fehérjét állít  Nehezen optimalizálható tenyésztési elő körülmények

SEJTTENYÉSZTÉS IPARI MÉRETEKBEN

TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

BIOREAKTOROK/FERMENTOROK ÁLTALÁNOS JELLEMZŐI

 Lehetőleg egyszerű tervezésű  Ne legyenek benne a tisztítást nehezítő alkatrészek, könnyen sterilizálhatók legyenek  Könnyen szétszedhető és összerakható legyen  Biokompatibilis és biointer anyagok használata (ne legyen benne króm vagy rozsdamentes acél)  Hő és alkoholos sterilizálást illetve a párás atmoszférát jól tűrje  Műszeres ellenőrzés lehetséges legyen (pl hőmérő, pH mérő, pumpák, rotorok, stb)

TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

FERMENTOROKKAL SZEMBENI ELVÁRÁSOK

 Az ipari gyakorlatban két fő típus: – Keverő tartályos (levegő bevezetés, gázbeporlasztás is lehetséges), használatuk: aerob és anaerob fermentációkhoz – Buborékoltatott oszlopok (torony fermentorok), levegőliftes fermentorok (kizárólag az aerob fermentáció)  Meghatározó működési paraméterei: – a keverő tartályosban a keverő fordulatszáma és a levegőztetési arány, – a buborékoltatott oszlopoknál egyedül a levegőztetési sebesség határozza meg a folyadék keveredését  Térfogat: – A keverttank fermentorok néhány száz köbméteres

TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

FORGÓEDÉNYES BIOREAKTOROK EUKARIÓTA SEJTEK SZÁMÁRA

 Folyadék forgatás  Sejtek nem ülepednek le  Fixált vázelemeken ülő sejtek  Növeli a sejtek vázra tapadását  Forgási sebesség 60–80 rpm  Térfogat 120–8000 ml  50% médium csere 2 naponként  Szövetvastagság 0,5 mm érhető el a fentiek mellett primer szövetek esetében

TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

IPARI BIOREAKTOR SZERKEZETÉNEK SEMATIKUS ÁBRÁZOLÁSA Sav

Szubsztrát Habzás gátló Bázis

Perisztaltikus pumpa

Hab

Melegítő edény

T Pumpa

Folyamat szabályzó

pH

Víz be

pO2 Ellennyomás szelep Biztonsági szelep

Electromágneses szelep hűtésre

Víz ki

Q szelep

Levegő Irányító elektronika

Q

FEHÉRJÉK KINYERÉSE A TERMELŐ SEJTEKBŐL

TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

FEHÉRJÉK KINYERÉSE I.

 Baktérium (avagy más organizmus) sejtek feltárása: ozmotikus sokk, kevertetés, stb  A sejtfeltárás nyomon követése: fehérjetartalom, enzimaktivitás és vezetőképesség mérése  Fermentlé szűrése optimálizált transzmembrán nyomással  Fehérjék tisztítása vizes fázisú, egymással nem elegyedő hidrofil polimerek segítségével (PEG és dextrán)

TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

FEHÉRJÉK KINYERÉSE II.

 Kromatográfiás tisztítás: affinitás és ioncserélő kromatográfiák (FPLC, HPLC)  Reverzfázisú HPLC a tisztulás nyomon követése  Extrakció  Szűrés  Bepárlás  Szárítószerrel történő szárítás  Derítés  Kristályosítás/vagy steril oldat készítése  Funkcionális analízis

TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001

MINŐSÉGBIZTOSÍTÁS ÉS ELLENŐRZÉS

 A minőségellenőrzés minden ipari lépésnél elengedhetetlen  A minőség a termelt fehérje mennyiségére és funkcióképességére is vonatkozik  Bármelyik lépés hibás, a termélés leállítása szükséges

KÖSZÖNÖM A FIGYELMET

JELEN MUNKA AZ EURÓPAI UNIÓ TÁMOGATÁSÁVAL, AZ EURÓPAI SZOCIÁLIS ALAP TÁRSFINANSZÍROZÁSÁVAL VALÓSUL MEG, „AZ ÉLETTUDOMÁNYI-KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE” CÍMŰ, TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 AZONOSÍTÓSZÁMÚ PROJEKT KERETÉBEN.