Regulace homeostázy železa u dětí

Univerzita Palackého v Olomouci Lékařská fakulta

Regulace homeostázy železa u dětí. MUDr. Jiří Houda

Dětská klinika při LF a FN Olomouc Školitel: doc. MUDr. Dagmar Pospíšilová, Ph.D. Studijní program: Pediatrie

2014

Prohlašuji, že jsem disertační práci na téma „Regulace homeostázy železa u dětí“ vypracoval pod vedením školitele samostatně za použití v práci uvedených pramenů a literatury. Dále prohlašuji, že tato disertační práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. Datum Podpis

……………………………………………………

Rád bych tuto práci věnoval památce své matky, která mne vždy v mé práci podporovala a mému otci, který jí byl ke konci její těžké nemoci velkou oporou.

Poděkování Chtěl bych poděkovat své rodině a přátelům za podporu a trpělivost po celou dobu mého studia. Dále bych rád poděkoval své školitelce doc. MUDr. Dagmar Pospíšilové, Ph.D., přednostovi olomoucké dětské kliniky prof. MUDr. Vladimírovi Mihálovi, CSc., MUDr. Zbyňkovi Novákovi za odborné vedení a cenné připomínky ke klinické a teoretické části dizertace. Dále bych rád poděkoval výzkumnému týmu Ústavu molekulární a translační medicíny v Olomouci, zejména doc. MUDr. Mariánu Hajdúchovi Ph.D., MUDr. Josefovi Srovnalovi, Ph.D., MUDr. Petrovi Džubákovi, Ph.D., Mgr. Dušanovi Holubovi a dalším kolegům.

Regulace homeostázy železa u dětí.

Obsah

Obsah. Úvod.

1

Cíle práce.

2

Teoretická část.

3

1. Výskyt železa a jeho význam pro člověka.

3

1.1 Obsah železa v lidském organizmu.

3

1.2 Úloha železa v lidském organizmu.

4

1.3 Potřeba železa pro lidský organizmus.

5

1.4 Zdroje železa.

6

2. Cirkulace železa a mechanizmy jeho řízení.

8

2.2 Regulace železa na úrovni organizmu.

17

2.3 Regulace železa na buněčné úrovni.

17

3. Patologické stavy při porušení homeostázy železa.

25

3.1 Deficit železa.

25

3.2 Přetížení železem.

30

4. Vyšetření metabolizmu železa.

33

4.1 Panel základních laboratorních vyšetření.

33

4.3 Experimentální metody.

35

5. Metabolizmus železa u nádorových onemocnění.

36

6. Nové terapeutické možnosti ovlivnění metabolizmu železa.

37

6.1 Agonisté hepcidinu.

37

6.2 Antagonisté hepcidinu.

38

7. Shrnutí teoretické části.

40

Experimentální část.

41

1. Měření hladiny hepcidinu u dětských pacientů s nespecifickými střevními záněty pomocí ELISA metody.

41

1.1 Pacienti a metody.

41

1.2 Výsledky měření hladiny hepcidinu metodou ELISA.

44

1.3 Diskuze a závěr.

49

2. Měření hladiny hepcidinu u pacientů se vzácnými typy anémií metodou kapalinové chromatografie - hmotnostní spektrometrie. 2.1 Pacienti a metody.

54 54

-i-


Obsah

2.2 Výsledky měření.

59

2.3 Diskuze a závěr.

60

Literatura.

62

Přílohy.

73

Příloha 1

74

Příloha 2

79

Příloha 3

100

Příloha 4

122

Příloha 5

126

Příloha 6

130

Příloha 7

134

Příloha 8

138

- ii -


Úvod. Železo (lat. Ferrum, Fe) je pro lidský organizmus esenciálním prvkem. Účastní se řady chemických procesů důležitých pro funkci tkání a orgánů. Nejdůležitější vlastností železa je schopnost vázat kyslík potřebný pro aerobní metabolizmus. Nedostatek Fe, stejně jako jeho nadbytek vede k poškození organizmu. Rovnováha Fe je proto přísně kontrolována komplexními regulačními mechanizmy, které reagují na aktuální potřeby organizmu a kompenzují nedostatek Fe i jeho nadbytek. V případě některých patologických stavů může být tato rovnováha výrazněji narušena. Je-li železa nedostatek, rozvíjí se stav označovaný jako sideropenie, jejímž důsledkem je mimo jiné anémie z nedostatku železa, nejčastější typ anémie u dětí i dospělých. V případě, že je železa v organizmu dostatek, není však dostupné pro krvetvorné buňky, rozvijí se anémie chronických chorob. Dojde-li k překročení prahu ukládání železa do zásob, dochází k tzv. přetížení organizmu železem. U člověka není vyvinutý mechanizmus aktivního vylučování Fe z organizmu. Nadbytečné železo je ukládáno do tkání a orgánů, kde pak způsobuje jejich toxické poškození vznikem volných kyslíkových radikálů. V posledních několika letech bylo objeveno několik molekulárně–genetických mechanizmů podílejících se na řízení metabolizmu železa. Tyto poznatky přispěly k pochopení patofyziologie řady onemocnění u člověka jako jsou různé typy anémií, hemochromatózy, apod. Výsledkem výzkumu metabolizmu Fe jsou nové diagnostické a terapeutické postupy, které pomohou přispět k léčbě i některých dnes obtížně léčitelných onemocnění.

-1-


Cíle práce. Cílem dizertační práce byla analýza vybraných biomarkerů metabolizmus železa v lidském organizmu na podkladě dosud známých poznatků o řízení homeostázy tohoto prvku. Dalším cílem bylo zhodnocení možností praktického využití dvou v současnosti nejpoužívanějších laboratorních metod k měření hladiny hepcidinu a definování přínosu těchto měření v diagnostice některých hematologických poruch u dětských pacientů. Specifikace cílů: − Stanovení hladiny hepcidinu imunochemickou metodou ELISA z krevních vzorků u dětí s nespecifickými střevními záněty. − Zavedení proteomické metody k měření hladiny hepcidinu. − Statistické srovnání výsledků měření těchto metod se zdravou populací. − Definování vztahu mezi hladinou hepcidinu a hladinami markerů metabolizmu železa měřených rutinními laboratorními metodami. − Definování vlivu zánětlivého procesu na metabolizmus železa. − Definování vlivu erytropoézy na metabolizmus železa.

-2-


Teoretická část

Teoretická část. 1. Výskyt železa a jeho význam pro člověka. Železo je nejčastějším prvkem planety Země. Největší množství je uloženo v zemském jádře. V zemské kůře je čtvrtým nejčastějším prvkem. Patří do chemické skupiny kovů (měď, kobalt, nikl, zinek a další). Nachází se běžně v přírodě v neživé formě (rudy) a v biologické formě (jako součást enzymů, bílkovin obsahujících hem, a dalších). Je základním stavebním prvkem všech živých organismů. Lidské tělo patří mezi nejvyvinutější formy života naší planety a i pro něj je železo esenciálním stopovým prvkem.

1.1 Obsah železa v lidském organizmu. Množství železa v organizmu zdravého dítěte narozeného v termínu je asi 75 mg/kg t. hm. Větší část tohoto množství dítě získává v průběhu 3. trimestru během těhotenství. Zásoby Fe získané během těhotenství jsou velice rychle spotřebovány v prvních měsících života a to především z důvodu rychlého růstu dětského organizmu. Vysoké nároky na metabolizmus Fe klesají u mužů po skončení období dospívání. Množství železa zdravého dospělého muže je asi 50 mg/kg. U žen po období dospívání klesá množství železa v organizmu do období klimaktéria na asi 35 mg/kg. Železo je u člověka vázáno zejména na hemové bílkoviny, malá část je součástí enzymů. Hladina železa v krevní plasmě je u zdravých dospělých mužů asi 8-10 µg/l. Většina plasmatického železa je spotřebována v kostní dřeni, která využívá železo k tvorbě erytrocytů (erytropoéze). Menší část slouží k syntéze enzymů, jejichž součástí je železo a zbytek nevyužitého množství železa je uloženo ve formě zásob [1]. Nejvíce Fe je obsaženo v erytrocytech ve vazbě na hemoglobin (65%), dále v zásobní formě v játrech ve vazbě na feritin a hemosiderin (25%) a v kosterní svalovině ve vazbě na myoglobin (6%) (viz Tab. 1) [1].

-3-


Teoretická část

Tab. 1 Přehled množství železa vázaného na jednotlivé biomolekuly u dospělého člověka a jeho dvoj/trojmocné formy. (Upraveno dle: Fauci AS, Braunwald E, Kasper DL, Hauser SL, Longo DL, Jameson JL, Loscalzo J, editors. Harrison's Principles of Internal Medicine. 17th ed. New York: McGraw-Hill Medical Publishing Division; 2008).

1.2 Úloha železa v lidském organizmu. Nejdůležitější biologickou vlastností železa je jeho schopnost vázat kyslík (O2). V průběhu evoluce se tato schopnost vyvinula do podoby krevní cirkulace, kde železo ve vazbě na hemoglobin (Hb) slouží jako distributor O2 do živých tkání. Železo je ale rovněž součástí různých enzymů, které využívají jeho oxido-redukčního potenciálu v metabolizmu mnoha látek. 1.2.1 Vazebná schopnost železa pro kyslík. Železo je vázáno na dvě hlavní molekuly: na hemoglobin a myoglobin, které souhrnně nazýváme hemoproteiny. Hemoglobin se skládá z bílkovinné složky – globinu a porfyrinového kruhu – hemu. Bílkovinu hemoglobinu tvoří tetramer složený ze čtyř globinových podjednotek. Každá podjednotka obsahuje jednu molekulu hemu. Na jednu molekulu hemu je navázán jeden atom železa. Bílkovinná složka hemoglobinu se mění v průběhu života, obsah železa se však nemění. V embryonálním období organizmus vytváří embryonální typ hemoglobinu (HbE) tvořený dvěma alfa řetězci se dvěma epsilon řetězci (HbE Gower 2) nebo dvěma zeta a dvěma delta řetězci (HbE Gower 1). Ve fetálním období je hemoglobin složen ze dvou alfa-globinových řetězců a dvou gama-globinových řetězců (HbF). V dospělosti nacházíme tzv. dospělý typ (HbA) složený ze dvou alfa a dvou beta řetězců (96 %), dále

-4-


Teoretická část

HbA2 složený ze dvou alfa a dvou delta řetězců (2–3%) a v malém množství se může u zdravých dospělých vyskytovat i fetální typ HbF (< 2 %) [2]. Schopnosti Fe vázat kyslík je využito i ve svalové tkáni, jejíž aktivita je vysoce náročná na energii a tedy na aerobní chemické procesy. Železo je ve svalovině vázáno na myoglobin. Myoglobin je tvořen bílkovinnou složkou globinem tvořící jeden řetězec. Na molekulu globinu je navázána jedna molekula hemu, která váže jeden atom Fe2+. Jedna molekula myoglobinu může navázat pouze jednu molekulu O2. Podle množství myoglobinu a tedy železa rozlišujeme různě intenzivní červené zabarvení příčně pruhované svaloviny a tím svalovinu intenzívně pracující od méně aktivní svalové tkáně [3]. 1.2.2 Oxido-redukční potenciál železa. Železo je vázáno na řadu enzymů: cytochromy a, b, c, sukcinát dehydrogenázu, cytochrom c oxidázu, cytochrom P450, katalázy, myeloperoxidázy a další. Jeho funkcí v bílkovinách může být vazba kyslíku, přenosu elektronů, funkce zásobní a funkce katalytická. Ve vazbě na bílkoviny je Fe rovněž transportováno jako biologicky aktivní železo. Je důležité pro kontrolu acido-bazické rovnováhy i u oxidativního stresu, kde převážně pomáhá eliminovat toxické volné kyslíkové radikály. Tvorba radikálů je však nutná např. k tvorbě nukleotidů, hlavní složky buněčné DNA. Železo je součástí enzymu ribonukleotid

reduktázy,

který

katalyzuje

přeměnu

ribonukleotidů

na

deoxyribonukleotidy [4].

1.3 Potřeba železa pro lidský organizmus. Potřeba železa v lidském organizmu se vyvíjí v průběhu života. Liší se v jednotlivých věkových skupinách a rozdíl se projevuje i mezi pohlavími. Potřeby v kojeneckém věku jsou jiné než u starších dětí, dospívajících a dospělých lidí. Novorozenci využívají zásob, které si v průběhu posledního trimestru těhotenství organizmus vytvořil. Období kojenecké a období dospívání je spjato s intenzivním růstem, který je charakterizován mimo jiné také zvýšenou spotřebou železa. Rovněž těhotenství a laktace jsou velice náročné na spotřebu železa. Přehled potřeby lidského organizmu v závislosti na věku a pohlaví je zobrazen v Tab. 2. Růst organizmu je tedy závislý na přísunu železa z vnějšího prostředí.

-5-


Teoretická část

Tab. 2 Přehled denní potřeby železa lidského organismu (m - měsíce, r - roky). (Upraveno dle: Food and Nutrition Board, Institute of Medicine—National Academy of Sciences Dietary Reference Intakes, 2000, 2002, reprinted with permission. Courtesy of the National Academy Press, Washington, DC).

1.4 Zdroje železa. Železo se vyskytuje v potravinách živočišného i rostlinného původu. V každé z nich se však vyskytuje v jiné formě a lidský organizmus jej dokáže zpracovat s odlišným efektem. Ve stravě je železo vázáno buď na bílkoviny obsahující hem, proto jej nazýváme hemové železo (představuje asi 40% obsahu stravy). Železo vázané na jiné molekuly nazýváme nehemové železo (asi 60% obsahu stravy). V rostlinné stravě je železo součástí různých nehemových bílkovin a enzymů. 1.4.1 Rostlinná strava. Koncentrace železa v rostlinné stravě je poměrně vysoká. Pro lidský organizmus je však důležitější jeho dostupnost, tzn. jaké množství z celkového obsahu železa dané potraviny je organizmus schopný vstřebat. Rostlinná tkáň obsahuje výhradně nehemové železo (viz Tab. 3). Rostlinná strava obsahuje látky, které vstřebávání železa různě ovlivňují a tím mění jeho dostupnost. Železo je v rostlinné tkáni vázáno převážně na fytáty. Fytáty obecně svou schopností vázat Fe snižují jeho uvolňování z rostlinné stravy během zažívání. Dalším faktorem negativně ovlivňujícím vstřebávání je obsah polyfenolů (např. v čaji, kávě, červeném víně) a taninů. Jeden šálek čaje (~ 200 ml) sníží absorpci -6-


Teoretická část

železa o 70 – 80 %. V opačném případě pozitivně působí kyselina askorbová (vitamin C), která vstřebávání podporuje [5].

Tab. 3 Obsah železa v jednotlivých potravinách rostlinného původu a množství dle denní potřeby. *DV - denní potřeba (Upraveno dle: U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service. 2003. USDA Nutrient Database for Standard Reference, Release

16.

Nutrient

Data

Laboratory

Home

Page,

http://www.nal.usda.gov/fnic/foodcomp). 1.4.2 Živočišná strava. Hlavní složkou živočišné stravy je hemové železo. Živočišná strava, jako např. červené maso, ryby a drůbež, obsahuje obecně velké množství svalové tkáně. Příčně pruhovaná svalovina kosterních svalů a svalovina srdeční obsahují molekuly sloužící k uskladňování kyslíku nutného pro energeticky náročnou funkci při svalové kontrakci. Jedná se hlavně o

-7-


Teoretická část

železo vázané na myoglobin, což je molekula podobná červenému krevnímu barvivu hemoglobinu. Živočišná strava v menší míře rovněž obsahuje hemové železo vázané na hemoglobin erytrocytů. Nehemové železo je obsaženo ve výrazně menší míře a je součástí hemosiderinu, feritinu, transferinu apod. (viz. Tab. 4) [6].

Tab. 4 Obsah železa v jednotlivých potravinách živočišného původu a množství dle denní potřeby. (Zdroj: U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service. 2003. USDA Nutrient Database for Standard Reference, Release 16. Nutrient Data Laboratory Home Page, http://www.nal.usda.gov/fnic/foodcomp).

2. Cirkulace železa a mechanizmy jeho řízení. Homeostáza, neboli rovnováha hladiny železa, je udržována z velké části recyklací starých (senescentních) erytrocytů pomocí buněk monocyto-makrofágového systému, kdy dochází postupně k opětovnému uvolnění železa do krevního oběhu. Při krvácení s minimálními ztrátami a při zvýšeném metabolizmu, je nedostatek Fe hrazen ze zásobního železa uloženého v játrech. Nedostatečné množství může být doplněno příjmem železa z běžné stravy. Přirozenou cestou vstřebávání železa je vstřebávání zažívacím traktem, kam se dostává v živočišných a rostlinných složkách denní stravy. Jeho obsah v jednotlivých potravinách se však může velice lišit a rovněž jeho schopnost vstřebání z jednotlivých složek stravy může být velmi rozdílná. Tyto rozdíly následně mohou vést až k nutričním -8-


Teoretická část

deficitům u různých typů diet. Vstřebávání železa ze stravy je však ovlivněno i jinými faktory, z nichž mnohé byly objeveny teprve nedávno. Hladina železa je regulována na úrovni celého organizmu (erytropoézou, zánětem, nutričními deficity, apod.) a na úrovni buněčné, kde klíčovou roli hrají tzv. železo regulující proteiny (IRP, z angl. iron regulatory proteins). 2.1. Cirkulace železa. 2.1.1 Absorpce železa. Přirozenou cestou lidského organizmu pro vstřebávání železa je zažívací trakt. Proces vstřebávání zahrnuje několik kroků, které se liší podle navázání železa na bílkoviny. Mezi orgány, které hrají klíčovou roli ve vstřebávání železa ze stravy, patří žaludek a tenké střevo, zejména duodenum. Především v těchto orgánech jsou podmínky pro absorpci železa ideální. Působí zde faktory jako nízké pH a redoxní potenciál a rovněž jsou zde ve sliznici v největší míře exprimovány proteiny nutné k přestupu železa ze zažívacího traktu do krevního oběhu. Ve vyspělých státech tvoří hemová forma Fe 10–15% živočišné stravy, zbytek tvoří nehemová forma. 2.1.1.1 Absorpce hemového železa. Hemové železo pochází z hemoglobinu, myoglobinu a dalších hemových proteinů, které se vyskytují v živočišné stravě. Kyselý obsah žaludku a žaludeční proteázy štěpí živočišnou tkáň a uvolňují hem z jeho vazby na proteiny. Vlivem redoxních reakcí je hemové železo oxidováno na hemin a tato molekula prostupuje do buněk sliznice duodena bez dalších modifikací. Pro hem byl nedávno identifikován transmembránový přenašeč, tzv. heme carrier protein 1 HCP1 [7]. V současné době se objevují studie popisující jeho roli více jako transportéra kyseliny listové [8]. Po přestupu hemového železa do intracelulárního prostoru enterocytu je porfyrinový kruh hemu enzymaticky rozštěpen pomocí hem-oxygenázy (HO) [9]. Tímto rozštěpením se uvolňuje železo vázané v tomto porfyrinovém kruhu do cytoplasmy. Následné kroky jsou společné hemovému i nehemovému železu. Malá část hemového železa může proniknout beze změny do krevního oběhu, kde je navázáno na hemopexin. 2.1.1.2 Absorpce nehemového železa.

-9-


Teoretická část

Nehemové železo je vázáno na organické molekuly jako jsou fytáty, oxalát, cukry, laktát a aminokyseliny. Důležitou roli při vstřebávání hraje dostupnost železa ze složek stravy, tedy jeho schopnost uvolnit se z vazeb na nehemové molekuly. Složení stravy má velký vliv na absorpci nehemového železa. Mateřské mléko je významným zdrojem nehemového železa. Z mateřského mléka se vstřebává více Fe (cca 50 % obsahu) než z běžné, i o Fe obohacené stravy (cca 4% obsahu) a z mléka kravského. Pro vstup do krevního oběhu jsou nezbytné enterocyty, které na svých membránách obsahují pro absorpci důležité molekuly. Na luminální membráně kartáčového lemu se nachází proteiny DMT1 (z angl. divalent metal transporter 1) a DCytB (z angl. duodenal cytochrome B) nutné pro vstup železa do intracelulárního prostoru. Na bazolaterální membráně se nachází membránový exportér Fe: feroportin, nezbytný pro výdej železa do krevního oběhu [10]. Absorpce nehemového Fe může být díky regulačním mechanizmům zvýšena až 10krát. Na druhou stranu existují i látky, které vstřebávání nehemového železa ze stravy snižují [11]. Látky, které snižují absorpci nehemového Fe se vyskytují rovněž ve stravě a patří mezi ně sójové peptidy [12], bílkoviny kravského mléka, fytáty, vláknina, polyfenoly obsažené v zelenině, čaji, kávě a víně. Fosfáty a fosfoproteiny inhibují absorpci železa z vaječného žloutku a mléka. Vápenaté ionty rovněž inhibují vstřebávání železa a dalších kovových iontů ze zažívacího traktu. Vstřebávání Fe rovněž redukují látky snižující tvorbu žaludeční kyseliny a tím i pH žaludeční šťávy, např. blokátory protonové pumpy, opakovaný reflux zásadité pankreatické šťávy z duodena do žaludku, chronický zánět žaludeční sliznice s atrofií žláz tvořících kyselou žaludeční šťávu. Mezi nejběžnější látky zvyšující absorpci patří vitamín C (kyselina askorbová). Dále látky obsažené v mateřském mléce, látky vázající železo, např. organické kyseliny, aminokyseliny a cukry s keto- skupinou rovněž podporují vstřebávání nehemového železa. Pro lepší vstřebávání se doporučuje konzumace kyselých nápojů, např. džusů, ovocných šťáv, apod. 2.1.1.3 Absorpce nehemového železa na buněčné úrovni. Duodenální enterocyty hrají hlavní roli při vstupu železa z vnějšího prostředí do krevního oběhu. Hlavní procesy se odehrávají na membránách těchto buněk, apikální a bazolaterální. Na apikální membráně dochází nejprve k redukci železitého iontu (Fe3+) na - 10 -


Teoretická část

iont železnatý (Fe2+). Tato chemická přeměna je katalyzována membránovým DCytB [13]. Následně prostupuje přes apikální membránu pomocí iontového kanálu DMT1 (rovněž používané zkratky Nramp2, DCT1, SLC11A2) (Obr. 1). Dvojmocné kovové ionty jsou přenášeny pomocí protonového symportu, při němž kyselé prostředí žaludeční natráveniny obsahující H+ hraje klíčovou roli pro efektivitu přenosu [14].

Obr. 1 Absorpce železa na luminální membráně kartáčového lemu enterocytu. V intracelulárním prostoru enterocytů, jejichž životní cyklus trvá 3-4 dny, je dvojmocné železo navázáno na zásobní feritin a následně vyloučeno odumřelými buňkami ze zažívacího traktu. Tímto způsobem organizmus omezuje vstřebávání železa ze zažívacího traktu při stavech, kdy hladina železa v plasmě je v normě nebo je zvýšená. Nezásobní dvojmocné železo je aktivně přenášeno z enterocytu do krevního oběhu. 2.1.1.4 Přestup železa z enterocytu do krevního oběhu. Proces výdeje dvojmocného železa z intracelulárního prostoru enterocytu do krevního oběhu se odehrává na bazolaterální membráně enterocytu pomocí membránového transportéru feroportinu (Fpn, SLC40A1) [15-17]. Na bazolaterální membráně se rovněž nachází enzym hephaestin (HEPH), který po výstupu dvojmocného železa do extracelulárního prostoru oxiduje Fe2+ na Fe3+ (Obr. 2). Železo je schopné navázat se na transportní bílkovinu transferin (Tf) v krevním oběhu pouze v trojmocné formě.

- 11 -


Transferinem

je

železo

Teoretická část

přenášeno

krevním

řečištěm

k

cílovým

orgánům.

Obr. 2 Výdej železa na bazolaterální membráně enterocytu do krevního oběhu. HPH haephestin, FPN - feroportin. 2.1.1.5 Absorpce a výdej železa na úrovni makrofágu. Kostní dřeň dospělého člověka spotřebuje 96 % denní potřeby železa. Denně je v organizmu spotřebováváno asi 25 mg železa. Pouze 1 mg je denně přijímán ze zažívacího traktu. 24 mg tedy téměř celé množství je získáváno ze starých tzv. senescentních erytrocytů, které jsou odbourávány v monocyto-makrofágovém systému. Pouze malé množství denní potřeby je uvolněno ze zásob železa. Hlavním zdrojem železa pro erytropoézu jsou tedy erytrocyty. Na recyklaci železa se podílí především makrofágy. Makrofágy jsou buňky schopné fagocytózy. Na recyklaci se podílí hlavně makrofágy ve slezině. Jejich povrchové molekuly hrají klíčovou roli v příjmu a výdeji železa získaného z fagocytovaných erytrocytů. V organizmu rozlišujeme dva druhy makrofágů. První typ se nachází např. v plicích, kde makrofágy fagocytují erytrocyty, ale nemají schopnost uvolněné železo exportovat zpět do krevního oběhu. Druhý typ makrofágů se nachází hlavně v sinusech sleziny a jater a tyto buňky mají schopnost železo aktivně vylučovat zpět do oběhu. Proces fagocytózy nazýváme erytrofagocytóza. V makrofázích dochází k rozpadu erytrocytu a uvolnění hemoglobinu. Z něj se uvolňuje hem, jehož porfyrinový kruh štěpí enzym hemoxygenáza (HO), čímž se

- 12 -


Teoretická část

uvolňuje Fe2+. Železo uvolněné z vazby na hemoglobin je dále buďto vázáno na zásobní feritin nebo hemosiderin uvnitř makrofágu nebo je exportováno do krevního oběhu [11]. Uvolňování železa z makrofágu se děje v různém časovém období. V časné fázi, která se uskuteční během několika prvních hodin po erytrofagocytóze, dochází k okamžitému uvolnění železa do krevního oběhu. V pozdní fázi dochází k uvolňování zásobního železa na podkladě aktuálních potřeb organizmu. Železo je transportováno do extracelulárního prostředí pomocí feroportinu. Feroportin je membránový transportér identický s feroportinem na bazolaterální membráně enterocytů. Pro navázání Fe2+ na transportní protein transferin je nutné Fe2+ oxidovat na Fe3+. Oxidace je katalyzována plasmatickým proteinem ceruloplasminem [18; 19]. Poté je Fe ve vazbě na transferin transportováno opět do kostní dřeně, kde může sloužit k tvorbě nových erytrocytů. 2.1.2 Transport železa krevním řečištěm. 2.1.2.1 Transferin. Hlavním transportním proteinem pro železo v krevním oběhu je transferin (Tf). Transferin je polypeptidový jednořetězcový β-globulin, který je tvořen převážně v játrech. Po internalizaci transferinu obsahujícího železo dochází k jeho recyklaci. Jeho biologický poločas je 8 – 10 dní. Transferin obsahuje 2 vazebná místa pro železo (Fe3+). Apotransferin je molekula bez navázaného železa. Po obsazení obou vazebných míst má transferin 3,5-krát větší afinitu k transferinovému receptoru (TfR), než transferin s jedním navázaným iontem [11]. Normální hladina transferinu v plasmě je 2–3 g/l. Hladinu transferinu měříme pomocí vazebné kapacity pro železo. Produkce transferinu v játrech stoupá při snížení zásob železa v hepatocytech, a naopak při zvětšených jaterních zásobách produkce transferinu klesá. Na transferin jsou navázány asi 4 mg železa, avšak během 24 hodin je celkem transportováno více jak 30 mg. Více jak 80% takto vázaného železa je využito v kostní dřeni k tvorbě hemoglobinu pro erytrocyty. U zdravého jedince je celková vazebná kapacita transferinu obsazena pouze asi jen z jedné třetiny, zbytek slouží pro navázání přebytečných iontů železa. 2.1.2.2 Transferinový receptor.

- 13 -


Teoretická část

Rozlišujeme dva typy transferinového receptoru (TfR). TfR1 je tvořen homodimerem glykoproteinu spojeným disulfidickým můstkem o velikosti asi 190 kDa. Je tvořen extracelulární

doménou,

jednoduchou

transmembránovou

částí

a

krátkou

cytoplasmatickou komponentou. Každý homodimer může vázat až dvě molekuly transferinu. TfR2 je ze 45% homologní s extracelulární částí TfR1. Tento receptor má menší afinitu k transferinu než TfR1 a nachází se převážně v jaterních buňkách a v erytroidních prekurzorech [20]. Největší množství TfR1 se nachází v normoblastech kostní dřeně, kde je 300.000 – 800.000 receptorů na buňku a kde dochází k vychytávání železa pro tvorbu hemoglobinu. V dalších fázích vývoje erytrocytu již počet receptorů klesá. Při odbourávání TfR dochází k jeho uvolňování do krevního oběhu. Ve formě sTfR je dnes možné ho měřit rutinními metodami. Hladina sTfR odpovídá aktivitě erytropoézy a požadavkům organizmu na železo pro tvorbu erytrocytů. Po navázání transferinu na TfR dochází k endocytóze komplexu a k tvorbě endocytických vezikul. Poté dochází k okyselení pH uvnitř endosomu a železo se přesouvá do intracelulárního prostoru, kde se začíná uvolňovat z vazby na transferin a prostupuje do cytoplasmy. Nejprve dojde k jeho redukci na Fe2+ pomocí enzymu STEAP2 (z angl. six-transmembrane epithelial antigen of the prostate), a poté je exportování do cytosolu pomocí DMT1. Feritin a TfR následně migrují zpět k membráně buňky, kde je apotransferin uvolňován do krevního oběhu. Koloběhu transferinu na buněčné úrovni je znázorněn na obr. 3.

- 14 -


Teoretická část

Obr. 3 Schéma cirkulace transferinu na buněčné úrovni. 2.1.3 Cílové orgány pro cirkulující železo. 2.1.3.1 Erytropoéza. Nejdůležitějším cílovým orgánem pro utilizaci železa je kostní dřeň. V kostní dřeni dochází k inkorporaci železa do krevního barviva – hemoglobinu. Až 70% celkového množství železa v lidském organizmu je ve vazbě na hemoglobin. Normoblasty jsou erytroidní buňky kostní dřeně, které obsahují největší koncentraci transferinových receptorů a mají tedy největší spotřebu železa v lidském organizmu. Železo je erytroidními buňkami využíváno k tvorbě hemoglobinu. Hemoglobin je tvořen v mitochondriích. V těchto organelách dochází k inkorporaci železa do protoporfyrinu IX pomocí enzymu ferochelatázy. Snížená volná hladina hemu v cytoplasmě erytroidních prekurzorů zvyšuje vychytávání železa buňkou, při zvýšené hladině vychytávání železa klesá. V plasmě se v malém množství (12–300 µg/l) vyskytuje i zásobní forma železa – feritin. Hladina plasmatického feritinu se liší od hladiny tkáňového feritinu. Erytroidní prekurzory jsou schopny plasmatický feritin vychytávat přes dosud neidentifikovaný receptor, avšak u zdravého jedince je feritin pouze malým zdrojem železa pro vlastní erytropoézu. Celkem 80–90% železa v normoblastu je využito k tvorbě hemoglobinu. Zbytek je ukládán ve formě feritinu, který tvoří barvitelná granula. Normoblasty s pozitivními granuly jsou nazývány sideroblasty, po enukleaci siderocyty. U zdravých jedinců tvoří sideroblasty asi polovina všech normoblastů. Prstenčité sideroblasty nacházíme u onemocnění zvaného sideroblastická anémie a MDS – RARS (z angl. myelodysplastic syndrome - refractory anemia with ringed sideroblasts) [20]. 2.1.3.2 Tvorba zásob železa. Železo je částečně ukládáno do zásob pro kompenzaci jeho zvýšené spotřeby. Ukládá se ve formě feritinu a hemosiderinu. Dvě třetiny zásobního železa se nacházejí v monocyto-makrofágovém systému a jedna třetina je v hepatocytech. Hlavní zásobní molekulou vážící železo je feritin. Feritin byl objeven českým fyziologem Vilémem Laufbergerem v roce 1937, který získal jeho krystalickou strukturu - 15 -


Teoretická část

z buněčné sušiny a následně popsal jeho roli. Feritin bez navázaného železa nazýváme apoferitin. Ten vytváří sférickou molekulu o průměru 13 nm a velikost 400–500 kDa. Vnitřní dutý prostor o průměru 6 nm komunikuje s vnějším prostředím pomocí 6 kanálů. Obal je tvořen 24 molekulami složenými ze dvou podjenotek – podjednotky H (těžká) a podjednotky L (lehká). Funkce těchto podjenotek se liší. H podjednotka obsahuje enzym oxidující Fe2+. Feritin obsahující větší množství těchto podjednotek je schopen rychleji přijímat železo. Feritin obsahující více L podjednotek je odolnější proti denaturaci. Jedna molekula feritinu pojme až 4500 iontů Fe3+. Uvnitř mitochondrií se nachází feritin lišící se od ostatních forem. Má vyšší oxidázovou aktivitu a podobá se více feritinu z H podjenotek. Jeho funkce není zatím dostatečně popsána, ale předpokládá se, že je pro organizmus velice důležitý, jelikož je mezi živočišnými druhy a ve fylogenezi zachován téměř v identické podobě. Hemosiderin je považován za nekompletně degradovanou molekulu feritinu složenou z Fe, feritinových bílkovin a dalších buněčných složek. Je méně rozpustný než feritin a má větší poměr železa k proteinové složce než molekula feritinu. Je barvitelný Pruskou modří. Z fyziologického hlediska představuje hemosiderin stabilnější, ale méně dostupnou formu zásobního železa. 2.1.4 Eliminace železa z organizmu. V roce 1938 McCance a Widdowson [21] jako první prokázali, že člověk nemá na rozdíl od některých jiných živočichů efektivní mechanizmus na vylučování nadbytečného množství železa. Nadbytek železa se za fyziologických podmínek nevyskytuje. Onemocnění vedoucí k přetížení organizmu se často rozvíjejí pomalu a pouze v případě, že množství železa překročí schopnost využít železo např. v erytropoéze nebo že překročí schopnost uložit nadbytek železa do zásob. Mechanizmus eliminace nadbytečného železa spočívá ve ztrátě buněk, např. epiteliálních buněk gastrointestinálního traktu, epidermálních buněk kůže a u žen erytrocytech menstruační krvi. Denní ztráty zdravého dospělého muže a zdravé nemenstruující ženy představují přibližně 1 mg/den. Menstruující ženy ztrácí v průměru 0,006 mg/kg/den železa menstruační krví, u některých toto množství může být až 0,025 mg/kg/den. U těhotných žen je spotřeba železa až 3,5-krát větší než u zdravého muže. Močí je vyloučeno méně jak

- 16 -


Teoretická část

0,05 mg/den a to hlavně odloučenými buňkami. Nevýznamná část je vylučována do potu, asi 22,5 µg/l [22].

2.2 Regulace železa na úrovni organizmu. 2.2.1 Regulace absorpce železa ze zažívacího traktu. V posledních letech bylo objeveno několik nových molekul, které hrají klíčovou roli v regulaci výdeje železa z intracelulárního prostoru a tím i hlavní roli v metabolizmu železa celého organizmu. Řízení absorpce je ovlivněno hlavně dvěma faktory, aktuálním obratem erytropoézy a množstvím zásobního železa. V případě nedostatečného množství zásobního železa v organizmu je absorpce ze zažívacího traktu zvýšena, naopak v případě zvýšených zásob železa dojde k útlumu vstřebávání ze zažívacího traktu. Absorpce železa může narůst až 10-krát. V případě zvýšené produkce červené krevní řady v kostní dřeni se rovněž zvyšuje absorpce železa ze zažívacího traktu.

2.3 Regulace železa na buněčné úrovni. 2.3.1 Hepcidin, feroportin a jejich role v metabolizmu železa. 2.3.1.1 Hepcidin. Již před více jak deseti lety dva nezávisle pracující výzkumné týmy [23; 24] identifikovaly hepcidin, který je klíčovým peptidem v metabolizmu železa. Je vylučován močí a syntetizován převážně v játrech. V menším množství je exprimován i v makrofázích, adipocytech [25], β-buňkami pankreatu [26] a řadou dalších tkání včetně srdce a mozku, avšak role zde tvořeného hepcidinu je zatím nejasná. Hepcidin je peptid složený z 25 aminokyselin (H − Asp − Thr − His − Phe − Pro − Ile − Cys − Ile − Phe − Cys − Cys − Gly − Cys − Cys − His − Arg − Ser − Lys − Cys − Gly − Met − Cys − Cys − Lys − Thr − OH) a 4 disulfidických můstků (Cys1 − Cys8, Cys3 − Cys6, Cys2 − Cys4 a Cys5 − Cys7) (viz Obr. 4). Kódován je genem HAMP (z angl. hepcidin antimicrobial peptide) lokalizovaném na dlouhém raménku chromozómu 19 (19q13.1) [27]. Translací 0,4 kb úseku mRNA pocházejícího z 3 exonů 2,5 kb úseku genu HAMP vzniká prekurzor hepcidinu pre- prohepcidin složený z 84 aminokyselin. Následně je z něj enzymaticky odštěpen prohepcidin složen z 64 aminokyselin. Poté je prohepcidin uvolněn do lumen - 17 -


Teoretická část

endoplazmatického retikula, kde dochází k odštěpení 39 aminokyselin enzymem furinu podobné proproteinové konvertázy a zůstává peptid složený z 25 aminokyselin hepcidin-25 pocházející z C konce prekurzoru [28]. Byly identifikovány i další formy hepcidinu složené z menšího množství aminokyselin, hepcidin-22 a hepcidin-20 [29]. Biologický význam pre-prohepcidinu nebyl prokázán [30]. U hepcidinu-20 byl in vitro prokázán antibakteriální a antifungální účinek v koncentracích 10ti násobně vyšších než je běžná hladina zdravých kontrol [24]. Struktura hepcidinu je mezidruhově poměrně jednotná. Lze tedy usuzovat, že mechanizmus řízení metabolizmus železa, na němž se hepcidin podílí, je efektivní a fylogeneticky výhodný [31].

Obr.

4

Struktura

rozpuštěné

formy

hepcidinu-25

(upraveno

dle:

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:PDB_1m4f_EBI.jpg). Původně oba objevitelské týmy určily hepcidinu roli v nespecifické imunitní odpovědi organizmu při obraně proti bakteriální infekci. Vzápětí byl na myším modelu objeven vztah hepcidinu k metabolismu železa [32] a ještě téhož roku byla blíže popsána jeho role regulátoru tohoto metabolismu [33]. Receptorem pro hepcidin byl identifikován rovněž klíčový protein feroportin. 2.3.1.2 Feroportin. Feroportin byl objeven v roce 2000 třemi nezávislými týmy, které jej identifikovaly jako transmembránový přenašeč železa nacházející se ve zvýšené míře na basolaterální straně enterocytů dudodena a na membráně makrofágů monocyto-makrofágového systému a Kuppferových buněk jater. V menší míře se pak nachází v plicních buňkách,

- 18 -


Teoretická část

buňkách renálních tubulů a v erytrocytárních prekurzorech. Feroportin je kódován genem SLC40A1 (SLC11A3, 2q32). Je to jedinečný peptid s konzervativní strukturou společnou pro savce a jiné obratlovce a jediný doposud objevený specifický transmembránový exportér železa [34]. Prostřednictvím feroportinu je intracelulární železo přenášeno do krevního oběhu, avšak přesný mechanizmus přenosu není doposud objasněn. Byly popsány dvě formy feroportinu [35]. FPN1A (Feroportin 1A) obsahuje ve své struktuře 5’ element senzitivní na hladinu železa a v buňkách s nedostatkem železa tlumí jeho syntézu. FPN1B (Feroportin 1B) tento 5` element neobsahuje. Nachází se především v duodenálních enterocytech, kde zajišťuje přenos železa z gastrointestinálního traktu (GIT) do krevního oběhu a jeho syntéza není tlumena nedostatkem železa. 2.3.2 Mechanizmus účinku hepcidinu a feroportinu. Po navázání hepcidinu na feroportin dochází k internalizaci komplexu a jeho inaktivaci v lysozomech buňky [36]. Hepcidin tedy působí tlumivě na vstřebávání železa ze zažívacího traktu a na výdej železa z makrofágů, čímž snižuje hladinu železa v krevním oběhu. V případě nedostatku železa dojde naopak k utlumení tvorby hepcidinu a ke zvýšenému uvolňování železa do krevního oběhu. Tímto mechanismem je udržována relativně stabilní rovnováha železa v organizmu (viz Obrázek 5).

Obr. 2 Homeostáza železa v organizmu a řízení jeho cirkulace hepcidinem. Hepcidin je produkován v hepatocytech jater v odpovědi na stav železa v organizmu (stimulační signál, +) a aktivitu erytropoézy (tlumící signál, -). Hepcidin (černá čára) inhibuje transport železa z enterocytů duodena, makrofágu sleziny a hepatocytů jater (×) a snižuje tak hladinu železa v plazmě. Patologické zvýšení produkce hepcidinu (v důsledku zánětu a inaktivačních mutací matriptázy-2, MT-2) vede k utlumení uvolňování železa z výše zmíněných buněčných kompartmentů a ke snížení jeho hladiny v plazmě, což vede

- 19 -


Teoretická část

k rozvoji anémie. Naopak při patologickém snížení produkce hepcidinu (v důsledku zvýšených hladin erytroidních faktorů nebo při mutacích genů asociovaných s hemochromatózou) dochází ke zvýšení hladiny železa v plazmě a eventuálnímu rozvoji přetížení organizmu železem. (Upraveno dle: Ganz 2011 [37]). Byly popsány mutace feroportinu, které vedou k jeho inaktivaci a způsobují hromadění železa v makrofázích. Nejčastěji se jedná o autosomálně dominantně dědičné mutace a v důsledku vedou k rozvoji onemocnění nazvaného feroportinová nemoc [38] (viz níže). Naopak při mutacích, které vedou k rezistenci na hepcidin nebo které vedou k tvorbě neúčinného hepcidinu, dochází k chronickému přetěžování organizmu železem až k možnému rozvoji onemocnění podobnému hemochromatóze (viz níže). 2.3.4 Faktory ovlivňující tvorbu hepcidinu. Hepcidin efektivně řídí distribuci železa v lidském organizmu. Regulací tvorby tohoto peptidu organizmus vyrovnává výkyvy v homeostáze železa způsobené vlivem vnějšího prostředí i vlivem různých genetických onemocnění. Faktory, které ovlivňují tvorbu hepcidin, působí na úrovni celého organizmu nebo na úrovni buňky. V posledních deseti letech bylo objasněno několik faktorů ovlivňujících tvorbu hepcidinu, z nichž některé působí stimulačně, jiné supresivně. 2.3.4.1 Regulace na úrovni celého organizmu. Produkce hepcidinu ovlivněná hladinou železa v krevním oběhu. Exprese hepcidinu je zpětně regulována hladinou železa v krevním oběhu, přičemž BMP/SMAD signální dráha je považována za hlavní regulační osu transkripce hepcidinu [39] v hepatocytech jater (Obr. 3). Na regulaci hladiny železa se také podílí membránový protein HFE (human hemochromatosis protein), který se kompetitivně váže na transferinový receptor [40; 41]. HFE je strukturálně podobná molekulám z třídy MHC třídy I. Role HFE u člověka není doposud plně objasněna, ale jeho nerovnováha vede k rozvoji dědičné poruchy akumulace železa, hemochromatózy typu I [42]. Studie na myších prokázaly, že HFE v buňkách gastrointestinálního traktu (GIT) neovlivňují kontrolu homeostázy za fyziologických podmínek [43]. Vazba HFE na TfR1 je inhibována při nadbytku holotransferinu, který vyvazuje HFE překrytím jeho vazebného

- 20 -


Teoretická část

místa. Následně se HFE nenavázané na TfR1 váže na TfR2, kde je jeho vazba méně silná, ale v kombinaci s holotransferinem je vazba HFE na TfR2 posílena [44]. Celý komplex poté stimuluje expresi hepcidinu pomocí signální dráhy, která dosud zůstává předmětem dalšího bádání. Některé studie [41; 45] popisují ovlivnění BMP (z angl. bone morphogenetic proteins) kaskády a/nebo MAPK (s angl. mitogen-activated protein kinase) kaskády tímto komplexem. Výsledkem je útlum vstřebávání a uvolňování dalšího železa do krevního oběhu z enterocytů a buněk monocyto-makrofágového systému.

Obr. 3 Schéma řízení exprese HAMP genu v hepatocytech. BMP6 po vazbě na BMP receptor (BMPR I-II) a membránový hemojuvelin (mHJV) stimuluje SMAD signální dráhu a expresi hepcidinu. Matriptáza-2 brání nadměrné expresi hepcidinu tím, že štěpí mHJV a vypíná tak BMP6/SMAD signální dráhu. Zvýšená hladina holotransferinu (Fe3+2TF) stabilizuje transferinový receptor 2 (TfR2) a v komplexu s HFE zvyšuje expresi HAMP. Detaily přenosu tohoto signálu nejsou známé (v obrázku označené otazníkem). Tvorba hepcidinu ovlivněná množstvím železa uloženého v zásobách. Tvorba hepcidinu v hepatocytech je kromě ovlivnění cirkulujícím železem ovlivněna i množstvím železa uloženého v zásobách. Přesný mechanizmus však nebyl doposud plně

- 21 -


Teoretická část

objasněn. Určitou roli v tomto procesu pravděpodobně hrají železo dependentní ligázy a prolyl hydroxylázy [46]. Tyto látky jsou železo dependentní a pravděpodobně hrají roli v regulačních mechanizmech ovlivněných hypoxií. Erytropoéza potlačuje tvorbu hepcidinu. Při produkci erytrocytů je železo spotřebováváno ve velkém množství a to při hemoglobinizaci, která probíhá již u erytrocytárních prekurzorů. Erytropoéza je téměř výhradně závislá na hladině železa v krevním oběhu vázaného na holotransferin [47]. Předpokládá se, že zvýšený obrat erytropoézy při krvácení nebo při zvýšeném působení erytropoetinu, tlumí tvorbu hepcidinu v játrech pomocí signálu, který vychází z kostní dřeně [48]. Tento tlumivý efekt se vyskytuje u onemocnění charakterizovaných zvýšenou, avšak neefektivní erytropoézou, kde často dochází k apoptóze erytrocytárních prekurzorů. Významně snížená hladina hepcidinu byla prokázána například u β-thalassemie [49; 50]. U tohoto onemocnění byla prokázána zvýšená hladina GDF-15 (z angl. growth differentiation factor 15) ze skupiny TGF-β (z angl. transforming growth factor β). GDF15 je syntetizován erythroidními prekurzory během zvýšeného buněčného stresu a apoptózy [51]. U anémie z krevních ztrát nebyla jeho zvýšená produkce prokázána [52]. Supresivní účinek GDF-15 na expresi hepcidinu byla experimentálně prokázána (viz níže). Hypoxie potlačuje tvorbu hepcidinu. Hypoxie snižuje hladinu hepcidinu, ale mechanizmus účinku není příliš znám. Ve studii, kde byli probandi vystaveni vysoké nadmořské výšce, došlo k rychlému poklesu hladiny hepcidinu a to před ostatními biochemickými změnami [53]. Regulační osa pravděpodobně zahrnuje HIF-1α (hypoxií indukovaný faktor 1 alfa), který je syntetizován játry. Zvýšena hladina HIF-1α pravděpodobně̌ snižuje hladinu hepcidinu nepřímo [54]. U polycytémie ruské populace obyvatel Čuvačska byla zjištěna homozygotní mutace genu pro von Hippel Lindau protein (R200W) [55]. Tato mutace vedla ke stabilizaci HIF-1α. Následně byla indukována tvorba erytropoetinu a snížena tvorba hepcidinu. Na myším modelu bylo prokázáno, že vyřazení genů Vhl a Epo nevedlo k potlačení tvorby hepcidinu, ale po injekčním podání erytropoetinu byla jeho tvorba potlačena [56]. Erytropoetinem stimulovaná erytropoéza při hypoxii potlačuje produkci hepcidinu

- 22 -


Teoretická část

pravděpodobně působením erytropoetinu v Epo-R signální dráze a regulací transkripčního faktoru C/EBPα [57]. Infekce a zánět zvyšují tvorbu hepcidinu. Tvorba zánětlivých mediátorů při infekcích a systémových zánětlivých onemocněních ovlivňuje syntézu hepcidinu na úrovni transkripce. IL-6 (interleukin 6), působící přes STAT-3 (signal transducer and activator of transcription 3) signální dráhu, je hlavním cytokinem ovlivňujícím produkci hepcidinu [36]. JAK/STAT signální dráha je aktivována zánětlivými cytokiny. STAT-3 obsahuje vazebnou část, která aktivuje promotor hepcidinu [58]. U člověka dochází po aplikaci IL-6 dochází ke zvýšení vylučované hladiny hepcidinu několikanásobně během 2 hodin po podání [59]. V laboratorních podmínkách byly zjištěny další cytokiny (např. IL-1, TNF-α), které mají vliv na tvorbu hepcidinu, jejich účinky u člověka však nebyly dosud potvrzeny [60; 61]. Tento mechanizmus působí jako obrana proti infekci způsobené snížením hladiny železa v krevním oběhu. Snížením dostupnosti železa pro mikroby naruší jejich látkovou výměnu a snižuje jejich schopnost dělení. Význam této nespecifické obrany člověka proti mikrobům je předmětem dalšího studia. Důsledkem snížení hladiny železa je jeho menší dostupnost pro erytropoézu. Při dlouhodobějším působení zánětlivé aktivity se rozvíjí anémie chronických chorob. 2.3.4.2 Ovlivnění syntézy hepcidinu na buněčné úrovni. Buňka sama je schopna reagovat na aktuální množství v ní obsaženého železa. Byl popsán mechanizmus, který umožňuje buňkám přijímat železo podle potřeby a zároveň se bránit proti jeho akumulaci a toxickému efektu. Část tohoto mechanizmu je vázána na úlohu transferinu a transferinového receptoru. Součástí mRNA pro TfR jsou domény nazvané IRE (z angl. iron-responsive element) [62], na které se váží IRP proteiny (z angl. iron regulatory protein). IRE jsou nekódující úseky kličky mRNA (UTR, z angl. untranslated region) kódující proteiny důležité pro řízení metabolismu železa (např. feritin L a feritin H, transferinový receptor, enzymy citrátového cyklu, feroportin a další). IRP (viz níže) se váží buď na 5` část UTR mRNA a tím potlačují translaci proteinů nezbytných pro metabolizmus železa,

- 23 -


Teoretická část

nebo se váží na 3` část UTR, čímž mRNA stabilizují [63; 64] a translace může proběhnout. Byly popsány dva typy IRP1 a IRP2. Jsou si strukturálně podobné, ale každý je regulován jiným způsobem. Pro IRP1 je charakteristická akonitázová aktivita, která klesá při nedostatku železa a tím se zvyšuje afinita IRP1 k mRNA např. TfR [65]. Zvýší se stabilita celé TfR mRNA vedoucí ke zvýšení syntézy receptoru. IRP2 se nachází v buňkách v menší míře. U toho proteinu dochází k jeho degradaci závislé na množství železa. Mechanizmus jeho působení ještě není kompletně objasněn. Obsahuje exon bohatý na cystein, který je považován za spouštěč oxidace, ubikvitinace a proteasomální degradace závislá na hladině železa. V případě nedostatku železa nedochází k odbourávání IRP2 pomocí buněčných proteáz [66], jeho hladina se zvyšuje a tím i jeho vazba na mRNA. Některé publikace však tuto teorii zpochybňují [67; 68]. Byly identifikovány další látky ovlivňující degradaci IRP2, např. hem [69], 2-oxoglutarát dependentní oxygenázy [67]. Na úrovni buňky byla vedle JAK/STAT signální dráhy popsána dráha BMP/Smad, která reguluje expresi hepcidinu. Tato kaskáda je považována za hlavní regulační osu transkripce hepcidinu [39]. Ovlivňuje metabolismus železa hlavně svým působením v játrech na úrovni hepatocytu. BMP je skupina molekul regulujících několik důležitých procesů jako embryogenezi, tvorbu a remodelaci kostí a hojení tkání. Zdrojem BMP by v játrech mohly být buňky intersticia a stelární buňky. Hlavní roli hraje BMP6, ale v menší míře působí stimulačně na tvorbu hepcidinu i ostatní typy BMP2, 4, 5, 7, 9 [70]. Receptory pro BMP jsou dva typy serin/threonin kináz. Receptory typu I se nazývají Alk2 a Alk3 (z angl. activin receptor-like kinase) [71], receptory II typu ActIIA (z angl. activin receptor typ IIA) a BMPRII (z abl. bone morphogenetic protein receptor II) [70]. Interakce BMP s jejich receptory vede k aktivaci receptorových kináz, následné fosforylaci

komplexu

SMAD1/5/8-SMAD4

(z

angl.

small

mothers

against

decapentaplegic), který je translokován do jádra, kde aktivuje promotor HAMP genu (z angl. hepcidin antimicrobial peptide). BMP6 jako ligand v kombinaci se svým koreceptorem

hemojuvelinem

(HJV),

glykosylfosfastidylinositolem

ukotveným

membránovým proteinem, spouští transkripci hepcidinu [39; 72]. Při mutaci HJV dochází k rozvoji juvenilní hemochromatózy, onemocnění z přetížení organismu železem. Matriptáza-2 (MT-2, TMPRSS6, z angl. transmembrane protease serine 6) a neogenin - 24 -


Teoretická část

jsou další molekuly, které ovlivňují syntézu hepcidinu a modulují tvorbu hemojuvelinu na povrchu membrán buněk [73; 74]. Při nedostatku železa v organizmu je výskyt TMPRSS6 na membráně buněk zvýšen [73]. Tento enzym patří mezi hlavní negativní transkripční faktory pro hepcidin. Svou aktivitou snižuje výskyt HJV na plazmatické membráně [75]. Byla zjištěna bodová mutace Ala736Val v genu pro TMPRSS6, která in vitro ovlivňila expresi hepcidinu a její výskyt se potvrdil i v italské populaci [76]. Zvýšena exprese TMPRSS6 byla zjištěna u hypoxie [77; 78], akutního alimentárního nedostatku železa [79] a po injekční aplikaci BMP6 [80].

3. Patologické stavy při porušení homeostázy železa. Patologické stavy způsobené nerovnováhou metabolizmu železa jsou jedny z nejčastějších onemocnění člověka. Jejich projevy se nejčastěji rozvíjí velice pomalu a často mohou způsobovat jen malé potíže. U pacientů trpících jiným primárním onemocněním může velice výrazně snižovat kvalitu života. Proto je důležité porozumět metabolizmu železa a tato onemocnění léčit. Nerovnováha se projevuje v obou směrech, tzn. při nedostatku (deficitu), tak při jeho nadbytku.

3.1 Deficit železa. Protože se železo nejvíce podílí na tvorbě erytrocytů, projevuje se jeho nedostatek železa v lidském organizmu nejčastěji anémií. Anémie je chorobný stav charakterizovaný sníženou hladinou hemoglobinu ve vztahu k věku, pohlaví a rase. Jelikož je železo naprosto nezbytné k tvorbě hemoglobinu, jeho nedostatečný přísun do erytroblastů vede ke snížení produkce erytrocytů. 3.1.1 Sideropenická anémie. Nejstarší onemocnění spjaté s nedostatkem železa je chloróza, dříve rovněž nazývané „onemocnění panen”. Postihovalo adolescentní dívky a projevovalo se bolestmi hlavy, palpitacemi, ztrátou chuti k jídlu a zvýšenou únavou. Vyskytovalo se do 20. let dvacátého století [81]. Thomas Sydenham v druhé polovině 17. století řadil toto onemocnění mezi hysterické poruchy a léčil jej pilulkami se sulfátem železa a stejným způsobem bylo léčeno i o 150 let později Blaudem. Dnes by toto onemocnění spadalo do skupiny sideropenická anémie (SA, IDA z angl. iron deficiency anemia), ale již se v takové míře nevyskytuje. Anémie z nedostatku železa je nejčastějším typem anémie u dětí. Nejvíce se - 25 -


Teoretická část

na snížení hladiny Fe podílí nedostatečný příjem železa stravou. Důležitá je skladba stravy s dostatečným obsahem živočišné složky, ale důležitou roli hrají i faktory podílející se na vlastním vstřebávání. Nedostatek železa může způsobit rovněž zvýšená potřeba železa např. v období rychlého růstu organizmu a v těhotenství (Tab. 5). U žen v produktivním věku dochází k fyziologickým ztrátám železa menstruační krví. Zdravé ženy tak mohou ztrácet až 80 mg železa během jednoho menstruačního cyklu. Konečné množství takto eliminovaného železa je pro každou ženu jiné a liší se i mezi jednotlivými regiony. Hormonální antikoncepce redukuje množství menstruačního krvácení a naopak nitroděložní tělíska krvácení zvětšují. Pří dárcovství krve dárce přichází o přibližně 250 mg železa na jednu transfuzní jednotku. Bylo zjištěno, že u části dárců dochází při frekvenci 5 darování za rok ke snížení zásobního železa. Proto se pacientům, kteří darují krev více jak 1–2-krát ročně, doporučuje přidat substituční preparáty železa. Krevní odběry během vyšetření u lékaře mohou být důležitou příčinou úbytku zásobního železa, především u malých dětí, chronicky nemocných a hospitalizovaných pacientů. Pacienti hospitalizovaní na jednotkách intenzivní péče ztrácí až 4-krát větší množství železa než pacienti na standardních odděleních. Nutná vyšetření tak ještě prohlubují deficit železa a rozvíjející se anémii, která často chronická onemocnění doprovází.

- 26 -


Teoretická část

Tab. 5 Příčiny nedostatku železa v organizmu. Rozvoj nedostatku železa trvá delší dobu a úbytek železa nastupuje v několika fázích. Nejprve dochází k vyčerpání zásobního železa, následně klesá hladina cirkulujícího železa. V důsledku snížené dostupnosti železa z krevního oběhu dochází ke snížené hemoglobinizaci erytrocytů tvořených v kostní dřeni. V poslední fázi pak dochází ke snížení hladiny hemoglobinu a hematokritu, kdy kostní dřeň tvoří malé erytrocyty (mikrocytóza) s nízkou koncentrací hemoglobinu (hypochromie). Příznaky sideropenické anémie vychází z nedostatku erytrocytů zajišťujících okysličování tkání. Pacient je bledý, unavený, se sníženou výkonností (anemický syndrom). Pro sideropenickou anémii je typický výskyt následujících symptomů: cheilosis (fisury koutků úst) a koilonychia (nehty ve tvaru hodinového sklíčka). Diagnostika sideropenické anémie se provádí pomocí klinického vyšetření a laboratorních testů (viz níže). Vzácně se vyskytující závažné stavy s výrazným snížením hladiny hemoglobinu a nestabilitou krevního oběhu mohou vyžadovat transfúzi a event. intravenózními preparáty železa. Ve většině případů se však jedná o mírnou formu anémie, která může být léčena orálními preparáty železa a změnou dietních návyků nebo orálními preparáty železa. 3.1.2 Anémie chronických chorob.

- 27 -


Teoretická část

Anémie chronických chorob (ACD, z angl. Anemia of Chronic Diseases, dnes používanější termín Anaemia of Inflammation) ) často doprovází řadu onemocnění, jako jsou záněty, infekce, tkáňové poškození, maligní onemocnění, selhání ledvin, aj. Etiologie této anémie je multifaktoriální. Na patofyziologii vzniku ACD se podílí především zvýšení hladiny zánětlivých cytokinů. Snížená tvorba erytrocytů a snížená tvorba hemoglobinu je podobně jako u SA způsobena nedostatečným přísunem železa do kostní dřeně. Na rozdíl od SA jsou zásoby železa v organizmu dostatečné nebo jen mírně snížené. Toto železo je však uloženo v intracelulárním prostoru enterocytů a makrofágů a jejich výdej do krevního oběhu je omezený, jedná se o tzv. relativní deficit železa. Mechanizmus vzniku nedostatku železa byl v posledních letech do značné míry objasněn. Předpokládá se, že hlavní roli zde hraje hepcidin. Hepcidin hraje roli i ve snížené citlivosti progenitorů erytroidní řady na erytropoetin (EPO), nebo zkráceném přežívání erytrocytů. Zvýšená hladina zánětlivých cytokinů stimuluje tvorbu hepcidinu, který se váže na feroportin v enterocytech a makrofázích a redukuje tím absorpci železa ze zažívacího traktu a jeho výdej do krevního oběhu. Na sníženém výdeji železa se rovněž podílí snížená exprese feroportinu, která se vyskytuje u zánětlivých stavů. Mechanizmus vlivu zvýšené hladiny zánětlivých cytokinů (TNF-α, IFN-γ, LPS lipopolysacharidy) na expresi feroportinu nebyl dosud přesně objasněn. Enterocyty nasycené železem se postupně odlupují (deskvamují) a odchází stolicí. Makrofágy nasycené železem apoptoticky zanikají. Velice pravděpodobně se jedná o fylogeneticky velice starý mechanizmus nespecifické imunitní obrany organizmu proti infekčním onemocněním. Snížená hladina železa v krevním oběhu omezuje schopnost dělení patogenních bakterií. Ten je poté velice limitován např. v buněčném dělení, či růstu a tím se stává zranitelnější vůči mechanismům specifické imunitní obrany. Anémie chronických chorob je diagnostikována na základě klinických projevů a laboratorních vyšetření. Pacient vedle příznaků základního onemocnění může být bledý, zvýšeně unavený, dušný s hyperkinetickou krevní cirkulací. Anémie tak může zhoršit kvalitu života postiženého pacienta. Ve většině případů se však jedná o náhodný nález při vyšetřování základního onemocnění. V případě anémie chronických chorob je potřeba především léčit základní onemocnění vedoucí k tvorbě zánětlivých cytokinů. Dosud nejsou dostupné léky ovlivňující

- 28 -


Teoretická část

metabolizmus železa na úrovni hepcidinu a feroportinu. Proto hlavním léčebným postupem zůstává symptomatická léčba pacienta zaměřující se na jeho klinické potíže. U mírných forem se podávají preparáty železa. Jelikož je vlivem zvýšené hladiny hepcidinu omezeno vstřebávání ze zažívacího traktu, jsou vhodnější preparáty pro nitrožilní aplikaci. U závažnějšího snížení hemoglobinu je nutné podáním krevní transfúze. 3.1.3 Sideropenická anémie refrakterní na železo. Do skupiny sideropenické anémie refrakterní na železo (IRIDA, z angl. iron refractory iron deficiency anemia) jsou řazeny vzácné mikrocytární sideropenické anémie refrakterní na perorální podávání preparátů železa Podstatou je mutace genu pro TMPRSS6, který exprimuje enzym matriptázu-2. Onemocnění je autosomálně recesivně dědičné [82]. Enzym TMPRSS6 odbourává HJV, který ovlivňuje expresi hepcidinu. Při nedostatečné funkci TMPRSS6 dochází ke zvýšené tvorbě hepcidinu, k rozvoji sideropenie a anémie [75]. 3.1.4 Jiné vrozené patologické stavy vedoucí k nedostatku železa. Mutace genu pro DMT1 byla nejprve popsána na myším modelu (mk/mk) [83] poté u krys [84]. U zvířat nesoucích ztrátovou mutaci DMT1 se rozvinula hypochromní mikrocytární anémie a sideropenie. Mutace genu DMT1 u člověka byla poprvé prokázána u českého pacienta v roce 2005 [85]. Jednalo se E399D mutaci, která neovlivňovala funkci ani expresi proteinu, ale vedla k preferenčnímu vynechání exonu 12 [86]. Pacient s touto mutací měl rovněž anémii, avšak hladina Fe v plazmě byla zvýšená a lehce zvýšená byla i hladina feritinu a tyto klinické nálezy u pacientů s různými mutacemi DMT1 byly potvrzeny i dalšími vědeckými pracemi [87; 88]. Rozdíly v lidském a hlodavčím fenotypu vysvětluje Priwitzerová [89] rozdílnou stravou, která u člověka obsahuje více hemové složky. Mutace genu pro hephaestin vede ke snížení placentálního přenosu železa a ke sníženému vstřebávání železa ze zažívacího traktu. Následný deficit železa vede k rozvoji anémie během novorozeneckého období. V dospělém věku však dochází k úpravě stavu. Předpokládá se že hephaestin hraje klíčovou roli v době intrauterinního vývoje, ale jeho důležitost s věkem klesá.

- 29 -


Teoretická část

3.2 Přetížení železem. Železo, které není organismem využito pro běžnou potřebu a jehož koncentrace převýšila kapacitu transportních a zásobních proteinů pro železo, se ukládá volně do tkání. Přítomnost barvitelného železa v orgánech se latinsky nazývá hemosiderosis, jelikož se dříve myslelo, že železo pochází z krve. Železo, které není vázané na zásobní či transportní bílkoviny, vede k toxickému postižení buněk, tkání a orgánů a k poruchám jejich funkce. Zvýšené ukládání železa ve tkáni způsobuje fibrotizaci a úbytek funkční tkáně. Je to důsledek reaktivity volného železa, které snadno tvoří volné kyslíkové radikály a tím vystavuje buňky oxidativnímu stresu. Hlavními příznaky jsou rozvoj jaterní hemosiderózy a později cirhózy, diabetu mellitu („bronzový diabetes“), kardiomyopatie a hypogonádotropního hypogonadismu, artritidy aj. K patologickému ukládání vedou stavy vrozené (primární) a stavy získané (sekundární) (viz Tab. 6).

Tab. 6 Patologické stavy vedoucí k přetížení organismu železem. 3.2.1 Hereditární hemochromatóza. Hereditární hemochromatóza (HH) je skupina onemocnění charakterizovaná patologickým ukládáním zvýšeného množství železa. Jedná se o vrozené onemocnění regulace metabolizmus železa. Nejčastější příčinou abnormálního ukládání železa u hereditární chromatózy je patologická funkce HFE. Příčinou nedostatečné funkce je mutace genu pro HFE - 30 -


Teoretická část

lokalizovaného na krátkém raménku chromosomu 6 (6p22.2). Tento typ hemochromatózy označujeme jako typ 1 nebo jako HFE hemochromatózu, která se nejčastěji vyskytuje u severské populace Evropy a dříve se manifestuje u mužů. K pozdější manifestaci projevů u žen přispívají fyziologické krevní ztráty. HFE se podílí na funkci TfR1 a tedy na vychytávání

cirkulujícího

železa

buňkami.

Při

snížené

nabídce

transferinu

transferinovému receptoru dochází ke zvýšené expresi DMT1, které na luminální membráně enterocytů zvyšuje vstřebávání železa ze zažívacího traktu. Do druhé skupiny hemochromatóz patří juvenilní hemochromatóza (HH typ 2A a 2B). U obou typů je narušen regulační metabolizmu železa. Jako první byly identifikovány mutace genu pro HJV, vedoucí k rozvoji hemochromatózy typu 2B [90]. U typu 2A byl identifikován genetický defekt genu pro hepcidin [91]. Dochází zde ke snížení hladiny či funkce hepcidinu, který reguluje vstřebávání ze zažívacího traktu a výdej železa z makrofágů. Typické je zvýšené vstřebávání železa ze zažívacího traktu a výskyt makrofágů neobsahujících žádné železo. Příznaky přetížení železem se projevují rychleji a jsou obvykle vážnější, než v případě HH typu 1. Rozvíjí se především kardiomyopatie, pankreatopatie se sníženou glukózovou tolerancí a hypogonadismus. Hepatopatie se vyskytuje méně častěji. Ve vzácných případech je popisována mutace genu pro TfR2 − hemochromatóza typu III. Klinické příznaky se podobají příznakům HH typu 1. Feroportinová nemoc (ferroportin disease) neboli hemochromatóza typu IV je syndrom zahrnující vysokou hladinu feritinu, často normální nebo mírně zvýšenou volnou vazebnou kapacitu pro železo a zvýšené ukládání železa převážně v makrofázích [38]. Byla identifikována autozomálně dominantně dědičná mutace FPN. U mutace C326S je narušena vazba hepcidinu na FPN. Hladina hepcidinu je proto u tohoto typu hemochromatózy zvýšená [92]. 3.2.2 Jiné patologické stavy doprovázené přetížením železem. Anémie s nadbytečným ukládáním železa, mezi které patří thalessemia major, sideroblastická anémie, chronické hemolytické anémie, jsou častou sekundární příčinou přetížení organizmu železem. Diamondova - Blackfanova anémie (DBA) je charakterizována sníženou erytropoézou a zvýšenou apoptózou erytrocytů. Podstatou

- 31 -


Teoretická část

onemocnění jsou mutace ribosomálních proteinů. Snížená tvorba erytrocytů je spojena s nutností opakovaných transfúzí, které vedou k nadměrnému přísunu Fe do organizmu. U těchto pacientů byla zjištěna zvýšená hladina feritinu a snížená saturace transferinu. Rovněž byla prokázána vysoká hladina hepcidinu. Dle Pospíšilové (2014) je u pacientů s DBA poměr hepcidin-feritin, který charakterizuje supresi tvorby hepcidinu ve vztahu k přetížení železem, u pacientů závislých na transfúzích vyšší než u pacientů s beta thalasemií major závislých na transfúzích. U DBA pacientů je tedy erytroidní suprese výraznější. Rovněž chronická jaterní onemocnění, např. hepatitida C, alkoholická cirhóza, apod., mohou způsobit nadbytečné ukládání železa. V subsaharské Africe byl zjištěn častější výskyt přetížení organizmu železem, než v jiných regionech světa. Svou roli zde údajně hraje konzumace místního piva, které je skladováno v ocelových sudech. Obsah železa v takovém pivě je asi 80mg/l. Ne všichni obyvatelé však trpí přetížením železa. Proto byla snaha objevit vrozené genetické predispozice. Bylo identifikováno několik mutací feroportinu, které mají různý dopad na pacienta. Pacienti mohou mít podobné příznaky jako u HH typu 1 a je u nich až 3-krát vyšší riziko rozvoje karcinomu jater než u obyvatel bez přetížení železem [93]. 3.2.3 Sekundární přetížení železem. U pacientů vyžadujících celoživotní substituci krevními transfúzemi dochází k přetěžování organizmu železem. Každou transfúzní jednotkou se do organizmu dodá 200–250 mg železa. Jelikož organizmus nemá efektivní mechanizmus k vylučování nadbytku železa a jelikož u těchto pacientů často není efektivní erytropoéza, dochází k ukládání tohoto železa do makrofágů. Jakmile množství takto získaného a vstřebaného železa překročí absorpční schopnost monocyto-makrofágového systému, dochází k ukládání železa do ostatních orgánů a k narušení jejich funkce. U pacientů léčených opakovanými krevními transfúzemi je proto léčbou volby zvýšené hladiny železa podávání chelátorů (např. deferoxamin , deferipron / Ferriprox®, deferasirox / Exjade®) [94]. Tyto látky mají schopnost vychytávat volné železo z krevního oběhu, jsou však někdy zatíženy nežádoucími účinky (např. bolesti břicha, nauzea, zvracení) [95].

- 32 -


Teoretická část

4. Vyšetření metabolizmu železa. Vyšetření laboratorních parametrů metabolizmu železa je důležité neinvazivní vyšetření pacienta, které může poskytnout základní informace nezbytné pro diferenciální diagnostiku. Mezi základní vyšetření patří stanovení krevního obrazu a stanovení železa v séru, celkové vazebné kapacity pro železo, feritinu a solubilního transferinového receptoru. Specializovaná vyšetření zahrnují molekulárně genetická vyšetření mutací jednotlivých biomolekul železového metabolizmu Fe, neinvazivní měření obsahu železa ve tkáních (sonografické vyšetření, magnetická rezonance), případně další invazivní vyšetření jako je punkce kostní dřeně a biopsie jater.

4.1 Panel základních laboratorních vyšetření. 4.1.1 Krevní obraz, diferenciální rozpočet a retikulocyty. Vyšetření krevního obrazu může podat základní informaci o typu anémie, hemoglobinizaci erytrocytů. Jednotlivé paramtery (Hb, MCV, MCH, počet erytrocytů, Htk, počet retikulocytů) pomáhají upřesnit diferenciálně diagnostickou rozvahu. K přesnému zařazení anémie je však ve většině případů potřeba dalšího vyšetření, především výše uvedených parametrů metabolizmu železa. 4.1.2 Hladina železa v séru. Vyšetření Fe-S (sérové hladiny železa) je součástí základního vyšetření. Vždy je však potřeba vyšetřit všechny parametry. Samotné vyšetření hladiny železa nevypovídá o aktuálním stavu metabolizmu železa. Může být snížená u deficitu železa, při právě probíhajících infekcích a může se měnit v průběhu dne. Norma u žen je 6,6–26 µmol/l u mužů 10,6–28,3 µmol/l. 4.1.3 Celková vazebná kapacita pro železo. CVK (TIBC, celková vazebná kapacita pro železo) označuje test vazebné kapacity krve pro železo. Tato hodnota nepřímo měří hladinu transferinu, tedy schopnost krve vázat volné železo. Norma je 2,5–3,7 mg/L. 4.1.4 Volná vazebná kapacita pro železo.

- 33 -


Teoretická část

VVK (UIBC, volná vazebná kapacita pro železo) je odrazem potřeby organizmu pro železo. Zvýšená hladina CVK svědčí pro nedostatek železa např. u sideropenické anémie, snížená hladina naopak signalizuje jeho dostatek, či nadbytek, např. u přetížení organizmu železem. Norma je u žen 15–50 % a u mužů 20–50 %. Počítá se ze vzorce : FeVK = TIBC – Fe-S. 4.1.5 Feritin. Hladina sérového feritinu koreluje s hladinou zásobního železa v organizmu. Je zvýšená u zvýšeného ukládání železa do zásob, např. u HH, ale i u ACHN. Jelikož je feritin reaktantem akutní fáze, je zvýšený i u zánětů. Snížený je u deficitu železa, např. u nedostatečného dietního příjmu. Norma u žen je 13–150 µg/l a u mužů 30 – 400 µg/l. 4.1.6 Solubilní transferinový receptor. sTfR (solubilní transferinový receptor) je dnes považován za velmi důležitý běžně dostupný marker deficitu železa v organizmu, vyjadřuje aktuální potřebu železa v erytroidních buňkách a nepřímo také aktivitu erytropoézy. Je součástí membránového receptoru pro transferin. Nedochází-li k vazbě těchto molekul, jako v případě deficitu železa, je receptor uvolněn do krevního řečiště. Jeho zvýšená hladina se tedy vyskytuje u stavů s deficitem železa, ale také u hemolytických anémií. Norma u žen je 1,9–4,4 mg/l a u mužů 2,2–5 mg/l. 4.2 Specializovaná vyšetření. 4.2.1 Orální absorpční test pro železo. Stanovení absorpční křivky pro železo se provádí u pacientů se sideropenickou anémií se špatnou odpovědí na léčbu perorálními preparáty železa. Test se provádí změřením hladiny železa ráno nalačno těsně před podáním orálního preparátu železa. Podává se přibližně 60 mg sulfátu železa. Mezi 1. a 2. hodinou po podání se pak opět změří sérová hladina železa. Stoupne-li o více jak 1 mg /l je absorpce železa ze zažívací traktu považována za normální. V opačném případě dochází ke snížené absorpci ze zažívacího traktu a léčba orálními preparáty není indikována. 4.2.2 Obsah železa v kostní dřeni.

- 34 -


Teoretická část

Vyšetření obsahu železa v kostní dřeni (Fe-BM, BMIS, bone marrow iron stores) se provádí pomocí vyšetření barvitelného železa ve dřeni. Odebírá se kostní dřen punkcí ze sternální kosti nebo z lopaty kosti kyčelní a provádí se nátěr na sklíčko. Toto sklíčko je nabarveno pruskou modří (Perlsovo barvení), která se váže specificky na železo. Toto vyšetření přináší důležitou informaci o množství železa dostupného pro tvorbu erytrocytů. Norma je 20 – 30 %. U sideropenie a sideropenické anémie je barvitelné železo snížené a u přetížení železa bývá zvýšené. U stavů s porušeným vychytáváním železa normoblasty je železo ve dřeni přítomno v Mo-Ma systému, ale prekurzory erytrocytů je neobsahují. 4.2.3 Biopsie jater a histologické vyšetření. Játra jsou nejcitlivějším indikátorem hromadění železa v organizmu. Biopsie jater a histologické vyšetření se provádějí převážně k průkazu hereditárních hemochromatóz a stavů se sekundárním přetížením organizmu železem. Z odebraných vzorků tkáně se provádí histologické vyšetření, které pomocí histochemického barvení může prokázat nadměrné ukládání železa a současně je vhodné vyšetřit obsah železa v sušině jaterní tkáně.

4.3 Experimentální metody. 4.3.1 Měření hladiny hepcidinu. Měření hladiny hepcidinu doposud zůstává na experimentální úrovni. Provádí se metodami proteomické analýzy a metodou imunochemické analýzy (ELISA). Definitivní určení normální hladiny zdravé populace, či určení rozdílu mezi mužskou a ženskou populací, eventuálně dětskou populací zůstává stále neurčeno. Hepcidin bývá zvýšen u chronických zánětlivých stavů, u infekcí, u maligních onemocnění, ale i u vrozených poruch vedoucích k nadměrné tvorbě hepcidinu. Wu et al. měřili hladiny hepcidinu v séru u novorozenců s pozdní novorozeneckou sepsí a zjistili, že u septických dětí je vzestup hladiny hepcidinu čtyřnásobný [96]. Podobně Cizmeci et al. prokázal zvýšené hladiny hepcidinu v krvi pupečníkové krve i novorozenců s časnou novorozeneckou sepsí [97]. Snížená hladina se vyskytuje u anémií z nedostatku železa, u deficitů cirkulujícího a zásobního železa. Jeho hladina může rozlišit SA od ACHN a predikovat účinnost substituční léčby orálními preparáty železa. 4.3.2 Molekulárně genetická vyšetření HFE, HJV, TfR2 a dalších. - 35 -


Teoretická část

Nejedná se o rutinně prováděná vyšetření k identifikaci příčin vrozených metabolických onemocnění, u kterých nebyla prokázána příčina běžnými metodami. Těmito metodami se rovněž vyšetřují genetické predispozice u rodin postižených stejným onemocněním vedoucích k přetížení organizmu železem nebo k jeho nedostatku.

5. Metabolizmus železa u nádorových onemocnění. U několika nádorových onemocnění byla prokázána zvýšená hladina hepcidinu. Jedná se o karcinom prsu, cholangiokarcinom, karcinom skvamózních buněk dutiny ústní, kolorektální karcinom, non-Hodgkinský lymfom, nádory mozku, malobuněčný karcinom plic, mezoteliom, mnohočetný myelom, nádory ovarií, jater, prostaty a ledvin a u leukémie. U nádoru ledvin byla prokázána výrazně zvýšený obsah železa v nádorové tkáni [98; 99]. Železo působí jako kofaktor katalytické aktivity HPH (HIF prolylhydroxyláze 5) a jako stavební prvek nádorové buňky. Bylo zjištěno, že zvýšená exprese mRNA hepcidinu v nádorové buňce zvyšuje metastatický potenciál nádoru, proto by měření exprese mohlo mít prognostický význam pro riziko vzniku metastáz nádoru. Vztah k histologii tumoru nebyl potvrzen [99]. Hepatocelulární karcinom patří mezi agresivně rostoucí tumory jater. Zvýšeně se vyskytuje u pacientů s hemochromatózou, thalasemií nebo sideroblastickou anémií. U tohoto nádoru byla prokázána potlačená produkce mRNA hepcidinu [100]. Snížená exprese byla dána do souvislosti s porušenou expresí p53, která se často vyskytuje u pacientů s hemochromatózou. Nádory mozku jsou rovněž cílem výzkumu metabolizmu železa. Neuron je buňka vysoce energeticky a metabolický náročná a železo nezbytně ke své bezchybné funkci potřebuje. U různých neurodegenerativních chorob, u např. Alzheimerovy a Parkinsonovy choroby, byla zjištěna vysoká hladina železa [101]. Růst gliomů je spojen s neovaskularizací. Zvýšená hladina HIF (hypoxia inducible factor) u neovaskularizace zvyšuje expresi proangiogenních faktorů, kam spadá i transferin a TfR1 [102]. Zvýšená exprese hepcidinu byla prokázána v regionů mozku, nejvíce v kortexu a předním thalamu. U nádorů mozku je však v porovnání se zdravou tkání exprese hepcidinu snížena.

- 36 -


Teoretická část

Hladina hepcidinu byla měřena pro sledování terapeutické odpovědi u pacientů s nádorovým onemocněním. U kolorektálního karcinomu však hladina hepcidinu nekoreluje s tíží anémie. Určitou prediktivní hodnotu hepcidinu prokazují studie u anemických pacientů se solidními tumory. Tito pacienti byli léčeni erytropoetinem, který snižoval expresi hepcidinu a tím zvyšoval absorpci železa z GIT [103-105].

6. Nové terapeutické možnosti ovlivnění metabolizmu železa. Nedostatek a nadbytek hepcidinu hraje dle nových poznatků roli v rozvoji poruch metabolizmu železa. Proto by antagonisté a agonisté hepcidinu mohli přispět k léčbě těchto běžných onemocnění. Zvířecí modely potvrzují teorii, že by hepcidin mohl být prostředkem k léčbě. Na myším modelu reprezentujícím hereditární hemochromatózu člověka bylo prokázáno, že ve skupině myší zvýšeně exprimujících hepcidin nebyla jaterní tkáň přetížena železem [106]. U modelu s β-thalasemií intermedia mírně zvýšená exprese hepcidinu vedla ke snížení zatížení jater železem a rovněž příznivě ovlivnila erytropoézu [107]. Mírné snížení hladiny železa vedlo k omezení tvorby nerozpustných komplexů vážících se na cytoplazmatickou membránu a ke snížení tvorby kyslíkových radikálů. U zvířecích modelů s anémií chronických chorob bylo v případě myší s vyřazenou expresí hepcidinu pozorováno zmírnění anémie a rychlejší úzdrava v porovnání s wild-type linií [108].

6.1 Agonisté hepcidinu. Léčebné možnosti přetížení organizmu železem jsou v současné době limitovány. Opakované venepunkce jsou indikovány u hereditární hemochromatózy. Ne všemi pacienty je tato léčba dobře tolerována. U léčby β-thalasemie jsou používány chelatační přípravky, které jsou zatíženy častými nežádoucími účinky [109]. Jelikož je u těchto onemocnění snížená hladina hepcidinu, dochází k rozvoji přetížení železem. Výzkum je zaměřen na látky mající stejný účinek jako hepcidin a na látky stimulující tvorbu hepcidinu. Samotný hepcidin nemá vhodné farmakologické vlastnosti. Syntéza bioaktivní formy je složitá a nákladná a jeho poločas v krevním oběhu je krátký v řádu několika minut [110]. Agonisté na peptidové bázi, tzv minihepcidiny, byli navrženi, aby se byli schopni vázat na vazebné místo pro hepcidin na feroportinu. Synteticky byli upraveni, aby jim vzrostla - 37 -


Teoretická část

biologická aktivita. Byly použity syntetické aminokyseliny, aby byly tyto látky odolnější proti proteázám. Některá hepcidinová analoga byla stejně účinná jako nativní hepcidin a měla delší poločas účinku [111]. Na myším modelu byl studován účinek minihepcidinu PR65. Byl studován preventivní a léčebný účinek. U myší s vyřazenou expresí hepcidinu byl subkutánně podáván PR65 a kontrolní roztok. Tyto myši byly zatíženy dietou obohacenou o železo. Narozdíl od kontrolního roztoku bylo prokázáno, že podávání PR65 brání přetížení jater železem. Rovněž byla snížený obsah železa v myokardu [111]. Léčebný účinek byl studován na myších s vyřazenou expresí hepcidinu a u těchto myší bylo rozvinuto přetížení železem. Po 2-týdenní aplikaci PR65 došlo pouze k částečné redistribuci železa do sleziny, efekt byl ale výrazně menší [111]. Látky, které stimulují tvorbu hepcidinu, cílí TMPRSS6 a BMP osu. Nai a kol. [82] prokázali, že homozygotní inaktivace TMPRSS6 u myší s thalasemií vede ke zvýšení hladiny hepcidinu. To vedlo ke zlepšení vstřebávání a využití železa a ke zvýšené erytropoéze. Ke snížení hladiny TMPRSS6 jsou zkoušeny RNA metody. Guo a kol [112] studovali vliv ASO (anti-sense nucleotides) působícího na úrovni mRNA pro TMPRSS6. Schmidt a kol [113] studovali vliv siRNA (small interfering RNA) ve vazbě na lipidové nanočástice. Oba tyto přístupy mají velmi podobné výsledky ovlivnění metabolizmu železa, ve smyslu snížení obsahu železa v játrech a zvýšení ve slezině. U lidí s onemocněními spojenými s nadměrným ukládáním železa by ovlivnění TMPRSS6 mohlo mít významný terapeutický přínos. Dále byl zkoumán vliv antagonistů BMP6 u stavů spojených s přetížením železa. BMP6 je u myší hlavním regulátorem transkripce hepcidinu. Corradini [114] aplikovala myším s HFE -/- BMP6 2-krát denně po dobu 10ti dní. Došlo ke zvýšení exprese mRNA hepcidinu, avšak obsah železa v játrech, myokardu a pankreatu se nesnížil. Je pravděpodobně nutná dlouhodobější aplikace BMP6 a sledování. Při delším než 2 týdenním podávání však u myší dochází ke vzniku peritoneálních kalcifikací.

6.2 Antagonisté hepcidinu. Zvýšená hladina hepcidinu byla prokázána u anémie při zánětlivých, nádorových onemocněních u chronického onemocnění ledvin a u IRIDA (tzn. iron-refractory iron deficiency anemia). Tato onemocnění jsou léčena erytropoetinem a intravenózním

- 38 -


Teoretická část

podáváním železa. Vysokodávkovaná léčba erytropoetinem je však zatížena četnými nežádoucími účinky [115]. Snížení hladiny hepcidinu se stalo předmětem výzkumu, který se zaměřuje na snížení jeho produkce, na jeho přímou neutralizaci, na ovlivnění vazby hepcidinu na feroportinu a na tvorbu feroportinu či jeho endocytózu. Zlepšení onemocnění a snížení produkce hepcidinu by mohlo být dosaženo ovlivněním regulačních os, mRNA hepcidinu, zánětlivého procesu primárního onemocnění, regulační osy erytropoézy a genovou terapií. Snížení tvorby BMP vede ke snížení produkce hepcidinu. Je známo, že heparin váže BMP [116], proto Poli a kol studovali vliv heparinu na tvorbu hepcidinu a prokázali jeho sníženou expresi na myším modelu po sedmidenní aplikaci heparinu [117]. Tito vědci dokonce připravili látky heparinu podobné, ale bez antikoagulačního účinku [118]. U pacientů došlo ke snížení hepcidinu až o 85% a k nárůstu sérové hladiny železa a snížení volné vazebné kapacity transferinu. Dále bylo prokázáno snížení tvorby hepcidinu při použití solubilního fragmentu HJV (sHJV.Fc). U tohoto fragmentu bylo potvrzeno široké spektrum inhibice BMP [119]. RNA metody cílí snížení exprese mRNA hepcidinu. U krys s anémií zánětlivých chorob bylo podáváno siRNA TfR2, což vedlo k významnému snížení mRNA hepcidinu [118]. Ovlivnění zánětlivého procesu by mohlo vést ke snížení hepcidinu. Zkoumá se vliv anticytokinů na hladinu hepcidinu. Monoklonální protilátka proti receptoru IL-6 (anti-IL6R) rychle snižuje u zvířecího modelu jeho hladinu [120]. Mezi další zkoumané látky patří antiTNF-α [121] a STAT3 inhibitor AG490 [79]. Nežádoucím účinkem těchto anti-cytokinů je však zvýšené riziko infekce, proto je jejich užití limitováno. Genová terapie je zkoušena ve formě siRNA nebo antisense oligonukleotidů cílících mRNA hepcidinu. Tyto látky se zvýšeně ukládají v játrech, kde probíhá nejvýznamnější část exprese hepcidinu [118]. K neutralizaci hepcidinového peptidu jsou studovány monoklonální protilátky, antikaliny a spiegelmery. Na myším modelu byla použita monoklonální protilátka proti hepcidinu (anti-hepcidin mAb) u anémie zánětlivých chorob a její užití vedlo k signifikantnímu snížení rezistence těchto myší na léčbu EPO [122]. Nyní je u pacientů s anémií při základním názorovém onemocnění testována monoklonální protilátka proti hepcidinu lidského původu (LY2787106)[118]. Antikaliny mají schopnost vázat a

- 39 -


Teoretická část

vychytávat biologické ligandy. Cíleně navržený antikalin PRS-080 má schopnost vázat hepcidin, čímž u studovaných opic zvyšoval mobilizaci železa z tkání a tím i jeho sérovou hladinu [118]. Spiegelmery jsou oligonukleotidy podobné RNA. Svou strukturou jsou odolné vůči nukleázám, což zajištuje jejich stabilitu v krevním oběhu. Rovněž antihepcidinový spiegelmer NOX-H94 byl testován na opicích, kde jeho podávání zabránilo rozvoji anémie zánětlivých chorob [123]. Ke snížení účinku hepcidinu jsou studovány i látky, které ovlivňují vazbu tohoto peptidu na feroportin. Jednou z takových látek je fursultiamin, který působí jako antagonista hepcidinu. Má velmi krátký biologický poločas a v in vivo pokusech nevedl k ovlivnění sériové hladiny železa u myší [124]. Ke snížení účinku hepcidinu teoreticky dochází i při zabránění endocytózu feroportinu po jeho spojení s hepcidinem. Rovněž podpoření produkce feroportinu by mohlo vést ke snížení účinku hepcidinu. Ve vývoji je několik takových látek, které zatím čekají na in vitro a in vivo testy.

7. Shrnutí teoretické části. Metabolizmus železa je jednou z nejdůležitějších součástí funkčních systémů lidského organizmu. Je to složitý proces, který spočívá v přísně regulované rovnováze docílené vzájemnou souhrou důležitých proteinů cestou signálních drah ovlivňujících expresi hepcidinu. Tento komplex velmi citlivě a efektivně reguluje příjem železa dle aktuálních potřeb organizmu. V průběhu lidského života se organizmus vyvíjí a jeho potřeba železa se mění. V období růstu organizmu je potřeba železa zvýšená a pomocí uvedených regulačních mechanizmů je lidské tělo schopno zvýšit příjem a dostupnost železa pro akcelerované chemické a biologické procesy. Při patologii jednotlivých složek řídícího systému dochází k narušení rovnováhy železa v organizmu. Nepříznivý je jak jeho nedostatek, který vede k rozvoji řady patologických stavů narušujících správnou funkci organizmu, tak jeho nadbytek vedoucí k poškozování důležitých orgánů svým toxickým účinkem. Postupné objevování molekul účastnících se metabolizmu železa přináší nové poznatky o řadě chorob. Hepcidin byl navíc dáván do souvislosti s patofyziologií řady dalších chorob, např. zánětu jater a cirhózy [125], aterosklerózy a infarktu myokardu [126; 127], malárie [128] a septického šoku [129]. Nové poznatky budou přínosem k budoucímu terapeutickému přístupu u běžných i vzácných onemocnění. Výzkum v této oblasti

je

velmi

aktivní,

progresivní

- 40 -

a

do

budoucna

velmi

přínosný


Experimentální část

Experimentální část. 1. Měření hladiny hepcidinu u dětských pacientů s nespecifickými střevními záněty pomocí ELISA metody. Od roku 2008 byly k dispozici první komerčně dostupné ELISA kity (z angl. enzymelinked immunoessay analysis) k měření hepcidinu. Na olomouckém pracovišti je hepcidin studován od roku 2009. První výzkumná práce byla zaměřena na dětské pacienty s nespecifickými střevními záněty (IBD, z angl. inflammatory bowel disease). Cílem této práce bylo v první řadě stanovit výskyt anémie v souboru dětí s IBD na podkladě analýzy vybraných hematologických a biochemických parametrů. Dalším cílem této práce bylo stanovení hladiny hepcidinu v plasmě nově komerčně dostupnou metodou ELISA v podskupině pacientů s IBD, srovnání hladin hepcidinu se zdravou dětskou populací a zhodnocení významu měření hladiny hepcidinu pro diagnostiku anémie doprovázející IBD.

1.1 Pacienti a metody. Soubor pacientů tvořilo 133 dětí s IBD (46 pacientů s UC a 87 s CD) diagnostikovaných v letech 2005 – 2011. Poměr děvčat a chlapců byl 1:1,56, věkové rozmezí bylo od 4 let do 18 let + 365 dní (medián 14 let). Pacienti byli diagnostikováni na základě Portských kritérií publikovaných v roce 2005. Aktivita onemocnění byla hodnocena pomocí indexů aktivity. U pacientů s CD byla aktivita hodnocena na základě Pediatric Crohn´s Disease Activity Index (PCDAI). Tento index posuzuje aktivitu dle klinických příznaků (bolest břicha, četnost stolic, aktivita pacienta), laboratorních hodnot (hematokrit, sedimentace erytrocytů, hladina sérového albuminu), antropometrických dat (hmotnost, růstová rychlost) a fyzikálního vyšetření pacienta [130; 131]. Pacienti s hodnotou PCDAI pod 10 bodů jsou v klinické remisi, mezi 11 a 30 mají pacienti lehkou formu onemocnění a nad 30 mají středně těžkou až těžkou formu onemocnění. U pacientů s UC byl použit Pediatric Ulcerative Colitis Activity Index (PUCAI), který vychází z hodnocení klinických potíží pacienta (počet stolic za den, přítomnosti krve ve stolici, bolesti břicha, noční stolice, aktivita pacienta) [132]. Pacienti s hodnotou PUCAI < 10 body byli v remisi onemocnění, mezi 10 a 30 body se jedná o malé či střední postižení a u

- 41 -



pacientů s indexem > 65 bodů hodnotíme onemocnění jako velmi závažné. Hodnocení aktivity onemocnění bylo prováděno v den odběru biologického materiálu. Vzorky krve použité k výše uvedeným laboratorním vyšetřením byly odebrány při pravidelných klinických kontrolách pacientů v gastroenterologických ambulancích. Po zavedení metody ELISA k vyšetření hladin hepcidinu byly v letech 2009 – 2011 odebrány vzorky krve u 56 pacientů s IBD (36 pacientů s CD a 20 pacientů s UC). Výsledky vyšetření hladiny hepcidinu pacientů s IBD byly porovnány se skupinou zdravých kontrol (n = 32) ve věku 1 – 17 let (medián 5 let), do které byli zahrnuti dětští pacienti vyšetření v rámci předoperační přípravy před plánovaným chirurgickým výkonem. Tito pacienti neměli známky akutní infekce a netrpěli žádným onkologickým, autoimunním či hematologickým onemocněním. Znění informovaného souhlasu bylo schváleno etickou komisí LF UP v Olomouci. U všech pacientů byl v certifikované laboratoři (ISO 9001:2000) v automatickém analyzátoru vyšetřen krevní obraz se zaměřením na zhodnocení charakteristik erytrocytů – hladiny hemoglobinu (Hb), hematokritu (HTC), počtu erytrocytů (ERY), středního objemu erytrocytu (MCV), koncentrace Hb v erytrocytu (MCH) a šíře distribuce erytrocytů (RDW). Standardními biochemickými metodami byly vyšetřeny parametry metabolizmu železa – hladina železa v séru (Fe-S), feritin, solubilní transferinový receptor (sTfR), a vybrané markery zánětu – interleukin-6 (IL-6) a C-reaktivní protein (CRP). Jednotlivé hodnoty vyšetřovaných parametrů byly hodnoceny podle platných norem uvedených v tab. 6 a 7.

Tab. 6 – Laboratorní normy krevního obrazu pro dětskou populaci rozdělené podle věku a pohlaví (Nathan and Oski’s Hematology of Infancy and Childhood, 7th Edition).

- 42 -



Tab. 7 – Laboratorní normy biochemických vyšetření pro dětskou populaci rozdělené podle věku a pohlaví dítěte (Nathan and Oski’s Hematology of Infancy and Childhood, 7th Edition). Plazma určená ke změření hladiny hepcidinu byla rozdělena do alikvotů, aby se předešlo opakovanému rozmrazování, a zamražena při -80°C. K měření hladiny hepcidinu byl použit komerční ELISA kit (DRG Instruments, Germany, Division of DRG International, Inc.). Parametry metody dle výrobce byly následující: norma pro hladinu hepcidinu 13,3 – 54,4 ng/ml (5 – 95 % percentil), dynamický rozsah 0,9 – 140 ng/ml, senzitivita této metody byla stanovena na 0,9 ng/ml. Reprodukovatelnost metody je stanovena pomocí koeficientu variace v rámci kitu na 4,86 % a mezi kity na 11,42 %. Výsledná absorbance byla změřena při vlnové délce 450 ± 10 nm pomocí spektrofotometru Labsystems iEMS Reader MF (Labsystems Oy, Helsinki, Finland). Vzorky byly měřeny v tripletech a z naměřených hodnot absorbance byla vypočítána průměrná hodnota. K výpočtu kalibrační křivky byly použity průměrné hodnoty absorbance standardních roztoků o známé koncentraci – standard 0,00 – 3,85 – 11,50 – 23,00 – 70,00 a 140,00 ng/ml. Z rovnice kalibrační křivky byly vypočítány hodnoty koncentrace hepcidinu pro naměřenou impedanci vzorků jednotlivých pacientů. Ke statistickému zpracování naměřených hladin hepcidinu byly použity hodnoty mediánu a 95 % interval spolehlivosti. Výsledky byly zobrazeny pomocí krabicových grafů. Ke srovnávání výskytu jevů mezi jednotlivými soubory pacientů byl použit Mannův-Whitneyho test (srovnání dvou souborů) a Kruskallův-Wallisův ANOVA test (srovnání 3 souborů). Vztah mezi hladinou hepcidinu a jednotlivými výsledky - 43 -



laboratorních vyšetření byl hodnocen pomocí neparametrické korelační analýzy (Spearmanův korelační koeficient). Za statisticky významné byly považovány hodnoty p < 0,05. Statistická analýza byla provedena počítačovým softwarem Statistica (StatSoft CR s.r.o., Czech Republic).

1.2 Výsledky měření hladiny hepcidinu metodou ELISA. Výsledky vybraných parametrů krevního obrazu a metabolizmu železa v celém souboru 133 dětských pacientů s IBD (CD a UC) jsou shrnuty v tab. 8. V tabulce jsou uvedeny mediány naměřených hodnot a jejich rozptyl pro jednotlivé parametry a jsou rozděleny podle typu IBD.

Tab. 8 - Srovnání výsledků laboratorních vyšetření u celého souboru dětských pacientů rozdělených podle typu IBD. Vyšetření krevního obrazu. Prevalence anémie u dětských pacientů s IBD v populaci s vyšetřenou hladinou hepcidinu byla 47,7% (n = 56), u pacientů s UC 45,7 % (n = 25) a u pacientů s CD 46% (n = 31). Medián hladiny hemoglobinu u dívek s IBD byl 121 g/l (SD 16,6) u chlapců 123,5 g/l (SD 24,0). Mikrocytóza byla přítomna u 62,4 % pacientů s IBD. Závažná anémie s nutností podání transfúze erytrocytů se vyskytla pouze u 3 pacientů. Výsledky měření parametrů metabolizmu železa.

- 44 -



Snížená hladina železa v séru byla u 52 ze 117 pacientů (44,4 %). Snížená hladina feritinu byla zjištěna u 68 ze 116 pacientů (58,6 %). U 55 ze 109 pacientů (50,5 %) byla prokázána zvýšena hladina sTfR. U 9 z 22 pacientů (42,3 %) ze skupiny pacientů s vyšetřenou hladinou Fe-S, feritinu a sTfR byla zjištěna současně snížená sérová hladina železa, snížená hladina feritinu a zvýšená hladina solubilního transferinového receptoru (viz tab. 8). Výsledky měření hladiny CRP a IL-6. U 44 % z 58 pacientů byla zjištěna zvýšená hladina CRP. U 24 pacientů byl vyšetřen IL-6 a u 4 pacientů (17 %) byla jeho hladina zvýšena. Byla prokázána statisticky významná pozitivní korelace mezi hladinou hepcidinu a hladinou CRP (R = 0,30 a p <

0,041), viz graf 1. Výsledky měřené hladiny hepcidinu. Z důvodu nově komerčně dostupného ELISA kitu pro měření hladiny hepcidinu bylo vyšetření metabolizmu železa u posledních 56 pacientů s IBD (dívky vs. chlapci 1:1,8) doplněno o vyšetření plazmatické hladiny hepcidinu. Třicet jeden pacient trpěl Crohnovou chorobou (8 dívek a 23 chlapců) a 25 pacientů ulcerózní kolitidou (12 dívek a 13 chlapců). Medián hladiny hepcidinu u všech změřených pacientů s IBD byl 42,0

- 45 -



ng/ml, tedy v mezích normy udané výrobcem kitu (13,3 – 54,4 ng/ml). Medián hladiny hepcidinu u dívek s IBD byl 65,2 ng/ml (n = 20, SD 40,5) a u chlapců 38,3 ng/ml (n = 36, SD 26,4). U dívek je medián hladiny hepcidinu signifikantně vyšší než u chlapců (p = 0,0042). Dle typu onemocnění pak u pacientů s UC byl medián hladiny hepcidinu 42,2 ng/ml (SD 38,2). U pacientů s CD byl medián hladiny hepcidinu 41,8 ng/ml (SD 30,1). Hladina hepcidinu byla zvýšená (> 54,4 ng/ml) u 11 z 20 dívek (55 %) s IBD a u 6 % z 36 chlapců s IBD. Snížená hladina hepcidinu (< 13,3 ng/ml) byla u 5 % dívek a u 3,6 % chlapců. Následující korelační analýzy byly provedeny v souboru 56 pacientů, u kterých byla stanovena hladina hepcidinu.

Graf 1 - Korelace hladiny hepcidinu s hladinou CRP u pacientů s IBD. Tab. 9 ukazuje korelace hladiny hepcidinu s koncentrací hemoglobinu, sérovou hladinou železa, feritinu, solubilního transferinového receptoru, CRP, s indexy aktivity PCDAI a PUCAI v souboru pacientů s IBD (n = 56). Kromě statisticky významné korelace mezi hladinou hepcidinu a hladinou CRP nebyla nalezena významná korelace mezi ostatními vyšetřovanými markery.

- 46 -



Tab. 9 - Korelace hepcidinu s výsledky laboratorních měření a indexy aktivity. Fe-S, sérové železo; sTfR, solubilní transferinový receptor; CRP, C-reaktivní protein; PCDAI, index aktivity Crohnovy choroby u dětí; PUCAI, index aktivity ulcerózní kolitidy u dětí. U pacientů s CD byl spočítán PCDAI. Rozptyl 1 – 16 bodů, medián 1. Nebyla zjištěna statisticky významná korelace mezi PCDAI a hladinou hepcidinu (p = 0,74; R = -0,063; n = 31). V klinické remisi bylo 29 pacientů (94 %), lehkou formu onemocnění měli 2 pacienti (6 %) a těžkou formu onemocnění v našem souboru neměl žádný pacient s CD. U pacientů s UC byl spočítán PUCAI. Rozptyl byl 0 – 40 bodů, medián 0. Rovněž nebyla zjištěna korelace mezi PUCAI a hladinou hepcidinu (p = 0,30; R = -0,22; n = 25). V remisi onemocnění bylo 21 pacientů (84 %), malé či střední postižení měli 4 pacienti (16 %) a závažnou formu onemocnění neměl žádný pacient. Ve skupině pacientů s IBD vyšetřené pro hladinu hepcidinu (n = 49) byla zjištěna významná nepřímá korelace mezi feritinem a sTfR (p < 0,000001; R = -0,68; n = 49) a mezi feritinem a RDW (p < 0,0002; R = -0,52; n = 48). U 17 z 56 pacientů (30%) byla zjištěna anémie a u 7 ze 17 pacientů s anémií byla hladina hepcidinu zvýšená. V grafu 2 je zobrazena distribuce hladiny hepcidinu u pacientů s UC (n = 25), s CD (n = 31) a u HC (n = 32). Nebyl zjištěn statisticky významný rozdíl mezi jednotlivými diagnózami pacientů s IBD. Jejich hladina hepcidinu se statisticky významně neliší od zdravých kontrol (HC).

- 47 -



Graf 2 - Rozložení hladiny hepcidinu u pacientů s UC, CD a HC. Sloupce vymezují data mezi pátým a 95. percentilem. Rámeček označuje interkvartální rozsah a medián hodnot dané skupiny. UC, ulcerózní kolitida; CD, Crohnova choroba; HC, zdravé kontroly. Pro zhodnocení rozdílů hladiny hepcidinu u dětských pacientů v různých věkových skupinách byl soubor rozdělen do věkové skupiny pacientů dětí do 18 let a mladistvých do 19 let. U skupiny pacientů nad 18 let věku byly zjištěny signifikantně vyšší hladiny ve srovnání s mladšími pacienty (p < 0,04). Medián hladiny hepcidinu dětí do 18 let byl 45,5 ng/ml (n = 41) a u pacientů 18 let a více byl medián 69,5 ng/ml (n = 15), viz. graf 3.

- 48 -



Graf 3 - Rozdíl hladin hepcidinu u dětí (pod 18 let) a mladých dospělých (18 a více let). Závislost hladiny hepcidinu na hladině Hb, RDW či MCV se u pacientů s anémií nepotvrdila.

1.3 Diskuze a závěr. Z analýzy celého souboru pacientů vyplývá, že anémie je častým doprovodným příznakem u pacientů se zánětlivým střevním onemocněním. Byla přítomná u téměř poloviny sledovaných dětí s IBD, což je v souladu s dosud publikovanými údaji [36; 133; 134]. Většinou se jedná o lehkou anémii, což může být dáno vyšším zastoupením pacientů vyšetřených v remisi onemocnění. Anémie je ve 43 % případů doprovázena sníženou hladinou feritinu a zvýšenou hladinou sTfR. V těchto případech se tedy jedná o kombinaci ACD s absolutním deficitem železa (ACD/IDA). Termín ACD/IDA použil Theurl (2009) a označoval jím ACD charakterizovanou výskytem anémie u pacientů s chronickou infekcí, autoimunitním onemocněním nebo malignitou v kombinaci se sníženou hladinou Hb, zvýšenou vazebnou kapacitou a sníženou hladinou feritinu [135]. Typický obraz ACD, kterou autor definuje jako sníženou hladinu Hb a normální nebo zvýšenou hladinu feritinu, byl v jejich souboru přítomen pouze u 7,7 %. Podobný nález byl prokázán i v souboru pacientů s vyšetřenou hladinou hepcidinu, ve kterém jsme

- 49 -



prokázali anémii charakteru ACD/IDA u 43 % dětí a obraz charakteristický pro ACD u 11,8 % dětí. Dosud bylo publikováno pouze velmi málo prací hodnotících hladinu hepcidinu u pacientů s IBD [136-139]. Všechny práce se zabývají pouze dospělými pacienty. Oustamanolakis (2010) srovnává hladiny hepcidinu u dospělých pacientů s IBD (n = 100) měřených metodou ELISA se zdravou populací (n = 102) [136]. U pacientů s IBD prokázal statisticky významně zvýšenou hladinu hepcidinu, signifikantně negativní korelaci mezi hepcidinem a Hb a pozitivní korelaci mezi hepcidinem a feritinem a mezi hepcidinem a hladinou CRP. V našem souboru pacientů však tyto nálezy nebyly potvrzeny. Rozdíl mezi hladinami hepcidinu mezi dětskými pacienty a zdravými kontrolami nebyl statisticky významný. Potvrdili jsme pouze pozitivní korelaci mezi hladinami hepcidinu a CRP. U pacientů s anémií a/nebo mikrocytózou jsme oproti řecké práci prokázali negativní korelaci mezi hladinou hepcidinu a feritinu. Korelace mezi hladinou hepcidinu a indexy aktivity onemocnění nebyla prokázána. Indexy aktivity představující neinvazivní způsob hodnocení průběhu onemocnění, avšak jejich možnosti jsou omezené a nekorelují s histologickým nálezem střevních biopsií. Výsledky srovnání indexů aktivity s histologií jsou v současnosti nehomogenní. Aktivitu IBD proto nelze hodnotit pouze neinvazivní metodou. Jsou studovány nové neinvazivní metody a biomarkery, které by více korelovaly se závažností průběhu IBD. Patří mezi ně zobrazovací metody CT (computed tomography), MRI (magnetic resonance imaging) s vysokým rozlišením [140] a fekální kalprotektin a laktoferin [141; 142]. Arnold (2009) ve své práci srovnává soubor dospělých pacientů s IBD (n = 61) se souborem zdravých kontrol (n = 25) [137]. Anémie byla zjištěna u 33% pacientů s IBD. U 90% pacientů s anémií byla nižší hladina feritinu a/nebo sérového železa a spadala do skupiny pacientů s IDA. Na rozdíl od řecké práce [136], kde byly hladiny hepcidinu u pacientů s IBD zvýšené, britští autoři zjistili signifikantně nižší hladiny hepcidinu u pacientů s IBD než u zdravých kontrol. Tento nález je v souladu s přítomností kombinace ACD/IDA u pacientů s IBD. Snížení hladiny hepcidinu u pacientů s IBD autor v diskuzi přikládá postižení střevní sliznice zánětem a ztrátě tzv. Panethových buněk, které ve střevní sliznici sekretují antimikrobiální peptidy, i hepcidin. Zastává hypotézu, že snížení

- 50 -



hladiny hepcidinu může být příčinou rozvoje střevního zánětu nebo že se podílí na chronickém průběhu IBD. Tato hypotéza však dosud nebyla potvrzena. V nizozemské studii [138] byla změřena hladina hepcidinu v séru dospělé zdravé populace rozdělené dle pohlaví a věku. Autoři uvádí rozdíly mezi jednotlivými pohlavími, kdy hladina hepcidinu byla u žen nižší než u mužů (medián u žen 18,1 ng/ml a u mužů 21,8 ng/ml). Odkazují se na práci prof. Ganze [139], který rozdíly mezi pohlavími interpretuje jako důsledek nižších zásob železa u žen především ve fertilním věku (medián věku zdravých amerických žen 32,5 a italských 28). U žen dále Galesloot zjistil významně nižší hladinu hepcidinu u premenopauzálních žen v porovnání s postmenopauzálními ženami. U mužů se hladina s věkem neměnila. V naší práci jsme potvrdili rozdíl mezi hladinami hepcidinu v plasmě u dívek a chlapců s IBD (medián pro dívky 65,2 ng/ml a 38,3 ng/ml pro chlapce) a pozorovali jsme stoupající trend mediánu hladiny hepcidinu s věkem, pro což svědčí signifikantní rozdíl hladiny hepcidinu mezi skupinou pacientů pod 18 let věku a starších. Dětští gastroenterologové pečují v odborných ambulancích o pacienty ve věku do 18 let + 365 dní. I v dětském věku je tedy hladina hepcidinu závislá na stáří pacienta. Vzestupný trend hladiny hepcidinu je srovnatelný u chlapců i u dívek. Údaje o normálním rozmezí hladin hepcidinu u dětí v literatuře zatím chybí. Stanovení norem je v současné době problematické i proto, že doposud nebyla stanovena nejspolehlivější metoda měření hladiny hepcidinu. Kroot [143] se zabýval srovnáním 22 laboratorních metod měřících hladinu hepcidinu. Mezi nejpoužívanější metody ke stanovení hladiny hepcidinu patří metody imunochemické (RIA, ELISA) a metody proteomické (LC-MS/MS, MALDI-TOF MS, apod.). Bylo zjištěno, že různé metody přináší různé výsledky a že se jednotlivé metody v absolutních číslech výrazně liší. Standardizace výsledků vyžaduje vyšetřování na velkém souboru pacientů. Produkce hepcidinu je regulována několika signálními drahami, které řídí transkripci genu pro hepcidin (HAMP). Mezi faktory ovlivňující tyto dráhy patří zánětlivé cytokiny (IL-6) aktivující kaskádu STAT3 [144; 145], která spouští transkripci genu HAMP, kódujícího hepcidin [146]. Hladina železa aktivuje kaskádu BMP6/SMAD [72; 147; 148] a tím inhibuje transkripci genu. Dalšími významnými faktory ovlivňujícími tvorbu hepcidinu jsou hypoxie [149] a aktivita erytropoézy [57]. Erytropoéza je proces vysoce

- 51 -



citlivý na dostatečný přísun železa. Dochází-li u pacientů s IBD k chronickým či akutním krevním ztrátám, kostní dřeň kompenzuje tyto ztráty zvýšenou produkcí erytrocytů. Toto zvýšení je doprovázeno zvýšenou spotřebou železa, proto dochází k utlumení tvorby hepcidinu, ke zvýšení absorpce železa z GIT a ke zvýšení výdeje Fe z monocytomakrofágového systému. U dětí a dospívajících s IBD může tedy být vliv zvýšené potřeby železa v období růstu v kombinaci s chronickými i akutními krevními ztrátami silnější než vliv zánětlivého procesu. Zdá se, že mechanismy zajišťující dostatečnou tvorbu erytrocytů a tedy dostatečný přísun kyslíku do tkání jsou nadřazeny všem ostatním vlivům. Tím by bylo možné vysvětlit převažující ACD/IDA (57 %) u anemických dětí s IBD v remisi onemocnění, u kterých se nejedná o akutní zánět ohrožující život pacienta. Izolované vyšetření hladiny Fe v séru je nespolehlivý ukazatel stavu Fe v organizmu. Vždy je nutno jej doplnit vyšetřením dalších přesnějších markerů, především feritinu a solubilního transferinového receptoru. V práci českých autorů [150] je k odlišení typu anémie u dětských pacientů s IBD vhodný index sTfR/log feritin. Hepcidin je rovněž diskutován jako potenciální biomarker schopný rozlišit sideropenickou anémii od anémie chronických chorob. Jeho tvorba je ovlivněna mnoha faktory, z nichž těmi nejdůležitějšími u pacientů s IBD jsou zvýšený obrat erytropoézy při deficitu Fe po opakovaných krevních ztrátách a na druhé straně zánětlivé onemocnění s tvorbou cytokinů. Zmíněné faktory působí protichůdně. Onemocnění, která zahrnují oba patogenetické mechanismy ovlivňující tvorbu hepcidinu, pak mohou představovat diagnostický problém. U dětské populace se na rozvoji anémie podílí významněji než u dospělých skutečný deficit Fe a anémie má charakteru ACD/IDA. Hladina hepcidinu našich pacientů měřená metodou ELISA se při hodnocení celého souboru významně neliší mezi pacienty s ACD, ACD/IDA a zdravými kontrolami. Pravděpodobně se zde podílí nerovnoměrné rozložení (větší rozptyl) hodnot hladin hepcidinu od nižších hladin přes normální ke zvýšeným ve srovnání s kontrolami. Při použití proteomické metody, která je ve srovnání s metodou ELISA schopna lépe podchytit škálu nízkých hodnot hladin hepcidinu, byl tento předpoklad již potvrzen [30]. Proteomická metoda je při detailním rozlišování snížených hodnot hepcidinu pravděpodobně citlivější.

- 52 -



V současné době je širší využití metody ELISA ke stanovení hladiny hepcidinu v diagnostice anémií u dětských pacientů s IBD limitované. Dosud nejsou komerčně dostupné ELISA kity, u kterých by výrobce deklaroval použití pro dětskou populaci. Kromě toho nebyly doposud definovány normy pro hepcidin pro dětskou populaci. Je nezbytné vyšetřit dostatečně velký soubor dětských pacientů s IBD, aby bylo možno srovnat citlivost metody pro rozlišení ACD od ACD/IDA. Na dostatečně velkém souboru pacientů bude možno zhodnotit korelaci hepcidinu s dosud běžně používanými ukazateli (MCV, RDW, feritin a sTfR). Rovněž je nezbytné vybrat optimální metodu vyšetření s dostatečně významnou senzitivitou a specificitou. Další využití měření hepcidinu, především pomocí proteomické analýzy, může přinést přesnější informace důležité pro bližší specifikaci anémie u IBD. Měření hladiny hepcidinu u pacientů s IBD může být jednoznačným přínosem při rozlišování mezi klasickou ACD a kombinací ACD s relativním nebo absolutním deficitem Fe. Může tak významně přispět k určení algoritmu léčby těchto pacientů. V nepřítomnosti anémie může hepcidin potenciálně sloužit i jako další důležitý marker aktivity zánětu.

- 53 -



2. Měření hladiny hepcidinu u pacientů se vzácnými typy anémií metodou kapalinové chromatografie - hmotnostní spektrometrie. První proteomickou metodu k detekci hepcidinu uvedla Nemeth v roce 2004, kdy měřila tento peptid pomocí imunodotu [36]. V roce 2005 byla u pacientů k měření hepcidinu v moči poprvé použita hmotnostní spektrometrie - SELDI-TOF MS (z angl. surface-enhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry) [151]. Výhodou hmotností spektrometrie je možnost přesně identifikovat bioaktivní hepcidin25. Tato metoda umožňuje odlišit bioaktivní formu od hepcidinu-22 a hepcidinu-20, který se rovněž v organizmu vyskytuje a jsou nerozlišitelné běžnou imunochemickou metodou. Murphy v roce 2007 vyvinul MS metodu ke kvantifikaci bioaktivní formy hepcidinu-25 z lidského a myšího séra [152]. K měření hladiny hepcidinu-25 byla použita proteomická metoda kapalinové chromatografie v kombinaci s hmotnostní spektrometrií (LC-MS, z angl. liquid chromatography - mass spectrometry). Ke kvantifikaci hepcidinu byl použit izotopově značený standard. Studovanou skupinou pacientů byli pacienti s vzácnou formou kongenitální aplázie červené krevní řady - Diamondovou - Blackfanovou anémií. Tento typ anémie je spojen s aplázií erytropoézy, která vede k deregulaci hepcidinu a přetížení organizmu železem, které je podobně závažné jako u β-thalasemie major [107; 153]. Tato práce byla zaměřena na zhodnocení vlivu erytropoézy na stav železa v organizmu a na ovlivnění regulace jeho homeostázy. U transfundovaných a netransfundovaných pacientů s DBA byla hodnocena korelace hladiny bioaktivního hepcidinu-25 změřená hmotnostní spektrometrií s parametry erytropoetické aktivity.

2.1 Pacienti a metody. 2.1.1 Pacienti. Studovanou skupinu tvořilo 25 pacientů z Českého národního registru pro DBA. Věkové rozmezí bylo 1,0 − 42,9 let (medián 23,7 let). 20 pacientů mělo potvrzenou mutaci ribozomálního proteinu (RP) a u 5 se mutace nepotvrdila. Kontrolní soubor tvořilo 12 dětských a 5 dospělých zdravých jedinců. Vyšetření a odběr biologického materiálu bylo provedeno po písemném souhlasu v souladu s Helsinskou deklarací a s Etickou komisí Fakultní nemocnice Olomouc. - 54 -



2.1.2 Rutinní laboratorní vyšetření pacientů. Vzorky žil ní krve byly odebírání běžnou venepunkcí. V certifikované laboratoři (ISO 9001:2000) byl v automatickém analyzátoru Sysmex XE-500 analyzer (Sysmex) u všech pacientů vyšetřen krevní obraz se zaměřením na zhodnocení charakteristik erytrocytů – hladiny hemoglobinu (Hb), hematokritu (HTC), počtu erytrocytů (ERY), středního objemu erytrocytu (MCV), koncentrace Hb v erytrocytu (MCH) a šíře distribuce erytrocytů (RDW). Standardními biochemickými metodami byly vyšetřeny parametry metabolizmu železa: hladina železa v séru (Fe-S), feritin, solubilní transferinový receptor (sTfR) a C-reaktivní protein (CRP). Jednotlivé hodnoty vyšetřovaných parametrů byly hodnoceny podle platných norem uvedených v tab. 1 a 2. Hladina EPO byla změřena metodou chemiluminiscence na pevné fázi. 2.1.3 Preanalytická fáze. Před odběrem žilní krve k měření hladiny hepcidinu byl získán informovaný souhlas pacienta a jeho zákonného zástupce. Po centrifugaci bylo získáno sérum, které bylo rozděleno do alikvotů, aby se zabránilo opakovanému rozmrazování, a vzorky byly zmrazeny na - 80°C. Ke změření hladiny hepcidinu-25 v séru byla použita proteomická metoda kombinace kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS). V první fázi analýzy byl vzorek purifikován metodou extrakce na pevné fázi (SPE). Bylo použito komerčně dostupných mikrotitračních SPE destiček Oasis® HLB. Před purifikací bylo do vyšetřovaných vzorků přidáno známé množství vnitřního standardu - izotopicky značeného [13C9,15N1-Phe4]-hepcidinu-25. Získaný extrakt byl separován na separační koloně UltiMate 3000 Nano LC System (Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, USA) s reverzní fází. Poté byl vzorek analyzován v hmotnostním spektrometru QTRAP 5500 (ABSciex, Framingham, MA, USA). Extrakce vzorků séra. Ke kalibraci byly připraveny roztoky syntetického hepcidinu-25 v králičím séru o koncentraci 2,5 − 5 − 10 − 25 − 50 − 100 − 250 − 500 ng/ml. Vzorky séra uchovávané při -80°C, byly rozmraženy na ledu. Odebráno bylo 200 µl séra, které bylo naneseno na 96ti jamkový panel. Následně bylo ke každému vzorku přidáno 50 µl vnitřního standardu (100 ng/ml) a 100 ul 0,1% roztoku kyseliny mravenčí. Mikrotitrační destička byla připravena

- 55 -



na extrakci přelitím 350 µl metanolu a vodu a odsáta vakuem. Na připravenou destičku byly naneseny vzorky a odsáty vakuem. Následně byla destička promyta sekvencí 200 µl vody, 200 µl metanolu/vody (30/70, v/v) (pH = 10) a 200 µl vody. Extrakt byl vymyt 50 µl roztoku metanolu/vody (90/10, v/v) (pH = 5) do sběrné 96 jamkové destičky. Kapalinová chromatografie a hmotnostní spektrometrie. Do eluátu bylo přidáno 150 µl vody a vše následně promícháno. 20 µl z každého vzorku bylo následně využito k analýze hmotnostním spektrometrem. Získaných 20 µl bylo separováno pomocí kapalinové chromatografie na reverzní fázi za použití kolony C18, 100A, 2,6 µm, 100 x 2,1 mm (Kinetex™). Separace byla naprogramována na diluční gradient (čas /min/; % solventu) (0; 10), (1,5;10), (4; 95), (5,5; 95), (5,6; 10) a (8,5; 10). Byla použita mobilní fáze A (5/95/0,1, metanol/voda/kyselina mravenčí, v/v/v) a mobilní fáze B (95/5/0,1, metanol/voda/kyselina mravenčí, v/v/v). Rychlost separace byla nastavena na 0,2 ml/min. Následně byl vzorek analyzován hmotnostním spektrometrem pomocí ionizace elektrosprejem (TurboIonSpray®) v pozitivním iontovém módu (viz. Obr. 4). Ionizace pomocí ESI spreje (z angl. electrospray ionization) byla nastavena na +5000 V. Vstupní teplota vzorku byla 600°C. Zmlžující plyn byl nastaven na 20 psi, zmlžující plyn na 42 psi a sušící plyn na 55 psi. Iontový posun MS/MS pro detekci hepcidinu-25 byl z m/z 697,8 na 354,1 (viz Obr. 5) a pro izotopově značený hepcidin-25 byl z m/z 700,6 na 354,1 (viz Obr. 6). Detekce hepcidinu-25 po separaci kapalinovou chromatografií byla zaznamenána křivkou (viz Obr. 7).

Obr. 4 Schéma zpracování a detekce trojitým kvadrupólem.

- 56 -



Obr. 5 Zprůměrovaná spektra píků 4-násobně nabitého iontu hepcidinu-25.

Obr. 6 Zprůměrovaná spektra píků 4-násobně nabitého iontu [13C9,15N1-Phe4]hepcidinu-25.

Obr. 7 Záznam detekce hepcidinu-25 po vymytí z kapalinové chromatografie. Srovnání standardu hepcidinu-25 (modrá křivka) se vzorkem pacientova séra (červená křivka). Kvatifikace. Vzorky ze syntetického hepcidinu-25 o známé koncentraci značené vnitřním standardem byly změřeny spektrometrem a změřené hodnoty plochy pod křivkou - 57 -



fragmentu b3 byly vztaženy k vstupní koncentraci. Kalibrační křivka byla vypočítána polynomickou rovnicí (r = 0,99639). Pomocí kalibrační křivky byla vypočítána hladina hepcidinu-25 ze vzorků séra pacientů a zdravých kontrol.

Graf. 4 Kalibrační křivka vypočítaná jako poměr mezi koncentrací a plochou pod křivkou. Přehled hmot (m/z) bioaktivního hepcidinu-25 a izotopicky značeného hepcidinu je uveden v tabulce 10. Hmota (Da) Peptidy

experimentální

teoretická

hepcidin-25

2796,3

2797,5

[13C9,15N1-Phe4]-hepcidin-25

2802,3

2803,5

Tab. 10 Přehled hmot měřeného hepcidinu. 2.1.4 Statistická metodika. Ke zpracování naměřených hladin hepcidinu byly použity hodnoty mediánu a 95 % interval spolehlivosti. Výsledky byly zobrazeny pomocí box plotů. Ke srovnávání výskytu jevů mezi jednotlivými soubory pacientů byl použit Mannův-Whitneyho test (srovnání dvou souborů). Vztah mezi hepcidinem a jednotlivými výsledky laboratorních vyšetření byl hodnocen pomocí neparametrické korelační analýzy (Spearmanův korelační

- 58 -



koeficient). Za statisticky významné byly považovány hodnoty p < 0,05. Statistická analýza byla provedena počítačovým softwarem Statistica 10 (StatSoft, Inc.).

2.2 Výsledky měření. Erytropoetická aktivita byla hodnocena množstvím erytroblastů v kostní dřeni, hladinou EPO a hladinou GDF15. U transfundovaných pacientů byl velmi redukovaný počet erytroblastů (pod 5%), ve srovnání s pacienty na kortikoidní terapii, či v remisi. Hladina EPO byla výrazně zvýšená u transfundovaných pacientů, což odpovídá fyziologické reakci organizmu na sníženou erytropoetickou aktivitu. Vliv erytropoetické aktivity na řízení metabolizmu Fe byla hodnocena následujícími parametry: hladina hepcidinu-25, feritinu a EPO. Hladina hepcidinu pozitivně korelovala s hladinou feritinu (P = 0,00003) (viz Graf 4), což odpovídá fyziologické reakci organizmu na zatížení železem. Dále byla zjištěna pozitivní korelace mezi hladinou hepcidinu a hladinou EPO (P = 0,001) (viz Graf 5), což naznačuje, že samotné zvýšení EPO nemá supresivní vliv na tvorbu hepcidinu.

Graf 4 Korelace hladiny hepcidinu s hladinou feritinu u pacientů s DBA.

- 59 -



Graf 5 Korelace hladiny hepcidinu s hladinou EPO u pacientů s DBA.

2.3 Diskuze a závěr. Podobně jako β-thalasemie major je DBA klasifikována jako anémie z přetížení železa. Závažnost anémie a nutnost opakovaného podávání krevních transfúzí je u obou onemocnění srovnatelná. Ale na rozdíl od akcelerované erytropoézy pacientů s thalasemií [154] je u pacientů s DBA erytropoéza mírně či výrazně snížená [155]. U pacientů s thalasemií byla patogeneze vzniku onemocnění a rozvoje přetížení organizmu železem podrobně popsána. Poznatky o patogenezi přetížení organizmu železem u pacientů s DBA zůstaly dosud omezené. Pacienti s DBA dependentní na transfúzích vyšetření v rámci studie měli prokazatelně nižší počet erytroblastů v kostní dřeni, sníženou hladinu sTfR, což odpovídá potlačené erytropoéze. Dále byla zjištěna vysoká hladina EPO. V séru byla vysoká hladina feritinu a snížená VVK. U pacientů v remisi nebo v léčbě kortikosteroidy, kteří nevyžadovali opakované transfúze, bylo prokázáno normální množství erytroblastů v kostní dření, normální hladina sTfR a v séru snížená nebo normální hladina feritinu a zvýšená VVK. Tyto výsledky naznačují, že zvýšení erytropoetické aktivity rovněž zvyšuje využití železa a tím potlačuje jeho ukládání v organizmu.

- 60 -



U transfundovaných DBA pacientů byla podobně jako u pacientů s thalasemií [156] zjištěna signifikantně vyšší hladina hepcidinu ve srovnání se zdravou kontrolou. Pacienti v remisi nebo v léčení kortikoidní terapií měli hladiny hepcidinu srovnatelné se zdravou kontrolou. Tito pacienti s efektivnější erytropoézou měli více potlačovali zvýšenou tvorbu hepcidinu. Poměr hepcidin - feritin odpovídal proporcionálně zatížení organizmu železem a byl vyšší u transfundovaných DBA pacientů, než u transfundovaných pacientů s βthalasemií major [156]. U pacientů s thalasemií byl tedy supresivní vliv erytropoézy na tvorbu hepcidinu výraznější, než u DBA pacientů. Vztah mezi hladinou hepcidinu a GDF15 a mezi poměrem hepcidin − feritin a hladinou GDF15 nebyl statisticky významný. U DBA pacientů tedy GDF15 neovlivňoval hladinu hepcidinu. Jeho hladina byla zvýšená i u pacientů v remisi a odpovídal pravděpodobně zvýšené apoptotické aktivitě erytroblastů. Tato práce potvrdila diverzitu metabolizmu železa u DBA pacientů s různým stupněm závažnosti onemocnění. Hladina hepcidinu a tedy fyziologická odpověď organizmu na nerovnováhu železa, se lišila dle erytropoetické aktivity a terapeutického přístupu. Bylo zjištěno, že EPO neměl supresivní vliv na expresi hepcidin. Jaký způsobem tlumí erytropoéza

expresi

hepcidinu

tedy

zůstává

- 61 -

předmětem

dalšího

výzkumu.


Literatura

Literatura. 1

Fauci AS. Harrison's principles of internal medicine. Edtion ed. New York: McGraw-Hill Medical, 2008. ISBN 978-0-07-146633-2.

2

Kliegman RM, Behrman RE, Jenson HB, et al. Nelson textbook of pediatrics. Edtion ed. Philadelphia, PA: Saunders, 2007. ISBN 9781437707557.

3

Gorelik S a Kanner J. Oxymyoglobin oxidation and membrane lipid peroxidation initiated by iron redox cycle: prevention of oxidation by enzymic and nonenzymic antioxidants. J. Agric. Food Chem. 2001; 49(12): 5945-5950.

4

Brown N, Eliasson R, Reichard P, et al. Nonheme iron as a cofactor in ribonucleotide reductase from E. coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1968; 30(5): 522-527.

5

Hallberg L a Hulthén L. Prediction of dietary iron absorption: an algorithm for calculating absorption and bioavailability of dietary iron. The American journal of clinical nutrition 2000; 71(5): 1147-1160.

6

Monsen E, Hallberg L, Layrisse M, et al. Estimation of available dietary iron. Am. J. Clin. Nutr. 1978; 31(1): 134-141.

7

Shayeghi M, Latunde-Dada G, Oakhill J, et al. Identification of an intestinal heme transporter. Cell 2005; 122(5): 789-801.

8

Qiu A, Jansen M, Sakaris A, et al. Identification of an intestinal folate transporter and the molecular basis for hereditary folate malabsorption. Cell 2006; 127(5): 917-928.

9

Raffin S, Woo C, Roost K, et al. Intestinal absorption of hemoglobin iron-heme cleavage by mucosal heme oxygenase. J. Clin. Invest. 1974; 54(6): 1344-1352.

10

Lönnerdal B a Kelleher S. Micronutrient transfer: infant absorption. Adv. Exp. Med. Biol. 2009; 639(29-40.

11

Wintrobe MM a Greer JP. Wintrobe's clinical hematology. Edtion ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2009.

12

Hurrell R, Juillerat M, Reddy M, et al. Soy protein, phytate, and iron absorption in humans. Am. J. Clin. Nutr. 1992; 56(3): 573-578.

13

Moore C, Dubach R, Minnich V, et al. Absorption of ferrous and ferric radioactive iron by human subjects and by dogs. J. Clin. Invest. 1944; 23(5): 755767.

14

Gunshin H, Fujiwara Y, Custodio A, et al. Slc11a2 is required for intestinal iron absorption and erythropoiesis but dispensable in placenta and liver. J. Clin. Invest. 2005; 115(5): 1258-1266.

- 62 -


Literatura

15

Abboud S a Haile D. A novel mammalian iron-regulated protein involved in intracellular iron metabolism. J. Biol. Chem. 2000; 275(26): 19906-19912.

16

Donovan A, Brownlie A, Zhou Y, et al. Positional cloning of zebrafish ferroportin1 identifies a conserved vertebrate iron exporter. Nature 2000; 403(6771): 776-781.

17

Mckie A, Marciani P, Rolfs A, et al. A novel duodenal iron-regulated transporter, IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation. Mol. Cell 2000; 5(2): 299-309.

18

Harris Z, Durley A, Man T, et al. Targeted gene disruption reveals an essential role for ceruloplasmin in cellular iron efflux. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96(19): 10812-10817.

19

Osaki S, Johnson D a Frieden E. The possible significance of the ferrous oxidase activity of ceruloplasmin in normal human serum. J. Biol. Chem. 1966; 241(12): 2746-2751.

20

Beaumont C a Delaby C. Recycling iron in normal and pathological states. Semin. Hematol. 2009; 46(4): 328-338.

21

Mccance R a Widdowson E. The absorption and excretion of iron following oral and intravenous administration. J. Physiol. 1938; 94(1): 148-154.

22

Green R, Charlton R, Seftel H, et al. Body iron excretion in man: a collaborative study. Am. J. Med. 1968; 45(3): 336-353.

23

Krause A, Neitz S, Mägert H, et al. LEAP-1, a novel highly disulfide-bonded human peptide, exhibits antimicrobial activity. FEBS Lett. 2000; 480(2-3): 147150.

24

Park C, Valore E, Waring A, et al. Hepcidin, a urinary antimicrobial peptide synthesized in the liver. J. Biol. Chem. 2001; 276(11): 7806-7810.

25

Bekri S, Gual P, Anty R, et al. Increased adipose tissue expression of hepcidin in severe obesity is independent from diabetes and NASH. Gastroenterology 2006; 131(3): 788-796.

26

Kulaksiz H, Fein E, Redecker P, et al. Pancreatic beta-cells express hepcidin, an iron-uptake regulatory peptide. J. Endocrinol. 2008; 197(2): 241-249.

27

Hunter H, Fulton D, Ganz T, et al. The solution structure of human hepcidin, a peptide hormone with antimicrobial activity that is involved in iron uptake and hereditary hemochromatosis. J. Biol. Chem. 2002; 277(40): 37597-37603.

28

Wallace D, Jones M, Pedersen P, et al. Purification and partial characterisation of recombinant human hepcidin. Biochimie 2006; 88(1): 31-37.

29

Kemna E, Tjalsma H, Podust V, et al. Mass spectrometry-based hepcidin measurements in serum and urine: analytical aspects and clinical implications. Clin. Chem. 2007; 53(4): 620-628.

- 63 -


Literatura

30

Nagy J, Lakner L, Poór V, et al. Serum prohepcidin levels in chronic inflammatory bowel diseases. J. Crohns Colitis 2010; 4(6): 649-653.

31

Hilton K a Lambert L. Molecular evolution and characterization of hepcidin gene products in vertebrates. Gene 2008; 415(1-2): 40-48.

32

Pigeon C, Ilyin G, Courselaud B, et al. A new mouse liver-specific gene, encoding a protein homologous to human antimicrobial peptide hepcidin, is overexpressed during iron overload. The Journal of biological chemistry 2001; 276(11): 78117819.

33

Nicolas G, Bennoun M, Devaux I, et al. Lack of hepcidin gene expression and severe tissue iron overload in upstream stimulatory factor 2 (USF2) knockout mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98(15): 8780-8785.

34

Donovan A, Lima C, Pinkus J, et al. The iron exporter ferroportin/Slc40a1 is essential for iron homeostasis. Cell Metab. 2005; 1(3): 191-200.

35

Zhang A-S a Enns C. Iron homeostasis: recently identified proteins provide insight into novel control mechanisms. J. Biol. Chem. 2009; 284(2): 711-715.

36

Nemeth E, Rivera S, Gabayan V, et al. IL-6 mediates hypoferremia of inflammation by inducing the synthesis of the iron regulatory hormone hepcidin. J. Clin. Invest. 2004; 113(9): 1271-1276.

37

Ganz T a Nemeth E. Hepcidin and disorders of iron metabolism. Annu. Rev. Med. 2011; 62(347-360.

38

Pietrangelo A. The ferroportin disease. Blood cells, molecules & diseases 2004; 32(1): 131-138.

39

Babitt J, Huang F, Wrighting D, et al. Bone morphogenetic protein signaling by hemojuvelin regulates hepcidin expression. Nat. Genet. 2006; 38(5): 531-539.

40

Schmidt P, Toran P, Giannetti A, et al. The transferrin receptor modulates Hfedependent regulation of hepcidin expression. Cell Metab. 2008; 7(3): 205-214.

41

Gao J, Chen J, Kramer M, et al. Interaction of the hereditary hemochromatosis protein HFE with transferrin receptor 2 is required for transferrin-induced hepcidin expression. Cell Metab. 2009; 9(3): 217-227.

42

Roy C a Enns C. Iron homeostasis: new tales from the crypt. Blood 2000; 96(13): 4020-4027.

43

Vujic Spasic M, Kiss J, Herrmann T, et al. Physiologic systemic iron metabolism in mice deficient for duodenal Hfe. Blood 2007; 109(10): 4511-4517.

44

Goswami T a Andrews N. Hereditary hemochromatosis protein, HFE, interaction with transferrin receptor 2 suggests a molecular mechanism for mammalian iron sensing. J. Biol. Chem. 2006; 281(39): 28494-28498.

45

Ramey G, Deschemin J-C a Vaulont S. Cross-talk between the mitogen activated protein kinase and bone morphogenetic protein/hemojuvelin pathways is required - 64 -


Literatura

for the induction of hepcidin by holotransferrin in primary mouse hepatocytes. Haematologica 2009; 94(6): 765-772. 46

Salahudeen A a Bruick R. Maintaining Mammalian iron and oxygen homeostasis: sensors, regulation, and cross-talk. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2009; 1177(30-38.

47

Bartnikas T, Andrews N a Fleming M. Transferrin is a major determinant of hepcidin expression in hypotransferrinemic mice. Blood 2011; 117(2): 630-637.

48

Pak M, Lopez M, Gabayan V, et al. Suppression of hepcidin during anemia requires erythropoietic activity. Blood 2006; 108(12): 3730-3735.

49

Adamsky K, Weizer O, Amariglio N, et al. Decreased hepcidin mRNA expression in thalassemic mice. Br. J. Haematol. 2004; 124(1): 123-124.

50

Papanikolaou G, Tzilianos M, Christakis J, et al. Hepcidin in iron overload disorders. Blood 2005; 105(10): 4103-4105.

51

Tanno T a Miller J. [GDF15 expression and iron overload in ineffective erythropoiesis]. [Rinshō ketsueki] The Japanese journal of clinical hematology 2011; 52(6): 387-398.

52

Tanno T, Rabel A, Lee Y, et al. Expression of growth differentiation factor 15 is not elevated in individuals with iron deficiency secondary to volunteer blood donation. Transfusion (Paris) 2010; 50(7): 1532-1535.

53

Talbot N, Lakhal S, Smith T, et al. Regulation of hepcidin expression at high altitude. Blood 2012; 119(3): 857-860.

54

Smith T, Robbins P a Ratcliffe P. The human side of hypoxia-inducible factor. Br. J. Haematol. 2008; 141(3): 325-334.

55

Gordeuk V, Miasnikova G, Sergueeva A, et al. Chuvash polycythemia VHLR200W mutation is associated with down-regulation of hepcidin expression. Blood 2011; 118(19): 5278-5282.

56

Liu Q, Davidoff O, Niss K, et al. Hypoxia-inducible factor regulates hepcidin via erythropoietin-induced erythropoiesis. J. Clin. Invest. 2012; 122(12): 4635-4644.

57

Pinto J, Ribeiro S, Pontes H, et al. Erythropoietin mediates hepcidin expression in hepatocytes through EPOR signaling and regulation of C/EBPalpha. Blood 2008; 111(12): 5727-5733.

58

Pietrangelo A, Dierssen U, Valli L, et al. STAT3 is required for IL-6-gp130dependent activation of hepcidin in vivo. Gastroenterology 2007; 132(1): 294300.

59

Nemeth E, Rivera S, Gabayan V, et al. IL-6 mediates hypoferremia of inflammation by inducing the synthesis of the iron regulatory hormone hepcidin. The Journal of clinical investigation 2004; 113(9): 1271-1276.

- 65 -


Literatura

60

Inamura J, Ikuta K, Jimbo J, et al. Upregulation of hepcidin by interleukin-1beta in human hepatoma cell lines. Hepatology research : the official journal of the Japan Society of Hepatology 2005; 33(3): 198-205.

61

Lee P, Peng H, Gelbart T, et al. Regulation of hepcidin transcription by interleukin-1 and interleukin-6. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005; 102(6): 1906-1910.

62

Constable A, Quick S, Gray N, et al. Modulation of the RNA-binding activity of a regulatory protein by iron in vitro: switching between enzymatic and genetic function? Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992; 89(10): 4554-4558.

63

Muckenthaler M, Gray N a Hentze M. IRP-1 binding to ferritin mRNA prevents the recruitment of the small ribosomal subunit by the cap-binding complex eIF4F. Mol. Cell 1998; 2(3): 383-388.

64

Binder R, Horowitz J, Basilion J, et al. Evidence that the pathway of transferrin receptor mRNA degradation involves an endonucleolytic cleavage within the 3' UTR and does not involve poly(A) tail shortening. EMBO J. 1994; 13(8): 19691980.

65

Haile D, Rouault T, Tang C, et al. Reciprocal control of RNA-binding and aconitase activity in the regulation of the iron-responsive element binding protein: role of the iron-sulfur cluster. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992; 89(16): 75367540.

66

Guo B, Phillips J, Yu Y, et al. Iron regulates the intracellular degradation of iron regulatory protein 2 by the proteasome. J. Biol. Chem. 1995; 270(37): 2164521651.

67

Wang J, Chen G, Muckenthaler M, et al. Iron-mediated degradation of IRP2, an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity. Mol. Cell. Biol. 2004; 24(3): 954-965.

68

Bourdon E, Kang D-K, Ghosh M, et al. The role of endogenous heme synthesis and degradation domain cysteines in cellular iron-dependent degradation of IRP2. Blood cells, molecules & diseases 2003; 31(2): 247-255.

69

Ishikawa H, Kato M, Hori H, et al. Involvement of heme regulatory motif in heme-mediated ubiquitination and degradation of IRP2. Mol. Cell 2005; 19(2): 171-181.

70

Xia Y, Babitt J, Sidis Y, et al. Hemojuvelin regulates hepcidin expression via a selective subset of BMP ligands and receptors independently of neogenin. Blood 2008; 111(10): 5195-5204.

71

Steinbicker A, Sachidanandan C, Vonner A, et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling attenuates anemia associated with inflammation. Blood 2011; 117(18): 4915-4923.

72

Andriopoulos B, Corradini E, Xia Y, et al. BMP6 is a key endogenous regulator of hepcidin expression and iron metabolism. Nat. Genet. 2009; 41(4): 482-487. - 66 -


Literatura

73

Silvestri L, Pagani A, Nai A, et al. The serine protease matriptase-2 (TMPRSS6) inhibits hepcidin activation by cleaving membrane hemojuvelin. Cell Metab. 2008; 8(6): 502-511.

74

Lee D-H, Lee D-H, Zhou L-J, et al. Neogenin inhibits HJV secretion and regulates BMP-induced hepcidin expression and iron homeostasis. Blood 2010; 115(15): 3136-3145.

75

Cau M, Melis M, Congiu R, et al. Iron-deficiency anemia secondary to mutations in genes controlling hepcidin. Expert Rev. Hematol. 2010; 3(2): 205-216.

76

Nai A, Pagani A, Silvestri L, et al. Increased susceptibility to iron deficiency of Tmprss6-haploinsufficient mice. Blood 2010; 116(5): 851-852.

77

Lakhal S, Schödel J, Townsend A, et al. Regulation of type II transmembrane serine proteinase TMPRSS6 by hypoxia-inducible factors: new link between hypoxia signaling and iron homeostasis. The Journal of biological chemistry 2011; 286(6): 4090-4097.

78

Maurer E, Gütschow M a Stirnberg M. Matriptase-2 (TMPRSS6) is directly upregulated by hypoxia inducible factor-1: identification of a hypoxia-responsive element in the TMPRSS6 promoter region. Biol. Chem. 2012; 393(6): 535-540.

79

Zhang S-P, Wang Z, Wang L-X, et al. AG490: an inhibitor of hepcidin expression in vivo. World journal of gastroenterology : WJG 2011; 17(45): 5032-5034.

80

Meynard D, Vaja V, Sun C, et al. Regulation of TMPRSS6 by BMP6 and iron in human cells and mice. Blood 2011; 118(3): 747-756.

81

Brumberg J. Chlorotic girls, 1870-1920: a historical perspective on female adolescence. Child Dev. 1982; 53(6): 1468-1477.

82

Nai A, Pagani A, Mandelli G, et al. Deletion of TMPRSS6 attenuates the phenotype in a mouse model of β-thalassemia. Blood 2012; 119(21): 5021-5029.

83

Fleming M, Trenor C, Su M, et al. Microcytic anaemia mice have a mutation in Nramp2, a candidate iron transporter gene. Nat. Genet. 1997; 16(4): 383-386.

84

Fleming M, Romano M, Su M, et al. Nramp2 is mutated in the anemic Belgrade (b) rat: evidence of a role for Nramp2 in endosomal iron transport. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95(3): 1148-1153.

85

Mims M, Guan Y, Pospisilova D, et al. Identification of a human mutation of DMT1 in a patient with microcytic anemia and iron overload. Blood 2005; 105(3): 1337-1342.

86

Priwitzerova M, Nie G, Sheftel A, et al. Functional consequences of the human DMT1 (SLC11A2) mutation on protein expression and iron uptake. Blood 2005; 106(12): 3985-3987.

87

Iolascon A, D'apolito M, Servedio V, et al. Microcytic anemia and hepatic iron overload in a child with compound heterozygous mutations in DMT1 (SCL11A2). Blood 2006; 107(1): 349-354. - 67 -


Literatura

88

Beaumont C, Delaunay J, Hetet G, et al. Two new human DMT1 gene mutations in a patient with microcytic anemia, low ferritinemia, and liver iron overload. Blood 2006; 107(10): 4168-4170.

89

Priwitzerova M, Pospisilova D, Prchal J, et al. Severe hypochromic microcytic anemia caused by a congenital defect of the iron transport pathway in erythroid cells. Blood 2004; 103(10): 3991-3992.

90

Papanikolaou G, Samuels M, Ludwig E, et al. Mutations in HFE2 cause iron overload in chromosome 1q-linked juvenile hemochromatosis. Nat. Genet. 2004; 36(1): 77-82.

91

Roetto A, Papanikolaou G, Politou M, et al. Mutant antimicrobial peptide hepcidin is associated with severe juvenile hemochromatosis. Nat. Genet. 2003; 33(1): 21-22.

92

Sham R, Phatak P, Nemeth E, et al. Hereditary hemochromatosis due to resistance to hepcidin: high hepcidin concentrations in a family with C326S ferroportin mutation. Blood 2009; 114(2): 493-494.

93

Gordeuk V. African iron overload. Semin. Hematol. 2002; 39(4): 263-269.

94

Hagag A, Elfrargy M, Gazar R, et al. Therapeutic value of combined therapy with deferasirox and silymarin on iron overload in children with Beta thalassemia. Mediterranean journal of hematology and infectious diseases 2013; 5(1).

95

Poggiali E, Cassinerio E, Zanaboni L, et al. An update on iron chelation therapy. Blood transfusion = Trasfusione del sangue 2012; 10(4): 411-422.

96

Wu T-WW, Tabangin M, Kusano R, et al. The utility of serum hepcidin as a biomarker for late-onset neonatal sepsis. The Journal of pediatrics 2013; 162(1): 67-71.

97

Cizmeci MN, Kara S, Kanburoglu MK, et al. Detection of cord blood hepcidin levels as a biomarker for early-onset neonatal sepsis. Med. Hypotheses 2014; 82(3): 310-312.

98

Karcioglu Z, Sarper R, Van Rinsvelt H, et al. Trace element concentrations in renal cell carcinoma. Cancer 1978; 42(3): 1330-1340.

99

Kamai T, Tomosugi N, Abe H, et al. Increased serum hepcidin-25 level and increased tumor expression of hepcidin mRNA are associated with metastasis of renal cell carcinoma. BMC Cancer 2009; 9(270.

100

Kijima H, Sawada T, Tomosugi N, et al. Expression of hepcidin mRNA is uniformly suppressed in hepatocellular carcinoma. BMC Cancer 2008; 8(167.

101

Hänninen M, Haapasalo J, Haapasalo H, et al. Expression of iron-related genes in human brain and brain tumors. BMC Neurosci. 2009; 10(36.

102

Kaelin W. The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein: roles in cancer and oxygen sensing. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 2005; 70(159-166.

- 68 -


Literatura

103

Mano M, Butzberger P, Reid A, et al. Current role of erythropoietin in the management of patients with haematological and solid malignancies. Cancer Therapy 2005; 3(41-56.

104

Ukarma L, Johannes H, Beyer U, et al. Hepcidin as a predictor of response to epoetin therapy in anemic cancer patients. Clin. Chem. 2009; 55(7): 1354-1360.

105

Dmoszynska A, Kloczko J, Rokicka M, et al. A dose exploration, phase I/II study of administration of continuous erythropoietin receptor activator once every 3 weeks in anemic patients with multiple myeloma receiving chemotherapy. Haematologica 2007; 92(4): 493-501.

106

Nicolas G, Viatte L, Lou D-Q, et al. Constitutive hepcidin expression prevents iron overload in a mouse model of hemochromatosis. Nat. Genet. 2003; 34(1): 97101.

107

Gardenghi S, Ramos P, Marongiu M, et al. Hepcidin as a therapeutic tool to limit iron overload and improve anemia in β-thalassemic mice. The Journal of clinical investigation 2010; 120(12): 4466-4477.

108

Kim A, Fung E, Parikh SG, et al. A mouse model of anemia of inflammation: complex pathogenesis with partial dependence on hepcidin. Blood 2013.

109

Porter J. Optimizing iron chelation strategies in beta-thalassaemia major. Blood Rev. 2009; 23 Suppl 1(7.

110

Xiao J, Krzyzanski W, Wang Y-M, et al. Pharmacokinetics of anti-hepcidin monoclonal antibody Ab 12B9m and hepcidin in cynomolgus monkeys. AAPS J. 2010; 12(4): 646-657.

111

Ramos E, Ruchala P, Goodnough J, et al. Minihepcidins prevent iron overload in a hepcidin-deficient mouse model of severe hemochromatosis. Blood 2012; 120(18): 3829-3836.

112

Guo S, Casu C, Gardenghi S, et al. Reducing TMPRSS6 ameliorates hemochromatosis and β-thalassemia in mice. J. Clin. Invest. 2013; 123(4): 15311541.

113

Schmidt P, Toudjarska I, Sendamarai A, et al. An RNAi therapeutic targeting Tmprss6 decreases iron overload in Hfe(-/-) mice and ameliorates anemia and iron overload in murine β-thalassemia intermedia. Blood 2013; 121(7): 1200-1208.

114

Corradini E, Schmidt P, Meynard D, et al. BMP6 treatment compensates for the molecular defect and ameliorates hemochromatosis in Hfe knockout mice. Gastroenterology 2010; 139(5): 1721-1729.

115

Bennett C, Spiegel D, Macdougall I, et al. A review of safety, efficacy, and utilization of erythropoietin, darbepoetin, and peginesatide for patients with cancer or chronic kidney disease: a report from the Southern Network on Adverse Reactions (SONAR). Semin. Thromb. Hemost. 2012; 38(8): 783-796.

- 69 -


Literatura

116

Wozney J, Rosen V, Celeste A, et al. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science 1988; 242(4885): 1528-1534.

117

Poli M, Girelli D, Campostrini N, et al. Heparin: a potent inhibitor of hepcidin expression in vitro and in vivo. Blood 2011; 117(3): 997-1004.

118

Fung E a Nemeth E. Manipulation of the hepcidin pathway for therapeutic purposes. Haematologica 2013; 98(11): 1667-1676.

119

Nili M, Shinde U a Rotwein P. Soluble repulsive guidance molecule c/hemojuvelin is a broad spectrum bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and inhibits both BMP2- and BMP6-mediated signaling and gene expression. J. Biol. Chem. 2010; 285(32): 24783-24792.

120

Song S-NJ, Tomosugi N, Kawabata H, et al. Down-regulation of hepcidin resulting from long-term treatment with an anti-IL-6 receptor antibody (tocilizumab) improves anemia of inflammation in multicentric Castleman disease. Blood 2010; 116(18): 3627-3634.

121

Doyle M, Rahman M, Frederick B, et al. Effects of subcutaneous and intravenous golimumab on inflammatory biomarkers in patients with rheumatoid arthritis: results of a phase 1, randomized, open-label trial. Rheumatology (Oxford, England) 2013; 52(7): 1214-1219.

122

Sasu B, Cooke K, Arvedson T, et al. Antihepcidin antibody treatment modulates iron metabolism and is effective in a mouse model of inflammation-induced anemia. Blood 2010; 115(17): 3616-3624.

123

Schwoebel F, Van Eijk L, Zboralski D, et al. The effects of the anti-hepcidin Spiegelmer NOX-H94 on inflammation-induced anemia in cynomolgus monkeys. Blood 2013; 121(12): 2311-2315.

124

Fernandes A, Preza G, Phung Y, et al. The molecular basis of hepcidin-resistant hereditary hemochromatosis. Blood 2009; 114(2): 437-443.

125

Oliveira S, De Sousa M a Pinto J. ER Stress and Iron Homeostasis: A New Frontier for the UPR. Biochemistry research international 2011; 2011(896474.

126

Li J, Meng X, Si H, et al. Hepcidin destabilizes atherosclerotic plaque via overactivating macrophages after erythrophagocytosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2012; 32(5): 1158-1166.

127

Simonis G, Mueller K, Schwarz P, et al. The iron-regulatory peptide hepcidin is upregulated in the ischemic and in the remote myocardium after myocardial infarction. Peptides 2010; 31(9): 1786-1790.

128

Prentice A. Hepcidin and iron-mediated resistance to malaria. EMBO Mol. Med. 2011; 3(11): 620-622.

129

De Domenico I, Zhang T, Koening C, et al. Hepcidin mediates transcriptional changes that modulate acute cytokine-induced inflammatory responses in mice. J. Clin. Invest. 2010; 120(7): 2395-2405. - 70 -


Literatura

130

Hyams J, Ferry G, Mandel F, et al. Development and validation of a pediatric Crohn's disease activity index. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 1991; 12(4): 439447.

131

Otley A, Loonen H, Parekh N, et al. Assessing activity of pediatric Crohn's disease: which index to use? Gastroenterology 1999; 116(3): 527-531.

132

Turner D, Hyams J, Markowitz J, et al. Appraisal of the pediatric ulcerative colitis activity index (PUCAI). Inflamm. Bowel Dis. 2009; 15(8): 1218-1223.

133

Wiskin A, Fleming B, Wootton S, et al. Anaemia and iron deficiency in children with inflammatory bowel disease. J. Crohns Colitis 2012; 6(6): 687-691.

134

Wilson A, Reyes E a Ofman J. Prevalence and outcomes of anemia in inflammatory bowel disease: a systematic review of the literature. The American journal of medicine 2004; 116 Suppl 7A(

135

Theurl I, Aigner E, Theurl M, et al. Regulation of iron homeostasis in anemia of chronic disease and iron deficiency anemia: diagnostic and therapeutic implications. Blood 2009; 113(21): 5277-5286.

136

Oustamanolakis P, Koutroubakis I, Messaritakis I, et al. Serum hepcidin and prohepcidin concentrations in inflammatory bowel disease. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 2011; 23(3): 262-268.

137

Arnold J, Sangwaiya A, Bhatkal B, et al. Hepcidin and inflammatory bowel disease: dual role in host defence and iron homoeostasis. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 2009; 21(4): 425-429.

138

Galesloot T, Vermeulen S, Geurts-Moespot A, et al. Serum hepcidin: reference ranges and biochemical correlates in the general population. Blood 2011; 117(25): 25.

139

Ganz T. Iron homeostasis: fitting the puzzle pieces together. Cell Metab. 2008; 7(4): 288-290.

140

Tielbeek JA, Makanyanga JC, Bipat S, et al. Grading Crohn disease activity with MRI: interobserver variability of MRI features, MRI scoring of severity, and correlation with Crohn disease endoscopic index of severity. AJR. American journal of roentgenology 2013; 201(6): 1220-1228.

141

Benitez J-MM, Meuwis M-aA, Reenaers C, et al. Role of endoscopy, crosssectional imaging and biomarkers in Crohn's disease monitoring. Gut 2013; 62(12): 1806-1816.

142

Nogueira IM, Miszputen SJ, Ambrogini Jr O, et al. Assessment of the response of patients with Crohn's disease to biological therapy using new non-invasive markers: lactoferrin and calprotectin. Arq. Gastroenterol. 2013; 50(2): 130-137.

143

Kroot J, Kemna E, Bansal S, et al. Results of the first international round robin for the quantification of urinary and plasma hepcidin assays: need for standardization. Haematologica 2009; 94(12): 1748-1752. - 71 -


Literatura

144

Wrighting D a Andrews N. Interleukin-6 induces hepcidin expression through STAT3. Blood 2006; 108(9): 3204-3209.

145

Huang H, Constante M, Layoun A, et al. Contribution of STAT3 and SMAD4 pathways to the regulation of hepcidin by opposing stimuli. Blood 2009; 113(15): 3593-3599.

146

Nicolas G, Chauvet C, Viatte L, et al. The gene encoding the iron regulatory peptide hepcidin is regulated by anemia, hypoxia, and inflammation. The Journal of clinical investigation 2002; 110(7): 1037-1044.

147

Kautz L, Meynard D, Monnier A, et al. Iron regulates phosphorylation of Smad1/5/8 and gene expression of Bmp6, Smad7, Id1, and Atoh8 in the mouse liver. Blood 2008; 112(4): 1503-1509.

148

Meynard D, Kautz L, Darnaud V, et al. Lack of the bone morphogenetic protein BMP6 induces massive iron overload. Nat. Genet. 2009; 41(4): 478-481.

149

Peyssonnaux C, Zinkernagel A, Schuepbach R, et al. Regulation of iron homeostasis by the hypoxia-inducible transcription factors (HIFs). J. Clin. Invest. 2007; 117(7): 1926-1932.

150

Šuláková A, Pozler O a Nováčková L. Prevalence a typ anémie v době stanovení diagnózy nespecifického střevního zánětu u dětí. Czecho-Slovak Pediatrics 2012; 67(1): 3-10.

151

Kemna E, Tjalsma H, Laarakkers C, et al. Novel urine hepcidin assay by mass spectrometry. Blood 2005; 106(9): 3268-3270.

152

Murphy A, Witcher D, Luan P, et al. Quantitation of hepcidin from human and mouse serum using liquid chromatography tandem mass spectrometry. Blood 2007; 110(3): 1048-1054.

153

Pasricha S-R, Frazer D, Bowden D, et al. Transfusion suppresses erythropoiesis and increases hepcidin in adult patients with β-thalassemia major: a longitudinal study. Blood 2013; 122(1): 124-133.

154

Tanno T a Miller J. Iron Loading and Overloading due to Ineffective Erythropoiesis. Advances in hematology 2010; 2010(358283.

155

Horos R a Von Lindern M. Molecular mechanisms of pathology and treatment in Diamond Blackfan Anaemia. Br. J. Haematol. 2012; 159(5): 514-527.

156

Origa R, Galanello R, Ganz T, et al. Liver iron concentrations and urinary hepcidin in beta-thalassemia. Haematologica 2007; 92(5): 583-588.

- 72 -


Přílohy. -

Původní vědecká publikace v impaktovaném časopise „Hepcidin levels in Diamond-Blackfan anemia reflect erythropoietic aktivity and diferent treatment strategies“ v Haematologica, IF 5,935 (viz Příloha 1).

-

Původní vědecká publikace „Výskyt anémie a význam měření hladiny hepcidinu metodou ELISA u dětí s nespecifickými střevními záněty“ v časopise Česko Slovenská pediatrie (článek přijat k publikaci, viz Příloha 2).

-

Odborný přehledový článek „Úloha hepcidinu v regulaci metabolizmu železa.“ v časopise Česko – Slovenská pediatrie (článek přijat k publikaci, viz Příloha 3).

-

Vědecký poster „Incidence anémie u dětských pacientů s Crohnovou chorobou“ na pediatrické konferenci v Košicích (XIX. Konferencia detských hematológov a onkológov ČR a SR, 20. - 22. listopadu 2009) (viz Příloha 4).

-

Vědecký poster „Quantification of hepcidin in blood and urine in children with inflammatory bowel diseases by ELISA method" na vědecké konferenci v Cascais v Portugalsku (Innovative Therapies for Red Cell and Iron Related Disorders, 15.20. dubna 2010) (viz Příloha 5).

-

Vědecký poster „Kvantitativní stanovení hladiny hepcidinu v krvi a v moči u dětských pacientů s nespecifickými střevními záněty metodou ELISA" na pediatrické konferenci v Olomouci (IX. český pediatrický kongres s mezinárodní účastí v tradici kongresu pediatrů a dětských sester - XXVIII. dnů praktické a nemocniční pediatrie, 19.-22.5.2010) (viz Příloha 6).

-

Vědecký poster „Význam vyšetření hepcidinu u vrozených poruch erytropoézy.“ na XXI. konferenci dětských hematologů a onkologů České a Slovenské republiky, 7. - 9. října 2011 (viz Příloha 7).

-

Grant FRVŠ 2413/2010/G3: „Vytvoření multimediální učebnice s komplexním přehledem poruch metabolismu železa a jejich projevech v hematologii“ na nosiči CD

(viz

Příloha

8 - 73 -

a

přiložené

CD).


Příloha 1

- 74 -


Příloha 1

LETTERS TO THE EDITOR Hepcidin levels in Diamond-Blackfan anemia reflect erythropoietic activity and transfusion dependency Diamond-Blackfan anemia (DBA) is a rare congenital red cell aplasia associated with mutations in ribosomal proteins (RP) in 49-71% of cases.1 DBA is a clinically heterogeneous disorder with one-third of patients developing transfusion-acquired iron overload.2 The severity of anemia and transfusion dependency in DBA is comparable to transfusion-dependent beta-thalassemia major. However, moderate to severe suppression of erythropoiesis in DBA2 is in contrast to accelerated ineffective erythropoiesis in beta-thalassemia.3,4 Knowledge of systemic iron regulation in DBA is limited. In this study, we assessed selected markers of erythropoietic activity and iron metabolism including the key molecule of this process, hepcidin, in DBA patients from the Czech National DBA Registry (Table 15 and Online Supplementary Table S1).6 The cohort was made up of 12 patients receiving regular transfusions with or without chelation therapy, 4 patients on steroids, 7 patients in remission without treatment, and 2 patients treated with corticosteroids and occasional transfusions. Nine patients, mostly from the transfusion-dependent group, were concomitantly treated with leucine (Online Supplementary Table S1).7 In transfusion-dependent patients, reduced number of erythroblasts in the bone marrow (median 0.8%), together with markedly decreased soluble transferrin receptor (sTfR, often under the lower limit of detection), confirmed

severely suppressed erythropoiesis that corresponded to substantially elevated erythropoietin (EPO) levels (median 2452 IU/L) (Table 1). Analysis of iron parameters showed increased serum iron, transferrin saturation (TSAT) and high ferritin levels (median 1290 ng/mL) (Table 1). This suggests that erythropoiesis of these patients is not able to utilize transferrin-bound iron effectively. Liver biopsy in 5 selected transfusion-dependent patients consistently showed markedly elevated liver iron concentration (LIC) (Table 1). Moreover, massive iron stores were detected in both hepatocytes and Kupffer cells (Figure 1A), distinguishing DBA from beta-thalassemia major with iron deposits predominantly in macrophages.4 The macrophage iron loading can be attributed to non-effective erythrocytederived iron recycling.8,9 Iron deposits in hepatocytes likely resulted from increased iron uptake by these cells. The involvement of non-transferrin-bound iron (NTBI) needs to be considered, as NTBI can be found in the plasma of patients with oversaturated transferrin and liver is the primary site for deposition of free iron from plasma.10,11 Since 2009, all our transfusion-dependent patients have been monitored for potential cardiac, liver and pancreatic iron overload by magnetic resonance imaging (MRI).12 Contrary to transfusion-dependent DBA patients, patients who are currently in disease remission or on steroids showed improved erythropoiesis as documented by near normal/higher number of bone marrow erythroblasts and the levels of sTfR within the normal range (Table 1). These patients had slightly increased or even normal levels of ferritin and near normal serum iron and TSAT (Table 1). This indicates that, in patients who achieved a remission state or who are hematologically stable on

Table 1. Parameters of iron status and erythropoietic activity in subgroups of Diamond-Blackfan anemia patients.

Age (years) Hepcidin (ng/mL) Ferritin (ng/mL) Hepcidin/ferritin ratio Fe (µmol/L) TSAT (%) LIC (mg/g d.w.) GDF15 (pg/mL) EB (%) EPO (IU/L) sTfR (mg/L)

TDP (n=12)

RP (n=7)

SP (n=4)

S,T* (n=2)

Reference range

7.6 (1.0-27.9) 341.5 (165.1-572.6) 1290 (343-3747) 0.240 (0.09-1.35) 41.5 (35.8-59.0) 91 (61-100) 7.3# (4.6-16.3) 676.2 (352.1-1694.8) 0.8 (0.4-8.2) 2452 (837-6476) ND† <0.5-1.2

26.9 (13.3-35.8) 72.1 (29.5-153.3) 177 (42-1079) 0.222 (0.09-1.04) 20.0 (10.0-30.6) 38 (25-55) ND

32.6 (27.0-42.9) 24.7 (8.5-100.1) 188 (44-637) 0.151 (0.10-0.19) 21 (14.7-33.4) 64 (63-65) ND

25.8 25.9 173.9 144.9 3150 868 0.06 0.17 39.6 43.2 93 94 ND

−

927.0 (556.3-2824.8) 21.4 (8.4-34.0) 137 (20-1913) 2.3 (1.3-3.2)

1127.6 (408.8-2190.8)3497.1 20.4 (16.8-33.4) 441 (287-500) 2.4 (1.8-2.8)

4221.5 (166-344)12 10.6 20.8 615 4000 1.4 1.4

27.6 (13.1-104.8)5 22-275 0.35 (0.2-2.2)5 7.2-29 21-48 0.3-1.4 223 15.0-25.0 4.3-29.0 1.9-4.45

Values are shown as medians and the full range of variation. TDP: transfusion-dependent patients; RP: patients in disease remission; SP: patients treated with steroids; S,T: patient on steroids and occasional transfusion; Fe: serum iron; TSAT: transferrin saturation; LIC: liver iron concentration, d.w.: dry weight; GDF15: growth differentiation factor 15; EB: erythroblasts in the bone marrow; EPO: serum erythropoietin; sTfR: soluble transferrin receptor; ND: not determined. *: individual values are shown; #: values available for 5 patients; †: median could not be calculated as 9 of 12 patients had sTfR bellow the limit of detection (less than 0.5 mg/L). Detailed description of individual methods can be found in the Online Supplementary Appendix. Pre-transfusion samples were collected for TDP.

haematologica | 2014; 99(7)

1

- 75 -


Příloha 1

Letters to the Editor

D P<3*10-5 R=0.742

3500

Ferritin

A

2500

1500

CZUH03

500

CZUH41

0

B P<5*10-5

600

P<10-6

% of erythroblasts

Hepcidin

400 300 NS

100 0

C

Controls

Whole cohort

TDP

P<10

200

300 400 Hepcidin

20

10

RSP

F

-6

0

100

200

300 400 Hepcidin

P<5*10-5

EPO

2500 P<1.6*10-5

500 600

P<1*10-3 R=0.635

6000

3500

GDF15

500 600

P<3*10-6 R=-0.795

30

0 4500

100

E

500

200

0

4000

1500 2000 500 0

Controls

Whole cohort

TDP

0

RSP

0

100

200

300 400 Hepcidin

500 600

Figure 1. Hepatic iron distribution, hepcidin and GDF15 levels and correlation analyses. (A) Perl’s staining showing iron deposits in the liver of two transfusion-dependent DBA patients; CZUH03 at the age of 10 (LIC, 4.6 mg/g d.w.) and CZUH41 at the age of 5 (10.3 mg/g d.w.). Massive iron stores (blue stain) can be found in both hepatocytes and Kupffer cells. Similar pattern of iron staining was obtained for the remaining three transfusion-dependent DBA patients analyzed (data not shown). (B) Significantly increased hepcidin levels in comparison with healthy controls were detected for the whole DBA cohort (n=25) and transfusion-dependent DBA patients (TDP, n=12); DBA patients in remission or treated with steroids (RSP, n=11) had hepcidin levels comparable with the controls. (C) GDF15 levels were significantly elevated in the whole DBA cohort (n=25), TDP (n=12) and RSP (n=11) when compared to healthy controls. (D-F) Hepcidin levels showed the following correlations: positive with ferritin (D), negative with the number of erythroblasts in the bone marrow (E) and positive with serum EPO (F). Closed and open circles depict TDP and RSP, respectively. Asterisk shows one patient on steroids and occasional transfusions; the other similarly treated patient (CZUH37) was excluded from statistical analyses due to concomitant occurrence of DBA and HFE C282Y homozygous mutation. The image in (A) was visualized with an Olympus IX 71 light microscope (Olympus, Hamburg, Germany), original magnification 400× and acquired with an Olympus DP 50 camera driven by DP controller software (provided by Olympus). Data in (B and C) are shown in a box plot depicting median (closed square), 25-75% range (box), and the highest and lowest value (the highest and the lowest whiskers, respectively). Image was assembled and labeled using Adobe Photoshop software (Adobe Systems, San Jose, CA, USA). NS: not significant.


2

- 76 -


Příloha 1


steroids, the improved erythropoietic activity increases iron utilization and consequently leads to amelioration of hyperferritinemia. The effect of leucine treatment on iron metabolism seems to be indirect (via improved erythropoiesis).7 Using reverse-phase liquid chromatography,5 we observed significantly higher hepcidin levels for the whole DBA cohort in comparison with healthy controls (median 165.1 vs. 27.6 pg/mL; P<0.00005) (Figure 1B). When hepcidin was assessed in individual subgroups of DBA patients, patients on regular transfusions showed significantly elevated hepcidin (median 341.5 pg/mL), as previously shown for transfusion-dependent beta-thalassemia major patients.4 Increased hepcidin above the median value of controls was detected even in the youngest patients aged 1.0 and 2.7 years (6-times and 20-times, respectively). This suggests that the absent or diminished erythropoiesis in the bone marrow, together with transfusions, is the driving factor for iron overload from early childhood. In contrast, DBA patients in remission or on steroids had hepcidin levels comparable to controls (medians 72.1 and 24.7 pg/mL, respectively) (Figure 1B). As erythropoiesis is known to produce a signal for hepcidin suppression,8,9 DBA patients with restored erythropoietic activity are likely to be able to attenuate hepcidin expression and thus increase the iron pool available for improved erythropoiesis. In agreement with this concept, we detected a trend towards lower hepcidin-ferritin ratio in patients on steroids (median 0.151) or patients in remission (median 0.222) when compared to transfusion-dependent patients (median 0.240) (Table 1), although these individual values were not significantly different from the hepcidin-ferritin ratio of healthy controls (median 0.35).5 Indeed, the hepcidin-ferritin ratio, which indicates suppression of hepcidin proportional to iron loading, is much higher in transfused DBA patients (range 0.09-1.35) than the hepcidin-ferritin ratio reported for transfusion-dependent beta-thalasemia major patients (range 0.02-0.3),4 suggesting that the erythroid drive suppressing hepcidin is much stronger in beta-thalassemia and not completely attenuated by transfusions. On the other hand, the bone marrow of DBA patients receiving transfusions is probably not releasing the putative erythroid suppressor of hepcidin production. In the 2 patients evaluated independently, hepcidin-ferritin ratio was more comparable with patients on steroids, reflecting their improved erythropoiesis (Table 1). Nevertheless, patient CZUH37 inherited a homozygous C282Y HFE mutation (Online Supplementary Table S2), which may contribute to inappropriately low levels of hepcidin (173.9 ng/mL) for the observed hyperferritinemia (3150 ng/mL).13 We next examined the levels of growth differentiation factor 15 (GDF15), a candidate negative regulator of hepcidin in beta-thalassemia and a marker of ineffective erythropoiesis.3 Significantly increased levels of GDF15 were detected for the whole DBA cohort as well as for the groups receiving different treatments when compared to normal controls (Figure 1C). We suppose that elevated levels of GDF15 in DBA patients may reflect the increased apoptosis of bone marrow erythroblasts that we observed in DBA patients selected for the TUNEL assay (Online Supplementary Figure S1).3 Lastly, we assessed which of the aforementioned signals/markers contribute to the regulation of hepcidin synthesis in DBA. Hepcidin positively correlated with ferritin (P=0.00003) (Figure 1D), reflecting hepcidin stimulation by the patients’ iron overload. An inverse correlation between the percentage of bone marrow erythroblasts and

hepcidin levels (P=0.000003) (Figure 1E) is consistent with negative regulation of hepcidin synthesis by erythropoietic activity. Although a negative correlation between EPO and the number of erythroblasts in the bone marrow (data not shown) confirms that EPO is stimulated in response to suppressed erythropoiesis and hypoxia, a positive correlation between hepcidin and EPO (P=0.001) (Figure 1F) demonstrates that hepcidin suppression by EPO requires active erythropoiesis in the bone marrow.14,15 Similarly, no correlation between hepcidin or hepcidin-ferritin ratio and GDF15 indicates that GDF15 is not playing a hepcidin-regulatory role in DBA. We conclude that DBA patients with different severities of anemia and different treatment strategies have diverse levels of hepcidin and iron overload. Hepcidin production in DBA reflects variable erythropoietic activity in the bone marrow and further contributes to the heterogeneity of this disease. It will be important to address whether some of these dissimilarities can be attributed to different types of disease-causing RP mutations. Dagmar Pospisilova,1 Dusan Holub,2 Zuzana Zidova,3 Lucie Sulovska,1 Jiri Houda,1 Vladimir Mihal,1 Ivana Hadacova,4 Lenka Radova,5 Petr Dzubak,2 Marian Hajduch,2 Vladimir Divoky,3 and Monika Horvathova3 1 Department of Pediatrics, Faculty of Medicine and Dentistry, Palacky University and University Hospital Olomouc; 2Institute of Molecular and Translational Medicine, Faculty of Medicine and Dentistry, Palacky University, Olomouc; 3Department of Biology, Faculty of Medicine and Dentistry, Palacky University; 4 Department of Pediatric Hematology and Oncology, Charles University, 2nd Faculty of Medicine, Prague; 5Central European Institute of Technology, Masaryk University, Brno, Czech Republic

Correspondence: [email protected] [email protected] doi:10.3324/haematol.2014.104034 Key words: Diamond Blackfan anemia, hepcidin levels, erythropoietic activity, transfusion dependency. DH and ZZ contributed equally to this manuscript. The online version of this article has a Supplementary Appendix. Funding: this work was supported by grant No. NT/11059 (Ministry of Health, Czech Republic) and partially by grants No. LF_2013_010 and LF_2013_015 (Internal Grant Agency of Palacky University). DH, PD and M Hajduch were supported by CZ.1.05/2.1.00/01.0030 (Ministry of Education, Youth and Sports, Czech Republic), M Horvathova, LS and VD were supported by NT/13587 (Ministry of Health, Czech Republic) and M Horvathova and VD partially by P305/11/1745 (Czech Science Foundation). LR was supported by 306242 NGS-PTL (the FP7 grant). Acknowledgments We thank Zuzana Prouzova, M.D. (Department of Clinical and Molecular Pathology, University Hospital Olomouc) for photomicrographs of the liver. Information on authorship, contributions, and financial & other disclosures was provided by the authors and is available with the online version of this article at www.haematologica.org.

References 1. Boria I, Garelli E, Gazda HT, Aspesi A, Quarello P, Pavesi E, et al. The ribosomal basis of Diamond-Blackfan Anemia: mutation and database update. Hum Mutat. 2010;31(12):1269-79. 2. Vlachos A, Ball S, Dahl N, Alter BP, Sheth S, Ramenghi U, et al. Diagnosing and treating Diamond Blackfan anaemia: results of an international clinical consensus conference. Br J Haematol.


3

- 77 -


Příloha 1


2008;142(6):859-76. 3. Tanno T, Noel P, Miller JL. Growth differentiation factor 15 in erythroid health and disease. Curr Opin Hematol. 2010;17(3):184-90. 4. Origa R, Galanello R, Ganz T, Giagu N, Maccioni L, Faa G, et al. Liver iron concentrations and urinary hepcidin in beta-thalassemia. Haematologica. 2007;92(5):583-8. 5. Mojzikova R, Koralkova P, Holub D, Zidova Z, Pospisilova D, Cermak J, et al. Iron status in patients with pyruvate kinase deficiency: neonatal hyperferritinaemia associated with a novel frameshift deletion in the PKLR gene (p.Arg518fs), and low hepcidin to ferritin ratios. Br J Haematol. 2014;doi: 10.1111/bjh.12779. 6. Pospisilova D, Cmejlova J, Ludikova B, Stary J, Cerna Z, Hak J, et al. The Czech National Diamond-Blackfan Anemia Registry: clinical data and ribosomal protein mutations update. Blood Cells Mol Dis. 2012;48(4):209-18. 7. Pospisilova D, Cmejlova J, Hak J, Adam T, Cmejla R. Successful treatment of a Diamond-Blackfan anemia patient with amino acid leucine. Haematologica. 2007;92(5):e66-7. 8. Ganz T, Nemeth E. Hepcidin and iron homeostasis. Biochim Biophys Acta. 2012;1823(9):1434-43. 9. Hentze MW, Muckenthaler MU, Galy B, Camaschella C. Two to tango: regulation of mammalian iron metabolism. Cell. 2010;142(1):

24-38. 10. Brissot P, Ropert M, Le Lan C, Loréal O. Non-transferrin bound iron: a key role in iron overload and iron toxicity. Biochim Biophys Acta. 2012;1820(3):403-10. 11. Hoffbrand AV, Taher A, Cappellini MD. How I treat transfusional iron overload. Blood. 2012;120(18):3657-69. 12. Berdoukas V, Nord A, Carson S, Puliyel M, Hofstra T, Wood J, et al. Tissue iron evaluation in chronically transfused children shows significant levels of iron loading at a very young age. Am J Hematol. 2013;88(11):E283-5. 13. van Dijk BA, Laarakkers CM, Klaver SM, Jacobs EM, van Tits LJ, Janssen MC, et al. Serum hepcidin levels are innately low in HFErelated haemochromatosis but differ between C282Y-homozygotes with elevated and normal ferritin levels. Br J Haematol. 2008;142(6):979-85. 14. Vokurka M, Krijt J, Sulc K, Necas E. Hepcidin mRNA levels in mouse liver respond to inhibition of erythropoiesis. Physiol Res. 2006;55(6):667-74. 15. Pak M, Lopez MA, Gabayan V, Ganz T, Rivera S. Suppression of hepcidin during anemia requires erythropoietic activity. Blood. 2006;108(12):3730-5.


4

- 78 -


Příloha 2

- 79 -


Příloha 2

Výskyt anémie a význam měření hladiny hepcidinu metodou ELISA u dětí s nespecifickými střevními záněty.

MUDr. Jiří Houda1 MUDr. Petr Džubák, Ph.D.1,2 MUDr. Eva Karásková1 Mgr. Dušan Holub2 MUDr. David Vydra1 Mgr. Dana Mlčůchová2 doc. MUDr. Marián Hajdúch, Ph.D.2 doc. MUDr. Oldřich Pozler, Ph.D.3 doc. MUDr. Dagmar Pospíšilová, Ph.D.1 1

Dětská klinika při LF UP a FN Olomouc, Puškinova 6, 77900, Olomouc, přednosta prof.

MUDr. V. Mihál, CSc., 2

Laboratoř experimentální medicíny, Ústav molekulární a translační medicíny, Lékařská

fakulta UP Olomouc, Hněvotínská 5, 775 15 Olomouc, ředitel Doc. MUDr. Marián Hajdúch, Ph.D. 3

Dětská klinika LF a FN Hradec Králové, Sokolská 581, 500 05, Hradec Králové,

přednosta prof. MUDr. M. Bayer, CSc.

Kontakt na prvního autora: Dětská klinika FN Olomouc, Puškinova 6, 77900, Olomouc, tel. 588444403, e-mail [email protected]

Finanční podpora práce: Grant IGA MZ ČR NS9951–4/2008, IGA LF 2012_17, infrastrukturní část projektu byla podpořena z projektu operačního programu VaVpI CZ.1.05/2.1.00/01.0030.

- 80 -


Příloha 2

2

Souhrn: Cílem práce je zhodnotit výskyt anémie a její typ v souboru dětských pacientů (n = 133) s nespecifickými střevními záněty (IBD) a zhodnotit výsledky měření hladiny hepcidinu metodou ELISA u části dětí souboru (n = 56). Anémie byla zjištěna u 47,7 % pacientů. Ve 43 % případů je doprovázena sníženou hladinou feritinu a zvýšenou hladinou sTfR, nález tedy odpovídá kombinaci absolutního deficitu železa (IDA) s anémií chronických chorob (ACD). Typický obraz ACD se zvýšenou hladinou feritinu byl přítomen pouze u 7,7 %. Medián hladiny hepcidinu u pacientů s nespecifickými střevními záněty byl 42,0 ng/ml, tedy v mezích normy udané výrobcem ELISA kitu (13,3 – 54,4 ng/ml). Hladina hepcidinu byla zvýšena u 55 % dívek a u 18 % chlapců s IBD. Byla nalezena statisticky významná pozitivní korelace mezi hladinou hepcidinu a hladinou CRP (R = 0,30 a p < 0,041). Dále byly zjištěny signifikantně vyšší hladiny hepcidinu u mladistvých pacientů starších 18 let ve srovnání se skupinou pacientů < 18 let. Naše nálezy nasvědčují tomu, že u dětí s IBD převažuje anémie chronických chorob (ACD) v kombinaci s absolutním deficitem železa. Tyto výsledky se liší od dosud publikovaných dat u dospělých pacientů s IBD. Znalost hladiny hepcidinu může významně přispět k přesnějšímu stanovení stupně skutečného deficitu železa a může být důležitým faktorem při rozhodování o léčebném postupu u pacientů s IBD. Rovněž může být přínosem pro diskuzi o hierarchii jednotlivých regulačních systémů produkce hepcidinu.

Klíčová slova: anémie chronických chorob, sideropenická anémie, nespecifické střevní záněty, hepcidin, feroportin, ELISA

- 81 -


Příloha 2

3 The incidence of anaemia and the use of the ELISA method for measuring hepcidin levels in children with inflammatory bowel disease. The aim of the study was to define the incidence of anemia in children with inflammatory bowel disease (IBD) (n = 133), to identify the type of anemia and to assess the results of hepcidin measurement by ELISA test in part group of the IBD patients (n = 56). Anemia was found in 47.7% of patients. The ferritin level was decreased and the soluble transferrin level was increased in 43% of anemic patients. This finding correspond with the combination of iron deficient anemia (IDA) and anemia of chronic diseases (ACD). A typical laboratory feature of ACD with increased ferritin level was present in only 7.7 % of anemic patients. Mean value of hepcidin level in patients with IBD was 42.0 ng/ml, which is in normal range delivered by ELISA kit manufacturer (13.3 – 54.4 ng/ml). The hepcidin level was increased in 55 % of the female IBD patients and in 18 % of the male patients. The statistically significant positive correlation between hepcidin and CRP level was found (R = 0.30 a p < 0.041). The hepcidin level was significantly higher in young adults over 18 years old than in younger children. Our findings suggest that ACD is the most common type of anemia in IBD children and it is accompanied with iron deficiency. These results differ from currently published data in the group of adult IBD patients. Measuring hepcidin level may be a helpful tool in the iron deficiency diagnostics and may represent an important factor in the treatment of IBD patients. It may be helpful as well in a discussion of the hepcidin regulatory axis hierarchy.

Key Words: anaemia of chronic diseases, iron deficiency anaemia, inflammatory bowel diseases, hepcidin, ferroportin, ELISA

- 82 -


Příloha 2

4

Úvod Do skupiny nespecifických střevních zánětů patří Crohnova choroba (CD), ulcerózní kolitida (UC) a indeterminovaná kolitida. Crohnova choroba je chronické zánětlivé onemocnění kterékoliv části trávicí trubice s predilekčním postižením ileocekální oblasti a tlustého střeva. Postižení je segmentální a zánět postihuje celou tloušťku stěny střevní. Histologicky je přítomen smíšený zánětlivý infiltrát s nekaseifikujícími granulomy. Ulcerózní kolitida je chronické zánětlivé onemocnění tlustého střeva. Zánětlivá infiltrace postihuje pouze slizniční vrstvu. Histologicky je typický smíšený zánětlivý infiltrát a kryptové abscesy. Zánětlivé změny postihují vždy rektum a odtud se šíří dále do tlustého střeva. Tlusté střevo je postiženo kontinuálně. Indeterminovaná kolitida je zánětlivé onemocnění tlustého střeva, kdy z endoskopického ani histologického nálezu nelze odlišit mezi CD a UC. Nespecifické střevní záněty se nejčastěji manifestují u mladých osob ve druhém až čtvrtém deceniu. V posledních dvaceti letech došlo k několikanásobnému zvýšení výskytu těchto nemocí u dětí. Před 20. rokem života onemocní 25 − 30% [1]. V současné době je ve vyspělých zemích Evropy a USA incidence Crohnovy choroby mezi 4 – 6 případů/100 000 obyvatel a ulcerózní kolitidy mezi 6 – 12 případů/100 000 obyvatel [2]. V dětském věku se uvádí incidence Crohnovy choroby 4,9 – 10,9 případů/100,000 dětí, incidence ulcerózní kolitidy 2,1 – 4,3 případů/100,000 dětí [3]. Přesná příčina těchto onemocnění není známa. Na vzniku se podílí řada faktorů, a to genetických, imunologických, i vlivy životního prostředí [3]. Onemocnění má chronický, často závažný průběh a významně ovlivňuje nejen růst a vývoj dítěte, ale také celkovou kvalitu jeho života. Anémie je jednou z častých komplikací primárního onemocnění u pacientů s IBD [4] a může významně zhoršit kvalitu života dítěte [5]. Prevalence anémie u pacientů s IBD je udávána různě. Vyskytuje se u 40 až 68 % dospělých pacientů. Informace o jejím výskytu u dětí s IBD jsou zatím sporadické. Dle posledních studií je přítomna až u 70 % dětských pacientů [6]. Na vzniku anémie se podílí několik faktorů, z nichž nejvýznamnější roli hrají nedostatečný příjem a poruchy resorpce železa při zánětu střevní sliznice, ztráty krve z gastrointestinálního traktu a změny metabolismu železa při zánětu [7]. Ve vzácných případech se může anémie vyskytnout jako důsledek nežádoucích účinků léčby

- 83 -


Příloha 2

5 imunomodulačními léky (azathioprin, methotrexát). U pacientů s IBD se tak může objevit jak typický obraz anémie chronických chorob (ACD), tak její kombinace s absolutním deficitem železa (ACD/IDA). Udržení homeostázy Fe je nezbytné nejen pro adekvátní produkci hemoglobinu a myoglobinu, ale i pro zajištění řady oxidativních procesů. Proto je metabolismus Fe v organismu precizně regulován jak na úrovni buněk, tak na úrovni celého organismu. Jedním z hlavních regulátorů homeostázu železa je hepcidin [8]. Tento peptid se tvoří v játrech z prohepcidinu, u kterého nebyla biologická funkce dostatečně prokázána. Hepcidin se váže na feroportin, který je doposud jediným známým transmembránovým přenašečem Fe z intracelulárního prostoru enterocytu do krevního oběhu. Po vazbě hepcidinu na feroportin je celý komplex hepcidin-feroportin internalizován, v cytoplasmě degradován a výdej Fe do krevního oběhu klesá [9]. Hepcidin působí ve sliznici duodena na apikální straně enterocytů, kde snižuje absorpci Fe z gastrointestinálního traktu (GIT). Dále působí na membráně makrofágů fagocytujících senescentní erytrocyty, kde brání exportu železa uvolněného z erytrocytů zpět do krevního řečiště. Snížení hladiny hepcidinu má za následek zvýšení vstřebávání Fe, vysoké hladiny hepcidinu naopak transport Fe snižují, až zastavují. Produkce hepcidinu je negativně regulována deficitem Fe v organismu, zvýšenou aktivitou erytropoézy a hypoxií, pozitivně je regulována zánětem. Cílem této práce bylo v první řadě stanovit výskyt anémie v souboru dětí s IBD na podkladě analýzy vybraných hematologických a biochemických parametrů. Po roce 2009, kdy byla zavedena komerčně dostupná ELISA metoda měření hladiny hepcidinu, jsme u části pacientů vyšetřených v tomto období provedli stanovení hladiny hepcidinu, srovnání hladin hepcidinu se zdravou dětskou populací a zhodnocení významu měření hladiny hepcidinu pro diagnostiku anémie doprovázející IBD.

- 84 -


Příloha 2

6

Pacienti a metody Pacienti Soubor pacientů tvořilo 133 dětí s IBD (46 pacientů s UC a 87 s CD) diagnostikovaných v letech 2005 – 2011. Poměr děvčat a chlapců byl 1:1,56, věkové rozmezí bylo od 4 let do 18 let + 365 dní (medián 14 let). Pacienti byli diagnostikováni na základě Portských kritérií publikovaných v roce 2005 [1]. Aktivita onemocnění byla hodnocena pomocí indexů aktivity. U pacientů s CD byla aktivita hodnocena na základě Pediatric Crohn´s Disease Activity Index (PCDAI). Tento index posuzuje aktivitu dle klinických příznaků (bolest břicha, četnost stolic, aktivita pacienta), laboratorních hodnot (hematokrit, sedimentace erytrocytů, hladina sérového albuminu), antropometrických dat (hmotnost, růstová rychlost) a fyzikálního vyšetření pacienta [10, 11]. Pacienti s hodnotou PCDAI pod 10 bodů jsou v klinické remisi, mezi 11 a 30 mají pacienti lehkou formu onemocnění a nad 30 mají středně těžkou až těžkou formu onemocnění. U pacientů s UC byl použit Pediatric

Ulcerative Colitis Activity

Index

(PUCAI), který vychází z hodnocení klinických potíží pacienta (počet stolic za den, přítomnosti krve ve stolici, bolesti břicha, noční stolice, aktivita pacienta) [12]. Pacienti s hodnotou PUCAI < 10 body byli v remisi onemocnění, mezi 10 a 30 body se jedná o malé či střední postižení a u pacientů s indexem > 65 bodů hodnotíme onemocnění jako velmi závažné. Hodnocení aktivity onemocnění bylo prováděno v den odběru biologického materiálu. Vzorky krve použité k výše uvedeným laboratorním vyšetřením byly odebrány při pravidelných klinických kontrolách pacientů v gastroenterologických ambulancích. Po zavedení metody ELISA k vyšetření hladin hepcidinu byly v letech 2009 – 2011 odebrány vzorky krve u 56 pacientů s IBD (36 pacientů s CD a 20 pacientů s UC). Výsledky vyšetření hepcidinu pacientů s IBD byly porovnány se skupinou zdravých kontrol (n = 32) ve věku 1 – 17 let (medián 5 let), do které byli zahrnuti dětští pacienti vyšetření v rámci předoperační přípravy před plánovaným chirurgickým výkonem. Tito pacienti neměli známky akutní infekce a netrpěli žádným onkologickým, autoimunním či hematologickým onemocněním. Znění informovaného souhlasu bylo schváleno etickou komisí LF UP v Olomouci.

- 85 -


Příloha 2

7

Laboratorní metody U všech pacientů byl v certifikované laboratoři (ISO 9001:2000) v automatickém analyzátoru vyšetřen krevní obraz se zaměřením na zhodnocení charakteristik erytrocytů – hladiny hemoglobinu (Hb), hematokritu (HTC), počtu erytrocytů (ERY), středního objemu erytrocytu (MCV), koncentrace Hb v erytrocytu (MCH) a šíře distribuce erytrocytů (RDW). Standardními biochemickými metodami byly vyšetřeny parametry metabolismu železa – hladina železa v séru (Fe-S), feritin, solubilní transferinový receptor (sTfR), a vybrané markery zánětu – interleukin-6 (IL-6) a C-reaktivní protein (CRP). Jednotlivé hodnoty vyšetřovaných parametrů byly hodnoceny podle platných norem uvedených v tab. 1 a 2.

Tab. 1 – Laboratorní normy krevního obrazu pro dětskou populaci rozdělené podle věku a pohlaví (Nathan and Oski’s Hematology of Infancy and Childhood, 7th Edition).

Tab. 2 – Laboratorní normy biochemických vyšetření pro dětskou populaci rozdělené podle věku a pohlaví dítěte (Nathan and Oski’s Hematology of Infancy and Childhood, 7th Edition).

Stanovení hepcidinu ELISA metodou

- 86 -


Příloha 2

8 Plazma určená ke změření hladiny hepcidinu byla rozdělena do alikvotů, aby se předešlo opakovanému rozmrazování, a zamražena při -80°C. K měření hladiny hepcidinu byl použit komerční ELISA kit (DRG Instruments, Germany, Division of DRG International, Inc.) ve formě komerčních kitů. Parametry metody dle výrobce byly následující: norma pro hladinu hepcidinu 13,3 – 54,4 ng/ml (5 – 95 % percentil), dynamický rozsah 0,9 – 140 ng/ml, senzitivita této metody byla stanovena na 0,9 ng/ml. Reprodukovatelnost metody je stanovena pomocí koeficientu variace v rámci kitu na 4,86 % a mezi kity na 11,42 %.Výsledná absorbance byla změřena při vlnové délce 450 ± 10 nm pomocí spektrofotometru Labsystems iEMS Reader MF (Labsystems Oy, Helsinki, Finland). Vzorky byly měřeny v tripletech a z naměřených hodnot absorbance

byla vypočítána průměrná hodnota. K

výpočtu kalibrační křivky byly použity průměrné hodnoty absorbance standardních roztoků o známé koncentraci – standard 0,00 – 3,85 – 11,50 – 23,00 – 70,00 a 140,00 ng/ml. Z rovnice kalibrační křivky byly vypočítány hodnoty koncentrace hepcidinu pro naměřenou impedanci vzorků jednotlivých pacientů.

Statistická metodika Ke zpracování naměřených hladin hepcidinu byly použity hodnoty mediánu a 95 % interval spolehlivosti. Výsledky byly zobrazeny pomocí krabicových grafů. Ke srovnávání výskytu jevů mezi jednotlivými soubory pacientů byl použit Mannův-Whitneyho test (srovnání dvou souborů) a Kruskallův-Wallisův ANOVA test (srovnání 3 souborů). Vztah mezi hladinou hepcidinu a jednotlivými výsledky laboratorních vyšetření byl hodnocen pomocí neparametrické korelační analýzy (Spearmanův korelační koeficient). Za statisticky významné byly považovány hodnoty p < 0,05. Statistická analýza byla provedena počítačovým softwarem Statistica (StatSoft CR s.r.o., Czech Republic).

- 87 -


Příloha 2

9

Výsledky Výsledky vybraných parametrů krevního obrazu a metabolismu železa v celém souboru 133 dětských pacientů s IBD (CD a UC) jsou shrnuty v tab. 3. V tabulce jsou uvedeny mediány naměřených hodnot a jejich rozptyl pro jednotlivé parametry a jsou rozděleny podle typu IBD.

Tab. 3 - Srovnání výsledků laboratorních vyšetření u celého souboru dětských pacientů rozdělených podle typu IBD.

Vyšetření krevního obrazu Prevalence anémie u dětských pacientů s IBD v populaci s vyšetřenou hladinou hepcidinu byla 47,7% (n = 56), u pacientů s UC 45,7 % (n = 25) a u pacientů s CD 46% (n = 31). Medián hladiny hemoglobinu u dívek s IBD byl 121 g/l (SD 16,6) u chlapců 123,5 g/l (SD 24,0). Mikrocytóza byla přítomna u 62,4 % pacientů s IBD. Závažná anémie s nutností podání transfúze erytrocytů se vyskytla pouze u 3 pacientů.

Vyšetření parametrů metabolismu železa Snížená hladina železa v séru byla u 52 ze 117 pacientů (44,4 %). Snížená hladina feritinu byla zjištěna u 68 ze 116 pacientů (58,6 %). U 55 ze 109 pacientů (50,5 %) byla prokázána zvýšena hladina sTfR. U 9 z 22 pacientů (42,3 %) ze skupiny pacientů s vyšetřenou hladinou Fe-S, feritinu a sTfR byla zjištěna současně snížená sérová hladina železa, snížená hladina feritinu a zvýšená hladina solubilního transferinového receptoru (viz. tab. 3).

Parametry zánětu U 44 % z 58 pacientů byla zjištěna zvýšená hladina CRP. U 24 pacientů byl vyšetřen IL-6 a u 4 pacientů (17 %) byla jeho hladina zvýšena. Byla prokázána statisticky významná pozitivní korelace mezi hladinou hepcidinu a hladinou CRP (R = 0,30 a p < 0,041), viz. graf 1.

- 88 -


Příloha 2

10

Hepcidin Z důvodu nově komerčně dostupného ELISA kitu pro měření hladiny hepcidinu bylo vyšetření metabolismu železa u posledních 56 pacientů s IBD (dívky vs. chlapci 1:1,8) doplněno o vyšetření plazmatické hladiny hepcidinu. Třicet jeden pacient trpěl Crohnovou chorobou (8 dívek a 23 chlapců) a 25 pacientů ulcerózní kolitidou (12 dívek a 13 chlapců). Medián hladiny hepcidinu u všech změřených pacientů s IBD byl 42,0 ng/ml, tedy v mezích normy udané výrobcem kitu (13,3 – 54,4 ng/ml). Medián hladiny hepcidinu u dívek s IBD byl 65,2 ng/ml (n = 20, SD 40,5) a u chlapců 38,3 ng/ml (n = 36, SD 26,4). U dívek je medián hladiny hepcidinu signifikantně vyšší než u chlapců (p = 0,0042). Dle typu onemocnění pak u pacientů s UC byl medián hladiny hepcidinu 42,2 ng/ml (SD 38,2). U pacientů s CD byl medián hladiny hepcidinu 41,8 ng/ml (SD 30,1). Hladina hepcidinu byla zvýšená (> 54,4 ng/ml) u 11 z 20 dívek (55 %) s IBD a u 6 % z 36 chlapců s IBD. Snížená hladina hepcidinu (< 13,3 ng/ml) byla u 5 % dívek a u 3,6 % chlapců. Následující korelační analýzy byly provedeny v souboru 56 pacientů, u kterých byla stanovena hladina hepcidinu.

Graf 1 - Korelace hladiny hepcidinu s hladinou CRP u pacientů s IBD. Tab. 4 ukazuje korelace hladiny hepcidinu s koncentrací hemoglobinu, sérovou hladinou železa, feritinu, solubilního transferinového receptoru, CRP, s indexy aktivity PCDAI a PUCAI v souboru pacientů s IBD (n = 56). Kromě statisticky významné korelace mezi hladinou hepcidinu a hladinou CRP nebyla nalezena významná korelace mezi ostatními vyšetřovanými markery.

- 89 -


Příloha 2

11

Tab. 4 - Korelace hepcidinu s výsledky laboratorních měření a indexy aktivity. Fe-S, sérové železo; sTfR, solubilní transferinový receptor; CRP, C-reaktivní protein; PCDAI, index aktivity Crohnovy choroby u dětí; PUCAI, index aktivity ulcerózní kolitidy u dětí. U pacientů s CD byl spočítán PCDAI. Rozptyl 1 – 16 bodů, medián 1. Nebyla zjištěna statisticky významná korelace mezi PCDAI a hladinou hepcidinu (p = 0,74; R = -0,063; n = 31). V klinické remisi bylo 29 pacientů (94 %), lehkou formu onemocnění měli 2 pacienti (6 %) a těžkou formu onemocnění v našem souboru neměl žádný pacient s CD. U pacientů s UC byl spočítán PUCAI. Rozptyl byl 0 – 40 bodů, medián 0. Rovněž nebyla zjištěna korelace mezi PUCAI a hladinou hepcidinu (p = 0,30; R = -0,22; n = 25). V remisi onemocnění bylo 21 pacientů (84 %), malé či střední postižení měli 4 pacienti (16 %) a závažnou formu onemocnění neměl žádný pacient. Ve skupině pacientů s IBD vyšetřené pro hladinu hepcidinu (n = 49) byla zjištěna významná nepřímá korelace mezi feritinem a sTfR (p < 0,000001; R = -0,68; n = 49) a mezi feritinem a RDW (p < 0,0002; R = -0,52; n = 48). U 17 z 56 pacientů (30%) byla zjištěna anémie a u 7 ze 17 pacientů s anémií byla hladina hepcidinu zvýšená. V grafu 2 je zobrazena distribuce hladiny hepcidinu u pacientů s UC (n = 25), s CD (n = 31) a u HC (n = 32). Nebyl zjištěn statisticky významný rozdíl mezi jednotlivými diagnózami pacientů s IBD. Jejich hladina hepcidinu se statisticky významně neliší od zdravých kontrol (HC).

- 90 -


Příloha 2

12

Graf 2 - Rozložení hladiny hepcidinu u pacientů s UC, CD a HC. Sloupce vymezují data mezi pátým a 95. percentilem. Rámeček označuje interkvartální rozsah a medián hodnot dané skupiny. UC, ulcerózní kolitida; CD, Crohnova choroba; HC, zdravé kontroly. Pro zhodnocení rozdílů hladiny hepcidinu u dětských pacientů v různých věkových skupinách byl soubor rozdělen do věkové skupiny pacientů dětí do 18 let a mladistvých do 19 let. U skupiny pacientů nad 18 let věku byly zjištěny signifikantně vyšší hladiny ve srovnání s mladšími pacienty (p < 0,04). Medián hladiny hepcidinu dětí do 18 let byl 45,5 ng/ml (n = 41) a u pacientů 18 let a více byl medián 69,5 ng/ml (n = 15), viz. graf 3.

- 91 -


Příloha 2

13 Graf 3 - Rozdíl hladin hepcidinu u dětí (pod 18 let) a mladých dospělých (18 a více let). Závislost hladiny hepcidinu na hladině Hb, RDW či MCV se u pacientů s anémií nepotvrdila.

- 92 -


Příloha 2

14

Diskuze Z analýzy celého souboru pacientů vyplývá, že anémie je častým doprovodným příznakem u pacientů se zánětlivým střevním onemocněním. Byla přítomná u téměř poloviny sledovaných dětí s IBD, což je v souladu s dosud publikovanými údaji [9, 13, 14]. Většinou se jedná o lehkou anémii, což může být dáno vyšším zastoupením pacientů vyšetřených v remisi onemocnění. Anémie je ve 43 % případů doprovázena sníženou hladinou feritinu a zvýšenou hladinou sTfR. V těchto případech se tedy jedná o kombinaci ACD s absolutním deficitem železa (ACD/IDA). Termín ACD/IDA použil Theurl (2009) a označoval jím ACD charakterizovanou výskytem anémie u pacientů s chronickou infekcí, autoimunitním onemocněním nebo malignitou v kombinaci se sníženou hladinou Hb, zvýšenou vazebnou kapacitou a sníženou hladinou feritinu [15]. Typický obraz ACD, kterou autor definuje jako sníženou hladinu Hb a normální nebo zvýšenou hladinu feritinu, byl v jejich souboru přítomen pouze u 7,7 %. Podobný nález byl prokázán i v souboru pacientů s vyšetřenou hladinou hepcidinu, ve kterém jsme prokázali anémii charakteru ACD/IDA u 43 % dětí a obraz charakteristický pro ACD u 11,8 % dětí. Dosud bylo publikováno pouze velmi málo prací hodnotících hladinu hepcidinu u pacientů s IBD [16, 17, 18, 19]. Všechny práce se zabývají pouze dospělými pacienty. Oustamanolakis (2010) srovnává hladiny hepcidinu u dospělých pacientů s IBD (n = 100) měřených metodou ELISA se zdravou populací (n = 102) [16]. U pacientů s IBD prokázal statisticky významně zvýšenou hladinu hepcidinu, signifikantně negativní korelaci mezi hepcidinem a Hb a pozitivní korelaci mezi hepcidinem a feritinem a mezi hepcidinem a hladinou CRP. V našem souboru pacientů však tyto nálezy nebyly potvrzeny. Rozdíl mezi hladinami hepcidinu mezi dětskými pacienty a zdravými kontrolami nebyl statisticky významný. Potvrdili jsme pouze pozitivní korelaci mezi hladinami hepcidinu a CRP. U pacientů s anémií a/nebo mikrocytózou jsme oproti řecké práci prokázali negativní korelaci mezi hladinou hepcidinu a feritinu. Arnold (2009) ve své práci srovnává soubor dospělých pacientů s IBD (n = 61) se souborem zdravých kontrol (n = 25) [17]. Anémie byla zjištěna u 33% pacientů s IBD. U 90% pacientů s anémií byla nižší hladina feritinu a/nebo sérového železa a spadala do skupiny pacientů s IDA. Na rozdíl od řecké práce [16], kde byly hladiny hepcidinu u pacientů s IBD zvýšené, britští autoři zjistili signifikantně nižší hladiny hepcidinu u pacientů s IBD než u zdravých kontrol. Tento nález je v souladu s přítomností kombinace ACD/IDA u

- 93 -


Příloha 2

15 pacientů s IBD. Snížení hladiny hepcidinu u pacientů s IBD autor v diskuzi přikládá postižení střevní sliznice zánětem a ztrátě tzv. Panethových buněk, které ve střevní sliznici sekretují antimikrobiální peptidy, i hepcidin. Zastává hypotézu, že snížení hladiny hepcidinu může být příčinou rozvoje střevního zánětu nebo že se podílí na chronickém průběhu IBD. Tato hypotéza však dosud nebyla potvrzena. V nizozemské studii [18] byla změřena hladina hepcidinu v séru dospělé zdravé populace rozdělené dle pohlaví a věku. Autoři uvádí rozdíly mezi jednotlivými pohlavími, kdy hladina hepcidinu byla u žen nižší než u mužů (medián u žen 18,1 ng/ml a u mužů 21,8 ng/ml). Odkazují se na práci prof. Ganze [19], který rozdíly mezi pohlavími interpretuje jako důsledek nižších zásob železa u žen především ve fertilním věku (medián věku zdravých amerických žen 32,5 a italských 28). U žen dále Galesloot zjistil významně nižší hladinu hepcidinu u premenopauzálních žen v porovnání s postmenopauzálními ženami. U mužů se hladina s věkem neměnila. V naší práci jsme potvrdili rozdíl mezi hladinami hepcidinu v plasmě u dívek a chlapců s IBD (medián pro dívky 65,2 ng/ml a 38,3 ng/ml pro chlapce) a pozorovali jsme stoupající trend mediánu hladiny hepcidinu s věkem, pro což svědčí signifikantní rozdíl hladiny hepcidinu mezi skupinou pacientů pod 18 let věku a starších. Dětští gastroenterologové pečují v odborných ambulancích o pacienty ve věku do 18 let + 365 dní. I v dětském věku je tedy hladina hepcidinu závislá na stáří pacienta. Vzestupný trend hladiny hepcidinu je srovnatelný u chlapců i u dívek. Údaje o normálním rozmezí hladin hepcidinu u dětí v literatuře zatím chybí. Stanovení norem je v současné době problematické i proto, že doposud nebyla stanovena nejspolehlivější metoda měření hladiny hepcidinu. Kroot [20] se zabýval srovnáním 22 laboratorních metod měřících hladinu hepcidinu. Mezi nejpoužívanější metody ke stanovení hladiny hepcidinu patří metody imunochemické (RIA, ELISA) a metody proteomické (LCMS/MS, MALDI-TOF MS, apod.). Bylo zjištěno, že různé metody přináší různé výsledky a že se jednotlivé metody v absolutních číslech výrazně liší. Standardizace výsledků vyžaduje vyšetřování na velkém souboru pacientů. Produkce hepcidinu je regulována několika signálními drahami, které řídí transkripci genu pro hepcidin (HAMP). Mezi faktory ovlivňující tyto dráhy patří zánětlivé cytokiny (IL-6) aktivující kaskádu STAT3 [21, 22], která spouští transkripci genu HAMP, kódujícího hepcidin [23]. Hladina železa aktivuje kaskádu BMP6/SMAD [24, 25, 26] a tím inhibuje transkripci genu. Dalšími významnými faktory ovlivňujícími tvorbu hepcidinu jsou hypoxie [27] a aktivita erytropoézy [28]. Erytropoéza je proces vysoce citlivý na dostatečný přísun

- 94 -


Příloha 2

16 železa. Dochází-li u pacientů s IBD k chronickým či akutním krevním ztrátám, kostní dřeň kompenzuje tyto ztráty zvýšenou produkcí erytrocytů. Toto zvýšení je doprovázeno zvýšenou spotřebou železa, proto dochází k utlumení tvorby hepcidinu, ke zvýšení absorpce železa z GIT a ke zvýšení výdeje Fe z monocyto-makrofágového systému. U dětí a dospívajících s IBD může tedy být vliv zvýšené potřeby železa v období růstu v kombinaci s chronickými i akutními krevními ztrátami silnější než vliv zánětlivého procesu. Zdá se, že mechanismy zajišťující dostatečnou tvorbu erytrocytů a tedy dostatečný přísun kyslíku do tkání jsou nadřazeny všem ostatním vlivům. Tím by bylo možné vysvětlit převažující ACD/IDA (57 %) u anemických dětí s IBD v remisi onemocnění, u kterých se nejedná o akutní zánět ohrožující život pacienta. Izolované vyšetření hladiny Fe v séru je nespolehlivý ukazatel stavu Fe v organismu. Vždy je nutno jej doplnit vyšetřením dalších přesnějších markerů, především feritinu a solubilního transferinového receptoru. V práci českých autorů [29] je k odlišení typu anémie u dětských pacientů s IBD vhodný index sTfR/log feritin. Hepcidin je rovněž diskutován jako potenciální biomarker schopný rozlišit sideropenickou anémii od anémie chronických chorob. Jeho tvorba je ovlivněna mnoha faktory, z nichž těmi nejdůležitějšími u pacientů s IBD jsou zvýšený obrat erytropoézy při deficitu Fe po opakovaných krevních ztrátách a na druhé straně zánětlivé onemocnění s tvorbou cytokinů. Zmíněné faktory působí protichůdně. Onemocnění, která zahrnují oba patogenetické mechanismy ovlivňující tvorbu hepcidinu, pak mohou představovat diagnostický problém. U dětské populace se na rozvoji anémie podílí významněji než u dospělých skutečný deficit Fe a anémie má charakteru ACD/IDA. Hladina hepcidinu našich pacientů měřená metodou ELISA se při hodnocení celého souboru významně neliší mezi pacienty s ACD, ACD/IDA a zdravými kontrolami. Pravděpodobně se zde podílí nerovnoměrné rozložení (větší rozptyl) hodnot hladin hepcidinu od nižších hladin přes normální ke zvýšeným ve srovnání s kontrolami. Při použití proteomické metody, která je ve srovnání s metodou ELISA schopna lépe podchytit škálu nízkých hodnot hladin hepcidinu, byl tento předpoklad již potvrzen [30]. Proteomická metoda je při detailním rozlišování snížených hodnot hepcidinu pravděpodobně citlivější.

- 95 -


Příloha 2

17

Závěr V současné době je širší využití metody ELISA ke stanovení hladiny hepcidinu v diagnostice anémií u dětských pacientů s IBD limitované. Dosud nejsou komerčně dostupné ELISA kity, u kterých by výrobce deklaroval použití pro dětskou populaci. Kromě toho nebyly doposud definovány normy pro hepcidin pro dětskou populaci. Je nezbytné vyšetřit dostatečně velký soubor dětských pacientů s IBD, aby bylo možno srovnat citlivost metody pro rozlišení ACD od ACD/IDA. Na dostatečně velkém souboru pacientů bude možno zhodnotit korelaci hepcidinu s dosud běžně používanými ukazateli (MCV, RDW, feritin a sTfR). Rovněž je nezbytné vybrat optimální metodu vyšetření s dostatečně významnou senzitivitou a specificitou. Další využití měření hepcidinu, především pomocí proteomické analýzy, může přinést přesnější informace důležité pro bližší specifikaci anémie u IBD. Měření hladiny hepcidinu u pacientů s IBD může být jednoznačným přínosem při rozlišování mezi klasickou ACD a kombinací ACD s relativním nebo absolutním deficitem Fe. Může tak významně přispět k určení algoritmu léčby těchto pacientů. V nepřítomnosti anémie může hepcidin potenciálně sloužit i jako další důležitý marker aktivity zánětu.

Poděkování MUDr. Josefu Srovnalovi, Ph.D., Mgr. Gabriele Rylové a Mgr. Tomáši Oždianovi za odborné konzultace.

- 96 -


Příloha 2

18

Literatura 1. IBD Working Group of the European Society for Paediatric Gastroenterology. Hepatology and Nutrition. Inflammatory bowel disease in children and adolescents: recommendations for diagnosis--the Porto criteria. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2005;41(1):1-7. 2. Lukáš M. Farmakoterapie idiopatických střevních zánětů Prakt. Lékáren. 2009;5(4):164167. 3. Wyllie R, Hyams JS, Kay M. Pediatric Gastrointestinal and Liver Disease. 4. vyd. Philadelphia: Elsevier Saunders 2011:472-504. 4. Bergamaschi G, Di Sabatino A, Albertini R, et al. Prevalence and pathogenesis of anemia in inflammatory bowel disease. Influence of anti-tumor necrosis factor-alpha treatment. Haematologica. 2010;95(2):199-205. 5. Wells CW, Lewis S, Barton JR, et al. Effects of changes in hemoglobin level on quality of life and cognitive function in inflammatory bowel disease patients. Inflamm Bowel Dis. 2006;12(2):123-30. 6. Goodhand JR, Kamperidis N, Rao A, et al. Prevalence and management of anemia in children, adolescents, and adults with inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 2011;20. 7. Gerasimidis K, McGrogan P, Edwards CA. The aetiology and impact of malnutrition in paediatric inflammatory bowel disease. J Hum Nutr Diet. 2011;24(4):313-26. 8. Ganz T. Hepcidin and its role in regulating systemic iron metabolism. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2006:29-35, 507. 9. Nemeth E, Tuttle MS, Powelson J, et al. Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization. Science. 2004;17;306. 10. Hyams JS, Ferry GD, Mandel FS, et al. Development and validation of a pediatric Crohn's disease activity index. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 1991;12(4):439-47. 11. Otley A, Loonen H, Parekh N, et al. Assessing activity of pediatric Crohn's disease: which index to use? Gastroenterology. 1999;116(3):527-31. 12. Turner D, Hyams J, Markowitz J, et al. Appraisal of the pediatric ulcerative colitis activity index (PUCAI). Inflamm Bowel Dis. 2009;15(8):1218-23. 13. Wiskin AE, Fleming BJ, Wootton SA, et al. Anaemia and iron deficiency in children with inflammatory bowel disease. J Crohns Colitis. 2012. 14. Wilson A, Reyes E, Ofman J. Prevalence and outcomes of anemia in inflammatory bowel disease: a systematic review of the literature. Am J Med. 2004;116. 15. Theurl I, Finkenstedt A, Schroll A, et al. Growth differentiation factor 15 in anaemia of chronic disease, iron deficiency anaemia and mixed type anaemia. Br J Haematol. 2010;148(3):449-55. 16. Oustamanolakis P, Koutroubakis IE, Messaritakis I, et al. Serum hepcidin and prohepcidin concentrations in inflammatory bowel disease. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2011;23(3):262-8. 17. Arnold J, Sangwaiya A, Bhatkal B, et al. Hepcidin and inflammatory bowel disease: dual role in host defence and iron homoeostasis. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2009; 21(4): 425-9.

- 97 -


Příloha 2

19 18. Galesloot TE, Vermeulen SH, Geurts-Moespot AJ, et al. Serum hepcidin: reference ranges and biochemical correlates in the general population. Blood. 2011;117(25):e218-25. 19. Ganz T, Olbina G, Girelli D, et al. Immunoassay for human serum hepcidin. Blood. 2008;15;112(10):4292-7. 20. Kroot JJ, Kemna EH, Bansal SS, et al. Results of the first international round robin for the quantification of urinary and plasma hepcidin assays: need for standardization. Haematologica. 2009;94(12):1748-52. 21. Wrighting DM, Andrews NC. Interleukin-6 induces hepcidin expression through STAT3. Blood. 2006;108(9):3204-9. 22. Huang H, Constante M, Layoun A, et al. Contribution of STAT3 and SMAD4 pathways to the regulation of hepcidin by opposing stimuli. Blood. 2009;113(15):3593-9. 23. Nicolas G, Chauvet C, Viatte L, et al. The gene encoding the iron regulatory peptide hepcidin is regulated by anemia, hypoxia, and inflammation. J Clin Invest. 2002;110(7):1037-44. 24. Kautz L, Meynard D, Monnier A, et al. Iron regulates phosphorylation of Smad1/5/8 and gene expression of Bmp6, Smad7, Id1, and Atoh8 in the mouse liver. Blood. 2008;15;112(4):1503-9. 25. Andriopoulos B Jr, Corradini E, Xia Y, et al. BMP6 is a key endogenous regulator of hepcidin expression and iron metabolism. Nat Genet. 2009;41(4):482-7. 26. Meynard D, Kautz L, Darnaud V, et al. Lack of the bone morphogenetic protein BMP6 induces massive iron overload. Nat Genet. 2009;41(4):478-81. 27. Peyssonnaux C, Zinkernagel AS, Schuepbach RA, et al. Regulation of iron homeostasis by the hypoxia-inducible transcription factors (HIFs). J Clin Invest. 2007;117(7):1926-32. 28. Pinto JP, Ribeiro S, Pontes H, et al. Erythropoietin mediates hepcidin expression in hepatocytes through EPOR signaling and regulation of C/EBPalpha. Blood. 2008;15;111(12):5727-33. 29. Šuláková A., Pozler O., Nováčková L., et al. Prevalence a typ anémie v době stanovení diagnózy nespecifického střevního zánětu u dětí. Česko – Slovenská pediatrie. 2012,67,1. 30. Pospíšilová D., Houda J., Holub D. Et al. Význam stanovení hladiny hepcidinu v diagnostice vybraných typů anémií v dětském věku. Transfuze Hematol. dnes. 2012,18,No.2:58-65.

- 98 -


Příloha 2

Titl: :

v Brně dne: 11.4.2014

Vážený kolego manuskript: Výskyt anémie a význam měření hladiny hepcidinu metodou ELISA u dětí

s nespecifickými střevními záněty.autorů MUDr. Jiří Houda1,MUDr. Petr Džubák, Ph.D.1,2,MUDr. Eva Karásková1,Mgr. Dušan Holub2,MUDr. David Vydra1,Mgr. Dana Mlčůchová2,doc. MUDr. Marián Hajdúch, Ph.D.2,doc. MUDr. Oldřich Pozler, Ph.D.3,doc. MUDr. Dagmar Pospíšilová Manuskript byl po recenzi již přijatý do tisku. Redakční rada Vám velmi děkuje za Váš zájem publikovat v časopise Česko-Slovenská pediatrie V úctě

Prof..MUDr.Hana Hrstková, CSc. vedoucí redaktor Česko-Slovenské pediatrie Pediatrická klinika FN a LF Černopolní 9 61300 Brno ČR e-mail [email protected] tel.532234235 723288023

- 99 -


Příloha 3

- 100 -


Příloha 3

Úloha hepcidinu v regulaci metabolizmu železa. Houda Jiří1, Pospíšilová Dagmar1, Horváthová Monika2 1

Dětská klinika při LF UP a FN Olomouc, Puškinova 6, 77900, Olomouc, přednosta prof.

MUDr. V. Mihál, CSc., 2

Ústav biologie při LF UP Olomouc, Hněvotínská 3, 77515 Olomouc, přednosta Doc. RNDr.

Vladimír Divoký, Ph.D.

Kontakt na prvního autora: Dětská klinika FN Olomouc, Puškinova 6, 77900, Olomouc, tel. 588444403, e-mail [email protected]

Abstrakt. Železo je nezbytné pro správnou funkci buněk lidského organizmu. Jako součást hemoproteinů (hemoglobinu, myoglobinu) a řady enzymů se podílí na oxygenaci tkání, na obraně proti oxidativnímu stresu, proliferaci buněk a na dalších důležitých metabolických pochodech. Protože je však nadbytek železa pro buňky a organizmus potenciálně toxický udržení homeostázy železa je pro organizmus zásadní. Klíčovou roli v tomto procesu hraje hepcidin, který kontroluje vstřebávání železa ze stravy, recyklaci železa ze zaniklých erytrocytů a jeho uvolňování ze zásob. Mnoho onemocnění se vyznačuje abnormální hladinou hepcidinu. Neadekvátní snížení hepcidinu vede k přetížení organizmu železem, které je typické u hereditární hemochromatózy, naopak zvýšená hladina hepcidinu se podílí na rozvoji anémie v důsledku nedostatečného přísunu železa pro erytropoézu. Molekulární mechanizmy ovlivňující produkci hepcidinu jsou dosud předmětem intenzívního výzkumu. Podrobnější znalosti o těchto mechanizmech mohou sloužit k vývoji nových látek zasahujících do regulace metabolizmu železa, které mohou být využity k diagnostickým a terapeutickým účelům u stavů s narušenou rovnováhou železa. Klíčová slova: metabolizmus železa, hepcidin, feroportin, hereditární hemochromatóza, anémie chronických chorob

- 101 -


Příloha 3

The role of hepcidin in iron metabolism regulation. Iron is essential for proper function of the cells in human body. Iron is involved in tissue oxygenation, antioxidant defence, cell proliferation and in other important metabolic processes as a part of hemoproteins (haemoglobin, myoglobin) and different iron-containing enzymes. It is crucial to keep iron homeostasis balanced, because of the potential iron toxicity. Hepcidin plays a key role in this process by controlling iron absorption from the diet, iron recycling from senescent erythrocytes and iron release from stores. Many diseases are accompanied by abnormal hepcidin level. Inappropriately low hepcidin leads to iron overload and is typical for hereditary hemochromatosis. Increased hepcidin level contributes to the development of anaemia caused by insufficient iron supply for erythropoiesis. Molecular mechanisms affecting hepcidin production are still subject of intensive research. More detailed knowledge about these mechanisms may contribute to the identification of new molecules involved in the regulation of iron metabolism and to the development of new drugs potentially useful in the treatment of disorders associated with disrupted iron homeostasis. Key words: iron metabolism, hepcidin, ferroportin, hereditary hemochromatosis, anaemia of chronic diseases

- 102 -


Příloha 3

Úvod. Železo (Fe) je esenciální prvek, který se hojně vyskytuje v živé i neživé přírodě. Nejčastěji se nachází v nerozpustné formě s minimální využitelností pro člověka. V živé přírodě se železo vyskytuje ve vazbě na hem – hemové železo a vázané na jiné proteiny – nehemové železo; přičemž v těchto sloučeninách se železo nachází jako dvojmocné Fe2+ nebo trojmocné Fe3+. Nedostatek železa vede k rozvoji sideropenie a sideropenické anémie. Jeho nadbytek naopak vede ke zvýšené produkci volných kyslíkových radikálů a zvýšení oxidačního stresu, který může být příčinou poškození buněk a tkání. Vzhledem ke své potenciální toxicitě se železo v organizmu nachází ve formě vázané, a to na různé transportní a zásobní proteiny (např. transferin, feritin, atd.). Přesná regulace metabolizmu železa je proto nezbytná pro správnou funkci buněk lidského organizmu. Udržení správné hladiny železa v organizmu je zajištěno citlivým regulačním mechanizmem, který je schopný reagovat na aktuální stav železa a jeho spotřebu a udržet tím nezbytnou rovnováhu. Objev několika klíčových molekul v posledním desetiletí významně přispěl k pochopení dosud nejasných aspektů metabolizmu železa.

- 103 -


Příloha 3

Cirkulace železa u člověka. Celkové množství železa v organizmu se u novorozence pohybuje kolem 75 mg/kg hmotnosti. U dospělého člověka se liší v závislosti na pohlaví a věku. U dospělého muže je přibližně 50 mg/kg hmotnosti a v průběhu dospělosti hladina železa více nekolísá. U žen ve fertilním věku dochází postupně v důsledku přirozených ztrát při menstruaci ke snížení obsahu železa až na hladinu asi 35 mg/kg hmotnosti. Ve srovnání s celkovým množstvím železa v organizmu jsou jeho denní ztráty minimální: 1 mg/den u dospělého muže a u žen mimo reprodukční věk. U menstruujících žen jsou ztráty od 0,006 – 0,025 mg/kg/den, a to především v důsledku menstruačního krvácení. Železo se vylučuje stolicí při odlučování starých enterocytů, močí při odlučování epitelu močového ústrojí a malá část je vylučována potem; ani jeden z těchto procesů však není regulován. Většina železa v organizmu je vázána na hemoglobin erytrocytů (cca 65%), další významná část je uložena v zásobní formě (feritin a hemosiderin) v játrech a slezině (cca 25%) (Tab. 1). Železo z erytrocytů je recyklované a uvolněné zpět do krevního oběhu, přičemž tento proces je nejvýznamnějším zdrojem železa (20-25 mg/den). Starší nebo poškozené erytrocyty jsou degradovány v monocytomakrofágovém systému sleziny. Po fagocytóze erytrocytu makrofágy dochází k rozpadu hemoglobinu a železo je uvolněno do cytoplasmy makrofágu. Podle potřeby je železo buďto aktivně uvolňováno zpět do krevního oběhu nebo uskladněno navázáním na feritin nebo hemosiderin.

Tab. 1 Přehled množství železa vázaného na jednotlivé biomolekuly u dospělého člověka a výskyt jeho dvoj/trojmocné formy. (Upraveno dle: Fauci AS, Braunwald E, Kasper DL, Hauser SL, Longo DL, Jameson JL, Loscalzo J, editors. Harrison's Principles of Internal Medicine. 17th ed. New York: McGraw-Hill Medical Publishing Division; 2008). Relativně malá část železa (1-2 mg/den) je vstřebávaná ze stravy. Stejně jako uvolňování železa ze zásob, tak i jeho vstřebávání z gastrointestinálního traktu (GIT) je přísně regulováno a řízeno na úrovni buněčných membrán. Naopak u člověka a vyšších obratlovců chybí aktivní a regulovaný systém pro vylučování nadbytečného železa.

- 104 -


Příloha 3

Vstřebávání železa. Železo se vstřebává jednak ve formě hemu, který pochází z hemoglobinu a myoglobinu a jednak ve formě volné. Hemové železo v potravinách živočišného původu je vstřebáváno v zažívacím traktu mnohem efektivněji než železo volné, molekulární mechanizmus však zatím není zcela objasněn. Transmembránový přenašeč SLC46A1 neboli HCP1 (heme carrier protein 1), který byl původně identifikován jako transporter hemu [1], se podílí především na transportu kyseliny listové [2]. Ve volné formě je dvojmocné železo (Fe2+) vstřebáváno na apikální straně enterocytů pomocí transmembránového přenašeče DMT1 (divalent metal transporter 1) [3] (Obr. 1A). Fe2+ vzniká redukční přeměnou z Fe3+, která je na apikální straně enterocytu v GIT katalyzována enzymem DCytB (duodenal cytochrome B).

Obr. 1 Schéma vstřebávání volného železa na apikální membráně (A) a jeho exportu na bazolaterální membráně (B) enterocytu. DMT1 - transmembránový transportér železa (divalent metal transporter 1), DcytB - duodenální cytochrom B reduktáza, HPH - hephaestin, FPN feroportin. Detailní popis v textu. Poté, co je v enterocytu část železa spotřebována na základní biochemické procesy a část je uložena do zásob po vazbě na feritin, je zbývající část železa aktivně uvolněna do krevního řečiště (Obr 1B). K uvolňování železa z enterocytů dochází na jejich bazolaterální straně za účasti feroportinu (FPN), zatím jediného známého exportéru železa [4]. Po vstupu Fe2+ iontů do krevního

- 105 -


Příloha 3

řečiště je Fe2+ oxidováno na trojmocnou formu Fe3+ pomocí feroxidázy hephaestinu [5]. Následně se trojmocné železo váže na transferin (Tf), čímž se snižuje jeho reaktivita a pohotovost k produkci toxických radikálů a v této vazbě je transportováno k cílovým buňkám exprimujícím transferinový receptor 1 (TfR1). Saturace transferinu železem je důležitým makrem celkové hladiny železa v organizmu; za fyziologických podmínek je transferin saturován železem na 30%, při jeho nadbytku saturace Tf stoupá. Transferin s Fe3+ (holotransferin) se na povrchu buněk naváže na membránový TfR1 a celý komplex se do intracelulárního prostředí dostává endocytózou. Z vytvořených endozomů je Fe2+ po redukci transportováno již zmíněným proteinem DMT1, klíčovou roli pro efektivitu přenosu zde hraje kyselé prostředí obsahující vodíkové protony [6]. V erytroidních buňkách je Fe2+ inkorporované do hemu a následným spojením s globinovými řetězci se vytváří molekula hemoglobinu. Recyklace železa v makrofázích. Jak jsme již zmínily, staré nebo poškozené erytrocyty jsou pohlceny makrofágy a degradací hemoglobinu v lysozomech dochází k uvolnění železa, které je podle potřeb vráceno do cirkulace nebo uskladněno ve formě feritinu. I z makrofágů je export Fe2+ zabezpečen feroportinem [4]. Tento proces recyklace železa je klíčový pro udržení homeostáze železa a jeho porucha se podílí např. na patofyziologii hereditární hemochromatózy a anémie chronických chorob (dříve označované jako anémie zánětu).

- 106 -


Příloha 3

Hepcidin, feroportin a jejich role v metabolizmu železa. Hepcidin. Již před více jak deseti lety (2001) dva nezávisle pracující výzkumné týmy [7;8] poprvé identifikovaly hepcidin, který je dnes považovaný za klíčový peptid v metabolizmu železa. Hepcidin je vylučován močí a syntetizován převážně v játrech. V menším množství je exprimován i v makrofázích, adipocytech [9], β-buňkách pankreatu [10] a řadě dalších tkání včetně srdce a mozku, avšak role zde produkovaného hepcidinu je zatím nejasná. Hepcidin je peptid složený z 25 aminokyselin a 4 disulfidických můstků. Je kódován genem HAMP (hepcidin antimicrobial peptide) lokalizovaném na dlouhém raménku chromozómu 19 (19q13.1) [11]. Translací mRNA vzniká prekurzor hepcidinu pre-prohepcidin složený z 84 aminokyselin. Následně je z něj enzymaticky odštěpen prohepcidin složený z 64 aminokyselin. Poté je prohepcidin uvolněn do lumen endoplazmatického retikula, kde dochází k odštěpení dalších 39 aminokyselin enzymem furinu podobné proproteinové konvertázy a tím vzniká peptid složený z 25 aminokyselin - hepcidin-25 pocházející z C konce prekurzoru [12]. Byly identifikovány i další formy hepcidinu složené z menšího počtu aminokyselin: hepcidin-22 a hepcidin-20 [13]. Biologický význam pre-prohepcidinu nebyl prokázán [14]. U hepcidinu-20 byl in vitro prokázán antibakteriální a antifungální účinek v koncentracích 10ti násobně vyšších než je běžná hladina zdravých kontrol [8]. Struktura hepcidinu je mezidruhově poměrně jednotná. Lze tedy usuzovat, že mechanizmus řízení metabolizmu železa, na němž se hepcidin podílí, je efektivní a fylogeneticky výhodný [15]. Původně oba objevitelské týmy určily hepcidinu roli v nespecifické imunitní odpovědi organizmu při obraně proti bakteriální infekci. Vzápětí byl na myším modelu objeven vztah hepcidinu a homeostázy železa [16] a ještě téhož roku byla blíže popsána jeho role hlavního regulátoru metabolizmu železa [17]. Proteinem, který se spolu s hepcidinem podílí na tomto procesu je feroportin. Feroportin. Feroportin byl objeven v roce 2000 třemi nezávislými týmy, které jej popsaly jako transmembránový přenašeč železa nacházející se ve zvýšené míře na bazolaterální membráně enterocytů duodena a na membráně makrofágů monocyto-makrofágového systému a Kupfferových buněk jater. V menší míře se pak nachází v plicních buňkách, buňkách renálních tubulů a v erytroidních prekurzorech. Feroportin je kódován genem SLC40A1 (SLC11A3, 2q32). Je to jedinečný peptid s konzervativní strukturou společnou pro savce a jiné obratlovce a jediný doposud

- 107 -


Příloha 3

objevený specifický transmembránový exportér železa [4]. Prostřednictvím feroportinu je intracelulární železo přenášeno do krevního oběhu, avšak přesný mechanizmus přenosu není doposud objasněn. Byly popsány dvě formy feroportinu [18]. FPN1A (Feroportin 1A) obsahuje ve své struktuře 5’ element senzitivní na hladinu železa, který v buňkách s nedostatkem železa tlumí jeho syntézu. FPN1B (Feroportin 1B) tento 5` element neobsahuje a nachází se především v duodenálních enterocytech, kde zajišťuje přenos železa z GIT do krevního oběhu a jeho syntéza není tlumena nedostatkem železa. Mechanizmus účinku hepcidinu a feroportinu. Po navázání hepcidinu na feroportin dochází k internalizaci komplexu a jeho degradaci v lysozomech buňky [19]. Snížené množství feroportinu na membráně buňky způsobuje snížený výdej železa z intracelulárního prostoru do prostoru extracelulárního. Stejným mechanizmem snižuje hepcidin v enterocytech vstřebávání železa ze zažívacího traktu a výdej železa do krevní cirkulace. V případě nedostatku železa dojde naopak k utlumení produkce hepcidinu a ke zvýšenému uvolňování železa do krevního oběhu prostřednictvím feroportinu. Tímto mechanismem je udržována relativně stabilní rovnováha železa v organizmu (Obr. 2).

Obr. 2 Homeostáza železa v organizmu a řízení jeho cirkulace hepcidinem. Hepcidin je produkován v hepatocytech jater v odpovědi na stav železa v organizmu (stimulační signál, +) a aktivitu erytropoézy (tlumící signál, -). Hepcidin (černá čára) inhibuje transport železa z enterocytů duodena, makrofágu sleziny a hepatocytů jater (×) a snižuje tak hladinu železa v plazmě. Patologické zvýšení produkce hepcidinu (v důsledku zánětu a inaktivačních mutací matriptázy-2, MT-2) vede k utlumení uvolňování železa z výše zmíněných buněčných kompartmentů a ke snížení jeho hladiny v plazmě, což vede k rozvoji anémie. Naopak při patologickém snížení produkce hepcidinu (v důsledku zvýšených hladin erytroidních faktorů nebo při mutacích genů asociovaných s hemochromatózou) dochází ke zvýšení hladiny železa v plazmě a eventuálnímu rozvoji přetížení organizmu železem. (Upraveno dle: Ganz 2011 [20]).

- 108 -


Příloha 3

Narušení této rovnováhy v důsledku mutací genů pro feroportin a hepcidin vede k rozvoji primárního přetížení organizmu železem, neboli hereditární hemochromatóze. Při dominantních mutacích genu pro feroportin (hemochromatóza typ 4b), které způsobují jeho rezistenci na hepcidin a při recesivních mutacích HAMP genu, které vedou k produkci neúčinného hepcidinu, dochází k nadměrnému uvolňování železa z makrofágů a enterocytů a rozvoji onemocnění podobnému klasické hemochromatóze (asociované s mutacemi v HFE, viz níže) s hyperferitinemií a přetížením parenchymatózních tkání železem (Obr. 2). V důsledku časného nástupu klinických příznaků u pacientů s mutací v HAMP genu se tomuto typu hemochromatózy říká juvenilní (typ 2b). Byly však popsány i dominantní mutace feroportinu, které vedou k jeho inaktivaci a způsobují tak hromadění železa v makrofázích a fenotyp odlišný od klasické hemochromatózy, kdy se u pacienta v důsledku nízké saturace transferinu může eventuálně rozvinout anémie. Tento typ hemochromatózy (4a) nebývá obvykle asociován s orgánovým poškozením železem a označuje se někdy i jako feroportinová nemoc [21].

- 109 -


Příloha 3

Faktory ovlivňující produkci hepcidinu. Hepcidin efektivně řídí distribuci železa v lidském organizmu. Regulací produkce tohoto peptidu organizmus vyrovnává výkyvy v homeostáze železa. Mezi faktory, které stimulují produkci hepcidinu patří zvýšená hladina železa a zánětlivé procesy, naopak deficit železa, akcelerovaná erytropoéza a hypoxie působí na produkci hepcidinu supresivně (Obr. 2). Produkce hepcidinu ovlivněná hladinou železa v krevním oběhu. Exprese hepcidinu je zpětně regulována hladinou železa v krevním oběhu, přičemž BMP/SMAD signální dráha je považována za hlavní regulační osu transkripce hepcidinu [22] v hepatocytech jater (Obr. 3). BMP (bone morphogenetic proteins) je skupina molekul regulujících několik důležitých procesů jako embryogenezi, tvorbu a remodelaci kostí a hojení tkání. Zdrojem BMP jsou pravděpodobně intersticiální a stelární jaterní buňky. Ze skupiny BMP molekul se na stimulaci hepcidinu závislé na železe podílí BMP6 [23]. Interakce BMP6 s příslušnými receptory (BMP receptor I a II, BMPRI-II) [24] vede k aktivaci komplexu SMAD1/5/8-SMAD4 (small mothers against decapentaplegic), který je translokován do jádra, kde aktivuje expresi HAMP genu. Důležitou roli v tomto procesu hraje hemojuvelin (HJV), glykosylfosfastidylinositolem ukotvený membránový protein, který funguje jako koreceptor pro BMP6 [22;25]. Recesivní mutace genu pro HJV způsobují deficit hepcidinu a vedou k rozvoji dalšího typu hemochromatózy označované i jako juvenilní hemochromatóza typu 2a.

- 110 -


Příloha 3

Obr. 3 Schéma řízení exprese HAMP genu v hepatocytech. BMP6 po vazbě na BMP receptor (BMPR I-II) a membránový hemojuvelin (mHJV) stimuluje SMAD signální dráhu a expresi hepcidinu. Matriptáza-2 brání nadměrné expresi hepcidinu tím, že štěpí mHJV a vypíná tak BMP6/SMAD signální dráhu. Zvýšená hladina holotransferinu (Fe3+2TF) stabilizuje transferinový receptor 2 (TfR2) a v komplexu s HFE zvyšuje expresi HAMP. Detaily přenosu tohoto signálu nejsou známé (v obrázku označené otazníkem). Přesná role dalších dvou proteinů, HFE (human hemochromatosis protein) a transferinového receptoru 2 (TfR2) na regulaci hepcidinu v závislosti na hladině železa je méně objasněna (Obr. 3). Nicméně mutace obou proteinů narušují expresi hepcidinu a vedou k rozvoji hemochromatózy typu 1 (HFE) a 3 (TfR2) (Obr. 2), co podporuje jejich podíl na regulaci exprese hepcidinu [26;27]. HFE je membránový protein strukturálně podobný molekulám z třídy MHC třídy I., který kompetitivně váže TfR1 [27;28]. Předpokládá se, že vazba HFE na TfR1 je inhibována při nadbytku holotransferinu, který obsazuje vazebné místo pro HFE. Následně se HFE nenavázaný na TfR1 váže na TfR2, kde je jeho vazba méně silná. V kombinaci s holotransferinem je vazba HFE na TfR2 zvýšena [29]. Celý komplex poté stimuluje expresi hepcidinu aktivací signální dráhy, která dosud zůstává předmětem dalšího výzkumu. Některé studie [27;30] popisují ovlivnění BMP kaskády a/nebo MAPK (mitogen-activated protein kinase) kaskády komplexem holotransferin-HFE-TfR2. Výsledkem je zvýšení hladiny hepcidinu a následný útlum vstřebávání a uvolňování dalšího železa do krevního oběhu z enterocytů a buněk monocyto-makrofágového systému. Dalšími významnými molekulami, které však naopak tlumí produkci hepcidinu jsou matriptáza2 (MT-2) kódována genem TMPRSS6 (transmembrane protease serine 6) a neogenin. Oba proteiny štěpí membránový hemojuvelin a snižují tak jeho množství na povrchu buněk [31-33] což vede k utlumení BMP6/SMAD signální dráhy a supresi hepcidinu (Obr. 3). Děje se tak při nedostatku železa [31]. V roce 2008 byla popsána bodová mutace Ala736Val v genu TMPRSS6 na chromozomu 22q12-13. Mutace vedla k inaktivaci MT-2 a v in vitro modelu ke zvýšení exprese hepcidinu. Posléze byly různé mutace TMPRSS6 nalezeny i u dalších pacientů s hypochromní mikrocytární anémie, která je rezistentní na perorální podávání železa a parenterální aplikace železa vede jen k malému zlepšení anémie [34]. Jedná se o autozomálně recesivně dědičnou formu sideropenické anémie rezistentní na železo, která se označuje jako IRIDA (iron refractory iron deficient anaemia) [35]. Zvýšena exprese TMPRSS6 byla kromě akutního alimentárního nedostatku železa [36] zjištěna i u hypoxie [37;38] a po injekční aplikaci BMP6 [39]. Erytropoéza potlačuje produkci hepcidinu.

- 111 -


Příloha 3

Největší část železa je v organizmu spotřebovávána při produkci erytrocytů a to jeho vazbou v molekule hemoglobinu, která probíhá v erytroidních prekurzorových buňkách. Erytropoéza je téměř výhradně závislá na hladině železa v krevním oběhu vázaného na holotransferin [40]. Předpokládá se, že zvýšený obrat erytropoézy při krvácení nebo při zvýšeném působení erytropoetinu tlumí produkci hepcidinu v játrech pomocí signálu, který vychází z kostní dřeně [41]. Tento tlumivý efekt erytropoézy se vyskytuje i u onemocnění charakterizovaných zvýšenou, avšak neefektivní erytropoézou, kde často dochází k apoptóze erytroidních prekurzorů a nedostatečné tvorbě zralých erytrocytů. Důsledkem je patologická suprese hepcidinu a následná akumulace železa ve tkáních (Obr. 2). Prototypem toho typu onemocnění je β-thalasemie intermedia [42;43], u které dochází k přetížení železem i bez transfuzí. Z toho vyplývá, že signály přicházející z kostní dřeně jsou nadřazené signálům, které informují o hladině železa v organizmu. Nicméně funkční erytropoéza ve dřeni je esenciální pro utlumení exprese hepcidinu, protože pacienti s kongenitální DiamondBlackfanovou anémií (DBA), která se vyznačuje těžkou anémií a erytroidní aplazií v kostní dřeni nejsou schopni suprimovat hladinu hepcidinu, která zůstává zvýšená [44]. Za potenciální mediátory supresivního signálu z kostní dřeně jsou u β-thalasemie považovány GDF15 [45] a TWSG1 [46], jejich podíl na fyziologické regulaci hepcidinu zatím nebyl prokázán [47]. Hypoxie potlačuje produkci hepcidinu. Hypoxie snižuje hladinu hepcidinu, ale mechanizmus účinku dosud není přesně známý. Ve studii, ve které byli dobrovolníci vystaveni vysoké nadmořské výšce, došlo k rychlému poklesu hladiny hepcidinu, a to před ostatními biochemickými změnami [48]. Regulační osa pravděpodobně zahrnuje HIF-1α (hypoxií indukovaný faktor 1 alfa) transkripční faktor, který je syntetizován játry. Snížení hladiny hepcidinu v důsledku hypoxie je výsledkem jak nepřímé [49] tak i přímé suprese exprese hepcidinu [50]. Podíl samotného erytropoetinu, produkovaného při hypoxii, na regulaci hepcidinu je nepřímý a vyžaduje aktivní erytropoézu ve dřeni. Již zmínění pacienti s DBA a erytroidní aplazií mají vysokou hladinu hepcidinu i při abnormálně vysokých koncentracích erytropoetinu v plazmě [44]. Infekce a zánět zvyšují produkci hepcidinu. Produkce zánětlivých mediátorů při infekcích a systémových zánětlivých onemocněních rovněž ovlivňuje syntézu hepcidinu na úrovni transkripce. IL-6 (interleukin 6), působící přes STAT-3 (signal transducer and activator of transcription 3) signální dráhu, je hlavním cytokinem ovlivňujícím produkci hepcidinu [19]. STAT-3 obsahuje vazebnou část, která aktivuje promotor genu pro hepcidin [51]. U dobrovolníků bylo po aplikaci IL-6 sledováno několikanásobné zvýšení vylučované hladiny hepcidinu během 2 hodin po podání [19]. V in vitro podmínkách byly objeveny

- 112 -


Příloha 3

další cytokiny (např. IL-1, TNF-α), které mají vliv na produkci hepcidinu, jejich účinky u člověka však nebyly dosud potvrzeny [52;53]. Tento mechanizmus působí jako obrana proti infekci. Snížením dostupnosti železa je narušena látková výměna mikroorganizmu a snižuje se jeho schopnost dělení. Význam této nespecifické obrany organizmu proti patogenním mikroorganizmům je předmětem dalšího studia. Důsledkem zvýšené hladiny hepcidinu a snížené hladiny železa v krevní cirkulaci je i jeho snížená dostupnost pro erytropoézu (Obr. 2). Při dlouhodobém působení zánětlivé aktivity nebo třeba u septických stavů se proto rozvíjí tzv. anémie chronických chorob. Produkce hepcidinu ovlivněná množstvím železa uloženého v zásobách. Jak jsme detailně popsali, produkce hepcidinu v hepatocytech je ovlivněna hladinou železa v krevním oběhu. Předpokládá se však, že svůj podíl na expresi hepcidinu má i množství železa uložené v zásobní formě. Přesný mechanizmus však nebyl doposud plně objasněn. Určitou roli v tomto procesu mohou hrát Fe-dependentní ligázy, prolyl hydroxylázy, hypoxie a BMP6 [54].

- 113 -


Příloha 3

Závěr. Objev hepcidinu a feroportinu a jejich vzájemného propojení vedlo k hlubšímu porozumění metabolizmu železa u člověka. Byla upřesněna molekulární podstata onemocnění jako je hereditární hemochromatóza, anémie chronických chorob [55], či IRIDA a objasněná příčina přetížení železem u anémií s neefektivní erytropoézou (Obr. 2). V poslední době se objevují studie popisující další patologické stavy asociované s narušením produkce nebo funkce hepcidinu a feroportinu [21]. Některá chronická zánětlivá onemocnění (např. nespecifické střevní záněty) spojená se zvýšenou hladinou cytokinů ovlivňují produkci hepcidinu, což vede k narušení metabolizmu železa [56]. Souhrnný přehled onemocnění s abnormální hladinou hepcidinu, která se podílí na patofyziologii dané nemoci, je uveden v Tab. 2.

Tab. 2 Přehled různých onemocnění ovlivňujících hladinu hepcidinu v séru. IRIDA iron refractory iron deficiency aneamia, IBD inflammatory bowel disease, HH hereditární hemochromatóza (Upraveno dle: Ganz 2011). Hladina hepcidinu se zatím stanovuje pouze experimentálně imunochemickými a proteomickými metodami. Na mezinárodní úrovni se stále pracuje na standardizaci měření hladin hepcidinu [57]. Stanovení hladin hepcidinu by mohlo pomoci při nastavení léčby anémií železem, erytropoetinem, a to především u anémií chronických chorob doprovázející různá onemocnění nebo naopak o nutnosti

- 114 -


Příloha 3

chelatace u anémií se sekundárním přetížením železem. Výpočet indexu hepcidin/feritin, který určuje, zdali produkce hepcidinu odpovídá množství železa, by mohl být podobně diagnosticky přínosný jako výpočet indexu sTfR/log feritinu v diferenciálně diagnostické rozvaze právě u anémie chronických chorob, ale i u sideropenické anémie [58]. Znalost regulace metabolizmu železa rovněž umožní vývoj nových léčebných postupů a léků pro stavy spojené s přetížením železa nebo stavy s nedostatkem železa v organizmu. Byly vyvinuty látky působící jako agonisté hepcidinu [59] i látky stimulující produkci hepcidinu [60], které se mohou uplatnit v léčbě nebo prevenci akumulace železa u hemochromatózy a β-thalasemie. Schmidt a kol. [28] prokázali účinek inhibice produkce matriptázy-2 (pomocí siRNA proti TMPRSS6) na zvýšení tvorby hepcidinu u myšího modelu s β-thalasemií intermedia. U těchto myší došlo po podávání látky ke snížení jaterního přetížení železem a ke zvýšení erytropoézy. Naopak antagonistů hepcidinu [61] či inhibitorů produkce hepcidinu [62-64] by bylo možno léčebně využít u pacientů s anémií chronických chorob nebo IRIDA. U těchto onemocnění by byla vhodná kombinace s látkami stimulujícími krvetvorbu. I navzdory obrovskému pokroku v pochopení fungování regulace metabolizmu železa, který přispěl ke zlepšení diferenciální diagnostiky nemocí asociovaných s tímto procesem a k rozvoji nových terapeutických přístupů, mnoho aspektů regulace homeostázy železa zůstává nejasných. Z klinického hlediska bude především významná identifikace erytroidních signálů suprimujících hepcidin jako i zhodnocení možnosti a bezpečnosti léčby patologických stavů s narušenou homeostázou železa látkami ovlivňujícími produkci anebo funkci hepcidinu.

Dedikace: Tento článek byl podpořen grantem Ministerstva zdravotnictví ČR IGA NT/13587 a Interním grantem Univerzity Palackého LF_2014_011.

- 115 -


Příloha 3

Literatura. 1

Shayeghi M, Latunde-Dada G, Oakhill J, et al. Identification of an intestinal heme

transporter. Cell 2005;122(5):789-801. 2

Qiu A, Jansen M, Sakaris A, et al. Identification of an intestinal folate transporter and the

molecular basis for hereditary folate malabsorption. Cell 2006;127(5):917-928. 3

Gunshin H, Mackenzie B, Berger U, et al. Cloning and characterization of a mammalian

proton-coupled metal-ion transporter. Nature 1997;388(6641):482-488. 4

Donovan A, Lima C, Pinkus J, et al. The iron exporter ferroportin/Slc40a1 is essential for

iron homeostasis. Cell Metab. 2005;1(3):191-200. 5

Vulpe C, Kuo Y, Murphy T, et al. Hephaestin, a ceruloplasmin homologue implicated in

intestinal iron transport, is defective in the sla mouse. Nat. Genet. 1999;21(2):195-199. 6

Gunshin H, Fujiwara Y, Custodio A, et al. Slc11a2 is required for intestinal iron absorption

and erythropoiesis but dispensable in placenta and liver. J. Clin. Invest. 2005;115(5):1258-1266. 7

Krause A, Neitz S, Mägert H, et al. LEAP-1, a novel highly disulfide-bonded human

peptide, exhibits antimicrobial activity. FEBS Lett. 2000;480(2-3):147-150. 8

Park C, Valore E, Waring A, et al. Hepcidin, a urinary antimicrobial peptide synthesized in

the liver. J. Biol. Chem. 2001;276(11):7806-7810. 9

Bekri S, Gual P, Anty R, et al. Increased adipose tissue expression of hepcidin in severe

obesity is independent from diabetes and NASH. Gastroenterology 2006;131(3):788-796. 10

Kulaksiz H, Fein E, Redecker P, et al. Pancreatic beta-cells express hepcidin, an iron-uptake

regulatory peptide. J. Endocrinol. 2008;197(2):241-249. 11

Hunter H, Fulton D, Ganz T, et al. The solution structure of human hepcidin, a peptide

hormone with antimicrobial activity that is involved in iron uptake and hereditary hemochromatosis. J. Biol. Chem. 2002;277(40):37597-37603. 12

Wallace D, Jones M, Pedersen P, et al. Purification and partial characterisation of

recombinant human hepcidin. Biochimie 2006;88(1):31-37. 13

Kemna E, Tjalsma H, Podust V, et al. Mass spectrometry-based hepcidin measurements in

serum and urine: analytical aspects and clinical implications. Clin. Chem. 2007;53(4):620-628. 14

Nagy J, Lakner L, Poór V, et al. Serum prohepcidin levels in chronic inflammatory bowel

diseases. J. Crohns Colitis 2010;4(6):649-653. 15

Hilton K a Lambert L Molecular evolution and characterization of hepcidin gene products in

vertebrates. Gene 2008;415(1-2):40-48.

- 116 -


16

Příloha 3

Pigeon C, Ilyin G, Courselaud B, et al. A new mouse liver-specific gene, encoding a protein

homologous to human antimicrobial peptide hepcidin, is overexpressed during iron overload. J. Biol. Chem. 2001;276(11):7811-7819. 17

Nicolas G, Bennoun M, Devaux I, et al. Lack of hepcidin gene expression and severe tissue

iron overload in upstream stimulatory factor 2 (USF2) knockout mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001;98(15):8780-8785. 18

Zhang A-S a Enns C Iron homeostasis: recently identified proteins provide insight into

novel control mechanisms. J. Biol. Chem. 2009;284(2):711-715. 19

Nemeth E, Rivera S, Gabayan V, et al. IL-6 mediates hypoferremia of inflammation by

inducing the synthesis of the iron regulatory hormone hepcidin. J. Clin. Invest. 2004;113(9):12711276. 20

Ganz T a Nemeth E Hepcidin and disorders of iron metabolism. Annu. Rev. Med.

2011;62(347-360. 21

Pietrangelo A The ferroportin disease. Blood cells, molecules & diseases 2004;32(1):131-

138. 22

Babitt J, Huang F, Wrighting D, et al. Bone morphogenetic protein signaling by

hemojuvelin regulates hepcidin expression. Nat. Genet. 2006;38(5):531-539. 23

Xia Y, Babitt J, Sidis Y, et al. Hemojuvelin regulates hepcidin expression via a selective

subset of BMP ligands and receptors independently of neogenin. Blood 2008;111(10):5195-5204. 24

Steinbicker A, Sachidanandan C, Vonner A, et al. Inhibition of bone morphogenetic protein

signaling attenuates anemia associated with inflammation. Blood 2011;117(18):4915-4923. 25

Andriopoulos B, Corradini E, Xia Y, et al. BMP6 is a key endogenous regulator of hepcidin

expression and iron metabolism. Nat. Genet. 2009;41(4):482-487. 26

Roy C a Enns C Iron homeostasis: new tales from the crypt. Blood 2000;96(13):4020-4027.

27

Gao J, Chen J, Kramer M, et al. Interaction of the hereditary hemochromatosis protein HFE

with transferrin receptor 2 is required for transferrin-induced hepcidin expression. Cell Metab. 2009;9(3):217-227. 28

Schmidt P, Toran P, Giannetti A, et al. The transferrin receptor modulates Hfe-dependent

regulation of hepcidin expression. Cell Metab. 2008;7(3):205-214. 29

Goswami T a Andrews N Hereditary hemochromatosis protein, HFE, interaction with

transferrin receptor 2 suggests a molecular mechanism for mammalian iron sensing. J. Biol. Chem. 2006;281(39):28494-28498. 30

Ramey G, Deschemin J-C a Vaulont S Cross-talk between the mitogen activated protein

kinase and bone morphogenetic protein/hemojuvelin pathways is required for the induction of hepcidin by holotransferrin in primary mouse hepatocytes. Haematologica 2009;94(6):765-772.

- 117 -


31

Příloha 3

Silvestri L, Pagani A, Nai A, et al. The serine protease matriptase-2 (TMPRSS6) inhibits

hepcidin activation by cleaving membrane hemojuvelin. Cell Metab. 2008;8(6):502-511. 32

Lee D-H, Lee D-H, Zhou L-J, et al. Neogenin inhibits HJV secretion and regulates BMP-

induced hepcidin expression and iron homeostasis. Blood 2010;115(15):3136-3145. 33

Cau M, Melis M, Congiu R, et al. Iron-deficiency anemia secondary to mutations in genes

controlling hepcidin. Expert Rev. Hematol. 2010;3(2):205-216. 34

Nai A, Pagani A, Silvestri L, et al. Increased susceptibility to iron deficiency of Tmprss6-

haploinsufficient mice. Blood 2010;116(5):851-852. 35

Yilmaz-Keskin E, Sal E, De Falco L, et al. Is the acronym IRIDA acceptable for slow

responders to iron in the presence of TMPRSS6 mutations? Turk. J. Pediatr. 2013;55(5):479-484. 36

Zhang S-P, Wang Z, Wang L-X, et al. AG490: an inhibitor of hepcidin expression in vivo.

World journal of gastroenterology : WJG 2011;17(45):5032-5034. 37

Lakhal S, Schödel J, Townsend A, et al. Regulation of type II transmembrane serine

proteinase TMPRSS6 by hypoxia-inducible factors: new link between hypoxia signaling and iron homeostasis. The Journal of biological chemistry 2011;286(6):4090-4097. 38

Maurer E, Gütschow M a Stirnberg M Matriptase-2 (TMPRSS6) is directly up-regulated by

hypoxia inducible factor-1: identification of a hypoxia-responsive element in the TMPRSS6 promoter region. Biol. Chem. 2012;393(6):535-540. 39

Meynard D, Vaja V, Sun C, et al. Regulation of TMPRSS6 by BMP6 and iron in human

cells and mice. Blood 2011;118(3):747-756. 40

Bartnikas T, Andrews N a Fleming M Transferrin is a major determinant of hepcidin

expression in hypotransferrinemic mice. Blood 2011;117(2):630-637. 41

Pak M, Lopez M, Gabayan V, et al. Suppression of hepcidin during anemia requires

erythropoietic activity. Blood 2006;108(12):3730-3735. 42

Adamsky K, Weizer O, Amariglio N, et al. Decreased hepcidin mRNA expression in

thalassemic mice. Br. J. Haematol. 2004;124(1):123-124. 43

Papanikolaou G, Tzilianos M, Christakis J, et al. Hepcidin in iron overload disorders. Blood

2005;105(10):4103-4105. 44

Pospisilova D, Holub D, Zidova Z, et al. Hepcidin levels in Diamond-Blackfan anemia

reflect erythropoietic activity and transfusion dependency. Haematologica 2014. 45

Tanno T, Bhanu NV, Oneal PA, et al. High levels of GDF15 in thalassemia suppress

expression of the iron regulatory protein hepcidin. Nat. Med. 2007;13(9):1096-1101. 46

Tanno T, Porayette P, Sripichai O, et al. Identification of TWSG1 as a second novel

erythroid regulator of hepcidin expression in murine and human cells. Blood 2009;114(1):181-186.

- 118 -


47

Příloha 3

Tanno T, Rabel A, Lee Y, et al. Expression of growth differentiation factor 15 is not

elevated in individuals with iron deficiency secondary to volunteer blood donation. Transfusion (Paris) 2010;50(7):1532-1535. 48

Talbot N, Lakhal S, Smith T, et al. Regulation of hepcidin expression at high altitude. Blood

2012;119(3):857-860. 49

Smith T, Robbins P a Ratcliffe P The human side of hypoxia-inducible factor. Br. J.

Haematol. 2008;141(3):325-334. 50

Gordeuk V, Miasnikova G, Sergueeva A, et al. Chuvash polycythemia VHLR200W

mutation is associated with down-regulation of hepcidin expression. Blood 2011;118(19):52785282. 51

Pietrangelo A, Dierssen U, Valli L, et al. STAT3 is required for IL-6-gp130-dependent

activation of hepcidin in vivo. Gastroenterology 2007;132(1):294-300. 52

Inamura J, Ikuta K, Jimbo J, et al. Upregulation of hepcidin by interleukin-1beta in human

hepatoma cell lines. Hepatology research : the official journal of the Japan Society of Hepatology 2005;33(3):198-205. 53

Lee P, Peng H, Gelbart T, et al. Regulation of hepcidin transcription by interleukin-1 and

interleukin-6. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005;102(6):1906-1910. 54

Salahudeen A a Bruick R Maintaining Mammalian iron and oxygen homeostasis: sensors,

regulation, and cross-talk. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2009;1177(30-38. 55

Goodnough L, Nemeth E a Ganz T Detection, evaluation, and management of iron-restricted

erythropoiesis. Blood 2010;116(23):4754-4761. 56

Oustamanolakis P, Koutroubakis I, Messaritakis I, et al. Serum hepcidin and prohepcidin

concentrations in inflammatory bowel disease. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 2011;23(3):262-268. 57

Kroot J, Kemna E, Bansal S, et al. Results of the first international round robin for the

quantification of urinary and plasma hepcidin assays: need for standardization. Haematologica 2009;94(12):1748-1752. 58

Šuláková A, Pozler O a Nováčková… L Prevalence a typ anémie v době stanovení diagnózy

nespecifického střevního zánětu u dětí. Czecho-Slovak … 2012. 59

Preza G, Ruchala P, Pinon R, et al. Minihepcidins are rationally designed small peptides that

mimic hepcidin activity in mice and may be useful for the treatment of iron overload. J. Clin. Invest. 2011;121(12):4880-4888. 60 defect

Corradini E, Schmidt P, Meynard D, et al. BMP6 treatment compensates for the molecular and

ameliorates

hemochromatosis

in

2010;139(5):1721-1729.

- 119 -

Hfe

knockout

mice.

Gastroenterology


61

Příloha 3

Sasu B, Cooke K, Arvedson T, et al. Antihepcidin antibody treatment modulates iron

metabolism and is effective in a mouse model of inflammation-induced anemia. Blood 2010;115(17):3616-3624. 62

Hashizume M, Uchiyama Y, Horai N, et al. Tocilizumab, a humanized anti-interleukin-6

receptor antibody, improved anemia in monkey arthritis by suppressing IL-6-induced hepcidin production. Rheumatol. Int. 2010;30(7):917-923. 63

Yu P, Hong C, Sachidanandan C, et al. Dorsomorphin inhibits BMP signals required for

embryogenesis and iron metabolism. Nat. Chem. Biol. 2008;4(1):33-41. 64

Poli M, Girelli D, Campostrini N, et al. Heparin: a potent inhibitor of hepcidin expression in

vitro and in vivo. Blood 2011;117(3):997-1004.

- 120 -


Příloha 3

Titl: :

v Brně dne: 9.6.2014

Vážený kolego manuskript:

Úloha hepcidinu v regulaci metabolizmu železa.autorů: Houda Jiří1, Pospíšilová Dagmar1, Horváthová Monika2

Manuskript byl po recenzi již přijatý do tisku. Redakční rada Vám velmi děkuje za Váš zájem publikovat v časopise Česko-Slovenská pediatrie V úctě

Prof..MUDr.Hana Hrstková, CSc. vedoucí redaktor Česko-Slovenské pediatrie Pediatrická klinika FN a LF Černopolní 9 61300 Brno ČR e-mail [email protected] tel.532234235 723288023

- 121 -


Příloha 4

- 122 -


Příloha 4

Incidence anémie u dětských pacientů s Crohnovou chorobou. Jiří Houda2, Dagmar Pospíšilová1, Petr Džubák2, Barbora Ludíková2, Zuzana Vymětalová3, Linda Petrželová3,. Dětská klinika1 a Laboratoř experimentální medicíny2, Fakultní nemocnice v Olomouci, Lékařská fakulta3, Palackého univerzita v Olomouci Úvod: Crohnova choroba (CD) patří mezi nespecifické střevní záněty, které jsou u dětí méně časté než u dospělých. Její incidence v posledních letech však výrazně narůstá. I přes pokroky v diagnostice a léčbě má toto onemocnění stále značnou morbiditu. Jedním z faktorů, které mohou významně ovlivnit kvalitu života dětských pacientů, je přítomnost anémie. Cílem práce bylo zhodnotit výskyt anémie v době diagnózy v souboru dětských pacientů s Crohnovou chorobou. Pacienti a metody: Soubor pacientů tvoří 56 dětí s CD, kteří jsou sledováni v gastroenterologické ordinaci Dětské kliniky Fakultní nemocnice v Olomouci. Z tohoto počtu je 34 chlapců (61%) a 22 dívek (39%) ve věku 6 - 20 let (průměr 16,17 roku). Věk diagnózy CD je 4 - 18 let (průměr 12,75 let). Byly hodnoceny tyto údaje: výskyt anémie u pacientů v době stanovení diagnózy a její základní charakteristiky: hodnota hemoglobinu, středního objemu erytrocytů (MCV), střední koncentrace Hb (MCH), hladina železa, feritinu a transferinového receptoru v séru, frekvence podání transfúzí, vliv anémie na fyzickou aktivitu pacienta. U části pacientů byla hodnocena hladina hepcidinu v séru a moči. Výsledky: Anémie v době diagnózy byla přítomna u 40 pacientů (71,42%), anémie s hodnotou hemoglobinu pod 100g/l byla zjištěna u 9 pacientů souboru (16,07%). 44,64% pacientů mělo sníženou hodnotu MCV a 71,43% pacientů mělo sníženou hodnotu MCH. Transfúze erytrocytární masy byla podána pouze jedné pacientce. Fyzická aktivita byla anémií ovlivněna u 6 pacientů (10,71%). Hladina železa byla snížena u 44 pacientů (78,6%), hladina feritinu byla snížena pouze u 10 pacientů (17,86%), hladina transferinového receptoru byla zvýšena u 10 pacientů ( 17,86% ).

- 123 -


Příloha 4

Závěr: Anémie může být počátečním příznakem závažného systémového onemocnění a její odhalení může být prvním důvodem k pátrání po vážném systémovém onemocnění, které může být dosud klinicky němé. U dětí s bolestmi břicha by přítomnost sideropenické anémie nebo anémie splňující charakteristiku anémie chronických chorob, měla být imperativem pro diagnostické vyloučení Crohnovy choroby. Detailní analýza parametrů anémie s cílem odlišit skutečný nedostatek železa v klidové fázi nemoci od anémie doprovázející aktivní zánět je nezbytná ke stanovení správného způsobu léčby. Stanovení hladiny hepcidinu z periferní krve by mohla být přínosem k upřesnění typu anémie a k určení správného způsobu léčby těchto pacientů. Tato práce byla podporována grantem IGA MZ ČR NS9951-4/2008

- 124 -


Příloha 4

- 125 -


Příloha 5

- 126 -


Příloha 5

Quantification of hepcidin in blood and urine in children with inflammatory bowel diseases by ELISA method. Houda J.1, Džubák P.2, Ludíková B.1, Pozler O.3, Pospíšilová D.1 1. Department of Paediatrics, Faculty of Medicine of Palacky University and Teaching Hospital in Olomouc 2. Laboratory of Experimental medicine, Department of Paediatrics in Olomouc 3. Department of Paediatrics, Faculty of Medicine Charles University and Teaching Hospital in Hradec Králové Introduction. The goal of the study is to create a method to determine the hepcidin and pro-hepcidin level in blood and urine in children with inflammatory bowel disease (IBD) and to define the relationship between hepcidin and pro-hepcidin with the type of anaemia and with the activity of inflammatory disease. Patients and Methods. We collected blood and urine samples from patients with Crohn’s disease or ulcerative colitis. Creating of the database helps to follow up the basic laboratory results (haemoglobin level, RBC, MCV, MCH, levels of iron, ferritin and sTfR) and clinical findings (physical examination, physical activity evaluated by question-form, number of transfusions). We studied 114 patients (65 males, 49 females) of our database; the age was 6-18 years. Quantification of the peptides is performed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results. We found anaemia (Hb < 120 g/l) in 54.4% of patients and serious anaemia (Hb < 100 g/l) in 9,6%. We described microcytic anaemia in 43.4% and hypochromic anaemia in 46.3% of the patients. The iron level was decreased in 55.2%, ferritin was decreased in 53.3% and increased sTfR level was found in 45.1%. In 2 patients it was necessary to administrate transfusions of erythrocytes due to severity of anaemia. Physical

activity

was

affected

in

5.3%. We

performed

ELISA

test for

hepcidin on 37 patients: 19 boys and 18 girls. The range of hepcidin level in blood was 31,9 – 133,7 ng/ml. 14 of tested children had anaemia and 13 children with anaemia had increased hepcidin level over the normal range. - 127 -


Conclusions.

Anaemia was present

Příloha 5

in

about

a

half

of

patients

with

IBD. Its occurrence can negatively influence the quality of life in these patients. Adequate treatment of anaemia should be included in the treatment algorithm. Laboratory findings showed the abnormal iron metabolism. The oral iron therapy is often ineffective and not well tolerated. One of the possible reasons could be the increased level of hepcidin. Hepcidin inhibits the normal absorption of iron in intestinal mucosa. Increased hepcidin levels would be helpful in patients’ selection for parenteral iron therapy. Study supported by grant IGA MZ ČR NS9951-4/2008.

- 128 -


Příloha 5

- 129 -


Příloha 6

- 130 -


Příloha 6

Kvantitativní stanovení hladiny hepcidinu v krvi a v moči u dětských pacientů s nespecifickými

střevními

záněty

metodou

ELISA

a

pomocí

hmotnostní

spektrometrie. Houda J.1, Džubák P.2, Ludíková B.1, Pozler O.3, Pospíšilová D.1 1. Dětská klinika LF UP a FN Olomouc 2. Laboratoř experimentální medicíny při DK FN Olomouc 3. Dětská klinika LF UK a FN Hradec Králové Cílem práce je vypracování metodiky ke stanovení hladin hepcidinu a pro-hepcidinu v krvi a moči dětských pacientů s nespecifickými střevními záněty a určení vztahu hepcidinu a pro-hepcidinu s typem anémie a s aktivitou zánětlivého onemocnění. Vyšetřovány byly vzorky pacientů s Crohnovou chorobou a ulcerózní kolitidou. Byla vytvořena databáze, která umožní sledovat v čase běžně dostupné laboratorní výsledky (hladina hemoglobinu, počet erytrocytů,MCV,MCH, hladiny sérového železa, ferritinu, sTfR) a klinický nález (fyzikální vyšetření, dotazníková metoda hodnotící fyzickou aktivitu, počet podaných transfuzí). Kvalitativní měření peptidů je provedeno ELISA metodou a hmotnostní spektrometrií. Databáze nyní obsahuje 81 pacientů (50 chlapců, 31 dívek) ve věku 6–18 let. U 61,7 % pacientů byla zjištěna anémie (Hb <120 g/l), u 12,3 % závažná anémie (Hb <100 g/l).U 48,8 % dětí byla zjištěna mikrocytární anémie a u 56,6 % hypochromní anémie. Hladina S-Fe snížena u 66,2 %, ferritin snížen u 51,5 %, sTFR byl zvýšen u 49,2 % pacientů. U 2 pacientů bylo pro závažnost anémie nutno podat transfuzi erytrocytů. Fyzickou aktivitu anémie ovlivnila u 7,4 % pacientů. Metodou ELISA bylo vyšetřeno prvních 13 pacientů. Hladina hepcidinu byla v rozmezí 12,7–87,3 ng/ml, 5 vyšetřovaných dětí mělo anémii a u 3 z nich byla zjištěna zvýšená hladina hepcidinu. Anémie se vyskytuje u 61,7 % pacientů s nespecifickými střevními záněty. Její přítomnost ovlivňuje nejen klinické příznaky primárního onemocnění, ale i celkový terapeutický přístup k těmto pacientům. Laboratorní parametry poukazují na abnormality v metabolismu železa. Jeho perorální substituce není obvykle účinná a většinou pacienty není dobře tolerována. Jednou z možných příčin může být

- 131 -


Příloha 6

zvýšená hladina hepcidinu, který svým působením ve střevní sliznici omezuje vstřebávání těchto přípravků. U 3 našich pacientů z 5 byla hladina hepcidinu zvýšená. Tato práce byla podporována grantem IGA MZ ČR NS9951-4/2008.

- 132 -


Příloha 6

- 133 -


Příloha 7

- 134 -


Příloha 7

Význam vyšetření hepcidinu u vrozených poruch erytropoézy. Houda J.1, Pospíšilová D.1, Ludíková B.1, Sulovská L.1, Ptoszková H.2, Novák Z.1, Holub D.1, Mihál V.1 1. Dětská klinika, Lékařská fakulta Univerzity Palackého a Fakultní nemocnice v Olomouci 2. Dětská klinika Fakultní nemocnice v Ostravě

Metabolismus železa (Fe) je regulován hepcidinem, který svou vazbou na feroportin omezuje výdej Fe z enterocytů duodena a z makrofágů podílejících se na sekvestraci senescentních erytrocytů. Hladina hepcidinu se snižuje u stavů se zvýšenou potřebou Fe, např. u sideropenické anémie, a zvyšuje u stavů s vysokou hladinou železa v organismu, např. u hemochromatóz nebo stavů spojených se sekundárním přetížením železem. Některé vzácné typy anémií jsou doprovázeny narušeným metabolismem železa. U pěti dětských pacientů s vrozenými defekty erytropoézy (3 pacienti s DiamondovouBlackfanovou anémií-DBA, 1 pacientka s hereditární hemolytickou anémií a 1 pacientka s vrozenou polycytémií) byla po vyšetření kompletního krevní obrazu, hladiny železa, feritinu a solubilního transferinového receptoru stanovena hladina bioaktivní formy hepcidinu-25 pomocí kompetitivní ELISA metody (DRG International Inc., Germany). Hladina feritinu byla u pacientů s DBA zvýšena (661 - 1361 ug/l, norma 20 - 150 ug/l) v důsledku chronického přetížení Fe při neefektivní erytropoéze a po opakovaných transfúzích erytrocytů. Hladina hepcidinu-25 byla 42,1 - 60,7 ng/ml (norma 13,3 - 54,4 ng/ml). U pacientky s vrozenou hemolytickou anémií (enzymopatie) byla hladina feritinu zvýšena a hladina hepcidinu-25 byla nízká: 11,3 ng/ml tedy pod dolní hranicí normy. U pacientky s vrozenou polycytémií je hladina feritinu snížená a hladina hepcidinu-25 je nízká 11,5 ng/ml. Hladina hepcidinu je kontrolována zejména erytropoetickou aktivitou a hladinou železa v organismu. Bylo prokázáno, že prostřednictvím signálních molekul GDF15, TWSG1, které reagují na anémii, je erytropoéza nadřazeným faktorem všem mechanizmům ovlivňujícím metabolismus Fe. U vrozených poruch erytropoézy se mohou kombinovat - 135 -


Příloha 7

tyto dva faktory: snížená hladina hepcidinu v důsledku vyšších nároků na přísun železa při větším obratu erytropoézy a zvýšená hladina hepcidinu při přetížení organismu železem. U pacientů trpících různými typy anémií či vrozenou polycytémií může znalost hladiny hepcidinu přinést důležité informace o patogenezi nerovnováhy metabolismu Fe a ovlivnit rozhodování o terapeutickém přístupu s výhledem využití agonistů nebo antagonistů hepcidinu. Stanovení hladiny hepcidinu u některých typů anémií může být v budoucnu přínosné pro klinickou praxi. Podpora: grant IGA MZ ČR NS9951-4/2008, VZ MSM 6198959205.

- 136 -


Příloha 7

- 137 -


Příloha 8

- 138 -


Příloha 8

Multimediální učebnice s komplexním přehledem poruch metabolismu železa a jejich projevech v hematologii. Podpořeno grantem FRVŠ 2413/2010.

Obr. 1 - Úvodní strana výukové prezentace a internetový odkaz na online verzi.

- 139 -


Příloha 8

Obr. 2 - Potisk výukového CD.

- 140 -

Regulace homeostázy železa u dětí

Recommend Documents