REDOX HOMEOSTASIS VIZSGÁLATA ÉS AZ ANTIOXIDÁNS KIEGÉSZÍTŐ KEZELÉS HATÁSA PORPHYRIA CUTANEA TARDÁBAN Doktori értekezés SZÉKELY EDIT
Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola
Témavezető: Dr. Blázovics Anna Ph.D. Hivatalos bírálok: Dr. Pozsonyi Teréz egyetemi docens Dr. Szemer Pál, egyetemi tanár, emeritus, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke:
Dr. Somogyi János egyetemi tanár, a MTA tagja
Szigorlati bizottság tagjai:
Dr. Szemere Pál egyetemi tanár, emeritus, Ph.D. Dr. Pozsonyi Teréz egyetemi docens, kandidátus
BUDAPEST 2006.
ÖSSZEFOGLALÁS Értekezés címe: Redox homeosztázis vizsgálata és az antioxidáns kiegészítő kezelés hatása porphyria cutanea tardában Szerző: Székely Edit Témavezető: dr. Blázovics Anna Készítés helye: Budapest, Semmelweis Egyetem Doktori Iskola 2/1 sz. Ph.D. program: A hepatológia szabad gyökös és immunológiai vonatkozásai.
Az elmúlt évtizedekben egyre több betegségről derült ki, hogy patogenézisében az oxidatív stressznek fontos szerepe van. Ez a magyarázata annak, hogy az antioxidáns kezelés jelentősége felértékelődött és napjaink kutatásaiban is előtérbe került. A májkárosodás talaján kialakuló, sporadikus porphyria cutanea tarda esetén a felhalmozódó vas felelős elsősorban az oxidatív stressz kialakulásáért. Megváltozik a betegek redox-homeosztázisa, az antioxidáns-szint csökken. Ezért várható az antioxidáns hatású E-vitamin és alfa-liponsav előnyős hatása a betegség kezelése során. Tanulmányaim célja a máj redox-státuszának vizsgálata, valamint az antioxidáns kiegészítő kezelés hatásának követése phlebotomizált porphyria cutanea tardában szenvedő betegeken. A klinikai diagnosztika mellett biokémiai, analitikai és fémion meghatározásokat végeztünk a szabad gyök – antioxidáns egyensúly meghatározásának kiértékelésére. Megvizsgáltuk az Evitamin és az alfa-liponsav hatását az oxidatív stressz mutatóira, a vizeleturoporfirin-szintre, a haemorrheologiai paraméterekre és a fémion-homeostasisra. Vizsgálataink igazolták, hogy a phlebotomia magában is jó kezelési módszernek bizonyult, de az addicionális E-vitamin-kezelés még hatékonyabbá teszi a terápiát a szabadgyökök direkt megkötésével a phototoxikus bőrtünetek kezelésében. Az alfa-liponsav az irodalomban leírtakkal ellentétesen kevésbé hatott a betegek redoxhomeostasisára, és kisebb mértékben befolyásolta az antioxidáns egyensúlyt. A klinikai eredmények alapján a phlebotomia eredményes kezelésnek bizonyult PCT betegek esetében, az eljárás nem változtatta meg kedvezően a fémionok mennyiségét a betegek vérében. A haemorrheologiai-vizsgálatok értékei szoros korrelációban vannak a redoxi-paraméterek változásával.
1
SUMMARY Investigation of redox homeostasis and the effect of additional antioxidant treatment in porphyria cutanea tarda Author: Székely Edit Consultant: Dr. Anna Blázovics Semmelweis University Budapest, School of Ph.D. Studies, 2/1 Ph.D. program: Immunological and free radical reactions in hepatology
The role of oxidative stress was proven in the pathogenesis of several diseases. This is why a great importance is attributed lately to the antioxidant therapy, and lots of studies are dealing with this issue. In PCT, the oxidative stress is caused by the excess iron, following liver damage. The redox homeostasis of the patients is modified, and the level of antioxidants is decreased. So, it is expectable that the antioxidant vitamin E and alfa-lipoic-acid treatment will have a beneficial effect during the treatment of PCT. The purpose of my study was the analysis of the redox status of the liver, and a folow up study on the effects of additional antioxidant treatment in phlebotomized PCT patients. We made biochemical, analytical and metal ion determinations for the study of the free radicalantioxidant balance. We studied the vitamin E and alfa-lipoic-acid effect on the indicators of the oxidative stress, urine porphyrin level, haemorrheological parameters and element ions homeostasis. Unlike the results of other studies, the alfa-lipoic-acid did not proved to be effective in improving the patients redox-homeostasis. According to the clinical data, phlebotomy proved to be an effective treatment in PCT, but it did not improved the leveles of element ions in the whole blood of the patients. Vitamin E treatment has an additional beneficial effect by directly scavenging free radicals. The results of the haemorrheological studies are in correlation with the changes of the redox parameters.
2
TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK ........................................................................................................................5 1. BEVEZETÉS ...................................................................................................................................8 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS .............................................................................................................10 2.1. Porphyria cutanea tarda.......................................................................................................10 2.1.1. A porphyria cutanea tarda patomechanizmusa.............................................................10 2.1.2. A porphyria cutanea tarda klinikuma ...........................................................................14 2.2. Redox –homeostasis............................................................................................................16 2.2.1. Szabadgyökös reakciók és antioxidáns védelem..........................................................16 2.2.2. A szabadgyökös reakciók molekuláris biológiai vonatkozásai....................................17 2.3. Fémionok jelentősége a redox-homeostasisban ..................................................................24 2.4. Oxidatív stressz és a porphyria cutanea tarda .....................................................................25 2.5. Terápiás céllal alkalmazható antioxidánsok a porphyria cutanea tardában ........................27 2.6. Májlézió porphyria cutanea tardában és az alkoholos májbetegség....................................27 2.7. Diabetes mellitus és a porphyria cutanea tarda együttes előfordulása ................................29 2.8. Haemorrheologiai vizsgálatok porphyria cutanea tardában ................................................31 3. CÉLKITŰZÉSEK ..........................................................................................................................33 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ........................................................................................................35 4.1. Anyagok ..............................................................................................................................35 4.2. Betegek................................................................................................................................35 4.3. Módszerek: ..........................................................................................................................37 4.3.1. Klinikai laboratóriumi paraméterek vizsgálata ............................................................37 4.3.3. Haemorrheologiai vizsgálatok......................................................................................41 4.3.4. Porfirin meghatározások ..............................................................................................42 4.3.5. Redox homeostasist vizsgáló módszerek .....................................................................47 4.3.6. Fémionok meghatározása.............................................................................................48 4.3.7. A- és E-vitamin meghatározása szérumban .................................................................49 4.3.8. Alkoholkoncentráció meghatározása ...........................................................................49 4.3.9. Pontmutációk kimutatása PCR módszerrel ..................................................................50 4.3.10. Matematikai statisztikai módszerek ...........................................................................50 5. EREDMÉNYEK ............................................................................................................................51 5.1. Klinikai kémiai vizsgálatok eredményeinek összehasonlítása különböző stádiumban lévő porphyria cutanea tardában szenvedő betegek esetében ............................................................51 5.1.1. Porphyria cutanea tarda beteg esetismertetése .............................................................52 5.1.2. Porphyria cutanea tarda betegek csoportosítása klinikailag aktív tünetek és a haemochromatosis gén mutáció alapján.................................................................................55 5.1.3. Porphyria cutanea tarda betegek csoportosítása az alkoholfogyasztás és a diabetes mellitus szerint .......................................................................................................................63 5.2. Redoxi-paraméterek vizsgálata phlebotomia-kezelés hatására porphyria cutanea tardában szenvedő betegekben..................................................................................................................69 5.3. Haemorrheologiai paraméterek vizsgálata ..........................................................................78
3
5.4. Fémion-koncentráció vizsgálata phlebotomizált porphyria cutanea tardában szenvedő betegekben..................................................................................................................................80 5.5 Antioxidáns terápia ..............................................................................................................86 5.5.1. Alfa-liponsav hatásának vizsgálata porphyria cutanea tardában..................................86 5.5.2. E-vitamin-kezelés hatásának vizsgálata porphyria cutanea tardában ..........................94 6. MEGBESZÉLÉS..........................................................................................................................100 6.1. Enzimdefektusok és haemochromatosis pontmutációk PCT-ban .....................................100 6.2. Redox-homeostázis porphyria cutanea tardában...............................................................101 6.3. Haemorrheologiai viszonyok porphyria cutanea tardában................................................102 6.4 . Fémionok szerepe a PCT-ban ..........................................................................................103 6.5 Az antioxidáns kiegészítő kezelés porphyria cutanea tardában .........................................105 7. TÉZISEK, KÖVETKEZTETÉSEK ................................................................................................107 8. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS .........................................................................................................108 9. IRODALOMJEGYZÉK.................................................................................................................111 10. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE .........................................................................................129
4
RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK ADH = alkohol-dehidrogenáz ALP = alkalikus-foszfatáz ALT = alanin-aminotranszferáz AP-1 = aktivátor protein-1 AST = aszpartát-aminotranszferáz ASO = anti-streptolizin ATP = adenozin-trifoszfát a.t. = analitikailag tiszta BCL2 = antiapoptotikus fehérje Bcl I = B-CCL/lymphoma 1 sejt restrikciós enzim CRP = C-reaktiv fehérje DALA = aminolevulinsav DPPH = 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil DHBS = 3,5-diklór-2-hidroxi-benzolszulfonsav DM = diabetes mellitus DMSO = dimetil-szulfoxid GGT = gamma-glutamiltranszferáz GLDH = glutamátdehidrogenáz G6P-DH = glükoz-6-foszfátdehidrogenáz Grx = glutaredoxin GSSG = oxidált glutation GSH = redukált glutation GSH-Px = glutation peroxidáz HDL = nagy denzitású lipoprotein (high density lipoprotein) HFE gén = herediter haemochromatosis gén HH = herediter haemochromatosis Hinf I = Haemophilus influenzae-restrikciós enzim HPETE = hidroperoxieikozatetraénsav IFN = interferon IL-6 = interleukin-6
5
IgA = immunglobulin A IgM = immunglobulin M IgG = immunglobulin G KP = koproporfirin eqAs = aszkorbinsav ekvivalens LDH = laktátdehidrogenáz LDL = kis denzitású lipoprotein (low density lipoprotein) LT = leukotriének MCV = átlagos vörösvérsejtszám MCSF = monocita kolóniastimuláló faktor MDA = malondialdehid MDH = malátdehidrogenáz MEOS = mikroszomális etanoloxidáló rendszer NADH = redukált-nikotinamid-adenindinukleotid NAD = nikotinsavamid-adenin-dinukleotid NER = Nucleotide excision repair (nukleotid kivágó javítás) NF-κB = nukleáris faktor Nox = NADPH-oxidáz 1
O2 = szinglet oxigén
O2-• = szuperoxid anion OH-• = hidroxilgyök P53
= transzkripciós faktor
PCT = porphyria cutanea tarda PGDF = trombocita eredetű növekedési faktor PGE2 = prosztaglandin származék Prx = peroxiredoxin PL. KEM.=.plazma kemilumineszcencia RLU = relative light unit ( kemilumineszcenciás fényintenzitás) RO• = szerves alkilgyök ROOH = szerves peroxid ROO• = szerves peroxidgyök
6
ROS = aktív oxigéngyök Rsa I = Rhodopseudomonas sphaeroides-restrikciós enzim SD = standard deviáció SE = szérum SH-csoport = szabad szulfhidril-csoport SOD = szuperoxid-dizmutáz TBARS=thiobarbitursav TNF-α = tumornecrosis faktor-alfa Trx = tioredoxin TrxR = tioredoxin-reduktáz TSC = össz-scavenger kapacitás TxA2 = tromboxán A2 UP = uroporfirin UROD = uroporfirinogén dekarboxiláz VVS = vörösvérsejt x = átlag
Az itt fel nem sorolt egyéb rövidítések magyarázatát az egyes fejezetekben adom meg. A dolgozat írásánál az Orvosi Helyesírási Szótár (Magyar Tudományos Akadémia, Budapest, 1982) ajánlását vettem figyelembe.
7
1. BEVEZETÉS 1. BEVEZETÉS 1841-ben Scherer említi először a vasnélküli vérfesték piros színét. Mülden 1844-ben tanulmányt irt a vasmentes biborszinű folyadékról, melyet hematinnak nevezett el. Hoppe-Seyler 1871-ben kimutatta, hogy a hematin fő alkotórésze a hematoporfirin, melyet a görög bíbor – porphuros – szóról nevezett el. A múlt század első felében a Nobel díjas Hans Fischer 30 éven át foglalkozott a porfirinek kémiájával.
Sikerült
elkülöníteni
az
egyes
porfirineket,
az
uro-
és
koproporfirint.
Laboratóriumában dolgozott éveken át Waldenström és Watson. Watson később Minneapolisban alapított iskolát, és több, még ma is használt vizsgálati módszert dolgozott ki. 1937-ben Waldenstrőm nevezte el a porfirinanyagcsere betegségeit porfiriáknak. s tőle származik a porphyria cutanea tarda elnevezés is. Svédországban folytatta kutatásait, leírta a porphyria cutanea tarda két fajtáját, porphyria cutanea tarda symptomatica és porphyria cutanea tarda hereditaria néven. Hazánkban a porfirinanyagcsere-betegségekkel kapcsolatos kutatások a 30-as évek elején indultak el. Róth és Udvardy 1931-ben közölték az első akut porfiriás esetüket (Róth, 1931). A II. Világháború okozta megtorpanás után az 50-es években lendült fel ismét a porfiria-kutatás, amikorra Róthnak és Goreczkynek sikerült létrehoznia egy modern porfiria-laboratóriumot és már kellő tapasztalatra tettek szert ahhoz, hogy a klinikum, a patogenézis és a vizsgálati módszerek terén európaszerte ismert megállapításokat tegyenek. Az első jelentős magyar összefoglalójuk 1965-ben jelent meg. 1968-as átdolgozott munkái, mind a klinikum, mind a vizsgálómódszerek tekintetében a kor egyik legmodernebb monographiája lett (Goreczky, 1969). A porphyria cutanea tarda betegséggel, annak patogenézisével Simon foglalkozott. 1981ben írt doktori téziseiben kiemelte, hogy „fontos patogenetikai tényező a membránok károsodása, melynek következtében az uroporfirin a citoszólból nemcsak a mitokondriumba juthat, hanem az intercellularis állományba is (Simon, 1981). Megállapításai időtállónak bizonyultak, az elmúlt évek kutatásai alátámasztani látszanak azokat. A porphyria cutanea tarda kutatások területén kapott eredmények tették aktuálissá számomra, hogy részletesen vizsgáljam az oxidatív stressz hatását, valamint a szervezetben zajló haemorrheologiai változásokat, azok szerepét a porphyria cutanea tarda patogenézisében, változásait a kórlefolyás során. Célul tűztem ki a terápiás lehetőségek vizsgálatát is, s hogy az
8
1. BEVEZETÉS alkalmazott kezelés befolyásolja-e ezeket a folyamatokat. Vizsgálataimat 3 betegcsoporton végeztem: 1. porphyria cutanea tardában szenvedő betegek, 2. alkoholfüggő porphyria cutanea tardában szenvedő betegek 3. 2-es típusú diabetes mellitusban is szenvedő és alkoholfüggő porphyria cutanea tardában szenvedő betegek. Kutatásaimat annak megítélése céljából végeztem, hogy az észlelt elváltozások csak a porphyria cutanea tarda betegség velejárói, vagy a társbetegség, esetleg exogén tényező (alkohol) következményei.
9
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. Porphyria cutanea tarda A porphyria cutanea tarda a leggyakoribb cutan porphyria, melyet a haem bioszintézisben szereplő uroporfirinogen-dekarboxilaz enzim csökkent működése és ennek következtében a porfirinek fokozott termelődése és kiválasztása jellemez. Prevalenciája országonként változó, 1:5000, - 1:70000. A betegséget férfi dominancia jellemzi. Pontos hazai felmérés nem ismert. 2 fő csoportot különítenek el, az esetek 20-25 %-a familiáris és 75 – 80 %-a sporadikus. Familiáris porphyria cutanea tarda esetén az uroporfirinogén-dekarboxiláz enzim csökkent
aktivitása autoszomális domináns módon öröklődik, s a szervezet minden szövetében kimutatható. Klinikai penetranciája alacsony, a hordozók 10 %-ában alakulnak ki tünetek. Sporadikus porphyria cutanea tarda esetén az uroporfirinogen-decarboxiláz enzim aktivitása
csak a májban csökkent. Rendszerint felnőtt korban, idült májbetegség talaján manifesztálódik. A klinikai tünetek kialakulásában több endogén és exogén tényező együttes hatásának van fontos szerepe. 2.1.1. A porphyria cutanea tarda patomechanizmusa Mai ismereteink szerint PCT-ban több gén – az UROD, a haemochromatosis és a citokróm P450 család génjeinek – koinheritenciája regulálja azt a vasdependens folyamatot, amelynek során a hepatikus UROD toxikus ágensek hatására inaktiválódik (Elder, 1986). Az alapvető kérdés még mindig az, hogy miért csak néhány egyénnél csökken a hepatikus uroporfirinogén-dekarboxiláz enzim aktivitása a toxikus ágensek okozta májsejtkárosodás során, és hogy ezek a toxikus faktorok hogyan okozzák az UROD-enzimdefektusát.
10
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 1. ábra A hembioszintézis és a porfiriák
Az 1. ábrán mutatom be a hembioszintézis során előforduló eltéréseket Nordmann nyomán (Nordmann, 1999).
11
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2. ábra: Porphyria cutanea tarda patogenezise
A 2. ábrán a porphyria cutanea tarda patogenezisének sematikus képe látható Thunell szerint (Thunell, 2000). 2.1.1.1 Familiáris porphyria cutanea tarda PCT-ben az UROD enzim génjének autoszomális domináns módon öröklődő mutációja észlelhető, amelyből eddig közel 30 különbözőt ismertek fel. Az UROD enzim csökkent aktivitása a szervezet összes sejtjére jellemző, gyakran egy allél mutációja a döntő. Kushner szerint a sporadikus PCT-hoz hasonlóan magasabb a C282Y mutáció gyakorisága (Kusner, 1998). A betegség manifesztálódásához az öröklött enzimdefektus mellett valószinüleg több kiváltó tényező egyidejű megléte is szükséges. 2.1.1.2. Sporadikus porphyria cutanea tarda Idült májbetegség talaján alakul ki. Az uroporfirinogen decarboxyláz enzim gátlásának mechanizmusa pontosan nem ismert, de valószinü, hogy több endogen és exogen tényező együttes hatásának következménye.
12
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS A betegség jellemzője, hogy a haemochromatosis gén és a citokróm P 450 család génmutációja gyakori. A betegségben öröklött vagy szerzett vasanyagcserezavar mindig jelen van. Az alkohol és vírusfertőzések, különösen a hepatitis C vírusinfekció, HIV, (Huerter, 1993; Loustaud, 2000), valamint a gyógyszerek, pl. ösztrogének, és citosztatikumok (Moore, 1987), a nikotin és különböző vegyszerek (Ippen, 1967) befolyásolják a betegség súlyosságát. A legjelentősebb patológiás tényező a vas. Az alkohol és ösztrogének fokozzák a vas bélből történő abszorbcióját (Mukerji, 2000; Guennoun, 2003), krónikus vírusfertőzés következtében, pedig vas mobilizálódhat a megkötött ferritin formából (Thunell, 2000.). Tehát a többi exogen tényező is a vasanyagcserére gyakorol hatást. A HFE-génmutáció (Cys282Tyr) felelős a vas bélből való abszorpciójának transzferrin-függő szabályozásáért (Kauppinen, 2005). Más HFE mutációk (H63D, S65C) felerősíthetik a hepatotropikus vírusok hatását a vas mobilizálásában (Bulaj, 2000). Már régóta ismert, hogy PCT-ban szenvedő betegek többségében magas a szérumvas és a ferritinszint, és gyakori az enyhe vagy a közepes fokú siderosis a májban (Franklin, 2002). Gyakran manifesztálódik a PCT már korábban fennállott betegségek mellett, mint a szifilisz, diabetes mellitus, autoimmun kórképek, tumorok (Remenyik,1996; Horkay,2003), dializissel kezelt vesebetegekben (Koszó, 1995 ). 2.1.1.3. Herediter haemochromatosis és a porphyria cutanea tarda kapcsolata Ismert tény, hogy a haemochromatosis gén előfordulása porphyria cutanea tardában szenvedő betegekben gyakori. Ezért vizsgáltuk mi is a haemochromatosis kialakulásáért felelős HFE gén pontmutációit. A HFE gén azonosítása előtt az átlag populációban nem volt lehetőség a haemochromatosis gén heterozigóta mutációhordozók kimutatására, így a heterozigóták vasparamétereinek tanulmányozása korábban szűkebb családvizsgálatokra korlátozódott. Progresszív vasfelhalmozódás a HLA-tipizálással azonosított heterozigóta egyéneknél nem volt megfigyelhető, de vasparaméterszintjeik magasabbak voltak a mutációt nem hordozó családtagjaikhoz viszonyítva. Többségüknél a szérumferritin-szint és a transzferrin-szaturáció értéke
a
normál-tartományban
maradt,
10-20
százalékuknál
azonban
emelkedett
vasparamétereket találtak (Bulaj, 1996; Adams, 1994; Lamoril, 2002; Turlin, 1998). Egy másik tanulmányban is (Whitfield, 2000) emelkedett vasparaméter-értékeket írtak le a HFE C282Y és H63D heterozigóta ikertestvéreknél a normális genotípusú testvérpárokhoz képest. Ezen eredmények birtokában következtetni lehet, hogy a HFE viszonylag gyakran előforduló C282Y és H63D heterozigóta genotípusai befolyásolhatják olyan multifaktoriális betegségek 13
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS kialakulását, illetve progresszióját, amelyekben a vaslerakódás patogenetikai szerepet játszhat. A porphyria cutanea tarda és a haemochromatosis kapcsolatának közvetlen vizsgálatát a haemochromatosis génjének (HFE) azonosítása tette lehetővé. A HFE génben (6. kromoszóma) három pontmutációt írtak le: Cys282Tyr (C282Y), His63Asp (H63D) és Ser65Cys (S65C) (Andrikovics, 1999). A C282Y pontmutációt az elvégzett vizsgálatok során a haemochromatózisban szenvedő, klinikai tünetek alapján diagnosztizált betegek 64-100 %-ában homozigóta formában találták meg. A HFE gén másik gyakori pontmutációja a 63.-dik aminosav helyen a hisztidin-aszpartát cseréje. A H63D génmutáció kapcsolatát a HH-val a klinikai tanulmányok nem igazolták egyértelműen. A harmadik pontmutációt, az S65C-t több szerző is vizsgálta PCT-ban. Sporadikus PCT-ban szenvedő angol betegek körében a kontrollcsoporthoz képest mind a C282Y homozigóta, mind a heterozigóta arányt magasnak találták (Roberts, 1997). PCT-ban szenvedő holland betegeknél a C282Y mutáció gyakoriság-emelkedése mellett a H63D előfordulási gyakoriságot (Santos, 1997), míg az olasz PCT-s betegeknél csak a H63D előfordulási gyakoriságot találták magasabbnak (Sampietro, 1998). Egyes szerzők még a familiáris PCT-ban szenvedő betegeknél is magasabbnak találták a C282Y mutáció előfordulási gyakoriságát. Felvetették, hogy a betegség megjelenéséhez a genetikailag érzékeny egyénekben is több kiváltó faktor egyidejű jelenléte szükséges (Kushner, 1998). 2.1.2. A porphyria cutanea tarda klinikuma Az uroporfirin-dekarboxiláz enzim aktivitásának csökkenése következtében jelentősen fokozódik az uroporfirin termelése és kiürülése a vizelettel. Nagy mennyiségben rakódik le a szövetekben, főként a bőrben és a májban. A bőrben akkumulálódó porfirinek fototoxikus hatása felelős a bőrjelenségekért. Az uroporfirin erősen fototoxikus, elnyeli a 300-350 nm hosszúságú fénysugarakat. Energia szabadul fel, mely fluoreszcenciában nyilvánul meg a porfirin molekula kettős kötéseiben lévő elektronok gerjesztése következtében. Szabad gyökök keletkeznek, melyek hatására a sejtstruktúrák, sejtmembrán károsodnak, sejtlízis alakul ki. A napnak kitett helyeken, főként a kézháton, arcon, fejen vesikulák, bullák, majd eroziók alakulnak ki, melyek heggel gyógyulnak. A bőr elvékonyodik, nagyon sérülékeny. Jellemző tünet a hypertrichosis, mely a postmenopausaban alkalmazott ösztrogén kezelés alatt kialakuló PCT-nél kifejezett is lehet. A legújabb kutatások felvetik különböző matrix-metalloproteinázok additív szerepét is (Hermann, 1996). A PCT-t
14
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS kísérő hepatopathia az igen gyakori steatosistól a krónikus aktív hepatitisen át a cirrhosisig tart. Gyakori a hepatocelluláris carcinoma. 2.1.2.1. A porphyria cutanea tarda laboratóriumi diagnosztikája A porfirin-analízis célja az uroporfirinuria igazolása. 24 órás gyűjtött vizeletből az uroporfirin és koproporfirin kvantitatív meghatározása. A vasanyagcsere a betegek túlnyomó többségében kóros. A máj diszfunkciója általában nem súlyos. HCV-re a vírus szerológiai vizsgálatok ma már minden esetben elvégzendők. Ha gyanú van rá, el kell végezni a szeropozitív betegek HIVvizsgálatát is. A részletes porfirinanalízis, a plazmaporfirin és a székletporfirin vizsgálatok nyújtanak segítséget a differenciálásban egyéb cután porphyriáktól.
2.1.2.2. A porphyria cutanea tarda terápiája A PCT krónikus lefolyású megbetegedés, remissziók és napfény hatására kialakuló akut exacerbatiok jellemzik. Spontán remisszió ritka, de az alkalmazott tüneti kezelésre hosszabb, rövidebb remisszió általában elérhető. Előfordul, hogy a provokáló tényezők eliminálása is klinikai tünetmentességet eredményez. A PCT kezelésére több eljárás is alkalmazható (Fritsch, 1998). Az Ippen-kúrát és a chloroquint ma is alkalmazzák. A vérlebocsátást 10 napontként végzik, általában addig, míg a szérumferritin-szint normalizálódik. Esetenként 2-3 dl vért bocsátanak le. A remisszió tartósabb, mint a chloroquin kezelés alkalmazásakor. A hepatopathia minden esetben adekvát belgyógyászati kezelést igényel, mivel a betegek sorsát a májkárosodás etiológiája, súlyossága és kezelési lehetőségei határozzák meg. Az újabban alkalmazott hosszas, legalább egy évig tartó interferon-alfa és ribavirin-kúra aktív HCV hepatitisben jelentősen, 20-ról 40%-ra növeli azoknak a betegeknek az arányát, akiknél a hepatopathia tartós remissziója érhető el (Lengyel, 1998; Souza, 2006), amivel párhuzamosan várhatóan a PCT lefolyása is kedvezően alakul. Ez a kombinált kezelés nagyobb egészségügyi centrumokban ma már hazánkban is megvalósítható. Ugyancsak kedvezően befolyásolja az antivirális terápia a HIV-fertőzéshez társuló PCT-t is, sőt a HCV-vel kombinált vírusfertőzés okozta PCT-ben az aktív retrovirális terápia átmeneti remisszióhoz is vezethet (Rich, 1999).
15
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.2. Redox –homeostasis 2.2.1. Szabadgyökös reakciók és antioxidáns védelem A szabad gyökök olyan molekulák vagy molekulafragmentek, amelyek a legkülső elektronhéjukon párosítatlan elektront tartalmaznak. Mivel az elektronok párképződésre hajlamosak, ezért a szabad gyökök gyorsan reakcióba lépnek más vegyületekkel (Fehér, Vereckei, 1985). A
szervezetben
fiziológiás
körülmények
között
keletkező
szabad
gyököknek
(pl.:
szuperoxidanion, nitrogén-monoxid, hidrogén-peroxid), biológiai funkciójuk van (Mc Cord, 2000). Emlősöknél több tényező fokozhatja a szabad gyökök képződését. A legfontosabbak a következők: a sejtek energiaellátását biztosító mitokondriális oxidatív metabolizmus, a mikroszomális drogmetabolizáló enzimrendszer, a prosztaglandin-bioszintézis, az indukálható NO-szintetáz-aktivítás, a fagociták, a monociták, a makrofágok és a Kupffer-sejtek szabadgyökös reakciói, a peroxiszomákban képződő H2O2 autooxidációja. A kutatások e területen újabb eredményeket hoztak, pl. a NADPH-oxidáz (Nox) működésének megismerése. A Nox részt vesz a jelátvitel szabályozásában is szabadgyök-termelése révén (Li Q, 2006; Dorman, 2005). A szervezetben keletkező szabad gyökök létrejöhetnek hypoxiában, hyperoxiában és normális oxigéntenzió mellett is (Cadenas, 2004). A szabad gyökök először a lipideket alkotó zsírsavmolekulákat támadják meg, mert a bennük levő kettős kötések könnyen oxidálódnak. Ez a gyökös mechanizmusú láncreakció a lipidperoxidáció. A láncreakciók sajátosságaiból adódóan már néhány szabad gyök is rendkívüli károsodásokat idézhet elő (Yin, 2005; Galinier, 2005). A feleslegben termelődő szabad gyökök minden molekulával reakcióba léphetnek. Rendkívül érzékenyek a szabad gyökökre azok a fehérjék, polipeptidek és peptidek, amelyek funkciós csoporttal rendelkező aminósavakat tartalmaznak. A makromolekulák polimerizálódhatnak, aggregálódhatnak, fragmentálódhatnak. Egyértelmű láncszakadáshoz vezet, ha a DNS károsodása a glükozrészen jön létre. Különösen a többszörösen telítetlen zsírsavak reagálnak érzékenyen a szabad gyökökre (Gonzalo, 2005; Afanas’ev, 2005; Halliwell, 1995; Blázovics, 2001). A szervezet normális működésének feltétele a szabad gyök – antioxidáns egyensúly, amely nélkülözhetetlen a sejtproliferáció és az apoptotikus sejtpusztulás szigorú kontrolljához. Sok
16
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS tudományos munka igazolja a szabad gyökök közvetlen vagy közvetett hatását a jelátvitelre (Kong, 2000; Kopper, 2002). 2.2.2. A szabadgyökös reakciók molekuláris biológiai vonatkozásai Az oxidatív stressz több szinten befolyásolja a sejtműködést, egyrészt több extracelluláris folyamatot indít be, másrészt intracellulárisan módosíthatja a ligandok receptorokhoz való kapcsolódását a jelátvitel során (Yilmaz, 2006; Castro, 2005; Poli, 2004). Szabad gyökök hatására az extracelluláris szignálregulált kinázok (ERK1/2), a c-Jun N-terminális kinázok (JNK/SAPK) és a p38 mitogénaktivált proteinkinázok (MAPK) gyorsan aktiválódnak, és így fontos szerepet játszanak az apoptózis indukciójában (Thompson, 1995; Earnshaw, 1999; Deng, 2003). Az
apoptózis programozott
sejthalál, melyben a maganyag és a sejtorganellumok
fragmentálódnak, míg a plazmamembrán ép marad. A sejt elszakad a környezetétől és a makrofágok az immunrendszer aktiválódása nélkül fagocitálják az életképtelenné vált összezsugorodott sejtet (Kopper, 2002; Budihardjo L. 1999; Orlowski, 1999).A nekrózis drámai változásokat jelent a szövetek számára, a sejtmembrán szétszakad, a sejtmaradványok kikerülnek az extracelluláris térbe és gyulladásos állapotot indukálnak. Az intracelluláris redoxi-állapot legfontosabb elemei a ciszteintartalmú fehérjék, illetve a glutation oxidált/redukált alakjának aránya. A GSH közvetlenül is részt vesz az oxigén szabad gyökök közömbösítésében. A 3. ábrán bemutatom a tioredoxin szerepét az oxidatív stresszben. A tioredoxin és a glutaredoxin, valamint más fehérjetiolok a NADPH hidrogénjének felhasználásával szintén részt vesznek a redox-homeostasis fenntartásában (Abate, 1990; Kamata, 1999).A tioredoxin a fehérjék szulfhidril-csoportjainak redukálását végzi, ezáltal befolyásolja a fehérjék térszerkezetének változásait, a receptorhelyek kialakulását és a transzkripciós faktorok (pl. NF-kB, AP-1) aktiválását (Meyer, 1994). A protein-diszulfid-izomeráz (PDI) a proteinek térszerkezetének kialakításában vesz részt. Ez az enzim is képes a dehidroaszkorbinsavat visszaredukálni aktív formájába. A γ-glutamiltranszpeptidáz kulcsenzim az intracelluláris redukált glutation homeostasisában és a sejten belüli redox-állapot fenntartásában. A γ-glutamil-transzpeptidáz reakcióban képződő H2O2 részt vesz az NF-κB aktiválásában (Meyer, 1993). A γ-glutamil-cisztein-szintetáz katalizálja a glutation szintézisének „rate limiting” lépését.
17
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS A γ-glutamil-cisztein-szintetáz szintézisének szabályozása és az antioxidáns védelmi rendszer más komponenseinek transzkripciós kontrollja átfedő. A tioredoxin és a glutaredoxin, valamint más fehérjetiolok a NADPH hidrogénjének felhasználásával a ribonukleotid-difoszfát-reduktáz enzim segítségével Mg2+ionok jelenlétében a ribonukleotidokat dezoxiribonukleotidokká redukálják (Das, 2001). A redukált tioredoxin a redoxfaktor 1-et (Ref1) is képes redukálni, amely a NF-κB, AP-1, ATF, Creb EGR transzkripciós faktorok redukálását végzi, ezáltal befolyásolja DNS-hez történő kötődésüket (Powis, 1997). 3. ábra: Tioredoxin szerepe az oxidatív stresszben
Az NF-κB és az AP-1 transzkripciós faktorok számos gén promoter régiójához kapcsolódnak és működésük az intracelluláris redox-állapot változásával szabályozható. Az NF-κB szabályozza a citokinek, sejtfelszíni receptorok, antioxidáns enzimek génjeinek expresszióját (Matés, 2000; Rust, C. 2000). Az NF-κB szerepet játszik a gyulladásos folyamatokban és a sejthalál kontrolljában is. Az apoptózist kiválthatják az NF-κB aktiválásával (4. ábra) képződő TNF-alfa, a retinoidok, a toxinok és a szabad gyökök. A szignalizációban a proteinkináz C is részt vesz. Az apoptózisban, a tumoros folyamatok kialakulásában a Bcl2 protoonkogén és a p53 protein játsszák a meghatározó szerepet (Rust, 2000; Schulze-Osthoff, 1997).
18
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS
4. ábra: Az NF-κB aktiválása és transzlokációja
Az immunreakciókat, a gyulladásos folyamatokat alapvetően, a prosztaglandinok két fontos képviselője a PGE2 és a 15-d-PGJ2 befolyásolják. Ezek a prosztanoidok kimutathatóak a rák progressziójában de tumornövekedést gátló hatásuk is ismert (Goodwin, 1991). Az antiinflammatorikus PGI-k, PGE-k és a PGD-k felelősek a trombocita- és leukocita-aggregáció gátlásáért, a leukocitamigráció és T-sejt-proliferáció csökkentéséért (Goodwin, 1991). A 15-dPGJ2 különös jelentősége az, hogy a sejtmagban aktiválja a PPARγ-át, ami azután szabályozza a génátírást. Egy másik mechanizmus szerint közvetlenül is képes regulálni a transzkripciót (Kliewer 1995, Lehmann 1997). A PPARγ gátolja az AP-1- és az NF-κB-aktiválást is.
19
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS A szuperoxid-dizmutáz (SOD) és a kataláz dizmutáció révén, míg a glutation-peroxidáz (GSHPx) oxido-redukciós reakcióban fejti ki antioxidáns hatását. A SOD a szuperoxid-gyök, míg a másik két említett enzim a hidrogén-peroxid semlegesítését végzi. Az extracelluláris tér kevésbé védett a szabadgyök-hatásokkal szemben. A védelem legfontosabb eleme a coeruloplasmin, mely a lipidperoxidációt katalizáló ferrovasat ferrivassá alakítja át. Számos kismolekula, mint például a glükóz és a bilirubin szintén rendelkezik antioxidáns tulajdonsággal. Porphyria cutanea tardában a növekvő raktározott vas a májban direkt vagy indirekt módon az oxidatív stresszt váltja ki (Mukerji, 1990; Smith, 1990). Számos in vitro és állatkisérletes tanulmány rámutatott, hogy az oxidatív stressznek és antioxidánsoknak jelentős szerepük van a porphyria cutanea tarda patogenezisében és terápiájában (Mukerji, 1990; Smith, 1990; Horváth, 2001; Mazzetti, 2004). Hypoxia során az oxigén parciális nyomáscsökkenésével párhuzamosan csökken a reaktív oxigén intermedierek képződése (Novák, 1993). Ez annak köszönhető, hogy a szabadgyök-képződésben kulcsfontosságú oxidáz-rendszerek katalitikus aktivitása és az autooxidációs mechanizmusok az oxigén parciális nyomásának csökkenésével szintén csökkennek. Az enzimatikus antioxidánsok mellett az oxidáció elleni védelemben számos nem enzim molekula vesz részt. A plazmában található nem enzimatikus molekulák közül, gyökfogó kapacitásuk és relatíve nagy koncentrációjuk miatt, az albumint, a húgysavat és a bilirubint tartják fontos antioxidánsnak. Ezek az anyagok a plazma teljes antioxidáns kapacitásának 5080%-t teszik ki (Wayner, 1987). További fontos antioxidánsok a plazmában sokkal kisebb koncentrációban jelenlevő zsíroldékony E-vitamin és béta-karotin, valamint a vízoldékony Cvitamin (Lunec, 2002) és az alfa-liponsav (Noda, 2003). Ezek a vegyületek koncentrációtól függően lehetnek antioxidánsok, vagy éppen ellenkezően, oxidációt elősegítő, prooxidáns tulajdonságúak. Az E-vitamin univerzális antioxidáns (Gulcin, 2005). Ismert, hogy az E-vitamin képes 1000 lipidmolekulát megvédeni a lipidperoxidációtól. Az aszkorbinsav és a redukált glutation (GSH) képesek a tokoferoxil gyököt regenerálni. Az utóbbi évek kutatási eredményei alapján ismertté vált, hogy az E-vitamin különböző gének aktiválásán és gátlásán keresztül befolyásolja a redox-homeostasist (Han, 2004). Az E-vitamin által modulált géneket 5 csoportba sorolják.
20
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS Az egyes csoportba az α-tokoferol-transzferprotein (α-TTP) és a citokróm P450 (CYP3A), γglutamil-cisztein-szintetáz, glutation-S-transzferáz gének tartoznak. Ezeknek a géneknek az aktivitását az E-vitamin aktiválja (Friling, 1990; Paolini, 2001). A második csoportba a CD36, SR-B1 és az SR-AI/II gének sorolhatók, melyek kapcsolatban állnak a lipidfelvétellel és az arteriosclerosissal. Az E-vitamin ezeknek a géneknek a működését gátolja. A harmadik csoport tagjai a tropomyozin, kollagén (C-1), MMP-1, MMP-19 és a kötőszövet növekedési faktor (CTGF) gének, amelyek az extracelluláris fehérjék expressziójának szabályozásáért felelősek. A tropomyozin és CTGF géneket aktiválja, míg a csoportba tartozó többi gén működését gátolja az E-vitamin. A negyedik csoport az E-szelektin, ICAM-1, integrinek, glikoprotein IIb, II-2, IL-4 és IL-β szintéziséért felelős géneket tartalmazza. Ezek a gének kapcsolatban állnak a gyulladásos folyamatokkal, a sejtadhézióval és a trombocita-aggregációval. A II-2 gén aktiválását, a többi gén gátlását írták le. Az ötödik csoport génjei kódolják azokat a fehérjéket, amelyek a sejtszignál-funkciókért és a sejt életfolyamatainak szabályozásáért felelősek. Ide tartoznak a PPAR-γ, a ciklin-D1, ciklin E, Bcl2-L1, p27 és CD95 (Apo-1/Fas ligand) génjei (Fuhrer, 2001). Az E-vitamin a PPAR-γ-gén működést aktiválja hasonlóan a Bcl2-Ll-hoz. A többi esetben gátlás történik. A p27, Bcl2, α-TTP, CYP3A, tropomiozin, II-2, PPAR-γ és a CTGF upregulációjáért feltehetően egy vagy több tokoferol felelős. A tokoferolhatás mediátorainak heterogenitása egy receptor vagy koreceptor létét feltételezi. Ezen a területen folynak jelenleg a kutatások (Azzi 2004). Emlős sejtekben kimutatható az α-tokoferilfoszfát, melynek prekurzora az α-tokoferol. Ez a vegyület a májban és a zsírszövetben halmozódik fel. Az α-tokoferilfoszfát kb. 150 pg/g koncentrációban található meg a májban. Feltételezik, hogy a tirozin-kináz katalizálja az átalakítást. A foszfatáz esetében a tirozinfoszfát-foszfatáz aktivitás jöhet szóba (Azzi 2002).
21
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 5. ábra: Az E-vitamin hatásmechanizmusa
Az 5. ábra az E-vitamin hatásmechanizmusát mutatja be. Az E-vitamin posttranszlációs szintnél gátolja a foszfolipáz A2 izoenzimet, így hatására nem képződik arachidonsav a foszfolipidekből. Gátolja a COX1 konstitutív és COX2 induktív enzimeket megakadályozva így a ciklikus endoperoxidok képződését. Az E-vitamin gátolja az 5-lipoxigenáz enzim hatására kialakuló hidroperoxieikozatetraénsavak (HPETE) és leukotriének képződését is (Pace-Asciak 1989). Az E-vitamin képes a prosztaglandin bioszintézis által kiváltott szignál transzdukciót befolyásolni. Az E-vitamin gátolja a PPAR-γ-receptornak a jelátvitelét az AP1, STAT1 és NF-κB transzkripciós faktorokra. A plazma E-vitamin szintjét Vandewoude és mtsai 1-es és 2-es típusú 22
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS cukorbetegekben vizsgálták. Egészséges egyének vitaminkoncentrációjával összehasonlítva nem találtak különbséget. Ugyanakkor szignifikáns különbséget találtak hyperlipoproteinaemiában mind a betegkontroll, mind a cukorbeteg egyénekben. Az E-vitamin/koleszterin arány nem különbözött a két csoportban. Megállapították, hogy a plazma E-vitamin szint összefügg a plazma lipidszintekkel, különösen az összkoleszterin és az LDL-koleszterin koncentrációval (Vandewoude MG 1987). Mivel az E-vitamin főleg a lipoproteinek belsejében szállítódik, plazmakoncentrációjának változása tükörképe a lipoprotein-szint változásának. Watanabe és munkatársai az E-vitamin-anyagcsere és a trombociták kapcsolatát vizsgálták. Negatív összefüggést találtak az alvadási faktorok és a thrombocyták E-vitamin-koncentrációja között. Arra következtettek, hogy az alacsonyabb E-vitamin-szint a cukorbetegek trombocitáiban közvetve hozzájárulhat a megnövekedett trombóziskészségükhöz (Watanabe, 1984). Karpen és mtsai is azt találták, hogy a plazma E-vitamin-koncentrációk egészséges és jól beállított cukorbeteg egyénekben nem különböznek (Karpen, 1985). A C-vitamin a sejtmagba jutva „redox-úton” szabályozza a DNS javítását. Az aszkorbinsav direkt DNS-oxidáló hatása függ in vivo koncentrációjától. A DNS-károsodást követően új javító enzimek de novo szintézise indul el, amely a Fos- és Jun-fehérjék komplexének kialakulásával hozható kapcsolatba. Az aszkorbinsav dózisfüggően aktiválja az AP-1-et és nem dózisfüggően az NF-κB–t. A C-vitamin megerősíti a redox factor-1 (Ref-1) szabályozott AP-1 protein DNS-hez történő kötődését. Fokozza a DNS repair-gének transzaktivációját. ROS hatására beindul a NER javítómechanizmus (Paolini, 1999). A kinázok redox-aktiválásában az A-vitamin a cRaf Zn-ujj-doménhez képes kötődni (DincovaKostova, 2005). A retinsav receptorok (RARs) szabályozzák a génexpressziót direkt módon és az AP-1 protein funkciójának gátlásán keresztül is. Az A-vitamin, illetve természetes és szintetikus származékai indukálják a rákos sejtek apoptózisát. A TRAIL-mediált (tumor necrosis factorrelated apoptosis-inducing ligand) apoptozis kapcsolódik az A-vitamin hatásmechanizmusához (Zhang, 2002).A mitokondriumban találhatók a koenzim Q és a liponsav. A liponsav, metabolikus antioxidáns a piruvát-dehidrogenáz enzimrendszer kofaktora. A 8-szénatomos zsírsav esszenciális jelentősége a mitokondriális piruvátdehidrogenáz-multienzim-komplex működéséhez. A liponsav COOH- csoportjával kapcsolódik a dihidrolipoil-transzacetiláz enzim
23
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS lizil- oldalláncának ε-NH2 csoportjához. Koenzim tulajdonságát a reverzibilis diszulfidszulfhidril átalakulás biztosítja. Alfa-liponsav megvéd a Zn hiány hatásaitól. Indukálja az NF-κB foszforiláció korai lépéseit és az AP-1 [c-Jun-N-terminal kinase (JNK) és a p38 foszforiláció] kaszkádot, valamint beindítja az NF-κB és a AP-1 DNS kötő aktivítását. (Mackensie, 2006). A liponsav scavengeli a ˙OH, a HOClֿ,a¹Oֿ˙2 és peroxilgyököket, valamint kelátot képez olyan átmeneti fémekkel, mint a Cu, a Zn és a Mn. A dihidroliponsav a Oֿ˙2 , a ˙OHֿ, a HOClֿ és a perferril gyököket scavengeli. Prooxidáns tulajdonsága a Fe³+ redukcióján keresztül érvényesül. Sem a liponsav, sem redukált származéka nem scavengeli a H2O2-ot. A liponsav és redukált formája egyaránt kiváló metabolikus antioxidáns. Részt vesznek a szervezet antioxidáns redox-ciklusában. Redukált formája hatásosabb antioxidáns.(Blázovics, Fehér 2001). Gyógyszerként mellékhatását még nem tapasztalták. Orálisan könnyen felszívódik. Gyógyászati alkalmazása indokolt polyneuropathiás diabetesben, szürkehályogban, glaukomában és Amanita phalloides mérgezésben. 2.3. Fémionok jelentősége a redox-homeostasisban A fémionoknak fontos szerepük van az oxidatív stressz kialakulásában. A táplálkozással, élelmiszer kiegészítőkkel, szervezetünkbe számos esszenciális és toxikus fémion juthat, melyeknek kölcsönhatásairól keveset tudunk. A környezetszennyezés (természeti katasztrófák, veszélyes hulladékanyagok nem megfelelő tárolása) következtében megnő a toxikus fémionok koncentrációja a szervezetben. A nehézfémek akkumulációja gátolja az enzimaktivitásokat. Nagy koncentrációban a nehézfémek befolyásolják a proteinek szintézisét és a génexpressziót (Szentmihályi, 2004). A máj jelentős szerepet játszik a nehézfém ionok detoxikálásában. Több mint 200 enzim alkotója a Zn, és fontos szerepe van a szerkezeti stabilitásukban. Részt vesz a szénhidrát-, lipid-, fehérje-, és nukleinsav anyagcserében. Zn-hiányos szervezetben emelkedett hidrogén-peroxid (H2O2) szint és alacsony glutation-koncentráció található. A Zn és Cu hiánya következtében nő a szérumkoleszterin- és triglicerid-koncentráció. Mindkét nyomelem befolyásolja a szervezet redox-homeosztázisát. A Zn és a Cu szintje szoros kapcsolatban van a hematológiai paraméterekkel (Szentmihályi, 2003). A Zn, Cu, és Mn képes modulálni a tumor szuppresszor p53-at, ezáltal befolyásolja az apoptózist. Az IL-6 szabályozza a metallothionein
24
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS expresszióját és a Zn akkumulációját. A Ni jelenlétében a glutation raktárak kiürülnek. Az Fe3+ iont az alfa-liponsav redukálja megszüntetve prooxidáns tulajdonságát (Mackenzie, 2006). A vastoxicitás a Fe(II)-hoz kapcsolható, mert a Fenton-típusú reakcióban ˙OH szabad gyök képződik. Haemochromatosisban a megemelkedett vaskoncentráció májfibrosist okozhat. A vastoxicitás növekvő oxidatív stresszt okoz, és katalizátora az aktív oxigén gyököknek, melyek oxidatív károsodást okoznak a lipidek, proteinek és nukleinsavak szerkezetében. A porphyria cutanea tardát a májban magas vasszinttartalom jellemzi. Már a betegség korai stádiumában jelentkezik a májfibrosis és cirrhosis. A máj károsodását a vaslerakódás és az alkoholfogyasztása nagyban elősegíti. A heterozigóta C282Y pontmutációnak fontos szerepe van a vas májban történő raktározásában, az alkoholos májbetegség, és a nem alkoholos steatohepatitis kialakulásában (Bonkovsky, 2003). A d-mező elemek növelik a lipidperoxidációt. Aszkorbinsav kezelés csökkenti a szöveti oxidációs folyamatokat. (Szentmihályi K, 2003). 2.4. Oxidatív stressz és a porphyria cutanea tarda Porphyria cutanea tardában az uroporfirinogén oxidációja függ a szabad vas katalizált hidrogénperoxid/hidroxilgyök átalakulástól. A kataláz és a mannitol képes gátolni az uroporfirinogén oxidációja során keletkező hidrogénperoxidot és hidroxilgyököket. Ez a gátlás 30%-kal kisebb, mint a SOD gátló hatása hasonló oxidációs folyamatokban (Mukerji, 1990). Kísérletek során megfigyelték az uroporfirinogén részleges oxidációját H2O2 + Fe2+ és a levegő oxigénjének jelenlétében. A Fe2+ ion autooxidációja a levegő oxigénjének jelenlétében szuperoxid (O2-) gyököket generál, egy elektron befogadásával az oxigén molekulán. Fe2+ + O2 ↔Fe3+ + O-2 Az uroporfirinogén univalens oxidációja (hidrogén atom elvonással) szuperoxid anion jelenlétében láncreakciót indít el. UPH6 + 3O2 + Men → UP + 3H2O2 + Men+1 (Az UPH6 és Upa porfirin redukált és oxidált formája, a Me fémkation, jelen esetben az Fe2+). Ez az uroporfirinogén oxidációs mechanizmus függhet a szuperoxiddizmutáz gátlásától. O-2 + H+ → HO˙2 + O-2 + H+ →
25
HO2˙ H2O2 + O2
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS A H2O2 a folyamat során reakcióba lép a Fe2+ ionnal és Fenton-reakcióval hidroxil gyököket (.OH) generál. Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + ˙OH + OH¯ A hidroxil-gyök oxidálja az uroporfirinogént hidrogén atom elvonással. A szuperoxid anion láncreakciót indíthat el. A vvs-k a szervezet többi sejtjéhez képest magas oxigénkoncentrációnak vannak kitéve. A vvs-ket mind extra-, mind intracellulárisan gyökhatások érik. Extracellulárisan a makrofágok, granulociták által aktivált hidrogénperoxid és szuperoxid-gyök hat a vvs-re. A vvs-k hemoglobintartalmuk miatt gazdagok vasban, ami a szabadgyök-reakciók egyik katalizátora. A vvs membránfehérjék szintén érzékenyek az oxidatív hatásra, a hemoglobin, pedig mint peroxidáz szerepel. Sejten belül az oxihemoglobin állandó jelenléte elősegíti a szuperoxidgyök-képződést. HbFe(II) + O2 → HbFe(III) O-2 →HbFe(III) + O2 Normális körülmények között egyensúly alakul ki a termelődött szuperoxid-gyök és a vvt antioxidáns védekező rendszere között. Feltételezik,
hogy
a
reaktív
intermedierek
hatással
vannak
egyes
haemorrheologiai
paraméterekre, így a vvs deformálódási képességére, aggregációjára és döntően ezeken keresztül a vérviszkozitásra is. 1980-ban Corry és munkatársai emberi vvs-ket oxidatív károsodás előidézésére tercier-butilhidroperoxiddal kezeltek és a membránzsírsavak peroxidációja következtében a membrán rigiditása jelentősen fokozódott. A sejt deformálhatósága csökkent (Baskurt, 1998). Fenilhidrazin-kezeléssel szintén fokozott lipidperoxidációt és a vvs-ek élettartamának csökkenését tudták kiváltani. Pfafferot és munkatársai a vvs-ket malondialdehiddel, a lipidperoxidáció végtermékével kezelték a membrán flexibilitásának csökkenését, sejtdehidrációt, intracelluláris viszkozitás-emelkedést, a sejt deformálhatóságának csökkenését és a vvs élettartamának megrövidülését figyelték meg (Helmut, 1985). Hirayama a vvs-ket szabadgyökképződést indukáló hipoxantin-xantinoxidáz rendszerben vizsgálva már egyperces expozíciót követően szintén a deformálódási képesség csökkenését detektálta. A hatás SOD vagy allopurinol előkezeléssel kivédhető volt (Hirayama, 2001).
26
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.5. Terápiás céllal alkalmazható antioxidánsok a porphyria cutanea tardában Számos betegségben a természetes antioxidáns védekezés csökkenését mutatták ki. A kutatók felvetették, hogy a természetes antioxidáns anyagok pótlásával esetleg az oxidatív károsodás csökkenthető, és ezzel a betegségek progressziója késleltethető (Maxwell, 1995). A porphyria cutanea tardában szenvedő betegekről készített tanulmányok kimutatták az antioxidáns státusz gyengülését (Sinclair, 1997; Adjarov, 2001; Rocchi, 1995) és a lipid peroxidációs folyamatok felgyorsulását (Rocchi, 1999). Jóllehet a hexachlorobenzol által indukált porphyriák sejtkultúráiról (Debets, 1980) és az állatokról készített tanulmányok az E-vitamin védő hatását bizonyították (Mazzetti, 2004), a porphyria cutanea tardás betegek E-vitamin kezeléséről ellentmondásos eredmények jelentek meg (Pinelli, 2002; Murty, 1969; Nair, 1972; Ayres, 1978; Watson, 1973). A szabad gyökök képződését az antioxidánsok megakadályozzák, vagy a képződött reaktivoxigén-intermediereket „befogva” (scavengerek) azok káros hatása ellen védelmet nyújtanak. A szabadgyök-képződés megakadályozása leginkább a lipidperoxidáció iniciálási és propagálási lépéseinek gátlásában nyilvánul meg. Az antioxidánsok egyszerre több mechanizmussal is kifejthetik hatásukat. 2.6. Májlézió porphyria cutanea tardában és az alkoholos májbetegség A sporadikus porphyria cutanea tarda kialakulásában az alkoholnak, mint indukáló tényezőnek fontos szerepe van. Az alkohol által okozott májbetegség kialakulásában az elfogyasztott alkohol mennyiségének jelentős szerepe van. Szoros korreláció figyelhető meg a dózis és a májbetegség kialakulása között (Waluga, 2003). Porphyria cutanea tardában szenvedő betegekben a krónikus alkoholfogyasztás eredményeként különböző súlyosságú májelváltozások jönnek létre, alkoholos zsírmáj, alkoholos hepatitis és alkoholos májcirrhosis (Pastor, 2005). Vannak adatok, amelyek megerősítik az alkohol szerepét a primer hepatocelluláris carcinoma kialakulásában (Fehér, 1987; Homann, 2005). Az alkohol okozta károsodásokkal szembe a nők jelentősen érzékenyebbek. A nők cirrhosis kockázata megközelítően háromszor nagyobb a férfiakénál (Hagymási, 2000). Csökken az antioxidáns molekulák mennyisége a krónikus alkoholisták szervezetében, valamint csökken a szervezet vitamintartaléka. Az alkohol metabolizmus legfontosabb helye, megközelítően 90%-ban a máj. A tüdőkön és a veséken keresztül 2-10%-ban direkt eliminációja történik és csak kis mennyiségben
27
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS metabolizálódik a gyomorban és a bélben (Lieber, 1991; Lieber, 1997). Az alkohol a májban három fő metabolikus úton alakul át acetaldehiddé: a citoszolban az alkohol-dehidrogenáz, a mikroszómában
az
indukálható
mikroszomális
etanoloxidáló
enzim
(MEOS)
és
a
peroxiszómában a kataláz hatására. A zsírsavak direkt észterezése (Laposta, 1986; Bora, 1996) nem specifikus metabolikus út, mely súlyos alkoholos mérgezésben, ill. idült alkoholizmusban egyaránt szerepet játszik. Az alkohol metabolizmusa során primer és szekunder szabadgyök-képződés figyelhető meg. (Horváth, 1992; Nordmann, 1996). Az alkohol-dehidrogenáz és a mitokondriális aldehid-dehidrogenáz izoenzimek polimorfizmusa felelős a citoszolban az alkohol egyénenként változó mértékű abszorpciójáért és eliminálásáért. Az acetaldehid mérgező metabolit, mely a mitokondriális aldehid-dehidrogenáz (ALDH) hatására alakul át acetáttá. (Lieber, 1997; Takeuchi, 2005). Az acetát kisebb részéből acetil-koenzim A jön létre, nagyobb része a véráramba kerül és a perifériás szövetekben ég el széndioxiddá és vízzé. Az alkoholista, porphyria cutanea tardában szenvedő betegben az acetaldehid proteinekkel képzett vegyülete is felelős az uroporfirinogen dekarboziláz enzim inaktiválásáért. Gátlódik a proteinszintézis, kiürül a glutation (GSH) és a lipidperoxidáció fokozódik (Lieber, 1997). A glutationszint csökkenése oxidatív károsodáshoz vezet. A mitokondriumban végbemenő oxidatív foszforiláció ROS képződéssel jár. Így felerősödik a máj oxidatív károsodása. Kismértékű alkoholfogyasztás nem indukálja a CYP2EI enzimet, viszont alkoholizmus hatására az izoenzim fokozottan szintetizálódik.A citokróm P450 izoenzime a CYP2EI részt vesz az alkoholok és az acetaldehid oxidációjában. A mikroszomális monooxigenáz etanoloxidáló enzim működéséhez NADPH kofaktort igényel. Az alkohol metabolizmusa során a sejtekben oxidatív károsodás megy végbe, felerősödik a lipid peroxidáció. A porphyria cutanea tardában szenvedő alkoholisták májának Kupffer-sejtjeiben megnövekedik a TNF aktivitás. Az alkohol oxidálását a peroxiszomában található kataláz H2O2 jelenlétében végzi el. Fiziológiás körülmények között az etanoloxidációban az alacsony H2O2-koncentráció miatt jelentéktelen a szerepe (Hagymási, 2001). Tehát, primer, illetve szekunder szabadgyök-termelés jön létre az alkohol metabolizmusa során. A citoszolban alkoholdehidrogenáz működése során keletkező nagy mennyiségű NADH a NADdependens xantin-dehidrogenáz működését gátolja, amely oxigén-dependens xantin-oxidázzá
28
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS alakul át. Szubsztrátként a hipoxantin helyett acetaldehidet is használhat az enzim, és miközben az acetaldehidet oxidálja O2˙¯ képződik. A NADH fokozza a zsírsavképződést (Yamanaka, 1996; Fehér, 1987). Alkoholizmusban növekszik a máj lipogenezise (Lieber, 1997). A laktátkoncentráció emelkedése a májban hyperlactacidaemiához vezet, ami acidózist vált ki, és a vesék húgysav-kiválasztását rontja. A xantin-oxidáz működése hozzájárul a fokozott szabadgyök-termeléshez. A zsírsavak mitokondriális β-oxidációja gátlódik, mivel a mitokondriumok a citrátkör működéséhez szükséges H-ekvivalenst nem a zsírsavak oxidációjából, hanem közvetlenül az alkoholból nyerik. A megnövekedett perifériás zsírsavmobilizáció, fokozza a hepatikus lipidfelvételt és a steatosist. (Lieber, 1997; 1975). Gyengül a szervezet antioxidáns védelme. A természetes antioxidánsok hiánya oxidált lipidek kialakulásához vezet, és károsodnak a membránstruktúrák (Fehér, 1987; Horváth, 1992; Lugasi, 1997, 1999; Blázovics, 2004). Krónikus alkoholizmusban felgyorsul a hepatocyták vasfelvétele. A vas központi szerepet játszik a lipidperoxidáció iniciálásában és propagációjában (Fehér, 1987). Ennek következtében fontos szerepe van a szöveti nekrózis kialakulásában. A vas felszabadulásának három lehetséges útját vizsgálták a májsejtekben; a ferritin út, az intracelluláris transzferrin-receptor komplex út és a hemoxigenáz út. A redox aktív szabad vas a ferritinből szabadul fel ischaemiás körülmények között, míg az etanol gyorsítja a vas felszabadulását az endoszomális transzferrin-receptor komplexből (Sergent, 2005). Jacobs és munkatársai megfigyelték, hogy a liposzomák bekebelezik az uroporfirinogént és a Fe3+. A vas uroporfirinogén oxidációt iniciál szabad gyök láncreakcióval, amikor elsődlegesen szuperoxid-gyökök és kisebb mennyiségben hidroxil-gyökök keletkeznek. Az Fe3+-nak Fe2+-ra való redukcióját az uroporfirinogén elektron átadása biztosítja. Az Fe2+ reoxidációja a lipid peroxidációból keletkező aktív oxigén generálásának mechanizmusával megy végbe. A máj mikroszomában a Fe3+ a NADH- P450 reduktáz közreműködésével Fe2+-vé alakul és aktív oxigén generálódik (Jacobs, 1989; Sinclair, 1987). 2.7. Diabetes mellitus és a porphyria cutanea tarda együttes előfordulása A diabetes mellitus szindróma komplex anyagcserezavar, melyben elsődleges a szénhidrátreguláció felborulása, de a zsír-, fehérje- és nukleinsav-anyagcsere zavarai is jelen vannak.
29
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS Irodalmi adatok és saját tapasztalataink alapján is a sporadikus porphyria cutanea tarda és a diabetes mellitus gyakran fordulnak elő együtt. Oka minden valószínűség szerint az, hogy mindkettő aethiologiájában jelentős szerepet játszik az oxidatív stressz. Az oxidatív stressznek központi szerepe van a diabéteszes szövetkárosodásban, hozzájárul az aktív oxigén gyökök szintjének emelkedéséhez, nő a nitrogén-oxid szintje a mitokondriumokban, és csökken a glutationperoxidáz aktivitása és a mangán tartalmú szuperoxid dizmutáz ménnyisége (Mastrocola, 2005). A β-sejteket bevonó citotoxikus antitestek az idevonzott neutrofilek „respiratory burst”-jét aktiválják. A felszabaduló ROI-ek képesek a SOD részleges gátlására a β-sejtekben. A reaktív oxigén intermedierek hatásukat kifejthetik az LDL oxidálása, az endothel károsítása, a vazomotilitás, valamint a véralvadás befolyásolása révén is. Az oxidált LDL-nek a “foam” sejtek kialakulásában tulajdonítanak szerepet, a szuperoxid anion/nitrogénoxid arány eltolódása az endothel-függő vazomotilitás zavarát okozhatja, valamint a reaktív oxigén intermedierek az érfalat közvetlenül károsíthatják. A glükóz intoleranciában és az oxidatív stresszben magas tioredoxinszintet mértek. Egyes kutatók (Miyamoto, 2005) a tioredoxint az oxidatív stressz markerének nevezik és felhasználják a kardiovascularis betegségek monitorozására. A fehérjék nem-enzimatikus glikozilációjának - más néven glikációjának - mértéke a glükóz koncentrációjától függ, és a jelenség a fehérjék strukturájának és funkciojának megváltozásához vezet. A hemoglobin fiziológiás glükózkoncentráció jelenlétében is glikálódik, de hiperglikémiás egyénekben jóval nagyobb mértékben. A plazmában található fehérjék, így az albumin is, glikálódnak, de ez egy rövidebb időszak glükóz fluktuációját tükrözi. A glikáció a glükóz autooxidációját fokozza, melyet reaktív oxigén intermedierek termelődése kísér, így antioxidáns anyagokkal befolyásolható lehet. Az érfal strukturális proteinjeinek glikációját olyan reakciók követik, melyek a fehérjék visszafordíthatatlan megváltozásához vezetnek. Ezeket a nemenzimatikus glikozilációs folyamatokat feltehetően a fehérjék oxidatív modifikációja kíséri. Ezt a folyamatot glikoxidációnak is szokták nevezni (Baynes, 1991). Glikoxidált anyagok az öregedés alatt normálisan is keletkeznek, de cukorbetegségben ez a folyamat felgyorsul, mely egyik oka lehet az erek fokozott öregedésének. A cukorbetegség - biokémiai szempontból - a felgyorsult kollagén öregedést is jelenti. A glikoxidáció károsíthatja a sejtek DNS-ét, így szerepet játszhat a diabeteses szövődmények és a β-sejt destrukció kialakulásában. Az utóbbi évek kutatásainak középpontjába került a PPAR-ligand aktiválta magreceptor rendszer élettani és kórfolyamatokban
30
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS játszott szerepe. A PPAR-receptorok a ligand aktiválta magreceptorok családjába tartozó transzkripciós faktorok (Auwerx, 1999; Ziouzenkova, 2002) A PPAR-γ aktivítás javítja az inzulinreceptor jelátvitelét, fokozza a GLUT-4 glukóztranszportert és gátolja a TNF-α expresszióját (Sewter, 2002). A PPAR-γ fokozza a trigliceridek zsírszövetben való raktározását és csökkenti a szabad zsírsavak inzulinrezisztenciát generáló hatását. Az inzulinérzékenység
csökkenését
nagyban
befolyásolja
a
zsírszövet
mennyiségének
megnövekedése. A PPAR-gammát a szigetsejtekben írták le. Expresszióját az intracelluláris glükózszint emelkedése csökkenti. Ez a nukleáris receptor alacsony glükozkoncentrációban a zsírsavanyagcsere fokozódását segíti elő (Flamez, 2002). A PPAR-rendszernek sokoldalú hatása van. Hatást gyakorol az érfalban a monociták, macrofágok, endotélsejtekre. Csökkenti az adhéziós molekulák, enzimek (COX-2, szekretált foszfolipáz A2, metalloproteázok), véralvadási tényezők (fibrinogén, PAI-1) és más fehérjék (CRP) termelődését (Sever, 2003). A PPAR-rendszer kontrolálja a programozott sejthalál folyamatait (Sever, 2003). Megfigyelték a PPAR-γ-agonisták vérnyomáscsökkentő hatását diabeteszes állatmodelleken és humán klinikai vizsgálatokban (Barroso, 1999). A cukorbetegség és az oxidatív stressz kapcsolatát vizsgáló megfigyelések többnyire jelentős hiperglikémiával, és a relatív inzulinhiányt szükségszerűen kísérő valamennyi metabolikus változással rendelkező újonnan diagnosztizált vagy rosszul kontrollált cukorbetegek esetében fordult elő (Baynes, 1991; Wolff, 1993; Somogyi, 1994; Somogyi, 2001). 2.8. Haemorrheologiai vizsgálatok porphyria cutanea tardában A rheologia (áramlástan) a különböző anyagok erőhatásra bekövetkező deformálódásával, áramlási tulajdonságaival foglalkozó tudomány. A modern haemorrheologia kezdete Fahreus nevéhez fűződik, aki 1930-ban definiálta a vörösvérsejtek áramlási jellegzetességeit szűk csövekben (Dormandy, 1983). Hazánkban a haemorrheologiai kutatások az 1970-es évek végén kezdődtek Pécsett, ahol kifejlesztették a máig is használt kapilláris viszkozimétert (HEVIMET-40, Hemorex) (Chien, 1987, Kollár, 2002). A teljesvér - mint szuszpenzió – viszkozitását több tényező együttesen befolyásolja: − haematocrit (a szuszpendált részecskék mennyisége) − plazmaviszkozitás (a szuszpenziós folyadék tulajdonsága) − vvs-aggregáció (a szuszpendált részecskék mérete)
31
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS − vérsejt-deformabilitás (a szuszpendált részecskék saját belső súrlódása) Normál értéke 37C0-on 4,5-5,5 mPas között van. Plazmaviszkozitás: A plazma viszkozitását a víz és a benne oldott nagy molekulájú anyagok határozzák meg. Ezek közül a fibrinogén játssza a döntő szerepet. Ezenkívül egyes globulin- és a lipidfrakcióknak, elsősorban a triglicerideknek, van meghatározó szerepe. Normál értékét – newtoni folyadékról lévén szó – 37C0-on 1,10 -1,4 mPas között adják meg (Mátrai, 1979). -Vérsejt-deformabilitás: A vérsejtek fontos tulajdonsága, hogy nem merev, statikus képződmények, hanem alakjukat az áramlási körülményektől függően változtatni képesek. A vvsk deformabilitását több tényező együttesen határozza meg: a vvs-belső anyagának viszkozitása, a vvs-membrán viszkozitása, a vvs-k felület/térfogat aránya, a vvs-k morfológiai sajátosságai. A deformálódási képesség az egyes vvs-k individuális tulajdonsága, így ez akkor juthat érvényre, ha
a
keringés
körülményeiből
adódóan
azok
már
nem
aggregálódott
formában
áramlanak.(Gaehtgens, 1980). A haemorrheologiai tulajdonságok megváltozása degeneratív elváltozásokhoz vezethet az erek falában. A kollagén redukálódása következtében az endothel rugalmassága csökken és evvel párhuzamosan a kapilláris permeabilitás is (Kiesewetter, 1994, Lip, 2002). A fibrinogén koncentráció
emelkedése
egyik
oka
a
plazmaviszkozitás
növekedésének.
Az
vvs
tulajdonságainak megismeréséhez fontos a vérviszkozitás és vvs filtráció megmérése. A vvs rigiditás hátrányosan befolyásolja a máj mikrovaszkuláris keringését hozzájárulva a máj diszfunkcióhoz (Rosenson, 1990; Habon, 2001; Késmárky, 2001; Tamer, 2002). Az oxidoredukciós folyamatok, a makrofágok, fehérvérsejtek, trombociták és vörösvérsejtek belsejében és felszínén mennek végbe. A lipidperoxidáció következtében nő a reaktív oxigén intermedierek mennyisége és ennek következtében protein oxidáció és DNS károsodás jön létre. A DNS törésekor aktiválódik a poli-ADP-ribóz polimeráz (PARP), amely enzim fontos szerepet tölt be a NAD+ katabolizmusban és a ROI indukálta sejthalálban (Tóth, 2000).
32
3. CÉLKITŰZÉSEK 3. CÉLKITŰZÉSEK 1. Kutatásaink egyrészt arra irányultak, hogy megfelelő módszereket alkalmazzunk PCT-ban a szabadgyökös károsodások korrekt meghatározására, illetve feltárjuk azokat a kapcsolatokat, amelyek szoros korrelációt mutatnak az egyes klinika-kémiai, haemorrheologiai és az oxidatív károsodást mérő paraméterek között. 2. Feltárjuk a vasanyagcsere zavarával járó esetleges változásokat a fémionanyagcserében. Meghatározzuk a fémionkoncentráció és redox-homeostasis közötti szoros összefüggéseket. 3. Az alábbi kérdésekre kerestük a választ: -A porphyria cutanea tarda és társbetegségek – alkoholfogyasztás, 2-es típusú diabetes mellitus – együttes fennállása esetén hogyan változik a porphyria cutanea tardára jellemző redox-homeostasis, és ez hogyan alakul megfelelő kezelés ill. alkoholtilalom hatására? -Hogyan alakulnak a haemorrheologiai viszonyok porphyria cutanea tardában és a társbetegségek együttes fennállása esetén? 4. Mivel a sporadikus porphyria cutanea tarda egyik fontos kóroki tényezője a vasfelhalmozódás, célul tűztük ki annak vizsgálatát, hogy a vas milyen mértékben befolyásolja a szervezet redoxhomeostasisát? 5. A vasterhelés alapján vetődik fel az a kérdés, hogy a szervezet redox-homeostasisában szereplő egyéb fémionok, mint a réz, mangán, cink koncentrációviszonyai hogyan alakulnak a betegség lefolyása során. Változik-e a kén, foszfor és szelén koncentrációja, s ha igen, milyen kapcsolatban van a rheologiai paraméterekkel? 6. Milyen mértékben változik az enzimatikus (SOD, GSHPx) antioxidáns védekezés porphyria cutanea tardában? 7. Irodalmi ismeretek alapján feltételeztük, hogy antioxidáns kezelések kedvező hatást gyakorolnak a betegség szekunder prevenciója során. E megfontolásból rövid időtartamú Evitamin és alfa-liponsav-kezeléseket alkalmaztunk phlebotomizált PCT-s betegekben. Arra voltunk kíváncsiak, hogy a kezelések milyen kedvező hatást váltanak ki a betegekben, illetve jelentkezik-e valamilyen nem kívánatos mellékhatás. A kétféle kezelés közül melyik alkalmasabb a betegek életminőségének javítására, melyik készítményt célszerű a továbbiakban, előnyben részesíteni a kiegészítő terápiában. 8. Hogyan változik a fémes és nem-fémes elemek koncentrációja alfa-liponsav kezelés hatására, s a változás szignifikáns-e?
33
3. CÉLKITŰZÉSEK 9. Hogyan változik a fémionkoncentráció E-vitamin kezelésre a betegcsoportokban a betegség súlyossága függvényében?
34
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1. Anyagok Sigma (USA): 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) ,mikroperoxidáz, 5-amino-2,3-dihidro1,4-ftalazinedion (luminol) Sigma (USA, LOGAN, UTAH) Porfirin Products Inc: „Porfirin Acids Marker Kit", mely kilenckomponensű standard, és uro-1-, uro-3-, hepta-, hexa-, penta-, copro-1, copro-3, mezo-IX, protoporfirint tartalmaz . Merck (Darmstadt) cég: ammóniumacetát. Diagnosticum, Budapest: epesav, húgysav, CRP kitek. Boehringer Mannheim: Kreatinin kit Randox: IgG, IgA, IgM, LDL-koleszterin, ferritin, transferrin, kolineszteráz, hemoglobin A1C (HbA1C), antistreptolysin O (ASO), C-reaktiv fehérje (CRP) kitek. Fábió: össz bilirubin, direkt bilirubin, glükóz, karbamid, koleszterin, triglicerid (TG), HDL-koleszterin, aszpartátaminotranszferáz (AST), alaninaminotranszferáz (ALT), gammaglutamiltranszferáz GGT), alkalikus foszfatáz, laktátdehidrogenáz (LDH), amiláz, vas kit. Medi-lab: összfehérje kit HUMÁN oltóanyag-termelő és gyógyszergyártó Rt. (Magyarország) Albumin kit. Minden más a.t. reagenst a Reanaltól vásároltuk. 4.2. Betegek Vizsgálatainkhoz a betegeket a MÁV Kórház és Központi Rendelőintézet, Országos Porphyria Központ Ambulancia Részlegén gondozottakból random szerűen választottam ki 45 PCT-ban szenvedő beteget (40 férfibeteg és 5 nőbeteg). Mind a 45 beteg sporadikus PCT-ban szenvedett. Minden résztvevő írásbeli vagy szóbeli tájékoztatást kapott a vizsgálat természetéről, mely után beleegyező nyilatkozatot írt alá. A vizsgálatokba nem vontunk be olyan betegeket, akiknél súlyos fokú szívelégtelenség, hematológiai, vagy rosszindulatú daganatos megbetegedés állt fenn, vagy a vizsgálat idején illetve az azt megelőző 4 hétben bármilyen heveny betegségük zajlott. A vizsgált nők átlag életkora 50 év felett volt. Fogamzásgátlót nem szedtek és postmenopauzális hormonpótlásban sem részesültek. A betegeket folyamatosan követtük. A betegszám nem változott, de összességében több mint 300 esetben történt vizsgálat. Egyes betegek több kísérleticsoportban is részt vettek. 35
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK A betegeket három csoportba soroltuk: csak PCT-ban szenvedő betegek (n=14) átlag életkor (59,42±10,23), alkoholfüggő PCT betegek (n=11) átlag életkor (55,69±6,21) és 2-es típusú diabetes mellitusban szenvedő és alkoholfüggő PCT betegek (n=9) átlag életkor (63,45±16,73). A klinikai kép és a laboratóriumi vizsgálatok alapján is képeztünk betegcsoportokat: PCT-A csoport; Klinikailag aktív állapot, jelentősen fokozott vizeleturoporfirin-űrítés, normális szérumvas és magas szérumferritin (n=6), átlag életkor (55,83±8,42). PCT-B csoport; Klinikailag inaktív állapot, mérsékelten fokozott vizeleturoporfirin-űrítés, normális szérumvas és magas szérumferritin (n=8), átlag életkor (59,12±7,10). PCT-C csoport; Klinikailag aktív állapot, magas vizeleturoporfirin, magas szérumvas és magas szérumferritin (n=6), átlag életkor (59,00±7,68). PCT-H1 csoport: Klinikailag aktív állapottal jellemző PCT férfibetegek, haemochromatosisra jellemző génpontmutáció, magas vizeleturoporfirin-űrítéssel (n=20) átlag életkor (52,80±6,21); PCT-H2 csoport: Klinikailag aktív állapottal jellemző PCT nőbetegek, haemochromatosisra jellemző génpontmutáció, magas vizeleturoporfirin-űrítéssel (n=5) átlag életkor (50,61±8,30); A viszonylag alacsony betegszámra való tekintettel voltak betegek akik mindkét felosztás egyegy csoportjában szerepeltek. A kutatások etikai engedélyének száma IKEB/ 5/2003, IKEB/33/2003. A vizsgálatok elvégzésekor figyelembe vettük az 1975.-ös 1983-ban módosított Helsinki Deklarációt. -Az alkoholfüggő PCT-s betegeket a szérumaszpartát-aminotranszferáz, alanin-aminotranszferáz, gamma-glutamiltranszferáz enzimek és triglicerid-koncentráció alapján különítettük el. Alkoholfüggő betegekre jellemző, hogy a szérum-aszpartát-aminotranszferáz érték nagyobb a szérum alanin-aminotranszferázénál. Alkoholfüggőknek tekintettük, akik minimum 50-60 gramm tiszta alkoholt (ez 3-5 dl bornak vagy 1,5 dl töményszeszesitalnak, vagy 12 dl sörnek felel meg) ittak meg naponta. Ez a mennyiség évek során májkárosodást okoz. A laboratóriumi leletekből kiemelendő a magas GGT és AST érték és az alkoholfüggő betegségétől függően emelkedik a süllyedés és a fehérvérsejtszám, illetve csökken a vörösvértestek és a vérlemezkék száma. -A 2-es típusú diabetes mellitus diagnózisa a WHO diagnosztikai kritériumainak felelt meg. Ennek alapján volt diabetes mellitus, ha az éhomi vércukorszint értéke vénás plazmában, enzimatikus módszerrel meghatározva eléri vagy meghaladja a 7,0 mmol/l értéket, és az étkezés
36
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK utáni bármely időpontban mért (random) vércukorszint eléri vagy meghaladja a 11,1 mmol/l értéket. -A kontroll-csoportokat önként jelentkezők alkották. A kontroll-csoportba nem vontunk be diabetes mellitusban, veseműködési zavarban, daganatos megbetegedésben, lipidanyagcserezavarban szenvedő egyéneket. 4.3. Módszerek: A meghatározásokat Olympus AU-600 (gyártó cég: Olympus) és MODULAR (gyártó: Hitachi, forgalmazó: Roche) automatákkal végeztük el. 4.3.1. Klinikai laboratóriumi paraméterek vizsgálata Szérumbilirubin A szérum össz bilirubin-koncentrációt kolorimetriás, dimetil-szulfoxid (DMSO) módszerrel határoztuk meg. Normálérték: 3,4-18,8 µmol/l. (FáBió, kat. sz.: 80403). Szérumbilirubin direkt Diazotált szulfanilsavval a direkt-bilirubin színes azo-bilirubin vegyületet alkot. A szinintenzítás arányos a szérum direkt-bilirubin-koncentrációjával. Normálérték: <5,1 µmol/l. (FáBió, kat. sz.: 80404). Aszpartát-aminotranszferáz Az AST nak minden szövetben két izoenzime fordul elő, egyikük a citoszolban, a másik a mitokondriumokban található. Az enzim legmagasabb aktivitásban a szívizomban, a májban és a vázizomban van jelen. A GOT katalitikus aktivitását a NADH 340 nm-en mért koncentráció csökkenésének sebessége alapján határozzuk meg. Normálérték: férfi: <38; nő: <32 µmol/l. (FáBió, kat.sz.: 80125). Alanin-aminotranszferáz Az ALT legnagyobb mennyiségben a májsejtek citoszoljában található.
37
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Az ALT katalitikus aktivitását a NADH 340 nm-en mért koncentráció csökkenésének sebessége alapján határoztuk meg. Normálérték: férfi: <41 U/l; nő: <31. (FáBió, kat.sz.: 80127). Alkalikus foszfatáz(ok) A szérum alkalikus foszfatáz aktivitása többféle izoenzimből és azok különböző izoformáiból adódik össze. A p-nitrofenol képződési sebessége arányos az alkalikus foszfatáz mennyiségével. Normálérték: férfi: <270; nő: <240 U/l. (FáBió, kat. sz.: 80014).
Gamma-glutamiltranszferáz A gamma-glutamiltranszferáz az egyik leglazábban kötött sejtmembrán fehérje. Normálérték: férfi: 8-61; nő: 5-36 U/l. (FáBió, kat. sz.: 80110).
Pszeudokolineszteráz A kolineszteráz élettani funkcióját eddig nem ismerjük. Klinikailag fontos funkciója, hogy elbont bizonyos izomrelaxánsokat (pl. szukcinil-bis-kolint). Normálérték: 5320-12920 U/l. (Randox, kat. sz.: DA-57211).
Laktát-dehidrogenáz
Az LDH minden sejt citoszoljában megtalálható. Az anyagcsere-állapottól függően vagy az anaerob glikolizis során képződő piruvátot redukálja laktáttá NADH segítségével, vagy az ellenkező folyamatot, ekkor a NAD+ szerepel hidrogénakceptorként. Normálérték: 240-480 U/l. (FáBió, kat.sz.: 80011).
Koleszterin Meghatározására leggyakrabban a koleszterin flavinenzimes oxidációját követő Trinder-reakciót használjuk. Normálérték: 3,2-5,2 mmol/l. (FáBió, kat.sz.: 80206). 38
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Trigliceridek
A szérumban található triglicerideket enzimatikusan lipázzal és észterázzal bontják. Normálérték: 0,6-1,7mmol/l. (FáBió, kat.sz.: 80119).
HDL-koleszterin A „direkt” HDL-koleszterin meghatározása Roche Diagnosticaban megadott elven történt. Normálérték: férfi:1,45-3,0; nő: 1,68-3,0 mmol/l. (Randox, kat.sz.: OSR6187).
LDL-koleszterin Az összkoleszterin és a VLDL + HDL-koleszterinkoncentrációk különbsége alapján kapjuk meg a LDL-koleszterin koncentrációját. Normálérték: <2,6 mmol/l. (Randox, kat. sz.: CH 2657).
Szérumvas A vas meghatározása fehérjementesítés nélküli módszerrel történt. Normálérték: férfi:10,6-28,3; nő:6,6-26 µmol/l. (FáBió, kat. sz.: 80018).
Transferrin A
transferrin
meghatározása
immuno-turbidimetriás
végpontos
módszerrel
történt.
Normálérték:2,1-3,8 g/l. (Randox, kat. sz.: OSR6152).
Ferritin Klinikai kémiai analizátorban immuno-turbidimetriás módszerrel mértük. Normálérték: férfi: 30,0-400,0ng/ml; nő:13,0-150,0ng/ml. (Randox, kat. sz.: FN 2467).
39
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Albumin Az albumin meghatározása kolorimetriásan brómkrezolzöld (BCG) segítségével történt. Normálérték: 35-52 g/l. (Roche, kat. sz.: 1875400).
Összfehérje Az összfehérje megméréséhez fotometriás színreakción alapuló, biuret módszert alkalmaztunk. Normálérték: 66-87g/l. (Randox, kat.sz.: OSR6132).
Húgysav A húgysav-koncentrációjának meghatározására enzimatikus, kolorimetriás tesztet alkalmaztunk (Urikáz/PAP). Normálérték: férfi:202-417; nő:143-339 µmol/l. (Diagnosticum, kat. sz.: 40921).
Karbamid A szérumkarbamid kétpontos, enzimatikus, UREÁZ-GLDH módszerel határoztuk meg.. Normálérték:1,7-8,3 mmol/l. (FáBió, kat. sz.: 50023).
Kreatinin A szérum kreatinin koncentrációt Jaffé kinetikus színteszt módszer alkalmazásával mértük. Normálérték: férfi: 62-106; nő: 44-80 µmol/l. (Randox, kat. sz.: OSR6173).
C-reaktiv fehérje (CRP) A mintát a pufferral és az antiszérummal összekeverjük, akkor a CRP specifikusan kötődik az anti-humán CRP antitestekhez oldhatatlan aggregátumokat alkotva. Normálérték: <10 mg/l. (Diagnosticum, kat. sz.: CRP/AUT-000).
40
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Glükóz A glükóz hexokináz (HK) és ATP jelenlétében foszforizálódik. Normálérték: 3,9-5,8 mmol/l. (FáBió, kat. sz.: 80008).
HbA1c A glikált hemoglobin, HbA1c az előző 6-8 hét átlagos vércukorszintjét tükrözi. Normálérték: <6%. (Randox, kat. sz.: HA 3443).
4.3.2. Haematologiai vizsgálatok A vörösvérsejtek száma 4,1-5,1 1012/l, összesített térfogata [hematocrit (normálérték: férfi:0,390,49; nő: 0,35-0,45] és a hemoglobin (normálérték: férfi:13,5-18,0 g/dl; nő:12,0-16,0 g/dl) koncentráció alapján általában három származtatott érték is megjelenik. A hematokrit/vvs-szám hányados az átlagos [(vörösvér)sejttérfogatot (MCV) normálérték: 80-96 fl] adja. A hemoglobin koncentráció és a hematokrit hányadosa szolgáltatja az átlagos celluláris hemoglobinkoncentrációt (MCHC), normálérték:32-36 g/dl. A hemoglobin-koncentráció és a sejtszám hányadosa az egy sejtre eső hemoglobin mennyiséget (MCH), normálérték: 26-34 pg/sejt.
4.3.3. Haemorrheologiai vizsgálatok A teljes vér- és plazmaviszkozitást a HEVIMET-40 kapillár viszkoziméterrel végeztük. A készülék gyártója a HEMOREX Gmk. A felülről megvilágított mérőhenger kapillárisába juttatott folyadékoszlop meniscusának helyzetváltozását 40 fotótranzisztor érzékeli és a számítógépes program a meniscus hely-idő függvényét, az ún. áramlásigörbét határozza meg. A newtoni folyadék (plazma) esetén az áramlásgörbe exponenciális függvényt ír le. A teljes vér, mint nem newtoni (Casson) folyadék esetén a folyási görbe az elméleti exponenciális görbétől eltér. Az eltérés mértékéből lehet meghatározni a viszkozitás változását a kapilláris csőben kialakuló sebességgrádiens függvényében. Teljes vér normálérték:<4,5 mPas, plazma normálérték: < 1,35 mPas.
41
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Vörösvérsejt deformabilitás A vörösvérsejt deformabilitását Carat FT-1 filtrométerrel határoztuk meg (gyártó. CARAT Gmk.). A mérőműszerben a vér egy 5 µm pórusméretű membránon áramlik keresztül. Az áramlást a készülékben 4 vizcm3 állandó hidrosztatikus nyomás tartja fent. A készülék alkalmas a lineárisan csökkenő áramlási sebességből az iniciális relatív filtrációs ráta (IRFR), a sejtáthaladási idő (RCTT), normálérték: <6 sec. alatt és a dugulási ráta (CR), normálérték: 1,5-3; meghatározására. Az IRFR az 5 μm-es pórusnagyságú szűrőn áthaladó vörösvértestek átlagos áthaladási idejét a póruson, a CR a nem deformabilis, rigid particulumok arányát mutatja meg (Dormandy, 1985). 4.3.4. Porfirin meghatározások Plazmaporfirin vizsgálata: A vér azonnali centrifugálásával (5000 rpm, 5 min.) elválasztjuk a plazmát. 300 μl plazmát 2700 μl foszfát pufferrel hígítunk (0,9% NaCl, 0,01M Na-foszfát, pH 7,4), majd 405 nm hullámhosszúságú fénnyel besugározva mérjük a minta fluorescens emisszióját 570-750 nm között Hitachi F-4010 spektrofluoriméterrel Poh- Fitzpatrick módszere szerint (1976). A 6. ábrán a porphyria cutanea tarda jellegzetes fluorescens emissziós csúcsát látjuk 620 nm-en.
42
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 6.ábra: Plazmaporfirin meghatározás Poh-Fitzpatrik módszere szerint F-4010 spektrofluoriméterrel
Vizeletporfirinek meghatározása: A vizsgálathoz a vizeletet sötét üvegben 24 órán át gyűjtöttük hűtőszekrényben tárolva. A gyűjtött vizelet teljes mennyiségéből Hitachi F-4010 spektrofluoriméterrel határoztuk meg a vizeletben ürülő uro-és koproporfirint Westerlund módszere szerint (1988). A vizelet előkészítése után felvettük a minta gerjesztési spektrumát 350-440 nm között. Az összporfirin mennyiségét az uroporfirin és koproporfirin gerjesztési spektrumainak izobesztikus hullámhosszán mértük. A két porfirin arányára a minta gerjesztési maximumának helyéből következtettünk. Normálérték: coproporfirin: 30-265 nmol/24h; uroporfirin: 1,0-45 nmol/24h. Székletporfirinek vizsgálata: Fontos a porphyria cutanea tarda betegek székletösszporfirin ürítésének a meghatározása. A székletösszporfirint Lockwood módszerével fagyasztott székletmintából végeztük. Referenciaérték: 230 nmol/g szárazanyag.
43
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Minta előkészítése: A székletet ürítés után azonnal mélyhűtőbe helyeztük. A betegnek ha ambulanter szállítani kellett a székletmintát, akkor azt hűtőtáskában elhelyezve szállították a laboratóriumba. Az összporfirin meghatározása során nyert kivonatot vizsgáltuk tovább magas nyomású folyadékkromatográf segítségével. A székletporfirin-kromatogramokat kiértékelve uro-1, -uro-3,-hepta, -hexa, -penta, copro-1, copro-3, mezo IX, és proto frakciókat találtunk. Az egyes betegekben a frakciók valamelyike hiányozhat, az uroporfirin és heptaporfirin mindegyik porphyria cutanea tarda-ban szenvedő betegben
megtalálható
volt,
ami
diagnosztikai
jelentőségű
Székletextraktumokban
a
székletporfirinek és izomerjeik mennyiségét magas nyomású folyadékkromatográf, Waters HPLC készülék segítségével határoztuk meg Lim és Peters módszere szerint. A gradiens HPLC rendszert a következő egységek alkotják: 2 db. Waters pumpa; Rheodyne 7125-081 titán injektor 20 µl mintaívvel és injektálási jeladóval; Alltech Direct Connect Cartridge oszloprendszer; Waters 470 fluoreszcenciás detektor. Oszlop: Hypersil ODS cartridge (hosszúság: 150 mm hosszú, átmérő:4,6 mm, szemcseméret:3 μm ). Készülék vezérlés és kiértékelés a Waters cég Millenium 32 programjával történik A széklet-extraktum porfirin összetételét és koncentrációját ismert koncentrációjú porfirin keverék standard alapján azonosítottuk. A mintát 18 mm-es résen át 360 nm-en gerjesztettük. A porfirinek 609 nm-en fluoreszkáló fényt bocsátanak ki, amit 30 mm-es rés szélességen vizsgáltunk. A 7. ábrán a székletporfirinek beazonosítására alkalmazott komplex standard porfirin kromatogramja látszik. A 8. ábrán a gerjesztési és emissziós spektrumokat mutatjuk be.
44
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
7. ábra: Standard porfirin kromatogram
45
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 8. ábra: Gerjesztési és emissziós spektrum
46
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.3.5. Redox homeostasist vizsgáló módszerek Plazma és vvs szabadgyök meghatározása luminometriás módszerrel A kemilumineszcencia jelensége alapján működő luminometriás módszerrel jól használható információkat kaphatunk a vizsgálandó készítményről. A H2O2/˙OH-luminol monoperoxidáz rendszer szolgáltatja a vizsgálat alapértékeként szolgáló standard fényintenzitást. A luminol stabil amino-ftálsavvá alakul, miközben a rendszer 425 nm-en monokromatikus fényt bocsát ki, amelynek intenzitása a keletkező szabad gyökök mennyiségével arányos. Amennyiben a minta scavenger tulajdonsággal rendelkezik, akkor a H2O2/˙OH-luminol monoperoxidáz rendszerhez képest alacsonyabb fényintenzitást mértünk. A vizsgálathoz 100 µl szérumot, 150 µl plazmát, 100 µl 10 g/l hemoglobin-tartalmú vvs-hemolizátumot használtunk. Az eredményeket relatíve light unit (RLU) egységben adtuk meg. H-donor aktivitás A minták hidrogén-donor aktivitását spektrofotometriás módszerrel az 1,1-difenil-2-pikrihidrazil (DPPH) gyök jelenlétében, Blois által leírt, Hatano által módosított módszerrel mértük. A DPPH stabil szabad gyök, amely 517 nm-en abszorbancia maximumot ad. Hidrogén-donor molekulák jelenlétében a DPPH hidrogént vesz fel az alábbi reakció szerint: (DPPH)˙ + HO−R−OH→(DPPH):H + HO−R.O˙ HO−R−O˙ + (DPPH)˙→(DPPH):H + O=R=O A DPPH molekula gyök-állapota megszűnik és a maximumhelyen mérhető abszorbancia a vizsgálandó vegyület hidrogéndonor aktivitásával arányosan csökken. A H-donor aktivitást a mintát nem tartalmazó kontrollhoz viszonyítva fejeztük ki a kontroll értékének százalékában. Gátlás (%)={Abs(kontroll)-Abs(minta)}/Abs(kontroll)x100 Redukálóképesség A redukálóképesség meghatározása a Fe(III)→Fe(II) átalakulás alapján történt fotometriás módszerrel Oyaizu (1986) szerint. Minél magasabb a reakcióelegy 700 nm-en mért abszorbanciája, annál erősebb a minta redukálóképessége, amit mmol/l aszkorbinsav ekvivalensben fejeztünk ki (mmol/leqAS).
47
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Szabad szulfhidril-csoport-koncentráció A szabad SH-csoportok (mmol/l) meghatározása Ellmann-reagens (5,5-ditiobis-2-nitrobenzoesav) jelenlétében, Sedlak és Lindsay által módosított Ellman-módszerrel történt. 440 nmen detektáltuk a keletkező 2-nitro-5-merkapto-benzoesavat (DTNB). Standardként redukált glutationt használtunk (Sedlak, 1986).
Glutation-reduktáz-aktivitás A szérum glutation-reduktáz-aktivitásának meghatározását BIOXYTECH® GR-340TM (OXIS International, Katalógus Nº21018D) reagens készlet segítségével végeztük, a gyártó útmutatója alapján. 340 nm-en mértük a glutation-reduktáz által katalizált NADPH→NADP+ átalakulását. A GSSG
redukciójának
mértékére
közvetve
a
NADPH-koncentráció
csökkenéséből
következtettünk. 1 U= 1 mmol GSSG redukciója/1 min/pH=7,6; 25ºC
Glutation-peroxidáz meghatározás A glutation-peroxidáz aktivitást humán eritrocitából határoztuk meg. Chin és munkatársai (1976) módszerének Sedlak és Lindsay (1986) által történt módosítása alapján. Az ismeretlen aktivitású enzimminta az 50 mM-os TRIS-HCl pufferben (pH 7,5) 0,2 mM redukált glutation kuménhidroperoxiddal (0,33mM) történő oxidációját katalizálja. A reakcióban megmaradó redukált glutation mennyiségét Ellman reagenssel 412 nm-en határozzuk meg. Egy egységnyi glutation peroxidáz 1 perc alatt 1 μmol redukált glutationt bont el egységnyi mennyiségű fehérjére vonatkoztatva.
4.3.6. Fémionok meghatározása A teljes vér makro- és mikroelemtartalmának meghatározásához atomemissziós spektrometriát alkalmaztunk. A mintákból 1,5-2,0 g-ot mértünk be teflonbombákba, majd a mintákat 5 cm³ cc. HNO3 és 2 cm³ 30%-os H2O2 elegyében roncsoltuk. A fémionok-koncentrációját ICP-OES (induktíven csatolt plazma optikai emissziós spektrométer) készülékkel határoztuk meg. A készülék típusa, Atom Scan 25 (Thermo Jarrell Ash) (Szentmihályi és mtsai módszerével 2000).
48
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.3.7. A- és E-vitamin meghatározása szérumban A szérumokban az A- és az E-vitamin mennyiségének meghatározása fordított fázisú HPLC-s technikával történt Rudy módszere alapján (1989). 0,2 ml szérum mintát 0,2 ml belső standard precipitáló reagens keverékkel összeráztuk, a lipid fázist n-hexánnal extraháltuk. Az oldószert etanolra cseréltük, vízzel a szükséges térfogatra hígítottuk, majd a GILSON MODULAR típusú HPLC-be injektáltuk. Az elválasztás szobahőmérsékleten, C18-as oszlopon történt, metanol/víz 90:10 v/v (A oldat) és etilacetát/izo-propanol 90:10 v/v (B oldat) segítségével lineáris gradiens használatával. Az áramlási sebesség 1,5 ml/perc volt. A detektálás Gilson UV-115 típusú detektorral λ = 300 nm-en történt. Az A- és E-vitamin koncentrációjának meghatározása az alkalmazott belső standard (retinol, retinil-palmitát, retinil-acetát és α-tokoferol keveréke) segítségével történt és a szérumban mért értéket µmol/l fejeztük ki. (Rudy, 1989) Tiobarbitursav-reaktív anyagok humán szérumban A meghatározás Pyles módszerével történt (1993). 0.15 ml szérumhoz 10μl 100 mM desferal oldatot adtunk, és 1,0 ml-re kiegészítettük 0.9%-os NaCl oldattal. A reakcióelegyhez 4 ml TBA reagenst adtunk és 95oC-on 80 percig inkubáltuk. A kialakult színt 4 ml extrakciós oldat (nbutanol:desztillált víz:piridin, 15:3:1) hozzáadása után a szerves fázisba ráztuk ki, majd centrifugálás után a felülúszó abszorbanciáját 510, 532 és 560 nm-en olvastuk le úgy, hogy a vak az extrakciós oldat volt. A mintában jelenlévő bilirubin és hemoglobin zavaró hatását a következő matematikai képlet alapján számolt abszorbanciaérték használatával küszöböltük ki: MDA532 = 1.22 x [(A532) - (0.56 x A510) + (0.44 x A560)] és a malondialdehid koncentrációját µmol/l fejeztük ki. A tiobarbitursav reaktív anyagok mennyiségét 1,1,3,3-tetraetoxipropánnal (Fluka) készült standardgörbe segítségével határoztuk meg (Pyles, 1993). 4.3.8. Alkoholkoncentráció meghatározása SIGMA enzimatikus
diagnosztikai kit segítségével határoztuk meg a humán szérumetanol
koncentrációját (Méthode n0 333-UV) Bucher és Redetzki módosított módszerével a gyártócég útmutatásai szerint. A módszer lényege, hogy az alkoholdehidrogenáz az alkoholt acetaldehiddé oxidálja és a NAD-ból NADH képződik. Az abszorbanciaváltozást 340 nm-en mértük (Bucher, 1951).
49
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.3.9. Pontmutációk kimutatása PCR módszerrel DNS extrakció: 5 ml citráttal vagy EDTA-val alvadásgátolt vérmintából „kisózásos” módszerrel történt (Miller, 1988). A kérdéses génszakaszt polimeráz láncreakcióval (PCR) amplifikálták az irodalomban ismertetett szintetikus oligonukleotidokkal (Feder, 1996). A C282Y mutációanalizis esetén a PCR terméket Rsa I, a H63D esetén Bcl I és a S65C esetén Hinf I restrikciós enzimmekkel emésztették (Martinez, 1988). A keletkezett DNS-fragmentumokat agaróz gélen választották el és UV-fény alatt etidium-bromid festéssel tették láthatóvá. Dr Andrikovics Hajnalka 4.3.10. Matematikai statisztikai módszerek Microsoft Excel, Statisztika 5.0 és Statisztika 6.0 programok szerint dolgoztuk fel a mérések adatait. A kiértékelés varianciaanalizissel történt. Alkalmaztuk a Student-féle egy és kétmintás tpróbát ANOVA statisztikai programcsomag felhasználásával. A kvantitatív vizsgálati eredményeket a mérések átlaga és szórása alapján p< 0,05 valószínűségi szinten értékeltük. Meghatároztuk a korrelációs koefficienseket. A minták normalitását a Shapiro-Wilk és a Histogram teszttel vizsgáltuk. Két független minta vizsgálatára, ha a normalitás vagy a varianciák homogenitása miatt a kétmintás t teszt nem volt használható, a Mann-Whitney U-tesztet használtuk. Két változó kapcsolatának szorosságát nem normális eloszlás esetén a Sperman-féle rangkorrelációval határoztuk meg.
50
5. EREDMÉNYEK 5. EREDMÉNYEK A MÁV Kórház és Központi Rendelőintézet, Országos Porphyria Központ részlegén évente 4060 porphyria cutanea tardában szenvedő beteg jelentkezik 4-5 alkalommal. Random választottam ki 45 beteget. 5.1. Klinikai kémiai vizsgálatok eredményeinek összehasonlítása különböző stádiumban lévő porphyria cutanea tardában szenvedő betegek esetében Vizsgálatainkban 45 porphyria cutanea tardában szenvedő beteg adatait dolgoztuk fel. Minden beteg
esetében
meghatároztuk
a
plazma,
vizelet
és
székletporfirinek
mennyiségét.
Vizsgálatainkkal a betegek mindegyikében igazoltuk a porphyria cutanea tarda betegséget. A PCT-ban szenvedő betegekben a plazmaporfirin-vizsgálatánál 620 nm-en jellegzetes emissziós csúcsot kapunk, így ez a diagnosztika részét képezi, a PCT fennállását erősíti meg. A vizeletporfirin meghatározásánál az alkoholfüggő és a 2-es típusú diabetes mellitus és alkoholfüggő PCT-ban szenvedő betegekben találtunk 82%-ban emelkedett uroporfirinszintet. A klinikailag inaktív, ill. aktív betegek között szignifikáns különbség volt az uroporfirin koncentrációban. A székletporfirinek és izomerjeik meghatározását végeztük.. A székletporfirin kromatogramokat kiértékelve uro-1, -uro-3,-hepta, -hexa, -penta, copro-1, copro-3, mezo IX, proto frakciókat találtunk. Az egyes betegekben a felsorolt frakciók közül némelyik hiányozott, de az uro- és heptacarboxyl-porfirin mindegyik porphyria cutanea tardában szenvedő betegben megtalálható volt. Ezeknek a frakcióknak a jelenléte diagnosztikus jelentőségű. A PCT betegek székletkromatogramját a 9. ábrán láthatjuk. Mivel a kromatográfiás-kép a betegség során jellemző változást nem mutat, minden beteg székletkromatogramjának bemutatására nem tértünk ki.
51
5. EREDMÉNYEK 9. ábra: Porphyria cutanea tardában szenvedő beteg székletkromatogramja
5.1.1. Porphyria cutanea tarda beteg esetismertetése K.P. 51 éves férfibeteg anamnézisében 1964-ben tonsillectomia, 1967-ben appendectomia, és 1978-ban nyombélfekély szerepel. Fiatal kora óta rendszeresen dohányzik, napi 1 doboz cigarettát szív. 1978 előtt bőségesen fogyasztott alkoholt, elsősorban sört, azóta csak ritkán, alkalmanként. 1979 nyarán jelentek meg először mindkét kézfején hólyagok, melyek gyorsan kifakadtak, helyükön előbb nedvedző fekélyek, majd hegek alakultak ki. Bőre sérülékennyé vált, munka közben kesztyűt kellett viselnie, kocsirendezői munkáját nehezen tudta ellátni. Kórházi kivizsgálása még abban az évben megtörtént, és az elvégzett vizsgálatok alapján hepatitis chronica cum fibrose, porphyria cutanea tarda diagnózist állították fel. Vizeletében nagy mennyiségben volt az uroporfirin. Egyéb laboratóriumi vizsgálatok eredményei normális tartományba
estek
(vizeleturoporfirin:
14450
52
nmol/24
óra,
Hb:15,5
g/dl
fvs:6000,
5. EREDMÉNYEK thrombocyta:190000, prothrombin: 105 %, AST: 18 U/l, ALT:25 U/l, GGT: 25 U/l, szérumbilirubin:0,9 μmol/l, alkalikus foszfatáz:110 U/l, amylase:130 /U/l, szérumösszfehérje:75 g/l, albumin: 42 g/l, szérumvas 35 μmol/l, szérumferritin: 560 μg/l, szérumtransferrin: 2,7g/l, szérum electroforezis: normális, süllyedés: 3 mm/óra, vércukor: 78 mg/dl, vizeletüledék és általános-vizsgálat: negatív. Fémionkoncentrációk teljesvérében: Ca: 102,06 μg/g, Cu: 1,205 μg/g, Fe: 795,61 μg/g, K: 1572 μg/g, Mg: 32,42 μg/g, Mn: 0,023 μg/g, P: 298,71 μg/g, S: 1299 μg/g, Zn: 6,9 μg/g. A nyert biopsia intenzív luminescenciát mutatott, fénymikroszkópos vizsgálata során fibrózissal szövődött idült gyulladás jelei voltak láthatók. A helyenként észlelt intralobuláris septumképződés felvetette agresszív forma lehetőségét is. Feltételezték, hogy a súlyos májkárosodást a korábbi, jelentős alkoholfogyasztás okozta. Kezelésként Ippen-kúrát alkalmaztak, melyet azóta is általában évenként 1-2 alkalommal meg kell ismételni. 1-1 kúra végére uroporfirin ürítése jelentősen csökkent és ezzel párhuzamosan a bőrjelenségek is regrediáltak. Gondozása során több alkalommal javasolták újabb májbiopsia elvégzését, de a beteg a vizsgálattól elzárkózott. Belgyógyászati statusa részleges alkohol abstinentia mellett alig változott és évtizedeken keresztül sem volt elérhető a tartós remisszió. Ennek hátterében a 2003-ban felfedezett hepatitis C vírus infekció állt. Laboratóriumi eredményei: (2005) vizelet uroporfirin: 17.680 - 7585 nmol/24 óra (norm érték: 45 nmol/24 óra). Szérumvas: 21 μmol/l, ferritin: 401 μg/l, totál transzferrrin: 1,6 g/l,. AST: 66 U/l, ALT: 50 U/l, GGT: 234 U/l, vércukor: 4,6 mmol/l, LDH: 449 U/l, CRP: 13,5mg/l, összkoleszterin. 4,5 mmol/l, trigliceridek: 1,12 mmol/l, HDL-koleszterin: 1,19 mmol/l, LDLkoleszterin: 2,80 mmol/l, HCT: 56,3 %. Fémionértékei: Ca: 49,06 μg/g (kontrollérték: 53,64±18,36), Cu: 0,73 μg/g (kontrollérték: 0,674±0,213), Fe: 476,11 μg/g (kontrollérétk: 504,8±63,2), K: 1518 μg/g (kontrollérték: 1820±308), Mg: 28,49 μg/g (kontrollérték: 37,27±7,51), Mn: 0,010 μg/g (kontrollérték: 0,099±0,112), P: 297,29 μg/g (kontrollérték: 329,6±17,9), S: 1260 μg/g (kontrollérték: 1501±83), Zn: 5,33 μg/g (kontroll- érték: 7,42±1,19). 2005-ben bőrjelenségei az őszi hónapokban is jelentkeztek (10. a-f ábrák), így ebben az évben harmadszor is Ippen-kúra elvégzése vált szükségessé. Jelenleg a hepatitis C vírusinfekció kezelését mérlegelik, annak reményében, hogy a vas mobilizációjának csökkentésével a porphyria cutanea tarda jelentős javulása is elérhető lesz.
53
5. EREDMÉNYEK 10. a, b, c, d, e, f ábrák: Bőrjelenségek sporadikus porphyria cutanea tarda betegen
A a
b •
•
c
d •
•
e
f •
•
a. b. c. d. e. f. ábrák: 51 éves porphyria cutanea tardában szenvedő férfibeteg. Kezén (a, b), alkarján már hegesedő (b), homlokán (d, e) és feje tetején (f) még hólyagos, pörkös bőrelváltozások láthatók.
54
5. EREDMÉNYEK 5.1.2. Porphyria cutanea tarda betegek csoportosítása klinikailag aktív tünetek és a haemochromatosis gén mutáció alapján A klinikai kép és a rutin laboratóriumi paraméterek szerint 4 csoportot képeztünk: 1. PCT-A csoport: Klinikailag klinikailag aktív PCT, normális szérumvas és magas szérumferritin, magas vizeleturoporfirin (n=6) átlag életkor (55,83±8,42); 2. PCT-B csoport: Klinikailag inaktív PCT, normális szérumvas és magas szérumferritin mérsékelten fokozott vizeleturoporfirin-űrítés (n=8) átlag életkor (59,12±7,10); 3. PCT-C csoport: Klinikailag aktív PCT, magas szérumvas, magas szérumferritin, magas vizeleturoporfirin értékekkel (n=6), átlag életkor (59,00±7,68). A PCT-A, PCT-B és PCT-C csoportba sorolt porphyria cutanea tardában szenvedő betegek HFE (HLA-H) génje nem hordozza a
282
Cys→Tyr,
63
His→Asp és
65
Ser→Cys pontmutációkat.
Vizsgált betegeink esetében a fenti pontmutációk által okozott öröklődő haemochromatosis előfordulása nem volt bizonyítható. A haemochromatozisban is szenvedő betegeket H betűvel jelöltük, nemek szerint megosztva, H1 és H2. 4.
PCT-H1
csoport:
Klinikailag
manifeszt
állapottal
jellemző
PCT
férfibetegek,
haemochromatosis HFE génpontmutáció, magas vizeleturoporfirin-űrítés (n=20) átlag életkor (52,80±6,21); 5.
PCT-H2
csoport:
Klinikailag
manifeszt
állapottal
jellemző
PCT
nőbetegek,
haemochromatosis HFE génpontmutáció, magas vizeleturoporfirin-űrítés (n=5) átlag életkor (50,61±8,30); A HFE (HLA-H) génben (6. kromoszóma) három pontmutációt írtak le; 63
His/Asp (H63D) és
65
282
Cys/Tyr (C282Y),
Ser/Cys (S65C). A megvizsgált PCT betegek 64%-a hordozza a HFE
(HLA-H) gén H63D és C282Y pontmutációkat. A betegek egyike sem hordozza a HFE (HLA-H) génben az S65C pontmutációt, míg a HFE (HLA-H) gén H63D pontmutációját 39,50%-ban heterozigóta formában és 11,11%-ban homozigótaként találtuk. A C282Y pontmutáció 13,34%ban fordult elő heterozigóta változatban. A porphyria cutanea tardában szenvedő betegek nagy részében magas szérumvas és ferritinszint figyelhető meg. A terápiás vérlebocsátás a bőrtünetek visszafejlődését eredményezi. A normál, vasterhelést nem mutató populáció mintegy egyötöde H63D-heterozigota.
55
5. EREDMÉNYEK Nem ismert, hogy a H63D mutáció hiányában milyen veszélyeztetettséget jelent az öröklődő haemochromatosis és porphyria cutanea tarda az egyéb betegségek szempontjából. A H63D pontmutáció-prevalencia betegeink esetében 9,5 % (allél frekvencia) volt. Ippen-kúra hatására csökkent a porfirinek ürítése, de a kontrollcsoporthoz viszonyítva a kúra után is szignifikánsan több porfirint ürítettek a betegek. Az 1. táblázatban a vizeletporfirin és a vasanyagcsere szérumértékei láthatók phlebotomia kezelés előtt és után. 1. táblázat: Vizeleturoporfirin és a vasanyagcsere alakulása phlebotomia kezelés után PCT-A VIZELETPORFIRIN ÉS VASANYAGCSERE ÉRTÉKEK ( x ±SD) PARAMÉTEREK KONTROLL PHLEBOTOMIA PHLEBOTOMIA (n=6) ELŐTT UTÁN (n=6) (n=6) VIZELET UP (nmol/24h) 9,62±4,53 3799,33±2557,14* 980,83±849,57*,# VIZELET KP (nmol/24h) 32,00±6,51 583,83±218,73* 155,60±97,00* SE VAS (µmol/l) 20,05±8,99 22,47±4,36 20,63±4,86 SE FERRITIN (µg/l) 76,41±13,03 721,83±656,51* 246,01±66,31* SE TRANSFERRIN (g/l) 2,78±0,15 2,70±0,49 2,58±0,16 szignifikáns p<0,05 *vs. kontrollcsoport, # vs. phlebotomia előtt 2. táblázat: Porphyria cutanea tarda betegek vizeleturoporfirin és vasanyagcsere paramétereinek változása phlebotomia kezelés hatására PCT-B VIZELETPORFIRIN ÉS VASANYAGCSERE ÉRTÉKEK ( x ±SD) PARAMÉTEREK KONTROLL PHLEBOTOMIA PHLEBOTOMIA (n=6) ELŐTT UTÁN (n=8) (n=8) VIZELET UP (nmol/24h) 9,62±4,53 1556,00±1118,97* 127,80±115,48* # § VIZELET KP (nmol/24h) 32,00±6,51 251,00±111,53* 231,14±160,98* SE VAS (µmol/l) 20,05±8,99 19,86±4,00 18,17±5,44 SE FERRITIN (µg/l) 76,41±13,03 465,31±3,76* 191,82±133,01* # SE TRANSFERRIN (g/l) 2,78±0,15 2,72±0,42 2,58±0,34 szignifikáns p<0,05 *vs. kontrollcsoport, # vs. phlebotomia előtt, § vs PCT-A csoport phlebotomia után
56
5. EREDMÉNYEK A PCT-B csoportba sorolt betegekben nem voltak bőrtünetek. Phlebotomia után a 2. táblázatban található értékeket kaptuk. A phlebotomia eredményeképpen szignifikánsan csökkentek a vasraktárak és a vizeleturoporfirin-szint. A PCT-A és PCT-B csoportokban a szérumvas érték nem szignifikánsan, de magasabb (PCT-A) (1. táblázat), vagy hasonlóak (PCT-B) (2. táblázat) voltak a kontrollcsoport értékével. A mérések eredményei a szérum ferritin-szint szignifikáns csökkenését igazolják a vérlebocsátások után. 3. táblázat: Vizeletporfirin és vasanyagcsere értékek változása PCT-H1 betegekben PCT-H-1 FÉRFIBETEGEK VIZELETPORFIRIN ÉS VASANYAGCSERE ÉRTÉKEI ( x ±SD) PARAMÉTEREK KONTROLL PHLEBOTOMIA PHLEBOTOMIA (n=6) ELŐTT UTÁN (n=20) (n=20) VIZELET UP (nmol/24h) 9,62±4,53 5630,80±3341,73 * 1587,14±1498,81* # VIZELET KP (nmol/24h) 32,00±6,51 939,93±539,80 * 415,14±286,23* SE VAS (µmol/l) 20,05±8,99 33,019±5,55 * 25,71±7,18 SE FERRITIN (µg/l) 76,41±13,03 692,24±266,48 * 250,10±165,64* # SE TRANSFERRIN (g/l) 2,78±0,15 2,87±0,40 2,48±0,26 szignifikáns p<0,05 *vs. kontrollcsoport, # vs. phlebotomia előtt A haemochromatosis génpontmutációt hordozó nő-, és férfibetegekben szignifikáns eltéréseket kaptunk az uroporfirin, koproporfirin, szérumvas és ferritin-paraméterek értékeiben a kontrollcsoporthoz viszonyítva (3. 4. táblázatok). Összehasonlítva a nőbetegek vizeleturoporfirin értékét phlebotomia előtt, megállapíthatjuk, hogy közel 50%-al alacsonyabb, mint a férficsoportban
kapott
vizeleturoporfirin
érték.
A
PCR-módszerrel
kimutatható
haemochromatosis gén pontmutációt tartalmazó csoportokban (PCT-H-1 és PCT-H-2) a szérumvas-érték szignifikánsan magasabb a kontrollcsoport értékével szemben (3. 4. táblázatok). A vizelet uroporfirin szignifikáns korrelációban van a szérum AST (r=0,64), a szérum ALT (r=0,71) és a szérum GGT (r=0,68). A szérumvas szignifikáns pozitív korrelációban (p<0,05) volt a szérum GGT-vel (r=0,59).
57
5. EREDMÉNYEK 4. táblázat: Vizeletporfirin és vasanyagcsere változásai PCT betegekben PCT-H-2 NŐBETEGEK VIZELETPORFIRIN ÉS VASANYAGCSERE ÉRTÉKEI ( x ±SD) PARAMÉTEREK KONTROLL PHLEBOTOMIA PHLEBOTOMIA (n=7) ELŐTT UTÁN (n=5) (n=5) VIZELET UP (nmol/24h) 9,62±4,53 3382,40±1973,19 * 708,00±457,77 * # VIZELET KP (nmol/24h) 32,00±6,51 517,20±227,16 * 359,60±235,01* SE VAS (µmol/l) 19,74±9,18 37,48±5,69 * 24,59±4,89 # SE FERRITIN (µg/l) 55,53±32,39 465,01±140,34 * 59,97±29,41 # SE TRANSFERRIN (g/l) 2,90±0,31 2,98±0,30 2,34±0,21 szignifikáns p<0,05 *vs. kontrollcsoport, # vs. phlebotomia előtti csoport A PCT-H1 és PCT-H2 csoportokban a vizeleturoporfirin szint a phlebotomia elvégzése után is szignifikánsan emelkedett maradt a kontrollcsoport értékeihez képest, míg a kezelés előtti paraméterekhez viszonyítva szignifikánsan alacsonyabb. Feltételezhető, hogy a normálértékhez képest magas uroporfirin szint további hosszú távú kezelések folytatását igényli. 5. táblázat: Porphyria cutanea tarda betegek vizeleturoporfirin és vasanyagcsere paramétereinek változása phlebotomia-kezelés hatására PCT-C FÉRFIBETEGEK VIZELETPORFIRIN ÉS VASANYAGCSERE ÉRTÉKEI ( x ±SD) PARAMÉTEREK KONTROLL PHLEBOTOMIA PHLEBOTOMIA (n=6) ELŐTT UTÁN (n=6) (n=6) VIZELET UP (nmol/24h) 9,62±4,53 1868,50±821,89 * 721,60±706,56 * # VIZELET KP (nmol/24h) 32,00±6,51 397,80±184,43 * 396,00±283,96 * SE VAS (µmol/l) 20,05±8,99 40,91±11,38 * 37,77±37,74 SE FERRITIN (µg/l) 76,41±13,03 798,22±523,44 * 172,87±152,76 * # SE TRANSFERRIN (g/l) 2,78±0,15 3,08±0,38 2,28±0,30 szignifikáns p<0,05 *vs. kontrollcsoport, # vs. phlebotomia előtti csoport PCT-C csoportba tartozó betegekben a napfénnyel érintkező bőrfelületeken bőrelváltozások, hólyagok, elpörkösödött hegek láthatók. A vérlebocsátással ürülő porfirinek a bőrelváltozások fokozatos eltűnéséhez vezettek. A vizelettel ürülő uroporfirin-koncentráció szignifikánsan emelkedett a kontrollcsoport értékéhez viszonyítva. Jellemző a kórosan felhalmozódott és
58
5. EREDMÉNYEK raktározott szérumferritin (5. táblázat). Többszöri vérlebocsátás után sem csökken a normáltartomány határai közé a szérumvas és ferritinszint. 6. táblázat: Porphyria cutanea tarda betegek májenzim paramétereinek változása phlebotomia kezelés hatására PCT-A MÁJFUNKCIÓT JELLEMZŐ PARAMÉTEREK ( x ±SD) PARAMÉTEREK KONTROLL PHLEBOTOMIA PHLEBOTOMIA (n=6) ELŐTT UTÁN (n=6) (n=6) AST (U/I) 29,66±4,96 51,33±18,01* 51,66±20,53* ALT (U/I) 21,00±7,32 59,83±18,79* 43,40±18,72* ALP (U/I) 161,83±52,30 278,66±158,59 212,00±80,46 GGT (U/I) 24,00±9,26 125,40±103,75 * 106,20±98,67 ÖSSZBILIRUBIN(µmol/l) 10,41±2,83 16,71±10,29 14,63±7,56 szignifikáns p<0,05 *vs. kontrollcsoport A PCT-A csoportba tartozó betegeknél a májenzim-paraméterek szignifikánsan nagyobb értéket mutatnak a kontrollcsoport értékeihez viszonyítva (6. tábla). A vérlebocsátás után is szignifikánsan nagyobb értékeket kaptunk az AST és ALT esetében. Ezek a paraméterek normalizálódása hosszabb időt igényel, mint a porfirin értékek csökkenése. 7. táblázat: Porphyria cutanea tarda betegek májenzim paramétereinek változása phlebotomia hatására PCT-B MÁJFUNKCIÓT JELLEMZŐ PARAMÉTEREK ( x ±SD) PARAMÉTEREK KONTROLL PHLEBOTOMIA PHLEBOTOMIA (n=6) ELŐTT UTÁN (n=8) (n=8) AST (U/I) 29,66±4,96 40,40±19,47 33,42±10,79 ALT (U/I) 21,00±7,32 50,00±24,55 27,00±12,63 ALP (U/I) 161,83±52,30 186,00±76,25 218,14±68,04 GGT (U/I) 24,00±9,26 93,40±58,71 68,57±58,72 ÖSSZBILIRUBIN(µmol/l) 10,41±2,83 12,35±3,17 11,54±2,36 A PCT-B csoportba tartozó betegek (7. táblázat) májenzim-paraméterei nem mutattak szignifikáns eltérést a kontrollcsoporthoz sem a vérlebocsátás előtt, sem azután.
59
5. EREDMÉNYEK
8. táblázat: HFE gén pontmutációval rendelkező porphyria cutanea tardában szenvedő betegek májenzim értékeinek változása phlebotomia kezelés hatására PCT-H-I FÉRFIBETEGEK MÁJFUNKCIÓT JELLEMZŐ PARAMÉTEREI ( x ±SD) PARAMÉTEREK KONTROLL PHLEBOTOMIA PHLEBOTOMIA (n=6) ELŐTT UTÁN (n=20) (n=20) AST (U/I) 29,66±4,96 63,28±28,72 * 41,78±19,83 ALT (U/I) 21,00±7,32 78,57±32,94 * 46,14±24,99 * # ALP (U/I) 161,83±52,30 217,21±58,55 219,21±75,96 GGT (U/I) 24,00±9,26 122,79±112,32 * 51,47±23,17 * # ÖSSZBILIRUBIN(µmol/l) 10,41±2,83 11,81±3,45 11,78±5,56 szignifikáns p <0,05 *vs. kontrollcsoport; #vs. phlebotomia előtt A haemochromatosis HFE gén pontmutációival rendelkező manifeszt PCT-s betegekben a phlebotomia után a májenzim-értékek közül, az alanin-aminotranszferáz (ALT) és a gammaglutamiltranszferáz (GGT) szignifikánsan csökkentek a kezelés előtti paraméterekhez viszonyítva (8. és 9. táblázatok). A phlebotomia hatására a szervezetben felhalmozódott porfirin kiürült. Feltételezzük, hogy a hepatociták vastartalmának csökkenése nagymértékben hozzájárult a javuláshoz és elősegítette az oxidációs stressz intenzitásának a csökkenését. 9. táblázat: HFE gén pontmutáció és phlebotomia hatása porphyria cutanea tardában szenvedő nőbetegek májenzim értékeire PCT-H-2 NŐBETEGEK MÁJFUNKCIÓT JELLEMZŐ PARAMÉTEREI ( x ±SD) PARAMÉTEREK KONTROLL PHLEBOTOMIA PHLEBOTOMIA (n=7) ELŐTT UTÁN (n=5) (n=5) AST (U/I) 27,00±8,83 45,60±14,35 * 40,60±24,52 ALT (U/I) 18,14±6,17 60,40±20,08 * 37,20±17,06 * # ALP (U/I) 164,00±31,01 159,20±41,36 183,60±49,89 GGT (U/I 20,57±4,07 37,75±19,01 * 36,50±23,01 ÖSSZBILIRUBIN µmol/l) 10,28±2,37 10,12±3,85 12,66±7,09 szignifikáns p<0,05 *vs. kontrollcsoport; # vs. phlebotomia előtt
60
5. EREDMÉNYEK 10. táblázat: Májfunkciós paraméterek PCT betegekben PCT-C MÁJFUNKCIÓT JELLEMZŐ PARAMÉTEREK ( x ±SD) PARAMÉTEREK KONTROLL PHLEBOTOMIA PHLEBOTOMIA (n=6) ELŐTT UTÁN (n=6) (n=6) AST (U/I) 29,66±4,96 54,50±16,05 * 38,85±15,08 ALT (U/I) 21,00±7,32 44,50±25,77 24,00±17,79 ALP (U/I) 161,83±52,30 183,75±27,69 204,40±73,76 GGT (U/I) 24,00±9,26 77,66±55,07 136,00±107,13 * ÖSSZBILIRUBIN(µmol/l) 10,41±2,83 12,26±6,66 14,66±11,63 szignifikáns p<0,05 *vs. kontrollcsoport A PCT-C csoportba (10. táblázat) tartozó betegek májenzim-értékeinek csökkenése a vérlebocsátás után nem volt matematikailag szignifikáns változás, sőt a GGT még növekedett is a phlebotomia előtti értékhez. 11. táblázat: Lipidparaméterek változása phlebotomia kezelés hatására PCT-ban szenvedő betegekben
PARAMÉTEREK KOLESZTERIN(mmol/l) TRIGLICERID (mmol/l) HDL-KOL (mmol/l) LDL-KOL (mmol/l)
PCT-A LIPIDPARAMÉTEREK ( x ±SD) KONTROLL PHLEBOTOMIA (n=6) ELŐTT (n=6) 4,46±0,30 5,62±1,76 1,04±0,43 2,08±1,29 1,39±0,35 1,68±0,64 2,99±1,06 3,25±1,25
PHLEBOTOMIA UTÁN (n=6) 5,18±1,52 1,11±0,57 1,50±0,57 3,26±1,19
12. táblázat: Phlebotomia-kezelés hatása a lipidparaméterekre porphyria cutanea tardában szenvedő betegekben PCT-B LIPIDPARAMÉTEREK ( x ±SD) PARAMÉTEREK KONTROLL PHLEBOTOMIA (n=6) ELŐTT (n=6) KOLESZTERIN(mmol/l) 4,46±0,30 5,32±1,43 TRIGLICERID (mmol/l) 1,04±0,43 2,38 ±1,29 HDL-KOL (mmol/l) 1,39±0,35 1,57 ±0,64 LDL-KOL (mmol/l) 2,99±1,06 3,18 ±1,25
61
PHLEBOTOMIA UTÁN (n=6) 5,19±1,51 2,2 3±1,55 1,48±0,35 2,66±1,40
5. EREDMÉNYEK A 11. és 12. táblázatban csoportosított porphyria cutanea tarda betegek lipidparaméterei nem mutatnak szignifikáns eltérést a kontrollcsoporthoz viszonyítva és nem változtak szignifikánsan a phlebotomia után. 13. táblázat: Haemochromatosis gén pontmutációt hordozó porphyria cutanea tardában szenvedő férfibetegek lipidparamétereinek változása phlebotomia kezelés hatására PCT-H-1 FÉRFIBETEGEK LIPIDPARAMÉTEREI ( x ±SD) PARAMÉTEREK KONTROLL PHLEBOTOMIA PHLEBOTOMIA (n=6) ELŐTT UTÁN (n=20) (n=20) KOLESZTERIN(mmol/l) 4,46±0,30 5,49±0,60 * 4,76±0,90 # TRIGLICERID (mmol/l) 1,04±0,43 1,61±0,90 1,97±1,75 HDL-KOL (mmol/l) 1,39±0,35 1,24±0,13 1,44±0,81 LDL-KOL (mmol/l) 2,99±1,06 3,26±1,11 2,77±0,60 Szignifikáns p<0,05 *vs kontroll; # vs phlebotomia előtt A kezelés előtti paramétereket elemezve azt találtuk, hogy a haemochromatosis génpontmutációra pozitív férfibetegek szérum koleszterin értékei szignifikánsan magasabb szintet mutattak a kontrollcsoporthoz viszonyítva (13. táblázat). A kezelés után viszont szignifikánsan alacsonyabb szintet kaptunk a kezelés előtti értékekhez képest. 14. táblázat: Haemochromatosis gén pontmutációt hordozó porphyria cutanea tardában szenvedő nőbetegek lipidparamétereinek változása phlebotomia kezelés hatására
PCT-H-2 NŐBETEGEK LIPIDPARAMÉTEREI ( x ±SD) PARAMÉTEREK KONTROLL PHLEBOTOMIA PHLEBOTOMIA (n=7) ELŐTT UTÁN (n=5) (n=5) KOLESZTERIN (mmol/l) 5,82±0,85 4,76±0,90 4,06±2,02 TRIGLICERID (mmol/l) 1,24±1,56 1,97±1,75 1,67±0,83 HDL-KOL (mmol/l) 1,59±0,21 1,44±0,81 1,67±0,35 LDL-KOL (mmol/l) 3,69±0,68 2,77±0,60 3,63±1,65
62
5. EREDMÉNYEK
15. táblázat: Phlebotomia kezelés hatása porphyria cutanea tardában szenvedő betegek lipid paramétereire PCT-C FÉRFIBETEGEK LIPIDPARAMÉTEREI ( x ±SD) PARAMÉTEREK KONTROLL PHLEBOTOMIA PHLEBOTOMIA (n=6) ELŐTT UTÁN (n=6) (n=6) KOLESZTERIN (mmol/l) 4,46±0,30 4,54±0,49 4,49±0,84 TRIGLICERID (mmol/l) 1,04±0,43 0,80±0,25 0,97±0,49 HDL-KOL (mmol/l) 1,39±0,35 1,96±0,71 1,68±0,64 LDL-KOL (mmol/l) 2,99±1,06 1,99±0,56 2,36±1,02 A PCT-A, PCT-B PCT-H-1, PCT-H-2 és PCT-C betegcsoportokban a zsíranyagcsere paraméterek nem változtak szignifikánsan a kezelés után (11, 12, 13, 14, 15 táblázatok). Ezekben a betegcsoportokban a megvizsgált paraméterekben nem találtunk szignifikáns eltérést a kontrollcsoporthoz viszonyítva sem. 5.1.3. Porphyria cutanea tarda betegek csoportosítása az alkoholfogyasztás és a diabetes mellitus szerint Az országos porphyria központban vizsgált betegek nagy része chronikusan alkoholfüggő, egyrészűknek 2-es típusú diabetes mellitusa is volt, így a betegek csoportosítása már részben adott.
Módszertani
részben
ismertetettek
alapján
elkülönítettünk
PCT-ban
szenvedő
betegcsoportot, PCT és alkoholfüggő betegcsoportot, és PCT-ban szenvedő, alkoholfüggő és még diabetes mellitusban is szenvedő betegeket. Vizsgálataink során meghatároztuk a májenzim paramétereket, a lipidanyagcsere paramétereket. Megmértük a redox-homeostasis és antioxidáns paramétereket. A PCT-ban szenvedő betegek haemorrheologiai paramétereit a vas háztartás függvényében figyeltük meg. A szérumban az aszpartát-aminotranszferáz koncentrációja szignifikánsan nagyobb értéket mutatott az alkoholt fogyasztó PCT, és a 2-es típusú diabetes mellitusban szenvedő és alkoholt fogyasztó PCT betegcsoportokban, míg a PCT csoportban nem változott szignifikánsan a kontrollcsoporthoz viszonyítva (11. ábra).
63
5. EREDMÉNYEK 11. ábra: Májenzim paraméterek PCT-ban szenvedő betegekben
A szérum AST szignifikáns pozitív korrelációt (p<0,05) mutatott a szérumferritin (r=0,73) értékével és a szérumtranszferrinnel (r=0,83). Mindhárom csoportban a szérum AST és szérum ALT között szignifikáns korrelációt kaptunk: a PCT csoportban (r=0,87), az alkoholfüggő PCTban szenvedő beteg csoportban (r=0,85), míg a 2-es típusú DM és alkoholfüggő PCT-ban szenvedő betegekben (r=0,86). 12. ábra: Szérum ALT változása PCT-ban
64
5. EREDMÉNYEK Az AST és ALT enzimek értékei az alkoholfüggő PCT-ban, valamint a diabéteszes és alkoholfüggő PCT-s betegcsoportokban szignifikánsan magasabbak a kontrollcsoport és a csak PCT betegcsoport-értékeihez viszonyítva (12. ábra). Az AST szignifikáns pozitív korrelációt (p< 0,05) adott a szérumvassal (r=0,82), szérum transzferrinnel (r=0,71) a PCT betegcsoportban. 13. ábra: Szérum GGT változása PCT betegekben
A alkoholfüggő PCT-ban és diabéteszes alkoholfüggő PCT-ban szenvedő betegcsoportokban szignifikánsan magas GGT aktivitást mértünk szemben a kontrollcsoportban mért értékekkel, míg a csak PCT-ban szenvedő betegekben nem szignifikánsan eltérő értékeket kaptunk (13. ábra). A szérum GGT aktivitás emelkedése mindkét csoportban érzékenyen jelzi a májsejtek toxikus károsodását alkohol hatására.
65
5. EREDMÉNYEK 14. ábra: Szérum alkalikus foszfatáz PCT-ban szenvedő betegekben
Az alkalikus foszfatáz enzim értékei a PCT-ban szenvedő betegekben nem szignifikánsan, míg az alkoholfüggő PCT és 2-es típusú DM és alkoholfüggő PCT betegcsoportokban szignifikánsan magasabbak a kontrollcsoport értékeihez viszonyítva (14. ábra). 15. ábra: Szérumkoleszterin koncentráció PCT betegekben
66
5. EREDMÉNYEK A szérum koleszterin értékek egyik betegcsoportban sem mutattak szignifikáns eltérést a kontrollcsoportban kapott értékhez viszonyítva (15. ábra) 16. ábra: Szérum triglicerid értékek PCT betegekben
Azok a PCT betegek szérumtriglicerid szintje, akik rendszeresen fogyasztanak alkoholt, és 2-es típusú DM-ben is szenvednek szignifikánsan magasabb volt a kontroll-, a PCT és az alkoholfüggő PCT betegcsoporthoz viszonyítva (16. ábra). Ez az eredmény összhangban áll a nemzetközi irodalomban ismertetett tapasztalatokkal, miszerint DM-ban fokozódik a trigliceridek zsírszövetben történő raktározása. 17. ábra: Szérum LDL-koleszterin PCT-ban szenvedő betegekben
67
5. EREDMÉNYEK
18. ábra: Szérum HDL-koleszterin eredmények PCT-ban szenvedő betegekben
A csak porphyria cutanea tarda, az alkoholtfogyasztó PCT valamint 2-es típusú diabéteszes és alkoholtfogyasztó PCT csoportokban a szérumkoleszterin, az LDL-koleszterin és HDLkoleszterin-értékek nem mutattak szignifikáns eltérést a kontrollcsoport-értékeihez viszonyítva (15. 17. 18. ábrák). A sporadikus porphyria cutanea tarda betegekben a vasmetabolizmus felborulása a vas raktározását eredményezi a szervezetben, de legfőképpen a májban. A PCT kapcsolata a herediter haemochromatosissal a HFE génpontmutáción keresztül, megerősíti a vaskoncentráció növekedését (Fodinger, 1999). A kóros vasmetabolizmus kapcsolatban van a hepatoceluláris nekrózissal akárcsak a kóros porfirinmetabolizmus is (D’Alessandro, 1997). A 19. ábrán bemutatjuk a szérumferritin koncentráció változását a porphyria cutanea tardában szenvedő betegekben
68
5. EREDMÉNYEK
19. ábra: Szérumferritin-szint PCT-ban szenvedő betegekben
Az alkoholtfüggő PCT és a 2-es típusú diabetes mellitus és alkoholfüggő PCT betegekben szignifikánsan emelkedett ferritin-koncentrációt mértünk a kontrollcsoport-érétkéhez viszonyítva. A nagyobb koncentráció az alkoholfogyasztásnak tekinthető. Az alkohol vaslerakódást indukáló hatását az irodalmi adatok is igazolják. 5.2. Redoxi-paraméterek vizsgálata phlebotomia-kezelés hatására porphyria cutanea tardában szenvedő betegekben Ebben a fejezetben azokat az eredményeket tárgyalom, amelyek a redox-homeostasisnak kialakulása szempontjából fontosak. A szervezet redoxi-homeostasisát PCT betegekben a vasfelhalmozódás és a porfirin megjelenése befolyásolja. A
betegek
plazma
szabad-SH-csoport
koncentrációjának
csökkenése
a
tiolcsoportok
redukálóképességének csökkenését jelzi. A H-donor aktivitás mérési eredményeiből a redukáló ekvivalensek elégséges vagy elégtelen voltára tudunk következtetni. A redukálóképesség mindazokat a változásokat jelzi, amelyek az oxidáló folyamatokkal szemben védelmet nyujtó plazma komponensekre vonatkoznak.
69
5. EREDMÉNYEK A phlebotomia hatására a szervezetből fokozatosan kiürül a porfirin, aminek következtében csökken a fotoreakcióban képződő aktív oxigén szabad gyökök mennyisége. A vérlebocsátás hatására alacsonyabb lesz a vas koncentráció is. Az oxidatív stressz mérséklődése maga után vonja a reaktív oxigén intermedierek szintjének csökkenését. Ebben a csoportban azonban a megmért redox-paraméterek (16. táblázat) nem szignifikánsan változtak a vérlebocsátás hatására porphyria cutanea tardában szenvedő betegekben. A PCT-A betegcsoportban a szabad SHcsoport koncentráció értékei szignifikánsan kisebbek voltak a kezelés előtt és utána is a kontrollcsoporthoz viszonyítva. A plazma kemilumineszcencia értékei is szignifikánsan nagyobbak voltak a kontrollcsoport-értékeihez viszonyítva, ami a megromlott össz-scavenger kapacitásra utal. 16. táblázat: Phlebotomia kezelés hatása a redox-paraméterekre porphyria cutanea tardában szenvedő betegekben PCT-A REDOX-PARAMÉTEREK ( x ± SD) PARAMÉTEREK KONTROL PHLEBOTOMI L A ELŐTT (n=6) (n=6) SZABAD SH-CSOPORT (mmol/l) 0,84±0,03 0,603±0,12* REDUKÁLÓKÉPESSÉG(mmol/leqAs) 1,74±0,21 1,16±0,54 * H-DONOR AKTIVÍTÁS gátlás (%) 60,62±1,98 55,99±8,17 PLAZMA-TSC (RLU%) 2,00±1,27 36,73±26,33* VVS-TSC (RLU%) 58,09±22,69 62,15±17,78 szignifikáns p<0,05 *vs. kontrollcsoport
PHLEBOTOMIA UTÁN (n=6) 0,52±0,16* 1,17±0,70 43,71±8,30* 25,71±27,01 62,36±18,16
17. táblázat: Redoxi-paraméterek PCT-ban szenvedő betegekben PCT-B REDOXI-PARAMÉTEREK ( x ± SD) PARAMÉTEREK KONTROLL PHLEBOTOMIA (n=6) ELŐTT (n=8) SZABAD SH-CSOPORT (mmol/l) 0,84±0,03 0,53±0,12* REDUKÁLÓKÉPESSÉG(mmol/leqAs) 1,74±0,21 1,22±0,54 * H-DONOR AKTIVÍTÁS gátlás (%) 60,62±1,98 52,48±6,17 * PLAZMA-TSC (RLU%) 2,00±1,27 28,51±26,33* VVS-TSC (RLU%) 58,09±22,69 60,15±17,78 szignifikáns p<0,05 *vs. kontrollcsoport
70
PHLEBOTOMIA UTÁN (n=8) 0,43±0,18 1,16±0,52 * 48,62±6,63 * 21,68±18,25* 66,36±18,97
5. EREDMÉNYEK A PCT-B csoportba sorolt porphyria cutanea tardában szenvedő betegekben (17. táblázat) szignifikánsan alacsonyabb értéket kaptunk a szabad SH-csoport-koncentrációban, és szignifikánsan alacsonyabb értékeket mértünk a plazma redukálóképesség és H-donor aktivitásban is a kontrollhoz képest. A PCT-A és PCT-B betegcsoportokban (16. 17. tábl.) a szabad SH-csoport-koncentráció csökkenését az emelkedett uroporfirin- és vasszint hatására kialakuló glutation-depléció következményének véljük. A plazma csökkent redukálóképességét az uroporfirin szintézis során fokozott mértékben keletkező redukálóekvivalensek következményének tartjuk. A phlebotomia előtt és után mért koncentrációk szignifikánsan alacsonyabbak a kontrollcsoportban meghatározott koncentrációhoz viszonyítva (16. 17. tábl.). A plazma és vvs kemilumineszcenciás fényintenzitások koncentrációjának növekedése a kontrollcsoport koncentrációszintjéhez viszonyítva az össz-scavenger kapacitás gyengülését jelezte. A vérlebocsátás előtti plazma kemilumineszcenciás fényintenzitás koncentráció szignifikánsan nagyobb volt a kontrollcsoporthoz viszonyítva. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a vérlebocsátás önmagában nem elegendő a szervezet redox-homeosztázisának helyreállítására. Feltételezhető, hogy a kezeléssel az antioxidáns rendszerben található vitaminok és más kismolekulák, mint pl. a glutation is kiürül.
18. táblázat: Porphyria cutanea tardában szenvedő betegek redox-paramétereinek változása phlebotomia kezelés hatására PCT-H REDOX-PARAMÉTEREK ( x ± SD) PARAMÉTEREK KONTROLL PHLEBOTOMIA ELŐTT (n=6) (n=15) SZABAD SH-CSOPORT (mmol/l) 0,84±0,03 0,56±0,19 * REDUKÁLÓKÉPESSÉG (mmol/leqAs) 1,74±0,21 1,09±0,33 H-DONOR AKTIVÍTÁS gátlás (%) 60,62±1,98 55,20±5,17 * PLAZMA-TSC (RLU%) 2,00±1,27 11,68±9,82 * VVS-TSC (RLU%) 58,09±22,6 62,58±17,14 szignifikáns p<0,05 *vs. kontrollcsoport
71
PHLEBOTOMIA UTÁN
(n=5) 0,45±0,06 * 1,12±0,16 51,22±5,33 9,32±6,44 * 71,26±12,16
5. EREDMÉNYEK A PCT-H betegcsoportban a szabad-SH csoport értéke, a plazma redukálóképesség és H-donor aktivitás alacsonyabbak a kontrollcsoport értékeihez viszonyítva (18. táblázat). A plazma kemilumineszcencia érték szignifikánsan emelkedett a betegcsoportban vérlebocsátás előtt és után a kontrollhoz viszonyítva, ami az össz-scavenger kapacitás csökkenését mutatja ebben a betegcsoportban is.
19. táblázat: Porphyria cutanea tardában szenvedő betegek redox-paramétereinek változása phlebotomia kezelés hatására PCT-C REDOX-PARAMÉTEREK ( x ± SD) PARAMÉTEREK KONTROLL PHLEBOTOMIA ELŐTT (n=6) (n=15) SZABAD SH-CSOPORT (mmol/l) 0,84±0,03 0,51 ±0,06 * REDUKÁLÓKÉPESSÉG(mmol/leqAs) 1,74±0,21 1,18±0,16 H-DONOR AKTIVÍTÁS gátlás (%) 60,62±1,98 49,11,22±5,33 PLAZMA-TSC (RLU%) 2,00±1,27 9,32±6,44 * VVS-TSC (RLU%) 58,09±22,6 71,26±12,16 szignifikáns p<0,05 *vs. kontrollcsoport
PHLEBOTOMIA UTÁN
(n=5) 0,49 ±0,36 1,15±0,37* 50,44±10,78* 8,85±4,34* 69,67±14,79
A vérlebocsátás nem változtatta meg szignifikánsan a betegek redox-paramétereit. A betegek proantioxidáns státuszában lényeges változás nem következett be phlebotomia kezelés hatására (19. táblázat). A plazmában található molekulák közül gyökfogó tulajdonságai és magas koncentrációja miatt jelentős antioxidáns az albumin, a húgysav és a bilirubin. Bár e vegyületeknek nem elsődleges funkciójuk a szabadgyökök semlegesítése, a plazma teljes antioxidáns kapacitását vizsgáló módszerek szerint annak 50-80%-át e vegyületek adják
72
5. EREDMÉNYEK 20. ábra: Albuminszint phlebotomizált PCT betegekben
Az albumin szabad SH csoportjai és réz-kötése miatt preventív antioxidáns (Suzuki E, 1992) A kontrollcsoport értékéhez viszonyítva a porphyriában szenvedő betegek mindhárom csoportjában az albuminkoncentráció szignifikánsan kisebb (20. ábra). Ez az eredmény is igazolja az antioxidáns kapacitás csökkenését a betegségben. A húgysav antioxidáns szerepére csak a közelmúltban derült fény. A húgysav döntően a májban képződik a xantinoxidáz által katalizált reakció során. Plazmakoncentrációját befolyásolja a vesén keresztüli kiválasztás és az étrend is. Vizsgálati eredményeink alapján mindhárom betegcsoportban a húgysavkoncentráció nem szignifikánsan, de magasabb értékeket adott a kontrollcsoportban kapott eredményekhez viszonyítva (21. ábra). Az alkoholt fogyasztó PCT csoportban a húgysav szoros negatív korrelációt (p<0,05) mutat a teljes vér viszkozitással (r= - 0,91) a PCT betegcsoportban az LDLkoleszterinnel (r= - 0,80), és a koleszterinnel (r = - 0,74). A bilirubin koncentrációtól függően antioxidáns tulajdonságú.
73
5. EREDMÉNYEK 21. ábra: A szérum húgysav-szint phlebotomizált PCT-ban szenvedő betegekben
22. ábra: A szérumösszbilirubin phlebotomizált PCT-ban szenvedő betegekben
A porphyria cutanea tardában szenvedő betegekben mért szérum bilirubin koncentráció nem mutatott szignifikáns különbséget a kontrollcsoport értékéhez képest (22. ábra).
74
5. EREDMÉNYEK A redox-folyamatok egyik fontos indikátora a plazma szabad-SH csoport koncentrációjának változása, mely a glutation koncentráció mennyiségét tükrözi.
23. ábra: Plazma SH-csoport phlebotomizált PCT-ban szenvedő betegekben
A porphyriás betegcsoportok mért értékei szignifikánsan alacsonyabbak voltak a kontrollcsoport értékéhez viszonyítva (23. ábra). A PCT betegcsoportban a plazma SH-csoport szignifikáns pozitív (p<0,05) korrelációt adott a vvs kemilumineszcencia értékkel (r=0,74) és negatív
szignifikáns
korrelációt
(p<0,05)
mutatott
a
HbA1c-vel
(r=
-
0,77),
a
szérumtranszferrinnel (r= - 0,75), a szérum AST-vel (r = - 0,82) és a szérum ALT-vel (r = - 0,77).
75
5. EREDMÉNYEK 24. ábra: Plazma redukálóképesség phlebotomizált PCT-ban szenvedő betegekben
A betegek csoportjaiban tapasztalt csökkenő redukálóképesség, nem szignifikáns, a kontroll csoportban megmért értékekhez viszonyítva (24. ábra). Szignifikáns pozitív korrelációt (p,<0,05) kaptunk a szérum húgysavval (r=0,91), a szérum HbA1c (r=0,74), a szérum glükozzal (r=0,75) a PCT betegcsoportban. 25. ábra: Plazma H-donor aktivitása phlebotomizált PCT-ban szenvedő betegekben
76
5. EREDMÉNYEK A kontrollcsoportban mért plazma H-donor aktivitáshoz viszonyítva kisebb értékeket kaptunk a három betegcsoportban (25. ábra), ami ismételten az antioxidáns státusz gyengülésére utal. Az alkohol és a diabetes mellitus az oxidatív stressz felerősödéséhez járulhat. 26. ábra: Plazma kemilumineszcencia értékek phlebotomizált PCT-ban szenvedő betegekben
A PCT-s betegcsoportban nem szignifikánsan nagyobb intenzitást mértünk, míg az alkoholfüggő porphyria cutanea tardában és a diabetesben is szenvedő betegcsoportban szignifikánsan magasabb kemilumineszcencia szintet mértünk a kontroll- és PCT-s betegek-értékéhez viszonyítva (28. ábra). Az alkoholfüggő PCT-s csoportban az oxidatív stressz következtében felgyorsul a reaktív oxigén intermedierek megjelenése. A 2-es típusú diabetes mellitusban is szenvedő betegcsoportban a jól karbantartott diabetes következtében kisebb mértékben jelentkezik a szabad gyök, de még mindig szignifikánsan magasabb eltérést mutat. A magas kemilumineszcenciás értékek jól jelzik az össz-scavenger kapacitás gyengülését a PCT és kontrollcsoporthoz viszonyítva.
77
5. EREDMÉNYEK
27. ábra: Vvs kemilumineszcencia értékek phlebotomizált PCT-ban szenvedő betegekben
A betegek vvs kemilumineszcencia intenzitás értékei magasabbak a kontrollértékekkel összehasonlítva mindhárom betegcsoportban (27. ábra). A betegek össz-scavenger kapacitásának csökkenését a SOD és GSH-Px aktivitás csökkenésével, a lipidperoxidáció felerősödésével a malondialdehid érték növekedésével lehet magyarázni. 5.3. Haemorrheologiai paraméterek vizsgálata A teljesvér viszkozitását több tényező együttesen befolyásolja, amelynek főbb meghatározói a következők: hőmérséklet, haematocrit, fibrinogén-koncentráció, a globulinok koncentrációja, a plazmaviszkozitás, vvs aggregáció és vvs deformabilitás. Az emberi vér heterogén szuszpenzió, amely különböző méretű és koncentrációjú sejteket tartalmaz. Az érrendszerben történő véráramlás rheologiai jellemzőit ezek a sejtek egymáshoz és az érfalhoz való viszonya határozza meg. A betegségek egy részében a kóros haemorrheologiai tényezők primaer rizikófaktort jelentenek, míg más esetekben a már fennálló helyzetet másodlagos tényezőként tovább súlyosodhat, illetve egyszerre mindkét módon kifejthetik kedvezőtlen hatásukat. Az
78
5. EREDMÉNYEK oxidredukciós folyamatok, valamint azok rendellenességei ismereteink szerint központi szerepet játszanak a vascularis betegségek létrejöttében (Tóth, 2000). A
20.
táblázatban
látható
az
uroporfirinszint
szignifikáns
emelkedését
mindhárom
betegcsoportban. A klinikai remisszióban a porfirin kiválasztás fokozatosan csökken. A porfirinszint változása egyben jó jelzője az ismétlődő phlebotomia hatékonyságának. A 20. táblázatban a többszörösen veszélyeztetett betegek laboratóriumi paramétereit adtuk meg a kontrollcsoporthoz viszonyítva. 20. táblázat: Szérum paraméterek és vizeleturoporfirin-szint phlebotomizált PCT-ban szenvedő betegekben PHLEBOTOMIZÁLT PCT-BAN SZENVEDŐ BETEGEK ÉS A KONTROLL SZÉRUM ÉS VIZELET PARAMÉTEREI ( x ± SD) Paraméterek Kontroll PCT PCT+Alk. PCT+Alk.+DM (n=10) (n=14) (n=11) (n=9) AST (U/l) 29,66±4,96 32,57±13,56 45,89±23,11 * 51,55±15,50 * ALT (U/l) 21,00±7,32 34,14±20,72 44,40±25,11 * 54,33±32,44 * GGT (U/l) 24,00±9,29 43,21±19,34 106,90±63,55 * 162,0±133,9*,# ALP (U/l) 161,8±52,3 205,1±91,1 233,9±84,84 * 258,66±115,47* Kol. (mmol/l) 4,46±1,30 4,58±0,93 4,45±1,91 5,32±1,22 TG (mmol/l) 1,04±0,43 1,19±0,52 1,15±0,67 2,75±2,26 *,#,§ HDL-Kol (mmol/l) 1,39±0,35 1,32±0,45 1,75±0,86 1,33±0,45 LDL-Kol (mmol/l) 2,99±1,06 2,86±0,94 2,74±1,19 2,79±1,19 Víz.UP (nmol/24h) 12,31±2,15 833±197 * 1300±1200 * 1450±1236 * Vas (μmol/l) 20,05±8,99 23,73±9,36 23,34±13,12 23,55±6,51 Transferrin ((g/l) 2,78±0,15 2,64±0,41 2,87±0,64 2,59±0,38 Ferritin (ng/ml) 76,41±13,03 147,94±128,14 226,21±153,46* 365,74±305,91* szignifikáns p<0,05; * vs. kontroll; # PCT csoport vs. PCT+Alk.+DM csoport; § PCT+Alk.+DM csoport vs. PCT+Alk. csoport A ferritinkoncentráció szignifikánsan emelkedett a PCT-ban szenvedő alkoholfüggő és a PCTban szenvedő, alkoholfüggő és 2-es típusú DM csoportokban is. A rheologiai paramétereket a 21. táblázatban mutatjuk be. Megmértük a hematokrit, hemoglobin, plazmafibrinogén-szinteket valamint a vér- és plazmaviszkozitást, vvs filtrabilitást és dugulási rátát.
79
5. EREDMÉNYEK 21. táblázat: Rheologiai paraméterek változásai phlebotomizált PCT-ban szenvedő betegekben PHLEBOTOMIZÁLT PCTBAN SZENVEDŐ BETEGEK ÉS A KONTROLL RHEOLOGIAI PARAMÉTEREI ( x ± SD) Paraméterek
Kontroll (n=10) HCT (%) 44,13±2,39 HGB (g/dl) 15,56±0,98 Vérviszk (mPas) 3,95±0,25 Plazma.viszk (mPas) 1,15±0,12 Tranzit idő (sec) 4,97±0,48 Dugulási ráta (%) 1,21±0,48 Fibrinogén (g/l) 3,02±0,61 szignifikáns p<0,05; * vs. kontroll
PCT PCT+Alk. PCT+Alk.+DM (n=14) (n=11) (n=9) 46,17±4,62 46,63±3,65 46,32±4,32 15,07±1,53 15,93±1,07 15,67±1,32 4,63±0,63 * 4,84±0,68 * 5,09±0,43 * 1,32±0,17 * 1,36±0,21 * 1,41±0,12 * 6,13±1,18 * 6,53±1,13 * 6,54±1,18 * 1,51±0,42 1,47±0,53 1,56±0,39 3,27±0,90 3,21±0,89 3,74±0,85 Vérviszk = vérviszkozitás; Plaza viszk. = plazma viszkozitás
A dugulási ráta értéke nem változott szignifikánsan a kontrollhoz viszonyítva (normálérték 0,53%). A hemoglobin- és fibrinogén-szintek nem változtak szignifikánsan a PCT betegeknél. A vvs.-k
tranzitideje
vérviszkozitása
és
szignifikánsan
emelkedett
plazmaviszkozitása
a
kontrollhoz
szignifikánsan
viszonyítva.
emelkedett
a
A
betegek
kontrollcsoporthoz
viszonyítva (21. tábl.).
5.4. Fémion-koncentráció vizsgálata phlebotomizált porphyria cutanea tardában szenvedő betegekben Az irodalmi leírásokban nem találtunk utalást fémion-koncentráció meghatározására a phlebotomizált PCT-ban szenvedő betegek vérében. Ennek következtében kutatásunk során meghatároztunk 19 fontosabb fémiont a PCT-s betegek véréből. A 22.-24. táblázatok a PCT-s betegek illetve a kontrollcsoport klinikai paramétereit foglalják össze. A legtöbb paraméter között nem találtunk szignifikáns eltérést a kontroll- és a PCT-s betegek csoportjai között. Az UP mennyisége növekedett, a 24 órás UP mennyisége 45 és 500 nmol között mozgott.
80
5. EREDMÉNYEK
22. táblázat: Phlebotomizált PCT-ban szenvedő betegek májparamétereink változásai PHLEBOTOMIZÁLT PCT-BAN SZENVEDŐ BETEGEK MÁJPARAMÉTEREI ( x ±SD) Paraméterek PCT Kontroll (átlag±SD) (n=8) (n=6) AST (U/l) 36,25±16,73 29,66±4,96 ALT (U/l) 36,50±26,54 21,00±7,32 GGT (U/l) 50,50±21,91 24,00±9,26 ALP (U/l) 230,00±101,60 161,83±52,30
23. táblázat: Phlebotomizált PCT-ban szenvedő betegek lipidparaméterei PHLEBOTOMIZÁLT PCT-BAN SZENVEDŐ BETEGEK LIPIDPARAMÉTEREI ( x ±SD) Paraméterek PCT Kontroll (átlag±SD) (n=8) (n=6) Kol. (mmol/l) 4,48±1,04 4,42±0,30 Tg (mmol/l) 1,03±0,44 1,02±0,43 LDL-kol (mmol/l) 2,69±0,82 2,39±0,35 HDL-kol (mmol/l) 1,31±0,54 1,39±0,35 24. táblázat: Phlebotomizált PCT-ban szenvedő betegek vasanyagcsere paraméterei PHLEBOTOMIZÁLT PCT-BAN SZENVEDŐ BETEGEK VASPARAMÉTEREI ( x ±SD) Paraméterek PCT Kontroll (átlag±SD) (n=8) (n=6) HGB (gdl) 15,22±1,77 14,37±26,05 Vas (μmol/l) 27,83±8,06 20,05±8,99 Transferrin (g/l) 2,43±0,31 2,78±0,15 Ferritin (ng/ml) 150,05±123,99 76,41±13,03 Az eredmények összegzése azt mutatta, hogy a vas koncentrációja a szérumban az ALT-val egyetemben szignifikánsan változtak (r=0,84) a phlebotomizált PCT-s betegek körében (p<0,005), ez az eredmény azonban nem volt észlelhető a kontrollcsoportban.
81
5. EREDMÉNYEK A 25-ös táblázat a PCT-ban szenvedő betegek teljes véréből mért fémionjainak eredményeit foglalja össze, a kimutatási határ feltüntetésével. A kimutathatósági határértékek a felhasznált automaták műszerérzékenységétől, a vérminták súlyából, illetve a végtérfogatokból lettek kiszámolva. A Cd, Co, Li, Mo, Ni és V ionok koncentrációja a detektálhatósági limit alatt volt, ezért ezeket nem tüntettem fel a táblázatban. 25. táblázat: Phlebotomizált PCT-ban szenvedő betegek vérének fémion meghatározásai PHLEBOTOMIZÁLT PCT-BAN SZENVEDŐ BETEGEK VÉRÉNEK FÉMION ÉRTÉKEI ( x ±SD) Fémionok Kontroll PCT Kimutatási (μg/g) (n=6) (n=8) határ 0,658±0,313 2,748±1,169 0,1 Al 0,657±0,493 2,402±1,04 * 0,02 B 0,013±0,005 0,108±0,048 * 0,002 Ba 53,64±11,89 66,41±26,79 0,002 Ca 0,738±0,159 0,706±0,130 0,01 Cu 530,4±51,7 483,82±51,18 0,01 Fe 1790±183 1542,74±225,06 0,5 K 41,37±6,15 32,52±5,96 * 0,0025 Mg 0,105±0,071 0,039±0,015 0,005 Mn 2323,00±160,00 2270,01±139,09 0,05 Na 329,60±18,31 297,22±24,48 * 0,25 P 1501±83 1319,70±145,49 * 0,25 S 7,85±0,99 6,79±1,78 0,001 Zn * szignifikáns vs. kontroll A PCT csoportban a vér Ba, Al, B és Ca mennyisége nagyobb volt a kontrollcsoportban talált értékeknél. A PCT betegek B és Al szintjei magasabbak voltak a normálértéknél is. A Mn, Zn, P, Mg, K és S mennyiségei alacsonyabbak voltak a PCT betegek esetében, mint a kontrollcsoportban, illetve mint a megadott normálértékek. A PCT-ban szenvedő betegek vérében mért fémionkoncentrációkat vizsgálva azt találtuk, hogy a csoportok között szignifikáns eltérések voltak (p<0,05) a Ba, B, Mg, P és S esetében. Mivel PCT-ban a fémionok metabolizmusa megváltozik, a különböző fémionok között létező korrelációk is felbomlanak. A kivétel az Al és Mn között létező korreláció (r=0,96 , 0,99) mely a kontrollcsoportban és a phlebotomizált PCT betegcsoportban mérve is megmaradt.
82
5. EREDMÉNYEK A phlebotomizált PCT betegcsoportban, pozitív korrelációt találtunk az Al-Mg (r=0,89), Al-Zn (r=0,77), B-S (r=0,84), Fe-Mg (r=0,79), K-P (r=0,88), Mg-Mn (r=0,87), Mn-Zn (r=0,78), Mg-Zn (r=0,78) fémionok között. A kontrollcsoport esetében, pozitív korrelációt a Ca-Cu (r=0,83), CaNa (r=0,86), Cu-Mg (r=0,90), Fe-K (r=0,85), Na-Mg (r=0,86), Zn-P (r=0,94) között. A 26-os táblázat a klinikai kép alapján csoportosított betegek laboratóriumi paramétereit foglalja össze. 26. táblázat: Szérum és vizelet paraméterek vizsgálata phlebotomizált PCT-ban szenvedő betegekben PHLEBOTOMIZÁLT PCT-BAN SZENVEDŐ FÉRFIBETEGEK SZÉRUM ÉS VIZELET PARAMÉTEREI (P<0,05) ( x ±SD) Paraméterek Kontroll PCT PCT+Alk. PCT+Alk.+DM (átlag±SD (n=10) (n=7) (n=10) (n=6) AST (U/I) 24,20±8,02 26,71±12,47 67,70±45,72*; ** 56,17±16,89* ** ALT (U/I) 19,00±6,16 24,00±12,12 55,40±25,28*; ** 66,67±28,46*; ** GGT (U/I) 22,30±7,37 38,71±23,84 100,20±66,6* ** 187,0±108,1 *;** KOL (mmol/l) 4,91±0,90 4,52±1,25 4,56±1,07 5,38±1,48 TG (mmol/l) 1,37±0,30 1,02±0,44 1,19±0,48 2,10±1,09 **; *** LDL-kol (mmol/l) 2,50±1,02 2,90±1,07 2,70±0,85 2,87±1,29 HDL-kol (mmol/l) 1,35±0,27 1,16±0,12 1,29±0,49 1,56±0,52 ALB (g/l) 47,50±2,80 40,71±6,67 * 39,60±4,19 * 41,67±5,82 * HS (µmol/l) 247,50±53,42 300,28±82,40 301,60±40,63 * 283,50±70,69 Vas (µmol) 19,03±6,97 24,26±7,73 24,91±9,06 25,96±5,05 Transferrin (g/l) 2,68±0,19 2,49±0,37 2,63±0,41 2,80±0,53 Ferritin (ng/ml) 76,41±13,03 81,43±40,89 182,85±136,05 * 203,19±67,24* ** Glükóz (mmol/l) 4,54±0,40 5,37±0,81 * 5,09± 0,96 9,05±3,3* ** *** CRP (mg/l) 1,23±0,49 2,46±2,61 1,85±1,56 1,22±0,49 VizeletUP(mmol/l) 9,62±4,53 518,14±348,1 * 1375,53±449,79* 641,67±183,59 * Szignifikáns p<0,05; * vs. kontroll; ** vs. PCT; *** vs. PCT+Alk. Szignifikánsan
magas
uroporfirin
koncentrációk
voltak
kimutathatók
mindhárom
betegcsoportban. Az AST, ALT és GGT koncentrációk szignifikánsan magasabbak voltak az alkoholfüggő
és
a
2-es
típusú
diabetes
mellitus, alkoholfüggő
PCT-ban
szenvedő
betegcsoportokban a kontrollcsoporthoz képest. Az ALB koncentrációja szignifikánsan kisebb volt az összes PCT csoportban. A HS koncentrációja szignifikánsan nagyobb volt az alkoholt fogyasztó PCT betegek körében.
83
5. EREDMÉNYEK Az alkoholt fogyasztó, illetve az alkoholt fogyasztó és diabéteszben szenvedő PCT betegek szignifikánsan magasabb ferritin-szintet mutattak a kontrollcsoporthoz képest. A glükóz koncentrációja szignifikánsan nagyobb volt a PCT és a PCT, + alkoholt fogyasztó és 2es típusú DM csoportokban. 27. táblázat: Plazma és vvs paraméterek változásai phlebotomizált PCT-ban szenvedő betegekben PHLEBOTOMIZÁLT PCT-BAN SZENVEDŐ FÉRFIBETEGEK PLAZMA ÉS VVS PARAMÉTEREI ( x ±SD) Paraméterek Kontroll PCT PCT+Alk. PCT+Alk.+DM (átlag±SD) (n=10) (n=7) (n=10) (n=6) HGB (g/dl) 15,44±0,99 15,06±1,70 15,95±1,21 15,63±1,63 HbA1c (%) 5,70±0,29 5,94±0,11 6,01±0,41 7,40±1,83 * H-donor (%) 60,62±1,98 49,30±8,55 * 54,60±9,10 52,88±9,70 * PRP (mmol/leqAS) 1,19±0,15 1,23±0,31 1,22±0,29 1,28±0,17 SH-csoport(mmol/l) 0,85±0,07 0,67±0,21 * 0,43±0,12*,** 0,57±0,19 * Pl.kem. (RLU%) 2,00±1,27 15,13±2,74 * 11,14±10,78 15,18±3,29 * VVS.kem. (RLU%) 48,09±22,69 64,89±21,30* 68,84±13,93* 67,95±21,68 * VVS. SOD 12,83±1,05 9,30±1,91 8,96±0,56 9,06±0,84 (megközelítő érték) VVS. GSH-Px 419,92±66,18 255,05±54,25 236,40±57,59 217,69±53,69 (megközelítő érték) Szignifikancia (p<0,05): * vs. kontroll, ** vs. PCT A 27-es táblázat a plazma és vvs paramétereit foglalja össze, illetve olyan nem specifikus paramétereket, melyek a plazma redox homeostasisát jellemzik a PCT betegek körében. A HGB koncentrációk között nem volt észlelhető különbség a különböző betegcsoportok között. A HbA1c szignifikánsan nagyobb volt a PCT-ban szenvedő, alkoholfüggő és DM csoportban. Az összes betegben szignifikánsan kisebb volt a plazmában mért szabad–SH csoport a kontrollcsoporthoz képest. A nem specifikus plazma redukálóképesség nem mutatott szignifikáns eltérést a PCT betegek plazmájában mérve a kontrollokhoz viszonyítva. A plazma H-donor aktivitása csökkent a PCT-s betegek körében. Az alkoholfüggő PCT csoportban a csökkenés nem volt szignifikáns, míg a PCT és PCT+alkoholt fogyasztó-2-es típusú DM csoportokban a csökkenés szignifikánsnak bizonyult.
84
5. EREDMÉNYEK A plazma redukálóképességében nem észleltünk különbségeket. A plazma és a vvs-k kemilumineszcencia intenzitása szignifikánsan magasabb volt mindhárom PCT-s betegcsoportokban a kontrollcsoporthoz képest. A SOD és a GSH-Px koncentrációk alacsonyabbak voltak mindhárom PCT betegcsoportban a kontrollcsoporthoz képest. A PCT alkoholfüggő és 2-es típusú diabetes mellitusban szenvedő betegekben szignifikánsan alacsonyabb volt a GSH-Px antioxidáns enzim értéke. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a PCT betegek antioxidáns státusza gyengült. A fémionok koncentrációját mutatjuk be a három PCT-s csoportban. (28. táblázat). 28. táblázat: Phlebotomizált PCT-ban szenvedő betegek teljes vérének fémion paraméterei PHLEBOTOMIZÁLT PORPHYRIA CUTANEA TARDA FÉRFIBETEGEK TELJESVÉRÉNEK FÉMION KONCENTRÁCIÓJA ( x ±SD) FÉMIONOK KONTROLLOK
PCT
(átlag±SD) (n=10) (n=6) 0,674±0,213 0,788±0,295 Cu 504,8±63,2 454,2±63,6 Fe 1820±308 1520±207 * K 37,27±7,51 30,87±4,16 Mg 0,099±0,112 0,014±0,021 Mn 329,6±17,9 302,6±42,7 P 1501±83 1350±211 S 7,415±1,189 6,297±1,447 Zn Szignifikáns p<0,05 * vs. Kontroll;
PCT+ALK
PCT+ALK+DM
(n=6) 0,792±0,198 548,2±135 1755±273 33,13±5,74 0,033±0,052 327,7±39,4 1323±227 * 6,599±1,413
(n=6) 0,751±0,135 527,4±230 1810±527 29,88±2,98 * 0,022±0,030 309,78±38,48 1446±310 4,954±1,424 *
A vas és a Cu koncentrációja nem mutatott szignifikáns eltéréseket a phlebotomizált csoportok között. A K, Mg, Mn, P, S és Zn koncentrációi azonban, alacsonyabbak voltak az összes PCT-s betegcsoportban, de az eltérések zöme nem volt szignifikáns ( 28. táblázat) A PCT-ban szenvedő betegek K koncentrációja, a PCT-ban szenvedő és alkoholfüggő betegcsoport S koncentrációja és a PCT-ban szenvedő, alkoholfüggő és 2-es típusú DM betegcsoport Zn koncentrációja szignifikánsan kisebb volt a kontroll- csoporttal szemben (p≤0,05).
85
5. EREDMÉNYEK 5.5 Antioxidáns terápia 5.5.1. Alfa-liponsav hatásának vizsgálata porphyria cutanea tardában. Az alfa-liponsav hatékonyságát sokoldalú vizsgálatokkal támasztották alá. Az alfa-liponsav hatékonyságát szabadgyökfogó aktivitása, antioxidáns hatása magyarázza (Han, 1995; Somogyi, 1994; Dudka, 2006). Ennek eredményeként az anyagcserefolyamatok újra normális mederbe terelődhet, javulnak a patológiás laboratóriumi májfunkciók értékei (AST, ALT, GGT), csökken a vizeleturoporfirin-szint és javulnak a redox-paraméterek. A vizsgálat során a 600 mg-os kiszerelésű ThiogammaR tablettát használtunk. Az alfa-liponsav optimális napi dózisában és alkalmazásának módjában (iv. vagy per os) még nincs egységes álláspont (Keresztes, 2000). A betegek (n=19) közül 5 beteg alkoholfüggő volt (szérumalkohol-szint = 6,53±2,92 mg/dl) és a szérum GGT szint szignifikánsan magasabb volt a PCT-s alkoholfüggő betegcsoportban mint a kontrollcsoportban. A porphyria cutanea tarda mellett 5 beteg 2-es típusú diabetes mellitusban szenvedett és alkoholfüggő is volt. A vizsgálatnak az volt a célja, hogy megállapítsuk, hogy a többszörösen hátrányos PCT-ban szenvedő betegek kiegészítő terápiája milyen mértékű javulást eredményezhet a csak PCT-s betegekhez viszonyítva. A vizsgált betegek és a kontrollszemélyek legfontosabb klinikai és alapvető laboratóriumi adatait táblázatokban, ábrákban tüntettem fel. A vizelettel ürülő összporfirin koncentráció és ebből az uroporfirin koncentráció a porphyria cutanea tarda betegség súlyosságának jó markere. Az UROD enzim gátlása annál nagyobb minél magasabb a porfirinszint a beteg szervezetében (28. ábra).
86
5. EREDMÉNYEK 28. ábra: Vizeleturoporfirin méréseknek változása
Mindhárom betegcsoportban az alfa-liponsav kezelés hatására csökkent a vizeleturoporfirin koncentráció, de a változás nem volt szignifikáns. A 29. ábra a szérumvas felhalmozódást mutatja PCT-ban. 29. ábra: Vasanyagcsere paraméterek PCT-ban szenvedő betegekben
87
5. EREDMÉNYEK A szérumvas koncentráció alfa-liponsav-kezelés után nem szignifikánsan, de alacsonyabbak voltak, mint a kezelés előtti középérték mindhárom betegcsoportban. Az alkoholos májbetegség patogenezisében a megnőtt szérumvas-koncentráció a ferritin-szint emelkedéséhez vezet a porphyria cutanea tarda betegekben (30. ábra).
30. ábra: Szérumferritin koncentráció változása PCT-ban szenvedő betegekben
Az ábra a szérumferritin eredmények változását mutatja PCT-ban szenvedő betegekben alfaliponsav kezelés hatására. A szérumferritin-szint növekedése felhívja a figyelmet további vizsgálat szükségességére. Az eltérések nem voltak szignifikánsak.
88
5. EREDMÉNYEK 31. ábra: Vércukorszint vizsgálata PCT-ban szenvedő betegekben
A vércukorszint alfa-liponsav kezelésére nem szignifikáns csökkenést mutat. Mindhárom kezelt csoportban mérsékelt javulást eredményez.
32. ábra: HbA1c értékek PCT-ban szenvedő betegekben
89
5. EREDMÉNYEK A kezelés eredményeként mindhárom betegcsoportban nem szignifikánsan csökkentek a HbA1c értékei (32. ábra), de a 2-es típusú diabetes és alkoholfüggő PCT-ban szenvedő betegcsoportban nagy volt a szórás. A lipidanyagcsere paramétereinek értékeiben nem találtunk szignifikáns eltérést a liponsav kezelés hatására (29. táblázat). 29. táblázat: Lipidparaméterek phlebotomizált PCT-ban szenvedő betegekben PHLEBOTOMIZÁLT PCT BETEGEK LIPIDPARAMÉTEREI ALFA-LIPONSAV KEZELÉS HATÁSÁRA ( x ±SD) PCT PCT PCT+Alk. PCT+Alk. PCT+Alk+ PCT+Alk+ Paraméterek k.e. k.u. k.e. k.u. DM DM x ±SD (n=9) (n=5) (n=5) (n=9) k.e. k.u. (n=5) (n=5) 4,59±1,10 4,84±1,13 3,85±0,77 4,03±0,90 4,80±1,33 4,72±1,07 Koleszterin (3,2-5,2 mmol/l)
Triglicerid
1,02±0,45
1,33±0,69
1,00±0,33
1,05±0,27
1,02±0,55
1,88±1,31
1,28±0,50
1,26±0,45
1,06±0,17
1,01±0,18
1,44±0,60
1,40±0,47
2,85±0,92
2,97±1,02
2,34±0,64
2,54±0,75
2,39±0,98
2,46±0,80
(0,6-2,3 mmol/l)
HDL-kol. (1,4-3,0 mmol/l)
LDL-kol. (< 2,6 mmol/l)
A porphyria cutanea tarda és alkoholfüggő betegek csoportjában a HDL-koleszterin koncentrációk voltak a legkisebbek a normáltartomány alsó határértékeihez hasonlítva, de az eltérés nem volt szignifikáns. 30. táblázat: Májenzim értékek phlebotomizált PCT-ban szenvedő betegekben PHLEBOTOMIZÁLT PCT BETEGEK MÁJENZIMPARAMÉTEREI ALFA-LIPONSAV KEZELÉS HATÁSÁRA ( x ±SD) Paraméterek PCT PCT PCT+Alk. PCT+Alk. PCT+Alk+ PCT+Alk+ k.e. k.u. k.e. k.u. DM DM x ±SD (n=9) (n=9) (n=5) (n=5) k.e. k.u. (n=5) (n=5) 34,44±16,62 31,25±9,46 49,0±34,69 32,66±9,5 51,0±12,51 53,4±12,28 AST (U/I) (n.é.<38)
ALT (U/I)
37,66±24,56 30,50±12,46
36,0±28,0
24,66±15,8
61,8±41,61
60,6±37,72
(n.é.<41)
GGT (U/I)
48,33±21,11 43,33±18,92 76,0±36,92 59,5±43,98 169,0±117,9* 137,0±82,95*
(n.é.8-61)
szignifikáns p<0,05 *vs PCT kezelés előtt és PCT kezelés után
90
5. EREDMÉNYEK
Májenzimértékek mindhárom betegcsoportban enyhe javulást mutattak (30. táblázat). Az alkoholfüggők és diabeteses porphyria cutanea tardában szenvedő betegcsoportokban a kezelés előtt mért paraméterek a normálérték felsőhatára felett helyezkedtek el, míg az alfa-liponsavas kezelés eredményeként a májenzim-paraméterek értékei javulást tükröztek. Szignifikáns eltérés csak a 2-es típusú DM-ban is szenvedő PCT-s alkoholfüggő betegekben volt kimutatható. 31. táblázat: Redox-homeostasis paraméterek vizsgálata PHLEBOTOMIZÁLT PCT-BAN SZENVEDŐ BETEGEK PLAZMA- ÉS VVSPARAMÉTEREI ALFA-LIPONSAV KEZELÉS HATÁSÁRA ( x ±SD) PARAMÉTEREK KONTROLLOK PCT PCT (átlag±SD) (n=10) kezelés előtt kezelés után (n=9) (n=9) PL SH (mmol/l) 0,85±0,07 0,45±0,10 * 0,34±0,07* PRP (mmol/leqAS) 1,19±0,15 1,28±0,20 1,18±0,23 PLHDON gátlás (%) 60,62±1,98 52,78±12,0 50,20±4,3 * PL.KEM. (RLU%) 2,00±1,27 6,82±1,0 * 5,43±0,86 *;** VVS KEM. (RLU%) 48,09±22,69 65,29±19,9 61,26±23,4 VVS. SOD (megközelítő érték) 12,83±1,05 8,029±0,17 * 7,65±0,83* VVS. GSH-Px (megközelítő é.) 419,.92±66,18 314,75±85,07* 260,45±63,81* Szignifikáns p<0.05 * vs kontroll, ** vs. PCT kezelés előtt; 32. táblázat: Plazma- és vvs- paraméterek változása phlebotomizált PCT-ban szenvedő betegekben PHLEBOTOMIZÁLT PCT-BAN SZENVEDŐ BETEGEK PLAZMA- ÉS VVSPARAMÉTEREI ALFA-LIPONSAV KEZELÉS HATÁSÁRA ( x ±SD) PARAMÉTEREK KONTROLLOK PCT+ALK PCT+ALK (átlag±SD) (n=10) kezelés előtt kezelés után (n=5) (n=5) PL SH (mmol/l) 0,85±0,07 0,47±0,10* 0,31±0,09*;** PRP (mmol/leqAS) 1,19±0,15 1,13±0,18 1,14±0,12 PLHDON gátlás (%) 60,62±1,98 51,99±3,5 42,25±24,1 * PL.KEM.. (RLU%) 2,00±1,27 14,86±0,10 * 4,0±0,24*;** VVS-KEM. RLU%) 48,09±22,69 73,93±11,3 * 63,23±9,77 VVS.SOD(megközelítő érték) 12,83±1,05 7,99±0,12 6,83±4,58 * VVS. GSH-Px (megközelítő é.) 419,.92±66,18 259,78±78,29* 310,06±78,52* Szignifikáns p<0.05 * vs kontroll, ** vs. PCT kezelés előtt;
91
5. EREDMÉNYEK
33. táblázat: Phlebotomizált porphyria cutanea tardában szenvedő betegek plazma- és vvsparaméterei PHLEBOTOMIZÁLT PCT-BAN SZENVEDŐ BETEGEK PLAZMA ÉS VVS PARAMÉTEREI ALFA-LIPONSAV KEZELÉS HATÁSÁRA ( x ±SD) PARAMÉTEREK (átlag±SD)
KONTROLLOK
PCT+ALK+DM PCT+ALK+DM kezelés előtt kezelés után (n=5) (n=5) PL SH (mmol/l) 0,85±0,07 0,48±0,24 * 0,26±0,09 * PRP (mmol/leqAS) 1,19±0,15 1,31±0,16 1,22±0,27 PLHDON (%) 60,62±1,98 51,97±10,56 * 51,6±6,45 * PL.KEM. (RLU%) 2,00±1,27 13,55±5,17 4,58±3,11*; ** VVS KEM. (RLU%) 48,09±22,69 67,94±21,67 67,9±17,2 12,83±1,05 7,08±0,10 6,43±0,57 VVS. SOD (megközelítő érték) 419,.92±66,18 285,86±78,76 * 290,38±68,12 * VVS. GSH-Px (megközelítő é) Szignifikáns p<0.05 * vs kontroll, ** vs. PCT+ALK+DM kezelés előtt; (n=10)
A plazma szabad SH-csoport koncentráció az alkoholfüggő porphyria cutanea tarda csoportban szignifikánsan csökkent a kezelés előtti értékhez viszonyítva (32. táblázat). Az alfa-liponsav diszulfidkötéseket tartalmaz, amelyek reagálnak a szabad SH-csoportokkal és ez által az alfaliponsav csökkenteni képes e csoportoknak a számát (Dudka, 2006). A plazma-kemilumineszcencia vizsgálatnál mindhárom betegcsoportban a kezelés előtti értékek szignifikánsan nagyobbak a kezelés utáni és a kontrollcsoport értékekeihez viszonyítva. Megállapíthatjuk, hogy a kezelés kezdetén mért magas kemilumineszcenciás értékek az összscavenger kapacitás gyengülésére utalnak. Az alfa-liponsav-terápia javította a betegek összscavenger kapacitását, bár a változás nem volt szignifikáns. A szuperoxid dizmutáz és glutation peroxidáz antioxidánsok értékei szignifikánsan kisebbek voltak a kontrollcsoport értékeihez viszonyítva és nem változtak kedvezően a kezelés befejezésekor sem.
92
5. EREDMÉNYEK 34. táblázat: Fémionok vizsgálata phlebotomizált PCT-ban szenvedő betegekben PHLEBOTOMIZÁLT PCT-BAN SZENVEDŐ BETEGEK TELJES-VÉRÉNEK FÉMION KONCENTRÁCIÓJA ALFA-LIPONSAV KEZELÉS HATÁSÁRA (p<0,05) ( x ±SD) FÉMION
(átlag±SD)
KONTROLLOK (n=6)
Cu (μg/g) 0,738±0,159 Fe (μg/g) 530,4±51,7 Zn (μg/g) 7,85±0,99 Mg (μg/g) 41,37±6,15 K (μg/g) 1790±183 S (μg/g) 1501±83 P (μg/g) 329,6±18,30 Se (pg/g) 83,31±11,71 Szignifikáns p<0,05 * vs. kontroll
PCT
PCT
kezelés előtt (n=9) 0,63±0,27 402,4±67,0 * 4,55±1,74 * 31,14±2,76 * 1656±210 1516±293 336,1±4,9 63,78±60,35
kezelés után (n=9) 0,60±0,20 358,5±54,7 * 4,26±1,13 * 26,99±7,71 * 1309±336* 1332±313 238,4±87,1* 99,33±48,88
Porphyria cutanea tardában szenvedő betegek teljes véréből a Zn, Mg és Fe fémionoknál szignifikánsan alacsonyabb értékeket mértünk a kontrollcsoport értékeihez viszonyítva. A Cu-ion koncentrációja nem szignifikánsan, de alacsonyabb volt a kontrollhoz képest (34. táblázat). A magnézium koncentráció a PCT betegcsoportban a kezelés után is szignifikánsan kisebb volt a kontrollcsoporthoz hasonlítva. A kezelés után a betegcsoportban még szignifikánsan kisebb értéket mértünk a kálium, foszfor cink és vas esetében a kontrollhoz képest. 35. táblázat: Fémionok vizsgálata alkoholfüggő PCT-ban szenvedő betegben PHLEBOTOMIZÁLT PCT-BAN SZENVEDŐ BETEGEK TELJES VÉRÉNEK FÉMION KONCENTRÁCIÓJA ALFA-LIPONSAV KEZELÉS HATÁSÁRA (p<0,05) ( x ±SD) FÉMION
KONTROLLOK (n=6)
PCT+ALK
kezelés előtt (n=9) Cu (μg/g) 0,738±0,159 0,69±0,17 Fe (μg/g) 530,4±51,7 471,0±86,8 Zn (μg/g) 7,85±0,99 6,35±0,14 * Mg (μg/g) 41,37±6,15 31,17±2,78 * K (μg/g) 1790±183 1803±173 S (μg/g) 1501±83 1474±50 P (μg/g) 329,6±18,30 351,1±29,2 Se (pg/g) 83,31±11,71 22,05±14,74 * Szignifikáns p<0,05 * vs kontroll; ** vs PCT+ALK kezelés előtt (átlag±SD)
93
PCT+ALK
kezelés után (n=9) 0,73±0,08 372,5±34,7** 3,50±1,26** 34,15±5,15 * 1488±37 *; ** 1417±63 * 259,7±32,1*;** 85,93±64,46 **
5. EREDMÉNYEK
Az alkoholfüggő PCT-s betegek alfa-liponsav-kezelés után mért Fe és Zn értékei szignifikánsan alacsonyabbak a kezelés előtt kapott értékekhez viszonyítva (35. táblázat). Szignifikánsan alacsonyabb értékeket kaptunk a K és P fémionoknál is a kezelés után. 36. táblázat: Fémionok vizsgálata 2-es típusú DM-ban is szenvedő és alkoholfüggő PCT-ban szenvedő betegekben PHLEBOTOMIZÁLT PCT-BAN SZENVEDŐ BETEGEK TELJES VÉRÉNEK FÉMION KONCENTRÁCIÓJA ALFA-LIPONSAV KEZELÉS HATÁSÁRA (p<0,05) ( x ±SD) FÉMION
(átlag±SD)
KONTROLLOK (n=6)
PCT+ALK+DM
PCT+ALK+DM
kezelés előtt kezelés után (n=5) (n=5) Cu (μg/g) 0,738±0,159 0,82±0,17 0,67±0,05 Fe (μg/g) 530,4±51,7 393,9±66,6 * 363,6±31,8 * Zn (μg/g) 7,85±0,99 4,53±1,55 * 5,10±0,96 * Mg (μg/g) 41,37±6,15 30,24±5,06 * 29,36±4,26 K (μg/g) 1790±183 1617±143 1473±144 * S (μg/g) 1501±83 1623±242 1393±112 P (μg/g) 329,6±18,30 270,6±127,5 211,5±49,8 * Se (pg/g) 83,31±11,71 34,72±20,85 * 92,50±26,68 ** Szignifikáns p<0,05 * vs kontroll; ** vs PCT+ALK kezelés előtt A Fe, Zn fémionok esetében a kontrollhoz viszonyítva szignifikánsan alacsony értékeket kaptunk mind a kezelés előtt, mind a kezelés után. Az alfa-liponsav-kezelés nem változtatta meg szignifikánsan a legtöbb fémion koncentrációt a betegekben (36. táblázat). A szelén koncentráció szignifikánsan emelkedett a betegek vérében az alfa-liponsav kezelés hatására. Lin és csoportja a fémionok
vizsgálatakor
májcirrhozisban
és
hepatocelluláris
karcinomában
emelkedett
koncentrációt mértek a Se, Fe, Cu és Zn elemek esetében. Azt találták, hogy a Cu:Zn arány fokozottan növekedett vírusos májkárosodásban (Lin, 2006). Mivel az alfa-liponsav-kezelés nem váltotta be a hozzáfüzött reményeket, a betegek redoxhomeostasisának javítása érdekében és a klinikai tünetek mérséklésére E-vitamin-kezelést terveztünk. 5.5.2. E-vitamin-kezelés hatásának vizsgálata porphyria cutanea tardában A tanulmányok sora számol be a megromlott antioxidáns státuszról (Adjarov, 2001; Rocchi, 1995) és a növekvő lipid peroxidációról (Rocchi, 1999) porphyria cutanea tardában szenvedő 94
5. EREDMÉNYEK betegekben.. Feltételezésünk szerint az E-vitamin és phlebotomia hatásosabb módszer az oxidatív stressz kivédésére szemben az önállóan alkalmazott phlebotomiával. 2003. áprilisától a MÁV Kórház és Központi Rendelőintézet Budapest, I. Belgyógyászat Porphyria részlegén 23 kezelt porphyria cutanea tardában (PCT) szenvedő beteget vizsgáltunk meg 4 hónap időtartam alatt. A betegek átlag életkora 60±9,7 év. A kontrollcsoport átlagéletkora 56±4,5 év. A 23 betegből 10 (43%) rendszeresen fogyaszt alkoholt megközelítőleg, 3-5 dl bort/nap vagy 5-10 dl sört/nap fogyasztottak alkoholos italt. Ezek a betegek közül egyiknek sem volt hepatitis C vírusfertőzése. A betegek diagnózisa plazma-, vizelet- és székletporfirin meghatározások eredményeinek értékelésével történt. A PCT-ban szenvedő betegek nem álltak hormonkezelés alatt, nem szedtek rendszeresen vitamin- vagy antioxidáns hatású készítményeket, nem-szteroid gyulladásgátló vagy thrombocytaaggregációt-gátló szereket. A dohányzók száma hasonló volt a csoportok között, és a vizsgálat reggelén nem dohányoztak. A kontrollcsoportban nem vontunk be diabetes mellitusban, veseműködési zavarban, daganatos megbetegedésben, magas vérnyomásban és lipidanyagcsere zavarban szenvedő egyéneket. A vizsgálat során a betegek napi egy kapszula (tocopherolum aceticum 200 mg) E-vitamint kaptak. Bár a phlebotomiával kezelt PCT-s betegek körében, az uroporfirin koncentrációja körülbelül a tizede volt a phlebotomiával nem kezelt betegekéhez képest, az uroporfirin excréciója a vizeletben a csak phlebotomiával kezelt betegek körében még mindig szignifikánsan magasabb volt (p<0,005) a kontrollcsoportéhoz képest. A phlebotomizált betegek körében alkalmazott E-vitaminkezelés tovább csökkentette, szignifikánsan (p<0,005) az uroporfirinek koncentrációját. (33. ábra) 33. ábra: Vizelet uroporfirin vizsgálata PCT-ban szenvedő betegekben
95
5. EREDMÉNYEK Nem volt szignifikáns eltérés a szérumvas, transferrin- és ferritin-mennyiségek között a három vizsgált csoportban, bár a ferritin mennyisége kissé magasabb volt a PCT-s betegek körében, a kontrollcsoporthoz képest (37. Táblázat). A különböző vizsgált csoportok eredményeit összehasonlítva, nem volt észlelhető különbség a vércukorszint, szérumkoleszterin, HDL-, LDL-koleszterin és triglicerid-szintek között. A szérumlipidek meghatározása azért szükséges, mert ezek koncentrációja befolyásolhatja a rheologiai paramétereket (Mózsik, 1992). A vércukorszint meghatározása, pedig azért, mert a hexaklórbenzollal kezelt patkányokban, alacsony vércukorszint volt kimutatható (Mazzetti, 2004) és ezt emberben is vizsgálni kivántuk. 37. táblázat: Rutin laboratóriumi mérések E-vitamin kezelt PCT-ban szenvedő betegekben Szérumban és vérben mért rutin laboratóriumi paraméterek PCT-ban szenvedő betegekben E-vitamin kezelés hatására ( x ±SD) Paraméterek Kontroll PCT PCT-E (n= 10) (n=23) (n=23) 21,61+8,13 25,16+8,39 19,03+6,97 Vas (μmol) 2,68+0,19 2,37+0,23 2,5+0,31 Transzferrin (g/l) 76,41+13,03 133,36+123,72 125,75+55,79* Ferritin (ng/ml) 4,54+0,4 5,69+1,03 5,35+0,55 Vércukor (mmol/l) 4,8+1,04 4,67+1,07 4,91+0,9 Koleszterin (mmol/l) 1,37+0,3 1,18+0,53 1,27+0,75 Trigliceridek (mmol/l) 1,35+0,27 1,.42+0,59 1,79+0,52 HDL-koleszterin (mmol/l) 2,5+1,02 2,84+1,01 2,31+1,17 LDL-koleszterin (mmol/l) 1,.23+0,49 5,43+3,33* 2,26+1,71 CRP (mg/l) 24,2+8,02 39,6+15,53* 25,25+9,27 AST (U/l) 19,0+6,16 38,8+19,63* 27,75+9,79* ALT (U/l) 22,3+7,37 47,1+21,39* 36,63+22,37 GGT (U/l) 194,7+58,15 256,7+101,28 204,75+71,11 ALP (U/l) (PCT= phlebotomiával kezelt PCT-ban szenvedő betegek, PCT-E= phlebotomiával és azután Evitaminnal kezelt PCT-ban szenvedő betegek, * szignifikáns különbségek (p<0.05) vs. Kontroll). A CRP szignifikánsan magasabb értékeket mutatott a csak phlebotomiával kezelt PCT-s betegek körében, a kontrollcsoporthoz képest. Az E-vitamin-kezelés csökkentette a CRP szinteket, bár ez a csökkenés nem bizonyult szignifikánsnak.
96
5. EREDMÉNYEK A májenzimek koncentrációja szignifikánsan magasabbnak bizonyult a csak phlebotomiával kezelt PCT-s betegek körében (AST p=0,009, ALT p=0,013, GGT p=0,017) a kontrollcsoporthoz viszonyítva. Az ALP szintjében nem volt érzékelhető különbség a csoportok között. Az emelkedett májenzim koncentrációt, az E-vitamin-kezelés csökkentette, de a csökkenés csak ALT értékében volt szignifikáns (37. táblázat). A szérum TBARS-szint magasabbnak bizonyult a csak phlebotomiával kezelt betegek körében (p=0,0001), a kontrollcsoporthoz viszonyítva. A magas TBARS-szintek azonban szignifikánsan csökkentek az E-vitamin-kezelés következtében (p<0,005) (38. Táblázat). 38. táblázat: Oxidatív stressz paraméterek és vitamin-szintek PCT-ban szenvedő betegekben
Oxidatív paraméterek és vitamin szintek PCT-ban szenvedő betegekben E-vitamin kezelés hatására ( x ±SD) Paraméterek Kontroll PCT PCT-E (n=10) (n=23) (n=23) 48,69+7,33* 25,75+10,21** 23,38+10,34 TBARS (μmol/l) 60,62+1,98 44,17+4,08* 63,59+4,12** H-donor-aktivítás (%) 0,41+0,07* 0,47+0,11* 0,85+0,07 SH-csoport (mmol/l) 419,92+66,18 299,9+84,55* 300,82+52,52* Eritrocita GSH-PX (megközelítő érték) 26,99+8,22 31,96+17,59 28,55+1,38 E-vitamin (μmol/l) 2,08+0,7 2,32+1,0 1,95+0,08 A-vitamin (μmol/l) (PCT= phlebotomiával kezelt PCT-ban szenvedő betegek, PCT-E= phlebotomiával és azután Evitaminnal kezelt PCT-ban szenvedő betegek, * szignifikáns (p<0.05) vs. control, ** szignifikáns (p<0.05) vs. PCT). A plazma H-donor aktivitása, a szabad SH-csoport koncentrációja és az eritrociták GSH-Px aktivitása szignifikánsan csökkent a csak phlebotomiával kezelt betegek körében, a kontrollcsoporthoz képest (p=0,0001, p<0,005, és p=0,0004). Az E-vitaminkezelés szignifikánsan növelte, a H-donor aktivitást (p<0,005) és emelte a plazmában található szabad SH-csoport koncentrációját. Nem befolyásolta azonban a GSH-Px aktivitását a csak phlebotomiával kezelt betegekhez képest.
97
5. EREDMÉNYEK A vizsgált csoportok körében nem volt kimutatható szignifikáns eltérés a szérum A és E vitaminok koncentrációja között, bár mindkét vitamin koncentrációja emelkedett az E- vitamin kezelést is kapott betegcsoportban. Mind a teljes vér, mind pedig a plazma esetében magasabb viszkozitást mértünk a csak phlebotomiával kezelt betegek körében (p<0,005, p=0,0003). Az E-vitaminkezelés nem befolyásolta a növekedett viszkozitás értékeket. (39. Táblázat). 39. táblázat: Haemorrheologiai értékek PCT-ban szenvedő betegekben Haemorrheologiai értékek PCT-ban szenvedő betegekben E-vitamin kezelés hatására ( x ±SD) Paraméterek Kontroll PCT (n=10) (n=23) 4,93+0,43* 4,21+0,38 Vérviszkozitás (mPas) 1,18+0,12 1,36+0,1* Plazma viszkozitás (mPas) 5,57+0,87 6,21+0,78 Tranzit idő (sec) 1,19+0,32 1,41+0,53 Dugulási ráta (%) 15,44+0,99 14,78+1,87 Hemoglobin (g/dl)
PCT-E (n=23) 4,34+0,43 1,35+0,05* 6,92+0,52* 1,39+0,29 14,00+1,46
(PCT= phlebotomiával kezelt PCT-ban szenvedő betegek, PCT-E= phlebotomiával és azután Evitaminnal kezelt PCT-ban szenvedő betegek, * szignifikáns (p<0.05) vs. kontroll). A tranzitidő és a dugulási ráta növekedett ugyan, a csak phlebotomiával kezelt betegek körében, ez a növekedés azonban nem bizonyult szignifikánsnak. Ez az eredmény azt mutatja, hogy az eritrociták deformabilitása nem csökkent szignifikánsan. Az E-vitamin-kezelés nem befolyásolta az eritrocták deformabilitását a csak phlebotomiával kezelt betegekével összehasonlítva, mégis, a tranzit idő növekedése szignifikánssá vált (p<0,005) az E vitaminnal kezeltek körében, a kontrollcsoporthoz képest. Klinikai kép Phlebotomiával kezelt PCT-ban szenvedő betegek, remisszióban voltak az alap vizsgálatok elvégzésekor, mégis, ez idő alatt, magas faktorú napvédő krém használata volt szükséges a bőrtünetek megelőzése céljából. 98
5. EREDMÉNYEK Az E-vitamin-kezelés hatására, ezek a betegek elhagyhatták a napvédő krémek használatát, a bőrtünetek kiújulása nélkül. 3 beteg a 23-ból (13%) képes volt napfürdőzni körülbelül 1 órát naponta, klinikai relapszus nélkül.
99
6. MEGBESZÉLÉS 6. MEGBESZÉLÉS Hazánkban a porphyria cutanea tarda előfordulása megközelítő felmérések szerint 1:5000, a nemek közti arány 4:1 a férfiak és a nők között. A PCT krónikus lefolyású megbetegedés, jelenleg nincs oki terápiája. Kezelés nélkül spontán nem gyógyul meg, bár előfordulhat, hogy a provokáló tényezők eliminálása klinikai tünetmentességet eredményez (Horkay, 2003). Porphyria cutanea tardában szenvedő betegek májenzim paramétereinek szignifikáns pozitív korrelációja a szérumvas és szérumtranszferrin koncentrációval arra enged következtetni, hogy a nagy mennyiségű vaslerakódás a befolyásolja az enzimparaméterek romlását a hepatocitákban és ez indítja el a szabadgyökös folyamatokat (Alla, 2006). Klinikai adatok bizonyítják, hogy a vasszintek csökkentése ismételt vérlebocsátások útján, átmenetileg javulást eredményez. A kezelés alatt a szérumvas és ferritinérték csökkenése mellett, az uroporfirinürítés is fokozatosan csökken, és így a kezelés hatásossága a vizelet-uroporfirin méréssel követhető. Normalizálódik a széklettel történő uroporfirin és heptakarboxilporfirin ürítés is, de az izokoproporfirin ürítés általában változatlan marad. 6.1. Enzimdefektusok és haemochromatosis pontmutációk PCT-ban A PCT patomechanizmusa még ma sem teljesen tisztázott. Biztos, hogy több endogén és exogén tényező együttes hatása szükséges az UROD defektusának kialakulásához. A kutatások legutóbbi eredményei a CYP1A2 polimorfizmusának jelentőségére hívták fel a figyelmet. Az összefüggést a CYP1A2 polimorfizmusa és a PCT-re való hajlam között számos betegen igazolták (Dereure, 2004; Nichols, 2003). Sporadikus PCT-ban szenvedő betegekben gyakori a herediter haemochromatosis gén mutációja is (Fodinger, 1999), de még nem ismert, hogy a H63D mutáció a C282Y hiányában milyen veszélyeztetettséget jelent az öröklődő haemochromatosis és porphyria cutanea tarda szempontjából. A normál, vasterhelést nem mutató populáció mintegy egyötöde H63Dheterozigóta. Saját betegeinkben H63D mutáció prevalencia magasnak bizonyult, és ez a HFE gén H63D pontmutációjának patogenetikai szerepére utal. A vas toxikus hatása okozza a kóros szabad gyökök jelenlétét a májban, módosítja a lipidek oxidatív státuszát a keringésben és közrejátszik az endothel károsodásában (Késmárky, 2001). A
100
6. MEGBESZÉLÉS kardiovaszkuláris betegség előfordulása mégsem gyakoribb a PCT-ban szenvedő betegekben, mint az egészséges populációban, de természetesen ezek a betegek magas rizikófaktorral élnek. Az alkoholfogyasztás, vírusinfekciók, hepatotoxikus kemikáliák, májsziderózis, ösztrogének és a drogélvezet indukálják a P450 izoenzimeket és így szintén hozzájárulnak a PCT klinikai manifesztációjához (Hindmars, 1999; Tavazzi, 2002). 6.2. Redox-homeostázis porphyria cutanea tardában Kutatásunkban arra is választ kerestünk, hogy az észlelt változások önmagában a porphyria cutanea tarda következményei-e, vagy a társbetegségek, mint az alkoholizmus és diabetes mellitus felelősek érte. Számunkra kedvezőnek bizonyult ez a csoportosítás azért is, mert választ vártunk arra a kérdésre, hogy az oxidatív stressz valóban túlnyomórészt a porphyria cutanea tarda következménye-e? A sporadikus porphyria cutanea tarda kialakulásában fontos szerepet játszanak egyes ágensek, mint például a vasfelhalmozódás, az alkohol, gyógyszerek (antikoncipiensek), diabetes, vírusfertőzések (HCV, HIV) és mások (Székely, 2002). Az oxigén gyökök az intracelluláris jelátvitelben másodlagos messengerként szerepelnek, és a sejtnek citotoxikus ágensei. A májban a kataláz, glutation peroxidáz, glutation-S-transzferáz szuperoxid dizmutáz biztosítják a megfelelő védelmet a vas és porfirin hatására keletkezett szabadgyökök befogásában (Dursum, 2005; Alla, 2005). A lipidperoxidáció iniciálásában és fokozódásában különösen alkoholfogyasztás mellett a vas, fontos szerepet tölt be, így, központi szerepe van a szöveti nekrózisban. A glutation véd az oxidatív károsodás ellen, azonban alkoholfüggőkben a glutation depléció jelentős (38. táblázat). Az alkoholfüggő betegekben az E- és C-vitamin-szintek nagyon alacsonyak, ezáltal kérdéses az oxidált glutation regenerációja (Horváth, 2001; Székely, 2003). A megnövekedett szabadgyök-koncentráció és a megváltozott antioxidáns védelem megromlott májfunkcióval jár (Horváth, 1992). A vasmetabolizmus megváltozása mellett az albuminszekréció és a glikoproteinszintézis megváltozása is megfigyelhető az alkoholizmusban. Ezek a változások lipoproteinémiát okoznak. A membránok károsodása és a kollagénszintézis aktivációja fibrosishoz vezet. A NADH koncentráció növekedése, a mitokondriumok károsodása az ATP szintjének csökkenését okozza (Lieber, 1997).
101
6. MEGBESZÉLÉS A PCT-ban szenvedő betegek redox-homeostasisát vizsgálva megállapítottuk, hogy ez a betegség súlyosságával arányosan változott. A betegek antioxidáns státuszát a szabad-SH csoportok, a Hdonor aktivitás és a plazma-redukálóképesség mérésével határoztuk meg. A szabad-SH csoportok csökkenése a glutation depléciónak tulajdonítható (Yilmaz, 2006). A vizsgált PCT-ban szenvedő betegekben a szabad-SH csoport szignifikánsan alacsonyabb szintet mutatott a kontrollcsoporttal szemben (23. ábra) (16 és 19 táblázatok). A kissé növekedett plazma-redukálóképesség az alkoholmetabolizmusból eredő redukáló ekvivalensek, a magas NADH/NAD arány eredménye. A redukálóképesség kisebb értékeket mutatott a phlebotomia utáni betegek csoportjában a kontrollcsoporthoz viszonyítva. A H-donor aktivitás lényeges eltérést nem jelzett a betegekben az egészségesek értékeihez viszonyítva (16. és 19. táblázatok). A betegek össz-scavenger kapacitása a plazmában szignifikánsan, míg a vvs-össz-scavenger kapacitás, nem szignifikánsan ugyan, de alacsonyabb szintet mutatott a kontrollcsoporthoz viszonyítva (16.-19. táblázatok) és (26. 27. ábrák). Megmértük a betegek enzimatikus antioxidáns védelmét biztosító két fontos enzim a SOD és a GSH-Px aktivitásokat. A két enzim aktivitása, a PCT betegcsoportokban alacsonyabbnak bizonyul, a kontrollcsoporthoz képest (27. táblázat). A malondialdehid-koncentráció mérésével a lipidperoxidáció folyamatok felerősödését igazoltuk (38. táblázat). A vérlebocsátás után nem javultak szignifikánsan a redoxi-paraméterek. A nagymennyiségben felhalmozódott porfirin a phlebotomia-kezeléssel nem tudott teljes mennyiségben ürülni a szervezetből, így, a beindult lipidperoxidációs folyamatok sem csökkentek kellő ütemben. A peroxidációs reakciók semlegesítésére nem volt kellő mennyiségű scavenger kapacitás. 6.3. Haemorrheologiai viszonyok porphyria cutanea tardában A redoxi-paraméterek változása szoros korrelációban van a haemorrheologiai paraméterek változásával. Kutatásaink során megállapítottuk, hogy a PCT-ban szenvedő betegek csökkenő antioxidáns aktivitása a kóros viszkozitással ellentétesen változott. Az emelkedett hematokrit érték valamint az erek falán lerakódott lipidanyagcsere termékek okozzák a teljes vér- és plazmaviszkozitás
növekedését
(Rosenson,
1990;
To-Figueras,
2003).
A
növekvő
vasfelhalmozódással nő a vérviszkozitás és csökken az össz-scavenger kapacitás, amit a vvs-ek 102
6. MEGBESZÉLÉS növekvő luminometriás intenzitása mutat. A vérviszkozitás változása függött a betegség súlyosságától, és a vvs-ek deformabilitásától. A plazmaviszkozitás növekedéséhez a fokozott lipidperoxidáció is hozzájárul (Székely, 2006). Vizsgálataink során azt tapasztaltuk, hogy a porphyria cutanea tardában szenvedő betegekben gyakoriak a kóros haemorrheologiai paraméterek. Ismert tény, hogy az alkoholfüggő betegekben a haemorrheologiai rizikófaktorok szintje kifejezetten emelkedett. (Krivosheev, 1994; Trapani, 1996). Ezért vizsgáltunk olyan betegcsoportokat is, ahol a porphyria cutanea tarda mellett diabetes mellitus és/vagy alkoholfüggőség is fennállott. Eredményeink alapján megállapítható, hogy a kóros haemorrheologiai paraméterek kialakulásában legfontosabb szerepe a porphyria cutanea tardának van. Megfigyeléseink egyben rámutatnak arra, hogy a PCT kezelése nemcsak a bőrtünetek miatt fontos, hanem a predisponáló tényezők, - az uroporfirinogéndekarboxiláz enzim müködését gátló tényezők – eliminálásával a haemorrheologiai paraméterek normalizálhatók, s ezzel a késői szövődmények, vasculáris betegségek megelőzhetők. 6.4 . Fémionok szerepe a PCT-ban A PCT-ban szenvedő betegekben a szöveti magas vasszintek kapcsolatban vannak más fémek metabolizmusával, ezért a vér vasszintjében bekövetkező változás módosíthatja más fémelemek szintjét is. A fémek számos protein enzimaktivitásához szükségesek. A magnézium 360 enzimet aktivál; foszfotranszferázokat, acetiltranszferázokat. A Zn több mint 300 enzim alkotója. A vas protoporfirin-IX-el alkotott stabil komplexe a hem. Az emberi szervezet vaskészletének 65%-át a vvs-k alkotják. Hemvasat tartalmaznak a monooxigenázok, az oxidázok, a peroxidázok, a kataláz és a citokrómok (Sigel, 1998). A vas fontos komponense az izom-, és vérfestékanyagnak, míg a réz 60-65%-a a cöruloplazminban található. A nehézfémtartalmú katalizátorok fontos szerepet töltenek be az oxigén-felvételben. A PCT-ban szenvedő betegek vérmintájából 19 elem koncentrációját
határoztuk
meg.
Összehasonlítva
a
kontrollértékekkel
ezen
elemek
koncentrációja közül csak K, S, Zn volt szignifikánsan alacsonyabb a PCT egyes formáiban (25. és 28. táblák). A Cu, Zn, Fe, Mn mind a szabadgyök-képzés, mind az antioxidáns védelem fontos elemei. A Zn és a Cu ionok az oxidatív stresszel szemben védelmet biztosítanak (Isik, 2005), fontos alkotói a szuperoxid-dizmutáznak. A Cu-ion, többek között, a komplement C aktiválódásában játszik szerepet. A Zn több mint 300 enzim kofaktora és részt vesz a legfontosabb életfolyamatokban.
103
6. MEGBESZÉLÉS IBD betegek vérének vizsgálatában, azt találták, egyes esetekben, táplálék kiegészítő szedése mellett, a Zn koncentrációja növekedett, illetve a teljesvérben mért Zn a vassal szignifikáns negatív korrelációt mutatott (Szentmihályi, 2000; Blázovics, 2004). Ezzel ellentétben a PCT betegek teljes vérében mért Zn koncentráció alacsonyabbnak bizonyult a kontrollcsoportéhoz képest (Székely, 2006). Az antioxidáns védelmi rendszert, melyet a H-donor aktivitás, redukálóképesség, és összscavenger kapacitás segítségével monitorizáltunk, elégtelen volt egyes PCT formákban (16.-19. táblák). Az Al és B koncentrációi relatív nagyobbak PCT-ban, a kontrollcsoport-értékeihez, és a normálértékekhez képest (25. táblázat). A Ba koncentrációja emelkedetebb volt a PCT-s betegcsoportban, mint a kontrollcsoportban, a mért eredmények a normáltartományba estek. Mind a kontroll-, mind pedig a phlebotomizált betegcsoport esetében szoros korrelációkat találtunk az Al és Mn között (r=0,96; 0,99). Hasonló, megváltozott korrelációk a fémionok között, más betegségek esetében is észlelhetők. Például az IBD-ben, ahol teljesen más pozitív korrelációk mutathatók ki mint például Al-Cu, vagy Fe-Cu között. A két betegség közötti hasonlóság az Al-Zn, illetve az Fe-Mg között mérhető pozitív korrelációban található (Szentmihályi, 2004). Bár a klinikai eredmények alapján a phlebotomia megfelelő kezelésnek bizonyult PCT-ban szenvedő betegek esetében, az eljárás nem változtatta meg kedvezően a fémionok mennyiségét a betegek vérében. A Zn kisebb koncentrációja, illetve a vér Mg, S, és P szignifikánsan alacsonyabb értékei is hozzájárulhattak bőrtünetek kialakulásához ( 25.táblázat). A különböző eredetű károsodások után a regenerálódó májsejteknek nagy mennyiségű Zn-re van szükségük rövid idő leforgása alatt. A megnövekedett szükséglet a Zn és Cu hordozó fehérje, a metallothionein indukálásával jár, a károsodás elszenvedése utáni első lépésben. Különböző vizsgálatok szerint Zn-transzfer következik be a metallothioneinről, különböző metalloenzimekre és transzkripciós faktorokra (Cherian, 2006). Különböző kutatócsoportok igazoltak májregeneráció-zavart a metallothionein-knockout egerekben. Több bizonyíték is arra utal, hogy az metallothioneinnek lényeges funkciója van a májsejt regenerációban (Cherian, 2006).
104
6. MEGBESZÉLÉS 6.5 Az antioxidáns kiegészítő kezelés porphyria cutanea tardában Miután az oxidatív stressznek, a PCT patomechanizmusában jelentős szerepe van, és ezt saját megfigyeléseink is bizonyították, arra a meggondolásra jutottunk, hogy a phlebotomiával is kezelt betegekben, antioxidáns védelmet is biztosítsunk, antioxidáns hatású vitaminokkal. E célból alfa-liponsavat és E-vitamint alkalmaztunk. Az alfa-liponsav a piruvátdehidrogenáz enzimkomplex kofaktora, és jelentős antioxidáns tulajdonsággal rendelkezik. Oxidált és redukált formája egyaránt scavenger tulajdonságú. Prooxidáns tulajdonsága stimulálja az inzulin-szignál kaszkádot, és ez által növeli a glükózfelvételt az izmokba. Másoldalról az alfa-liponsav védi az inzulin-szignál kaszkádot az oxidatív stressztől. Az alfa-liponsav gátolja a hepatikus gliconeogenezist és gátolja a lipidek oxidációját, ezáltal növelve a perifériás glükózfelhasználást (Konrad, 2005). Az alfa-liponsav-kezelés azonban nem váltotta be azt a reményt, amit az irodalom alapján vártunk. Bár csökkent a szabadgyök-szint a betegek vvs-ében, de az antioxidáns védelmi rendszer aktivitása inkább visszaszorult (Székely, 2005). Ugyanakkor, az irodalmi adatoknak megfelelően, a mi kutatásunkban is csökkent az alfa-liponsav-kezelés után mért szérumglükóz-szint és a HbA1c koncentrációja (31. táblázat, 31. 32. ábrák). A PCT-s betegek antioxidáns védelmének erősítésére E-vitamin kiegészítő terápiát alkalmaztunk. Az E-vitamin-kezelés jótékony hatásáról ellentmondásos eredmények olvashatók az irodalomban. Vannak szerzők (Pinelli, 2002; Murty, 1969; Nair, 1971; Nair, 1972; Ayres, 1978), akik azt találták, hogy az E-vitamin-kezelés csökkentette az uroporfirin értékeket, illetve mérsékelte a klinikai tüneteket (Székely, 2006). Watson és kutatócsoportja azonban ezt nem erősítette meg, ők E-vitamin-kezelés hatására nem észleltek változást az uroporfirin exkrécióban (Watson, 1973). Egyetlen egereken végzett állatkísérlet (Horváth, 2001) célozta meg az E-vitamin-kezelés hatását mind a porfirin-szintekre, mind pedig az oxidatív stressz paramétereire (33. ábra, 37. és 38. táblázatok). Ebben a vizsgálatban, a hexachlorobenzollal és vassal indukált hepatikus porfiriás egérmodellen (a modell hasonlít a humán sporadikus PCT-re), az E-vitamin-kezelés csökkentette az oxidatív stresszt és a hepatikus összporfirin-szintet. Saját kutatási eredményeink is ezt támasztják alá (38. táblázat).
105
6. MEGBESZÉLÉS A phlebotomiát kísérő E-vitamin-kezelés másik előnye, a bőrtünetekre való jótékony hatás lehet. A tünetek melyek a fototoxikus mechanizmus útján jelentkeznek, mérséklődnek a kezelés hatására. E-vitamint tartalmazó antioxidánsok kombinációja meggátolta a porfirin indukálta phototoxicitást humán fibroblasztokban (Böhm, 2001). A phlebotomia magában is jó kezelési módszernek bizonyult a phototoxikus bőrtünetek kezelésében. A beavatkozás eltávolítja a vasat, így csökken a szabadgyök reakciók mértéke. Az addicionális E-vitamin-kezelés még hatékonyabbá teheti a kezelést a szabadgyökök direkt megkötésével. Az E-vitamin adásának szükségességét alátámasztja az a tény, hogy az általunk vizsgált betegek, az E-vitamin-kezelés alatt elhagyhatták a magas faktorú napvédő krémek használatát, melyek egyébként szükségesek voltak a klinikai relapszus megelőzése céljából, a phlebotomia után is. A kezelés kapcsán megállapítható volt, hogy az E-vitamin nem tudta normalizálni a vizelet uroporfirin koncentrációját (33. ábra), a májfunkciót vizsgáló laborparamétereket ( 37. táblázat), az oxidatív stressz mutatóit (38. táblázat), és a haemorrheologiai paramétereket sem (39. táblázat). További vizsgálatok szükségesek hosszabb ideig tartó E-vitamin-kezeléssel és esetleges nagyobb dózisú E-vitaminnal, hogy megállapítsuk, hogy a phlebotomia után remisszióban lévő PCT betegek E-vitamin-kezelése képes-e a komplett biokémiai remisszió elérésére, - újabb relapsus megakadályozására. Az E-vitamin-kezelés rövidnek bizonyult a haemorrheologiai viszonyok jelentős javulása szempontjából. Ennek okát a vvs-k hosszabb életidejével magyarázzuk. Feltételezzük, hogy az Evitamin-kezelés azért nem változtatta meg szignifikánsan a viszkozitás-paramétereket, mert a kezelés az oxidatív stressz kialakulását követően kezdődött.
106
7. TÉZISEK, KÖVETKEZTETÉSEK 7. TÉZISEK, KÖVETKEZTETÉSEK 1.
Megállapítottuk, hogy sporadikus PCT-ban az oxidatív stressz fontos szerepet játszik a betegség patogenezisében.
2.
PCT-ban szignifikánsan csökken az antioxidáns védelem.
3.
A haemorrheologiai paraméterek változása PCT-ban szenvedő betegekben szoros korrelációban van a redoxi-paraméterek változásával.
4.
Az alkoholfüggő és 2-es típusú diabetes mellitusban szenvedő PCT betegek redoxiparaméterei a legrosszabbak.
5.
A phlebotomia hatékony kezelésnek bizonyult a klinikai kémiai paramétereket vizsgálva, de nem javította a redox-homeostasist.
6.
A phlebotomizált PCT-s betegek Zn, Se, Mg, Fe, S és P ion koncentrációja szignifikánsan eltér az egészségesektől.
7.
Az alfa-liponsav-kezelés nem javította sem a redox-homeostasist, sem a cutan tüneteket.
8.
Az alfa-liponsav kezelés tovább csökkentette a Zn, Mg, S, P és Cu koncentrációkat, de a kontroll értékeket nem érte el. A Se koncentráció a kontrollértéket elérte a kezelést követően.
9.
Phlebotomiát követő E-vitamin-kezelés javította a cutan tüneteket és tovább csökkentette a vizelet uroporfirin koncentrációját. A változás szignifikáns volt.
10. Az E-vitamin-kezelés kedvezően befolyásolta a nem specifikus redox-paraméterek
értékeit, azonban nem javult a GSH-Px enzimaktivitás a betegekben phlebotomia és Evitamin együttes alkalmazása után sem. 11.
Az E-vitamin-kezelés hatására nem javultak a haemorrheologiai paraméterek.
107
8. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
8. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Doktori értekezésem a Semmelweis Egyetem, Budapest, Doktori Iskola 2/1. sz. Ph.D. programjában készült. Hálával tartozom a program vezetőjének, Prof. Dr. Fehér János egyetemi tanárnak a tudományos munkánál, valamint az értekezés elkészítésénél nyújtott értékes tanácsaiért, útmutatásaiért. Köszönöm Prof. Dr. Tulassay Zsolt egyetemi tanárnak, a Semmelweis Egyetem II. Belgyógyászati Klinika igazgatójának, hogy kutatásaimat támogatta. A dolgozat elkészülésében felbecsülhetetlen érdemei vannak Dr. Blázovics Annának, az orvostudományok kandidátusának, a Semmelweis Egyetem, Budapest, ll. Belgyógyászati Klinika Biokémiai Kutatócsoportja vezetőjének. Őszinte és fáradhatatlan segítségéért, hasznos tanácsaiért, a tudományos életben való eligazodást segítő irányításáért kifejezhetetlen hálával tartozom. Nagy hálával tartozom Dr. Szentmihályi Klárának, a Magyar Tudományos Akadémia Kémiai Kutatóintézete tudományos csoportvezetőjének a fémion-mérésében nyújtott segítségéért, a hasznos tanácsokért, amelyeket a mérési eredmények pontos feldolgozásában, kiértékelésében adott. Köszönetemet fejezem ki Dr. Tasnádi Gyöngyi főorvosnak, hogy lehetőséget adott a betegcsoport megfigyelésére, a vizsgálatok elvégzésére és hasznos tanácsokkal látott el a betegek bemutatása során. Köszönöm, hogy támogatta munkám végzését és a dolgozat elkészítését. Köszönetemet fejezem ki Prof. Dr. Gachályi Béla Ph.D tudományos igazgatónak a doktori iskola elvégzéséhez nyújtott tanácsaiért, segítségéért. Köszönöm Dr. Várnai Katalin főorvosnőnek, hogy megteremtette a lehetőséget a klinikai kémiai vizsgálatok elvégzéséhez. Hálával tartozom Dr. Szűcs Mária főorvosnak és a MÁV Kórház Laboratóriuma munkatársainak a klinikai kémiai vizsgálatok elvégzésében nyújtott segítségért. Dr. Bor Márta adjunktusnak köszönöm a szakirodalom feldolgozásához nyújtott segítségét és a szakmai konzultációkat. Dr. Batke Józsefnek, a biológia tudományok doktorának az együttműködést a HPLC székletporfirin meghatározásokban és a leletek feldolgozásában.
108
8. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Hálás köszönetemet fejezem ki Bárkovits Saroltának és Pintér Edinának a Semmelweis Egyetem, Budapest, II. Belgyógyászati Klinika Biokémiai Kutatólaboratóriuma asszisztenseinek a szabadgyök-vizsgálatok terén nyújtott segítségükért, Tamonné Péter Valériának, az Országos Porphyria Központ asszisztensének a betegek vérvételénél nyújtott segítségeit. Továbbá köszönöm Bíró Erzsébetnek, a Magyar Tudományos Akadémia Kémiai Kutatóintézete munkatársának a fémion-minták meghatározásában nyújtott segítségét.. Köszönettel és rendkívüli hálával tartozom Dr. Lugasi Andrea Ph.D c. egyetemi docensnek, az Országos Élelmezés- és Táplálkozástudományi Intézet Élelmiszerkémiai Analitika Főosztálya munkatársának, aki az E- és A-vitamin valamint, a malondialdehid mérések elvégzését lehetővé tette és hasznos tanácsokkal segítette munkámat. Köszönöm baráti jóindulatát és türelmét. Köszönöm Rapavi Erika PhD hallgatónak a közreműködését a vizsgálatok elvégzésében. Őszinte köszönetemet fejezem ki Pallai Zsoltnak és Kurucz Tímeának, akik a SOD, GSH-Px valamint epesav mérések elvégzésénél segédkeztek. Dr. Lónyai Péternek, a BIOEXTRA Kft. Igazgatójának ezúton fejezem ki köszönetemet az Evitaminnal végzett kísérlethez szükséges vitamin biztosításáért. Hálámat fejezem ki Dr. Mlinkó Évának a WÖRWAG PHARMA munkatársának az alfaliponsav kísérlethez felhasznált gyógyszerért. Köszönettel tartozom Dr. Somogyi Anikó docensnek, az orvostudomány kandidátusának a diabetes mellitus kutatás terén adott szakmai tanácsokért. Köszönettel tartozom Dr. Andrikovics Hajnalka Ph.D és Dr. Tordai Attila Ph.D munkatársaknak a Molekuláris genetikai vizsgálatok elvégzéséért. Dr. Hagymási Krisztina Ph.D klinikai orvosnak az értekezés elkészítéséhez nyújtott tanácsaiért. Dr. Dinya Elek kandidátusnak köszönetemet fejezem ki a statisztikai feldolgozásban nyújtott segítségéért. Köszönetemet fejezem ki Dr Ambrus Szilárdnak, a helyes szakmai nyelvezet alkalmazásához nyújtott segítségéért. Hálámat fejezem ki Hován Lászlóné könyvtárosnak, a sok tudományos cikk beszerzéséért. Végül, de nem utolsó sorban, hálás vagyok férjemnek, gyerekeimnek, szüleimnek valamint barátaimnak a képzésem és tudományos munkám kivitelezése, a dolgozat elkészítése alatt nyújtott támogatásukért, megértésükért, bátorításukért.
109
8. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS A dolgozat elkészítéséhez az ETT 002/2003 Tárcaszintű Kutatási Támogatás, a NKFP-1/016, NKFP-1B 047/2004 és NKFP-1/A/005/2004 biztosítottak anyagi lehetőséget.
110
9. IRODALOMJEGYZÉK 9. IRODALOMJEGYZÉK 1. Abate C., Patel L., Rauscher IFJ., Curran T. Redox regulation of Fos and Jun DNA: binding
activity in vitro. Science. 1990; 249: 1157–61. 2. Adams PC. Prevalence of abnormal iron studies in heterozygotes forhereditary
hemochromatosis: an analysis of 255 heterozygotes. Am J Hematol. 1994, 45(2): 146-9. 3. Adjarov D., Ribarova F., Koytcheva N., Shiskov S., Ivanova A., Antonov K. Impaired
antioxidant status in porphyria cutanea tarda. Acta Med Bulg 2001; 28: 135-43 4. Afanas'ev IB. Free radical mechanisms of aging processes under physiological conditions. Biogerontology. 2005, 6(4): 283-90. 5. Alla V., Bonkovsky HL. Iron in nonhemochromatotic liver disorders. Semin Liver Dis. 2005, 25(4): 461-72. 6. Andrikovics H. és mtsai. Új molekuláris genetikai módszer az öröklődő haemochromatosis
differenciáldiagnosztikájában. Orv. Hetil. 1999, 140: 2517-2522. 7. Auwerx J. PPAR-γ, the ultimate thrifty gene. Diabetol. 1999, 42: 1033-1049. 8. Azzi A. The role of alfa–tocopherol in preventing disease, Eur J Nutrition. 2004a; 43: Suppl. 1, 118-85. 9. Azzi A, Stocker A. Vitamin E: non-antioxidant roles. Prog Lipid Res. 2000; 39: 231-35. 10. Azzi A, Gysin R, Kempná P, et al. Regulation of gene ecpression by alpha tocoppherol. Biol Chem. 2004b; 385: 585-61. 11. Ayres S Jr, Mihan R. Porphyria cutanea tarda: response to vitamin E. A review and two case
reports. Cutis 1978, 22: 50-52. 12. Barroso J., Gurnell M., Crowley VE., Agostini M., Schwabe JW., Soos MA., Marlen GL., Williams TD., Levis H., Schafer AS., Chatterje VK., O’Rahilly S. Dominant negative
mutations in human PPAR-γ associated with severe insulin resistance, diabetes mellitus and hypertension. Nature. 1999, 402: 880-883. 13. Baynes JW. Role of oxidative stress in development of complications in diabetes. Diabetes 1991, 40(4): 405-412. 14. Blázovics A. Oxidativ stressz és májbetegség. Orvosi Hetilap 2004, (38) 1937-1942. 15. Blázovics A., Fehér J. Az oxidativ stressz és a máj. Medicina Könyvkiadó Rt. Budapest 2001, 62-63.
111
9. IRODALOMJEGYZÉK 16. Blázovics A. A zsírmáj biokémiája. Folia Hepatologica 1999, 4: 9-18. 17. Blázovics A., Szentmihályi K., Vinkler P., Kovács Á. Zn overdose may cause disturbance in
the iron metabolism. Trace Elements and Electrolytes 2004, 21, 4, 240-247. 18. Blázovics A., Hagymási K., Prónai L. Citokinek, prosztaglandinok, nutritív és nem nutritív
faktorok gyulladásos bélbetegségekben. Orvosi Hetilap 2004, (50): 2523-2529. 19. Blázovics A., Lugasi A., Hagymási K, Szentmihályi K., Kéry A. Natural antioxidants and
tissue regeneration; Curative effet and reaction mechanism, In: Sigh E, and Govil JN Eds. Phytochemistry and Pharmacology II. SCI TECH Publishing LLC, Texas, USA. 2002b; 8: 93-34. 20. Blois MS Antioxidant determination by the use of a stable free radicals. Nature 1958, 4617: 1198-2000. 21. Bonkovsky HL. Iron and the liver. Am J Med Sci. 1991, 301(1): 32-43. 22. Bonkovsky HL., Lambrecht RW., Shan Y. Iron as a co-morbid factor in nonhemochromatic
liver disease. Alcohol, 2003, 30: 137-144. 23. Böhm F, Edge R, Foley S, Lange L, Truscott TG. Antioxidant inhibition of porfirin-induced
cellular phototoxicity. J Photochem Photobiol 2001; 177-83 24. Bulaj ZJ., Griffen LM., Jorde LB., Edwards CQ., Kushner JP. Clinical and biochemical
abnormalities in people heterozygous for hemochromatosis. N Engl J Med. 1996, 335(24): 1799-805. 25. Bulaj ZJ., Phillips JD., Ajioka RS., Franklin MR., Griffen LM., Guinee DJ., Edwards CQ., Kushner JP. Hemochromatosis genes and other factors contributing to the pathogenesis of
porphyria cutanea tarda. Blood, 2000, 95 (5): 1565-1571. 26. Bucher T., Redetzki H.: Eine Spezifische Photometrische betimmung von thylalkohoul auf
Fermentativem Wege. Klin. Wochenschr. 1951, 29: 615-620. 27. Budihardjo I, Oliver H, Lutter M, Luo X, Wang X. Biochemical pathways of caspase
activation during apoptosis. Annu Rev Cell Dev Biol. 1999; 15: 269-90. 28. Bygum A, Christiansen L, Petersen NE, Horder M, Thomsen K, Brandrup F. Familial and
sporadic porphyria cutanea tarda: clinical, biochemical and genetic features with emphasis on iron status. Acta Derm Venereol. 2003, 83(2):115-120. 29. Cadenas E. Mitochondrial free radical production and cell signaling. Mol Aspects Med. 2004, 25: 17-26.
112
9. IRODALOMJEGYZÉK 30. Castro GD., de Castro CR., Maciel ME., Fanelli SL., de Ferreyra EC., Gomez MI., Castro JA.
Ethanol-induced oxidative stress and acetaldehyde formation in rat mammary tissue: Potential factors involved in alcohol drinking promotion of breast cancer. Toxicology. 2005 Dec 22; [Epub ahead of print 31. Cherian MG., Kang YJ. Metallothionein and liver cell regeneration. Exp Biol Med (Maywood). 2006, 231 (2):138-44. 32. Chien S., Dormandy J., Ernst E. and Mátrai A. Clinical Hemorheology. Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht, 1987. 33. D'Alessandro Gandolfo L., Griso D., Macri A., Biolcati G., Barlattani A., Topi GC. Iron and
porphyria cutanea tarda. Cel. and mol. Biol. 1997, 43 (1): 75-79. 34. Dabrowska E., JabLonska-Kaszewska I., Lukasiak J., Dorosz A., Falkiewicz B.
Abnormalities in serum copper and iron concentrations in porphyria cutanea tarda patients and their relationships with other parameters. BioFactors, 2000, 11: 135-137. 35. Dabrowska E., Jablonska-Kaszewska I., Lukasiak J., Dorosz A.,; Falkiewicz B. Serum iron
and copper and their relations to hepatocellular carcinoma in porphyria cutanea tarda and hemochromatosis patients--case report. BioFactors, 2000, 11: 131-134. 36. Daecon A.C., ElderG.H.. Front line tests for the investigation of suspected porphyria .J. Clin. Pathol. 2001, 54: 500-507. 37. Das KC. c-Jun NH2-terminal kinase-mediated redox-dependent degradation of IκB: role of
thioredoxin in NF-κB activation. J Biol Chem. 2001; 276: 4662-70. 38. Deng Y., Ren X., Yang L., Lin Y., Wu X. A JNK-dependent pathway is required for TNFα-
induced apoptosis. Cell. 2003, 115: 61-70. 39. Debets FMH., Hamers WJHMB., Strik JJTWA. Metabolism as a prerequisite for the
porfirinogenic
action
of
polyhalogenic
aromatics,
with
special
reference
to
hexachlorobenzene and polybrominated biphenyls. Int J Biochem 1980; 12: 1019-25 40. Dereure O., Aguilar-Martinez P., Bessis D., Blanc F., Larrey D., Guillot B., Schved JF., Guilhou JJ. No significant association between CYP1A2 polymorphism and porphyria
cutanea tarda .Acta Derm Venereol. 2004, 84(3): 254-5. 41. Dinkova-Kostova AT, Holtzclaw WD, Wakabayashi N. Keap1, the sensor for electrophiles
and oxidants that regulates the phase 2 response, is a zinc metalloprotein. Biochemistry. 2005; 44: 6889-99.
113
9. IRODALOMJEGYZÉK 42. Dinya M, Székely E, Szentmihályi K, Tasnádi Gy, Blázovics A. Element analysis in the total
blood of the phlebotomised patients with porphyria cutanea tarda. Trace Elem in Med and Biol 2005, 19: 217-220. 43. Dorman RB., Wunder C., Saba H., Shoemaker JL., Macmillan-Crow LA., Brock RW.
NAD(P)H oxidase contributes to the progression of remote hepatic parenchymal injury and endothelial disfunction, but not mocrovascular perfusion defici. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2005, [Epub ahead of print] 44. Dormandy J, Flute P., Mátrai A., Bogár L., and Mikita J. The new St. George’s Blood
Filtrometer; Clinical Hemorheology, 1985, 5: 975-983. 45. Dormandy JA. Red Cell Deformability and Filterability. Martinus Nijhoff Publisher, Boston, 1983. 46. Doss M., Von Tiepermann R., Schneider J., Schmid H. New type of hepatic porphyria with
porphobilinogen synthase defect and intermittent acute clinical manifestation. Klin. Wochenschr. 1979, 57: 1123-1127. 47. Doss MO., Kuhnel A., Gross U. Alcohol and porfirin metabolism. Clin. Biochem. 2000, 35: 109-125. 48. Doss MO., Kühnel A., Gross U. Alcohol and porfirin metabolism. Alcohol Alcohol. 2000, 35: 109-125. 49. Doss MO., Kuhnel A., Gross U., Sieg I. Hepatic porphyrias and alcohol.Medizinische Klinik. 1999, 94 (6): 314-328. 50. Doss MO., Sassa S. The porphyrias. In: Noe DA., Rock RC., editors. Laboratory medicine.
The selection and interpretation of clinical laboratory studies. Baltimore MD.: Williams & Wilkins 1994, 535-55. 51. Dudka J. Decrease in NADPH-Cytochrome P450 Reductase Activity of the Human Heart,
Liver and Lungs in the Presence of Alfa-Lipoic Acid. Ann Nutr Metab. 2006 Jan, 50(2): 121125. [Epub ahead of print] 52. Dursun E., Dursun B., Suleymanlar G., Ozben T. Effect of haemodialysis on the oxidative
stress and antioxidants in diabetes mellitus Acta Diabetol. 2005, 42(3): 123-8. 53. Earnshaw WC., Martins LM., Kaufmann SH. Mammalian caspases: structure, activation,
substrates and functions during apoptosis. AR Biochem. 1999, 68: 383-24. 54. Elder GH., Alcohol intake and porphyria cutanea tarda. Clin. Dermat. 1999, 17: 431-436.
114
9. IRODALOMJEGYZÉK 55. Elder GH. Metabolic abnormalities in the porphyrias. In: Mascaro JM. Editor. Seminars in dermatology. Orlanddo FL.: Grune & Stratton. 1986, 88-98. 56. Elder GH. Update on enzyme and molecular defects in porphyria. Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. 1998, 14: 66-69. 57. Elder G.H., Urquhart A.J., De Salamanca R. Immunoreactive uroporfirinogen decarboxylase in the liver in porphyria cutanea tarda. Lancet.1985, 229-232. 58. Feder JN., Gnirke A., Thomas W. és mtsai, A novel MHC class I-like gene is mutated in
patients with hereditary haemochromatosis. Nat. Genet. 1996, 13: 399-408. 59. Fehér J., Vereckei A. Szabadgyök reakciók jelentősége az orvostudományban. Medicina. Biogál, Budapest, 1985. 60. Fehér J., Lengyel G., Blázovics A. Antioxidánsok, nyomelemek a betegségek megelőzésében. Magyar Sporttudományi Szemle. 2002, 2: 32-36 61. Fehér J., Lengyel G. A new approach to drug therapy in non-alcoholic steatohepatitis (NASH). J. Int. Med. Res. 2003, 31: 537-551. 62. Fehér J., Blázovics A., Gonzales-Cabello R., Horváth MÉ., Gergely P. Effects of silibinin and
vitamin-E on lipid peroxidation and cellular immunoreactivity in experimentally induced fatty liver of rats. Med. Sci. Monit., 1996, 2: 397-403. 63. Fehér J., Csomós G., Vereckei A. Free radical reactions in medicine. Springer Verlag. 1987. 64. Flamez D., Berger V., Kruhoffer M., Orntoft T., Pipeleers D., Schuit FC. Critical role of
cataplerosis via citrate in glucose-regulated insulin release. Diabetes. 2002, 51: 2018-2024. 65. Fodinger M., Sunder-Plassmann G. Inherited disorders of iron metabolism.Kidney international. 1999, 55 Suppl 69: S22-S34. 66. Franklin MR., Phillips JD., Kushner JP. Uroporphyria in the uroporfirinogen decarboxylase-
deficient mouse: Interplay with siderosis and polychlorinated biphenyl exposure. Hepatol. 2002, 36(4): 805-811. 67. Friling RS., Bensimon S., Daniel V. Xenobiotic-inducible expression of murine glutathione S-transferase Ya subunit gene is controlled by an electrophile-responsive element. Proc Natl Acad Sci USA. 1990, 87: 6258-62. 68. Fritsch C., Lang K., von Schmiedeberg S., Bolsen K., Merk H., Lehmann P., Ruzicka T.
Porphyria cutanea tarda. Skin pharmacology and applied skin physiology. 1998, 11 (6): 321-335.
115
9. IRODALOMJEGYZÉK 69. Fritsch C., Schmiedeberg S., Lehmann P. Porphyria cutanea tarda. Hautarzt. 1998, 49: 870882. 70. Fuhrer D. A Nuclear receptor in thyroid malignancy: is PAX8/PPAR-γ the Holly Grail of follicular thyroid cancer? Eur J Endocrinol. 2001; 144: 453-56. 71. Gaehtgens P., Dührssen C., Albrecht KH. Motion, deformation and interaction of blood cells
and plasma during flow through narrow capillary tubes. Blood Cells. 1980, 6: 799-812). 72. Galinier A., Carriere A., Fernandez Y., Carpene C., Andre M., Caspar-Bauguil S., Thouvenot JP., Periquet B., Penicaud L., Casteilla L. Adipose tissue pro-adipogenic redox changes in
obesity. J Biol Chem. 2005 Dec 23; [Epub ahead of print]. 73. Gonzalo R., Garcia-Arumi E., Llige D., Marti R., Solano A., Montoya J., Arenas J., Andreu AL. Free radicals-mediated damage in transmitochondrial cells harboring the T14487C
mutation in the ND6 gene of mtDNA. FEBS Lett. 2005 Dec 19;579(30):6909-6913. Epub 2005 Dec 1. 74. Goodwin JS. Are prostaglandins proinflammatory, antiinflammatory, both or neither. J Rheumatol. 1991, (Suppl 28). 18: 26-29. 75. Goreczky L. Porpphyrinek és porfirinopathiák. Az orvostudomány aktuális problémái. Medicina. 1969, 3: 97-135. 76. Gulcin I., Beydemir S., Hisar O. Effect of alfa-tocopherol on antioxidant enzyme activities
and lipid peroxidation in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Acta Vet Hung. 2005, 53(4): 425-33. 77.
Guennoun N., Gerolami-Colombani V., Sebti A, Aquaron R. [Sporadic porphyria
cutanea tarda: a case report in a Moroccan man] Med Trop (Mars). 2003, 63(2): 183-7. 78. Habon-T; Szabados-E; Kesmarky-G; Halmosi-R; Past-T; Sumegi-B; Toth-K The effect of
carvedilol on enhanced ADP-ribosylation and red blood cell membrane damage caused by free radicals Acta-Pharm.-Hungarica. 2002, 71 (3): 306-313. 79. Habon T, Szabados E, Kesmarky G, Halmosi R, Past T, Sumegi B, Toth K. The effect of
carvedilol on enhanced ADP-ribosylation and red blood cell membrane damage caused by free radicals. Cardiovasc Res 2001; 52: 153-60. 80. Hagymási K., Blázovics A., Lengyel G., Kocsis I., Fehér J. Oxidative damage in alcoholic
liver disease. Eur. J. Gastroent. Hepatol. 2000, 2: 1-8.
116
9. IRODALOMJEGYZÉK 81. Hagymási K. A máj redox-homeosztázisának tanulmányozása kisérletes és humán
vizsgálatokban: antioxidáns kezelés antioxidáns betegség. Tézisek, Budapest, 2002. 82. Halliwell B., Murcia MA., Chirico S., Aruoma OI. Free radicals and antioxidants in food
and in vivo: what they do and how they work. Crit. Rev. Food. Sci. Nutr. 1995, 35(1-2):7-20. 83. Han SN., Adolfsson O., Lee C-K., Prolla TA., Ordovas J., Meydani SN. Vitamin E and Gene
Expression in Immune Cells. Ann NY Acad Sci 2004, 1031: 96-01. 84. Hatano T, Kagawa H, Yasuhara T, Okuda T. Two new flavonoids and other constituents in
licore root: their relative astringency and radical scavenging effects. Chem Pharm Bull 1988; 36, 2090-2097. 85. Helmut Sies. Oxidative Stress. Academic Press 1985. 86. Hermann G., Wlaschek M., Botsen K. et al. Photosensitisation of uroporfirin augments the
ultraviolet A-induced synthesis of matrix mtalloproteinases in human dermal fibroblasts. J. Invest. Dermatol. 1996, 107: 398-403. 87. Hirayama J., Abe H., Kamo N., Ikebuchi K., Ikeda H.. Comparison of the effects of different
antiviral treatments on the antioxidant systems of stroma-free hemoglobin. Photochem Photobiol. 2001, 74(3): 461-4. 88. Homann N., Stickel F., Konig IR., Jacobs A., Junghanns K., Benesova M., Schuppan D., Himsel S., Zuber-Jerger I., Hellerbrand C., Ludwig D., Caselmann WH., Seitz HK. Alcohol
dehydrogenase 1C*1 allele is a genetic marker for alcohol-associated cancer in heavy drinkers. Int J Cancer. 2005, [Epub ahead of print] 89. Horkay I. Dr. A cutan porphyriák korszerű diagnosztikája és terápiája. Bőrgyógy. és venerol. szemle. 2003, 76: 193-196. 90. Horváth MÉ., Faux SP, Smith AG, et al. Cheeseman K. H. Vitamin E protects against ironhexachlorobenzene induced porphyria and formation of 8-hydroxy-deoxy guanoside in the liver of C57BL/10SeSa mice. Toxicology Lett. 2001, 122: 97-02. 91. Horváth MÉ., Faux SP., Smith AG., Blázovics A., Van der Looy M., Fehér J., Cheeseman KH. Vitamin E protects against iron-hexachlorobenzene induced porphyria and formation of
8-hydroxy-deoxy guanosine in the liver of C57BL/10SeSa mice. Toxicology. Lett. 2001, 122: 97-102.
117
9. IRODALOMJEGYZÉK 92. Horváth T., Szabó L., Nagy Z., Blázovics A., Gergely K., Schwartz T. Endogenous scavenger
levels (vitamin E and A) of patients with chronic alcoholic liver disease under different environmental conditions. Acta Phys Hung. 1992, 80: 381-89. 93. Horváth T., Blázovics A. Chemiluminescence in blood syste of alcoholics and of patients with
subliminal alcohol-drug use. Croat. J. gastroenterol. Hepatol. 1992a,1: 159-163. 94. Horváth T., Szabó L., Nagy Z., Blázovics A., Gergely K., Schwartz T. Endogenous scavenger
levels (vitamin E and A) of patients with chronic alcoholic liver disease under different enviromental conditions. Acta Phys. Hung. 1992b, 80:381-389. 95. Huerter CJ., Kunkel JR., Stinson R. Porphyria cutanea tarda in association with human
immunodeficiency virus (HIV) infection. Nebraska medical journal. 1993, 78 (6): 155-157. 96. Ippen H., Kausalfaktoren der porphyria cutanea tarda. Derm. Wschr. 1967, 153: 1351-135. 97. Isik B., Isik RS., Ceylan A., Calik O. Trace elements and oxidative stress in chronic
obstructive pulmonary disease. Saudi Med J. 2005, 26(12): 1882-5. 98. Jacobs JM., Sinclair PR., Lambrecht RW., and Sinclair JF. FEBS Lett. 1989, 250: 349-352. 99. Kamata H, Hirata H. Redox regulation of cellular signaling. Cell Signal 1999; 11: 1-14. 100. Karpen CW., Cataland S., O’Dorisio TM., Panganamala RV. Production of 12-
hydroxyeicosatetraenoic acid and vitamin E status in platelets from type 1 human diabetic subjects. Diabetes 1985, 34 (6): 526-531. 101. Kauppinen R. Porphyrias Lancet 2005, 365: 241-252. 102. Keresztes K., Kempler P. A diabeteses neuropathia korszerű szemlélete és kezelése. Magyar Belorv Arch 2000, 53: 331-336. 103. Kesmarky-G., Toth-K., Vajda-G., Habon-L., Halmosi-R., Roth-E. Hemorheological and
oxygen free radical associated alterations during and after percutaneous transluminal coronary angioplasty Clin.-Hemorheol.-and-Microcirc. 2001, 24 (1): 33-41. 104. Kiesewetter-H., Jung-F., Junger-M., Marx-U., Koscielny-J Chronic venous insufficiency:
Only a macro- or als a microangiopathy? Clinical-Hemorheology. 1994, 14 (SUPPL. 1): S65-S78. 105. Kliewer SA, Lenhard JM, Willson TM, Patel I, Morris DC, Lehmann JM. A prostaglandin
J2 metabolite binds peroxisome proliferator-activated receptor gamma and promotes adipocyte differentiation. Cell. 1995; 1: 813-19.
118
9. IRODALOMJEGYZÉK 106. Kollár L. Haemorreologia szerepe perifériás keringési betegségekben. Háziorvos Továbbképző Szemle. 1997. 2 p 355-356. 107. Kollár L. Dr. Haemorheológi a gyakorló érsebész szemével. Érbetegségek. 2002/suppl. 9-13. 108. Kong AN., Yu R., Chen C., Mandlekar S., Primiano T. Signal transduction events elicited
by natural products: role of MAPK and caspase pathways in homeostatic response and induction of apoptosis. Arch Pharm Res. 2000, 23: 1-16. 109. Konrad D. Utilization of the insulin-signaling network in the metabolic actions of alfa-lipoic
acid-reduction or oxidation? Antioxid Redox Signal. 2005, 7(7-8): 1032-9. 110. Kopper L., Fésűs L, Apoptózis, Medicina, Budapest, 2002. 111. Koszó F., Simon M. A porphyria cutanea tarda patogenezise. Orvosi Hetilap. 2000. 141 (14): 709-713. 112. Kószó F., Földes M., Morvay M et al. Krónikus hemodializissel kapcsolatos
porphyria/pseudoporphyria. Orv. Hetil. 1995, 135: 2131-36. 113. Kószó F. Vas- és alkoholterhelés, valamint membrán tulajdonság változások porfirin
anyagcserére gyakorolt hatása a krónikus hepatikus porphyria kialakulása szempontjából. Kandidátusi értekezés 114. Kushner JP., Haemochromatosis genes and other risc faktors in the pathogenesis of
porphyria cutanea tarda. Blood. 1998, 92: 69. 115. Lamoril J., Andant C., Gouya L., Malonova E., Grandchamp B., Martasek P, et al.
Hemochromatosis (HFE) and transferrin receptor-1 (TFRC1) genes in sporadic porphyria cutanea tarda (sPCT). Cell. Mol. Biol. 2002, 48: 33-41. 116. Lengyel G., Bálint T., Fehér J. Új irányelvek a krónikus vírus hepatitis kezelésében. Folia Hepat. 1998, 3: 30-33. 117. Lehmann JM., Lenhard JM., Oliver BB., Ringold GM., Kliever SA. Peroxisome
proliferator-activated receptors α and γ are activated by indomethacin and other nonsteroidal and anti-inflammatory drugs. J Biol Chem. 1997, 272: 3406-10. 118. Lieber CS., DeCarli LM., Feinman L., Hasumura Y., Korsten M., Matsuzaki S., Teschke R.
Effect of chronic alcohol consumption on ethanol and acetaldehyde metabolism. Adv. Exp. Med. Biol. 1975, 59: 185-227. 119. Lieber CS. Hepatic, metabolic and toxic effects of ethanol: 1991 update. Alcoholism Clin. Exp. Res., 1991, 15: 573-592.
119
9. IRODALOMJEGYZÉK 120. Lieber CS. Role of oxidative stress and antioxidant therapy in alcoholic and non-alcoholic
liver disease. Adv. Pharmacol. 1997, 38: 601-628. 121. Liebler DC., Baker PF., Kaysen KL. Oxidation of vitamin E: Evidence for competing autooxidation and peroxyl radical trapping reactions of the tocopheroxyl radical. J. Am. Chem. Soc. 1990, 112: 6995-7000. 122. Li Q., Harraz MM., Zhou W., Zhang LN., Ding W., Zhang Y., Eggleston T., Yeaman C., Banfi B., Engelhardt JF. Nox2 and Rac1 Regulate H2O2-Dependent Recruitment of TRAF6
to Endosomal Interleukin-1 Receptor Complexes. Mol Cell Biol. 2006, 26(1): 140-154. 123. Lip-GYH., Blann-AD., Farooqi-IS., Zarifis-J., Sagar-G., Beevers-DG.
alterations
in
haemorheology,
endothelial
dysfunction,
platelet
Sequential
activation
and
thrombogenesis in relation to prognosis following acute stroke: The West Birmingham Stroke.Project Blood-Coagulation-and-Fibrinolysis. 2002: 13 (4): 339-347. 124. Lim CK., Peters TJ. Urine and faecal porfirin profiles by reversed-phase high performance
liquid chromatografy in the porphyrias. Clin. Chim. Acta. 1984, 139: 55-63. 125. Lin CC., Huang JF., Tsai LY., Huang YL. Selenium, Iron, Copper, and Zinc Levels and
Copper-to-Zinc Ratios in Serum of Patients at Different Stages of Viral Hepatic Diseases. Biol Trace Elem Res. 2006, 109(1): 15-24. 126. Lockwood WH., Poulos V., Rossi E. and Curnow DH. Rapid procedure for fecal porfirin
assay. Clin. Chem. 1985, 30/7: 1163-1167. 127. Loustaud-Ratti V., Lunel F. Extrahepatic manifestations of hepatitis C virus infection. La Revue du praticien. 2000, 50: 1089-1093. 128. Lugasi A., Blázovics A., Dworschák E., Fehér J. A vörösbor kardioprotektív hatásáról az
irodalmi adatok tükrében. Orv. Hetil. 1997, 138: 673-681. 129. Lugasi A., Blázovics A., Fehér J. Magyar vörösborok in vitro antioxidáns tulajdonságai. Orv. Hetil.1999, 140: 2051-2056. 130. Lunec J., Holloway KA., Cooke MS., Faux S., Griffiths HR., Evans MD. Urinary 8-oxo-2’-
deoxyguanosine: redox regulation of DNA repair in vivo? Free Radic Biol Med. 2002, 33(7): 875-85. 131. Mackenzie GG., Zago MP., Erlejman AG., Aimo L., Keen CL., Oteiza PI. Alfa-Lipoic acid
and N-acetyl cysteine prevent zinc deficiency-induced activation of NF-kappaB and AP-1
120
9. IRODALOMJEGYZÉK
transcription factors in neuroblastoma IMR-32 cells. human neuroblastoma IMR-32 cells. Free Radic Res. 2006, 40(1):75-84. 132. Matés JM., Saches-Jiménez FM. Role of reactive oxygen species in apoptosis: implications
for cancer therapy. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2000, 32: 157-170. 133. Martinez PA., Jeanjean Ph., Masmejean C és mtsai. Simple and rapid detection of the newly
described mutations in the HLA-H gene. Blood, 1997, 89: 1835-1836. 134. Mazzetti MB., Taira MC., Lelli SM., Dascal E., Basabe JC. Hexachlorobenzene impairs
glucose metabolism in a rat model of porphyria cutanea tarda: a mechanistic approach. Arch Toxicol 2004, 78: 25-33. 135. Maxwell S. Prospects for the use of antioxidant therapies. Drugs. 1995, 49(3): 345-361. 136. Mastrocola R., Restivo F., Vercellinatto I., Danni O., Brignardello E., Aragno M., Boccuzzi G. Oxidative and nitrosative stress in brain mitochondria of diabetic rats. J Endocrinol. 2005, 187(1): 37-44. 137. Mátrai Á., Bogár L., Fendler K. A haematokrit és a fibrinogénszint szerepe a vér rheológiai
tulajdonságainak meghatározásában. Kisérl. Orvostud. 1979, 31: 204-212. 138. McCord JM. The evolution of free radicals and oxidative stress. Am. J. Med.. 2000, 108: 652-659. 139. Meyer M, Pahl HL, Baeuerle PA. Regulation of the transcription factors NF-κB and AP-1
by redox changes. Chem.Biol. Interact. 1994; 91: 91–100. 140. Meyer M, Schreck R, Baeuerle PA. H2O2 and antioxidants have opposite effects on
activation of NF-κB and AP-1 in intact cells: AP-1 as secondary antioxidant responsive factor. EMBO J. 1993; 12: 2005–15. 141. Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. és mtsai. A simple salting out procedure for extracting
DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res. 1988, 16: 1215-1218. 142. Miyamoto S, Kawano H, Hokamaki J, Soejima H, Kojima S, Kudoh T, Nagayoshi Y, Sugiyama S, Sakamoto T, Yoshimura M, Nakamura H, Yodoi J, Ogawa H. Increased
plasma levels of thioredoxin in patients with glucose intolerance. Intern Med. 2005, 44 (11): 1127-32. 143. Moore M R., McColl KEL., Rimington C. et al. Disorders of Porfirin Metabolism. Plenum Med. : Book. Comp. New York-London, 1987.
121
9. IRODALOMJEGYZÉK 144. Mózsik Gy, Fiegler M, Juricskay I, Mezey B, Tóth K. Oxygen free radicals, lipid
metabolism, and whole blood and plasma viscosity in the prevention and treatment of human cardiovascular diseases. Bibl Nutr. Diet 1992; 49: 111-24. 145. Mukerji SK, Pimstone NR. Free radical mechanism of oxidation of uroporfirinogen in the
presence of ferrous iron. Arch. of Biochem. and Biophysics 1990, 281: 177-184. 146. Mukerji SK. Haem biosynthesis and human porphyria cutanea tarda: effects of alcohol intake. Indian J Exp Biol. 2000, 38 (7): 635-42. 147. Murty HS, Pinelli A, Nair PP, Mendeloff A. Porphyria cutanea tarda: therapeutic response
to vitamin E (abstr). Clin Res 1969, 17: 474. 148. Nair PP. Vitamin E and metabolic regulation. Ann N Y Acad Sci 1972, 203: 53-61. 149. Nichols RC, Cooper S, Trask HW, Gorman N, Dalton TP, Nebert DW, Sincir JF, Sinclair PR. Uroporfirin accumulation in hepatoma cells expressing human or mouse CYP1A2:
relation to the role of CYP1A2 in human porphyria cutanea tarda. Biochem Pharmacol. 2003, 65 (4): 545-50. 150. Noda Y., Ogata K., Mori A. Antioxidant activities of novel alfa-lipoic acid derivatives: N-
(6,8-dimercaptooctanoyl)-2-aminoethanesulfonate-
and
N-(6,8-dimercaptooctanoyl)-L-
aspartate-zinc complex. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 2003, 113-114: 133-147. 151. Norman RA. Past and Future: Porphyria and Porfirins SKINmed: Dermatology for the Clinician, 2005, 5: 287-292. 152. Nordmann Y., Puy H., Deybach JC. Les porphyries hépathiques. Rev. Med. Intern. 1999, 20: 333-340. 153. Nordmann Y., Puy H, Deybach JC. The porphyrias. J. Hepatol. 1999, 30: 12-16. 154. Nordmann R., Rouach H. Alcohol and free radicals: from basic research to clinical
prospects. Ann Gastroent Hepatol Paris. 1996, 32: 128-33. 155. Nordmann R., Puy H. Human hereditary hepatic porphyrias. Cli. Chim. Acta. 2002, 325: 17-37. 156. Novák Z, Waart FVD, Fisher TC, Johnson CS, Meiselman HJ. Increased superoxide radical
generation by erythrocytes in sickle cell disease. Oxygen Free Radicals and Scavengers in the Natural Sciences Eds: Mózsik, Emerit, Fehér, Matkovics, Vincze Akadémiai Kiadó 1993, 207-210.
122
9. IRODALOMJEGYZÉK 157. Orlowski RZ. The role of the ubiquitin-proteasome pathwayin apoptosis. Cell Death Diff. 1999, 6: 303-13. 158. Oyaizu M. Studies on product of browning reaction prepared from glucosamine. Jpn. J. Nutr. 1986, 44: 307-315. 159. Pace-Asciak CR, Asotra S. Biossynthesis, catabolis, and biological properties of HPETEs,
hydroperoxide derivatives of arachidonic acid. Free Rad Biol Med. 1989, 7: 409-33. 160. Paolini M., Antelli A, Pozetti L, et al. Induction of cytochrome P450 enzymes and
overgeneration of oxygen redicals in beta-carotene supplemented rats. Carcinogenesis, 2001; 22: 1483-85. 161. Parissien S. George IV: The Royal Joke. Monarchs and Leaders BBC History 2001, 2-5. 162. Pastor IJ., Laso FJ., Romero A., Gonzalez-Sarmiento R. -238 G>A polymorphism of tumor
necrosis factor alfa gene (TNFA) is associated with alcoholic liver cirrhosis in alcoholic Spanish men. Alcohol Clin Exp Res. 2005, 29 (11): 1928-31. 163. Pinelli A., Trivulzio S., Tomasoni L., Bertolini B., Pinelli G. High-dose vitamin E lowers
urine porfirin levels in patients affected by porphyria cutanea tarda. Pharmacol Res 2002; 45: 355-359 164. Poh-Fitzpatrick, Maureen B.,Lamola A., Murray Hill Direct spectrofluorometry of diluted
erythrocytes and plasma: a rapid diagnostic method in primary and secondary porfirinemias. J. Lab. Clin. Med. 1976 87 (2): 362-370. 165. Poh-Fitzpatrick, Maureen B. Plasma porfirin fluorescence marker for variegate porphyria. Arch. Dermatol. 1980, 118: 543-547. 166. Poli G, Leonarduzzi G., Biasi F., Chiarpotto E.. Oxidative stress and cell signaling. Curr Med Chem. 2004, 11: 1163-82. 167. Powis G., Gasdanska JR., Baker A. Redox signalling and the control of cell growth and
death. Adv. Pharmacol. 1997, 38: 329-358. 168. Pyles, I. A., Strejskal, J., Eizing, S.: Spectrophotometric measurement of plasma 2-
thiobarbituric acid reactive substances in the presence of hemoglobin and bilirubin interference. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1993 4: 407-419. 169. Remenyik É, Ujj Gy, Kószó F, Horkay I. Porphyria cutanea tarda and chronic lymphoid
leukemia. Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. 1996, 12: 180-182.
123
9. IRODALOMJEGYZÉK 170. Rich HD, Mylonakis E. NossaR. et al. Highly active antiretroviral therapy leading to
resolution of porphyria cutanea tarda in a patient with AIDS and hepatitis C. dig. Dis. Sci. 1999, 44: 1034-1037. 171. Rocchi E., Casalgrandi G., Masini A, Giovannini F., Ceccarelli D., Ferrali M., Marchini S., Ventura E. Circulating pro- and antioxidant factors in iron and porfirin metabolism
disorders. Ital. J. Gastroenterol. and Hepatol. 1999 31 (9): 861-867. 172. Rocchi E., Stella AM., Casanelli M., Borghi A., Nardella N., Seium Y., Casalgrandi G.
Liposoluble vitamins and naturally occurring carotenoids in porphyria cutanea tarda. Eur J Clin Invest 1995; 25: 510-514. 173. Rosenson-RS., Baker-AL., Chow-MJ., Hay-RV. Hyperviscosity syndrome in a
hypercholesterolemic patient with primary biliary cirrhosis Gastroenterol, 1990, 98(5 I): 1351-1357. 174. Róth I, Udvardy L. Orv. Hetil. 1931, 46-30. 175. Rust C, Gores GJ. Apoptosis and liver diseases. Am. J. Med. 2000, 108: 567-574. 176. Rudy J. L., Ibarra, F., Zeigler M. és mtsai.: Simultaneous determination of retinol, retinyl
palmitate, and α-tocopherol in serum or plasma by reversed-phase high performance liquid chromatography. LC-GC International, 3. 36. 1989. 177. Sampietro M., Piperno A, Lupica L., Arosio C., Vergani A., Corbetta N. et al. High
prevalence of the His63Asp HFE mutation in Italian patients with porphyria cutanea tarda. Hepatology. 1998, 27: 181-184. 178. Schulze-Osthoff K, Ferrari D, Riehemann K és mtsai. Regulation of NF-ĸB activation by
MAP kinase cascades. Immunbiol. 1997, 198: 35-49. 179. Sever PS., Dahlöf B., Poulter NR., Wedel H., Beevers G., Caulkjeld M., Collins R., Kjeldsen, SE., Kristinsson A., Mcinnes GT., Mehlsen J., Nieminen M., O’Brien E. Oestergren J for the ASCOT investigators: Prevention of coronary and stroke events with atorvastatin in
hypertensive patients who have average or lower-than-average cholesterol concentrations in the Anglo-Scandinavian Cardiac Outcomes Trial-lipid lowering arm (ASCOT-LLA): a multicentre randomized controlled trial. Lancet. 2003, 361: 1149-1158. 180. Sedlak J, Lindsay RH. Estimation of total, protein bound and non-protein sulfhydril groups
in tissues with Ellman’s reagent. Abal. Biochem. 1986, 25: 192-205.
124
9. IRODALOMJEGYZÉK 181. Sergent O., Tomasi A., Ceccarelli D., Masini A., Nohl H., Cillard P., Cillard J., Vladimirov YA., Kozlov AV. Combination of Iron Overload Plus Ethanol and Ischemia Alone Give Rise
to the Same Endogenous Free Iron Pool. Biometals. 2005, 18 (6): 567-575. 182. Sewter C., Vidal-Puik A. PPAR (gamma) and the thiazolidine-diones: molecular basis for a
treatment of „Syndrome-X? Diabetes. Obes. Metab. 2002, 4: 239-248. 183. Sigel A, Sigel H. Iron transport and storagen microorganisms, plants and animals. Metal Ions Biol. Syst. 1998, 35: 1-775. 184. Simon M. A porphyria cutanea tarda patogenezise. Tézisek. 1981. 185. Sinclair P., Lambrecht R. and Sinclair J. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987, 146: 1324-1329. 186. Sinclair PR., Gorman N., Shedlofsky SI., Honsinger CP., Sinclair JF., Karagas MR., Anderson KE. Ascorbic acid deficiency in poprhyria cutanea tarda. J Lab Clin Med 1997; 130: 197-201. 187. Smith AG., De Matteis F. Oxidative injury mediated by the hepatic cytochrome P-450
system in cojunction with cellular iron. Effects on the pathway of haem biosynthesis. Xenobiotica 1990, 20: 865-877. 188. Somogyi A., Pusztai P., Frechl J., Fehér J. A diabetes mellitus és a szabad gyökös reakciók
feltételezett kapcsolata az érelmeszesedéssel. Orv. Hetil. 1994, 135 (33): 1815-1818. 189. Somogyi A., Sármán B., Blázovics A.., Tulassay Zs. Diabetes mellitus és oxidatív stressz. Folia Hepatol 2001, 6 10-11. 190. Somogyi A., Gonzales-Cabello R., Szondy É., Blázovics A., Gergely P., Fehér J. Effects de
la hiperlipémia sobre la blastogenésis inducida por mitógenos, en limfocitos aislados de basos de ratón. Allergol. Immunopathol. 1987, 15: 89-92. 191. Souza RM., Freitas LA., Lyra AC., Moraes CF., Braga EL., Lyra LG. Effect of iron
overload on the severity of liver histologic alterations and on the response to interferon and ribavirin therapy of patients with hepatitis C infection. Braz J Med Biol Res. 2006, 39 (1): 79-83. 192. Szentmihályi K., Csiktusnádi-Kiss GA., Keszler Á., Kótai L., Candeaias M., Bronze MR., Boas LV., Spauger I. and Forgács E. Method development for measurement of elements in
Hungarian red wines by inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICPOES). Acta Alimentaria. 2000, 29: 105-121.
125
9. IRODALOMJEGYZÉK 193. Szentmihályi K., Blázovics A, Vinkler P. Free radical properties of metal complexes. Acta Biologica Szegediensis. 2000, 47, 1-4, 107-109. 194. Szentmihályi K., Blázovics A, Vinkler P. Free radical properties of metal complexes. Acta Biologica Szegediensis. 2003, 47 (1-4): 107-109. 195. Szentmihályi K., Fehér E., Vinkler P., Kéry Á., Blázovics A. Metabolic alterations of toxic
and none essential elements by the treatment of Sempervivum tectorum extract in hyperlipidemic rat model. Toxicol. Pathol. 2004, 32, 1: 50-57. 196. Székely E., Tasnády Gy., Várnai K., Bor M., Pusztai M., Blázovics A. Redox homeostasis of
PCT patients. Z. Gastroenterologie. 2002, 5: 359. 197. Székely E., Szentmihályi K., Tasnádi Gy., Várnai K., Blázovics A. Effect of alpha-lipoic
acid on the porphyria cutanea tarda patients with type 2 diabetes mellitus and heavy drinkers. Z. Gastroenterol 2005, 43: 477-529. 198. Székely E., Szentmihályi K., Tasnádi Gy., Kurucz T., Pallai Zs., Somogyi A., Blázovics A.
Element status of total blood and redox homeostasis of phlebotomized sporadic porphyria cutanea tarda patients with diabetes mellitus and in heavy drinkers Trace Elem. and Electrol. 2006, 23: 43-49. 199. Székely E., Bor M., Tasnádi Gy., Várnai K., Almási A., Blázovics A. Hemorheological
status and redox homeostasis of phlebotomised porphyria cutanea tarda patients with diabetes mellitus and in moderate alcohol consumer. Clin. Hemorheol. Microcirc. 2006, 03: 10-14. 200. Székely E., Vereckei A, Bor M., Tasnádi Gy., Várnai K., Pallai Zs., Lugasi A., Blázovics A. Additional beneficial effects of vitamin E administration on hemorheological status in
patients with porphyria cutanea tarda treated with phlebotomy. Clin. Hemorheol. Microcirc. 2006. (submitted). 201. Szodoray L., Sümegi S. Über die Nosologie der chronischen kutanen Porphyrie. Dermatologica. 1944, 90: 224-228. 202. Takeuchi M., Saito T. Cytotoxicity of Acetaldehyde-Derived Advanced Glycation End-
Products (AA-AGE) in Alcoholic-Induced Neuronal Degeneration.Alcohol. Clin. Exp. Res. 2005, (12 Suppl): 220S-4S. 203. Tamer-S., Cefle-K., Palanduz-S., Vatansever-S. Rheological properties of blood in patients
with chronic liver disease. Clinical-Hemorheology-and-Microcirculation. 2002, 26 (1): 9-14. 204. Tasnádi Gy. Amit a porfiriákról tudni kell. Új diéta 2002, 3: 6-9.
126
9. IRODALOMJEGYZÉK 205. Tasnádi Gy., Bor M., Pusztai Á., Székely E. Akut porphyriák a differenciáldiagnosztikában. Orvosi Hetilap. 2003, 144 (17): 811-818. 206. Tasnádi Gy., Bor M., Pusztai Á. Akut porphyriák kezelése. A betegek és hordozók
gondozásának jelentősége. Orv. Hetil. 2003, 19: 933-938. 207. Thompson CB, Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science 1995, 267: 1456-62. 208. Thunell S.& Harper P. Porfirins, porfirin metabolism, porphyrias. III. Diagnosis, care and
monitoring in porphyria cutanea tarda – suggestions for a handling programme. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 2000, 60: 561-580. 209. Tóth K. Haemorheologiai faktorok és oxigén szabad gyökös reakciók szerepe a mocardialis ischaemia kialakulásában. Doktori pályázat, 2000. 210. Turlin B., Deugnier Y. Evaluation and interpretation of iron in the liver. Semin. Diagn. Pathol. 1998, 15 (4): 237-245. 211. Vandewoude MG., van-Gaal LF., Vandewoude MF., De-Leeuw IH. Vitamin E status in
normocholesterolemic and hypercholesterolemic diabetic patients. Acta Diabetol Lat. 1987, 24(2): 133-139. 212. Zhang XK. Vitamin A and apoptosis in prostate cancer. Endocrine Related Cancer. 2002, 9: 87-102. 213. Waluga M., Hartleb M. Alcoholic liver disease. Wiad Lek. 2003, 56(1-2): 61-70. 214. Wayner DDM., Burton Gw., Ingold KU., Barclay LRC., Locke SJ. The relative
contributions of vitamin E, urate ascorbate and proteins to the total peroxyl radical-trapping antioxidant activity of human blood plasma. Biochem. Biophys. Acta. 1987, 924: 408-419. 215. Watanabe J., Umeda F., Wakasugi H., Ibayashi H. Effect of vitamin E on platelet
aggregation in diabetes mellitus. Tohoku J Exp Med 1984, 143 (2): 161-169. 216. Watson CJ, Bossenmajer I, Cardinal R. Lack of significant effect of vitamin E on porfirin
metabolism. Report of four patients with various forms of porphyria. Arch Int Med 1973, 131: 698-701. 217. Westerlund J., Pudek M., Schreiber WE. Principles and technics Clin Chem. 1988, 34: 345355. 218. Whitfield JB. Meta-analysis of the effects of alcohol dehydrogenase genotype on alcohol
dependence and alcoholic liver disease. Alc Alcohol. 1997, 32: 613-19.
127
9. IRODALOMJEGYZÉK 219. Wolff SP. Diabetes mellitus and free radicals. Britmed. Bull. 1993, 49 (3): 642-652. 220. Yamanaka H. Alcohol ingestion and hyperuricemia. Nippon rinsho, 1996, 54: 3369-3373. 221. Yin DM., Wu JC., Yuan YJ. Reactive Oxygen Species, Cell Growth, and Taxol Production
of Taxus cuspidata Cells Immobilized on Polyurethane Foam. Appl Biochem Biotechnol. 2005, 127 (3): 173-86. 222. Yilmaz MI., Saglam M., Caglar K., Cakir E., Sonmez A., Ozgurtas T., Aydin A., Eyileten T., Ozcan O., Acikel C., Tasar M., Genctoy G., Erbil K., Vural A., Zoccali C. The
Determinants of Endothelial Dysfunction in CKD: Oxidative Stress and Asymmetric Dimethylarginine. Am J Kidney Dis. 2006 Jan., 47 (1): 42-50. 223. Zhang XK. Vitamin A and apoptosis in prostate cancer. Endocrine Related Cancer. 2002, 9: 87-102 224. Ziouzenkova O., Perrey S., Marx N., Bacqueville D., Plutzky J. The peroxisomaproliferator
activated receptors. Curr. Atheroscler. Rep. 2002, (magyar kiadás: 2/4: 443-452, 2002) 4: 59-64.
128
10. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE 10. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE
1. Tasnádi Gy, Bor M, Pusztai Á, Székely E. Akut porphyriák a differenciáldiagnosz-tikában. Orv. Heti. 2003, 17: 811-818. 2. Dinya M, Székely E, Szentmihályi K, Tasnádi Gy, Blázovics A. Element determinations in the total blood of phlebotomised patients with porphyria cutanea tarda. J. Trace Elem. Med. Biol. 2005, 19: 217-220. IF: 0,87 3. Székely E, Szentmihályi K, Tasnádi G, Kurucz T, Pallai Zs, Somogyi A, Blázovics A. Element status of total blood and redox homeostasis of phlebotomized sporadic porphyria cutanea tarda patients with diabetes mellitus and in heavy drinkers. Trace Elem. Electrolyt. 2006, 1: 43-49. IF: 0,571 4. Székely E, Bor M, Tasnádi Gy, Várnai K, Almási A, Blázovics A. Hemorheological status and redox homeostasis of phlebotomised porphyria cutanea tarda patients with diabetes mellitus and in moderate alcohol consumer. Clin. Hemorheol. Microcirc. 2006, 03: 10-14. IF 0,63 5. Blázovics A, Fehér E, Kocsis I, Rapavi E, Székely E, Váli L, Szentmihályi K. How can Beiqishen tea consumption influence redox homeostasis in experimental hyperlipidemy? Acta Alim. Hung. 2006, 35: 41-52. IF: 0,214 6. Rapavi E, Gonzalez-Cabello C, Szentmihályi K, Székely E, Blázovics A. The effect of calyx infusion of Hibiscus Sabdariffa L. on T-cells-mediated immune response in mitogen induced blastogenesis of human lymphocytes in vitro. Acta Alim. Hung. 2006, 35: 2: (in press) IF 0,214 7. Rapavi E, Kocsis I, Fehér E, Szentmihályi K, Lugasi A, Székely E, Blázovics A The effect of citrus flavonoids on the redox state of alimentary-induced fatty liver in rats. Nat. Prod. Res. 2006, 35: 1. (in press) IF: 0,525 8. Dörnyei O, Kovács Á, Székely E, Dinya E, Blázovics A. Táplálkozási antioxidánsokra vonatkozó felmérések gyulladásos bélbetegségekben. Orv. Hetil. 2006. (submitted) 9. Székely E, Vereckei A, Bor M, Tasnádi Gy, Várnai K, Pallai Zs, Lugasi A, Blázovics A. Additional beneficial effects of vitamin E administration on hemorheological status in patients with porphyria cutanea tarda treated with phlebotomy. Clin. Hemorheol. Microcirc. 2006 (submitted)
IF 0,63
129
10. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE
Idézhető absztraktok 1. Székely E, Tasnádi Gy, Várnai K, Bor M, Pusztai Á, Blázovics A. Redox-homeostasis of PCT patients Z. Gastroenterol 2002. IF: 1,076 2. Rapavi E, Fehér E, Székely E, Kocsis I, Blázovics A. Effects of detralex-treatment on antioxidant defense system of ileum and colon in hyperlipidemic rats. Z. Gastroenterol 2003; 41: 454. IF: 1,076 3. Székely E, Szentmihályi K, Tasnádi Gy, Várnai K, Blázovics A. Redox-homeostasis and element status of the porphyria cutanea tarda patients with diabetes mellitus and alcoholism. Z. Gastroenterol, 2004, 42: 403-452. IF: 1,0 4. Székely E, Szentmihályi K, Tasnádi Gy, Várnai K, Blázovics A. Effect of alpha-lipoic acid on the porphyria cutanea tarda patients with type 2 diabetes mellitus and heavy drinkers. Z. Gastroenterol 2005, 43: 477-529. IF: 1,0
Proceedings 1. Blázovics A, Szentmihályi K, Kocsis I, Lugasi A, Héthelyi É, Stefanovits-Bányai É, Bárkovits S, Pintér E, Rapavi E, Székely E, Kurucz T, Pallai Zs. In vitro, in vivo állatkísérletes és humán modelleken történő vizsgálatok a szöveti redox-státusz meghatározására növényi eredetű hatóanyagok terápiás alkalmazása során. Széchenyi Szimpózium. 2004, NKFP 1/016/2001. 2. Rapavi E, Kocsis I, Szentmihályi K, Lugasi A, Fehér E, Bányai É, Rhenzo González-C, Székely E, Szeberényi Sz, Borbás T, Pallai Zs, Kurucz T, Balázs A, Czinner E, Héthelyi É, Hagymási K, Bárkovits S, Pintér E, Bíró E, Fehér J, Blázovics A. Újabb adatok a természetes hatóanyagok in vitro és in vivo hatásmechanizmusának megértéséhez. Széchenyi Szimpózium. 2004, NKFP 1/016/2001. 3. May Z, Taba G, Blázovics A, Székely E, Bíró E, Fébel H, Szentmihályi K. Stripping-technika alkalmazása különböző mintákban lévő szelén meghatározásoknál voltammetriás módszerrel. Erdélyi Magyar Műszaki Tudományos Társaság. 2005, 54: 354-356. 4. Székely E, Szentmihályi K, Tasnádi Gy, Várnai K, Almási A, Blázovics A. Effect of alphalipoic acid on the status of selenium and elements in porphyria cutanea tarda patients with
130
10. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE
type 2 diabetes mellitus and heavy drinkers. International symposium on Trace Elements in the Food Chain (TEFC) May 25-27. 2006. Kongresszusi előadások, poszterek 1. Székely E, Pallai Zs, Rapavi E, Tasnádi Gy, Blázovics A. Porphyria cutanea tardában szenvedő betegek vérének rheologiai viszonyai és antioxidáns tulajdonságai. Korányi Frigyes Tudományos Fórumon 2002. április 25-én: 2. Székely E, Pintér E, Bárkovits S, Pallai Zs, Blázovics A. Szignifikáns epesav koncentrációnövekedés porphyria cutanea tarda-ban. Ph. D. Tudományos Napok 2002. június 7-8. Budapest. 3. Székely E, Várnai K, Bor M, Tasnádi Gy, Rapavi E, Blázovics A. A vasanyagcsere zavara, rheologiai viszonyok és a redox homeostasis kapcsolata porphyria cutanea tardában. Magyar Laboratóriumi Diagnosztikai Társaság 51. Nagygyűlése 2002. augusztus 28-31. 4. Székely E, Rapavi E, Tasnádi Gy, Bor M, Pusztai Á, Blázovics A. Lipidparaméterek, rheologiai viszonyok és szabadgyök-folyamatok porphyria cutanea tardában. A Magyar Belgyógyász Társaság 39. Nagygyűlése, Budapest, 2002. november 21-23. 5. Bor M, Székely E, Pusztai Á, Tasnádi Gy. Acut intermittens porphyria genetikai diagnosztikája: Három új mutáció a magyar populációban. Magyar Laboratóriumi Diagnosztikai Társaság 51. Nagygyűlése Gyula 2002. augusztus 28-31. 6. Pusztai Á, Bor M, Székely E, Tasnádi Gy. Autonóm neuropathia vizsgálata akut porphyriás betegekben. A Magyar Belgyógyász Társaság 39. Nagygyűlése, Budapest, 2002. november 21-23. 7. Székely E, Lugasi A, Bíró L, Tasnádi Gy, Blázovics A. „Short term” E-vitamin kezelés hatása a redox-homeosztázisra porphyria cutanea tardában. Ph.D Tudományos Napok 2003. április 10-11 Budapest. 8. Székely E, Bárkovits S, Pintér E, Tasnádi Gy, Blázovics A. E-vitamin kezelés hatása a rheologiai viszonyokra és a redox homeostasisra porphyria cutanea tardában. Harmadik Magyar Mikrokeringés Kongresszus 2003. május 9-10. Balatonkenese. 9. Székely E, Tasnádi Gy, Pallai Zs, Kurucz T, Rapavi E, Bor M, Pusztai Á, Blázovics A. Effectiveness of alpha-lipoic acid in porphyria cutanea tarda. Porphyrins & Porphyrias 2003 Prague September 21-24, 2003. 10. Bor M, Balogh K, Berkes E, Székely E, Pusztai Á, Tasnádi Gy, Hunyadi L. Genetic screening of acute intermittent porphyria in Hungary: an update. Porphyrins & Porphyrias 2003, Prague, September 21-24. 2003.
131
10. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE
11. Pusztai Á, Bor M, Székely E, Balogh K, Berkes E, Hunyadi L, Tasnádi Gy. Acute porphyria – but which one? Porphyrins & Porphyrias 2003, Prague September 21-24, 2003. 12. Székely E, Szentmihályi K, Tasnádi Gy, Várnai K, Szűcs M, Blázovics A. Element analysis in total blood of the patients with porphyria cutanea tarda. 4th International symposium on trace elements in human: New Perspectives 9-11 October 2003 Athens Greece. 13. Rapavi E, Kocsis I, Székely E, Bárkovits S, Pintér E, Blázovics A. Citrus flavonoidok hatása a rutin laboratóriumi paraméterekre hiperlipidémiás patkonyban. Ph.D Tudományos Napok 2003 április 10-11. Budapest. 14. Rapavi E, Bányai É, Szentmihályi K, Balázs A, Lugasi A, Székely E, Blázovics A Camellia sinensis tartalmú többkomponensű és monokomponensű teák antioxidáns tulajdonsága és fitokémiai vizsgálata. X. Jubileumi Primer Prevenciós Fórum 2003. május 22. Budapest. 15 Székely E, Tasnádi Gy, Várnai K, Blázovics A. Kontrollált porphyria cutanea tarda időskorban Magyar Gerontológiai Társaság Kongresszusa Szeged 2004. március 26-27. 16. Székely E, Tasnádi Gy, Blázovics A. Májfunkciós paraméterek és szabadgyök-folyamatok kapcsolata alkoholista és 2-es típusú diabetes mellitusban szenvedő porphyria cutanea tarda betegeknél. Ph. D. Napok 2004. 17. Székely E, Tasnádi Gy, Bor M, Szűcs M, Várnai K, Pintér E, Bárkovits S, Fehér J, Pallai Zs, Blázovics A. Redox-homeostasis szignifikáns javulása alfa-liponsavval kezelt alkoholista és diabetes mellitusban is szenvedő porphyria cutanea tardás betegeknél. A Magyar Laboratóriumi Diagnosztikai Társaság 52. Nagygyűlése Sopron 2004. szeptember 2-4. 18. Székely E, Tasnádi Gy, Szűcs M, Várnai K, Szentmihályi K, Kovács M, Blázovics A. E-vitamin- és alfa-liponsav-kezelés hatása phlebotomizált porphyria cutanea tardában szenvedők redox-homeostasisának változására. A Magyar Szabadgyök-Kutató Társaság III. Konferenciája, Debrecen 2005. október 13-15. 19. Blázovics A, Takács-Hájos M, Kocsis I, Fébel H, Szentmihályi K, Váli L, Székely E, Stefanovits-Bányai É. The effect of table beet extract on hyperlipidemy. Magyar Gasztroenterológiai Társaság 47. Nagygyűlés Balatonaliga, 2005 június 07-11. 20. Szentmihályi K, Kocsis I, Rapavi E, Fodor J, Székely E, Blázovics A. Magnesium therapy in hyperlipidemy. Magyar Gasztroenterológiai Társaság 47. Nagygyűlés Balatonaliga, 2005 június 07-11. 21. Dörnyei O, Kovács Á, Székely E, Dinya E, Blázovics A. Panaszt okozó gyümölcsök és zöldségek fogyasztására vonatkozó táplálkozási kérdőívek kiértékelése gyulladásos bélbetegségekben. A Magyar Szabadgyök-kutató Társaság III. Konferenciája Debrecen, 2005. október 13-15. 22. Blázovics A, Lugasi A, Kovács Á, Székely E, Váli L, Székely Gy, Fébel H, Pallai Zs, Kurucz T, Szilvás Á. Redox-homeosztázis tanulmányozására kifejlesztett módszerek alkalmazása 132
10. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE
természetes antioxidáns kiegészítő terápia hatásosságának megítélésére primer és szekunder prevencióban. Magyar Laboratóriumi Diagnosztikai Társaság 53. Nagygyűlése, Szeged, 2006. augusztus 30 - szeptember 2.
133
