9/16/2012
Materi Kuliah Bioteknologi Pertanian Prodi Agroteknologi Pertemuan Ke 4
TEKNIK FUSI SEL
Protoplasma • Sel tanpa dinding sel • Dapat digunakan sebagai eksplan • Digunakan untuk rekayasa genetika – Paling sering untuk ekspresi transien – transformasi konifer
Ir. Sri Sumarsih, MP. Email:
[email protected] Weblog: Sumarsih07.wordpress.com Website: agriculture.upnyk.ac.id
• Digunakan untuk membuat hibrid interspesifik
Fusi Protoplas: Mengapa menggunakan ini?
Produksi Hibrida Melalui Fusi Protoplas
• Karena dapat dilakukan • Dimungkinkan untuk persilangan secara luas • Digunakan untuk pengenalan ciri penyakit dan kualitas • Potensi yg sangat besar untuk masa depan jika ingin memecahkan permsalahan yang sulit di masa kini • Protoplas juga target untuk rekayasa genetika .
Empat tahap untuk produksi hibrida: • Isolasi Protoplas • FusiProtoplas • Seleksi Hibrida • Regenerasi tanaman
1
9/16/2012
Sumber Protoplasma • Dari organ tanaman spt daun, apex pucuk, buah, akar, bintil akar legum, koleoptil, lapisan aleuron pada serealia, atau dari kultur suspensi sel • Daun yang paling mudah dari jaringan mesofil, biasanya menggunakan pucuk plantlet yang muda dan steril. • Dari kultur suspensi sel umur 3-5 hari
Isolasi Protoplas secara enzimatik • Daun: lapisan epidermis dibuang • Letakkan daun dalam larutan(diberi osmotikum) – Isotonik sampai larutan yang hipertonik ringan – Biasanya mengandung mannitol atau sorbitol 500600 mM/L
• Tambahkan enzim – Selulase, hemiselulase, pektinase – Terjadi degradasi dinding sel • Pencucian dan pemurnian dg sentrifugasi
• Inkubasi untuk memisahkan protoplasma viabel
Isolasi Protoplas • Letakkan daun (atau menggunakan hasil kultur sel tanaman)dalam Buffer – Isotonik sampai larutan yang hipertonik ringan – Biasanya mengandung mannitol atau sorbitol
• Tambahkan enzim – Selulase, pektinase – Degradasi dinding sel
• Inkubasi (& pemurnian)
Pelaksanaan isolasi dan kultur protoplasma •20 ml suspensi sel, dipisahkan media dg selnya •Tambahkan 10 ml larutan enzim, campur, masukkan ke petridish • Inkubasikan 28o C 6 jam, saring dg saringan 50-100 μm •Pindahkan filtrat ke dalam tabung centrifuge, cuci dg menambahkan 5ml washing medium melalui filter •Centrifuge larutan pada 155xg selama 5 menit •Buang supernatan, ulangi sentrifugasi, tambah 10 ml float medium, centrifuge lagi pada 155xg selama 5 menit •Ambil larutan terkeruh, tambah 5 ml media kultur, centrifuge lagi •Supernatant dibuang, tambah media kultur 5 ml, hitung kerapatan protoplasma dg haemacytometer (1x100000)/ml •Teteskan protoplasma ke petridish yg diberi kertas saring lembab •Inkubasi di cahaya rendah, tambahkan 100 ul media kultur setelah 7-10 hari
2
9/16/2012
Hasil isolasi protoplasma
Protoplas ma dalam larutan
Daun plantlet kentang sbg sumber protoplasma
Media kultur protoplasma • Umumnya menggunakan media MS atau B5 dan modifikasinya • Diberi larutan osmotikum: manitol atau sorbitol 500-600 mM/L • Penambahan 1 mM/L CaCl2 meningkatkan pembelahan sel • ZPT: auksin & sitokinin utk inisiasi • Auksin yg digunakan: 2,4 D atau NAA • Sitokinin yg digunakan: BAP, Kinetin, 2i-P
Fusi sel pada bakteri
Enzym lisosim yang dapat merusak dinding sel bakteri
3
9/16/2012
Sel A
Tambahkan Enzim
Sel B
FUSI PROTOPLAS: • Tidak terjadi secara spontan • Tambah promotor fusi – PEG / Elektrik / Virus
• Kemudian diinkubasi • Tiga kemungkinan produk hasil fusi: – Sel A=Sel A – Sel B=Sel B – Sel A=Sel B
Terminologi dalam teknik fusi sel • Hibridisasi genetik: fusi protoplasma sel yg berbeda • Heterokarion: gabungan 2 atau lebih inti sel protoplasma • Cybrid: gabungan sitoplasma 2 sel atau lebih
• Inti biasanya tidak berfusi (sel heterokarion)
4
9/16/2012
Tambah Promotor Fusi
Fusi Protoplas
PROTOPLASMA DILIHAT DI BAWAH MIKROSKOP
HASIL FUSI PROTOPLASMA
Regenerasi Protoplasma menjadi plantlet •Osmotikum digunakan untuk proteksi osmotik dalam media kultur • Dalam seminggu-10 hari, protoplasma viable telah meregenerasikan dinding selnya dan membelah diri • Tekanan osmose
media perlahan-lahan diubah dg cara meneteskan media tanpa manitol atau sorbitol • Tekanan osmose media apbl tdk diubah, maka tekanan osmose media yg tinggi akan menghambat pembelahan sel
5
9/16/2012
KULTUR PROTOPLASMA UNTUK MERAKIT TANAMAN HIBRIDA
Regenerasi protoplasma menjadi plantlet bersifat hibrida
6
