BIOTEKNOLOGI Victoria Henuhili, MSi *)., Jurdik Biologi FMIPA UNY
Sub Topik : FUSI PROTOPLAS KULTUR PROTOPLAS Berkembang pada tahun1960, setelah menghilangkan dinding sel secara enzimatis
diketemukan
cara
FUSI PROTOPLAS Memfusikan 2 macam protoplasma yang sama atau berbeda, sehingga menghasilkan hibrida sel yang diharapkan dapat mengadakan regenerasi menjadi tanaman baru dengan sifat yang baru Semua informasi genetik yang dikehendaki tidak berada dalam protoplasma yang sama
SUMBER PROTOPLAS - Jaringan daun, kalus, kultur suspensi sel, kotiledon, bunga dsb
FAKTOR YANG MEMPENGARUHI KEBERHASILAN & VIABILITAS PROTOPLAS - Kondisi jaringan donor Sehat, kecepatan pertumbuhan, keadaan sitoplasma yang menyusun jaringan - Larutan enzim yang digunakan isolasi protoplasma - Waktu inkubasi & agitasi lama waktu inkubasi dan agitasi untuk hidrolisa dinding sel bervariasi, tergantung jaringan serta konsentrasi larutan enzim - Prosedur pencucian dan cara infiltrasi - Faktor lingkungan Cahaya, temperatur, kelembaban tanah dan kesuburan tanah dari tanaman yang akan diisolasi protoplasmanya - Penyimpanan jaringan pada tempat yang gelap 24 - 72 jam
1
*)
[email protected]
KEBERHASILAN ISOLASI PROTOPLAS Diketahui dengan menggunakan pewarnaan evan biru - Protoplas yang tidak berwarna = viabel Menghambat masuknya zat warna ke dalam protoplas - Yang berwarna biru = mati UJI VIABILITAS MENGGUNAKAN PEWARNA FLOURESEIN DIACETATE (FDA) Dapat dilihat pada mikroskop flouresensi - Sel-sel yang hidup akan nampak memancarkan cahaya flouresensi kuning atau hijau - Biasanya untuk menghitung sel yang hidup / mati secara simultan digunakan zat warna ganda yaitu FDA dan PI (Propidium Iodise) KULTUR PROTOPLAS - Protoplas dikultur pada media cair - Suspensi protoplas dikultur pada tetes cairan dalam cawan petri, kemudian disegel dengan parafilm - Kultur diinkubasi pada temperatur 25 - 28oC dengan intensitas cahaya 100 - 500 Lux (gelap) - Setelah regenerasi dinding sel dan pembelahan telah dimulai dalam medium cair tersebut, sel dapat dipindahkan ke medium padat FUSI PROTOPLAS - Spontan - Induksi INDUKSI FUSI SECARA KIMIA / ELEKTRIK 1. NaNO3 2. Ca++ konsentrasi tinggi & Ph tinggi Contoh : Fusi protoplas 2 jenis tanaman tembakau pada larutan dengan konsentrasi ion Ca++ ( 50 Mm/liter CaCl2.2H2O) & Ph 10,1 3. Polietilen Glikol (PEG) PEG dipakai dengan konsentrasi 25% - 30% dan BM 1000 - 6000 4. Fusi Elektrik - Kontak membran - Pemulihan bentuk, fusi inti dll
2
*)
[email protected]
KONDISI KULTUR & LINGKUNGAN PROTOPLAS Syarat Faktor Lingkungan : - PH 5,5 – 5,8 - Osmolaritas 0,35 – 0,70 M O
O
- Temperatur 22 C – 28 C - Intensitas cahaya rendah > 2000 LUX
MEDIUM KULTUR PROTOPLAS Medium kultur protoplas terdiri dari : -
Osmotic stabilizer (Manitol & Sorbitol untuk menjaga osmolaritas kedua senyawa ini digunakan bersama-sama atau terpisah. Sorbitol digunakan sebagai sumber karbon
-
Nutrien anorganik Terdiri dari amonium dan nitrat. Untuk menghilangkan pengaruh toksis dari ammonium ditambahkan asam suksinat..
-
Sumber karbon Glukose (dapat juga ditambahkan sukrose dengan perbandingan yang sama. Penggunaan sukrose saja tidak cocok untuk medium protoplas)
-
Vitamin Thiamin, asam nikotianat dan peridoksin
-
Nitrogen organik Yang sering digunakan: 0,01-0,25% asam casamino, atau kasein hidrolisat. Dapat juga ditambah 1– 5 Mm/L Glutamin atau 1–5 % air kelapa
-
Zat pengatur tumbuh Auksin dan sitokinin dibutuhkan untuk menginduksi pembelahan sel dan regenerasi.
-
Auksin yang dipakai: 2,4D & NAA
-
Sitokinin yang dipakai : Kineti, Bensiladenin & Zeatin
ISOLASI, FUSI dan KULTUR PROTOPLAS - BAHAN : Mesofil daun muda seedling - LARUTAN ENZIM : 1% enzim selulosa 0,1% maserosim 15% air kelapa (pengganti MES) 0,5 M sukrosa Garam : CaCl2.2H2O 10Mm
3
*)
[email protected]
- STERILISASI BAHAN SAMPEL 1. 1–3 gr bahan (mesopil daun) dicuci sampai bersih 2. masukkan dalam Etanol 70% 1 mnt Kemudian sodium hipoklorit 1 – 5% + Tween 20 selama 10 mnt 3. Bilas dengan air steril 3 kali - ISOLASI PROTOPLAS & PENCUCIAN 1. Sayat epidermisbawah daun dengan pinset 2. Iris daun & hilangkantulang daun 3. Masukkan irisan daun dalam preplasmolysing agent selama 1 jam, goyang dengan shaker (40 rev/mnt), pada keadaan gelap dan O
temperatur 25 C 4. Preplasmolysing agent dibuang, ganti larutan enzim 5. Inkubasikan selama 18 Jam 6. Saring bahan dengan filter nilon 200 Mm 7. Saring lagi dengan filter nilon 80 Mm 8. Pindahkan bahan ke tabung sentrifuse 9. Sentrifus selama 3 mnt dengan kecepatan 100 x g 10. Buang supernatan dengan menggunakanpipet 11. Tambahkan larutan pencuci 12. Protoplas di atas permukaan, dipipet diamati di atas gelas benda di bawah mikroskop
- FUSI PROTOPLAS 1. Protoplas viabel dipindah ke tabung yang lain 2. Suspensi dengan larutan pencuci (0,5 M Sukrosa & 5 – 10 mM CaCl2.2H2O) 3. Ganti larutan pencuci 1X 4. Protoplas siap difusi - PEG dengan BM 6000 konsentrasi 25 – 35% - 0,3 M Glukosa - 50 Mm CaCl2.H2O
4
*)
[email protected]
- Ph 5,8 5. Ambil 0,5 ml protoplas yang viabel 6. Tambahkan 1,0 ml larutan PEG 7. Diamkan selama 5 – 20 menit 8. Lihat di bawah mikroskop 9. Apabila sudah banyak terjadi fusi, larutan PEG dipipet dikeluarkan 10.
Ganti dengan larutan PEG + CaCl2 konsentrasi tinggi dengan perbandingan 1 : 2
11. Biarkan 10 menit 12. Keluarkan larutan PEG dengan pipet 13. Ganti dengan larutan pencuci suspensi 14. Inkubasi 5 mnt 15. Sentrifuse 3 mnt 16. Cuci dengan larutan pencuci 17. Kulturkan protoplas dalam medium kultur 18. Regenerasi dinding mekroskop UV
5
*)
[email protected]
dapat
diamati
dengan
menggunakan
