Protokol do cvičení pro předměty ´Biotechnology in Horticulture´ a ´Breeding of Fruit Species´ ___________________________________________________________________________ Protokol byl vytvořen za finanční podpory grantu FRVŠ - G4 2149/2006 Protokol sestavila Ing. Lenka Bláhová __________________________________________________________________________
Název úlohy: Detekce rostlinných virů pomocí RT-PCR 1. ČÁST - Izolace RNA z rostlinného materiálu Časová náročnost: 4 hodiny Potřebné vybavení: tlouček; třecí miska; skalpel; lihový kahan; centrifuga; termoblok nebo vodní lázeň s teploměrem; digestoř (pro práci s merkaptoethanolem); třepačka „vortex“; vyvíječ ledu nebo vymrazovací destičku pro 1500 µl mikrozkumavky; pipety 0.5-10 µl, 10100 µl, 20-200 µl, 100-1000 µl a 1000-5000 µl; vyvařené plastové špičky pro pipety; „RNase free“ plastové špičky s filtrem pro pipetu 20-200 µl; vyvařené plastové mikrozkumavky 2 000 µl, 1 500 µl, 250 µl; ochranné rukavice; papírové ubrousky
Potřebné chemikálie a roztoky: guanidin hydrochloridový třecí pufr, mořský písek, 10 % vodný roztok SLS (sodium laury sarkosyl), merkapthoethanol , 6 M NaI, 96% ethanol, vodní suspenze oxidu křemičitého, promývací pufr, RNáz prostá voda Doporučená opatření: •
• • •
smyslem protokolu je získat RNA, která je lehce degradovatelná RNázami. RNáza je běžně přítomna na pokožce člověka jako přirozená ochrana před RNA viry. V průběhu celého protokolu je proto nutné používat ochranné rukavice, které především chrání pokožku před přímým stykem s chemikáliemi a sníží riziko kontaminace vzorku RNázami. pro snížení rizika degradace RNA a kontaminací mezi jednotlivými vzorky otevírat mikrozkumavky se vzorky pouze na nezbytně nutnou dobu při přepipetovávání vzorků do nových mikrozkumavek v průběhu protokolu pro každý vzorek použít novou špičku při přidávání roztoků ke vzorkům v průběhu izolace, lze použít jednu špičku pouze v případě, že nebyla kontaminována vzorkem!
Pracovní postup: • • •
podle počtu vzorků nachystat a popsat vyvařené mikrozkumavky, zapnout termoblok a nastavit teplotu na 70 °C, do třecí misky s tloučkem nasypat malé množství mořského písku, přidat 2 ml třecího pufru a 200 mg rostlinného pletiva obsah misky rozdrtit tloučkem až vznikne homogenní kaše a obsah přelít do připravené plastové mikrozkumavky o objemu 2 ml
Pozn.: Během homogenizace dochází k oxidaci polyfenolických látek, které mohou nevratně reagovat s proteiny a nukleovými kyselinami. Tyto složky negativně ovlivňují výtěžek izolace. V průběhu homogenizace, dbát na to, aby porušená pletiva nebyla příliš dlouho v kontaktu se vzduchem a tím zabránit oxidaci polyfenolických látek. • • •
• • •
•
• •
• • •
• •
• •
mikrozkumavky zavíčkovat, přemístit do centrifugy a odstředit po dobu 3 minut při 1300 rpm do nové (1,5 ml) mikrozkumavky přemístit 500 µl vodné fáze a přidat 100 µl 10% SLS (sodium lauryl sarkosyl) stojánek se vzorky přemístit do zapnuté digestoře a přidat 5 µl merkaptoethanolu , mikrozkumavky důsledně zavíčkovat, lehce promíchat a umístit do termobloku předehřátého na 70 °C inkubovat 10 minut při 70 °C a následně zchladit na ledu po dobu 5minut mikrozkumavky přemístit do centrifugy a odstředit je po dobu 10 minut při 1300 rpm do nových mikrozkumavek (1,5 ml) přesát 300 µl vodné fáze a přidat v následujícím pořadí: 1. 300 µl 6M NaI 2. 150 µl 96% etanolu 3. přidat 25 µl vodní suspenze oxidu křemičitého mikrozkumavky se vzorky umístit do držáku třepačky „vortex“, ve kterém jsou udělány otvory umožňující horizontální pohyb mikrozkumavek. Otáčky třepačky „vortex“ nastavit na hodnotu 600 otáček.min-1 (ne více), zapnout a nechat inkubovat 20 minut. Během tohoto kroku dojede k navázání nukleových kyselin na krystalickou mřížku oxidu křemičitého mikrozkumavky vyjmout z držáku třepačky, přemístit je do centrifugy a odstředit po dobu 1 minutu při 5000 rpm odlít vodnou fázi, přidat 500 µl promývacího pufru, uzavřít mikrozkumavky a důkladně je promíchat na třepačce „vortex“ a pomocí ultrazvukové lázně (cílem je, aby se usazenina oxidu křemičitého odlepila od stěn tuby a vznikla neprůhledná suspenze) mikrozkumavky přemístit do centrifugy a odstředit při 5000 rpm po dobu 1 minuty zopakovat předchozí dva kroky odlít vodnou fázi, zbytky promývacího pufru nechat odkapat z tub otočených dnem vzhůru na čistý papírový ubrousek, poté nechat tuby volně otevřené na vzduchu cca 5 minut, aby došlo k částečnému oschnutí usazeniny přidat 150 µl RNáz prosté vody, usazeninu s vodou důkladně promíchat na třepačce „vortex“, případně pomocí ultrazvukové lázně mikrozkumavky přemístit do termobloku předehřátého na 70 °C a inkubovat po dobu 4 minut. V průběhu tohoto kroku dojde k uvolnění zachycených nukleových kyselin z mřížky oxidu křemičitého do roztoku odstředit po dobu 3 minut při 13000 rpm za použití „RNase free“ pipetové špičky s filtrem opatrně odsát vodní fázi, tak aby nedošlo k její kontaminaci usazeninou a přemístit ji do nové plastové mikrozkumavky 250 µl (roztok obsahuje nukleové kyseliny). Získaný izolát uchováváme krátkodobě při -20ºC, dlouhodobě při -80ºC.
2. ČÁST - One step RT-PCR za použití Reverse-iTTM One step RT-PCR Kit (fa. ABgene) Časová náročnost: 2 hodiny 45 minut Potřebné vybavení: flow box; třepačka „vortex“; mikrocentrifuga; ; termocykler; pipety 0.5-10 µl, 10-100 µl, 20-200 µl, 100-1000 µl; „RNase free“ plastové špičky s filtrem 1-10 µl, 10-100 µl, 100-1000 µl; „RNase free“ plastové mikrozkumavky 500 µl, 250 µl; ochranné rukavice; vymrazovací destička
Potřebné chemikálie a roztoky: Reverse-iTTM One step RT-PCR Kit (fa. ABgene), neionizovaná voda, sekvenčně specifické primery pro virus
Doporučená opatření: • • • •
jedná se o práci s RNA, je vhodné pracovat ve flow boxu, který je vyhrazen k tomuto účelu používat jednorázové plastové rukavice, které chrání pokožku před stykem s chemikáliemi a zároveň snižují riziko vlivu RNáz, které jsou přítomny běžně na rukou pro snížení rizika degradace RNA a kontaminací mezi jednotlivými vzorky otevírat mikrozkumavky se vzorky pouze na nezbytně nutnou dobu při přepipetovávání vzorků do nových mikrozkumavek v průběhu protokolu pro každý vzorek použít novou špičku
Pracovní postup: • •
zapnout flow box, připravit a popsat nové mikrozkumavky na vzorky v nové mikrozkumavce (500µl ) připravit mix o složení uvedeném v následující tabulce pro daný počet vzorků + negativní kontrolu + blank (vzorek složený pouze z mixu, bez templátu RNA) + pozitivní kontrolu výchozí pracovní koncetrace koncetrace
Složka RNáz prostá voda 2 x RT-PCR Master Mix R primer (specifický pro hledaný vir) F primer (specifický pro hledaný vir) TM
Reverse-iT RTase Blend Celkový objem mixu
• •
objem
2×
1×
8,5 µl 12,5 µl
10 µM
0,2 µM
0,5 µl
10 µM
0,2 µM
0,5 µl
50 U/µl -
25 U -
0,5 µl 22,5 µl
počet vzorků včetně blanku a kontrol
rozpipetovat 22,5 µl mixu do připravených mikrozkumavek mikrozkumavku s blankem (vzorek složený pouze z mixu, bez templátu RNA) zavíčkovat
• •
do mikrozkumavek připravených pro vzorky a negativní kontrolu přidat 2,5 templátu RNA a řádně je zavíčkovat nakonec přidat stejné množství templátu RNA do mikrozkumavky pro pozitivní kontrolu a zavíčkovat
Pozn.: Je vhodné dodržet posloupnost vnášení templátů do mixu tak, aby blank mohl posloužit jako kontrola, zda mix nebyl kontaminován. Nebo také aby negativní kontrola mohla sloužit jako kontrola pro odhalení možných kontaminací při vnášení templátů vzorků do mixu a aby nedošlo ke kontaminaci vzorků pozitivní kontrolu. • •
zavřené tubičky lehce promíchat a stočit na impuls v mikrocentrifuze mikrozkumavky přemístit do termockyleru a spustit daný program
Teplotní program doporučený pro one-step RT-PCR s využitím kitu (fa. ABgene)je uveden v následující tabulce. Teplotní program, přesněji teplota hybridizace primerů s templátem (A), optimální časový interval pro hybridizaci primerů (B), délka trvání prodlužování řetězce (C) a kolikrát má být cyklus (krok3 – krok5) opakován se při detekci různých virů liší. Podmínky jsou determinovány použitými primery (respektive vychází z vlastností RT-PCR produktu) a pro jednotlivé viry se liší. Při zadávání těchto hodnot do programu termocykleru je nutné vycházet z publikace o použitém primeru a dodržet doporučené podmínky.
Krok 1 cDNA syntéza 2 3 denaturace 4 hybridizace primerů 5 prodlužování řetězce
podmínky teplota v °C Čas 47 30 min 2 min 94 20 s A
opakování kroku 3-5
C 72
6 dosyntetizování řetězce 4 7 chlazení •
B
počet cyklů 1 1
5 min 10 min 1
Po proběhnutí RT-PCR reakce se obecně doporučuje čerstvé produkty ihned analyzovat na gelu, případně lze RT-PCR produkty krátkodobě uchovat v chladu v ledničce nebo při -5°C
3. ČÁST - Separace produktů jejich barvení a vizualizace Časová náročnost: 1 hodina 45 minut Potřebné vybavení: horizontální elektroforéza; zdroj napětí; pipety 0.5-10 µl, 2-20 µl; plastové špičky 1-10 µl, 10-100 µl; forma na gel a hřebínek pro vytvoření komor; ochranné brýle; ochranné plastové rukavice; laboratorní váhy; mikrovlnná trouba; elektromagnetická míchačka; UV transiluminátor; fotoaparát s červeným filtrem; kádinka
Doporučená opatření: •
při manipulaci s agarózovým gelem, do kterého byl přidán ethidium bromid, pracujeme s mutagenní látkou, je nezbytné DŮSLEDNĚ používat příslušné ochranné pomůcky a dodržovat vhodné laboratorní návyky!
Potřebné chemikálie a roztoky: agaróza, TAE 1x, velikostní standard (např. pBR322/ BsuRI fa. Fermentas), dávkovací pufr; pracovní roztok ethidium bromidu
Pracovní postup: • •
• • •
pro přípravu většího (pro 40 vzorků) 1,5 % agarózového gelu smícháme v skleněné kádince 2,25 g agarózy a 150 ml pufru TAE 1x kádinku se suspenzí zakrýt, přenést do mikrovlnné trouby a nechat rozehřát dokud není obsah kádinky úplně čirý, případně promíchat skleněnou tyčinkou a doplnit odpařené množství TAE 1x pufru na daný objem čirý gel přenést na elektromagnetickou míchačku a nechat chladit připravit formu pro gel a hřebínek pro vytvoření komor po ochlazení gelu na úroveň kdy je nádoba s gelem udržitelná v ruce, přidat ethidium bromid v dávce 1 µl pracovního roztoku na 10 ml gelu a nechat promíchat
Pozn.: Od této chvíle při manipulaci gelem pracujeme s mutagenní látkou ethidium bromid, je třeba DŮSLEDNĚ dodržovat vhodné laboratorní návyky! • • • • • •
gel nalít do připravené formy, umístit hřebínek a nechat ztuhnout připravit vzorky: smíchat 4 µl dávkovacího pufru a 17 µl RT-PCR produktu po ztuhnutí gelu odstranit hřebínek a gel přemístit do vertikální elektroforézy tak, aby komory gelu byl celé ponořeny v elektroforetickém pufru TAE 1x pomocí pipety nanést vzorky do komůrek gelu a na každý gel nanést do jedné z komůrek také 10 µl velikostního standardu elektroforézu přikrýt víkem a připojit ke zdroji. Nastavit podmínky separace na 115 V a nechat běžet po dobu cca 15 minut gel přenést na transiluminátor, vizualizovat a výsledek zdokumentovat pomocí fotoaparátu s červeným filtrem
Složení potřebných roztoků pro protokol detekce rostlinných virů pomocí RT-PCR Složení roztoků pro 1. část - izolace nukleových kyselin Složení guanidin hydrochloridového třecího pufru Chemikálie
koncentrace
navážka na 100 ml roztoku
Guanidin hydrochlorid
6M
57,32 g
Octan sodný, pH 5,2
0,2 M
1,64 g
EDTA
25 mM
0,93 g
Octan draselný
1M
9,82 g
PVP-40
2,50%
2,5 g
Složení 10% roztoku SLS (sodium laury sarkosyl) – v 50 ml deionizované vody rozpustit 5 g sodium laury sarkosylu Složení promývacího pufru chemikálie
Tris-HCl, pH 7,5 EDTA NaCl Ethanol
zásobní roztok
Pracovní roztok
c
C
100 ml
1,211g / 10 mM 1 ml 10ml 0,372g / 0,1 M 0,5 mM 500 µl 10ml 2,92g / 0,5 M 50 mM 10 ml 100ml 50% 50 ml 1M
Složení a příprava 6M jodidu sodného navážka na chemikálie roztoku Na2SO4
0,75 g
NaI
36 g
40 ml
Příprava vodní suspenze oxidu křemičitého Pro přípravu 500 ml suspenze oxidu křemičitého bylo smícháno 60 g SiO2 a deionizované vody a vzniklá suspenze byla nechána 24 hodin stát v klidu pro ustálení. Po ustálení se odlilo
horních 470 ml supernatantu, zbytek v kádince byl doplněn vodou do 500 ml, rozmíchán a opět nechán ustálen po dobu 5 hodin. Poté bylo odlito 440 ml supernatantu. U zbývající suspenze bylo upraveno pH na hodnotu 2 pomocí HCl. Na závěr byl roztok autoklávován a skladován v tmavé lahvi při 4 °C.
Složení roztoků potřebných pro 3. část - separace RT-PCR produktů Složení a příprava pufru TAE 1x TAE 1x se připraví ředěním zásobního roztoku TAE 50x s vodou v poměru 1:49. Složení zásobního pufru je uvedeno v následující tabulce.
Chemikálie
Pro přípravu 1000 ml smíchat
Tris base Kyselina octová ledová EDTA
242,2 g 57,1 ml 18,61 g
Složení dávkovacího pufru
Chemikálie
navážka pro 10 ml
Bromphenol blue Orange G Ficoll
0,025 g 0,05 g 1,5 g
Dávkovací pufr je vhodné pro dlouhodobé udržení skladovat při 5 °C. Část roztoku s nímž se momentálně pracuje je možné uchovávat při pokojové teplotě. Pracovní roztok ethidium bromidu - jedná se roztok ethidium bromidu v dávce 0,5 µg na ml vody
