PERBANDINGAN ANTARA EKSPRESI TGF β PADA PROSES PENYEMBUHAN REPARASI RUPTUR TENDON ACHILLES DENGAN DAN TANPA PEMBERIAN SEL PUNCA MESENSIMAL SUMSUM TULANG PADA KELINCI Ixnatius Ariyando* Heri Suroto** Djoko Roeshadi*** *. Resident Orthopedi dan Traumatologi Surabaya ** Konsultan senior Departemen Orthopedi dan Traumatologi, RSU Dr. Soetomo, Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga, Surabaya *** Profesor dan konsultan senior Departemen Orthopedi dan Traumatologi, RSU Dr. Soetomo, Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga, Surabaya
ABSTRAK Pendahuluan: Setiap proses penyembuhan pada manusia dewasa didapatkan adanya kadar TGF-β yang tinggi, hal ini terjadi juga dengan pola yang sama pada penyembuhan tendon pada insersinya di tulang. Sel punca mesensimal sumsum tulang tidak hanya membantu diferensiasi fibroblas menjadi tenosit tapi juga dapat melepaskan faktor pertumbuhan yang dapat memodulasi penyembuhan tendon. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi ekspresi dari TGF-β pada proses penyembuhan reparasi tendon achilles kelinci yang diberi sel punca mesensimal sumsum tulang. Metode: Penelitian ini menggunakan post-test only control group design study. Delapan belas kelinci putih New Zealand digunakan dalam penelitian ini. Model traumanya adalah luka tajam komplit melalui midsubstance dari tendon achilles. Tendon yang terpotong segera direparasi dengan pejahitan modified Kessler menggunakan prolene 4.0 dan running suture epitendineous menggunakan prolene 5.0. Kedua tungkai dilakukan perlukaan, tendon achilles kanan diberi sel punca mesensimal sumsum tulang dan yang kiri tidak diberi sel punca. Spesimen diperiksa pada minggu keempat. Pemeriksaan immunohistokimia dilakukan untuk mengevaluasi ekspresi TGF-β pada tendon achilles yang telah diberi sel punca dibandingkan dengan kelompok kontrol yang tidak diberi sel punca. Hasil: ekspresi TGF-β yang tinggi didapatkan pada 66,7% dari sampel yang diberi sel punca, akan tetapi hanya 11,1% pada grup kontrol. Mann-Whitney test yang digunakan sebagai analisis statistik, menunjukkan perbedaan ekspresi TGF-β yang signifikan pada penyembuhan reparasi tendon achilles antara grup yang diberi sel punca mesensimal dengan grup kontrol yang tidak diberi sel punca mesensimal (p=0,016). Diskusi: TGF-β, sebagai faktor pertumbuhan yang utama tidak hanya bertanggung jawab atas penyembuhan tendon tetapi juga proses fibrosis yang berlebihan yang mengarah kepada perlekatan. Pada penelitian ini didapatkan peningkatan TGF-β lebih kepada penyembuhan tendon yang lebih baik, bukan kepada proses fibrosis. Kata kunci : sel punca mesensimal, penyembuhan tendon, TGF-β
PENDAHULUAN
Kerusakan tendon dapat terjadi secara akut ataupun kronik, baik karena faktor intrinsik maupun ekstrinsik. Untuk kasus-kasus trauma, faktor ekstrinsik lebih dominan. Bila terjadi suatu kerusakan atau cedera, tentu hal ini dapat menimbulkan morbiditas yang cukup mengganggu bagi pasien. Biasanya hal ini membutuhkan waktu beberapa bulan untuk kembali pada fungsi semula. Usaha-usaha rekayasa jaringan membuktikan bahwa konstruksi cellscaffold based dapat meningkatkan proses penyembuhan tendon pada defek tendon. Penelitian-penelitian eksperimental menunjukkan gambaran histologis dan fungsi biomekanik yang lebih baik pada defek tendon yang diisi dengan scaffold yang telah dilumuri serbuk sel punca mesensimal yang diambil dari sumsum tulang dibandingkan dengan scaffold tanpa sel punca mesensimal. Tendon memiliki beberapa variasi dan bentuk dan terdiri dari komponen matriks intraselular maupun ekstraselular. Struktur tendon terdiri dari fibril kolagen, serat kolagen, untaian ikatan serabut penyusun tendon, tendon itu sendiri, dan epitenon. (Alphonsus et al, 2007) Penelitian-penelitian pada tendon umumnya dilakukan pada defek tendon, dimana segmen tendon digantikan dengan konstruksi tendon yang telah mengalami rekayasa jaringan. Pada aplikasi klinis, ruptur tendon atau laserasi yang memerlukan primary repair jauh lebih sering dijumpai daripada trauma tendon dengan defek yang memerlukan graft tendon. Perbaikan yang bermakna penyembuhan tendon telah didapatkan melalui kemajuan teknik operasi dan kemajuan di bidang rehabilitasi, tetapi tetap saja masih didapati masalah reruptur pada tendon yang telah dijahit disamping problem perlekatan. Karena itu selain terus mengembangkan metode operasi dan rehabilitasi yang lebih baik, hasil akhir yang lebih baik secara klinis
juga dapat dioptimalkan dengan memodulasi proses penyembuhan, salah satunya dengan aplikasi sel punca pada sisi yang dijahit setelah ruptur. (Alphonsus et al, 2007) Efek transplantasi sel punca mesensimal bukan hanya untuk menuntun diferensiasi akan tetapi juga untuk melepaskan faktor parakrin seperti faktor pertumbuhan dan sitokin. Transforming growth factors-β ( TGF-β ) adalah sitokin multifungsional yang meregulasi proses biologis yang luas termasuk proliferasi sel, migrasi, deferensiasi, apoptosis dan deposisi matriks ekstraselular yang berperan penting dalam proses penyembuhan tendon. Gumpalan darah yang terbentuk disekitar tendon yang cedera mengandung berbagai macam sel dan dengan segera melepas berbagai macam faktor pertumbuhan antara lain TGF-β dan VEGF. (Moloy, 2003) Pada penyembuhan luka orang dewasa didapatkan kadar TGF-β yang tinggi ( Shah, 1995 ), demikian pula didapatkan pola yang sama pada penyembuhan dari insersi tendon pada tulang. ( Galatz, 2006 ) Penggunaan sitokin dan faktor pertumbuhan untuk memodulasi penyembuhan tendon sebagian besar tetap merupakan suatu eksperimen dan terbatas pada penyelidikan in vitro dan pada binatang. Penggunaan klinis faktor pertumbuhan untuk penanganan problem pada tendon belum pernah dilaporkan. (Sharma , 2005 ) MATERIAL DAN METODE
Binatang coba dibagi menjadi dua kelompok. Kelompok pertama, kelompok perlakuan, tendon achiles kanan dipotong secara tajam pada pertengahan, dijahit secara primer dengan modified kessler suture menggunakan prolene 4.0 dan diperkuat dengan running suture menggunakan prolene 5.0. Kemudian repair site disuntikkan sel punca
mesensimal. Sementara kelompok kedua sebagai kelompok kontrol, dilakukan prosedur yang sama dengan kelompok perlakuan tetapi tidak di aplikasikan sel punca mesensimal. Terminasi dan pemeriksaan dilakukan dilakukan pada minggu ke empat. Setelah dilakukan pemotongan secara tajam pada tendon achiles, kemudian dilakukan penjahitan primer dengan metode modified Kessler menggunakan benang prolene 4.0 dan diperkuat dengan running suture menggunakan benang prolene 5.0. Kelompok tendon achiles yang digunakan untuk eksperimen didapat dari tendon achiles ekstremitas inferior kanan sementara untuk kelompok kontrol dari tendon achiles ekstremitas inferior kiri Umur rata-rata kelinci 6 bulan dan berat 2,0 +/- 0,5 kg. Sel punca pada penelitian ini didapat dari sumsum tulang femur kelinci sejenis yang telah ditumbuhkan sebelumnya. Parameter yang dievaluasi yaitu gambaran imunohistokimia sel kolagen tipe-1 yang dibandingkan antara kelompok coba dan kontrol. HASIL
Telah dilakukan penelitian eksperimental pada 9 ekor kelinci putih New Zealand. Kelompok tendon achilles yang mendapat perlakuan adalah tendon achilles ekstremitas inferior kanan sementara untuk kelompok kontrol adalah tendon achilles ekstremitas inferior kiri. Tidak didapatkan mortalitas dalam perawatan selanjutnya. Terminasi dan pemeriksaan immunohistokimia dilakukan dilakukan pada minggu ke-empat. Data baku hasil penelitian eksperimental proses penyembuhan tendon achilles kelinci pada minggu ke-empat kemudian diolah sesuai tujuan dan hipotesis penelitian. Data baku meliputi informasi jumlah ekspresi Transforming Growth Factor-β (TGF-β) pada
penyembuhan reparasi tendon yang diberi sel punca dan yang tidak diberi sel punca.
Gambaran studi immunohistokimia TGF-β pada minggu ke-4 kelompok kontrol
TGF-β
Perlakuan 0-25% 26-50% 51-75%
Tanpa Stem Cell
Stem Cell
Total
Total
1
7
1
9
11,1%
77,8%
11,1%
100,0%
0
3
6
9
,0%
33,3%
66,7%
100,0%
1
10
7
18
5,6%
55,6%
38,9%
100,0%
Dari tabel tampak bahwa pada sampel yang diberi sel punca, ekspresi TGF-β dengan densitas tinggi (51-75%) adalah sebanyak 66,7% sampel, sedangkan kontrol hanya sebanyak 11,1% sampel.
Dari hasil uji Mann-Whitney menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang bermakna pada ekspresi TGF-β antara penyembuhan reparasi ruptur tendon yang diberi sel punca dengan yang tidak diberi sel punca (p = 0,016 ).
DISKUSI Gambaran studi immunohistokimia TGF-β pada minggu ke-4 kelompok perlakuan
Test Statisticsb
TGF_b
Mann-Whitney U
16.500
Wilcoxon W
61.500
Z
-2.412
Asymp. Sig. (2-tailed)
.016
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]
.031a
a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan-Kontrol
Berdasarkan vaskularisasinya, tendon dibagi menjadi dua kelompok yaitu : tendon yang di kelilingi oleh paratenon akan mendapat lebih banyak suplai darah hingga di sebut sebagai tendon vaskular sementara tendon yang di kelilingi oleh sheath , memiliki relatif sedikit vaskularisasi, merupakan tendon avaskular. Tendon achiles merupakan kelompok tendon yang kaya vaskularisasi, sehingga orientasi longitudinal serabut kolagennya sudah terjadi pada minggu ketiga dan keempat, berbeda dengan tendon tipe avaskular yang orientasi longitudinal serabut kolagennya mulai pada minggu ke enam. Secara histologi tendon yang terputus memperlihatkan peningkatan proliferasi fibroblas dan vaskular pada minggu ketiga atau keempat juga. Dalam waktu yang sama terjadi pembentukan tipe-1 yang menggantikan kolagen tipe-3 dimana proses remodeling dimulai. Perbandingan ekspresi TGF-β pada sisi penyambungan tendon
Dari tabel diatas tampak bahwa sampel yang diberi sel punca mengekspresikan TGF-β dengan densitas tinggi (51-75%) sebanyak 66,7% sampel, sedangkan sampel yang tidak diberi sel punca mengekspresikan TGF-β dengan densitas tinggi (51-75%) sebanyak 11,1%. Ini menunjukan bahwa pada sampel yang diberi sel punca mengekspresikan TGF-β lebih tinggi daripada yang tidak diberi sel punca..
Dari tabel diatas tampak bahwa sampel yang diberi sel punca mengekspresikan TGF-β dengan densitas tinggi (51-75%) sebanyak 66,7% sampel, sedangkan sampel yang tidak diberi sel punca mengekspresikan TGF-β dengan densitas tinggi (51-75%) sebanyak 11,1%. Ini menunjukan bahwa pada sampel yang diberi sel punca mengekspresikan TGF-β lebih tinggi daripada yang tidak diberi sel punca..
Hal ini menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang bermakna ekspresi TGF-β pada kelompok penyembuhan reparasi ruptur tendon achilles yang diberi sel punca mesensimal dengan kelompok yang tidak diberi sel punca mesensimal Pada penelitian yang dilakukan Okamoto et al, tahun 2010 menunjukkan bahwa pada minggu ke-empat didapatkan perbedaan yang bermakna antara ekspresi TGF-β kelompok yang diberi sel punca dengan kelompok kontrol. Didapatkan juga perbedaan yang bermakna dalam jumlah sel spindle yang matur, kolagen tipe-1, vaskularisasi, dan ekspresi VEGF dibandingkan dengan kontrol. Pada penelitian Nainggolan, tahun 2011, tentang ekspresi fibroblast dan biomekanik tendon, penelitian Hilmi, tahun 2011 tentang ekspresi kolagen tipe-1 dan penelitian Wijaya, tahun 2011, tentang densitas skleraksis, yang dilakukan bersama-sama dengan penilitian ini, keempatnya menunjukkan peningkatan yang bermakna dibandingkan kelompok kontrol yang tidak diberi sel punca. TGF-β bertanggung jawab secara langsung terhadap peningkatan jumlah dan proliferasi fibroblast dan makrofag, angiogenesis, upregulation dari aktifitas inhibitor metalloproteinase, downregulation dari aktivitas proteinase dan sintesis kolagen setelah trauma. Sehingga ini dikaitkan dengan pembentukan jaringan parut post trauma atau operasi. Ada 3 isofrm dari TGF-β : β1, β2, dan β3. TGF-β1 adalah bentuk yang paling banyak ditemukan pada manusia dewasa dan diperkirakan bertanggung jawab atas proses inflamasi dan pembentukan jaringan parut. Sebagai tambahan TGF-β1 eksogenus juga diketahui dapak menginduksi proses angiogenesis dan deposisi dari kolagen serta jaringan granulasi. Tenosit intrinsik dan fibroblas tendon sheath ekstrinsik juga diketahui memproduksi TGF-β1 dan ini
diaktivasi melalui keadaan tendon yang mengalami perlukaan ( Pedro, 2003 ). Suatu hal menarik dikemukakan bahwa TGF-β3 dikatakan memiliki kemampuan anti pembentukan jaringan parut pada cutaneous rat wound model, dan telah dipostulasikan berfungsi sebagai regulator negatif dari jaringan parut pada suatu injury environment. ( Shah, 1995 ) Akan tetapi penelitian lain mengatakan bahwa pemberian TGF-β3 (eksogenus) tidak menunjukkan reduksi dari pembentukan jaringan parut ( Manning, 2011 ) Pada penelitian ini pengecatan immunohistokimia yang dipakai adalah untuk TGF-β1, dimana TGF-β1 lebih mengarahkan pada proses fibrosis, akan tetapi pada hasil penelitian penyerta untuk densitas skleraksis ( Wijaya, 2011 ) dan kolagen tipe-1 ( Hilmi, 2011 ) menunjukkan bahwa peningkatan skleraksis seiring dengan peningkatan kolagen tipe-1 menunjukkan bahwa peningkatan TGF-β1 tidak mengarah kepada proses adhesi atau fibrosis akan tetapi mengarah kepada penyembuhan tendon. KESIMPULAN
Terdapat perbedaan secara bermakna ekspresi TGF-β dengan pengecatan immunohistokimia antara penyembuhan reparasi ruptur tendon achilles kelinci yang diberi sel punca mesensimal dengan penyembuhan reparasi ruptur tendon achilles kelinci tanpa diberi sel punca mesensimal pada minggu keempat.
DAFTAR PUSTAKA
Alphonsus K.S. et al. Bone marrow derived mesenchymal stem cell influence early tendon healing in a rabbit achiles tendon model. J Bone Joint Surg Am. 2007; 89 : 74-81 Awad HA, Boivin GP, Dressler MR, et al. Repair of patellar tendon injuries using a cell-collagen composite. J Orthop Res 2003;21(3):420—31. Barrilleaux B, Phinney DG, Prockop DJ, O'Connor KC (2006). "Review: ex vivo engineering of living tissues with adult stem cells". Tissue Eng 12 (11): 3007– 19 Brunski JB, Puleo DA, Nanci A. Review article: Biomaterials and biomechanics of oral and maxillofacial implants: current status and future developments. The Int J Oral Maxillofac Implants 2000; 15(1): 1546. Caplan, A.I., 2005. Mesenchymal Stem Cells: Cell-Based Reconstructive Therapy in Orthopedics. Tissue Eng. 11; 7/8 : 1198 – 1211. Chang, J., Most, D., Stelnicki, E., Siebert, J.W., Longaker, M.T., Hui, K., Lineaweaver, W.C., 1997. Gene expression of transforming growth factor beta-1 in rabbit zone II flexor tendon wound healing: evidence for dual mechanisms of repair. Plast. Reconstr. Surg.;100:937-44. Docheva, D., Haasters, F., Schieker, M., 2008. Mesenchymal Stem Cells and Their Cell Surface Receptors. Current Rheumatology Reviews. 4, 1 –2. scarring. J. Cell Sci.;108:985-1002. Gardner RL (2002). "Stem cells: potency, plasticity and public perception". Journal of Anatomy 200 (3): 277–82. Galatz LM, Sandell LJ, Rothermich SY, et al. 2006. Characteristics of the rat
supraspinatus tendon during tendon-tobone healing after acute injury. J Orthop Res 24:541-550 Hsu C, Chang J. Clinical implications of growth factors in flexor tendon wound healing. J Hand Surg 2004; 29A(4): 55163. Manning, CN, Kim HM, Elbert SS, Galatz LM, Havlioglu N, Thomopoulos S, 2011. Sustained delivery of transforming growth factor beta three enhances tendon-to-bone Healing in a rat model. J Orthop Res 29:1099-1105 Ngo, M., Pham, H., Longaker M.T., Chang, J,. 2001. Differential expression of transforming growth factor-beta receptors in a rabbit zone II flexor tendon wound healing model. Plast. Reconstr. Surg.;108:1260-7. Ratajczak MZ, Machalinski B, Wojakowski W, Ratajczak J, Kucia M (2007). "A hypothesis for an embryonic origin of pluripotent Oct-4(+) stem cells in adult bone marrow and other tissues". Leukemia 21 (5): 860–7 Rockwood, C. A, Green, D.P,at all, Healing of the Musculoskletal Tissues, Fractures in Adults, vol 1, Fourth Edition, Lippincott-Raven, Philadelphia,1996, p284-89 Salter,R.B, Musculoskletal Injuries, Textbook of Disorders and Injuries of musculoskletal system, third Edition, Lippincott William and Wilkins, Philadelphia,1999,p 494-95 Sharma, P., Maffulli N., 2005. Tendon injury and Tendinopathy : Healing and repair. J Bone Joint Surg, vol. 87 A, 187202. Shah, M., Foreman, D.M., Ferguson, M.W., 1995. Neutralisation of TGF-beta 1
and TGFbeta 2 or exogenous addition of TGF-beta 3 to cutaneous rat wounds reduces Simon S.R. Anatomy Biology and biomechanics of Tendon, Ligament and Meniscus, Orthopaedic Basic Science, American Academy of Orthopaedic Surgeons, 1994, p 47-58 Tuan RS, Boland G, Tuli R. Review adult mesenchymal stem cells and cell-based tissue engineering. Arthritis Res and Ther 2003; 5(1): 32-45. Wolfman NM, et al. Ectopic induction of tendon and ligament in rats by growth and differentiation factors 5, 6, and 7, members of the TGF-β gene family. J. Clin. Invest 1997; 100(2): 321-30. Young RG, Butler DL, Weber W, Caplan AI, Gordon SL, Fink DJ. Use of mesenchymal stem cells in a collagen matrix for achilles tendo repair. J. Orthop. Res 1998; 16(4): 406-13.
