PRODUKSI PROTEIN DENGAN SISTEM EKSPRESI DI SEL EUKARYOT
Suharsono • Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi, IPB • Departemen Biologi, FMIPA, IPB • E-mail:
[email protected];
[email protected]
Kelemahan sel prokaryot Produksi protein heterologus eukaryot di sel prokaryot (bakteri): -Tidak stabil -Kekurangan aktivitas biologis -Dapat terkontaminasi oleh toksin dari bakteri di dalam sel prokaryot tidak terjadi modifikasi pascatranslasi
Pascatranslasi pada eukaryot Pembentukan ikatan disulfida oleh disulfida isomerase Æ pelipatan protein Æ menentukan stabilitas dan aktivitas Pemotongan proteolitik dari protein prekursor Æ menentukan fungsi protein Glikosilasi melalui penambahan residu gula Æ menentukan stabilitas protein -Terikat pada O: serin, treonin -Terikat pada N: asparagin Penambahan pada protein: fosforilasi, asetilasi, sulfatasi, asilasi, γ-karboksilasi, miristilasi, palmitasi
Glikosilasi Khamir
Khamir
Serangga
Mamalia
Serangga
Terikat pada O
Mamalia
Terikat pada N
Vektor ekpresi pada eukaryot 1. Gen penanda seleksi di eukaryot 2. Promoter 3. Signal berhenti transkripsi dan translasi 4. Sekuen yang menandai poliadenilasi pada transkrip mRNA + Ori (plasmid) atau sekuen komplementer (untuk integrasi ke DNA kromosom sel inang) Introduksi DNA ke dalam sel: •Transformasi (bakteri, khamir) •Transfeksi (sel hewan)
Teknik untuk transformasi khamir 1. Elektroporasi (kejutan listrik berenergi tinggi) 2. Perlakuan Li asetat 3. Menggunakan protoplast Transveksi pada sel hewan 1. Sel dicampur dengan DNA yang telah dipresipitasi dengan CaPO4 atau DEAE-dextran 2. Elektroporasi
Sistem ekspresi Saccharomyces cerevisiae Sebagai sel inang ekspresi gen eukaryot: 1. Sel tunggal, secara genetik dan fisiologis telah diketahui, mudah tumbuh (di tabung reaksi dan bioreaktor) 2. Mempunyai promoter kuat dan plasmid (2 μm) 3. Melakukan proses modifikasi pascatranslasi 4. Mensekresi beberapa protein, shg bila digunakan untuk produksi protein rekombinan ekstrasel Æ purifikasi mudah 5. Organisme yang dianggap aman
Protein rekombinan yang diproduksi oleh sistem ekspresi S. cerevisiae
Insulin: 50% produksi dunia diproduksi oleh S. cerevisiae
Vektor ekspresi S. cerevisiae 3 kelompok 1. Vektor episom atau plasmid, yeast episomal plasmid (YEp) 2. Vektor terintegrasi atau yeast integrating plasmid (YIp) 3. Kromosom-khamir buatan atau yeast artificial chromosome (YAC) YEp: -ekstensif digunakan (produksi protein intra/ekstra sel) -berdasarkan plasmid 2 μm dengan jumlah kopi yang tinggi -menggunakan inang S.c mutan auxotrofik, gen WT di vektor Æ komplementasi misal: YEp (LEU2), S.c (leu2)
Vektor ekspresi S. cerevisiae Promoter yang disenangi: teregulasi secara ketat, indusibel Misal: promoter yg diinduksi galaktosa: transkripsi naik 1000x bila + galaktosa Terminasi transkripsi Æ ekspresi maksimal
Plasmid tidak stabil di S. c. •dalam kultur berskala besar (>10 liter) Îintegrasi gen ke kr. Æ YIp Kendala: produk rendah krn kopi gen tunggal Îdiatasi: sasaran ke DNA repetitif (rDNA= 200 kopi; sekuen δ = 400 kopi)
δ = bagian retrotransposon = sekuen DNA Æ RNA Æ DNA Æ integrasi ke beberapa situs
A1 & A2 = ujung gen yang tidak esensial
YAC -pengklonan segmen besar (100 kb), kromosom terpisah di S.c. -stabil -untuk: peta fisik genom manusia, analisis gen besar, pustaka genom -mirip kromosom: Ori (ARS), sentromer, telomer -belum digunakan untuk produksi protein -potensi: produksi protein dg jumlah besar dari gen multikopi atau protein dengan subunit yang berbeda
Produksi protein intrasel di S. cerevisiae Cu/Zn-SOD: agen terapi untuk penyakit bengkak (osteroarthritis, rheumatoid arthritis, scleroderma, ankylosing spondylitis) Æ perlu Cu/Zn-SOD dari manusia Superoksida +
H+
Cu/Zn-SOD
H2O 2
katalase/peroksidase
H2O + O2
• Ekspresi cDNA Cu/Zn-SOD manusia di E. coli Æ alanin setelah metionin inisiator tidak terasetilasi
Produksi SOD manusia Dengan YEp sehingga: 1. gen LEU2; 2. Ori dari plasmid 2 μm; 3. gen AmpR; 4. Ori E. coli; 5. cDNA Cu/Zn-SOD manusia (promoter dan terminator GAPD= glyceraldehyde phosphate dehydrogenase) S. c (LEU2-)
Seleksi medium tanpa leusin
produk Cu/Zn-SOD
LEU2 tumbuh
Untuk memudahkan purifikasi: ÆProtein disekresikan ke luar sel fusi dengan sekuen signal (peptida signal, sekuen pendahulu) di hulu contoh sekuen signal: faktor tipe kelamin (mating) gen α, prepro-α-factor Contoh: hirudin (dari Hirudo medicinalis) sebagai antikoagulan darah
Kelemahan ekspresi di S. cerevisiae 1. Kadang ekspresi rendah dan hasil rendah 2. Hiperglikosilasi (>100 residu manosa) Æ mengganggu fungsi, antigen 3. Protein kadang disekresikan di ruang periplasmik Æ purifikasi mahal 4. Pada konsentrasi sel yang tinggi, menghasilkan etanol yang toksik terhadap sel sehingga jumlah protein yang disekresikan rendah
Sistem ekspresi selain khamir • Pichia pastoris (methylothropic yeast), karena: 1. punya promoter yang diinduksi metanol (alkohol oksidase): + metOH Æ 30% AOX; -metOH Æ 0% AOX) 2. tidak mensintesis etanol sehingga dapat mencapai kerapatan sel yang tinggiÆ jumlah protein yang disekresikan tinggi 3. mensekresikan sedikit protein sehingga mempermudah purifikasi protein rekombinan yang disekresikan
Vektor ekspresi di P. p 1. GOI di antara promoter dan terminator AOX1 2. Ori dan penanda seleksi di E. coli 3. Penanda seleksi di khamir
Vektor integratif P. pastoris Æ menghindari instabilitas plasmid GOI dan penanda seleksi diintegrasikan ke kromosom: 1). rekombinasi tunggal; 2). rekombinasi ganda GOI -bakteri, fungi, tan, hewan -manusia: HBsAg, HSA
Alternatif inang lain:
Hansenula polymorpha: hemoglobin A manusia (2
α- dan 2 β-globin)
Schizosaccharomyces pombe Candida utilis: monelin Aspergillus: α-amylase, lipase, amyloglucosidase,
cellulase untuk pangan, minuman, dan industri dan pulp.
Sistem ekspresi sel serangga-baculovirus Baculovirus Inang: invertebrata (serangga) Siklus infeksi: 2 bentuk 1. Nukleokapsid tunggal (partikel virus): dari sel terinfeksi 2. Polihedron: kumpulan nukleokapsid (virion) terbungkus di dalam matriks protein (polihedrin) Sel lisis, organisme mati Æ polihedron Polihedron melindungi virion Polihedrin disintesis dalam jumlah banyak pada tahap akhir (36-48 jam setelah infeksi, selama 4-5 hari) s/d sel lisis dan inang mati
Promoter polihedrin (polyh) • sangat kuat, tidak untuk produksi virus • proses pascatranskripsi • dapat untuk produksi protein (polihedrin diganti dengan GOI) Îbaculovirus digunakan utk produksi protein mamalia Contoh:
Autographa californica multiple nuclear
polyhedrosis virus (AcMNPV) menginfeksi ulat jengkal alfalfa (A.c) dan 30 spesies serangga, sel serangga (ulat tentara, Spodoptera frugiperda)
Sistem vektor ekspresi Baculovirus AcMNPV rekombinan: 1. promoter polihedrin dan bagian hulu AcMNPV (situs rekombinasi) 2. MCS (di antara promoter dan terminator polihedrin) 3. terminator polihedrin dan daerah hilir AcMNPV (situs rekombinasi) Î diperbanyak di E. coli
Sel serangga diinfeksi dengan AcMNPV dan vektor (GOI) Î c.o. ganda Î GOI terintegrasi ke AcMNPV, gen polihedrin hilang. Virion tanpa gen polihedrin Î baculovirus rekombinan dapat diisolasi dari plak tanpa oklusi Identifikasi virus rekombinan: -hibridisasi, PCR -biru-putih bila lacZ di bawah kontrol promoter baculovirus
Sel inang + baculovirus rekombinan Î 4-5 hari panen protein Protein yang dihasilkan oleh baculovirus
Sistem ekspresi sel mamalia •produksi protein dg modifikasi pascatranslasi •Sel COS, BHK, HEK-239: ekspresi sementara dan cepat untuk mengetahui integritas konstruksi •Sel CHO: ekspresi stabil & produksi protein dalam jumlah besar Vektor ekspresi sel mamalia: •Ori di sel eukaryot (dari virus ex: SV40) •promoter & terminator pengendali GOI •penanda seleksi di sel eukayot (thymidine kinase)
Vektor ekspresi sel mamalia
p= promoter I= intron pa= polyadenilation MCS= multiple cloning sites SMG= selectable marker gene ori= origin of replication
Protein dengan 2 atau lebih subunit •Protein yang tersusun dari 2 rantai peptida yang berbeda •human thyroid-stimulating hormone (heterodimer); hemoglobin (tetramer, α2β2) & antibodi (tetramer, H2L2) Sintesis: @ peptida terpisah, dirakit menjadi dimer atau tetramer secara in vitro Æ tidak efisien In vivo Æ efisien: 2 vektor ekspresi @ cDNA untuk satu subunit & penanda seleksi berbeda
•Seleksi dengan 2 agen Æ sel hidup membawa dua vektor Æ protein rekombinan dimer/tetramer Kendala: satu vektor hilang, jumlah kopi berbeda (jumlah protein beda) Æ satu vektor membawa 2 gen di bawah promoter & terminator berbeda
Vektor bisistronik •jumlah kedua protein sama •mengandung 2 GOI dipisah oleh IRES (internal ribosome entry site, dari virus mamalia) dikontrol satu promoter & terminator Æ transkrip tunggal Æ translasi dari ujung 5’ untuk rantai α dan dari IRES untuk rantai β
Penanda seleksi untuk vektor ekspresi mamalia
Skema seleksi untuk meningkatkan produksi protein •jumlah kopi vektor ekspresi dinaikkan dengan peningkatan konsentrasi agen seleksi secara bertahap
