Predictie van stralingsgeïnduceerde toxiciteit in borstkankerpatiënten behandeld met radiotherapie op basis van het genotype
Nikki MASURE
Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. H. Thierens Vakgroep Medische basiswetenschappen
Academiejaar 2014-2015
Predictie van stralingsgeïnduceerde toxiciteit in borstkankerpatiënten behandeld met radiotherapie op basis van het genotype
Nikki MASURE
Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. H. Thierens Vakgroep Medische basiswetenschappen
Academiejaar 2014-2015
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”
8 mei 2015
Nikki Masure
Prof. Dr. H. Thierens
Voorwoord Deze scriptie werd gemaakt ter afronding van mijn opleiding tot Master in de Biomedische Wetenschappen. Graag had ik hierbij mijn promotor Prof. Dr. H. Thierens bedankt om mij de kans te geven dit onderzoek uit te voeren, dankzij U heb ik een bijzonder boeiend jaar achter de rug. Het INW was bovendien een bijzonder aangename omgeving om deze masterproef te mogen verwezenlijken. Hiernaast gaat ook een heel grote dankjewel uit naar mijn begeleidster Kim. Bedankt voor het aanleren van de vele technieken in het labo, om me wegwijs te maken in de statistische analyses en voor alle tijd die je investeerde in het nalezen van deze scriptie. Jouw deur stond altijd voor me open! Ook Dr. Liv Veldeman wil ik graag bedanken voor de medewerking bij het verzamelen van de vele patiëntengegevens. Greet en Eline, bedankt voor alle hulp en voor de toffe sfeer tussen het labowerk door. Dankzij jullie zijn de uurtjes voorbij gevlogen. Tot slot verdienen mijn mama en papa, mijn zus en mijn vriend een speciaal plaatsje. Zonder jullie onvoorwaardelijke steun en vertrouwen in mij was dit nooit gelukt. Bedankt voor alles!
Inhoud AFKORTINGEN ..................................................................................................................................................... I SAMENVATTING ................................................................................................................................................. 1 ABSTRACT ............................................................................................................................................................ 2 INLEIDING ............................................................................................................................................................ 3 1
2
3
4
Borstkanker ............................................................................................................................................... 3 1.1
Incidentie.............................................................................................................................................. 3
1.2
Anatomie en ontwikkeling ................................................................................................................... 3
1.3
Risicofactoren ...................................................................................................................................... 4
1.4
Behandeling ......................................................................................................................................... 4
Stralingsgeïnduceerde toxiciteit ................................................................................................................ 7 2.1
Acute toxiciteit ..................................................................................................................................... 7
2.2
Chronische toxiciteit ............................................................................................................................ 8
2.3
Scoringssystemen ............................................................................................................................... 10
2.4
Risicofactoren voor radiosensitiviteit................................................................................................. 10
Single nucleotide polymorphisms (SNPs) .............................................................................................. 11 3.1
TNFα rs1800629 ................................................................................................................................ 11
3.2
XRCC1 rs2682585.............................................................................................................................. 12
3.3
Genome wide association study ......................................................................................................... 12
Probleem en doelstelling ......................................................................................................................... 13
MATERIALEN EN METHODEN ....................................................................................................................... 14 1
Inleiding .................................................................................................................................................. 14
2
Studiepopulatie ....................................................................................................................................... 14
3
Scoring toxiciteit ..................................................................................................................................... 14
4
DNA isolatie uit 3 mL humaan bloed ..................................................................................................... 15
5
DNA concentratiebepaling ..................................................................................................................... 16
6
PCR ......................................................................................................................................................... 17 6.1
Principe .............................................................................................................................................. 17
6.2
Primers ............................................................................................................................................... 17
6.3
PCR-optimalisatie .............................................................................................................................. 18
6.4 Controle PCR-reactie ............................................................................................................................. 19 6.5 7
8
Bereiding buffers................................................................................................................................ 20
SNP analyse ............................................................................................................................................ 20 7.1
RFLP .................................................................................................................................................. 20
7.2
HRM .................................................................................................................................................. 21
Kwaliteitscontrole ................................................................................................................................... 23
9
Statistische analyse ................................................................................................................................. 23
RESULTATEN ..................................................................................................................................................... 25 1
Optimalisatie protocols ........................................................................................................................... 25 1.1
CCDC129 rs882460 T>C................................................................................................................... 25
1.2
XRCC1 rs2682585 G>A.................................................................................................................... 26
1.3
TNFα rs1800629 G>A ...................................................................................................................... 27
1.4
SATB2 rs2881208 G>A ..................................................................................................................... 28
1.5
SLFN14 rs2840044 A>G ................................................................................................................... 29
2
Beschrijving onderzoekspopulatie .......................................................................................................... 31
3
Associatiestudie naar late toxiciteit ........................................................................................................ 33 3.1
Associaties tussen patiënt- en behandelingsgerelateerde factoren en late toxiciteit ........................... 34
3.2
Associaties tussen genetische polymorfismen en late toxiciteit ......................................................... 36
BESPREKING ...................................................................................................................................................... 38 1
Invloed van klinische en behandelingsgerelateerde factoren .................................................................. 38
2
Validatie van SNPs ................................................................................................................................. 43
BESLUIT .............................................................................................................................................................. 46 REFERENTIES .................................................................................................................................................... 47 ADDENDUM .......................................................................................................................................................... I
Afkortingen °C
Graden Celsius
AC
Adriamycin-cyclophoshamide
AI
Aromatase inhibitoren
BCCT.core
Breast cancer conservative treatment.cosmetic results
BRCA
Breast cancer susceptibility gene
CAF
5-fluorouracyl-doxorubicin-cyclophosphamide
CTCAE
Common terminology criteria for adverse events
DNA
Deoxyribonucleic acid
EDTA
Ethyleendiaminetetra-azijnzuur
ER
Estrogen receptor
EtBr
Ethidium bromide
BFB
Bromofenol blauw
RE
Restrictie enzyme
Cc
Cubic centimeter
HWE
Hardy Weinberg equilibrium
OR
Odds ratio
FEC
Fluorouracil-epirubicin-cyclophosphamide
GWAS
Genome wide association study
HER2
Human epidermal growth factor receptor 2
HRM
High resolution melting
IDT
Integrated DNA technologies
IL
Interleukine
IMRT
Intensity modulated radiation herapy
KT
Kamertemperatuur
LENT-SOMA
Late effects of normal tissue-subjective objective management analytical
LTA
Lymphotoxine alpha
MAF
Minor allel frequency
MgCl2
Magnesiumchloride
Min
Minuten
mL
Milliliter
PCR
Polymerase chain reaction
PR
Progesterone receptor
RBC
Rode bloedcel
RFLP
Restriction fragment length polymorphism
I
RT
Radiotherapie
RTOG/EORTC
Radiation therapy oncology group/European organisation for research and treatment of cancer
Sec
Seconden
SERMS
Selective estrogen receptor modulators
SNP
Single nucleotide polymorphism
STAT
Standardized total average toxicity
Ta
Annealing temperature
TBE
Tris-boraat-EDTA
TE
Tris EDTA
Tm
Melting temperature
TNF
Tumor necrosis factor
TNM
Tumor node metastasis
UV
Ultraviolet
UZ
Universitair ziekenhuis
V
Volt
XRCC
X-ray repair cross complementing
μL
Microliter
II
Samenvatting Borstkanker treft jaarlijks ongeveer 10.000 vrouwen in België en is daarmee de meest voorkomende kanker bij vrouwen. Borstsparende chirurgie, gevolgd door adjuvante radiotherapie vormt de standaard behandeling voor borstkanker in een vroeg stadium. Bestraling van de borst kan echter ernstige ongewenste effecten met zich meebrengen die de levenskwaliteit van patiënten kunnen beïnvloeden. Het al dan niet optreden van dergelijke nevenreacties is afhankelijk van patiënt tot patiënt. Deze variabiliteit wordt toegeschreven aan klinische en dosimetrische parameters, alsook aan genetische factoren. In dit thesisonderzoek worden associaties nagegaan tussen single nucleotide polymorphisms (SNPs) en het optreden van chronische toxiciteit na radiotherapie. Genotypering van 238 patiënten, allen behandeld in het UZ Gent, gebeurde aan de hand van restriction fragment length polymorphism (RFLP) of aan de hand van high resolution melting (HRM). Logistieke regressie werd toegepast teneinde associaties na te gaan tussen SNPs en de ontwikkeling van late toxiciteit na radiotherapie. De invloed van klinische en dosimetrische parameters werd bepaald via univariate analyse. Parameters die een significante associatie vertoonden met de ontwikkeling van late toxiciteit werden in rekening gebracht via multivariate analyse. Dragers van het variante A allel ter hoogte van de SNP rs2682585 (XRCC1) vertonen een hoger risico op een slechte cosmetische uitkomst (p=0.009). Het variante TT genotype voor de SNP rsxxx in het gen SLFN14 gaat gepaard met een hoger risico op de ontwikkeling van fibrose (p=0.029). Tot slot werd ook voor de SNP rs2881208 in het SATB2 gen een associatie met radiotoxiciteit opgemerkt. Dragers van het variante A allel vertonen een hoger risico op algemene toxiciteit na radiotherapie (p=0.05). De resultaten gevonden in dit thesisonderzoek moeten met de nodige voorzichtigheid worden geïnterpreteerd en dienen gevalideerd te worden in een grotere, onafhankelijke cohorte. Verder onderzoek naar de invloed van genetische varianten is vereist, zodat uiteindelijk een predictiemodel kan worden opgesteld voor de ontwikkeling van stralingsgeïnduceerde toxiciteit in borstkankerpatiënten.
1
Abstract BACKGROUND: Ionizing radiation is an efficient treatment in breast cancer therapy. However, some patients react to radiation with strong adverse side effects in the normal tissue which can limit the treatment's success and impair with a patients’ quality of life. This study aimed to identify common single nucleotide polymorphisms (SNPs) associated with chronic radiation toxicity. MATERIALS AND METHODS: Genotyping was performed using restriction fragment length polymorphism (RFLP) or high resolution melting (HRM) in 238 patients. All patients received adjuvant breast radiotherapy (15x2.67Gy) at Ghent University Hospital. Logistic regression was used to assess associations between SNPs and late toxicity. Patient- and treatment related confounding factors were determined by univariate analysis. Outcomes of interest were breast oedema, pigmentation changes, fibrosis and cosmesis as well as an overall toxicity score (Standardized Total Average Toxicity, STAT). Toxicity was scored using the LENT-SOMA scale. Cosmesis was assessed using BCCT.core. RESULTS: Patients carrying the rare allele in rs2682585 (XRCC1) show a higher risk for the development of a poor cosmetic outcome (p=0.009). TT genotypes in rsxxx (SLFN14) appear to cause significantly more fibrosis (p=0.029). Carriers of the rare allele in the genetic variant rs2881208 (SATB2) are associated with a higher risk for overall toxicity (p=0.05). CONCLUSIONS: We identified genetic variations significantly associated with chronic toxicity development after radiotherapy. Nevertheless, these results must be validated in larger independent cohorts. Additional variants need to be identified to develop a test that can be used clinically for prediction of late radiation toxicity.
2
Inleiding 1
Borstkanker
1.1 Incidentie Borstkanker is de meest voorkomende kanker bij vrouwen. In 2012 werden in België 10.531 nieuwe diagnoses gesteld, met het grootste aantal nieuwe gevallen in de leeftijdscategorie 50 tot 60 jaar. Het is tevens de grootste doodsoorzaak bij vrouwen inzake kanker (2). Borstkanker blijft duidelijk een grote impact aanhouden op onze maatschappij. Anderzijds heeft de ziekte tegenwoordig een vrij goede prognose dankzij snellere diagnoses en continue verbetering van behandelingsmethoden. In Vlaanderen hebben vrouwen gemiddeld een vijfjaarsoverleving van 88% en een tienjaarsoverleving van 78%. Door de stijgende incidentie én de stijgende overlevingsgraad wordt het steeds belangrijker om eventuele blijvende nevenreacties van de behandeling te beperken en op die manier de levenskwaliteit van deze vrouwen te optimaliseren.
1.2 Anatomie en ontwikkeling Borstkanker ontwikkelt zich in de weefsels van de borst. Er kunnen twee types onderscheiden worden. Enerzijds zijn er de ductale carcinomen, die zich manifesteren vanuit de ductuli die bedoeld zijn om melk van de borst naar de tepel te transporteren. Minder frequent zijn de lobulaire carcinomen, die ontstaan in de lobules die melk produceren (Figuur 2). In enkele zeldzame gevallen kan borstkanker ook ontstaan in andere delen van de borst, zoals vet- of bindweefsel (3).
Figuur 1. De borstklier (3)
3
De ontwikkeling van kanker is het resultaat van een accumulatie van vele individuele genetische mutaties die samen het signalisatie- en controlesysteem van een cel, de naburige cellen en de omgevende matrix verstoren. Deze abnormaliteiten zijn meestal het gevolg van spontane mutaties tijdens mitose. Stamcellen delen immers snel en intensief tijdens de ontwikkeling van de borst (4).
1.3 Risicofactoren De belangrijkste risicofactor voor het ontwikkelen van borstkanker is het geslacht. Borstkanker komt in 99% van de gevallen voor bij vrouwen. Daarnaast stijgt de incidentie van borstkanker in functie van de leeftijd. Blootstelling aan ioniserende straling kan een invloed hebben op het ontwikkelen van borstkanker, alsook borstdensiteit, obesitas, rookgedrag en alcoholconsumptie. Daarnaast zijn er heel wat hormonale factoren die het risico op borstkanker verhogen zoals een vroege menarche (<11 jaar), een late menopauze (>54 jaar) en een zwangerschap op latere leeftijd (>40 jaar). Ook het gebruik van orale contraceptiva en hormonale substitutietherapie zijn van belang (5). Slechts 10% van alle borstkankers is te wijten aan genetische predispositie. De belangrijkste susceptibiliteitsgenen zijn BRCA1 en BRCA2. Mutaties in deze genen zijn hoog penetrant en worden overgeërfd op een autosomaal dominante manier. Vrouwen met mutaties in het BRCA1-gen hebben 87% kans op het ontwikkelen van borstkanker. Mutaties in het BRCA2gen
leiden
in
84%
van
de
gevallen
tot
borstkanker
(5,
6).
Enkele
andere
borstkankersusceptibiliteitsgenen zijn P53, PTEN, ATM en CHEK2 (7). Mutaties in deze genen zijn zeldzaam en vertonen een geringer risico op borstkanker. Verder werden ook reeds variaties in genen (single nucleotide polymorphisms, SNPs) geïdentificeerd die geassocieerd zijn met laag penetrante borstkanker predispositie (8, 9).
1.4 Behandeling Borstkanker is geen eenduidige ziekte. Verschillende subtypes vereisen een verschillende aanpak. Classificatie van borstkanker kan gebeuren op basis van histopathologische criteria, gekend als TNM-staging (tumor-node-metastasis), alsook op basis van klinische criteria. De klinische criteria omvatten immunohistochemische merkers zoals de estrogen receptor (ER), de progesterone receptor (PR) en de human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) (10, 11).
4
Verder is de aanwezigheid van uitzaaiingen van belang voor het opstellen van een behandelingsplan. Hiervoor wordt steeds een biopt genomen van de sentinel lymfeklier. Deze lymfeklier ontvangt immers als eerste lymfevocht uit de borst, en dus ook een eventuele uitzaaiing (12). Deze factoren dragen, naast de leeftijd en algemene conditie van de patiënt, bij tot het bepalen van de meest optimale behandeling (13). Borstkanker vereist immers een multidisciplinaire aanpak. Meestal wordt een combinatie toegepast van chirurgie, chemotherapie, radiotherapie, hormoontherapie en/of doelgerichte therapie. 1.4.1 Chirurgie De meeste borstkankerpatiënten ondergaan chirurgie om de tumor te verwijderen. Enerzijds kan een lumpectomie uitgevoerd worden waarbij de borst gespaard blijft. Hierbij wordt de tumor verwijderd alsook een klein stukje omliggend weefsel. In sommige gevallen is het echter nodig om een mastectomie uit te voeren, waarbij de volledige borst wordt weggenomen (14). Vaak wordt een combinatie toegepast met chemotherapie. De chemotherapie wordt vooraf toegediend om de tumor te doen krimpen, zodat hij eenvoudiger kan worden verwijderd tijdens de ingreep. Dit wordt neoadjuvante therapie genoemd. Na chirurgie kan de patiënt een adjuvante therapie krijgen, dit om de kans op terugkeer van de tumor te verkleinen (12). 1.4.2 Chemotherapie Chemotherapie zorgt ervoor dat de groei van snel delende kankercellen afgeremd wordt. Veel bijwerkingen worden veroorzaakt door effecten die de actieve stoffen hebben op gezonde cellen. De patiënten binnen deze studie kregen, indien chemotherapie vereist was, fluorouracil-epirubicin-cyclophosphamide
(FEC),
5-fluorouracyl-doxorubicin-
cyclophosphamide (CAF), adriamycin-cyclophosphamide (AC) en/of Taxotere toegediend. 1.4.3 Radiotherapie Radiotherapie is een essentieel onderdeel in de behandeling van borstkanker. Het is een van de meest effectieve en minst dure behandelingen. Ongeveer 70% à 80% van alle borstkankerpatiënten ondergaat radiotherapie. Deze behandeling kan worden toegepast als monotherapie of als adjuvante therapie. Borstkankerpatiënten ondergaan na borstsparende chirurgie routinematig een adjuvante radiotherapeutische behandeling om de kans op herval te beperken (15). Hierbij wordt gebruik gemaakt van ioniserende straling om kankercellen te doden of hun deling af te remmen (12). 5
Intensity modulated radiation therapy (IMRT) is een recentere techniek die meer homogene dosissen toelaat dan conventionele radiotherapie. Dit wordt beoogd dankzij het gebruik van meerdere intensiteitsniveaus voor één enkele bundel. De techniek wordt gestuurd door computer-geoptimaliseerde planningen die modulatie van de bundelintensiteit toelaten. Hierdoor kan de bestraling meer op de tumor gericht worden en blijven de omliggende weefsels meer gespaard (16, 17). Borstkankerpatiënten kunnen bestraald worden op twee manieren: in ruglig of in buiklig. Een standaard behandeling in ruglig is voor de patiënt het meest comfortabel. De positionering van de patiënt kan vlot en gemakkelijk gebeuren. Echter, in ruglig kan de borst sterk bewegen tijdens de bestraling wegens ademhaling. De zwaartekracht zorgt er tevens voor dat de borst wordt uitgespreid over de thorax waardoor de longen en het hart een aanzienlijke dosis ontvangen. Sinds enkele jaren wordt onderzoek gedaan naar bestraling in laterale buiklig, waarbij de patiënt zich op een speciale tafel bevindt waarbij de borst naar beneden kan hangen. De niet-bestraalde borst wordt uit het bestralingsveld verwijderd met behulp van een speciale borsthouder. Het bestralingsveld is in deze positie een stuk kleiner en het hart en de longen blijven aanzienlijk meer gespaard. Ook beweegt de borst minder tijdens ademhaling wegens immobilisatie van de thorax. Voor de patiënt is deze positie echter minder comfortabel. De positionering vergt meer tijd en is moeilijk te reproduceren (18). 1.4.4 Hormoontherapie Hormoontherapie wordt toegepast in het geval van ER positieve en/of PR positieve borstkankers. ER en PR worden geactiveerd door steroïdhormonen en zijn betrokken bij cellulaire proliferatie, inhibitie van apoptose, invasie en angiogenese. De endocriene behandeling bestaat enerzijds uit selective estrogen receptor modulators (SERMS) waartoe o.a. tamoxifen en raloxifen behoren. Deze SERMS onderdrukken de oestrogeen signalisatie. Anderzijds wordt ook gebruik gemaakt van aromatase inhibitoren (AI) zoals letrozole en anastrozole. De AI’s blokkeren de biosynthese van oestrogeen uit androgenen (10). Mogelijke bijwerkingen van hormoontherapie zijn warmteopwellingen, gewichtstoename en stramme gewrichten. Behandeling met tamoxifen verhoogt de kans op tromboflebitis en endometriumkanker. Een verhoogd risico op osteoporose is kenmerkend voor AI gebruikers (19, 20).
6
1.4.5 Doelgerichte therapie Doelgerichte therapie wordt voorgeschreven aan patiënten met een tumor die HER2 overexpresseert. Dit komt voor in 15 tot 20% van alle borsttumoren en leidt tot een vrij agressief fenotype. In deze studie werd 6.7% van de onderzoekspopulatie behandeld met Trastuzumab. Trastuzumab of herceptine is een monoklonaal antilichaam dat gericht is tegen HER2. Op die manier wordt de werking van HER2 geblokkeerd. Echter, niet alle HER2 positieve patiënten reageren op dit antilichaam. Daarnaast kan ook resistentie tegen trastuzumab optreden. Een gecombineerde therapie met trastuzumab en lapatinib blijkt efficiënt te zijn in het geval van trastuzumab-resistente HER2 positieve patiënten (10). 2
Stralingsgeïnduceerde toxiciteit
Bij radiotherapie wordt gebruik gemaakt van ioniserende straling. Als deze straling invalt op een cel kan het DNA beschadigd worden door depositie van de energie. Dit kan op een directe wijze of op een indirecte wijze via de vorming van reactieve radicalen. In beide gevallen resulteert ioniserende straling in de vorming van enkelstrengbreuken of dubbelstrengbreuken. Radiotherapie steunt op het principe dat de DNA herstelcapaciteit van cellen die stralingsschade hebben ondergaan groter is in gezonde cellen dan in kankercellen. Met andere woorden, kankercellen zijn gevoeliger voor straling dan gezonde cellen (21). Desalniettemin wordt er onvermijdelijk een fractie van de omliggende gezonde weefsels aangetast. Bij de bestraling wordt immers rekening gehouden met lokale tumorverspreiding en microscopische tumorextensies. Daarnaast wordt ook geanticipeerd op bewegingen van de tumor en de organen tussen de verschillende fracties (22). Op die manier treden stralingsgeïnduceerde bijwerkingen
op
die
een
invloed
kunnen
hebben
op
de
levenskwaliteit
van
borstkankerpatiënten (23). Deze complicaties vormen een limiterende factor voor radiotherapie .
2.1 Acute toxiciteit Acute toxiciteit of vroegtijdige nevenreacties manifesteren zich tijdens of kort na de behandeling. Het optreden ervan is niet afhankelijk van de dosis per fractie maar wel van de bestralingsduur. Acute toxiciteit wordt vooral waargenomen in snel delende weefsels zoals de huid en de mucosa (24).
7
De huid bestaat uit drie compartimenten: de epidermis, bestaande uit meerlagig verhoornd plaveiselepitheel, de dermis die onder andere bloed- en lymfevaten bevat en de hypodermis of de subcutane laag (Figuur 2).
Figuur 2. De opbouw van de huid (1)
De meest voorkomende acute bijwerkingen zijn dermatitis, desquamatie, pijn en oedeem. Dermatitis of ontsteking van de huid komt voor bij ongeveer alle patiënten maar varieert in ernst. Oedeem is een opstapeling van vocht in het onderhuids bindweefsel, wat zorgt voor zwelling van de borst. Droge of vochtige desquamatie betreft het afschilferen van de huid, waarbij al dan niet een vochtig exsudaat vrijkomt. Deze symptomen ontwikkelen zich wanneer functionele cellen verloren gaan door normale weefsel turnover en niet vervangen worden doordat de stamcellen beschadigd zijn door ioniserende straling. Stamcellen zijn echter meer tolerant voor straling dan andere celtypes waardoor er na verloop van tijd compensatoire proliferatie en herstel optreedt (22). Acute toxiciteit is bijgevolg meestal reversibel (15).
2.2 Chronische toxiciteit Chronische toxiciteit of laattijdige nevenreacties kunnen maanden tot jaren na de bestraling optreden. Ze komen voor in trager prolifererende weefsels en zijn meestal irreversibel (24). Chronische nevenreacties komen minder frequent voor dan de acute reacties. Ze zijn minder afhankelijk van de bestralingsduur, maar de dosis per fractie is hier wel van belang. Bijgevolg zullen deze reacties de basis vormen voor dosisbeperkingen in de radiotherapie (24).
8
Late effecten ontwikkelen zich via complexe interactieprocessen die nog niet goed gekend zijn. Bestraling van weefsels activeert een snelle moleculaire respons. In het algemeen is deze respons vergelijkbaar met het proces van wondheling: heel wat cytokines, waaronder IL-1, IL-6 en TNFα, worden geproduceerd in een poging om te schade te herstellen (25). De pathogenese bij borstkankerpatiënten is divers en omvat onder andere fibrose, waarbij er een toename optreedt van de hoeveelheid bindweefsel in de borst. Vrijstelling van vasoactieve cytokines zorgt er immers voor dat fibrine de weefsels kan binnendringen, wat leidt tot collageen depositie. Verlies van parenchymcellen kan leiden tot atrofie, wat aanleiding geeft tot een gewijzigd uitzicht of cosmesis van de borst. Pigmentatieveranderingen ter hoogte van de borst kunnen eveneens plaatsvinden. Bestraling kan de dermale melanocyten vernietigen waarbij hypopigmentatie optreedt. Anderzijds kan de productie van melanine in de huid gestimuleerd worden, hierbij spreekt men van hyperpigmentatie (26). Ook vasculaire schade kan optreden ten gevolge van radiotherapie. Deze vasculaire schade uit zich onder de vorm van bloedingen, ischemie of teleangiëctasieën. Teleangiëctasieën zijn zichtbaar als permanent verwijde bloedvaatjes op de borst, vlak onder het huidoppervlak (27). De ontwikkeling van secundaire carcinomen en pneumonitis zijn minder frequente vormen van chronische toxiciteit (24). Een voorbeeld van stralingsgeïnduceerde toxiciteit wordt weergegeven in figuur 3.
Figuur 3. Late toxiciteit na borstbestraling. De foto links werd genomen voor aanvang van de RT. De rechtste foto werd genomen twee jaar na de bestraling. Deze gegevens werden verkregen via de dienst radiotherapie van het UZ Gent.
9
2.3 Scoringssystemen De beoordeling van complicaties na radiotherapie kan op verschillende manieren gebeuren. De meest gebruikte scoringssystemen zijn de RTOG/EORTC schaal (Radiation Therapy Oncology Group/European Organisation for Research and Treatment of Cancer) (28), de LENT/SOMA schaal (Late Effects of Normal Tissues/Subjective, Objective, Management, Analytical) (29) en de CTCAE schaal (Common Terminology Criteria for Adverse Events) (30). Bijwerkingen worden uitgedrukt op een schaal van 1 tot 4 (of in sommige gevallen tot 5) waarbij 1 zeer matige toxiciteit weergeeft en 5 wijst op dood ten gevolge van de toxiciteit. Naast deze scorelijsten kunnen cosmetische veranderingen van de borst gescoord worden aan de hand van foto’s. Deze foto’s worden genomen onder gestandaardiseerde condities en op verschillende tijdstippen. Ze worden genomen voor aanvang van de radiotherapie en 6 maanden, 1 jaar en 2 jaar na de behandeling. De scoring van de foto’s kan op een subjectieve manier gebeuren, waarbij minstens 3 onafhankelijke observers de foto’s beoordelen, alsook op een objectieve manier, waarbij gebruik wordt gemaakt van de Breast Cancer Conservative Treatment. Cosmetic results software (BCCT.core). BCCT.core baseert zich voornamelijk op het verschil tussen de behandelde en niet-behandelde borst en categoriseert elke foto automatisch in vier klassen (excellent, good, fair, poor). Om deze indeling te bereiken wordt eerst een continue waarde toegekend aan elk BCCT beeld op basis van asymmetrie, pigmentatieverandering en de zichtbaarheid van het litteken. Deze bepalingen worden voorafgegaan door semi-automatische lokalisatie van enkele referentiepunten op de digitale foto’s (de positie van de tepel, de aflijning van de borst en de fossa jugularis van het sternum) (31, 32).
2.4 Risicofactoren voor radiosensitiviteit De ontwikkeling en de ernst van bijwerkingen na radiotherapie varieert sterk van patiënt tot patiënt. Dit kan te wijten zijn aan behandelingsfactoren: type straling, de totale dosis, dosis per fractie, bestraald volume, positie van de patiënt en eventuele gelijktijdige chemotherapie (33-35) alsook aan patiënt gerelateerde factoren zoals de leeftijd, Body Mass Index (BMI), de grootte van de borsten, rookgedrag,… (36). Comorbiditeiten als diabetes en hypertensie, waarbij sprake is van een verminderde vascularisatie zijn eveneens van belang (22).
10
Heel wat studies suggereren dat ook genetische factoren mee bepalend zijn voor radiosensitiviteit. Zeldzame genetische aandoeningen als het Nijmegen breakage syndroom, Ataxia Telangiectasia, Bloom’s syndroom en Fanconi’s anemie liggen aan de basis van deze ontdekking. Deze patiënten vertonen allen een extreme stralingsgevoeligheid. Elk van deze syndromen blijkt bovendien geassocieerd te zijn met mutaties in genen betrokken bij detectie van DNA schade of bij DNA herstel. Dit gaf aanleiding tot verder onderzoek naar een genetische achtergrond voor radiosensitiviteit (37). Radiosensitiviteit wordt beschouwd als een complexe polygenetische aandoening (24). Naast de eerder besproken zeldzame hoogpenetrante mutaties kunnen ook laag-penetrante polymorfismen in het DNA bijdragen tot een verhoogde radiosensitiviteit. 3
Single nucleotide polymorphisms (SNPs)
Een SNP is de meest voorkomende vorm van genetische variabiliteit onder individuen. Het betreft een enkelvoudige baseverandering die aanwezig is bij minstens 1% van de bevolking. Het menselijk genoom bevat ongeveer 10 miljoen SNPs. Meestal komen deze variaties voor in het DNA gelegen tussen de genen. Wanneer een SNP echter gelegen is in een gen of in een regulatorische regio kan dit de functie van een gen beïnvloeden en op die manier een meer directe rol spelen bij het ontstaan van ziektes en de individuele respons op therapie (38). In deze studie wordt getracht een verband te vinden tussen het voorkomen van bepaalde polymorfismen en radiosensitiviteit. De SNPs werden geselecteerd op basis van enkele recente publicaties die een sterke associatie konden aantonen tussen de welbepaalde SNP en het optreden van late toxiciteit na bestraling bij borstkankerpatiënten.
3.1 TNFα rs1800629 TNFα bevindt zich op chromosoom 6 en speelt een belangrijke rol bij ontstekingsprocessen. Het is een multifunctioneel cytokine dat geproduceerd wordt na verwonding of infectie. De SNP met de code rs1800629, ook gekend onder de naam TNF-308, betreft een substitutie van guanine (G) naar adenine (A) die bij een Kaukasische populatie een frequentie van 21% vertoont (39). Het polymorfisme is gelegen in de promotorregio van TNFα, 308 basenparen upstream van de transcriptie startplaats en 1000 basenparen downstream van het lymfotoxine alfa (LTA) gen. Een studie van Talbot et al. suggereert een significante associatie tussen dit polymorfisme en het optreden van toxiciteit na bestraling (40). Het eindpunt in deze studie was een STAT score (Standardized Total Average Toxicity-score) waarin induratie, teleangiëctasieën, oedeem, atrofie, pigmentatie en pijn geïncludeerd werden (41). 11
3.2 XRCC1 rs2682585 XRCC1 is een gen gelegen op chromosoom 19 dat betrokken is bij het herstel van DNA enkelstrengbreuken gevormd door blootstelling aan ioniserende straling. De SNP met de code rs2682585 is een G>A substitutie die voorkomt met een frequentie van 20% (39). Dit polymorfisme, ook gekend onder de naam His6Arg resulteert op eiwitniveau in een substitutie van histidine naar arginine ter hoogte van codon 6. Het polymorfisme bevindt zich in de promotorregio van XRCC1 (1128 basenparen upstream van de transcriptie startplaats), waar het deel uitmaakt van een transcriptiefactor bindingsplaats. De SNP kan aldus XRCC1 genexpressie wijzigen, wat resulteert in een gewijzigde eiwitproductie. In een studie van Seibold et al. werd aangetoond dat dragers van het A allel een protectief effect vertonen met betrekking tot late radiotoxiciteit. De eindpunten die in deze studie beschouwd werden zijn fibrose
en
late
huidreacties.
Deze
late
huidreacties
omvatten
teleangiëctasiën,
pigmentatieveranderingen en atrofie. Tot slot werden STAT scores bepaald waarin al deze eindpunten geïncludeerd waren. Significante associaties konden worden aangetoond voor huidreacties en globale toxiciteit (42).
3.3 Genome wide association study Tot nu toe werd slechts één GWAS uitgevoerd teneinde de genetische basis van stralingstoxiciteit na borstbestraling te ontrafelen (43). Deze studie van Barnett et al. identificeerde nieuwe kandidaat SNPs, zonder rekening te houden met de functie en het belang van bepaalde genen. Er werden negentien SNPs naar voor geschoven die mogelijks geassocieerd zijn met stralingsgeïnduceerde toxiciteit. Hieruit werden drie SNPs geselecteerd op basis van de sterkste associatie (p-waarde) en op basis van de minor allele frequency (MAF). De geselecteerde polymorfismen vertonen volgens Barnett et al. een associatie met een algemene STAT-score. Deze score omvat pijn, teleangiëctasieën en het krimpen van de borst. Er werden eveneens enkele SNPs geïdentificeerd die associatie vertonen met het ontwikkelen van teleangiëctasieën, deze SNPs worden echter buiten beschouwing gelaten aangezien er in onze studiepopulatie amper teleangiëctasieën voorkomen. Tabel I geeft een overzicht weer van de geselecteerde SNPs uit de GWAS.
12
Tabel I. Selectie SNPs op basis van de GWAS studie van Barnett et al. (43) SNP
GEN
Eindpunt
p-waarde
MAF* (%)
rs2840044
near SLFN14
Globale toxiciteit (STAT score)
7.90x10-6
33
rs882460
CCDC129
Globale toxiciteit (STAT score)
5.70x10-5
24
rs2881208
SATB2
Globale toxiciteit (STAT score)
2.83x10-5
36
*MAF=minor allele frequency
4
Probleem en doelstelling
In dit onderzoek wordt gezocht naar een verband tussen de aanwezigheid van bepaalde SNPs in het genoom en het risico op ontwikkeling van laattijdige stralingsgeïnduceerde toxiciteit na borstbestraling. SNPs waarbij in grootschalige, en dikwijls gevalideerde studies een significante associatie met late toxiciteit aangetoond werd, worden beschouwd in deze studie met het oog op externe validatie. Patiëntgerelateerde en behandelingsgerelateerde factoren worden eveneens in rekening gebracht. De klinische eindpunten die beschouwd worden zijn fibrose, oedeem, pigmentatie (op basis van LENT-SOMA), cosmesis (op basis van foto’s) en globale toxiciteit (via de STAT score).
13
Materialen en methoden 1
Inleiding
In deze studie worden associaties onderzocht tussen de hoger beschreven genetische variaties (SNPs) en het risico op chronische toxiciteit na radiotherapie in borstkankerpatiënten. Als eerste wordt DNA geïsoleerd uit bloedstalen van borstkankerpatiënten die radiotherapie ondergingen. Vervolgens wordt het DNA fragment waarin de SNP zich bevindt exponentieel geamplificeerd met behulp van PCR (polymerase chain reaction). De bepaling van het genotype gebeurt uiteindelijk via RFLP (restriction fragment length polymorphism) of HRM (high resolution melting). Via statistische analyse wordt de associatie met radiotoxiciteit onderzocht. 2
Studiepopulatie
Er zullen bloedstalen gebruikt worden van 238 borstkankerpatiënten die tussen 2009 en 2012 behandeld werden met radiotherapie in het UZ Gent. Alle patiënten gaven toestemming tot deelname aan de studie via een informed consent formulier. Enkel patiënten waarvan reeds een 2-jarige follow-up periode verstreken is, werden geïncludeerd. De bestraling gebeurde volgens het START-B schema (15 x 2.67 Gy). De boost (indien nodig) bestond uit 4 x 2.5 Gy. Patiënten met een C-cup of groter werden gerandomiseerd voor bestraling in ruglig of in buiklig. Patiënten met een kleinere cup werden steeds in ruglig bestraald. Naast deze gegevens werden ook nog enkele patiëntgerelateerde (BMI, leeftijd, borstvolume, menopauzale status,…) en behandelingsgerelateerde (behandelingsduur, chemotherapie, hormoontherapie, type boost,…) variabelen bepaald, waarvan vermoed wordt dat ze een rol spelen bij de ontwikkeling van stralingstoxiciteit. 3
Scoring toxiciteit
Voor de beoordeling van de radiotoxiciteit werd gebruik gemaakt van de LENT-SOMA schaal (44) (Bijlage 1). In deze studie worden fibrose, oedeem en pigmentatie beschouwd. Deze eindpunten werden geselecteerd op basis van de frequentie van voorkomen. Er wordt een score gegeven voor aanvang en twee jaar na de RT, op een schaal van 0-4. Door het verschil te nemen van beide scores wordt de toxiciteit bepaald die te wijten is aan de RT. Patiënten komen terecht in klasse ∆0 (geen toxiciteit), ∆1 (milde toxiciteit) of ∆2 (ernstige toxiciteit).
14
Naast de eindpunten bepaald met de LENT-SOMA schaal, die voor alle 238 patiënten beschikbaar is, wordt cosmesis van de borst beschouwd. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van gestandaardiseerde foto’s. Voor 201 patiënten zijn dergelijke foto’s beschikbaar. Deze foto’s kunnen gescoord worden op een objectieve manier, aan de hand van drie onafhankelijke observers, of op een subjectieve manier, gebruik makende van BCCT.core. Hier worden eveneens scores toegekend voor de RT en 2 jaar na de RT en wordt gewerkt met het verschil tussen beide scores. Wegens de lage overeenkomst tussen de scores van de observers werd cosmesis beschouwd op basis van BCCT.core. Tabel II geeft de inter-observer variabiliteit weer. Tabel II. Inter-observer variabiliteit Observers Observer 1 t.o.v. observer 2
Kappa-waarde* 0.269
Observer 1 t.o.v. observer 3
0.153
Observer 2 t.o.v. observer 3
0.248
*Kappa is een maat voor intra- en interobserver overeenkomst. Een kappa-waarde van 0 wijst op geen enkele overeenkomst. Een kappa-waarde van 1 wijst op volledige overeenkomst.
Tot slot werd globale toxiciteit bepaald via een STAT score die alle eindpunten (fibrose, oedeem, pigmentatie en cosmesis)
includeerde. Voor elke patiënt (k) wordt een
gestandaardiseerde Z-score bepaald voor elk eindpunt (i) waarvan een score (s) gekend is. Het gemiddelde van deze Z-scores vormt de STAT score (41).
4
DNA isolatie uit humaan bloed
Er wordt steeds gestart van bloed dat bewaard wordt in buizen gecoat met ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA). De eerste stap bij DNA purificatie is cellyse: er wordt 3 ml bloed toegevoegd aan 9 ml rode bloedcel (RBC) lyse (Qiagen Sciences) in 15 ml buisjes. Dit wordt gemengd door de buisjes enkele malen te roteren, gevolgd door een incubatie van 5 min. bij kamertemperatuur (KT). De buisjes worden nog enkele malen geroteerd tijdens de incubatie. Hierna worden ze gedurende 5 min. gecentrifugeerd (Centrifuge 5804 eppendorf) aan 2000 xg en wordt het supernatans grotendeels verwijderd. Vervolgens worden de buisjes gevortext (VWR), wordt 3 ml cellyse oplossing (Qiagen) toegevoegd en worden ze opnieuw gevortext. Indien celklompjes aanwezig zijn, wordt er
15
geïncubeerd op 37°C tot de oplossing homogeen is. Het protocol kan hier onderbroken worden vermits de stalen stabiel zijn in de cellyse oplossing gedurende 2 jaar op KT. De tweede stap is proteïne precipitatie: 1 ml proteïne precipitatie buffer (Qiagen) wordt toegevoegd aan het cellysaat, dit wordt gedurende 20 sec. gevortext en gedurende 10 min. geïncubeerd op ijs. Hierna wordt er gedurende 5 min. gecentrifugeerd aan 2000xg. De neergeslagen eiwitten moeten een stevig donkerbruin pellet vormen. Indien dit niet het geval is, worden de vorige drie stappen herhaald. DNA precipitatie is de derde stap. Het supernatans (en DNA) wordt overgegoten in een 15 ml buisje dat 3 ml 100% isopropanol (KT) (VWR) bevat. De buisjes worden een 50-tal keer geroteerd tot de witte DNA draden zichtbaar worden. Dit wordt gedurende 3 min. gecentrifugeerd aan 2000xg. Het supernatans wordt afgegoten en 3 ml 70% ethanol (KT) (Sigma-aldrich) wordt toegevoegd teneinde het DNA pellet te wassen. Dit wordt gecentrifugeerd gedurende 1 min. aan 2000xg en het supernatans wordt afgegoten. Er wordt nogmaals kort gecentrifugeerd en de resterende vloeistof wordt geaspireerd. De buisjes worden 10 min. gedroogd aan de lucht. De laatste stap in het proces is DNA hydratatie: er wordt 500 μL DNA hydratatie oplossing (Qiagen) toegevoegd en zacht gevortext gedurende 5 sec. Dit wordt gedurende 1u op 65°C geïncubeerd met behulp van een warmwaterbad (Fisher scientific) waarna het overnacht op KT geïncubeerd wordt. Uiteindelijk wordt er kort gecentrifugeerd en de DNA oplossing wordt overgebracht in een 1.5 ml buisje met schroefdop. Dit dient bewaard te worden op 4°C/-20°C. 5
DNA concentratiebepaling
De concentratie en de kwaliteit van het geïsoleerde DNA worden bepaald met behulp van een Trinean Dropsense-96 Multichannel fotospectrometer. Dit toestel is beschikbaar op de dienst Medische Genetica van het UZ Gent. Er wordt gebruik gemaakt van een
plaatje met
capillairen. In de eerste drie lanen wordt 1µl DNA hydratatiebuffer gepipetteerd. De eerste laan functioneert als callibrator, de tweede en derde laan zijn blanco controles. In de overige lanen wordt steeds 2µl DNA oplossing van patiëntenstalen gepipetteerd. De spectrometer berekent voor elk staal de UV-absorptie bij 260nm en 280nm. Op die manier kan de DNA concentratie (ng/μl) van elk staal bepaald worden. Voor de kwaliteitsbepaling wordt de verhouding A260/A280 berekend. Voor zuiver DNA ligt deze waarde steeds tussen 1.8 en 2.0. Nadien wordt steeds een werkoplossing gemaakt met een concentratie van 25ng/µl. Deze concentratie wordt bekomen na verdunning met Tris-EDTA (TE) buffer.
16
6
PCR
6.1 Principe Met behulp van PCR kan een DNA fragment van interesse exponentieel geamplificeerd worden. Een PCR reactie bestaat uit drie stappen. De eerste stap is de denaturatie waarbij de dubbele helix uit elkaar valt bij een hoge temperatuur (94°C). Erna vindt de hybridisatie plaats waarbij het DNA hybridiseert met de primers bij een lage temperatuur (45-65°C). Als laatste gebeurt de extensie: een polymerase verlengt de primers bij een gemiddeld hoge temperatuur (72°C). Dit proces wordt 30-40 keer herhaald. Er wordt steeds gebruik gemaakt van een standaard PCR mix (Tabel III). Deze mix wordt uitverdeeld over kleine PCR-epjes die uiteindelijk in het toestel geplaatst worden (BIO-RAD c1000 Thermal Cycler). Tabel III. Standaard PCR mix Reagens
Hoeveelheid
dNTP’s* (1mM)
3 µl
Buffer kappa* (5X)
3 µl
MgCl2 kappa* (25mM)
0.9 µl
Forward primer° (50µM)
0.3 µl
Reverse primer° (50µM)
0.3 µl
Kappa Taq* (5U/µl)
0.072 µl
DNA (25ng/µl)
3 µl
Sigma water
4.43 µl
Totaalvolume
15 µl
*: Kapa Biosystems °: Integrated DNA Technologies
6.2 Primers Een primer is een kort stukje enkelstrengig DNA dat complementair is met het target DNA. Het wordt gebruikt als startpunt van de PCR-reactie. Er zijn steeds twee primers vereist: een die hecht op de 3’ streng en een andere die bindt op de 5’ streng, deze worden respectievelijk de forward en de reverse primer genoemd. Primers kunnen ontwikkeld worden met behulp van een computerprogramma (Primer3Plus). Anderzijds kunnen ze ook manueel ontworpen worden op basis van de sequentie van het gen waarin de SNP zich bevindt (NCBI SNP database). Een ideale primer is ongeveer 18-22 baseparen lang en bevat 50% GC-nucleotiden.
17
De annealing temperature (Ta) van een primer verhoogt al naargelang de lengte van de primer en ligt steeds tussen 50°C en 68°C, beide primers moeten echter dezelfde Ta hebben. De Ta ligt 2 graden onder de smelttemperatuur (Tm) die berekend kan worden met behulp van volgende formule: (#A/T x 2) + (#G/C x 4). Een primer bevat liefst geen herhalingen van 3 of meer basenparen, de kans neemt dan immers toe dat de primer met zichzelf zal binden in plaats van met het target DNA. Ook de twee primers onderling mogen geen homologe stukken bevatten omdat ze dan met elkaar zouden kunnen hybridiseren. Aan het 3’ eind bevindt er zich bij voorkeur een G of een C. Deze nucleotiden bevatten immers 3 waterstofbruggen (tegenover 2 in het geval van A of T) waardoor een sterkere binding verkregen wordt. Uiteindelijk kan in silico gecontroleerd worden of de PCR reactie zal slagen met de ontworpen primers (UCSC Genome Bioinformatics). De primers worden door Integrated DNA Technologies (IDT) geleverd in poedervorm. Ze worden opgelost in een 10 mM TE buffer. Wanneer de primers gebruikt worden voor sequenering of voor RFLP wordt een stockoplossing bereid met een concentratie van 250 μM en een werkoplossing van 50 μM. Voor gebruik bij HRM wordt een stockoplossing van 100 μM en een werkoplossing van 5 μM gemaakt. De concentraties worden steeds bereikt door toevoegen van TE buffer.
6.3 PCR-optimalisatie Eerst en vooral dient, zoals eerder vermeld, een geschikt primerpaar gezocht te worden. Nadien moeten de condities voor elke PCR-reactie geoptimaliseerd worden. In tabel IV wordt een overzicht weergegeven van mogelijke PCR programma’s. Er kan gestart worden met een algemeen programma op Ta (annealing temperature = Tm – 2). Eventueel kan ook een touchdown programma uitgevoerd worden op Ta, het voordeel van een touchdown programma is dat de binding van de primer veel specifieker gebeurt. Indien er nog steeds aspecifieke bandjes te zien zijn, kan de temperatuur opgedreven worden tot wanneer een goed resultaat bekomen wordt.
18
Tabel IV. PCR-programma’s Algemeen programma
Touchdown programma
95°
5 min
94°
2 min
95°
1 min
94°
20 sec
Ta
1 min
Ta
15 sec
72°
1 min
-1° per cyclus
72°
10 min
72°
1 min
15°
10 min
94°
40 sec
Ta – 12
40 sec
72°
30 sec
72°
10 min
15°
10 min
35 cycli
12 cycli
24 cycli
6.4 Controle PCR-reactie Met behulp van gelelektroforese (CosmoBio) kan gecontroleerd worden of de PCR-reactie gelukt is. DNA is negatief geladen en zal migreren naar de anode (de positieve pool). Kleine moleculen zullen sneller migreren dan grote moleculen. Op die manier kunnen DNA fragmenten op basis van hun grootte onderscheiden worden. Er wordt een 1.5% agarosegel gemaakt door 1.5g agarose (Sigma) op te koken in 100 ml 0.5X Tris boraat EDTA-buffer (TBE-buffer). Na dit 30 minuten te laten drogen wordt een stevige gel bekomen met afzonderlijke laantjes. Het eerste laantje wordt geladen met een ladder (BioLabs), hetgeen ons een indicatie geeft over de grootte van het PCR fragment. De overige laantjes worden gevuld met 2μl PCR-product, 1.5μl ladingsbuffer en 6.5μl water. Tijdens elke PCR reactie dient er steeds een negatieve controle aanwezig te zijn. Bij deze blanco wordt water toegevoegd aan de mix in plaats van DNA. Als de negatieve controle toch een signaal geeft, is er sprake van contaminatie. Na een gelelektroforese gedurende 30 min aan 135V, wordt de gel gedurende 20 min in een ethidium bromide (EtBr) bad geplaatst. EtBr is een kleurstof die intercaleert tussen het DNA en zal aldus het DNA aankleuren. Uiteindelijk kan het resultaat gecontroleerd worden onder een UV-lamp.
19
6.5 Bereiding buffers 6.5.1 TE buffer Om een 100 mM TE buffer te bereiden wordt 6.05 g Tris samen met 1.86 g EDTA opgelost in 500 ml dH2O. De oplossing wordt aangezuurd met 1M HCl. Van deze stock wordt een werkoplossing bereidt van 10 mM door 10 keer te verdunnen. 6.5.2 TBE buffer 10X stock TBE buffer wordt bereid door 54 g Tris, 27.5 g boraat en 4.65 g EDTA2Na op te lossen in 500 ml dH2O. De 0.5X werkoplossing wordt verkregen door 20 keer te verdunnen. 6.5.3 Ladingsbuffer 500 µl glycerol, 250 µl broomfenolblauw (BFB) 1% en 250 µl dH2O worden samengevoegd voor het verkrijgen van de ladingsbuffer. De ladingsbuffer wordt bewaard in 1.5 ml epjes op -20°C. BFB is een toxisch poeder, er dient steeds in de trekkast te worden gewerkt. 7
SNP analyse
7.1 RFLP 7.1.1 Principe Restriction fragment length polymorphism (RFLP) is een techniek waarmee verschillen in homologe DNA sequenties kunnen worden opgespoord. Het DNA fragment van interesse wordt verknipt met restrictie-enzymen (RE). De aanwezigheid van een SNP kan echter een knipplaats verwijderen of induceren. Door specifiek een RE te kiezen waarvan z’n herkenningssequentie de polymorfe plaats bevat, kunnen verschillende genotypes van elkaar onderscheiden worden. Hiervoor wordt het geamplificeerde DNA toegevoegd aan een mix bestaande uit water, enzym (BioLabs) en een enzym-specifieke buffer (BioLabs). Na incubatie worden de resulterende fragmenten gescheiden volgens hun lengte met behulp van gelelektroforese. Er wordt een 2% agarose gel gebruikt die vervolgens gekleurd wordt met EtBr. Ook hier wordt steeds een ladder op de gel geladen alsook ongeknipt PCR-product.
20
7.1.2 Optimalisatie Voor de PCR-reactie die voorafgaat aan RFLP zijn primers vereist die een fragment leveren van 600 à 800 basenparen, waarin de SNP centraal gelegen is. Voor de RFLP-reactie wordt eerst op zoek gegaan naar een geschikt RE, dit kan in silico gebeuren. De DNA sequentie, inclusief de SNP, wordt ingevoerd in restrictionmapper.org; eenmaal met het wild type allel en eenmaal met het variante allel. Enzymen die slechts één van beide sequenties herkennen komen in aanmerking. Vervolgens wordt gezocht naar de ideale mix. Deze mix bestaat zoals reeds vermeld uit PCR-product, water, het enzym en enzym-specifieke buffer. Er wordt steeds in een eindvolume van 30µl gewerkt. De verhouding van deze bestanddelen in de mix wordt gevarieerd, alsook de incubatietijd. Dit tot wanneer een duidelijk resultaat bekomen wordt waarbij alle PCR-product geknipt is, met hierbij zo weinig mogelijk RE toe te voegen.
7.2 HRM 7.2.1 Principe High resolution melting (HRM) analyse is een techniek waarbij geamplificeerd DNA wordt verhit van 60°C tot 95°C. Het volledige protocol wordt weergegeven in tabel V. Op een bepaald moment wordt de smelttemperatuur van het DNA bereikt en zullen de twee DNAstrengen uiteen gaan. Dit proces wordt in real-time gevolgd dankzij een fluorescente kleurstof die specifiek intercaleert met dubbelstrengig DNA. Aangezien de smelttemperatuur van een DNA fragment afhankelijk is van de sequentie, kan deze techniek gebruikt worden voor SNP analyse. Bij HRM worden specifieke smeltpatronen bekomen, de smeltcurves van homozygoten hebben een gelijkaardige vorm maar vertonen een shift in Tm. De curve van een heterozygoot heeft een andere vorm wegens de vorming van heteroduplexen (Figuur 3). Tabel V. Standaard HRM programma 95°C
10 min
95°C
15 sec
Ta
1 min
95°C
10 sec
60°C
1 min
95°C
15 sec
60°C
15 sec
40 cycli
21
Figuur 3. Genotypering m.b.v. HRM voor rs2881208. Smeltcurves voor WT (GG), mutanten (AA) en heterozygoten (GA).
Er wordt steeds een mix gemaakt die uitverdeeld wordt over een HRM-plaat. De samenstelling van deze mix wordt weergegeven in tabel VI. Van elk genotype worden telkens twee gekende controles toegevoegd ter referentie. De HRM reactie wordt uiteindelijk uitgevoerd met het 7500 Fast Real Time PCR system van Applied Biosystems. Nadien gebeurt de verwerking van de gegevens met behulp van HRM Software v2.0 (Applied Biosystems). Tabel VI. Standaard HRM mix Reagens
Hoeveelheid
dNTP’s (10mM)
0.4 µl
Buffer (10X)
2 µl
MgCl2 (25mM)
1.2 µl
Forward primer (5µM)
1.2 µl
Reverse primer (5µM)
1.2 µl
AmpliTaq (5U/µl)
0.05 µl
Syto 9 (20X)°
0.6 µl
DNA (25ng/µl)
1 µl
Sigma water
12.35 µl
Totaalvolume
20 µl
° in plaats van Syto 9 kan ook meltdoctor dye gebruikt worden
22
7.2.2 Sequenering Om gebruik te kunnen maken van HRM zijn steeds gekende controles vereist ter referentie. Hiervoor dienen enkele stalen gesequeneerd te worden, dit gebeurt door de firma GATC Biotech. Er dient zowel PCR product als primer te worden afgeleverd. De primers worden zo ontworpen dat er een fragment ontstaat van ongeveer 400 basenparen. Het resultaat wordt bekeken met Sequence scanner v1.0. 7.2.3 Optimalisatie Er wordt gezocht naar primers die een fragment leveren van ongeveer 100 tot 200 basenparen lang. Bij voorkeur bevinden er zich geen andere SNPs in het fragment, dit kan op voorhand gecontroleerd worden via Ensembl. Er worden verschillende primers ontworpen zodat uiteindelijk verder gewerkt kan worden met het beste primerpaar; het primerpaar waarbij de verschillende genotypes het best onderscheiden worden. Daarnaast dient ook het correcte HRM programma te worden bepaald. De temperatuur van de HRM zal afhankelijk zijn van de Ta van de gebruikte primers. 8
Kwaliteitscontrole
Voor elke onderzochte SNP wordt de analyse van 10 à 15% van de stalen herhaald. Dit om te controleren of elke genotypering wel correct gebeurd is. Indien de genotypes van een bepaald staal niet overeen komen,
dienen alle stalen van deze reactie opnieuw te worden
geanalyseerd. 9
Statistische analyse
Alvorens de statistische analyse aan te vangen, worden de patiënten gedichotomiseerd. Zoals hoger beschreven krijgen de patiënten voor elk klinisch eindpunt een score, gaande van 0 tot 4, toegekend voor de RT en 2 jaar na de RT. Er wordt gewerkt met het verschil tussen beide scores, op die manier komen de patiënten in de klassen ∆0 (geen toxiciteit), ∆1 (matige toxiciteit) of ∆2 (ernstige toxiciteit) terecht. De dichotomisering werd in deze studie op twee manieren aangepakt. Voor de eerste aanpak worden alle patiënten met ∆0 gecategoriseerd in één groep (0 = vertonen geen toxiciteit na RT) en alle patiënten met
∆1 en ∆2
gecategoriseerd in een andere groep (1 = vertonen matige of ernstige toxiciteit na RT). Voor de tweede aanpak worden alle patiënten met ∆0 en ∆1 gecategoriseerd als 0 en enkel patiënten die ernstige toxiciteit vertonen (∆2) gecategoriseerd als 1.
23
Voor de dichotomisering van de continue STAT scores werd het 75e percentiel berekend. STAT scores hoger dan het 75e percentiel werden gecategoriseerd als 1. Lagere STAT scores werden gecategoriseerd als 0. Voor de statistische analyse naar associatie tussen genetische variaties en het optreden van late toxiciteit na RT werd logistieke regressie toegepast teneinde odds ratio’s en p-waarden te bekomen. De invloed van mogelijke confounders, waaronder klinische parameters en behandelingsgerelateerde factoren, wordt bepaald via univariate analyse. Associaties met categorische variabelen worden nagegaan met behulp van de Chi-Square test. De Mann Whitney U test wordt gebruikt om associaties met continue variabelen na te gaan. Variabelen die een significante associatie vertonen worden in rekening gebracht via multipele regressie. P-waarden kleiner of gelijk aan 0.05 wijzen op statistische significantie. De analyses werden uitgevoerd met behulp van SPSS v.20.0 software pakket.
24
Resultaten 1
Optimalisatie protocols
In bijlage 2-6 worden de uitgewerkte protocols voor de SNP bepalingen weergegeven. Bijlage 7 bevat de resultaten van de genotypering.
1.1 CCDC129 rs882460 T>C Voor de optimalisatie van de PCR reactie, voorafgaand aan RFLP, wordt manueel op zoek gegaan naar een geschikt primerpaar. Primers 558 en 559 werden ontworpen en getest onder verschillende condities. Geen enkele keer kon echter een duidelijk fragment waargenomen worden zonder smeer of aspecifieke bindingen. Er werd besloten om nieuwe primers te ontwerpen. Voor deze primers, die weergegeven worden in tabel VII, werd een algemeen PCR programma gebruikt op 64°C. Er wordt een fragment geamplificeerd van 673 bp.
Tabel VII. PCR primers rs882660 Primer nummer
Primer sequentie
Primer lengte (bp)
Tm (°C)
Fwd 562
5’- GACTTGGCCACTTCCTCTAC -3’
20
62
Rev 563
3’- AGGCAGTTCTCAACCTCCTG -5’
20
62
Met behulp van het programma restrictionmapper.org wordt op zoek gegaan naar een geschikt restrictie-enzyme (RE). De SNP met code rs882460 betreft een T>C substitutie; MluI is een RE dat enkel knipt in het geval van een C. Het patroon dat na gelelectroforese en kleuring bekomen wordt is als volgt: TT genotype vertoont een bandje ter hoogte van 673 bp, TC genotype vertoont bandjes ter hoogte van 673, 421 en 252 en CC zal bandjes vertonen ter hoogte van 421 en 252 (zie figuur 4). Voor het digest bestond de ideale mix uit 3µl buffer, 0.2µl enzym (2U), 16.8 µl water en 10 µl PCR-product. Dit werd gedurende 3u geïncubeerd op 37°C.
Figuur 4. Resultaat digest rs882460. Laan 1: ladder, laan 2: ongeknipt PCR product, overige lanen: patiëntenstalen
25
1.2 XRCC1 rs2682585 G>A Voor de genotypering van deze SNP werd eveneens een geschikt RE gevonden. Voor de PCR reactie worden primers 528 en 529 gebruikt, die weergegeven worden in tabel VIII. Als RE werd gekozen voor FauI. Er werden mixen bereid met enzym concentraties gaande van 1 unit tot 10 units. De stalen werden geïncubeerd gedurende 3u, alsook overnacht. In geen enkel geval echter werd het DNA voldoende geknipt. Dit kan te wijten zijn aan CpG-methylatie, FauI wordt immers geblokkeerd in dit geval (45).
Tabel VIII. PCR primers rs2682585 Primer nummer
Primer sequentie
Primer lengte (bp)
Tm (°C)
Fwd 528
GGAGGATGGAGGATTCAGAG
20
62
Rev 529
GAATCCCAGTTCTTGCAGCC
20
62
Aangezien RFLP niet haalbaar blijkt te zijn voor deze SNP, wordt overgeschakeld op HRM. Gekende controles worden verkregen via sequenering, hiervoor worden de reeds ontworpen primers 528 en 529 gebruikt (Tabel IX). Na sequenering was er geen enkel AA genotype beschikbaar. Voor optimalisatie van de HRM worden 4 primerparen getest op 60°C. De volgende combinaties werden getest: 530/531, 530/533, 531/532 en 532/533 (Tabel IX). De verschillende genotypes worden het best onderscheiden met primerpaar 531/532, met deze primers wordt dan ook verder gewerkt. Na enkele HRM analyses werden vermoedelijk AA genotypes teruggevonden. Deze genotypes werden bevestigd via sequenering. De smeltcurve wordt weergegeven in figuur 5.
Tabel IX. HRM primers rs2682585 Primer nummer
Primer sequentie
Primer lengte (bp)
Tm (°C)
Fwd 530
AAGGTCTCTGGTCTCCTGG
19
60
Rev 531
CTGGTTCTGCCTTCCCAAC
19
60
Fwd 532
TGTATCAGCAGTACCTGGTC
20
60
Rev 533
CTGACCTCAGCTATTTCTCC
20
60
26
Figuur 5. Genormaliseerde smeltcurve rs2682585
1.3 TNFα rs1800629 G>A Deze SNP werd reeds onderzocht binnen de onderzoeksgroep, waardoor het protocol reeds op punt stond. Primers 435 en 436, die weergegeven worden in tabel X, werden gebruikt en leveren een PCR fragment van 109 bp lang. Figuur 6 geeft de genormaliseerde smeltcurve weer.
Tabel X. HRM primers rs1800629 Primer nummer
Primer sequentie
Primer lengte (bp)
Tm (°C)
Fwd 435
AGGAAACAGACCACAGACCTGG
22
66
Rev 436
CCACTGACTGATTTGTGTGTAGG
23
66
Figuur 6. Genormaliseerde smeltcurve rs1800629
27
1.4 SATB2 rs2881208 G>A Deze SNP werd geanalyseerd met HRM, er werd immers geen geschikt RE gevonden. Omdat er gekende controlestalen vereist zijn, werden primers ontworpen voor zowel sequenering (546, 547) als voor HRM (548, 549, 550, 551). De primers worden weergegeven in tabel XI.
Tabel XI. Primers rs2881208 Primer nummer
Primer sequentie
Primer lengte (bp)
Tm (°C)
Fwd 546*
CAGCTAAGTGGAAGAATATG
20
56
Rev 547*
AAATGAACACTGGACTCATG
20
56
Fwd 548°
TGACTTGACTTTGCATCTCAG
21
60
Rev 549°
CTGGACATTTAGTATCTCACC
21
60
Fwd 550°
GACTCTGAAGCCAGGTTGC
19
60
Rev 551°
GCACTGGAGGTAAGCTATAG
20
60
*primers voor sequenering °primers voor HRM
Verschillende primer combinaties werden getest op 60°C. Geen enkele combinatie levert echter een goeie scheiding op van de genotypes. Met behulp van de software wordt duidelijk dat de PCR reactie niet gelukt is. De HRM wordt opnieuw ingesteld op 62°C. Het primerpaar 549/550 levert nu een goed resultaat, er wordt een fragment gevormd van 136 bp. Het smeltpatroon wordt weergegeven in figuur 7.
Figuur 7. Genormaliseerde smeltcurve rs2881208
28
1.5 SLFN14 rs2840044 A>G Voor deze SNP werd evenmin een geschikt RE gevonden, rs2840044 werd aldus via HRM bepaald. In tabel XII worden de primers weergegeven. Het primerpaar 552/553 werd gebruikt voor sequenering. Van de primers voor HRM (554, 555, 556, 557) werden verschillende primerparen getest. Met de primers 554/557 kunnen de verschillende genotypes het best van elkaar onderscheiden worden. Deze primers leveren een fragment van 164 bp. Tabel XII. HRM primers rs2840044 Primer nummer
Primer sequentie
Primer lengte (bp)
Tm (°C)
Fwd 552*
CCAGATGCCTCCATCTCACC
20
64
Rev 553*
ACTGCGCTTAGCCGACAATTG
21
64
Fwd 554°
CTCTGCCACATTCTAGCTATG
21
62
Rev 555°
GGAGGAGGCTCTGTTATTATC
21
62
Fwd 556°
GGATCCTAAGGTGTTCAGATC
21
62
Rev 557°
CAAAGAGCACATGTTAACACAC
22
62
*primers voor sequenering °primers voor HRM
Na analyse bleken de stalen gegroepeerd te worden in meer dan drie klassen, hetgeen het vermoeden opwekte dat er een andere SNP in het fragment aanwezig was. Aangezien de SNP met code rs2840044 niet gelegen is ín een gen, maar nabij het SLFN14 gen, kon op voorhand niet gecontroleerd worden of naburige SNPs aanwezig waren. De sequeneringsdata van de controlestalen waren reeds gekend en bevestigden de aanwezigheid van een extra SNP op 19 bp van rs2840044, zoals weergegeven in figuur 8. Deze extra SNP zal eveneens onderzocht worden op associatie met late toxiciteit na RT. Het betreft een G>T variatie en komt in onze studiepopulatie voor met een frequentie van 38%. Dit polymorfisme zal aangeduid worden met de code rsxxx. rs2840044
rsxxx
Figuur 8. Resultaat van de sequenering van staal Ga29
29
In plaats van drie mogelijke genotypes (AA, AG, GG), kan deze HRM in theorie negen verschillende genotypes onderscheiden. De sequenering leverde reeds 5 genotypes, waarvan telkens minimaal één als controle meegenomen werd in elke HRM run. De resultaten van de sequenering worden weergegeven in tabel XIII. Tabel XIII. Controlestalen HRM SLFN14 Controlestaal
rs2840044
rsx
Ga07
AA
TT
Ga30
AA
GT
Ga10
AG
GG
Ga29
AG
GT
Ga40
GG
GG
Figuur 9 geeft de smeltcurves weer voor beide SNPs. Na enkele analyses vertonen drie stalen steeds een afwijkende curve. Op basis van het smeltpatroon vermoeden we dat deze drie stalen voor rs2840044 en rsx respectievelijk een genotype AA en GG hebben. Sequenering van deze drie stalen bevestigde deze genotypes. In bijlage 6 kunnen de protocols voor deze SNPs teruggevonden worden.
Figuur 9. Genormaliseerde smeltcurve rs2840044 + rsx
30
2
Beschrijving onderzoekspopulatie
Voor deze studie werd een groot aantal patiëntenkarakteristieken en behandelingsgerelateerde variabelen beschouwd. Tabel XIV geeft een algemeen overzicht weer van de onderzoekspopulatie. De leeftijden van de patiënten binnen de populatie bevinden zich tussen de 33 en 80 jaar. De mediaan van de BMI-waarden bedraagt 26, wat erop wijst dat meer dan de helft van de onderzoekspopulatie aan een lichte vorm van overgewicht lijdt. Ongeveer 20% van de vrouwen lijdt aan ernstig overgewicht. De meeste vrouwen (84%) zijn postmenopauzaal. Adjuvante hormoontherapie werd gegeven aan 84% van de patiënten, terwijl slechts 29% chemotherapie onderging. Van alle patiënten werd ongeveer 74% in ruglig en 26% in buiklig bestraald. Ongeveer 62% kreeg reeds te maken met acute toxiciteit. Tabel XIV. Algemeen overzicht van de populatie (n=238) Leeftijd (jaar) mediaan bereik BMI (kg/m2) mediaan bereik missing BH cupmaat ≤C >C missing Borstvolume (cc) mediaan bereik missing Dosimetrische hotspots V105(cc) mediaan bereik missing Menstruatie ja nee missing Diabetes ja nee missing Hypertensie ja nee missing Roken ooit nooit missing
59 33-80 26 16-50 1 166 67 5 495 42-2091 2 5 0-439 33 34 (14.3) 200 (84.0) 4 (1.7) 17 (7.1) 218 (91.6) 3 (1.3) 66 (27.7) 169 (71.0) 3 (1.3) 98 (41.2) 138 (58.0) 2 (0.8)
31
Tabel XIV (vervolg). Algemeen overzicht van de populatie (n=238) Roken gedurende RT ja nee Alcohol ooit nooit missing Alcohol gedurende RT ja nee missing Tumorgrootte (cc) mediaan bereik Hormoontherapie ja nee missing Hormoontherapie middel tamoxifen aromatase inhibitor Chemotherapie ja nee missing Doelgerichte therapie ja nee Positie ruglig buiklig Axilla bestraling ja nee Boost ja fotonen elektronen nee Acute toxiciteit* ja nee missing
16 (6.7) 220 (92.4) 176 (73.9) 60 (25.2) 2 (0.8) 38 (16.0) 198 (83.2) 2 (0.8) 1.5 0.2-5 200 (84.0) 37 (15.5) 1 (0.5) 129 (64.5) 71 (35.5) 69 (29.0) 168 (70.5) 1 (0.5) 16 (6.7) 222 (93.3) 176 (73.9) 62 (26.1) 33(13.9) 205 (86.1) 182 (76.5) 176 (96.7) 6 (3.3) 56 (23.5) 147 (62.3) 89 (37.7) 2 (0.8)
Data tussen haakjes geven percentages weer *Acute toxiciteit wordt beschouwd indien men minstens twee graden slechter scoort na RT dan voor RT voor oedeem, desquamatie en/of dermatitis
32
3
Associatiestudie naar late toxiciteit
De klinische eindpunten die beschouwd worden binnen deze studie zijn fibrose, oedeem, pigmentatie en cosmesis van de borst. Deze aspecten worden gescoord voor de RT en twee jaar na de RT. Door het verschil te nemen van beide scores wordt de toxiciteit bepaald die te wijten is aan de RT. De patiënten worden onderverdeeld in drie klassen: ∆0, ∆1 of ∆2. Patiënten in ∆0 vertonen geen toxiciteit door RT. ∆1 wijst op matige toxiciteit door RT (een stijging van één graad). Ernstige toxiciteit wordt weergegeven als ∆2 (een stijging van twee graden). De frequentie van toxiciteit binnen de populatie wordt weergegeven in tabel XV. Tabel XV: toxiciteit binnen de studiepopulatie Eindpunt
Aantal patiënten
Percentage
∆1 ∆2
62 22
26% 9%
∆1 ∆2
37 3
16% 1%
∆1 ∆2 Missing
49 9 1
21% 4% 0.4%
∆1 ∆2 Missing
66 10 37
33% 5% 16%
Fibrose
Oedeem
Pigmentatie
Cosmesis
Binnen deze studie werd elk eindpunt op twee manieren geanalyseerd. Bij een eerste dichotomisering werd ∆0 beschouwd als ‘geen toxiciteit’, patiënten die een ∆1 of een ∆2 toegewezen kregen vormen de ‘cases’ die toxiciteit vertonen na RT. Bij een tweede dichotomisering werd iets strenger te werk gegaan. Enkel patiënten die ernstige nevenreacties vertonen (∆2) worden nu beschouwd als ‘cases’. ∆0 en ∆1 worden hier beschouwd als ‘geen toxiciteit’. Het is echter niet evident om statistische significantie te bereiken wanneer ∆0 + ∆1 vergeleken worden met ∆2. Het aantal patiënten in de groep ∆2 is voor de meeste eindpunten immers beperkt. In onze studiepopulatie vertoonden slechts 3 patiënten ernstige oedeem. Analyses volgens de strengere dichotomisering waren hier bijgevolg zinloos.
33
3.1 Associaties tussen patiënt- en behandelingsgerelateerde factoren en late toxiciteit Een overzicht van de sterkste associaties wordt weergegeven in tabel XVI. Oudere personen hebben meer kans op het ontwikkelen van late toxiciteit. Een hoger BMI en grotere borstvolumes zijn eveneens risicofactoren. Vrouwen met een grote cupmaat blijken een hoger risico te hebben voor de ontwikkeling van oedeem. Een grote tumor is significant geassocieerd met de ontwikkeling van fibrose. Dosimetrische hotspots worden beschouwd als het volume van de borst dat een dosis krijgt die 105% bedraagt van de voorgeschreven tumordosis. Zoals verwacht zijn deze hotspots risicofactoren voor nevenreacties na RT. Postmenopauzale vrouwen vertonen significant meer toxiciteit dan premenopauzale vrouwen met
betrekking
tot
oedeem,
pigmentatie
en
globale
toxiciteit.
Hypertensie
en
alcoholconsumptie hebben eveneens een nadelig effect op de ontwikkeling van oedeem. Patiënten die een adjuvante hormoontherapie ondergingen vertonen een hoger risico op nevenreacties. Het type hormoontherapie blijkt eveneens van belang. Behandeling met tamoxifen leidt tot minder toxiciteit dan wanneer aromatase inhibitoren gebruikt worden. Vrouwen waarvan ook de axilla bestraald werden, vertonen vaker toxiciteit. Het krijgen van een boost vertoont een significante associatie met de ontwikkeling van fibrose en globale toxiciteit. Tot slot blijken vrouwen die eerder reeds te maken kregen met acute toxiciteit, ook een hogere kans hebben op het ontwikkelen van chronische toxiciteit. Diabeten en rokers vertonen geen significant hoger risico op late toxiciteit na RT. De duur van de RT blijkt eveneens van weinig belang te zijn, alsook het krijgen van chemotherapie en/of doelgerichte therapie. Verder leverde ook de positie waarin de patiënt bestraald werd (in ruglig of in buiklig) geen significant verband op met de ontwikkeling van toxiciteit.
34
Tabel XVI: Associaties tussen patiënt-en behandelingsgerelateerde variabelen en late toxiciteit na radiotherapie (p-waarden) Variabele Leeftijd BMI Cupmaat recode˟ Borstvolume Dosimetrische hotspots, V105 Menstruatie Hypertensie Alcohol Alcohol tijdens RT Tumor grootte Hormoontherapie Hormoontherapie middel Axilla bestraling Boost Acute toxiciteit
Fibrose_d1*
Fibrose_d2°
Oedeem
Pigmentatie_d1
Pigmentatie_d2
BCCT_d1
BCCT_d2
STAT
0.013 0.012 0.005 0.005 -
0.046 0.056 0.006 -
0.005 0.001 0.003 <0.001 0.046 0.023 0.049 0.041 0.003 <0.001 0.001 0.011
0.004 0.001 0.001 0.022 0.002 0.011 <0.001 <0.001 0.007
0.006 0.001 0.017 0.007 -
0.053 0.021 0.001 0.018 0.043 -
0.034 0.001 0.003 0.012 0.034 -
0.001 <0.001 <0.001 <0.001 0.013 0.002 <0.001 <0.001 0.017 <0.001
* d1(dichotomisering 1): ∆0 wordt gecategoriseerd als 0 (geen toxiciteit), ∆1 en ∆2 worden gecategoriseerd als 1 (optreden van toxiciteit). ° d2 (dichotomisering 2): ∆0 en ∆1 worden gecategoriseerd als 0 (geen toxiciteit), ∆2 wordt gecategoriseerd als 1 (optreden van toxiciteit). ˟ voor cupsize werd met een coderingssysteem gewerkt: 1 = A, B, C; 2 = D+
35
3.2 Associaties tussen genetische polymorfismen en late toxiciteit Alle SNPs werden consistent bevonden met het Hardy Weinberg Equilibrium (HWE). De volledige resultaten van de univariate en multivariate analyse van de SNPs met betrekking tot late toxiciteit zijn te vinden in bijlage 8. De SNPs waarvoor significante associaties gevonden werden met één of meerdere eindpunten worden hieronder besproken. De SNP met code rs2682585 (XRCC1) vertoont associatie met de ontwikkeling van slechte cosmesis na RT. Univariate analyse wijst uit dat dragers van het GA genotype een significant hoger risico vertonen op ontwikkeling van een slechte cosmesis (OR=2.43, p=0.006). Na correctie voor confounders blijft deze associatie significant (OR*=2.07, p*=0.036) en wordt de associatie tussen het AA genotype en een slechte cosmesis eveneens significant (OR*=4.38, p*=0.027). Na univariaat en multivariaat testen van een dominant en recessief model blijkt dat drager zijn van één A allel voldoende is voor predispositie (OR=2.41, p=0.003,
OR*=2.34,
p*=0.009,
respectievelijk)..
De
genotypefrequenties
worden
weergegeven in figuur 10.
XRCC1 rs2682585 (dominant)
100 80 60 40 20 0
Goede cosmesis (∆0)
GG
GA
Genotype
AA
Slechte cosmesis (∆1+∆2)
Frequentie (%)
Frequentie (%)
XRCC1 rs2682585
100 80 60 40 20 0
Goede cosmesis (∆0)
GG
GA + AA
Genotype
Slechte cosmesis (∆1+∆2)
Figuur 10: risicoanalyse voor cosmesis: genotypefrequenties van XRCC1 rs2682585
Als deze analyses herhaald worden bij de tweede, strengere dichotomisering (goede cosmesis: ∆0 + ∆1; slechte cosmesis: ∆2) worden dezelfde trends opgemerkt. Nu zijn echter twee A allelen vereist voor een hoger risico op een slechte cosmetische uitkomst (OR*=9.37, p*=0.059). Statistische significantie wordt hier net niet bereikt. De SNP met code rs882560 (CDCC129) blijkt na correctie voor confounders eveneens een invloed te hebben op het cosmetisch resultaat na RT volgens dichotomisering 2. Het CC genotype vertoont een protectief effect voor het ontwikkelen van een slechte cosmesis. Deze trend is echter niet significant (OR*=0.24, p*=0.087).
36
Het polymorfisme rsxxx dat gevonden werd in de nabijheid van de SNP met code rs2840044 (SLFN14) blijkt geassocieerd te zijn met het optreden van fibrose na RT. Na univariate analyse van fibrose volgens dichotomisering 1 bleek dragerschap van het TT genotype een risicofactor te zijn voor de ontwikkeling van fibrose (OR=2.21, p=0.058). Na correctie voor confounders blijft deze trend zich voortzetten (OR*=2.38; p*=0.076). Statistische significantie wordt echter niet bereikt. Wanneer dezelfde analyse wordt uitgevoerd volgens de strengere dichotomisering wordt wel significantie bereikt. Univariate analyse wijst op associatie tussen het TT genotype en de kans op fibrose (OR=3.86, p=0.057). Correctie voor confounders versterkt deze associatie (OR*=4.35, p*=0.042). Verder onderzoek naar het recessief effect van het T allel bevestigt voorgaande bevindingen (OR=2.68, p=0.039, OR*=2.94,p*=0.029). Figuur 11 geeft de genotypefrequenties weer.
100 80 60 40 20 0
SLFN14 rsxxx (recessief)
Geen fibrose (∆0+∆1) Fibrose (∆2) GG
GT
TT
Genotype
Frequentie (%)
Frequentie (%)
SLFN14 rsxxx 100 50
Geen fibrose (∆0+∆1)
0
Fibrose (∆2) GG + GT
TT
Genotype
Figuur 11: risicoanalyse voor fibrose: genotypefrequenties van SLFN14 rsxxx
Verder vertoont de SNP met code rs2881208 (SATB2) een verband met het optreden van globale toxiciteit, weergegeven onder de vorm van een STAT score. Univariate analyse leidt niet tot een significante associatie, maar wanneer gecorrigeerd wordt voor confounders blijkt het GA genotype geassocieerd te zijn
met een verhoogde kans op globale toxiciteit
(OR*=3.55, p*=0.009). Analyse van het dominante model bevestigt deze bevindingen (OR*=2.42, p*=0.050). Voor de overige SNPs kon geen significante associatie aangetoond worden met het optreden van late toxiciteit na RT.
37
Bespreking De doelstelling van deze thesis bestond erin mogelijke associaties na te gaan tussen genetische variaties en de ontwikkeling van laattijdige toxiciteit na RT. Hierbij werd mogelijke confounding van klinische en behandelingsgerelateerde factoren in rekening gebracht. Van 238 patiënten werd het genotype voor de geselecteerde SNPs bepaald. Hierna werd gezocht naar mogelijke genetische susceptibiliteit met betrekking tot fibrose, oedeem, pigmentatie, cosmesis en/of globale toxiciteit. 1
Invloed van klinische en behandelingsgerelateerde factoren
De leeftijd van de vrouw is significant geassocieerd met alle eindpunten in deze studie, uitgezonderd fibrose (d2). Deze bevindingen worden bevestigd door de literatuur (46-48). Dit verband kan verklaard worden door leeftijdsgerelateerde accumulatie van mutaties en een afname wat betreft DNA herstelcapaciteit (36). Tevens gaat veroudering gepaard met een conversie van klierweefsel naar vet- en bindweefsel, wat een negatief effect kan hebben op de cosmetische uitkomst van de borst (47). Wat betreft de invloed van BMI is de literatuur inconsistent, een overzicht wordt weergegeven in tabel XVII. De studie van Lilla et al. vond geen significante associaties. Echter, deze studie onderzocht enkel de eindpunten fibrose en teleangiëctasieën, waarvan teleangiëctasieën bij ons niet werden beschouwd (36). Een studie van Cardoso et al. daarentegen vond wel associaties met BMI (49, 50). In onze studie vertoont BMI een significant verband met alle eindpunten, uitgezonderd fibrose (d2). Vrouwen met een hogere BMI hebben gewoonlijk grotere borsten die meer vetweefsel bevatten, waardoor een homogene dosisdistributie bemoeilijkt wordt en het cosmetisch eindresultaat beïnvloed wordt (51). De correlatie tussen BMI en borstvolume werd in onze studiepopulatie bevestigd (r2=0.688, p=<0.001). Fibrose (d2) blijkt niet geassocieerd te zijn met leeftijd en/of BMI. Dit kan te wijten zijn aan het beperkt aantal patiënten dat zich in de ∆2-categorie bevindt. Bovendien is fibrose een eindpunt dat moeilijk vast te stellen is. Fibrose is niet zichtbaar op foto’s, maar wordt vastgesteld door palpatie. De LENT-SOMA schaal houdt tevens geen rekening met eventuele uitbreidingen van fibrose, bijvoorbeeld van het litteken naar de volledige borst, waardoor fibrose niet steeds consistent gescoord wordt.
38
Tabel XVII: Overzicht associaties BMI - late toxiciteit #patiënten Scoreschaal Eindpunt Toxiciteit
Referentie
p-waarde
Thesis
238
LENT-SOMA LENT-SOMA LENT-SOMA LENT-SOMA LENT-SOMA BCCT.core BCCT.core STAT
Fibrose d1 Fibrose d2 Pigmentatie d1 Pigmentatie d2 Oedeem Cosmesis d1 Cosmesis d2 Globale tox.
≥∆1 ≥∆2 ≥∆1 ≥∆2 ≥∆1 ≥∆1 ≥∆2 >75%
Lilla et al.(36)
478
RTOG/EORTC + LENT-SOMA RTOG/EORTC + LENT-SOMA Harris scale
Teleangiëctasieën
≥2
0.012 0.001 0.001 0.001 0.021 0.001 <0.001 -
Fibrose
≥2
-
Cosmesis
fair/poor
<0.006
Cardoso et al.(50) -
120
Geen associatie gevonden
Voor de cupmaat werd enkel associatie vastgesteld met de ontwikkeling van oedeem. Borstvolume daarentegen was geassocieerd met alle eindpunten, uitgezonderd fibrose. Borstvolume is een betere variabele dan de cupmaat om de grootte van de borst te bepalen. Heel wat vrouwen weten immers de juiste BH-maat niet of dragen de foute BH. Anderzijds zijn cupmaten niet gestandaardiseerd onder verschillende BH-fabrikanten (52). In de literatuur werd de grootte van de borst significant bevonden met de ontwikkeling van stralingsgeïnduceerde complicaties (46, 50, 53) , wat consistent is met de bevindingen in deze thesis. Tabel XVIII geeft een overzicht weer. Bij bestraling van grotere borsten kunnen meer dosisinhomogeniteiten optreden, waardoor de kans op toxiciteit toeneemt (46). Het effect van dosisinhomogeniteiten werd in deze studie nagegaan aan de hand van V105 bepaling, zijnde het volume van de borst dat 105% van de voorgeschreven dosis ontving. Zoals verwacht vertonen deze hotspots een significant verband met alle eindpunten, uitgezonderd fibrose.
Referentie
Tabel XVIII: Overzicht associaties borstvolume - late toxiciteit #patiënten Scoreschaal Eindpunt Toxiciteit
Thesis
238
Kelemen et al.(46)
198
Cardoso et al. (50)
120
Ciammella et al. (53) 212 -
LENT-SOMA LENT-SOMA LENT-SOMA LENT-SOMA LENT-SOMA BCCT.core BCCT.core STAT Scoreschaal 0-4 volgens Johansen et al. (54) Harris scale RTOG RTOG Harvard
Fibrose d1 Fibrose d2 Pigmentatie d1 Pigmentatie d2 Oedeem Cosmesis d1 Cosmesis d2 Globale tox. Oedeem Fibrose Cosmesis Cosmesis Huidtoxiciteit Subcutane tox. Cosmesis
≥∆1 ≥∆2 ≥∆1 ≥∆2 ≥∆1 ≥∆1 ≥∆2 >75% Niet gedefinieerd fair/poor ≥∆2 ≥∆2 Fair/poor
p-waarde 0.001 0.017 <0.001 0.001 0.003 <0.001 <0.001 <0.05 <0.005 0.021
Geen associatie gevonden
39
Bevindingen met betrekking tot de invloed van hypertensie vertonen discrepanties in de literatuur (53, 55). Volgens onze studie leidt hypertensie tot een significant verhoogd risico op oedeem en een slechte cosmesis. Dit risico is mogelijks te wijten aan de medicatie, eerder dan aan hypertensie per se. Verschillende diuretica en inhibitoren van het angiotensine converterend enzym hebben immers een gekend fototoxisch effect, waardoor ze radiosensitiviteit kunnen verhogen (36). In onze studie vertonen diabetespatiënten geen verhoogd risico op stralingsgeïnduceerde toxiciteit, wat consistent is met de bevindingen van Lilla et al. (36). Volgens Ciammella et al. vertonen diabeten echter wel een significant hoger risico op complicaties na RT (53). Tabel XIX geeft een overzicht weer. Chronische diabetes kan gepaard gaan met microvasculaire veranderingen, wat atherosclerose kan veroorzaken, resulterend in weefsel hypoxie. Diabeten hebben bovendien een gestegen viscositeit van het bloed, wat kan leiden tot verdere weefsel ischemie (55).
Referentie
Tabel XIX: Overzicht associaties diabetes - late toxiciteit #patiënten Scoreschaal Eindpunt Toxiciteit
p-waarde
Thesis
238
LENT-SOMA LENT-SOMA LENT-SOMA LENT-SOMA LENT-SOMA BCCT.core BCCT.core STAT
Fibrose d1 Fibrose d2 Pigmentatie d1 Pigmentatie d2 Oedeem Cosmesis d1 Cosmesis d2 Globale tox.
≥∆1 ≥∆2 ≥∆1 ≥∆2 ≥∆1 ≥∆1 ≥∆2 >75%
Lilla et al. (36)
478
RTOG/EORTC + LENT-SOMA RTOG/EORTC + LENT-SOMA RTOG RTOG Harvard
Teleangiëctasieën
≥2
-
Fibrose
≥2
-
Huidtoxiciteit Subcutane tox. Cosmesis
≥∆2 ≥∆2 Fair/poor
0.028 0.024
Ciammella et al. (53) -
120
Geen associatie gevonden
De studie van Cardoso et al. wijst op een significant verband tussen de menopauzale status van de vrouw en de algemene cosmetische uitkomst van de borst na RT (50). Dit is consistent met onze resultaten. Postmenopauzale vrouwen vertonen een hoger risico op oedeem, pigmentatie (d1) en globale toxiciteit. Dit verband kon niet worden aangetoond met pigmentatie (d2), mogelijks door het lage aantal patiënten in klasse ∆2. Roken heeft volgens onze studie geen effect op het ontwikkelen van toxiciteit na RT. Eerdere studies wijzen op een significante associatie tussen roken en het risico op teleangiëctasieën (36). Wegens de lage incidentie van teleangiëctasieën in onze populatie werd dit eindpunt niet beschouwd in deze studie. 40
Alcoholconsumptie werd significant geassocieerd bevonden met betrekking tot oedeem en fibrose. In de literatuur werd nog maar weinig onderzoek gedaan naar het effect van alcohol op laattijdige complicaties na RT. Patiënten die naast RT ook chemotherapie en/of doelgerichte therapie ondergingen, vertonen volgens deze studie geen hoger risico op stralingsgeïnduceerde complicaties. Een groot aantal studies suggereert echter dat chemotherapie een risicofactor is voor het ontwikkelen van chronische complicaties (46, 53, 56, 57). Deze associatie blijkt vooral relevant te zijn wanneer chemotherapie gelijktijdig met de RT wordt gegeven (58), wat onze bevindingen kan verklaren. Chemotherapie en RT werden immers steeds sequentieel toegepast. Hormoontherapie wordt voorgeschreven in het geval van ER positieve en/of PR positieve borstkankers. In onze populatie werd 84% van de vrouwen behandeld met hormoontherapie. Deze vrouwen vertonen significant meer oedeem, pigmentatie en globale toxiciteit, alsook een slechter cosmetisch resultaat.
Behandeling gebeurt dikwijls met tamoxifen, waarbij de
oestrogeen signalisatie geblokkeerd wordt. Anderzijds kunnen aromatase inhibitoren (AI) toegediend worden, die de biosynthese van oestrogeen uit androgenen blokkeren. In onze studie vertoont het gebruik van AI een sterk significant verband met de ontwikkeling van fibrose, oedeem, pigmentatie en globale toxiciteit, hetgeen tegenstrijdig is met wat in de literatuur reeds gevonden werd (46, 59). De meerderheid van de patiënten ontvangt na RT een additionele boost. Het krijgen van een boost leidt volgens onze studie tot een hoger risico op fibrose (d2) en globale toxiciteit. In eerdere studies werd boost reeds geassocieerd bevonden met late toxiciteit (53, 56, 60). De geïnduceerde toxiciteit is uiteraard sterk afhankelijk van de voorgeschreven boost dosis. Deze kan bestaan uit fotonen- of elektronenbundels. Elektronen worden gebruikt voor oppervlakkige aandoeningen, ze zetten hun energie immers af ter hoogte van de huid, terwijl fotonen dieper penetreren. De studie van Kelemen et al. suggereert dat een boost met elektronen, anders dan een fotonenboost, een protectief effect uitoefent op de ontwikkeling van oedeem en fibrose. Er wordt immers gebruik gemaakt van één direct elektronenveld in tegenstelling tot de tangentiële velden die bij een fotonenboost gebruikt worden (46). De studie van Rajan et al. daarentegen geeft aan dat toxiciteit en cosmetische uitkomst na een follow-up periode van twee jaar gelijkaardig is voor zowel een
fotonen- als een
elektronenboost (61). In onze studie werd eveneens geen significant verschil opgemerkt tussen een fotonen- of elektronenboost. Dit resultaat kan echter niet zomaar vertrouwd worden, aangezien slechts 6 patiënten in deze studie een elektronenboost kregen. 41
Voor bepaalde patiënten is bestraling van de axilla noodzakelijk. Ongeveer 14% van onze studiepopulatie onderging een dergelijke axillabestraling. Deze patiënten vertonen significant meer oedeem en pigmentatie en globale chronische toxiciteit. In de studie van Kelemen et al. bleek axillabestraling eveneens significant geassocieerd te zijn met het risico op oedeem (46). Wanneer niet enkel de borst maar ook de axilla bestraald worden, kunnen problemen met overlappende velden optreden, wat leidt tot overdosering (47). Bestraling in buiklig leverde geen protectief effect met betrekking tot de ontwikkeling van stralingsgeïnduceerde complicaties. Dit is inconsistent met wat verwacht werd op basis van de literatuur. Studies wijzen immers uit dat bestraling in buiklig minder dosisinhomogeniteiten veroorzaakt dan wanneer bestraald word in ruglig (62, 63). Andere behandelingsgerelateerde factoren, zoals fractionatie en de totaal voorgeschreven dosis worden in de literatuur significant geassocieerd bevonden met het risico op radiotoxiciteit (47, 48). Onze studiepopulatie bestond echter uit patiënten die allen in het UZ Gent behandeld werden, waar ze onder sterk gelijkaardige condities bestraald werden. Alle patiënten ondergingen whole breast irradiation (WBI) volgens hetzelfde fractionatieschema (15 x 2.67 Gy). Indien een boost vereist was, bestond die steeds uit 4x2.5 Gy. Voor deze factoren kon dus geen associatie worden nagegaan. Patiënten die tijdens, of kort na RT reeds te maken kregen met acute toxiciteit, vertoonden in onze studie een hogere kans op de ontwikkeling van oedeem, pigmentatie en globale chronische toxiciteit. Acute toxiciteit werd beschouwd wanneer patiënten minstens 2 graden slechter scoorden na RT dan voor RT voor dermatitis, desquamatie en/of acute oedeem. Giotopoulos et al. vond een significante associatie tussen het optreden van acute toxiciteit en de ontwikkeling van fibrose. Deze studie werd echter op een kleine patiëntengroep uitgevoerd, waardoor de betrouwbaarheid afneemt (56). De studie van Lilla et al., waarbij een grotere cohorte bestudeerd werd, vond geen verband tussen het optreden van acute toxiciteit en de ontwikkeling van fibrose (36), dit werd bevestigd door de studie van Bentzen et al. (64) alsook door onze studie. Tabel XX geeft een overzicht weer.
42
Referentie
Tabel X: XOverzicht associaties acute toxiciteit - late toxiciteit #patiënten Scoreschaal Eindpunt Toxiciteit
p-waarde
Thesis
238
LENT-SOMA LENT-SOMA LENT-SOMA LENT-SOMA LENT-SOMA BCCT.core BCCT.core STAT
Fibrose d1 Fibrose d2 Pigmentatie d1 Pigmentatie d2 Oedeem Cosmesis d1 Cosmesis d2 Globale tox.
≥∆1 ≥∆2 ≥∆1 ≥∆2 ≥∆1 ≥∆1 ≥∆2 >75%
Lilla et al. (36)
478
RTOG/EORTC + LENT-SOMA RTOG/EORTC + LENT-SOMA
Teleangiëctasieën
≥2
0.011 0.007 <0.001 -
Fibrose
≥2
-
LENT-SOMA LENT-SOMA LENT-SOMA
Teleangiëctasieën Fibrose Atrofie
≥2 ≥2 ≥2
<0.001 0.02
Giotopoulos et al.(56) -
167
Geen associatie gevonden
Voor
leeftijd,
menopauzale
status,
borstvolume,
dosimetrische
hotspots,
boost,
axillabestraling en een adjuvante hormoontherapie kan besloten worden dat ze geassocieerd zijn met het risico op chronische toxiciteit na RT. Tussen het optreden van acute toxiciteit en chronische toxiteit lijkt eveneens een correlatie te bestaan. Een eenduidig besluit, met betrekking tot welke factoren significant geassocieerd zijn met toxiciteit na RT, kan moeilijk geformuleerd worden. Het grootste probleem is de discrepantie wat betreft de bestudeerde eindpunten in elke studie alsook een gebrek aan een gestandaardiseerde scoring van toxiciteit. 2
Validatie van SNPs
In een studie van Talbot et al. werd rs1800629 (TNFα) significant geassocieerd bevonden met een groter risico op algemene late radiotoxiciteit (40). Deze associatie werd gevalideerd in twee additionele cohorten, waardoor de studie bestond uit een totaal van 2036 vrouwen. In onze studie kon de associatie met rs1800629 niet bevestigd worden. De studiepopulatie bestond slechts uit 238 vrouwen, waaronder slechts één het homozygoot variante genotype vertoont. De verwachtte MAF was 21%, terwijl de MAF in onze studiepopulatie slechts 13.9% bedraagt, hetgeen mogelijks kan verklaren waarom voor rs1800629 bij ons geen associatie gevonden werd. XRCC1, een base excision repair (BER) gen, is betrokken bij het herstel van DNA enkelstrengbreuken gevormd door blootstelling aan ioniserende straling. De genetische variatie rs2682585 in dit gen, is volgens een studie van Seibold et al. significant geassocieerd met
een
lager
risico
pigmentatieveranderingen
op en
late
huidtoxiciteit
atrofie,
OR=0.77)
(waaronder en
globale
teleangiëctasieën, toxiciteit
(42). 43
Globale toxiciteit werd bepaald via een STAT score die huidtoxiciteit en fibrose includeerde. Deze associatie werd gevalideerd in vijf onafhankelijke cohorten. In dit thesisonderzoek werd getracht deze associatie nogmaals te bevestigen. Er werd echter een sterk significant verband gevonden tussen de aanwezigheid van een variant A allel bij rs2682585 en een hóger risico op een slecht cosmetisch eindresultaat na RT (OR=2.41). Na corrigeren voor multipele testing, door middel van een conservatieve Bonferroni correctie was dit verband nog steeds statistisch significant. De studiepopulatie van Seibold et al. bedroeg meer dan 2.000 patiënten, in tegenstelling tot onze populatie die slechts uit 238 patiënten bestond. Ook was de follow-up periode na RT dikwijls een stuk langer dan in onze studie mogelijk was, wat van groot belang is in het onderzoek naar chronische toxiciteit. Symptomen kunnen immers een erg lange latentieperiode vertonen. Ondanks deze verschillen blijven de sterk tegenstrijdige resultaten moeilijk te verklaren. In de GWAS studie van Barnett et al. werden meer dan 2.000.000 SNPs geanalyseerd teneinde associatie na te gaan met late toxiciteit na RT. De meest veelbelovende SNPs werden gerepliceerd in een onafhankelijke cohorte. Na deze replicatiefase bleken 19 SNPs mogelijks geassocieerd met globale late toxiciteit, uitgedrukt door een STAT score. Van deze SNPs werden rs2881208 (SATB2), rs882460 (CCDC129) en rs2840044 (nabij SLFN14) geselecteerd voor validatie in deze studie. Voor de SNP rs2840044, gelegen nabij SLFN14 kon in onze studie geen associatie met globale toxiciteit worden aangetoond. De SNP rsxxx daarentegen, dat bij toeval ontdekt werd vlakbij rs2840044, bleek in onze studie wel significant geassocieerd te zijn met fibrose; TT genotypes bevonden zich voornamelijk in de ∆2 categorie voor fibrose. Voor de SNP rs2881208 (SATB2) werd na univariate analyse geen associatie aangetoond. Na multivariate analyse werd wel een significante associatie gevonden tussen dragerschap van het variante A allel en globale toxiciteit volgens een STAT score, hetgeen consistent is met de resultaten van de GWAS van Barnett et al. De STAT score die in onze studie gebruikt werd includeerde echter andere eindpunten (fibrose, oedeem, pigmentatie, cosmesis) dan de STAT score gebruikt in de studie van Barnett et al. (pijn, teleangiëctasieën, krimpen van de borst). Associatie met de SNP rs882460 (CCDC129) kon in onze studiepopulatie niet gevalideerd worden.
44
Deze resultaten moeten met de nodige voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. Geen van de geselecteerde SNPs uit de GWAS werd eerder gerapporteerd met betrekking tot radiosensitiviteit. Bijgevolg kunnen deze resultaten niet vergeleken worden met de literatuur. De GWAS had bovendien onvoldoende power. Powerberekeningen wezen uit dat een studiepopulatie van minstens 3.000 patiënten vereist was om significantie te bereiken op genoom-wijd niveau, hetgeen hier niet het geval was. Een vergelijking van de resultaten van Barnett et al. en de resultaten gevonden in dit thesisonderzoek is niet eenvoudig. De onderzochte eindpunten zijn immers onvoldoende vergelijkbaar. Bovendien bestond de studiepopulatie in dit onderzoek slechts uit 238 patiënten.
45
Besluit Radiosensitiviteit wordt beschouwd als een complexe polygenetische aandoening, waarbij een groot aantal genen in verschillende pathways van belang kunnen zijn. Het identificeren van genetische polymorfismen die aan de basis liggen van de individuele respons op RT is bijgevolg complex. De SNP rs2682585 (XRCC1) bleek geassocieerd met de ontwikkeling van late toxiciteit. Dragers van het variante A allel hebben een hoger risico op een slecht cosmetisch eindresultaat na RT. Voor de SNP rsxxx (SLFN14) die tijdens dit onderzoek ontdekt werd, vertonen patiënten met het variante TT genotype een significant hoger risico op de ontwikkeling van fibrose. Tot slot is de aanwezigheid van een A allel ter hoogte van rs2881208 (SATB2) significant geassocieerd zijn met ernstigere globale toxiciteit na RT. Deze resultaten dienen echter met de nodige voorzichtigheid geïnterpreteerd te worden, gezien onze studiepopulatie eerder klein was en de beschouwde eindpunten dikwijls varieerden tussen de studies onderling. Replicatie van deze resultaten in een grotere onafhankelijke cohorte is aangewezen. Late nevenreacties na radiotherapie hebben dikwijls een lange latentieperiode, waardoor het voor dit soort studies aangewezen is om langere follow-up periodes te hanteren. Het opvolgen van gestandaardiseerde scoringssystemen is hierbij van het grootste belang.
46
Referenties 1. Waugh A GA. Ross and Wilson Anatomy and physiology in health and illness, 9th edn. Edinburgh Churchill livingstone 2001. 2. Belgian cancer registry. Kankerregister (2011). http://www.kankerregister.org. 3. Breast cancer. A.D.A.M. medical encyclopedia (2013). www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmedhealth/PMH0001911/. 4. Wren BG. The origin of breast cancer. Menopause. 2007;14(6):1060-8. 5. McPherson K, Steel CM, Dixon JM. ABC of breast disease: Breast cancer-epidemiology, risk factors, and genetics. British Medical Journal. 2000;321(7261):624-8. 6. Hanson H, Hodgson S. Cancer genetics and reproduction. Best practice & research Clinical obstetrics & gynaecology. 2010;24(1):3-18. 7. Thompson D, Easton D. The genetic epidemiology of breast cancer genes. Journal of mammary gland biology and neoplasia. 2004;9(3):221-36. 8. Shiovitz S, Korde LA. Genetics of breast cancer: a topic in evolution. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO. 2015. 9. Turnbull C, Rahman N. Genetic predisposition to breast cancer: past, present, and future. Annual review of genomics and human genetics. 2008;9:321-45. 10. De Abreu FB, Schwartz GN, Wells WA, Tsongalis GJ. Personalized therapy for breast cancer. Clinical genetics. 2014;86(1):62-7. 11. Benson JR, Weaver DL, Mittra I, Hayashi M. The TNM staging system and breast cancer. The Lancet Oncology. 2003;4(1):56-60. 12. Breast cancer treatment (2014). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmedhealth/PMH0032825/. 13. Vlaamse Liga tegen Kanker (2014). www.tegenkanker.be. 14. Fisher B, Anderson S, Bryant J, Margolese RG, Deutsch M, Fisher ER, et al. Twenty-year follow-up of a randomized trial comparing total mastectomy, lumpectomy, and lumpectomy plus irradiation for the treatment of invasive breast cancer. The New England journal of medicine. 2002;347(16):1233-41. 15. World cancer report (2008). http://www.iarc.fr/en/publications/pdfs-online/wcr/2008/wcr_2008.pdf. 16. Dayes I, Rumble RB, Bowen J, Dixon P, Warde P. Intensity-modulated radiotherapy in the treatment of breast cancer. Clinical oncology (Royal College of Radiologists (Great Britain)). 2012;24(7):488-98. 17. McDonald MW, Godette KD, Butker EK, Davis LW, Johnstone PAS. Long-Term Outcomes of IMRT for Breast Cancer: A Single-Institution Cohort Analysis. International Journal of Radiation Oncology*Biology*Physics. 2008;72(4):1031-40. 18. Veldeman L, Speleers B, Bakker M, Jacobs F, Coghe M, De Gersem W, et al. Preliminary Results on Setup Precision of Prone-Lateral Patient Positioning for Whole Breast Irradiation. International Journal of Radiation Oncology*Biology*Physics. 2010;78(1):111-8. 19. Sert F, Ozsaran Z, Esen E, Alanyali S, Sert I, Haydaoglu A, et al. Adverse effects of endocrine therapy in breast cancer: single institute experience. Contemporary oncology (Poznan, Poland). 2014;18(5):344-8. 20. Hind D, Ward S, De Nigris E, Simpson E, Carroll C, Wyld L. Hormonal therapies for early breast cancer: systematic review and economic evaluation. Health technology assessment (Winchester, England). 2007;11(26):iii-iv, ix-xi, 1-134. 21. Hubenak JR, Zhang Q, Branch CD, Kronowitz SJ. Mechanisms of injury to normal tissue after radiotherapy: a review. Plast Reconstr Surg. 2014;133(1):49e-56e. 22. Stone HB, Coleman CN, Anscher MS, McBride WH. Effects of radiation on normal tissue: consequences and mechanisms. The Lancet Oncology. 2003;4(9):529-36. 23. Al-Ghazal SK, Fallowfield L, Blamey RW. Does cosmetic outcome from treatment of primary breast cancer influence psychosocial morbidity? European journal of surgical oncology : the journal of the European Society of Surgical Oncology and the British Association of Surgical Oncology. 1999;25(6):571-3. 24. Barnett GC, West CM, Dunning AM, Elliott RM, Coles CE, Pharoah PD, et al. Normal tissue reactions to radiotherapy: towards tailoring treatment dose by genotype. Nat Rev Cancer. 2009;9(2):134-42. 25. Herskind C, Bamberg M, Rodemann HP. The role of cytokines in the development of normal-tissue reactions after radiotherapy. Strahlentherapie und Onkologie : Organ der Deutschen Rontgengesellschaft [et al]. 1998;174 Suppl 3:12-5. 26. Harper JL, Franklin LE, Jenrette JM, Aguero EG. Skin toxicity during breast irradiation: pathophysiology and management. Southern medical journal. 2004;97(10):989-93. 27. Medline Plus (2014). http://www.nlm.nih.gov/medlineplus. 28. Cox JD, Stetz J, Pajak TF. Toxicity criteria of the Radiation Therapy Oncology Group (RTOG) and the European organization for research and treatment of cancer (EORTC). International Journal of Radiation Oncology*Biology*Physics. 1995;31(5):1341-6.
47
29. Pavy JJ, Denekamp J, Letschert J, Littbrand B, Mornex F, Bernier J, et al. Late effects toxicity scoring: the SOMA scale. Radiotherapy and Oncology. 1995;35(1):11-5. 30. Common Terminology Criteria for Adverse Events (2009). http://evs.nci.nih.gov/ftp1/CTCAE/CTCAE_4.03_2010-06-14_QuickReference_5x7.pdf 31. Preuss J, Lester L, Saunders C. BCCT.core – Can a computer program be used for the assessment of aesthetic outcome after breast reconstructive surgery? The Breast. 2012;21(4):597-600. 32. Oliveira HP, Magalhaes A, Cardoso MJ, Cardoso JS. An accurate and interpretable model for BCCT.core. Conference proceedings : Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society IEEE Engineering in Medicine and Biology Society Annual Conference. 2010;2010:615861. 33. Fehlauer F, Tribius S, Alberti W, Rades D. Late effects and cosmetic results of conventional versus hypofractionated irradiation in breast-conserving therapy. Strahlentherapie und Onkologie : Organ der Deutschen Rontgengesellschaft [et al]. 2005;181(10):625-31. 34. Borger JH, Kemperman H, Smitt HS, Hart A, van Dongen J, Lebesque J, et al. Dose and volume effects on fibrosis after breast conservation therapy. International journal of radiation oncology, biology, physics. 1994;30(5):1073-81. 35. Bowden SJ, Fernando IN, Burton A. Delaying Radiotherapy for the Delivery of Adjuvant Chemotherapy in the Combined Modality Treatment of Early Breast Cancer: Is It Disadvantageous and Could Combined Treatment be the Answer? Clinical Oncology. 2006;18(3):247-56. 36. Lilla C, Ambrosone CB, Kropp S, Helmbold I, Schmezer P, von Fournier D, et al. Predictive factors for late normal tissue complications following radiotherapy for breast cancer. Breast Cancer Res Treat. 2007;106(1):143-50. 37. Andreassen CN, Alsner J, Overgaard J. Does variability in normal tissue reactions after radiotherapy have a genetic basis--where and how to look for it? Radiotherapy and oncology : journal of the European Society for Therapeutic Radiology and Oncology. 2002;64(2):131-40. 38. http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/genomicresearch/snp. 39. Sherry ST, Ward MH, Kholodov M, Baker J, Phan L, Smigielski EM, Sirotkin K. dbSNP: the NCBI database of genetic variation. Nucleic Acids Res. 2001 Jan 1;29(1):308-11. 40. Talbot CJ, Tanteles GA, Barnett GC, Burnet NG, Chang-Claude J, Coles CE, et al. A replicated association between polymorphisms near TNFalpha and risk for adverse reactions to radiotherapy. British journal of cancer. 2012;107(4):748-53. 41. Barnett GC, West CML, Coles CE, Pharoah PDP, Talbot CJ, Elliott RM, et al. Standardized Total Average Toxicity Score: A Scale- and Grade-Independent Measure of Late Radiotherapy Toxicity to Facilitate Pooling of Data From Different Studies. International Journal of Radiation Oncology*Biology*Physics. 2012;82(3):1065-74. 42. Seibold P BS, Schmezer P, Helmbold I, Barnett G, Coles C, Yarnold, J TC, Imai T, Azria D, Koch CA, Dunning AM, Burnet N, Bliss JM, Symonds RP, Rattay T, Suga, T KS, Bourgier C, Vallis KA, Sautter-Bihl ML, Claßen J, Debus J, Schnabel T, Rosenstein BS,, Wenz F WC, Popanda O, Chang-Claude J. XRCC1polymorphism associated with late toxicity after radiotherapy in breast cancer patients. International Journal of Radiation Oncology • Biology • Physics. 2015. 43. Barnett GC, Thompson D, Fachal L, Kerns S, Talbot C, Elliott RM, et al. A genome wide association study (GWAS) providing evidence of an association between common genetic variants and late radiotherapy toxicity. Radiotherapy and oncology : journal of the European Society for Therapeutic Radiology and Oncology. 2014;111(2):178-85. 44. Mornex F, Pavy JJ, Denekamp J, Bolla M. [Scoring system of late effects of radiations on normal tissues: the SOMA-LENT scale]. Cancer Radiother. 1997;1(6):622-68. 45. New England Biolabs (2015). international.neb.com/products/r0651-faui. 46. Kelemen G, Varga Z, Lazar G, Thurzo L, Kahan Z. Cosmetic outcome 1-5 years after breast conservative surgery, irradiation and systemic therapy. Pathology oncology research : POR. 2012;18(2):421-7. 47. Munshi A, Kakkar S, Bhutani R, Jalali R, Budrukkar A, Dinshaw KA. Factors influencing cosmetic outcome in breast conservation. Clinical oncology (Royal College of Radiologists (Great Britain)). 2009;21(4):285-93. 48. Azria D, Betz M, Bourgier C, Sozzi WJ, Ozsahin M. Identifying patients at risk for late radiationinduced toxicity. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 2012;84, Supplement 1(0):e35-e41. 49. Cardoso MJ, Cardoso J, Amaral N, Azevedo I, Barreau L, Bernardo M, et al. Turning subjective into objective: The BCCT.core software for evaluation of cosmetic results in breast cancer conservative treatment. The Breast. 2007;16(5):456-61. 50. Cardoso MJ, Cardoso J, Santos AC, Vrieling C, Christie D, Liljegren G, et al. Factors determining esthetic outcome after breast cancer conservative treatment. The breast journal. 2007;13(2):140-6.
48
51. Clarke D, Martinez A, Cox RS. Analysis of cosmetic results and complications in patients with stage i and ii breast cancer treated by biopsy and irradiation. International Journal of Radiation Oncology*Biology*Physics. 1983;9(12):1807-13. 52. McGhee DE, Steele JR. Breast volume and bra size. International Journal of Clothing Science and Technology. 2011;23(5):351-60. 53. Ciammella P, Podgornii A, Galeandro M, Micera R, Ramundo D, Palmieri T, et al. Toxicity and cosmetic outcome of hypofractionated whole-breast radiotherapy: predictive clinical and dosimetric factors. Radiation oncology (London, England). 2014;9:97. 54. Johansen J, Overgaard J, Overgaard M. Effect of adjuvant systemic treatment on cosmetic outcome and late normal-tissue reactions after breast conservation. Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 2007;46(4):525-33. 55. Chon BH, Loeffler JS. The effect of nonmalignant systemic disease on tolerance to radiation therapy. The oncologist. 2002;7(2):136-43. 56. Giotopoulos G, Symonds RP, Foweraker K, Griffin M, Peat I, Osman A, et al. The late radiotherapy normal tissue injury phenotypes of telangiectasia, fibrosis and atrophy in breast cancer patients have distinct genotype-dependent causes. British journal of cancer. 2007;96(6):1001-7. 57. Johansen J, Overgaard J, Rose C, Engelholm SA, Gadeberg CC, Kjaer M, et al. Cosmetic outcome and breast morbidity in breast-conserving treatment--results from the Danish DBCG-82TM national randomized trial in breast cancer. Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 2002;41(4):369-80. 58. Abner AL, Recht A, Vicini FA, Silver B, Hayes D, Come S, et al. Cosmetic results after surgery, chemotherapy, and radiation therapy for early breast cancer. International journal of radiation oncology, biology, physics. 1991;21(2):331-8. 59. Azria D, Gourgou S, Sozzi WJ, Zouhair A, Mirimanoff RO, Kramar A, et al. Concomitant use of tamoxifen with radiotherapy enhances subcutaneous breast fibrosis in hypersensitive patients. British journal of cancer. 2004;91(7):1251-60. 60. Vrieling C, Collette L, Fourquet A, Hoogenraad WJ, Horiot JC, Jager JJ, et al. The influence of the boost in breast-conserving therapy on cosmetic outcome in the EORTC "boost versus no boost" trial. EORTC Radiotherapy and Breast Cancer Cooperative Groups. European Organization for Research and Treatment of Cancer. International journal of radiation oncology, biology, physics. 1999;45(3):677-85. 61. Rajan SS, Sharma SC, Kumar N, Kumar R, Singh G, Singh R, et al. Clinical and cosmetic results of breast boost radiotherapy in early breast cancer: A randomized study between electron and photon. Journal of cancer research and therapeutics. 2014;10(4):889-95. 62. Buijsen J, Jager JJ, Bovendeerd J, Voncken R, Borger JH, Boersma LJ, et al. Prone breast irradiation for pendulous breasts. Radiotherapy and oncology : journal of the European Society for Therapeutic Radiology and Oncology. 2007;82(3):337-40. 63. Griem KL, Fetherston P, Kuznetsova M, Foster GS, Shott S, Chu J. Three-dimensional photon dosimetry: a comparison of treatment of the intact breast in the supine and prone position. International journal of radiation oncology, biology, physics. 2003;57(3):891-9. 64. Bentzen SM, Overgaard M. Relationship between early and late normal-tissue injury after postmastectomy radiotherapy. Radiotherapy and oncology : journal of the European Society for Therapeutic Radiology and Oncology. 1991;20(3):159-65.
49
Addendum Bijlage 1 De LENT-SOMA schaal 0 Nil
1 10%-25%
2 >25%-40%
3 >40%-75%
4 Whole breast
None
-
-
-
None
asymptomatic
symptomatic
Management of breast oedema Ulceration
No intervention
-
-
Secondary dysfunction Medical intervention
Sugical management -
None
Management of ulcer
No intervention
Epidermal ≤1 cm2 -
Dermal ≤1 cm2 Medical intervention
Telangiectasia
None
Post radiation fibrosis
None
Minimal (>1 per cm2) Barely palpable/increa sed density
Arm lymphoedema Management of arm lymphoedema
None
2-4cm increase
Moderate (14 per cm2) Definite increased density & firmness >4-6 increase
No oedema
-
Elastic stocking/ elevate arm
None
Transitory, slight
Permanent, marked
0 None
1 Mild pain, not interfering with function
None
Topical analgesics
2 Moderate pain; pain or analgesics interfering with function, but not interfering with ADL Oral, nonnarcotic analgesics
Retraction or atrophy Management of atrophy Breast oedema
Pigmentation change
Pain
Management of pain
Subcutaneous Surgical intervention / wound debridement Severe (>4 per cm2) Marked density, retraction & fixation > 6cm increase Intensive physiotherapy, compression, wrapping -
Surgical intervention/ mastectomy Necrosis/ exposed bone Surgical intervention/ mastectomy -
useless arm/ angiosarcoma surgical intervention/ amputation -
3 Severe pain; pain or analgesics severely interfering with ADL
4 Disabling
Oral, mild opioids
Oral, strong opioids
i
Bijlage 2
CCDC129 rs882460 T>C 23% PCR Primers: 562 & 563 PCR mix: Standard PCR conditions: Algemeen 66° PCR fragment size: 673 bp Digest Enzyme: MluI Incubation: 37°C for 3 hours Digest volume dH2O PCR product Buffer 3 MluI (2U)
30 µl 16,8 µl 10 µl 3 µl 0,2 µl
Expected digest product: TT: 673 TC: 673/421/252 CC: 421/252 Agarose gel picture:
ii
Bijlage 3
XRCC1 rs2682585 G>A 21% PCR-HRM Mix : AB Meldoctor reagentia :
Reagens dNTP mix buffer MgCl2 primer 531 primer 532 AmpliTaq Syto9 DNA H2O
PCR conditions :
Concentratie Hoeveelheid (µl) 10mM 0.4 10X 2 25 mM 1,2 5 µM 1.2 5 µM 1.2 5 U/µl 0,05 50µM 0.6 25 ng/µl 1 12.35 20 95°
10 min
95° 60°
15 sec 1 min
95° 60° 95° 60°
10 sec 1 min 15 sec 15 sec
40 cycli
PCR fragment size : 145 nt Pattern
iii
Bijlage 4
TNFα rs 1800629 G>A 21% PCR-HRM Mix : AB Meldoctor reagentia:
Reagent dNTP mix buffer MgCl2 Primer 435 Primer 436 AmpliTaq Syto 9 DNA H2O
PCR conditions :
Concentration 10mM 10X 25 mM 5 µM 5 µM 5 U/µl 20X 25 ng/µl -
95°
10 min
95° 60°
15 sec 1 min
95° 60° 95° 60°
10 sec 1 min 15 sec 15 sec
Amount (µl) 0.4 2 1,2 1.2 1.2 0,05 0.6 1 12.35 20
40 cycli
PCR fragment size : 109 bp Pattern
iv
Bijlage 5
SATB2 rs2881208 G>A 37 % PCR-HRM Mix : AB Meldoctor reagentia :
Reagens dNTP mix buffer MgCl2 primer 550 primer 551 AmpliTaq Syto9 DNA H2O
PCR conditions :
Concentratie Hoeveelheid (µl) 10mM 0.4 10X 2 25 mM 1,2 5 µM 1.2 5 µM 1.2 5 U/µl 0,05 50µM 0.6 25 ng/µl 1 12.35 20 95°
10 min
95° 62°
15 sec 1 min
95° 60° 95° 60°
10 sec 1 min 15 sec 15 sec
40 cycli
PCR fragment size : 197 nt Pattern
v
Bijlage 6
(Near) SLFN14 rs2881208 G>A 37 % rs xxx G>T 38% PCR-HRM Mix : AB Meldoctor reagentia :
Reagens dNTP mix buffer MgCl2 primer 554 primer 557 AmpliTaq Syto9 DNA H2O
PCR conditions :
Concentratie Hoeveelheid (µl) 10mM 0.4 10X 2 25 mM 1,2 5 µM 1.2 5 µM 1.2 5 U/µl 0,05 50µM 0.6 25 ng/µl 1 12.35 20 95°
10 min
95° 60°
15 sec 1 min
95° 60° 95° 60°
10 sec 1 min 15 sec 15 sec
40 cycli
PCR fragment size : 164 nt Pattern
vi
Bijlage 7 Resultaten genotypering Sample
BC001 BC004 BC007 BC009 BC010 BC011 BC012 BC013 BC017 BC018 BC019 BC020 BC023 BC027 BC030 BC031 BC032 BC034 BC035 BC036 BC037 BC039 BC040 BC041 BC043 BC045 BC046 BC047 BC048 BC050 BC051 BC053 BC055 BC057 BC058 BC059 BC060 BC061 BC062 BC064 BC065 BC067 BC069 BC071 BC075
TNFα rs1800629 G>A GG GG GG GA GG GG GG GG GA GG GG GG GG GG GA GG GA GA GG GG GG GA GA GG GG GG GG GG GG GG GG GG GG GA GA GG GG GG GG GG GA GG GA GG
XRCC1 rs2628585 G>A GG GG GG GG GG GG GG GG GA GA GA AA GG GG GG GG GA GA GG GG GG GG AA GG GG GA GG GA GA GA GG GG GA GG GG GA GG GG GG GG GG GG GG GA GA
SLFN14 rs2840044 A>G AG AG AA AA AA AG GG AA AG AG AG AG AG AG AG GG AG AA AG AG GG AA AG AG AG AA AG AG AG AA AG AA AA AG AG AG GG AG AA AG AG AG AA AG GG
SLFN14 rsxxx G>T GT GT TT TT TT GG GG TT GT GG GT GT GT GG GT GG GT TT GG GT GG GT GT GT GT GT GT GT GT TT GT TT TT GG GG GT GG GT TT GT GG GT GT GT GG
SATB2 rs2881208 G>A GA GG GA AA GA GA AA GA GA GG GA GA AA GA GA AA GG GA GA GA GG GA GA GA GA GA GG GG AA GA GG GG GA GG GA GA GG GG GG GG GA GA GA GA GG
CCDC129 rs882460 T>C TT TC TT TT TC TC TT TT TC TC TT TC TT TT TT TT TC TC TC TT TC TC TT TT TT TT TT TC TT TC TC TT TT TT TC TT TC TT TC TT TT TT TC TT TT
vii
Bijlage 7 (vervolg) Sample
BC076 BC077 BC079 BC082 BC083 BC084 BC086 BC090 BC091 BC092 BC094 BC096 BC097 BC098 BC100 BC101 BC102 BC103 BC104 BC111 BC112 BC114 BC115 BC119 BC125 BC126 BC127 BC128 BC131 BC133 BC134 BC135 BC136 BC142 BC145 BC146 BC147 BC148 BC149 BC151 BC152 BC153 BC154 BC155 BC157 BC158 BC159 BC160 BC164 BC169 BC170 BC171 BC172 BC173 BC174
TNFα rs1800629 G>A GG GG GG GA GG GG GG GA GG GG GG GG GA GG GG GG GG GG GA GA GA GG GG GA GG GA GG GG GG GG GA GG GG GG GG GA GA GG GG GG GG GA GA GG GA GG GG GA GA GG GA GG GA GG GG
XRCC1 rs2628585 G>A GG GG GG GG GA GA GG GG AA GA GA AA GG GA GA GG GA GA GG GA GG GA GG GG GG GA GA GG GG GA GG GG GG GA GG GG GG GG GA GG GG GG GA AA GG GG GA GG GA AA GG GG GG GG GG
SLFN14 rs2840044 A>G AA GG AA AA AA GG AG AA AG AG AG GG AG AG AG AG AA AA AG GG AG AG GG AG AG AA AG AG AG AA AG AG GG AA AG AA AG AA AA AG AA AA AA AG AG AG AA AG GG AA AG AA AG GG GG
SLFN14 rsxxx G>T TT GG TT GT GT GG GT TT GT GT GT GG GT GG GT GT GT GT GG GG GT GG GG GT GT GT GT GT GT TT GT GT GG TT GT GT GT TT TT GT GT TT TT GT TT GT TT GT GG GT GT GT GT GG GG
SATB2 rs2881208 G>A AA GA GA GG GG GG GG GA GG GA GA AA GA GA GA GG GA AA GG GA GA GA GA GA GA GG AA GG GA GG GG GA GA GA GG AA GA GA GA GA GA GG GG GA GG AA GG GA GA AA GA GG GG AA GG
CCDC129 rs882460 T>C TC TC TC CC TC TT TC TT TC TT TT TT TC CC TT TT TT TT TT TT TT TT TC TC TT TT TT TC TT TT CC TC TT TT TT TT TT TT TT TC TC TT CC TT TC TT TC TC TT TT TC TC TC TT TT
viii
Bijlage 7 (vervolg) Sample
BC176 BC177 BC179 BC182 BC183 BC184 BC187 BC188 BC190 BC192 BC195 BC196 BC197 BC198 BC200 BC201 BC203 BC204 BC206 BC207 BC208 BC210 BC211 BC212 BC213 BC214 BC216 BC217 BC218 BC219 BC220 BC222 BC227 BC228 BC229 BC232 BC233 BC234 BC235 BC239 BC241 BC243 BC244 BC245 BC247 BC248 BC249 BC250 BC251 BC252 BC253 BC254 BC256 BC258 BC261
TNFα rs1800629 G>A GG GG GA GA GG GA GG GG GG GG GG GA GG GG GG GG GG GA GG GG GG GG GG GG GA GG GG GG GG GG GG GG GG GG GA GG GA GA GA GA GG GG GG GG GG GG GG GA GA GG GG GG GA GG GG
XRCC1 rs2628585 G>A GA GG GG GG GG GG GA GG AA GA GG GG GG GG GG GA GA GA GG GG GA GG GG GG GG GG GG GG GA GG GA GG GG GG GG AA GG GG GG GG GG GG GA GA GG AA GG GG GA GG GA GG GG GA GG
SLFN14 rs2840044 A>G AG GG AG AG AG AA AG AG AA AA AG AA AG AA AA AA AA GG AA AG AA AG AG AG AG AA GG AG AA AG AA AG AG AG AG GG AA AG AG AG AG GG AA AA GG AG AG AA AA AA AA AG AA AA AG
SLFN14 rsxxx G>T GT GG GT GT GT GT GT GT TT TT GT TT GT TT GT TT GT GG TT GG TT GG GT GT GT TT GG GT GG GT TT GT GG GT GT GG TT GG GT GT GT GG GT GG GG GG GT GT GT TT TT GT TT GT GG
SATB2 rs2881208 G>A GA GG GA GA GA GG AA GG AA GG GA GA GG GA GG GG GG GG GG GG GG GG GA AA GA GG GG GA AA GA AA GG GA GA GA GG GG GA GA GA GG GA GG GG GA GA GA GG GA GG GG AA GG GG GA
CCDC129 rs882460 T>C TT TT TT TT TT TC TT TT TC TT TC TC TC TT TT TT TT TC TT CC TC TC TT TC TC TC CC TT TC TT TT TT TC TT TT TT TT CC TT TC TT TT TC TT TT TT TT TC TT CC TT CC TC TT TC
ix
Bijlage 7 (vervolg) Sample
BC262 BC263 BC264 BC266 BC267 BC268 BC269 BC270 BC271 BC272 BC273 BC274 BC275 BC276 BC280 BC281 BC282 BC283 BC284 BC287 BC288 BC289 BC291 BC292 BC294 BC297 BC299 BC300 BC302 BC304 BC305 BC307 BC308 BC310 BC311 BC313 BC314 BC316 BC317 BC318 BC319 BC321 BC322 BC323 BC324 BC325 BC326 BC328 BC331 BC333 BC336 BC340 BC342 BC343 BC344
TNFα rs1800629 G>A GG GA GG GG GG GG GG GG GG GG GG GG GG GG GG GA GG GG GG GG GG AA GG GG GG GA GG GG GA GG GG GG GG GG GA GA GG GA GG GA GA GG GG GG GG GG GA GA GA GG GG GA GG GG GA
XRCC1 rs2628585 G>A GA GA GA GG GG GA AA GG GG GG GA GA GA GA GA GA GG GG GA GG GG GA AA AA GG GG GG GA GG GG AA GG GG AA GA GA GA GA GA GG GG GG GG GG GA GG GA GA GG GG GG GG GG GA GG
SLFN14 rs2840044 A>G AG AA AA AG AA AG AG AA AA AG AG AG AG GG AG AG AG AA AG AA AG AG AA AG AG AG AA AG AG AG AG AG AG AA AA AA GG AG AG GG AG AG AG AG AG AA AG AG AG AG AG GG AG AG AA
SLFN14 rsxxx G>T GT GT GT GT GT GT GG GT TT GG GT GT GT GG GT GT GT TT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GG GT GG GG GG GT TT TT TT GG GT GT GG GT GG GT GT GT GG GG GT GT GT GG GG GT GT GT
SATB2 rs2881208 G>A GG GG GA GG GA GG GG GA GG GA GA AA AA GA GA GA GA GG GA GG GA GG GG GA AA GA GA GA GG GA AA AA GG GA GA GA AA AA GG GG GG GG GG GA GA GG GG GG GG GG GG GA GG GA GA
CCDC129 rs882460 T>C TT TT TC TC TT TT TC TT TT TT CC TC CC TT TT TC TT TT TC TC TT TT TC TT TT TC TT TT TC TC TC TT TC TT TT TT CC TC TT TT TT TC TT TC TT TT TT TC TT TT CC TT TT TC TT
x
Bijlage 7 (vervolg) Sample
BC345 BC346 BC348 BC349 BC350 BC352 BC353 BC356 BC362 BC363 BC364 BC365 BC367 BC369 BC371 BC373 BC375 BC379 BC380 BC381 BC383 BC385 BC386 BC387 BC388 BC394 BC395 BC396
TNFα rs1800629 G>A GG GA GA GA GG GG GG GG GA GG GG GA GG GG GG GG GG GA GG GG GG GG GG GG GG GA GG GG
XRCC1 rs2628585 G>A GG GG GG GG GA GG GA AA GG GA GA GG GA GG GA GG GA GA GG GA AA GG GG GG GG GG GG GA
SLFN14 rs2840044 A>G AG AG AG AG AG AA AG AA GG AA AA AA AA AA GG AA AA AA AA AA AG AA AG AA AA AG AG AG
SLFN14 rsxxx G>T GT GG GT GT GG TT GT TT GG TT GT GT GT GT GG GT GT TT GT TT GG TT GT TT TT GT GG GT
SATB2 rs2881208 G>A GG AA GG GG GA GG GA GA GA AA GG GA GG GA GA GG GA GA GG AA GA GA GG GG GG AA GG GG
CCDC129 rs882460 T>C TC TT TC TT TT TT TT TT TC TT TT TC TC TT CC TT TC TC TC TC TT TT TT TC TC TT TC TT
xi
Bijlage 8 Analyse van SNPs en fibrose
Gen rs code
Alle patiënten n=238
Geen toxiciteit (∆0) n=154
Toxiciteit (∆1 + ∆2) n=84
172 (72.6) 64 (27.0) 1 (0.4)
115 (66.9) 38 (59.4) 0 (0.0)
57 (33.1) 26 (40.6) 1 (100.0)
145 (60.9) 77 (32.4) 16 (6.7)
94 (64.8) 49 (63.6) 11 (68.8)
51 (35.2) 28 (36.4) 5 (31.2)
96 (40.3) 112 (47.1) 30 (12.6)
65 (67.7) 71 (63.4) 18 (60.0)
31 (32.3) 41 (36.6) 12 (40.0)
139 (58.4) 85 (35.7) 14 (5.9)
87 (62.6) 60 (70.6) 7 (50.0)
52 (37.4) 25 (29.4) 7 (50.0)
82 (34.5) 130 (54.6) 26 (10.9)
51 (62.2) 85 (65.4) 18 (69.2)
31 (37.8) 45 (34.3) 8 (30.8)
58 (24.4) 134 (56.3) 46 (19.3)
42 (72.4) 87 (64.9) 25 (54.3)
16 (23.6) 47 (35.1) 21 (45.7)
OR
p-waarde
OR*
p-waarde*
1.38 1.43 -
0.285 0.229 -
1.24 1.30 -
0.527 0.436 -
1.05 0.85 1.01 0.82
0.860 0.755 0.961 0.726
0.99 0.91 0.98 0.91
0.985 0.883 0.950 0.884
1.21 1.40 1.25 1.26
0.514 0.438 0.426 0.565
1.40 1.60 1.44 1.34
0.326 0.345 0.261 0.530
0.70 1.67 0.80 1.91
0.222 0.360 0.419 0.242
0.54 1.34 0.63 1.66
0.077 0.647 0.148 0.422
0.87 0.73 0.85 0.80
0.637 0.516 0.557 0.610
0.86 0.75 0.84 0.82
0.658 0.614 0.602 0.714
1.42 2.21 1.59 1.72
0.311 0.058 0.160 0.104
1.62 2.38 1.79 1.70
0.231 0.076 0.130 0.179
TNFα rs1800629 GG GA AA dominant recessief XRCC1 rs2682585 GG GA AA dominant recessief SATB2 rs2881208 GG GA AA dominant recessief CDCC129 rs882460 TT TC CC dominant recessief SLFN14 rs2840044 AA AG GG dominant recessief SLFN14 rsxxx GG GT TT dominant recessief
* Gecorrigeerd voor leeftijd, BMI, alcohol tijdens RT en type hormoontherapie.
xii
Bijlage 8 (vervolg) Analyse van SNPs en fibrose
Gen rs code
Alle patiënten n=238
Geen toxiciteit (∆0 + ∆1 ) n=216
Toxiciteit (∆2) n=22
172 (72.6) 64 (27.0) 1 (0.4)
159 (92.4) 56 (87.5) 0 (0.0)
13 (7.6) 8 (12.5) 1 (100.0)
145 (60.9) 77 (32.4) 16 (6.7)
134 (92.4) 66 (85.7) 16 (100.0)
11 (7.6) 11 (14.3) 0 (0.0)
96 (40.3) 112 (47.1) 30 (12.6)
86 (89.6) 103 (92.0) 27 (90.0)
10 (10.4) 9 (8.0) 3 (10.0)
139 (58.4) 85 (35.7) 14 (5.9)
127 (91.4) 77 (90.4) 12 (85.7)
12 (8.6) 8 (9.4) 2 (14.3)
82 (34.5) 130 (54.6) 26 (10.9)
72 (87.8) 121 (93.1) 23 (88.5)
10 (12.2) 9 (6.9) 3 (11.5)
58 (24.4) 134 (56.3) 46 (19.3)
55 (94.8) 123 (91.8) 38 (82.6)
3 (5.2) 11 (8.2) 8 (17.4)
OR
p-waarde
OR*
p-waarde*
1.75 1.97 -
0.241 0.142 -
1.45 1.64 -
0.438 0.291 -
2.03 1.63 -
0.117 0.274 -
1.85 1.51 -
0.183 0.369 -
0.55 0.96 0.49 1.11
0.553 0.948 0.608 0.878
0.75 0.85 0.77 0.98
0.552 0.814 0.569 0.979
1.10 1.76 1.19 1.70
0.834 0.490 0.700 0.507
1.11 1.54 1.18 1.48
0.832 0.603 0.725 0.628
0.54 0.94 0.60 1.33
0.196 0.929 0.258 0.670
0.50 0.90 0.56 1.33
0.160 0.886 0.214 0.673
1.64 3.86 2.16 2.68
0.461 0.057 0.228 0.039
1.71 4.35 2.30 2.94
0.433 0.042 0.200 0.029
TNFα rs1800629 GG GA AA dominant recessief XRCC1 rs2682585 GG GA AA dominant recessief SATB2 rs2881208 GG GA AA dominant recessief CDCC129 rs882460 TT TC CC dominant recessief SLFN14 rs2840044 AA AG GG dominant recessief SLFN14 rsxxx GG GT TT dominant recessief
* Gecorrigeerd voor tumorgrootte en boost
xiii
Bijlage 8 (vervolg) Analyse van SNPs en oedeem
Gen rs code
Alle patiënten n=238
Geen toxiciteit (∆0) n=198
Toxiciteit (∆1 + ∆2) n=40
172 (72.6) 64 (27.0) 1 (0.4)
145 (84.3) 51 (79.7) 1 (100.0)
27 (15.7) 13 (20.3) 0 (0.0)
145 (60.9) 77 (32.4) 16 (6.7)
120 (82.8) 63 (81.8) 15 (93.8)
25 (17.2) 14 (18.2) 1 (6.2)
96 (40.3) 112 (47.1) 30 (12.6)
79 (82.3) 91 (81.3) 28 (93.3)
17 (17.7) 21 (18.7) 2 (6.7)
139 (58.4) 85 (35.7) 14 (5.9)
118 (84.9) 68 (80.0) 12 (85.7)
21 (15.1) 17 (20.0) 2 (14.3)
82 (34.5) 130 (54.6) 26 (10.9)
69 (84.1) 108 (83.1) 21 (80.8)
13 (15.9) 22 (16.9) 5 (19.2)
58 (24.4) 134 (56.3) 46 (19.3)
49 (84.5) 112 (83.6) 37 (75.5)
9 (15.5) 22 (16.4) 9 (24.5)
OR
p-waarde
OR*
p-waarde*
1.37 1.34 -
0.402 0.431 -
1.40 1.40 -
0.487 0.487
1.07 0.32 0.92 0.31
0.861 0.281 0.823 0.267
0.74 0.24 0.65 0.27
0.563 0.291 0.402 0.329
1.07 0.33 0.90 0.32
0.553 0.948 0.608 0.878
1.94 1.18 -
0.214 0.748 -
1.41 0.94 1.34 0.82
0.345 0.935 0.407 0.795
1.44 0.48 1.23 0.43
0.468 0.534 0.664 0.470
1.08 1.26 1.11 1.20
0.838 0.688 0.776 0.726
2.04 3.84 2.19 2.24
0.213 0.119 0.163 0.273
1.07 1.32 1.13 1.26
0.876 0.589 0.763 0.578
0.66 0.44 0.60 0.59
0.470 0.283 0.357 0.415
TNFα rs1800629 GG GA AA dominant recessief XRCC1 rs2682585 GG GA AA dominant recessief SATB2 rs2881208 GG GA AA dominant recessief CDCC129 rs882460 TT TC CC dominant recessief SLFN14 rs2840044 AA AG GG dominant recessief SLFN14 rsxxx GG GT TT dominant recessief
* Gecorrigeerd voor leeftijd, BMI, cupsize, borstvolume, dosimetrische hotspots, menstruatie, hypertensie, alcohol, hormoontherapie, type hormoontherapie, axilla bestraling en acute toxiciteit
xiv
Bijlage 8 (vervolg) Analyse van SNPs en pigmentatie Gen rs code
Alle patiënten n=237
Geen toxiciteit (∆0) n=179
Toxiciteit (∆1 + ∆2) n=58
171 (72.6) 64 (27.0) 1 (0.4)
132 (77.2) 45 (70.3) 1 (100.0)
39 (22.8) 19 (29.7) 0 (0.0)
145 (61.2) 76 (32.1) 16 (6.7)
112 (77.2) 56 (73.7) 11 (68.8)
33 (22.8) 20 (26.3) 5 (31.2)
95 (40.1) 112 (47.3) 30 (12.6)
72 (75.8) 81 (72.3) 26 (86.7)
23 (24.2) 31 (27.7) 4 (13.3)
138 (58.2) 85 (35.9) 14 (5.9)
105 (76.1) 63 (74.1) 11 (78.6)
33 (23.9) 22 (25.9) 3 (21.4)
82 (34.6) 129 (54.4) 26 (11.0)
58 (70.7) 100 (77.5) 21 (80.8)
24 (29.3) 29 (22.5) 5 (19.2)
58 (24.5) 133 (56.1) 46 (19.4)
44 (75.9) 101 (75.9) 34 (73.9)
14 (24.1) 32 (24.1) 12 (26.1)
OR
p-waarde
OR*
p-waarde*
1.43 1.40 -
0.277 0.307 -
1.53 1.52 -
0.309 0.316 -
1.21 1.54 1.27 1.44
0.557 0.451 0.441 0.516
0.97 3.48 1.23 3.51
0.950 0.116 0.608 0.107
1.20 0.48 1.02 0.44
0.571 0.214 0.939 0.138
2.67 0.70 2.02 0.41
0.036 0.635 0.111 0.200
1.11 0.87 1.08 0.83
0.740 0.835 0.813 0.785
0.23 1.02 0.87 0.23
0.210 0.964 0.735 0.203
0.70 0.50 0.68 0.71
0.269 0.318 0.213 0.512
0.90 1057 0.97 1.69
0.803 0.522 0.939 0.409
1.00 1.11 1.02 1.11
0.991 0.820 0.946 0.777
0.68 0.31 0.57 0.40
0.408 0.077 0.207 0.117
TNFα rs1800629 GG GA AA dominant recessief XRCC1 rs2682585 GG GA AA dominant recessief SATB2 rs2881208 GG GA AA dominant recessief CDCC129 rs882460 TT TC CC dominant recessief SLFN14 rs2840044 AA AG GG dominant recessief SLFN14 rsxxx GG GT TT dominant recessief
* Gecorrigeerd voor leeftijd, BMI, borstvolume, dosimetrische hotspots, menstruatie, hormoontherapie, type hormoontherapie, axilla bestraling, acute toxiciteit
xv
Bijlage 8 (vervolg) Analyse van SNPs en pigmentatie
Gen rs code
Alle patiënten n=237
Geen toxiciteit (∆0 + ∆1) n=228
Toxiciteit (∆2) n=9
171 (72.6) 64 (27.0) 1 (0.4)
164 (95.9) 62 (96.9) 1 (100.0)
7 (4.1) 2 (3.1) 0 (0.0)
145 (61.2) 76 (32.1) 16 (6.7)
142 (97.9) 71 (93.4) 15 (93.8)
3 (2.1) 5 (6.6) 1 (6.2)
95 (40.1) 112 (47.3) 30 (12.6)
93 (97.9) 105 (93.8) 30 (100.0)
2 (2.1) 7 (6.2) 0 (0.0)
138 (58.2) 85 (35.9) 14 (5.9)
132 (95.7) 82 (96.5) 14 (100.0)
6 (4.3) 3 (3.5) 0 (0.0)
82 (34.6) 129 (54.4) 26 (11.0)
80 (97.6) 124 (96.1) 24 (92.3)
2 (2.4) 5 (3.9) 2 (7.7)
58 (24.5) 133 (56.1) 46 (19.4)
54 (93.1) 128 (96.2) 46 (100.0)
4 (6.9) 5 (3.8) 0 (0.0)
OR
p-waarde
OR*
p-waarde*
0.76 0.74 -
0.731 0.717 -
0.63 0.63 -
0.592 0.590 -
3.33 3.16 3.30 1.78
0.106 0.333 0.097 0.600
3.83 3.87 3.84 2.33
0.134 0.320 0.111 0.508
3.10 2.41 -
0.165 0.279 -
4.96 2.90 -
0.101 0.242 -
0.805 0.69 -
0.763 0.603 -
0.71 0.66 -
0.683 0.609 -
1.61 3.33 1.89 2.43
0.573 0.241 0.433 0.285
1.24 4.06 1.56 3.48
0.814 0.223 0.614 0.183
0.53 0.39 -
0.354 0.169 -
0.31 0.24 -
0.161 0.079 -
TNFα rs1800629 GG GA AA dominant recessief XRCC1 rs2682585 GG GA AA dominant recessief SATB2 rs2881208 GG GA AA dominant recessief CDCC129 rs882460 TT TC CC dominant recessief SLFN14 rs2840044 AA AG GG dominant recessief SLFN14 rsxxx GG GT TT dominant recessief
* Gecorrigeerd voor leeftijd, BMI, borstvolume en dosimetrische hotspots
xvi
Bijlage 8 (vervolg) Analyse van SNPs en cosmesis
Gen rs code
Alle patiënten n=201
Geen toxiciteit (∆0) n=125
Toxiciteit (∆1 + ∆2) n=76
144 (72.0) 55 (27.5) 1 (0.5)
91 (63.2) 33 (60.0) 1 (100.0)
53 (36.8) 22 (40.0) 0 (0.0)
124 (61.7) 63 (31.3) 14 (7.0)
87 (70.0) 31 (49.2) 7 (50.0)
37 (29.8) 32 (50.8) 7 (50.0)
79 (39.3) 98 (48.8) 24 (11.9)
50 (63.3) 59 (60.2) 16 (66.7)
29 (36.7) 39 (39.8) 8 (33.3)
119 (59.2) 69 (34.3) 13 (6.5)
73 (61.3) 42 (60.9) 10 (76.9)
46 (38.7) 27 (39.1) 3 (23.1)
60 (29.9) 118 (58.7) 23 (11.4)
36 (60.0) 76 (64.4) 13 (56.5)
24 (40.0) 42 (35.6) 10 (43.5)
49 (24.4) 118 (58.7) 34 (16.9)
31 (63.3) 72 (61.0) 22 (64.7)
18 (36.7) 46 (39.0) 12 (35.3)
OR
p-waarde
OR*
p-waarde*
1.15 1.11 -
0.678 0.745 -
1.06 1.03 -
0.863 0.944 -
2.43 2.35 2.41 1.71
0.006 0.133 0.003 0.334
2.07 4.38 2.34 3.46
0.036 0.027 0.009 0.059
1.14 0.86 1.08 0.80
0.675 0.763 0.795 0.630
1.77 1.01 1.58 0.73
0.105 0.989 0.174 0.517
1.02 0.48 0.916 0.47
0.949 0.278 0.766 0.267
0.82 0.24 0.77 0.25
0.801 0.087 0.427 0.090
0.83 1.15 0.88 1.31
0.565 0.773 0.676 0.552
0.82 1.36 0.89 1.56
0.576 0.568 0.739 0.361
1.1 0.94 1.06 0.88
0.786 0.893 0.858 0.740
1.00 0.96 0.99 0.96
0.997 0.931 0.980 0.919
TNFα rs1800629 GG GA AA dominant recessief XRCC1 rs2682585 GG GA AA dominant recessief SATB2 rs2881208 GG GA AA dominant recessief CDCC129 rs882460 TT TC CC dominant recessief SLFN14 rs2840044 AA AG GG dominant recessief SLFN14 rsxxx GG GT TT dominant recessief
* Gecorrigeerd voor BMI, borstvolume, dosimetrische hotspots en hormoontherapie
xvii
Bijlage 8 (vervolg) Analyse van SNPs en cosmesis
Gen rs code
Alle patiënten n=201
Geen toxiciteit (∆0 + ∆1) n=191
Toxiciteit (∆2) n=10
144 (72.0) 55 (27.5) 1 (0.5)
136 (94.4) 53 (96.4) 1 (100.0)
8 (5.6) 2 (3.6) 0 (0.0)
124 (61.7) 63 (31.3) 14 (7.0)
119 (96.0) 60 (95.2) 12 (85.7)
5 (4.0) 3 (4.8) 2 (14.3)
79 (39.3) 98 (48.8) 24 (11.9)
75 (94.9) 94 (95.9) 22 (91.7)
4 (5.1) 4 (4.1) 2 (8.3)
119 (59.2) 69 (34.3) 13 (6.5)
115 (96.6) 64 (92.8) 12 (92.3)
4 (3.4) 5 (7.2) 1 (7.7)
60 (29.9) 118 (58.7) 23 (11.4)
57 (95.0) 113 (95.8) 21 (91.3)
3 (5.0) 5 (4.2) 2 (8.7)
49 (24.4) 118 (58.7) 34 (16.9)
46 (93.9) 112 (94.9) 33 (97.1)
3 (6.1) 6 (5.1) 1 (2.9)
OR
p-waarde
OR*
p-waarde*
0.64 0.63 -
0.582 0.566 -
0.62 0.62 -
0.599 0.596 -
1.19 3.97 1.65 3.73
0.816 0.121 0.439 0.116
0.67 8.39 1.23 9.37
0.658 0.078 0.784 0.059
0.80 1.71 0.97 1.92
0.755 0.553 0.963 0.428
0.67 0.87 0.71 1.11
0.614 0.894 0.654 0.913
2.25 2.40 2.27 1.66
0.240 0.451 0.216 0.645
2.11 6.66 2.43 4.67
0.343 0.166 0.239 0.231
0.84 1.81 0.99 2.02
0.817 0.532 0.992 0.392
0.55 1.90 0.71 2.82
0.463 0.547 0.652 0.269
1.1 0.94 1.06 0.88
0.786 0.893 0.858 0.740
0.51 0.38 0.48 0.60
0.411 0.452 0.361 0.666
TNFα rs1800629 GG GA AA dominant recessief XRCC1 rs2682585 GG GA AA dominant recessief SATB2 rs2881208 GG GA AA dominant recessief CDCC129 rs882460 TT TC CC dominant recessief SLFN14 rs2840044 AA AG GG dominant recessief SLFN14 rsxxx GG GT TT dominant recessief
* Gecorrigeerd voor leeftijd, BMI, borstvolume en dosimetrische hotspots
xviii
Bijlage 8 (vervolg) Analyse van SNPs en globale toxiciteit (STAT)
Gen rs code
Alle patiënten n=238
Geen toxiciteit (<75e percentiel) n=174
Toxiciteit (>75e percentiel) n=64
172 (72.6) 64 (27.0) 1 (0.4)
128 (74.4) 44 (68.8) 1 (100.0)
44 (25.6) 20 (31.2) 0 (0.0)
145 (60.9) 77 (32.4) 16 (6.7)
108 (74.5) 54 (70.1) 12 (75.0)
37 (25.5) 23 (29.9) 4 (25.0)
96 (40.3) 112 (47.1) 30 (12.6)
71 (74.0) 78 (69.6) 25 (83.3)
25 (26.0) 34 (30.4) 5 (16.7)
139 (58.4) 85 (35.7) 14 (5.9)
105 (75.5) 59 (69.4) 10 (71.4)
34 (24.5) 26 (30.6) 4 (28.6)
82 (34.5) 130 (54.6) 26 (10.9)
57 (69.5) 97 (74.6) 20 (76.9)
25 (30.5) 33 (25.4) 6 (23.1)
58 (24.4) 134 (56.3) 46 (19.3)
45 (77.6) 99 (73.9) 30 (65.2)
13 (22.4) 35 (26.1) 16 (34.8)
OR
pwaarde
OR*
pwaarde*
1.32 1.29 -
0.385 0.423 -
1.33 1.29 -
0.503 0.540 -
1.24 0.97 1.19 0.90
0.487 0.964 0.551 0.860
0.76 1.12 0.80 1.23
0.527 0.895 0.601 0.812
1.24 0.57 1.08 0.51
0.492 0.297 0.808 0.183
3.55 0.51 2.42 0.26
0.009 0.415 0.050 0.073
1.36 1.24 1.34 1.09
0.316 0.735 0.317 0.884
1.22 0.85 1.16 0.79
0.639 0.848 0.721 0.780
0.78 0.68 0.76 0.80
0.417 0.468 0.365 0.643
1.08 1.81 1.17 1.72
0.870 0.386 0.717 0.374
1.22 1.85 1.37 1.60
0.586 0.165 0.378 0.181
0.90 0.76 0.86 0.81
0.818 0.656 0.735 0.703
TNFα rs1800629 GG GA AA dominant recessief XRCC1 rs2682585 GG GA AA dominant recessief SATB2 rs2881208 GG GA AA dominant recessief CDCC129 rs882460 TT TC CC dominant recessief SLFN14 rs2840044 AA AG GG dominant recessief SLFN14 rsxxx GG GT TT dominant recessief
* Gecorrigeerd voor leeftijd, BMI, borstvolume, dosimetrische hotspots, menstruatie, hormoontherapie, type hormoontherapie, axilla bestraling, boost en acute toxiciteit.
xix
xx
