Praktikum č. 1: Zásady správné laboratorní praxe v mikrobiologické laboratoři (bezpečnost práce v infekčním prostředí, kategorizace mikroorganismů z hlediska rizik, členění mikrobiologické laboratoře a její vybavení, metody sterilizace a dezinfekce).
Cíle: 1. Seznámit se s hlavními zásadami bezpečnosti práce v mikrobiologické laboratoři (ML). 2. Seznámit se s přístroji a zařízením mikrobiologické laboratoře, s požadavky na práci s různými skupinami mikroorganismů. 3. Osvojit si základní termíny a seznámit se s prostředky k zabezpečení desinfekce a sterilizace. 4. Poznat a naučit se používat základní pomůcky potřebné pro práci v ML.
Zásady bezpečnosti práce ve cvičebnách Ústav mikrobiologie a imunologie s příslušnými laboratořemi a cvičebnami patří k rizikovým pracovištím, kde hrozí nebezpečí profesionálních infekcí. Při práci ve cvičebně, která je zároveň i laboratoří, je nutno přísně dodržovat pracovní postupy a řídit se pokyny vyučujících, nebo ostatních pracovníků. Přísně je zakázána nedovolená manipulace s kohoutky plynu a vody a elektrickou instalací. Ze cvičeben je zakázáno odnášet infekční materiál, pomůcky nebo pláště. Při práci ve cvičebně jsou studenti povinni úzkostlivě dodržovat zásady osobní hygieny. Ve cvičebnách je přísně zakázáno jíst, pít a kouřit. Během práce je nutno vyvarovat se mnutí očí, nosu, škrábání se ve vlasech, okusování nehtů, dále je nutné dodržovat čistotu, klid a pořádek. V infekčním prostředí nemají místo zbrklost, nepořádek a zbytečné úkony. Studenti si dezinfikují a myjí ruce vždy po potřísnění biologickým materiálem a před opuštěním cvičebny. Práce v infekčním prostředí, včetně cvičeben, je zakázána ženám gravidním a v dalším období 9 měsíců po porodu. Bezpečnost práce v klinické laboratoři Standardní metody izolace a kultivace bakterií nejsou zárukou bezpečnosti pro příslušné pracovníky. Klinické vzorky a kultury bakterií, s možným obsahem patogenů, jsou potencionálním nebezpečím pro zdraví člověka. Stupeň rizika závisí na povaze mikroorganismu, způsobech jeho uchovávání (kultivace na miskách, v bujónu, skladování atd.) a typu manipulace (pipetování, odstřeďování, atd.). Z hlediska šíření patogenů v laboratorním prostředí je nejnebezpečnější aerosol, vzniklý při manipulaci s kulturami a vzorky. Obecná bezpečnostní opatření při práci v klinické laboratoři •
Musí se zajistit, aby pracovní prostor byl čistý a bez průvanu.
•
Povrch pracovního stolu musí být ošetřován vhodným desinfekčním prostředkem před započetím práce a po jejím skončení.
•
Zkumavky a jiné laboratorní nádoby se musí otevírat v blízkosti plamene, a to při maximálně možném příkonu.
•
Je třeba pracovat rychle a bez zbytečných pohybů.
•
Kovové kličky, jehly apod. se sterilizují žíháním v plameni, a to před použitím a po něm. Mokré kličky se musí před žíháním nejprve nad plamenem vysušit, aby se předešlo rozstřikování materiálu.
5
•
Použité pipety, skleněné tyčinky apod. se před mytím a sterilizací umisťují do zvláštních nádob s desinfekčním prostředkem (např. s roztokem chlornanu sodného).
•
Používané Petriho misky, kultivační půdy a veškerý jiný materiál, který může obsahovat mikroorganismy, se umisťuje do zvláštních kontejnerů.
•
Výrobky z plastu, které nejsou určeny k opakovanému používání, se umístí do plastových pytlů (kontejnerů), s nimiž se sterilizují nebo spálí.
•
Dojde-li k potřísnění pracovní plochy kontaminovanou živnou půdou nebo kontaminovaným vzorkem, musí se takové potřísnění ihned odstranit vatovým tampónem smočeným v 70 % (V/V) etanolu nebo jiném desinfekčním prostředku a teprve potom lze v práci pokračovat.
•
Vzorky tkání musí být uchovávány a zpracovávány takovým způsobem, aby se vyloučila kontaminace pracovních stolů. Po zpracování musí být bezpečně likvidovány.
•
Kontaminované tampóny, papírové zátky, buničitá vata, bavlna a podobné materiály je třeba oddělit od ostatních odpadků a spálit.
•
Používání pipet představuje značné riziko i při dodržování všech zásad bezpečnosti práce. Vyplnění horního konce pipety sterilní vatou nechrání vždy pracovníka před rizikem infekce, proto je zapotřebí používat gumové balónky nebo pipetovací zařízení s filtry. Dalším vysokým rizikem je kapání tekutin z pipety, při kterém se tvoří aerosol.
•
Používání chirurgických rukavic snižuje riziko kontaminace pracovníka na minimum. Postup při nehodách
Sebemenší poranění je třeba hlásit vyučujícímu, stejně jako každou nehodu, při které dojde ke kontaminaci biologickým materiálem. Při vniknutí infekčního materiálu do organismu, je třeba poskytnout první pomoc.
SKUPINY MIKROORGANISMŮ PODLE NEBEZPEČNOSTI •
1. skupina. Mikroorganismy u nichž je většinou nepravděpodobné, že vyvolají onemocnění člověka /komenzálové člověka a zvířat nebo mikroorganismy, které se u savců nevyskytují /.
•
2. skupina. Mikroorganismy, které mohou vyvolat onemocnění člověka a mohou být nebezpečné pro laboratorní pracovníky. Je nepravděpodobné, že by se taková infekce šířila. Infekce získané v laboratoři jsou výjimečné a je proti nim dostupná efektivní profylaxe nebo léčba. Př.: Campylobacter spp., Clostridium botulinum /tetanii/, Corynebacterium diphteriae, Staphylococcus aureus, Yersinia enterocolitica, Herpes simplex, Influenza, virus Epstein-Baarové /infekční mononukleóza/ a další.
•
3. skupina. Původci těžkých infekcí člověka, u kterých hrozí i infekce laboratorních pracovníků. Je zde riziko šíření, ale existuje proti těmto infekcím efektivní profylaxe nebo terapie. Př.: Bacillus anthracis, Brucella spp., Salmonella Typhi, Yersinia pestis, cytotoxické kmeny E. coli, Rickettsia spp., Chlamyda psittaci, virus infekční hepatitidy typ B, virus encephalitídy koní, virus klíšťové encefalitídy.
•
4. slupina. Původci těžkých infekcí člověka, u kterých hrozí infekce laboratorních pracovníků. Existuje riziko šíření a není dostupná vhodná profylaxe a terapie. Př.: Virové infekce - Ebola, Machupo, Amapari, virus Junin (Argentinská nemoc), virus horečky Lasa, Variola, Marburská horečka, Krymskokonžská hemoragická horečka.
6
Poznámka: Rozdělení mikroorganismů je možno nalézt v Nařízení vlády č. 178/2001 Sb. A novele Nařízení vlády č. 441/2004 Sb., kterým se stanoví podmínky ochrany zdraví zaměstnanců při práci, vydané na základě předpisů Evropské unie.
Požadavky pro práci s 1. skupinou mikroorganismů • • • • • • • •
Personál musí být poučen o postupech používaných v laboratoři. Laboratoř se musí snadno čistit. Dveře musí být při práci zavřeny. Laboratoř musí být vybavena umyvadlem na mytí rukou. V laboratoři se nosí pracovní pláště, které se zde při odchodu odkládají. Je zakázáno v laboratoři jíst, pít, kouřit, žvýkat, uchovávat potraviny nebo používat pleťovou kosmetiku. Nepipetuje se ústy. nehodách a závadách se vede evidence. Požadavky pro práci s 2. skupinou mikroorganismů
jako u skupiny 1. s těmito výjimkami: • • • • • • • • •
Přístup omezený jen pro personál laboratoře. Umyvadlo s bezdotykovým spouštěním vody. Ruce se po práci myjí nebo desinfikují. Autokláv musí být ve stejné budově jako laboratoř. Laboratorní plášť musí být při práci zapnutý a je uložen odděleně od civilního oděvu. Pracuje se na otevřeném stole s výjimkou postupů, při kterých dochází k tvorbě aerosolu. Musí být dostupné desinfekční prostředky pro případ rozlití infekčního materiálu. Stoly se po práci desinfikují. Všechny odpady musí být před likvidací dekontaminovány. Požadavky pro práci s 3. skupinou mikroorganismů jako pro druhou skupinu s těmito výjimkami:
• • • • • • • •
Do laboratoře má přístup pouze personál zacvičený, který je oprávněn /autorizován/ k dané činnosti. Laboratoř je v době mimo provoz uzamčena. Ve vybavení laboratoře musí být autokláv. Laboratorní pláště se před praním autoklávují. Laboratoř musí být pod negativním tlakem a vypouštěný vzduch je filtrován. Při práci se používají rukavice. Laboratoř používá jen vlastní vybavení. Laboratoř je možno desinfikovat formalínovými parami.
Požadavky pro práci s 4. skupinou mikroorganismů jako pro třetí skupinu s následujícími výjimkami: • • • •
Velmi omezený přístup přes hygienickou smyčku /sprcha + výměna celého oděvu/. Materiál přichází a odchází přes prokládací autokláv, který je ve vybavení laboratoře. Je instalováno zařízení, které monitoruje stav a hlásí poruchy negativního tlaku. Pracuje se v boxech III. třídy.
7
MIKROBIOLOGICK Á L ABOR ATOŘ, JEJÍ ČLENĚNÍ A Z AŘÍZENÍ Celkový prostor musí být natolik dostatečný, aby to umožnilo udržovat prostory v čistotě a pořádku (počítáme přibližně 20 m2 pracovní plochy na 1 pracovníka). Zvláštní místnosti musí být zajištěny pro mytí skla a ostatních pomůcek, sterilizaci použitého laboratorního skla a kultivačních půd s bakteriálními kulturami, přípravu a sterilizaci médií, pro kontrolu sterility (lze nahradit laminárním boxem), pro přípravu vzorků (pokud tyto mohou být rizikem kontaminace, např. sypké potraviny, krmiva). Při zařizování laboratoře je třeba dodržet opatření, která směřují k zábraně rizika kontaminace prachem (skříně vestavěné do výše stropu, desková topná tělesa, okenní lišty, svítidla). Chladničky a odstředivky se umístňují na chodbách. Hladký a omyvatelný povrch stěn a podlah. Pracovní prostředí chráníme před přímým slunečním světlem (žaluzie mezi okenními skly). Přístroje a zařízení: inkubátory (skříňové, komorové), autoklávy, horkovzdušné sterilizátory, plynové kahany, odstředivky, chladničky, mrazící boxy, UV lampy, zařízení pro přípravu destilované a deionizované vody. Kultivační boxy - jsou laboratorní zařízení, která poskytují pracovní prostor v němž je zabezpečena ochrana laboratorního pracovníka proti infekci aerosolem a současně umožňují ochranu materiálu před nežádoucí kontaminací. Rozeznáváme 3 třídy boxů (obr. č. 1): I. nesterilní vzduch laboratoře prochází boxem kolem infekčního materiálu a sterilizuje se jen vypouštěný vzduch II. sterilizuje se vzduch do boxu vpouštěný i z boxu vypouštěný (laminární "flow" box) III. uzavřený box s manipulačními rukavicemi, kde je vzduch sterilizován při vstupu i výstupu. Sterilizace vzduchu je zabezpečena UV zářením nebo častěji filtrací přes HEPA (highefficiency particle arresters) filtry, které zadržují částice větší než 0,3 µm. Kultivační boxy třídy I. a II. musí poskytovat ochranný faktor 10 5. To znamená, že ze 100 000 částic (např. spór), které se uvolní v pracovním prostoru, se pouze 1 částice může dostat přes pracovní otvor. Obr. č. 1: Typy kultivačních boxů
8
FYZI K ÁLNÍ PROSTŘEDKY DESI NFEKCE A STERILIZ ACE Základní pojmy: Desinfekce - je souborem opatření, která slouží k likvidaci patogenních mikroorganismů. Je součástí pracovních postupů a preventivních opatření proti možnosti přenosu infekce. K dezinfekci se používají převážně chemické prostředky (viz tab. č. 1). S desinfekcí úzce souvisí sanitace, což jsou postupy které obvykle zabezpečují čištění a částečnou desinfekci. Sterilizace - je souborem opatření, která slouží k zneškodnění (devitalizaci) všech mikroorganismů (patogenních i nepatogenních – viry, baktérie, kvasinky, plísně a jejich spóry). Antisepse – brání infekci (sepsi) použitím chemických látek (antiseptik), které nejsou tak toxické jako desinfekční prostředky a lze je aplikovat na tkáně člověka a zvířat. Baktericidní, fungicidní, algicidní, virocidní - tyto termíny vyjadřují devitalizační účinek desinfekční látky nebo antiseptika na specifickou skupinu mikroorganismů. Termíny bakteriostatický, fungistatický vyjadřují účinek jehož výsledkem je zastavení množení.
TEPLO Nesporulující bakterie jsou obvykle devitalizovány teplotami v rozmezí 50-60o C. Značně odolné k účinku tepla jsou bakteriální spóry. a) účinek suchého tepla - vegetativní buňky jsou inaktivovány při 100o C během 1 hodiny, spóry při 140oC za 3 hodiny. Příklad využití: horkovzdušné sterilizátory, sterilizace bakteriologické kličky plamenem. b) účinek vlhkého tepla (obecně efektivnější než sterilizace suchým teplem) •
teplot y pod 100 o C - Pasteur použil ke sterilizaci teploty 60oC po dobu 30 min.
•
var př i 100 o C - sterilizace nástrojů (inaktivuje pouze vegetativní formy)
•
teplot y nad 100 o C - využití při autoklávování - sterilizace účinkem přehřáté páry (115138o C) v uzavřeném prostoru (obr. č. 2).
Kontrola funkce autoklávu: fyzikální, chemická (barevné indikátory), biologická (Bacillus stearotermophilus. B.subtilis). Bakteriologické půdy autoklávujeme při 121oC (245 kPa) po dobu 15 minut. Tab. č. 1: Přibližné expozice vlhkého tepla nutné k devitalizaci Mikroorganismus Kvasinky Plísně Bakterie Viry
Vegetativní buňky
Spóry
5 minut při 50-60oC
5 minut při 70-80 oC
30 minut při 62oC
30 minut při 80 oC
10 minut při 60-70oC
0,5-12 minut při 121 oC
30 minut při 60oC
9
Obrázek č. 2: Schéma horizontálního autoklávu
ZÁŘENÍ a) ionizující záření (sterilizace pomůcek z plastů, obvazového materiálu) b) ultrafialové záření (UV) - 328-210 nm Zařízení: rtuťové výbojky (95% 253,7 nm) Užití: zabezpečení aseptického prostředí laboratoří, operačních sálů apod. Poznámka: výbojky mají časově omezenou účinnost, proto je nutné dokumentovat jejich provozní hodiny nebo kontrolovat jejich účinnost
FILTRACE Filtrace slouží ke sterilizaci tekutin a plynů (vzduch). Druhy filtrů: azbestové (Seitzův), ze sintrového skla, membránové (polymery - celulóza, polyester) Bakteriologické filtry mají průměr pórů 0,015 - 12 µm. K filtraci vody pro bakteriologické vyšetření se např. užívají membránové filtry s póry o průměru 0,45 µm. K filtraci vzduchu v kultivačních boxech slouží HEPA (high-efficiency particle arresters) filtry, které zadržují částice větší než 0,3 µm.
10
Tab. č. 2: CHEMICKÉ PROSTŘEDKY DESINFEKCE A STERI LIZ ACE SKUPINA
UŽITÍ
PŘÍKLADY
Fenoly a krezoly
desinfekce
fenol
konzervace
fenol, krezol
desinfekce vzduchu
hexylresorcinol
konzervace
organické kyseliny
desinfekce vzduchu
kyselina mléčná
desinfekce
kyselina chlorovodíková
desinfekce potravin a krmiv (salmonely)
kyselina mravenčí, propionová
Zásady
desinfekce
NaOH
Chlorové preparáty
desinfekce
chlorové vápno, chlornan sodný, chloramin
desinfekce dojící techniky
jodofóry
desinfekce rukou před operací
jodofóry
Kyseliny
(uvolňující volný chlór) Jódové preparáty
desinfekce pro veterinární účely jodofóry Kvarterní amoniové báze desinfekce kůže
benzalkonium chlorid, acetylpyridinium chlorid
Biguanidy
antisepse
chlorhexidin
Diamidiny
desinfekce ran
propamidin, dibromopropamidin, isethionáty
Aldehydy
desinfekce/sterilizace
glutaraldehyd
termolabilních lék. pomůcek
glutaraldehyd
desinfekce/fumigace
formaldehyd
Alkoholy,
desinfekce pracovních povrchů, etanol (ředěný – 60%) zařízení (rychlý účinek) konzervace
etanol
algicidy, fungicidy (dřevo, celulóza, stavební mat.)
deriváty Cu
farmaceutická konzervancia
organické sloučeniny Hg
sterilizace
etylenoxid
dekontaminace
propylenoxid
Oxidační látky
potravinářský průmysl
peroxid vodíku, kys. peroctová
Siřičitany a dusitany
konzervancia v potrav. průmyslu
Barviva
lokální antiseptika
Deriváty těžkých kovů
Plyny
Methyl violeť (violeť krystalová, gencianová), brilantová zeleň (jen Gbakterie), malachitová zeleň
11
12
