PRAKTIKUM 1 Spektrofotometri. Spectrophotometer Mapada V-1100D
TUJUAN Pada akhir praktikum ini mahasiswa seharusnya sudah: • mengenal konsep-konsep spektrofotometri, termasuk Hukum Beer, spektra absorbsi dan koefisien absorbsi molar • mampu menetukan spektrum absorbsi suatu senyawa dan mengerti cara memakai spektrum absorbsi untuk menolong menentukan identitas suatu senyawa • mampu menentukan konsentrasi larutan tertentu (misalnya, larutan riboflavin) dengan tepat menggunakan metode perhitungan berdasarkan nilai koefisien absorbsi molar. PENDAHULUAN Alat spektrofotometer adalah salah satu alat yang paling sering dipakai dalam bidang Biokimia. Alat ini dapat dipakai untuk menentukan konsentrasi senyawa dalam suatu larutan, untuk mengukur kecepatan reaksi yang dikatalisis enzim dan untuk menentukan identitas senyawa tertentu. Oleh karena spektrofotometer begitu sering dipakai maka mahasiswa harus mengerti cara memakainya dengan benar. Spektrofotometri berdasar kemampuan molekul-molekul dalam larutan menyerap sinar. Seandainya sinar putih dipantulkan lewat larutan berwarna maka sinar, pada panjang gelombang tertentu, akan diserap (absorbed) dan larutan itu berwarna karena adanya sinar yang tidak diserap (transmitted). Senyawa tak berwarna tidak menyerap sinar pada panjang gelombang pada daerah spektrum tampak tetapi mungkin dapat menyerap sinar pada daerah lain (UV atau infra-merah). Spektrofotometer yang dilengkapi dengan sumber sinar UV atau infra-merah dapat dipakai untuk meneliti senyawa yang tidak berwarna.
Hukum Beer Untuk larutan senyawa tertentu, jumlah cahaya yang masuk dibandingkan cahaya yang diserap oleh larutan tersebut bergantung pada konsentrasi senyawa terlarut itu dengan demikian: Log Io / I = εcl Di mana Io adalah intensitas cahaya yang masuk (incident light intensity) I adalah intensitas cahaya yang tidak diserap (transmitted light intensity) c adalah konsentrasi senyawa terlarut (moles l-1). l (huruf bukan angka) adalah panjangnya jalan cahaya melalui larutan (light path) (= 1 cm di semua praktikum semester ini) ε (ucapannya epsilon) adalah absorbsi1 larutan dengan konsentrasi sebesar satu molar pada suhu dan pH tertentu. Disebut koefisien absorbsi molar (atau absorptivitas molar), nilainya tetap dan merupakan ciri khas suatu senyawa. 1 Dalam bahasa Indonesia ‘absorbsi’, ‘absorbansi’ dan ‘absorban’ dipakai (urutan dalam daftar ini berdasarkan frekuensi pemakaian di internet). Dalam bahasa Inggris ‘absorbance’ dan ‘extinction’ dipakai. 1
Log Io/I disebut absorbsi dan diberi lambang ‘A’. Spektrofotometer dapat menunjukkan hasil pengukuran dalam satuan absorbsi maka nilai Io dan I tidak perlu ditentukan sendiri. Oleh karena itu Hukum Beer dapat disingkatkan menjadi: Absorbsi = koefisien absorbsi molar x konsentrasi x panjang jalan cahaya
A
= εcl
(perhatikan l = 1 cm)
Range: Perhatikan bahwa hukum Beer hanya berlaku pada kisaran absorbsi terbatas. Kisaran tersebut bergantung pada senyawanya tetapi, pada umunnya, nilai absorbsi di atas 2 tidak berarti. Oleh karena A = log Io/I maka absorbsi sama dengan 2 berarti cahaya yang masuk (Io) seratus kali lebih besar dibandingkan cahaya yang tidak diserap.
Panjang gelombang: Selama praktikum ini panjang gelombang di bawah 340 nm tidak akan dipakai sehingga kuvet plastik boleh dipakai (kecuali dengan pelarut organik). Pada panjang gelombang yang lebih pendek kuvet quartz harus dipakai karena sinar UV tidak dapat tembus kaca ataupun plastik.
Petunjuk bagi Spektrofotometer Mapada V-1100D2 1. 2. 3. 4. 5.
6. 7.
Hidupkan alatnya (tombol di belakang alat di sebelah kiri kabel listrik). Pilih Absorbsi (A) dengan tombol MODE yang terletak pada panel pertunjukan (mode yang dipilih terlihat pada bagian kiri layarnya). Pilih panjang gelombang (nm) dengan setelan pada muka alat (panjang gelombang yang dipilih terlihat pada bagian atas layarnya). Tetapkan '0%T' (absorbsi yang tak terbatas): Tutup tutupnya dan tekan tombol 'V' pada panel pertunjukan. Tetapkan '100%T' (absorbsi sama dengan nol): Masukkan blangko3 dan tekan tombol 'Δ' pada panel pertunjukan. Masukkan sampel dan baca/catat absorbsinya (terlihat pada bagian kanan layarnya). Ulangi langkah 6 dengan sampel lainnya. Atau ulangi langkah 5 dan 6 pada panjang gelombang yang lain.
2 Perhatikan: Gambar pada halaman 5 di User's Manual salah – letaknya mata panah (tapi bukan teksnya) terbalik. 3 Dengan pemegang sel dimasukkan sepenuhnya, letakkan kuvet dalam posisi yang terdekat pada operator (cahaya bersinar dari kiri ke kanan di kompartemen sampel). 2
PERCOBAAN Penentuan Spektrum Absorbsi Senyawa-senyawa dapat menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu sehingga jikalau absorbsi suatu larutan diukur pada berbagai panjang gelombang maka absorbsi pada panjang gelombang tertentu akan lebih besar dibandingkan absorbsi pada panjang gelombang yang lain. Dengan mengukur absorbsi (A) sebagai fungsi panjang gelombang (λ) maka dapat diperoleh spektrum absorbsi untuk senyawa terlarut itu. Oleh karena spektrum absorbsi itu bergantung pada struktur kimianya maka spektrum absorbsi ini dapat dibandingkan dengan spektrum absorbsi senyawa yang diketahui strukturnya untuk menentukan identitas senyawa anu itu. Panjang gelombang di mana absorbsi maksimum disebut λmax. Suatu senyawa dapat memiliki lebih dari satu λmax. Sebagai contoh penentuan spektrum absorbsi, dalam praktikum ini mahasiswa akan menetukan spektrum absorbsi vitamin riboflavin. Riboflavin terdapat dalam koenzim FMN (flavin mononucleotide) dan FAD (flavin adenine dinucleotide) yang dibutuhkan oleh enzimenzim tertentu. Riboflavin menjadi rusak apabila kena cahaya maka jangan membiarkannya kena cahaya tanpa alasan. Ukur absorbsi larutan riboflavin tiap 10 nm pada jarak 350-550 nm. Pakai air sebagai kontrol (reagent blank) karena riboflavin terlarut dalam air. Nolkan spektrofotometer dengan reagent blank ini pada tiap panjang gelombang. Pakai dua kuvet, satu untuk reagent blank itu dan satu lagi untuk larutan riboflavin. Kedua kuvet ini seharusnya mempunyai absorbsi yang sama. Catat hasil pengukuran pada tabel tersedia di bawah kemudian dalam tempat yang tersedia: (a)
Gambarkan spektrum absorbsi riboflavin (absorbsi vs panjang gelombang – landscape mode).
(b)
Catat kedua nilai λmax.
(c)
Hitung koefisien absorbsi molar, ε, pada kedua λmax. Konsentrasi riboflavin adalah 4,5 x 10-5 moles l-1 atau 2,25 x 10-5 moles l-1. Perhatikan tulisan pada sampel yang dipakai. Satuan untuk ε adalah litre mol-1 cm-1.
3
LAPORAN PRAKTIKUM I Nama: TUJUAN
Penentuan Spektrum Absorbsi. Konsentrasi larutan riboflavin yang dipakai adalah
μM yaitu
DATA Panjang gelombang (nm)
Absorbsi
350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 550
4
mol l-1.
ANALISIS DATA Gambarkan grafik hubungan antara absorbsi (A) dan panjang gelombang (λ) pada kertas grafik yang tersedia (pakailah kertas grafik itu dengan orientasi “landscape”). Tandai sumbu secara jelas dan tulis judul di atas gambarnya (Petunjuk: Apakah istilah yang dipakai untuk grafik semacam ini?).
HASIL 1.
Catat nilai λmax:
dan
2.
Konsentrasi riboflavin yang dipakai adalah4:
3.
Hitung koefisien absorbsi molar (ε) untuk tiap λmax:
(jangan lupa sebutkan satuannya)
Perlihatkan cara hitung dan satuan angka-angka di atas. Perhatikan: satuan litre boleh disingkatkan baik dengan lambang ‘l’ ataupun dengan lambang ‘L’. Oleh karena itu satuan untuk ε boleh ditulis sebagai L mol-1 cm-1 atau l mol-1 cm-1. Bandingkan spektrum absorbsi dan nilai-nilai koefisien absorbsi molar yang diperoleh dengan konsentrasi riboflavin yang berbeda. Apa persamaan dan perbedaan? [Riboflavin] (μM)
22,5
45
Perbandingan (coret yg salah)
λmax (nm)
dan
dan
sama/beda
ε (L mol-1 cm-1)
dan
dan
sama/beda
Absorbsi pada panjang gelombang yang sama
sama/beda
Bentuk grafik secara keseluruhan
sama/beda
4 Konsentrasi larutan riboflavin dicatat dalam petunjuk praktikum ini. 5
6
PERTANYAAN 1. Absorbsi (atau absorbansi) suatu larutan pada panjang gelombang tertentu (λmax-nya) adalah 0,3 dalam kuvet berukuran 1 cm. Hitung konsentrasi larutan tersebut apabila nilai absorptivitas molar (ε), senyawa yang menyerap sinar dengan λmax itu, sebesar 6.220 l mol-1 cm-1.
2. Seandainya Mawar diberi larutan riboflavin dan dia meminta bantuanmu, jelaskan cara dia dapat menentukan konsentrasi larutan itu dengan menggunakan spektrofotometer?
3. Tentukan konsentrasi sampel-sampel berikutnya. Senyawa
λmax (nm)
ε (l mol-1cm-1)
Absorbsi
Methylene Blue
664
7,4 x 104
0,54
Indocyanine Green
720
7,5 x 104
1,69
Eumelanin
407
2,5 x 103
0,83
Pheomelanin
430
2,8 x 103
1,53
Oksihemoglobin
414
5,2 x 105
1,04
Deoksihemoglobin
433
5,5 x 105
0,47
Konsentrasi (μmol l-1)
4. Apakah nilai konsentrasi yang dihitung untuk Indocyanine Green di atas (pertanyaan 3) teliti atau tidak? Beri alasan untuk jawabanmu.
7
