Ketrampilan Dasar Laboratorium Program Studi Ilmu Biomedik 2011 2011
Kuliah 4: Oktober 5, 2010 Pengenceran “revisited”
OpenWetWare…file names Spektrofotometri Praktikum Metabolisme
Pengenceran:: Pengenceran
a:b
Fishel, L.A. 2010. Dilution Confusion: Conventions for Defining a Dilution Journal of Chemical Education 87:183-1185.
The ratio a:b is generally defined as the quotient (a/b) and is described as a in b.2–4 However, it may also be expressed as a to b.5,6 [meaning]…the sum a+b. 2. Kaplan LA, Pesce AJ, eds. Clinical Chemistry: Theory, Analysis, Correlation. 5th ed. St Louis, Mo.: Mosby Elsevier; 2010:32. 3. Troy DB, ed. Remington—The Science and Practice of Pharmacy. 21st ed. Philadelphia, Pa.: Lippincott Williams & Wil-kins; 2006:119. 4. Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE, eds. Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics. 4th ed. St. Louis, Mo.: Elsevier Saunders; 2006:27. 5. Darton M, Clark J. The Macmillan Dictionary of Measurement. New York, NY: Macmillan Publishing Co.; 1994:378. 6. The Random House Dictionary of the English Language. 2nd ed., unabridged. New York, NY: Random House; 1987:1602.
Pengenceran:: Pengenceran
a:b
Untuk mata kuliah Ketrampilan Dasar Laboratorium, a:b selalu diartikan a/a+b 1:1 pengenceran 50% atau 1/2 dari awalnya 1:3 pengenceran 25% atau 1/4 dari awalnya 2:3 pengenceran 40% atau 2/5 dari awalnya 1:9 pengenceran 10% atau 1/10 dari awalnya 1:10 pengenceran <10% atau 1/11 dari awalnya
Filenames in OpenWetWare Praktikum 4: Metabolisme I dan Spektrofotometri Bahan Praktikum Metabolisme I dan Spektrofotometri Artikel Dasar Kegiatan Praktikum Metabolisme di sini
Tugas Mahasiswa (laporan) Praktikum 4 Tolonglah nama file Anda termasuk nama Anda/kelompok Anda sendiri Contoh: "Abdi dan Mustafa laporan praktikum metabolisme dan spektrofotometri.pdf“
??Apakah email sudah sampai??
Spectrophotometry Basic Ideas: i) If a molecule absorbs a photon of electromagnetic radiation, its energy level will rise EXCITED STATE ii) a molecule may vibrate in many ways, so there are many vibrational levels iii) Absorption (and emission) of energy is quantal (yaitu set values)
Energy Level Diagram
Basic ideas..... iv) Electromagnetic Spectrum: relationship between energy and wavelength
E = hc/
(h Planck’s constant=4.13566733×10−15 eVs)
UV and visible spectrum (~200-800nm) berguna bagi penelitian molekul-molekul electronic transitions X-ray or -ray energy tinggi molekul dihancurkan/kanker IR energi agak rendah mendapat keterangan tentang struktur molekul (rotational or vibrational transitions)
UV and visible spectrum (~200-800nm) λ semakin kecil
energi semakin besar
** skala logarithmik**
Ada molekul/unsur yang dapat menyerap cahaya langsung pada 200nm < λ > 800nm misalnya: DNA atau protein
Absorption Spectra of DNA and protein
DNA and protein absorb energy in the UV region (DNA pada =260nm; protein pada =280nm)
Hasil Spektrofotometri DNA
Spektra absorpsi glukosa dan kolesterol glukosa
kolesterol
dasarnya: H2O2 bereaksi dengan fenol, 4-amino-antipirin serta peroksidase derivatif kuinonimin yang berwarna merah.
standar
sempel sempel
λ (nm)
serapan
serapan
standar
λ (nm)
diambil dari: https://fscimage.fishersci.com/images/D10972~.pdf Enzymatic Colorimetric Methods for the Analysis of Human Serum by UV-Visible Spectroscopy, Keppy et.al., Thermo Fisher Scientific
Protein dapat diukur dgn reagensia Biuret Serapan cahaya dibanding dengan panjang gelombang cahaya pada reaski reagensia Biuret dengan protein 0.4
serapan
0.35 0.3
0.25 0.2
0.15
Puncak serapan pada ≈520 nm
0.1 0.05 0
480
500
520
540
560
580
600
620
panjang gelombang (nm)
data yg diperoleh pada praktikum BM506 2009
Alat Spektrofotometer :
d Io
I
hubungan antara transmisi cahaya (I/ Io) dgn konsentrasi sempel
log10(Io/I) = -dc
Io= intensitas cahaya yang masuk I = intensitas cahaya yang keluar d = jarak larutan yang dilalui cahaya (cm) c = konsentrasi larutan (mole/litre atau M) = molar absorption coefficient (M-1cm-1)
% transmission = 100 x (Io/I) tapi lebih praktis untuk mengunakan konsep serapan (absorbance) dimana , A = -log10(Io/I)
A = dc
d Io
Io= intensitas cahaya yang masuk
A = -log10(Io/I)
I
I = intensitas cahaya yang keluar
Kalau 0% cahaya diserap sempel?? Io= I A = -log10(1) A = 0 Kalau 50% cahaya diserap sempel?? Io> I A = -log10(2) A = 0,3 Kalau 99,9% cahaya diserap sempel?? Io>> I A = -log10(1000) A = 3
Kalau nilai A yang diperoleh > 1,5 sebaiknya sempel diencerkan dulu agar hasilnya lebih akurat/ dapat dipercaya
Hukum Beer-Lambert 2
A = dc Hukum Beer-Lambert benar pada konsentrasi yang berbanding lurus dengan A
spektrofotometer Mode (transmittance or absorption) Cuvette holder On/Off
Wavelength adjustment 100%T (0 absorbance) adjustment
Basic operation: kuvet i) pakai sempel blanko dan sempel yg lain ii) sempel blanko dimasukkan dulu untuk dinulkan sinyal pada yg sedang digunakan iii) sempel yg lain diperiksa pada yg sama. iv)serapannya dibaca
Praktikum 4 Metabolisme I (glukosa (glukosa,, trigliserida,, urea) dan trigliserida Teknik Spektrofotometri Kelompok praktikum Bagian praktikum
Pengenceran Grafik-grafik Laporan/Proposal
Metabolisme II
Kelompok Praktikum Kelompok 1 (masuk (masuk pk 08:00): Dedy Ernawati Mara Imam Fera Roy Martina Lily Dorra Kelompok 2 (masuk (masuk pk 12:00): Taya Elsa Leo Yeni Musthari Ningrum Donny Sukaisi
Taufik Anwar
Dita Siti
Grup praktikum ditentukan setiap hari praktikum 18
Cara kerja kerja.... .... 1. Pengenceran - doubling dilution dan decimal dilution dari larutan stok glukosa dan urea (meja 1,3,5 mengerjakan pengenceran larutan stok urea dan meja 2,4 mengerjakan pengenceran larutan stok glukosa) 2. Sempel darah diambil (boleh semua mhs, paling sedikit seorang dari grup meja Anda). 1ml darah cukup.
3. Darah disentrifugasi biar serum dapat diambil 4. Kerjakan pemeriksaan glukosa, trigliserida serta urea pada sempel serum sesuai dengan prosedurnya
Cara kerja kerja.... .... volume reagensia kit
volume sampel
konsentrasi standard kit periode dan temperatur inkubasi periksa pada λ
TRIGLISERIDA
GLUKOSA 1000l reagensia glukosa
1000l reagensia R2
10l
10l
10l
100mg/dl
200mg/dl
40mg/dl
10 min @ 37C 500nm
UREA 1000l reagensia A, kemudian 1000l reagensia B
5 min @ 25C 5 min @ 37C ** 2X** 530nm
600nm
Hasilnya.... Hasilnya .... Tabel 1a s/d 2b konsentrasi
grup meja__
grup meja__
Hitung garis regresi (linear regression) pada data yg diperoleh. Rumus yang dihasilkan berbentuk y= mx + b dimana y = serapan; x = konsentrasi dan “m” merupakan slope
serapan
faktor 1 2 4 8 16 32 64 128 blanko
konsentrasi
Hasilnya.... Hasilnya .... Tabel 3 GLUKOSA
mhs: ______
mhs: ______
UREA
mhs: ______
Serapan sempel dari grafik 1a/2a dari grafik 1b/2b
}
dari rumus kit
contoh urea:
Asempel/Astandar x 40mg/dl
maksudnya dari rumus garis regresi y= mx + b
mhs: ______
Hasilnya.... Hasilnya .... Tabel 4 Hasil pemeriksaan glukosa, trigliserida dan urea plasma mahasiswa detil2 mhs (berapa lama sejak makan; rata-rata apa yg dimakan; jenis kelaminan; umur) 1.
GLUKOSA
A
2.
serapan
3.
data kelas
kadar
TRIGLISERIDA
A
kadar
UREA
A
kadar
Laporan dan proposal Metabolisme II Laporan * satu laporan per grup meja 1-2 halaman selain Tabel 3 dan 5 grafik kata-kata sendiri perubahan yang ada dicatat 3 kesimpulan dari setiap grafik (5 grafik yang berdasar Tabel 1a, 1b, 2a, 2b serta Table 4) komentar atas kebuktian (atau tidak) Hukum BeerLambert komentar atas hasil pada Tabel 3. saran
Laporan dan proposal Metabolisme II Proposal untuk Praktikum Metabolisme II (dibuat masing-masing) Dari data dan pengalaman Anda pada praktikum ini, pikirkan suatu hipotesis dan mendesain suatu percobaan yang bisa membuktikan hipotesis Anda itu benar atau tidak dan yang bisa diuji dalam konteks praktikum (ingatlah keterbatasan waktu dan alat!!) Siapkan cara kerja/proposal yang lengkap dan jelas proposal akan dikumpulkan (secara hardcopy) pada UTS (tgl 10 Nopember) akan dikomentar dikembalikan kepada Anda sebelum akhir bulan Nopember. Anda boleh bergabung dengan seorang mhs lain (terserah Anda) sebagai grup meja untuk praktikum Metabolisme II dan boleh memilih satu proposal di antara kalian berdua untuk mengerjakan bersama-sama pada jam praktikum pada tgl 15 Desember 2011.
UTS Praktek Ketrampilan Praktikum Akan dilaksanakan pada Hari Kamis tgl 10 November pk 08:30 s/d selesai Bentuknya: per orang 45 menit 15 menit sempat membaca soal-soal 15 menit kegiatan praktek laboratorium 15 menit kegiatan praktek data analisis Bahan ujian: semua bahan kuliah & praktikum *diperbolehkan Anda bawa bahan praktikum atau catatan lain. Jangan lupa pengaris, pensil, penghapus, balpoin (pasti bertugas buat grafik! – kertas grafik disediakan kami)
References:: References Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. & Walter, P. 2008. Molecular Biology of the Cell (5th ed), Garland Science, Taylor & Francis Group, New York. Southeastern Universities Research Association (www.sura.org) Dunn, S.M.J. 1990. PMCOL 306 Course Notes, University of Alberta Pharmacology Department Holme, D. J. & Peck, H. 1998. Analytical Biochemistry (3rd ed), Addison Wesley Longman Inc., New York.
