VETERINÁRNÍ A FARMACEUTICKÁ UNIVERZITA BRNO
FAKULTA VETERINÁRNÍ HYGIENY A EKOLOGIE Ústav biochemie, chemie a biofyziky
PRAKTICKÁ CVIČENÍ Z VETERINÁRNÍ BIOCHEMIE INOVOVANÉ ÚLOHY
MVDr. Vladimír Kopřiva, Ph.D. Doc. MVDr. Ladislav Malota, CSc. MVDr. Tomáš Nekvapil, Ph.D. MVDr. Martin Hostovský
BRNO 2011
OBSAH ÚVOD ........................................................................................................................................ 2 1
SPRÁVNÁ LABORATORNÍ PRAXE ......................................................................... 3
1.1
TEORETICKÁ ČÁST........................................................................................................... 3
1.2
PRAKTICKÁ ČÁST ............................................................................................................ 9
1.2.1
Močová analýza – vizuální a reflektrometrická metoda.......................................... 9
1.2.2
Lyonorm – kontrolní sérum ................................................................................... 24
1.2.3
Praktická aplikace zásad správné laboratorní praxe ve cvičeních veterinární
biochemie ............................................................................................................................. 26 2
BIOCHEMICKÁ PROBLEMATIKA MEDU............................................................. 36
2.1
TEORETICKÁ ČÁST......................................................................................................... 36
2.2
PRAKTICKÁ ČÁST .......................................................................................................... 44
2.2.1
Stanovení kyselosti medu ...................................................................................... 44
2.2.2
Stanovení aldóz medu ........................................................................................... 45
3
BIOCHEMICKÁ PROBLEMATIKA VITAMINU C ................................................ 46
3.1
TEORETICKÁ ČÁST......................................................................................................... 46
3.2
PRAKTICKÁ ČÁST .......................................................................................................... 49
3.2.1
Stanovení obsahu kyseliny askorbové ve vlastní moči ......................................... 49
3.3
SATURAČNÍ TEST: .......................................................................................................... 51
3.4
VITAMIN C A JEHO OBSAH VE VYBRANÝCH KOMODITÁCH OVOCE A ZELENINY ............. 51
4
POUŽITÁ LITERATURA ........................................................................................... 53
1
ÚVOD Předkládaný učební text představuje studentům inovované úlohy praktických cvičení z veterinární biochemie. První kapitola se věnuje problematice Správné laboratorní praxe, včetně praktických příkladů uplatnění v biochemické laboratoři. Další kapitola představuje biochemii medu jako komodity živočišného původu, včetně praktických inovovaných úloh stanovení kyselosti medu a stanovení aldóz medu. Třetí část je věnována biochemii vitaminu C, jodometrickému stanovení vitaminu C ve vlastní moči a informacím o obsahu vitaminu C ve vybraných komoditách ovoce a zeleniny.
Učební text byl vypracován v rámci řešení projektu OPVK „Inovace výuky veterinárních studijních
programů
v oblasti
bezpečnosti
potravin“,
reg.
číslo
CZ/1.07/2.2.00/15.0063.
Brno, květen 2011
Autorský kolektiv
2
projektu
1 SPRÁVNÁ LABORATORNÍ PRAXE 1.1 TEORETICKÁ ČÁST
V systému laboratorní praxe je aktuálně definována správná laboratorní praxe (zkr. SLP, z angl. GLP), která představuje soubor opatření k zajištění kvality dat. Se správnou laboratorní praxí souvisí i systém jakosti, který je v laboratoři zavedený. Základem tohoto systému je QA/QC, tj. Quality Assurance a Quality control, která souhrnně tvoří QA (Quality Assesment).
Quality Assesment zahrnuje:
Quality Assurance – tj. soustava tvořící -
systém jakosti,
-
laboratorní prostředí,
-
personál laboratoře,
-
vybavení laboratoří,
-
řízení jakosti v laboratoři,
-
standardní operační postupy tzv. SOP, metody dokumentované a validované,
-
kalibrační postupy,
-
hodnocení způsobilosti,
-
vyjadřování výsledků,
-
kontrolní postupy,
-
nápravná opatření,
-
interní prověrky,
-
audit systému jakosti.
Quality control – jedná se o prostředky a činnosti používané ke splnění požadavků na jakost, vztahující se k zajištění jakosti specifických vzorků interních a externích.
3
Významným ukazatelem je akreditace laboratoří, tj. získání osvědčení o akreditaci. Akreditace je postup, na jehož základě vystavuje úřední orgán oficiální uznání, že organizace nebo osoba jsou způsobilé k vykonávání určitých činností. Základem pro akreditaci je zavedení systému jakosti a je třeba popsat činnosti v příručce jakosti, která představuje základní dokument, který je třeba průběžně aktualizovat a musí být k dispozici všem pracovníkům laboratoře.
Příručka jakosti obsahuje: -
identifikační data organizace a laboratoře,
-
charakteristiku koncepce systému jakosti,
-
charakteristiku struktury laboratoře,
-
organizační schéma laboratoře,
-
personální složení laboratoře,
-
popis pracovních a funkčních činností,
-
popis odpovědnosti a pravomocí jednotlivých pracovníků laboratoře,
-
dokumentace týkající se prostor, vybavení, zařízení, včetně postupů zabezpečování jakosti, uvedení referenčních materiálů,
-
nápravná opatření,
-
postup vyřizování námitek a stížností,
-
systém zabezpečování nestrannosti, nezávislosti a věrohodnosti, včetně její deklarace v písemné podobě.
Nejdůležitějším výstupem je správnost laboratorního výsledku. V laboratořích jsou využívány tzv. referenční materiály, resp. certifikované referenční materiály využitelné pro kalibraci. Laboratoř ve své práci vychází z: -
normovaných metod,
-
vlastních metod (je nutné provést jejich validaci).
Metody se zpracovávají pro aplikaci v laboratorní praxi ve formě tzv. standardních operačních postupů (tzv. SOP).
4
Validace je soubor systematických laboratorních studií dokládajících provozní charakteristiky metody.
Souhrn Zásady správné laboratorní praxe lze shrnout do následujících oblastí laboratorní činnosti: 1) organizaci a její pracovníky (instituce, laboratoř, pracovníky s kvalifikací v oboru, právy a povinnostmi) -
prostory laboratoře, jejich vybavení, kompetence kvalifikovaných pracovníků, včetně
vedoucích, 2) systém zajišťování jakosti, včetně pracovníka pověřeného zajišťováním jakosti -
zpracovává a trvale udržuje pracovník pověřený zajišťováním systému jakosti
na pracovišti, 3) pracoviště a jeho prostorové a technické vybavení, -
odpovídající
členění
prostor
laboratoře,
zkušební
prostory,
manipulační,
administrativně-dokumentační a archivní, 4) přístrojové a materiální vybavení -
zahrnuje laboratorní přístroje, vybavení, včetně uvedení jejich kalibrace dle SOP,
používané materiály a činidla, 5) zkušební systémy fyzikální, chemické a biologické -
zahrnuje systémy fyzikální, chemické a biologické,
6) analyzované a referenční látky, resp. certifikované referenční materiály -
analyzované a referenční materiály přesného označení, testování látek,
7) standardní operační postupy -
SOP (standardní operační postupy) se zpracovávají pro všechny činnosti, které
se v laboratoři provádějí, 8) praktické provedení odborných studií -
zahrnuje plán studie, průběh , závěrečnou zprávu, která musí obsahovat předepsané
náležitosti, 9) dokumentace výsledků práce akreditované laboratoře, resp. pracoviště -
vedení předepsané dokumentace k činnostem laboratoře včetně protokolu o výsledku
vyšetření, 10) archivace potřebných záznamů -
zahrnuje archivaci (ukládání) a vyhledávání potřebných dokumentů a písemných
materiálů v příslušné podobě. 5
Součástí celého komplexu správné laboratorní praxe je AUDIT (interní a externí).
Interní audit – provádí se v rámci laboratoře a cílem je ověření, zda je systém jakosti účinný. Externí audit – provedený nezávislým orgánem jako součást akreditace.
Vedle
auditu
je
součástí
celého
systému
jakosti
validace
a
verifikace.
Jedná
se o charakterizaci metody a ověření správného fungování metody. Jeden z rozdílů validace a verifikace je v tom, že validace se provádí pro metody, které nejsou normované a verifikace se realizuje u všech metod, včetně normovaných.
Validace potvrzuje, že požadavky na specifické zamýšlené použití jsou splněny. Výstupem validace je validační protokol. Validace zahrnuje řadu tzv. validačních parametrů, např. kalibrace,
mez
detekce,
mez
stanovitelnosti,
reprodukovatelnost,
výtěžnost,
systematická chyba a náhodná chyba.
Verifikace je ve smyslu definice ověření správného fungování metody.
Akreditace Akreditaci provádí akreditační orgán, v České republice Český institut pro akreditaci. Vydává osvědčení o akreditaci na základě splnění kritéria ČSN EN ISO/IEC 45000-17025 a je způsobilý (odborně, technicky, organizačně a personálně) k nezávislému provádění zkoušek specifikovaných v osvědčení. Dozor nad dodržováním akreditačních kritérií provádí akreditační orgán ČIA jedenkrát ročně. Výstupem akreditace je osvědčení o akreditaci, jeho součástí je příloha s přesnou specifikací předmětu akreditace. Platnost osvědčení je tři roky, platnost reakreditace je pět let.
Akreditační orgány v ČR: Český institut pro akreditaci (ČIA) – výkonný orgán pro akreditaci - zkušebních laboratoří, - kalibračních laboratoří, - certifikačních orgánů pro certifikaci výrobků, systému jakosti a personálu, - certifikačních orgánů pro certifikaci EMS organizací. - inspekčních orgánů. 6
Mezinárodní organizace v oblasti akreditace: Evropská organizace pro akreditaci laboratoří (EAL) Evropská organizace pro akreditaci certifikačních orgánů (EAC)
Zásady správné laboratorní praxe – informace pro studenty ZABEZPEČOVÁNÍ JAKOSTI V LABORATORNÍ PRAXI Zabezpečování jakosti v laboratorní praxi je významnou součástí práce každé laboratoře. Problematiku jakosti řeší řada předpisů, pro činnost v oblasti akreditace laboratoří.
Abychom přiblížili našim studentům teoretické poznatky k zabezpečování jakosti v biochemické laboratoři v rámci našich praktických cvičení, uvádíme dvě skupiny příkladů, které jsou součástí zabezpečování jakosti, ale i součástí popisu v příručce jakosti dané laboratoře.
Jde o zásady: -
správné laboratorní praxe v biochemické analýze,
-
prezentace a interpretace získaných výsledků v rámci biochemické analýzy.
Nedílnou součástí a samostatnou kapitolou příručky jakosti je dodržování zásad správné laboratorní praxe. Se zabezpečováním správné laboratorní praxe v rámci jakosti laboratorní činnosti se setkáváme i v našich praktických cvičeních a pro studenty uvádíme konkrétní příklady aplikace správné laboratorní praxe v praktických cvičeních biochemie:
1) používání kontrolních sér v rámci jednotlivých praktických laboratorních úkolů – jde o využití tzv. Lyonormů, kdy se využívají kontrolní séra založená na porcinním séru obohaceném o elektrolyty, příslušné substráty a vybrané enzymy, jde o vlastní systém kontroly správnosti laboratorní práce,
2) práce s automatickými pipetami – nutnost nastavení přesných objemů činidel a roztoků, použití správné špičky, dodržení zásad práce s automatickou pipetou,
3) práce s laboratorním vybavením v průběhu biochemických analýz – např. vodní lázeň (správné nastavení požadované teploty a dodržení přesného času inkubace), centrifuga 7
(správný počet otáček a čas odstřeďování), spektrofotometr (nastavení správné vlnové délky a kalibrace přístroje), automatická míchačka (správná rychlost a čas míchání), poloautomatický analyzátor Basic Secomam (správné programování zvolené metody, dodržení předepsaného postupu v jednotlivých krocích práce s přístrojem), práce s připravenými činidly (použití správné koncentrace a objemu).
Součástí praktické aplikace zásad správné laboratorní praxe v rámci zabezpečování jakosti je i vlastní prezentace a interpretace výsledků biochemických analýz. Jde o dodržování těchto zásad:
1) získané laboratorní výsledky kvalitativních důkazů a kvantitativní analýzy hodnotíme podle stanovených kritérií, nejčastěji biochemických hodnot nebo fyzikálně-chemických ukazatelů stanovených příslušnou legislativou.
2) u kvalitativních důkazů jde o hodnocení výsledku a posouzení např. vzniku barevných reakcí a jejich intenzity, vzniku dalších struktur ve zkumavce např. sraženiny, gelu, apod.,
3) v případě kvantitativní analýzy jde o porovnání hodnot získaných analýzou a tzv. fyziologickou hodnotou, normovanou hodnotou pro jednotlivé potravinové komodity, včetně rozmezí těchto hodnot,
4) hodnocení výsledků v obecné rovině podle daných kriterií , např. metoda hodnocení pomocí křížků (nejčastěji u kvalitativních důkazů), metoda slovního hodnocení „pozitivní, negativní, dubiózní“, aplikace a posouzení výsledků podle fyziologických hodnot (ve veterinární biochemii pro daný bioanalyt a druh zvířete, resp. se zohledněním věku zvířat),
5) správné a přesné vypracování laboratorního protokolu o výsledku biochemické analýzy podle daných parametrů výstupu protokolu.
8
1.2 PRAKTICKÁ ČÁST
1.2.1
Močová analýza – vizuální a reflektrometrická metoda
Úvod: Vyšetření moči patří k základním klinicko-biochemickým vyšetřením ve veterinární medicíně a zahrnuje vyšetření: -
fyzikální
-
chemické
-
mikroskopické (močový sediment)
-
speciální vyšetření - zahrnuje mikrobiologické vyšetření a rozbor močových konkrementů
Teoretická příprava: Složení primární moči, systém renin-angiotensin-aldosteron, funkce ledvin ve vztahu k ABR. Objasněte pojmy: polyurie, polakisurie, strangurie, anurie, isostenurie, polydipsie. Ketogeneze, ketolýza, transport ketonových látek krví, ketoacidóza. Krevní barvivo a jeho deriváty. Biosyntéza hemoglobinu.
Úkol: 1. Proveďte makroskopické posouzení (zbarvení, pach, zákal, pěna…). 2.
Proveďte
důkazy
patologických
součástí
moči
kvalitativními
zkouškami
ve zkumavkách (proteiny, glukosa, ketolátky, krev, žlučová barviva a žlučové kyseliny).
Nemůže-li být analýza moči provedena do 2 hodin po odběru, moč musí být uchována při 4 °C a před analýzou ekvilibrována na teplotu laboratoře.
Makroskopické posouzení moči K fyzikálnímu vyšetření patří především smyslová analýza, kdy zjišťujeme barvu, pěnu, čirost a zápach moči. Dále sem náleží zjištění reakce moči (pH), její specifické hmotnosti (hustoty) a diurézy.
9
1. Barva U masožravců a přežvýkavců je světle až slámově žlutá, u koně červeno- až hnědožlutá barva (barva koňaku), kalného vzhledu (obsah uhličitanu vápenatého) s hustou až vazkou konzistencí, neboť obsahuje mukoproteiny. H = světle až zlatě žlutá.
Odchylky: - světlejší barva – nadměrné pití (zředěná moč), selhání (insuficience) regulační funkce ledvin. - tmavší barva – nedostatek vody, mimořádně ztráty vody (průjem, pocení). - červená barva – erytrocyty, myoglobin, porfyriny, rostlinná barviva (např. červená řepa). - červenohnědá barva – methemoglobin, myoglobin, erytrocyty, hemoglobin, intoxikace olovem nebo rtutí. - hnědá až černá barva – melanin, alkapton, methemoglobin, fenoly; často se toto zbarvení objevuje teprve po stání na vzduchu. - žlutozelená, žlutohnědá barva – bilirubin, biliverdin.
2. Pěna Žlutou až hnědožlutou pěnu může způsobit bilirubin. Větší množství bezbarvé pěny bývá u moči obsahující bílkovinu nebo glukosu. Pěna je hojnější a trvalejší.
3. Množství Objem moči za 24 h (tj. diuréza) je pro každé zvíře odlišné; u skotu se pohybuje od 6 do 25 l, u koně od 4 do 15 l, u psa od 0,04 až do 2 l. H = u dospělých 1 - 2 litry.
Zvýšená diuréza = polyurie Snížená diuréza = oligurie Úplná zástava = anurie (produkce moči pod 50 ml za 24 h).
4. Čirost Normální čerstvá moč je čirá a průhledná u masožravců, všežravců a přežvýkavců. Zkalená moč se vyskytuje fyziologicky vždy u koní; přítomnost mucinu jí dodává hustou až vazkou konzistenci.
Příčinou zkalené moči ihned po vymočení bývá také pyurie. 10
5. Zápach Je ovlivněn skladbou přijatého krmiva a také dlouhým stáním (oxidace, bakteriální rozklad) kdy se mění na amoniakální. Aromatický zápach vnímáme u moči býložravců, pichlavě ostrý u masožravců. Typický je zápach při přítomnosti acetonu – je přirovnáván k zápachu shnilých jablek (provází např.hladovění, diabetes mellitus). H = pach je svérázný, připomíná pach hovězí polévky nebo bujónových kostek.
6. Reakce moči (určení pH) Reakci moči určujeme v čerstvé moči co nejdříve. Není-li moč konzervována (thymol v isopropanolu, formaldehyd), dochází k rozmnožení mikroorganismů, spojené s hydrolýzou močoviny na NH3 a k posunu na alkalickou stranu. Při rutinním vyšetření měříme pH pomocí pH-papírků (PHAN, ALBUPHAN, PENTAPHAN, HEPTAPHAN), které jen krátce (na 1s) ponoříme do moči. Po vyjmutí otřeme kapku ulpívající na dolním okraji proužku o okraj zkumavky a ihned srovnáme se zbarvením příslušné zóny s barevnou stupnicí, na které odečteme pH.
Zóna papírku obsahuje
acidobazické indikátory (methylenová červeň a bromthymolová modř), které reagují na koncentraci H+
iontů v moči změnou svého zbarvení. Analýza může být zkreslena
přítomností par amoniaku v ovzduší laboratoře, stáje apod.
kyselé pH = moč většiny masožravců (obsahuje dihydrogenfosforečnan sodný / NaH2PO4) alkalické pH = moč koně, býložravců (obsahuje uhličitan vápenatý / CaCO3 moč všežravců – pH je závislé na složení krmiva
člověk = pH 5,5 < 6,5 s krajními mezemi 4,5 - 8,0 ⇓ pH moči: acidóza, hladovění, zátěž, infekce, dehydratace, febrilie.
7. Hustota (specifická hmotnost) Specifická hmotnost dává informaci o iontové koncentraci moči. Referenční hodnoty jsou při běžném příjmu tekutin a potravin během dne mezi 1010 - 1050 g/l. U diabetu, akutního zánětu ledvin má stanovení hustoty velký diagnostický význam.
11
Přehled referenčních rozmezí hustoty a pH moči u vybraných druhů zvířat Hustota (g/l)
pH
Kůň
1020 – 1032 – 1050
7,5 – 8,0 – 8,5 – 9,0
Hříbata
pod 1010
7,5 – 8,0 – 8,5 – 9,0
Dojnice
1030 – 1045
7,0 – 7,5 – 8,0 – 8,5
Ovce
1015 – 1045
7,4 – 8,4
Koza
1015 - 1045
7,4 – 8,4
Prase
1010 – 1030
5,0 – 6,5 – 6,8 – 7,0
Pes
1015 – 1040
5,5 – 7,0
Kočka
1015 – 1050
5,5 – 7,0
Člověk
1010 – 1025
5,5 – 6,5
Poznámka: - u vysokoprodukčních dojnic nemá pH moči klesnout pod hodnotu 7,0; silný vliv výživy, metabolické zátěže, vysoké produkce mléka - u psa je hustota moči nad 1050 signálem dehydratace (vliv výživy, granule x vařená strava, maso + zelenina) - u kočky je hustota moči nad 1060 rovněž signál dehydratace.
Důkaz patologických součástí moči Úkol: Proveďte základní vyšetření vlastní moči na přítomnost patologických součástí (kvalitativní reakce, diagnostické papírky). Při provádění důkazů souběžně s vyšetřovaným vzorkem vlastní moči analyzujte modelový vzorek. Příprava modelového vzorku: moč s přídavkem vyšetřované patologické součásti ke vzorku vlastní moči, např. při průkazu glukosy v moči přidáte k moči několik kapek roztoku glukosy, podobně žluč (žlučová barviva), krev, krevní sérum (bílkovina), aceton (ketolátky).
12
PROTEINY V MOČI (PROTEINURIE)
Zkouška s kyselinou sulfosalicylovou: Její princip spočívá v tom, že se bílkovina kyselinou sulfosalicylovou denaturuje, což se projeví tvorbou zákalu až sraženiny podle množství přítomné bílkoviny. Tato zkouška je nejpoužívanější ze všech způsobů důkazu bílkoviny v moči. Je vysoce citlivá a prokáže i fyziologická množství bílkovin v moči (nepřesahující 0,15 g/ 24 h). Proto negativní výsledek s určitostí znamená, že v moči není patologické množství bílkoviny, kdežto v případě opalescence rozhodnou další, méně citlivé zkoušky, zda nalezená bílkovina v moči nepřesáhla fyziologicky se vyskytující množství (zkouška varem).
Pracovní postup: Ke 2 ml moči přidáme 2 kapky kyseliny octové (5 mol/l) a 3-5 kapek kyseliny sulfosalicylové (0,917 mol/l). Jestliže je ve vzorku přítomna bílkovina, pozorujeme opalescenci, zákal nebo dokonce bílou sraženinu bílkovin. Intenzitu zákalu hodnotíme ve světle dopadajícím na zkumavku z boku dle následující tabulky.
Hodnocení:
Nález
Označení
opalescence je viditelná proti černému pozadí
Přibližná koncentrace bílkovin v g/l
stopy
cca 0,1
+
0,1 – 0,25
mléčný zákal neprůhledný
++
0,25 – 1,0
mléčný zákal vločkující
+++
2,0 – 4,0
tvarohovitá sraženina
++++
4,0 a více
v bočním světle (fyziologický nález) lehký zákal, prosvítá jím drobný text, který je dobře čitelný
Poznámka: Moč použitá na zjištění přítomnosti bílkoviny musí být čirá!! V případě vzniku opalescence je vhodné provést s močí méně citlivou zkoušku (zkouška varem) a dle jejího výsledku rozhodnout, zda nalezená bílkovina v moči nepřesáhla fyziologicky se vyskytující množství (stopy).
13
Zkouška varem: Využívá termolability bílkovin při pH v okolí jejich izoelektrického bodu.
Pracovní postup: Asi 5 ml moči okyselíme třemi kapkami 5 mol/l kyseliny octové (izoelektrický bod) a zahřejeme do varu. Bílkovina se projeví bílým zákalem až sraženinou. Dbáme, abychom nepřidali kyseliny octové příliš mnoho, bílkovina by se pak nevysrážela (falešně negativní výsledek).
Zvýšení (proteinurie): enormní zátěž, horečka, glomerulonefritida, pyelonefritida. Falešně pozitivní reakci dávají v moči přítomné sulfonamidy, perorální antidiabetika a vyšší koncentrace penicilínu. Kůň: falešně pozitivní protein reaguje na diagnostickém proužku (alkalická moč, fyziologická přítomnost mukoproteinů).
GLUKOSA V MOČI (GLYKOSURIE)
Zkoušky redukční: Zkouška Fehlingova Při Fehlingově zkoušce s CuSO4 . 5 H2O (Fehling I) v alkalickém prostředí vzniká sraženina Cu(OH)2, která se vinanem sodnodraselným (Fehling II + hydroxid sodný) rozpustí na modrý komplexní anion. Glukosa vyredukuje za tepla z tohoto roztoku cihlově červený Cu2O. Zkouška se používá v klinické praxi k průkazu všech redukujících cukrů v moči (diagnostickými proužky prokážeme jen glukosu).
Pracovní postup: 1 díl Fehlingova roztoku I. + 1 díl Fehlingova roztoku II. a stejný díl moči vpravíme do zkumavky a opatrně povaříme. V přítomnosti cukrů vzniká zelenavá, zelenožlutá a žlutočervená sraženina oxidu měďného. Pouhá změna barvy (z jasně modré barvy se stane modrozelená nebo zelená, ale roztok zůstává průhledný, bez sraženiny) neznačí pozitivní výsledek zkoušky. Toto zelené zbarvení vzniká tím, že vyredukovaný oxid měďný vytváří barevný komplex s kreatininem. Před zkouškou je dobře se přesvědčit povařením samotného činidla, zda nedává spontánní reakci – což se může stát, jsou-li roztoky staré.
Zvýšení (glykosurie): diabetes mellitus, léčba glukokortikoidy, stres, traumata.
14
Falešně pozitivní reakci způsobuje např. přítomnost kyseliny močové, gentisové (metabolit aspirinu) nebo kyseliny askorbové v moči při nedodržení reakčních podmínek. Výsledek je ovšem ovlivněn přítomností dalších redukujících látek v moči (alkapton, streptomycin a jeho metabolity, bílkoviny apod.).
Poznámka: Při důkazu glukosy redukční zkouškou nesmí moč obsahovat bílkoviny, které se musí odstranit vysrážením filtrací (deproteinovaná moč).
KETOLÁTKY V MOČI (KETONURIE, NAD 0,1 g/l MOČI)
Zkouška Legalova Aceton dává s nitroprussidem sodným v alkalickém prostředí karmínově červené zbarvení. Tutéž barvu však vytváří i kreatinin, obsažený fyziologicky v moči. Na rozdíl od zbarvení vyvolaného acetonem zmizí barva způsobená kreatininem, jestliže roztok okyselíme kyselinou octovou.
Pracovní postup: Několik krystalků nitroprussidu sodného rozpustíme asi ve 2 ml moči. Potom přidáme několik kapek NaOH (2,5 mol/l). Vznikne-li červené zbarvení, neznamená ještě přítomnost acetonu. Přidáme několik kapek ledové kyseliny octové (koncentrované). Není-li aceton přítomen, červené zbarvení se mění na žlutavé, kdežto v pozitivním případě se původní červená barva ještě zvýrazní.
Zkouška Langeova (modifikace zkoušky Legalovy) 5 ml moči, 5 kapek nitroprussidu sodného (0,624 mol/l), 2 – 3 kapky kyseliny octové (1,665 mol/l) a směs se převrství amoniakem (14,705 mol/l). Na rozhraní amoniaku a směsi se objeví červenofialový prstenec, je-li v moči obsažen aceton.
Zkouška Lestradetova (oblíbená rychlá zkouška proveditelná i ve stáji) Působením acetonu na práškové Lestradetovo činidlo vzniká fialové zabarvení. Reakce je citlivější než Legalova zkouška.
15
Na hodinové sklíčko dáme na špičku nože práškového činidla a přidáme 1 – 2 kapky moči. Pozorujeme, zda vzniklo červenofialové zabarvení, způsobené ketolátkami. Lehké narůžovění se odečítá jako stopy.
Zvýšení (ketonurie): diabetes mellitus, diabetická ketoacidosa, lačnění, hladovění. Dislokace slezu, ulehnutí a lipomobilizační syndrom krav. Ketonurie je indikací pro stanovení glukosemie.
KREV A KREVNÍ BARVIVO V MOČI
Heitz – Boyerova zkouška (velmi citlivá) K 1 ml moči přidáme 1 kapku krve, smísíme se stejným dílem Heitz-Boyerova činidla a opatrně navrstvíme peroxid vodíku (0,88 mol/l). Vzniklý červený prstenec na rozhraní kapalin je důkazem přítomnosti krve. Zvýšení (hematurie): erytrocyty, stroma erytrocytů, poranění (exogenní, chirurgické, konkrementy), tumory, infekce, septické záněty, paraziti.
PIGMENTURIE = hemoglobinurie, myoglobinurie / moč je načervenalá příp. dohněda zbarvená a má lakový vzhled. Hemoglobinurie: bez přítomnosti erytrocytů. Rozlišení hematurie a hemoglobinurie umožní mikroskopické vyšetření močového sedimentu. Myoglobinurie: rozpad svalových vláken / zhmoždění svalů, vyčerpávající svalová zátěž, akutní svalové trauma, myositis. Poznámka: Obsahuje-li moč větší množství hnisu (peroxidasy leukocytů), léčiva, jodidy, soli mědi a železa, může vzniknout falešně pozitivní reakce. Povařením moči se enzymy inaktivují a reakce je negativní, zatímco v případě krevního barviva se jeho aktivita zahřátím nemění. Nález je vhodné potvrdit (vyvrátit) výskytem četných erytrocytů v močovém sedimentu.
16
ŽLUČOVÁ BARVIVA V MOČI
Zkouška s dusitanem sodným na bilirubin (zelený Ehrlich) K 5 ml moči přidáme 2 kapky roztoku dusitanu sodného (0,072 mol/l) a moč okyselíme několika kapkami koncentrované kyseliny chlorovodíkové. V přítomnosti bilirubinu se objeví zelené zabarvení. Nadbytkem dusitanu sodného se mění zelené zabarvení rychle v modré a zmizí. Proto přidáváme dusitan sodný velmi opatrně.
Zkouška s roztokem jodu 1 ml moči převrstvíme 1 ml jodové tinktury. V pozitivním případě se na styčné ploše vytvoří zelený prstenec.
Zvýšení (bilirubinurie): onemocnění jaterního parenchymu, invaze parazitů.
Poznámka: Moč k důkazům bilirubinu musí být co nejčerstvější. Bilirubin se na vzduchu snadno oxiduje. U koně je vylučován jako hydrobilirubin. U zdravých psů je bilirubin prokazatelný ve 20 až 60 % vzorků moči při hustotě moči > 1020 g/l.
ŽLUČOVÉ KYSELINY V MOČI Žlučové kyseliny (kyselina cholová, deoxycholová, chenodeoxycholová, lithocholová) vznikají v játrech z cholesterolu, jsou zde konjugovány s glycinem nebo taurinem a ve formě konjugátu vylučovány do duodena jako součást žluče. Snižují povrchové napětí, čímž napomáhají emulgaci tuků a jejich trávení ve střevě. Do moči se žlučové kyseliny dostávají při snížení průchodnosti až blokádě žlučových cest.
Zkouška Pettenkoferova Na styčné ploše mezi koncentrovanou kyselinou sírovou a močí, do které přidáme sacharosu, se za přítomnosti žlučových kyselin vytváří purpurový prstenec.
Ve zkumavce převrstvíme opatrně koncentrovanou kyselinu sírovou močí v níž je rozpuštěno malé množství sacharosy. V přítomnosti žlučových kyselin vznikne purpurový prstenec.
17
MOČOVÝ INDIKÁN (bez modelového vzorku) Činností symbiotické bakteriální mikroflóry vzniká ve střevě z tryptofanu mimo jiné produkt indol (tryptofan bez postranního řetězce). Indol je oxidován na indoxyl (3-hydroxyindol), který po resorpci je v játrech konjugován s kyselinou sírovou (koenzym PAPS donor aktivního sulfátu) a jako netoxický produkt je vyloučen močí (např. u psa 0,010 – 0,030 g/l moči, u koně 0,12 – 0,300 g/l moči). Zvýšení exkrece indikánu: neprůchodnost střev (kolika u koně, cizí těleso, vysoký stupeň naplnění žaludku).
Důkaz patologických součástí moči pomocí diagnostických proužků – srovnání, vyhodnocení metodou vizuální a reflektometrickou.
Úkol: Proveďte důkaz patologických součástí moči pomocí diagnostických proužků-srovnání výsledků metodou vizuální a reflektometrickou. Nastudujte močový sediment pomocí mikroskopických obrazů a doprovodných textů k močovému sedimentu
V rutinní screeningové analýze moči v laboratoři i v terénu se používá vyšetření diagnostickými proužky (stripy). Diagnostické proužky jsou určeny pro klinické biochemické laboratoře vyšetřující lidskou moč,ale lze je použít i ve veterinární medicíně, pokud jsou zohledněny některé zvláštnosti interpretace výsledků (zejména se jedná o vyšetření proteinurie u krav, které mají fyziologicky alkalickou moč, díky které se tato zkouška jeví jako falešně pozitivní. Jedinou zkouškou na proteinurii se tak stává v praxi zkouška s kyselinou sulfosalicylovou).
Manipulace s diagnostickými proužky: jsou dodávány v původním obalu – tubě. Jedna tuba obsahuje konstantní počet proužků v závislosti na výrobci zhruba 50-150. Ve víčku bývá umístěna hygroskopická látka – silikagel, která zabraňuje adsorpci vlhkosti.
Při vyšetření se držíme návodu výrobce, tak jak je to patrné z přiloženého letáčku k diagnostickým
proužkům
(monofunkčním,
polyfunkčním).
Přiložené
letáčky
před analýzami pečlivě prostudujte a dodržujte pracovní postup, který je na nich uveden.
18
DocUReader Charakteristika přístroje: Přístroj DocUReader je určen pro objektivní vyhodnocování diagnostických proužků LabStripU10 nebo LabStripU11 pro analýzu moči.
Příprava vzorku a diagnostického proužku: -
Do vyšší zkumavky si připravte tolik moči, aby do ní bylo možné ponořit všechna reagenční pole diagnostického proužku.
-
Pozor: použijte jen čerstvou, dobře promíchanou moč bez konzervačních prostředků, odebranou do čisté nádoby. Moč při analýze nesmí být starší než 4 h.
-
Z obalu vyjměte jen tolik proužků, kolik budete potřebovat a obal ihned uzavřete víčkem. Nedotýkejte se reagenčních polí proužku.
Zásady správného měření na přístroji: -
Stiskněte tmavomodré tlačítko START a současně ponořte diagnostický proužek do dobře promíchané a čerstvé moči na dobu 1-2 s.
-
Pečlivě odstraňte přebytečnou moč tak, že se podélnou stranou proužku a zespodu dotknete buničité vaty nebo filtračního papíru.
-
Položte proužek na nosič reagenčními poli nahoru.
-
Ujistěte se, že začátek proužku sahá až ke koncovému bloku nosiče a že je proužek správně v nosiči umístěn. Musíte to stihnout do 50 s po smočení diagnostického proužku.
-
Měření začne automaticky po 50 s. Čas zbývající do začátku měření indikují kontrolky, které se zleva rozsvěcují jedna po druhé. Zeleně svítící kontrolky se rozsvěcují každých 5 s (časová rezerva), poslední tři kontrolky jsou červené a představují upozornění (limit času). Měření začne, až se rozsvítí poslední červená kontrolka. Jakmile měření skončí, nosič se vysune do původní polohy. Zároveň se vytiskne výsledek. Pozitivní výsledek je označen hvězdičkou a je také signalizován rozsvícením červené kontrolky u příslušného analytu.
Informace o kontrole přístroje: Pro kontrolu správné funkce přístroje jsou určeny šedé kontrolní proužky, které se dodávají s přístrojem. Kontrolu se doporučuje provádět jedenkrát za tři měsíce a kdykoliv nastanou pochybnosti o správné funkci přístroje. (Kontrola přístroje je už provedena laborantkou). 19
Vypnutí přístroje: -
Vyjměte použitý proužek z přístroje.
-
Vytáhněte síťový adaptér ze síťové zásuvky.
Vyčistěte nosič proužků vlhkým nebo suchým hadříkem tak, aby do přístroje nevnikla vlhkost. Používat se mohou běžné dezinfekční a čistící neagresivní prostředky (ethanol, mýdlová voda). Nosič proužků je třeba čistit jednou denně, podle potřeby i častěji.
Vyšetření močového sedimentu Úkol: Proveďte mikroskopické vyšetření močového sedimentu
Součásti močového sedimentu nastudujete pomocí vytištěných obrázků a textů. Do protokolu zakreslete nejčastěji se vyskytující součásti močového sedimentu. Na cvičení se připravte prohlédnutím webových stránek:
http://sekk.cz/atlas/
Vyšetření močového sedimentu z nekonzervované moči je nutno provést do 1 hodiny po odběru, jinak dochází k výraznému nebo úplnému rozpadu elementů. Močové válce lze přesně analyzovat jen v čerstvé moči do 30 min.
Pracovní postup: Vzorek moči dobře promíchejte a odměřte do zkumavky 10 ml moči. Centrifugujte při 3000 otáčkách po dobu 10 minut. Opatrně odsajte 9 dílů supernatantu. K 0,5 ml močového sedimentu přidejte 50µl barvícího roztoku a jemně promíchejte. Po 5 minutách přeneste 1015µl obarveného sedimentu na podložní sklíčko a překryjte krycím sklíčkem.
Vzorek umístěte do videomikroskopu a orientačně prohlédněte při zvětšení 100-200x. Lze tak posoudit rovnoměrnost rozdělení elementů a je možné vidět vzácně se vyskytující částice, jako jsou válce a epitelové buňky. Pak prohlédněte preparát při zvětšení 400x a vyhodnoťte nález. V případě stanovení počtu elementů lze využít k tomuto účelu počítací komůrku.
20
V mikroskopii močového sedimentu lze kromě mikroskopie v procházejícím světle využít i techniky fázového kontrastu, nebo mikroskopie s polarizačním filtrem.
Mikroskopie v procházejícím světle poskytuje hrubou orientaci při mikroskopii nebarvených preparátů. Pro názorné určení morfologie močového sedimentu se využívá supravitální barvení, které zvýrazňuje buněčné struktury.
Mikroskopie fázového kontrastu slouží pro rychlé vyhodnocení nebarvených preparátů a podrobnějšímu posouzení sedimentu.
Mikroskopie s polarizačním filtrem se využívá pro lepší identifikaci krystalů a tukových tělísek.
K orientačnímu vyšetření močového sedimentu lze využít i diagnostických proužků.
Orientační vyšetření močového sedimentu pomocí diagnostických proužků
Diagnostický proužek (reakční
Ekvivalent při mikroskopickém
zóna)
vyšetření
Krev (hemoglobin / erytrocyty)
Erytrocyty, erytrocytové válce
Leukocyty
Leukocyty, leukocytové válce
Bílkovina
Válce granulární, voskové, hyalinní
Dusitany
Bakterie
Hodnocení nálezu v močovém sedimentu
Močový sediment
- orgánový(buňky, válce) - neorgánový (krystaly)
21
Přehled hlavních součástí močového sedimentu
krevní buňky Buněčné elementy epitelie
erytrocyty leukocyty lymfocyty makrofágy renální tubulární buňky buňky přechodného epitelu dlaždicové epitelie
nádorové buňky
bezbuněčné Válce buněčné
Mikroorganismy
hyalinní granulované voskové tukové erytrocytové leukocytové epitelové bakteriální
bakterie kvasinky trichomonády plísně
Krystaly Základní morfologická charakteristika buněk močového sedimentu Buněčný typ Erytrocyt Granulocyt
Jádro
Cytoplazma
bezjaderný element
diskoidní tělíska
segmentované, vícelaločnaté, jasně granulovaná, obvykle se barví
Makrofág
modré, někdy špatně obarvené červeně často rozbitá modrá jádra, granulární, obsahuje i části
Lymfocyt
nehomogenní chromatin fagocytovaného materiálu velké, hladké jádro, vyplňující tenký okraj cytoplazmy bez
téměř celou buňku granulací degenerované, malé (polygonální) nevýrazná Dlaždicová buňka lokalizované uprostřed hruběji granulovaná Renální tubulární homogenní jasné, kulovité nebo cytoplazma, často buňka oválné, excentricky uložené červená,
22
hustá tmavě
Vybrané krystaly v močovém sedimentu
Druh krystalu
Typický tvar
Močany (uráty)
amorfní
Kyselina močová
různé tvary, "soudky", "rosety"
Močan amonný
kuličky, „trnová jablka“
Uhličitan vápenatý Fosforečnan amonnohořečnatý (triple fosfát) Šťavelan vápenatý
Cholesterol
Cystin
Tyrosin Leucin
Klinický význam
kuličky uspořádané do tvaru činky tvar „víka od rakve“
při infekci močových cest
„obálky“ (dihydrát), „piškoty“
u zdravých jedinců
– (monohydrát)
otrava ethylenglykolem
ploché destičky s odlomeným rohem
šestiboké hranoly
poškození glomerulární membrány
Cystinurie
tenké jehličky ve snopečcích
onemocnění jater
nebo v rozetách
aminoacidurie
olejovité kuličky
onemocnění jater
23
1.2.2
Lyonorm – kontrolní sérum
Lyonorm je kontrolní sérum, založené na séru porcinním, pro klinickou biochemii, obohacené o elektrolyty, substráty a enzymy. Ke každému je přiložen atest, jehož číslo musí souhlasit s číslem šarže na lahvičce kontrolního séra. Uvádí se atestovaná hodnota a rozptyl analýz, které jsou vypočteny s použitím statistických metod z výsledků analýz prováděných v 50 laboratořích v ČR a SR standardizovanými nebo nejčastěji užívanými metodami.
Kontrolní séra je nutné skladovat v temnu a v chladu při teplotách pod +8°C. Dodávají se v lyofilizované formě a ředí se k použití redestilovanou vodou v objemu 3 ml.
Součástí je písemný materiál, který uvádí rozmezí hodnot jednotlivých parametrů biochemické analýzy krevního séra.
Poznámka: Výsledky stanovení Lyonormu slouží pro kontrolu pracovního postupu, zahrnující jak vlastní práci v laboratoři, tak i čistotu a správnost zvolených chemikálií. Pokud je výsledek v rozmezí, které udává výrobce, výsledek, respektive celé měření, je správný a to i bez ohledu na to, jestli je nebo není ve fyziologickém rozmezí. V opačném případě je výsledek nesprávný, i když leží ve fyziologickém rozmezí.
Parametry Lyonormu
Konstituent
Jednotka
Atest
Interval
SUBSTRÁTY Celkový bilirubin
µmol/l
57
50 – 64
Glukosa
mmol/l
16
14,7 – 17,3
Močovina
mmol/l
10,6
9,8 – 11,4
Kreatinin
µmol/l
193
178 – 208
Kyselina močová
µmol/l
358
329 – 387
24
ELEKTROLYTY Osmolalita
mmol/kg
334
317 – 351
Draslík
mmol/l
8,9
8,5 – 9,3
Sodík
mmol/l
142
138 – 146
Chlor
mmol/l
109
104 – 114
Fosfor
mmol/l
3,01
2,77 – 3,25
Vápník
mmol/l
3
2,76 – 3,24
Hořčík
mmol/l
1,54
1,39 – 1,69
Železo
µmol/l
27,1
24,4 – 29,8
ENZYMY Alkalická fosfatasa – ALP
µkat/l
3,25
2,76 – 3,74
Kyselá fosfatasa – ACP
nkat/l
148
126 – 170
µkat/l
1,27
1,08 – 1,46
Aspartataminotransferasa – AST
µkat/l
0,86
0,73 – 0,99
Alaninaminotransferasa – ALT
µkat/l
0,71
0,60 – 0,82
Cholinesterasa – CHE
µkat/l
9,96
7,97 – 11,95
Laktatdehydrogenasa – LDH
µkat/l
29,9
22,4 – 37,4
Kreatinkinasa – CK
µkat/l
193
144,8 – 241,3
Gama-glutamyltransferasa – GMT
LIPIDY Celkový cholesterol
mmol/l
2,28
2,10 – 2,46
Triacylglyceroly
mmol/l
0,75
0,56 – 0,94
HDL cholesterol
mmol/l
0,67
0,57 – 0,77
Celkové proteiny
g/l
63
60 – 66
Albumin
g/l
35
32 – 38
25
1.2.3
Praktická aplikace zásad správné laboratorní praxe ve cvičeních veterinární biochemie
1.2.3.1 Dávkování roztoků
Práce s automatickými pipetami
Automatické pipety (dávkovače) dělíme na: 1) pipety s nastavitelným objemem (viz část A) 2) pipety s konstantním objemem (viz část B)
Ad 1) pipety s objemem v rozmezí 2-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl a 1000-5000 µl Ad 2) pipety s objemem 10 µl, 20 µl, 200 µl a 500 µl
PIPETY
A) PIPETY S NASTAVITELNÝM OBJEMEM
objem v rozmezí: 0,002 – 0,020 ml (2 – 20 µl)
0,002 ml (2 µl)
26
0,010 ml (10 µl)
0,020 ml (20 µl)
objem v rozmezí: 0,020 – 0,200 ml (20 – 200 µl)
0,020 ml (20 µl)
0,100 ml (100 µl)
0,200 ml (200 µl)
objem v rozmezí: 0,200 – 1ml (200 – 1000 µl)
0,200 ml (200 µl)
0,500 ml (500 µl)
1,000 ml (1000 µl)
2 ml (2000 µl)
5 ml (5000 µl)
objem v rozmezí: 1 – 5ml (1000 – 5000 µl)
1 ml (1000 µl)
27
B) PIPETY S KONSTANTNÍM OBJEMEM
objem: 0,010 ml (10 µl)
objem: 0,020 ml (20µl)
1.2.3.
objem: 0,200 ml (200 µl)
28
objem: 0,500 ml (500 µl)
1.2.3.2 Zásady pro správnou laboratorní práci v biochemické laboratoři – laboratorní vybavení
Práce s instrumentální technikou v praktickém cvičení – praktické zásady a poznatky
Při práci s laboratorní technikou ve cvičeních biochemie a biochemických laboratorních metod je třeba dodržovat následující zásady práce:
automatická pipeta – použití automatické pipety se správným dávkovacím rozmezím objemu, použití správné velikosti a objemu špičky (rozlišení barevné žluté, modré a bílé), nastavení správného požadovaného objemu pro odměření činidla nebo roztoku, dodržení dvou poloh – polohy pro nasátí a polohy pro vypuštění tekutiny ze špičky dávkovače,
Zásady pro práci s automatickými pipetami: a) používáme automatické pipety s předepsaným objemem, b) nasávání do pipety provádíme opatrně, abychom zabránili nasátí vzduchové bubliny, c) každá pipeta má dvě polohy – první pro nasátí příslušného objemu a druhá pro jeho vypuštění, c) tekutinu ze špičky automatické pipety vypouštíme stiskem pístu velmi opatrně, d) hlavní zásadou je použití správného kalibru špičky na automatickou pipetu (špičky bílé, modré a žluté), 29
e) některé pipety mají ve svém ústí filtr, který se nesmí odstranit, slouží k její ochraně, f) pipety NIKDY neodkládáme na pracovní stůl, pokud je na nich již jednou nasazena špička.
vodní lázeň (termostat) – určena pro temperování teploty v postupech biochemických analýz, správné nastavení teploty pomocí digitálního ukazatele (v praktických cvičeních bývá nastaveno na 37 a 45 °C), dodržení času inkubace zkumavek ve vodní lázni, správné uzavření prostoru vodní lázně pomocí nerezového víka,
odstředivka (centrifuga) – určena k odstřeďování pomocí odstředivkových zkumavek nebo plastových patron, správné umístění do držáků (nosičů) v bubnu centrifugy, přesné vyvážení zkumavek na analytických vahách pro dodržení rovnovážné polohy v odstředivce, správná manipulace s knoflíkem otáčky a knoflíkem čas pro odstřeďování, obvykle otáčky 3000 ot/min. a čas odstřeďování 10 minut, !POZOR! časový knoflík nastavíme pohybem tzv. „proti směru hodinových ručiček“,
spektrofotometr (Spekol typ 11) – otevření tzv. štěrbiny pro průchod paprsku světla (použít páčku v levé dolní části přístroje), použití správného typu skleněné kyvety (ve vztahu k jeho profilu a objemu analyzovaného roztoku), dostatečný objem měřeného roztoku pro nalití do příslušné kyvety, nastavení správné vlnové délky v nanometrech (nm) pomocí mikrometrického šroubu na přístroji, zařazení rozsahu měření táhlem podle příslušného rozsahu vlnových délek (uvedeno na přístroji).
NÁVOD K POUŽITÍ SPEKTROFOTOMETRU „ SPEKOL 11“
Měření absorbance -
zapněte spektrofotometr čtvercovým tlačítkem vpravo dole na panelu přístroje (zapíná vyučující na začátku praktických cvičení),
-
stiskněte tlačítko s označením „E“ pro měření absorbance (angl. EXTINCTION)
-
nastavte požadovanou vlnovou délku otočným šroubem v nm, pozor na měření s vlnovou délkou nad 620 nm, kdy je nutno povytáhnout zasunovací táhlo u otočného šroubu,
-
proveďte posun páčky pro natočení filtru (vlevo u panelu přístroje od otočného šroubu) do potřebné polohy „otevřené“ nebo „polootevřené“,
-
do připravených skleněných kyvet (k dispozici u přístroje) vložte analyzovaný vzorek (roztok), minimální množství 1 cm na výšku, neplňte plné kyvety, 30
-
připravte si druhou kyvetu s destilovanou vodou nebo roztokem pro slepou zkoušku,
-
kyvetu se vzorkem a slepou zkouškou (destilovanou vodou) vložte do měřící násady, jedna násada je pro vzorek, druhá násada je pro slepý vzorek,
-
proveďte vynulování přístroje stisknutím tlačítka R (Reset),
-
při hodnotě 0,000 na display zasuňte kyvetu se vzorkem a zapište absorbanci
-
kyvetu vysuňte, vylijte vzorek, kyvetu řádně opláchněte destilovanou vodou, osušte ji buničitou vatou,
-
pokračujte v dalším měření všech připravených vzorků,
-
kyvety vypláchnuté destilovanou vodou umístěte do připravené skleněné vaničky s buničitou vatou,
-
přístroj nevypínejte, pouze uzavřete štěrbinu, převeďte do režimu „OFL“ stisknutím tlačítka R a ponechte v provozu pro další studenty.
mineralizační zařízení pro spalování vzorků (mokrá cesta mineralizace vzorků) – spalování provádět v předepsaném čase alespoň 2 hodiny pro dostatečnou mineralizaci vzorku (určeno pro analýzu Kjeldahlovou metodou),
laboratorní třepačka – správné umístění zkumavky s roztokem do středu plastového kotouče míchačky, použití dostatečného časového intervalu a rychlosti otáček nastavením ovládacím knoflíkem, zabezpečí se tím dokonalé promíchání směsi ve zkumavce,
práce s digestoří – při práci v digestoři pracujeme zásadně se zapnutým odtahem (zapíná se spuštěním zeleného tlačítka na digestoři), po ukončení práce vypneme pomocí červeného tlačítka na digestoři, nedojde k vypnutí ihned, ale po určitém časovém intervalu (v minutách).
1.2.3.3 Interpretace laboratorních výsledků v biochemické analýze Interpretace laboratorních výsledků při analýze modelových vzorků je významnou součástí analýzy. Získané výsledky kvalitativních důkazů (průkazů) a kvantitativních analýz hodnotíme podle stanovených kritérií.
V případě kvalitativních důkazů jde o průkaz přítomnosti (ano/ne), s využitím většinou subjektivního hodnocení výsledku analýzy. Jedná se např. o vznik barevných reakcí, barevných nebo bezbarvých sraženin, amorfních struktur, či jiných výsledků kvalitativních důkazů. V případě kvantitativní analýzy (vážkové analýzy - gravimetrie, odměrné analýzy 31
volumetrie nebo instrumentální analýzy s využitím instrumentálních metod) jde nejčastěji o porovnání získaných hodnot s fyziologickými hodnotami.
U potravin a potravinových surovin se jedná nejčastěji o hodnocení zdravotní nezávadnosti a jakosti podle stanovených ukazatelů v příslušných právních předpisech. Hodnoty vycházejí z příslušné legislativy.
Bývají uváděné jako fyzikálně-chemické požadavky s uvedením
parametru, jeho hodnoty, resp. rozmezí hodnot a jednotky.
Interpretace výsledků má značný význam, neboť je nedílnou součástí posouzení zdravotní nezávadnosti
(bezpečnosti,
z anglického
food
safety)
a
jakosti
daných
potravin
a potravinových surovin živočišného i rostlinného původu.
Jako praktické příklady parametrů v návaznosti na biochemické hodnocení uvádíme u rostlinných komodit obsah vody, obsah NaCl v sušině, kyselost, obsah tuku, obsah některých kyselin, obsah etanolu, obsah cukru, obsah oxidu uhličitého, obsah nerozpustných látek ve vodě, obsah sacharózy, glukózy a fruktózy, vitaminů, minerálních látek, apod. U komodit živočišného původu obsah vody, obsah tuku, obsah soli, volných mastných kyselin, laktózy, hydroxymetylfurfuralu, enzymatická aktivita diastázy, obsah sacharózy, obsah vybraných nutrientů (minerálních látek, proteinů, cukrů, lipidů), poměrový ukazatel kolagen/svalová bílkovina, titrační kyselost pro potravinářský kasein, číslo kyselosti, peroxidové číslo, obsah histaminu, apod.
Interpretace výsledků se uplatňuje i v rámci přípravy systémů zabezpečování jakosti, v potravinářství
např.
systém
HACCP
a
jeho
praktická
aplikace
v jednotlivých
potravinářských technologiích.
Při interpretaci výsledků v biochemické laboratoři klinického charakteru je důležité se řídit těmito zásadami (informace pro studenty): -
uvědomit si hned na začátku, z jakého zvířete zkoumaný vzorek (krevní sérum, moč.) pochází
-
nesnažit se napasovat změřené a vypočítané výsledky na referenční hodnoty nějakého druhu zvířete, ale naopak posuzovat referenční hodnoty ve vztahu ke známému druhu
-
výsledek, který spadá do referenčního rozmezí, ještě nemusí být správný
32
-
výsledek, který je nad nebo pod referenčním rozmezí může být správný, v tomto případě je třeba si uvědomit, jaká(é) příčina(y) mohly elevaci hodnot vyvolat a uvažovat o diferenciální diagnostice (např. u ALT/AST).
1.2.3.4 Příklady biochemických parametrů krevní plasmy
1. Enzymy
ALT = alaninaminotransferasa -
katalyzuje reakci alaninu a 2-oxoglutarátu za vzniku pyruvátu a glutamátu (pyridoxylfosát)
-
cytoplasmatický enzym
-
nejvyšší aktivita v hepatocytech
-
zvýšená aktivita: poškození jaterního parenchymu – zánět, infekce, sepse, steatóza, akutní pankreatitida
AST = aspartátaminotransferasa -
katalyzuje reakci aspartátu a 2-oxoglutarátu za vzniku oxalacetátu a glutamátu
-
cytoplasmatický i mitochondriální enzym
-
nejvyšší aktivita ve svalovině – kosterní, srdeční a v játrech
-
u přežvýkavců je specifičtější marker onemocnění jater než ALT
-
zvýšená aktivita: poškození kosterní svaloviny, myokardu, jaterního parenchymu (jako u ALT)
GMT/GGT = γ-Glutamyltransferasa -
katalyzuje přenos aminokyselin do buněk
-
membránový enzym
-
nejvyšší aktivita v játrech a buňkách žlučovodů
-
zvýšená aktivita: onemocnění jater, žlučovodů, marker oxidačního stresu
CK = Kreatinkinasa -
katalyzuje fosforylaci kreatinu na kreatin fosfát (jedná se o reversibilní reakci)
-
má tři isoenzymy – MM (kosterní svaly), MB (myokard), BB (mozek)
-
zvýšená aktivita: poškození kosterní, srdeční svaloviny 33
LDH/LD = laktátdehydrogenasa -
katalyzuje hydrogenaci pyruvátu na laktát (jedná se o reversibilní reakci)
-
má pět isoenzymů složených z H a M podjednotek (H4, H3M1, H2M2,H1M3, M4)
-
cytoplasmatický enzym
-
nejvyšší aktivita ve svalech, játrech, erytrocytech
-
zvýšená aktivita: hepatopatie, myopatie, hemolýza
ALP = alkalická fosfatasa -
katalyzuje defosforylaci molekul v alkalickém prostředí
-
má tři isoenzymy – kostní, střevní a placentární
-
zvýšená aktivita: onemocnění kostí, jater, žlučových cest
2. Minerální látky
Hořčík -
kofaktor řady enzymů (zejména kinasy), podílí se na nervosvalové činnosti, potlačuje depresivní stavy, působí na oběhový systém, prevence infarktu, předčasný porod a potrat, zdravý chrup, prevence vzniku ledvinových a žlučníkových kamenů, uklidňující prostředek
-
zvýšená koncentrace (hypermagnesiemie) při metabolické acidóze, selhání ledvin, dehydrataci
-
snížená koncentrace (hypomagnesiemie) při deficitu v krmné dávce, malabsorpci, ztráty při průjmech
Vápník -
zejména extracelulární prvek
-
vyskytuje se ve formě volné (Ca2+) a vázané na albumin
-
zastává významnou úlohu v metabolismu kostí a srážení krve, podílí se na hemokoagulaci, působí jako druhý posel
-
zvýšená koncentrace (hyperkalcemie) – hypervitaminóza vit. D, tumory kostí, primární hyperparatyreóza, metabolická acidóza
-
snížená koncentrace (hypokalcemie) – rachitis, sekundární hyperparatyreóza, renální selhání, poporodní paréza dojnic, strava bohatá na oxaláty 34
Anorganický fosfor -
spolu s vápníkem a hořčíkem se podílí na tvorbě kostí a zubů, udržování acidobazické rovnováhy, ukládání a uvolňování energie, je složkou nukleových kyselin, snižuje bolesti při artritidě
-
zvýšená koncentrace (hyperfosfatemie) – při hypoparatyreóze, hypervitaminóze vid. D, metabolické acidóze, renální selhání
-
snížená koncentrace (hypofosfatemie) – hyperparatyreóza, Cushingův syndrom, metabolická alkalóza, aplikace kortikoidů
3. Další významné biochemické parametry -
glukosa, kyselina mléčná (laktát)
-
albumin, celkové proteiny, močovina, kreatinin, cystatin C, amoniak
-
cholesterol, TAG, žlučové kyseliny, bilirubin
Biochemie různých forem ikteru
Bilirubin Typy ikteru plasma/sérum Prehepatální
zvýšený
(hemolytický)
(nekonjugovaný)
Hepatální
zvýšený
(hepatocelulární) (konj./nekonjug.) Posthepatální
zvýšený
(obstrukční)
(konjugovaný)
moč
-
Urobilinogen Feces (deriváty) zvýšené
konjug.
konjug.
35
normální/ snižené snížené/ acholické
plasma/sérum
moč
zvýšené
zvýšené
snížený / zvýšený
snížený/ žádný
snížený / zvýšený snížený/ žádný
2 BIOCHEMICKÁ PROBLEMATIKA MEDU 2.1 TEORETICKÁ ČÁST Med je komodita živočišného původu. Je definován ve vyhlášce č. 76/2003 Sb., kterou se stanoví požadavky na přírodní sladidla, med, cukrovinky, kakaový prášek a směsi kakaa s cukrem, čokoládu a čokoládové cukrovinky, ve znění vyhlášky č. 43/2005 Sb. ___________________________________________________________________________
Vybraná ustanovení vyhlášky č. 76/2003 Sb., ve znění pozdějších předpisů:
Definice medu (ve smyslu ustanovení § 7 vyhl. č. 76/2003 Sb., ve znění pozdějších předpisů.
Med je potravina přírodního sacharidového charakteru, složená převážně z glukózy, fruktózy, organických kyselin, enzymů a pevných částic zachycených při sběru sladkých šťáv květů rostlin (nektar), výměšků hmyzu na povrchu rostlin (medovice) nebo na živých částech rostlin včelami (Apis molifera), které sbírají, přetvářejí, kombinují se svými specifickými látkami, uskladňují a nechávají dehydratovat a zrát v plástech,
Vyhláška dále v souvislosti s medem definuje následující pojmy:
medem květovým (nektarovým) - med pocházející zejména z nektaru květů,
medem medovicovým - med pocházející zejména z výměšků hmyzu (Hemiptera) sajícího z rostlin na živých částech rostlin nebo ze sekretů živých částí rostlin,
pastovým medem - med, který byl po získání upraven do pastovité konzistence a je tvořen směsí jemných krystalů,
vytočeným medem - med získaný odstřeďováním odvíčkovaných bezplodových plástů,
plástečkovým medem - med uložený a zavíčkovaný včelami do bezplodových plástů čerstvě postavených na mezistěnách vyrobených výhradně ze včelího vosku nebo bez nich a prodávaný v uzavřených celých plástech nebo dílech takových plástů, 36
vykapaným medem - med získaný vykapáním odvíčkovaných bezplodových plástů,
medem s plástečky - med, který obsahuje jeden nebo více kusů plástečkového medu,
lisovaným medem - med získaný lisováním bezplodových plástů za použití mírného ohřevu do 45 st.C nebo bez použití tepla,
filtrovaným medem - med, který byl po získání upraven odstraněním cizích anorganických nebo organických látek takovým způsobem, že dochází k významnému odstranění pylu,
pekařským medem (průmyslovým medem) - med určený výhradně pro průmyslové použití nebo jako složka do jiných potravin; může mít cizí příchuť nebo pach, může vykazovat počínající kvašení nebo mohl být zahřát.
Členění medu:
a) podle původu 1. květový 2. medovicový
b) podle způsobu získávání a úpravy 1. vytočený med 2. plástečkový med 3. lisovaný med 4. vykapaný med 5. med s plástečky 6. filtrovaný med 7. pastový med
Označování medu
Kromě údajů uvedených v zákoně a v prováděcím právním předpisu se med dále označí a) podle jeho původu podle § 8 písm. a) a podle způsobu jeho získávání a úpravy podle § 8 písm. b); v případě, že se jedná o vytočený med, nemusí být způsob získávání a úpravy 37
uveden, b) zemí původu, kde byl med získán; pokud se jedná o směs medů pocházejících z více zemí Evropské unie nebo ze třetích zemí, lze jej označit příslušným názvem:
1. "směs medů ze zemí ES", 2. "směs medů ze zemí mimo ES", 3. "směs medů ze zemí ES a ze zemí mimo ES".
Označení medu, s výjimkou filtrovaného medu a pekařského medu (průmyslového medu), může být doplněno následujícími údaji:
a) regionálním, územním nebo místním označením původu, pokud výrobek pochází zcela z uvedeného zdroje původu, b) ve vztahu k původu medu [§ 8 písm. a)] názvem "jednodruhový" nebo "smíšený", c) druhem rostlin, z nichž pochází, pokud výrobek pochází zcela nebo převážně z uvedeného druhu a má odpovídající organoleptické, fyzikálněchemické a mikroskopické charakteristiky, d) specifickými kritérii jeho jakosti.
Pekařský med (průmyslový med) se kromě údajů uvedených v zákoně a v prováděcím právním předpisu označí slovy "pekařský med" nebo "průmyslový med" a dále zemí původu podle odstavce 1 písm. b).
Pekařský med (průmyslový med) musí být na všech obalech označen v blízkosti názvu údajem, že med je určen pouze na vaření, pečení nebo jiné zpracování.
Pokud je pekařský med (průmyslový med) použit jako složka potraviny, může být v názvu této potraviny použit termín "med" namísto termínu "pekařský med" nebo "průmyslový med"; v seznamu složek se však vždy uvede název "pekařský med" nebo "průmyslový med".
Přípustné záporné hmotnostní odchylky u spotřebitelského balení jsou uvedeny v příloze č. 3 tabulce 3.
38
Požadavky na jakost
Do medu nesmí být přidány, s výjimkou jiného druhu medu, žádné jiné látky včetně přídatných látek.
Z medu nesmí být odstraněn pyl ani jakákoli jiná složka, s výjimkou případů, kdy tomu při odstraňování cizích látek, zejména filtrací, nelze zabránit.
Med, s výjimkou pekařského (průmyslového) medu, nesmí
a) mít jakékoliv cizí příchutě a pachy, b) začít kvasit nebo pěnit, c) být zahřát do takové míry, že jeho přirozené enzymy jsou zničeny nebo se stanou neaktivní.
U medu nesmí být uměle změněna kyselost.
Filtrovaný med a pekařský (průmyslový) med nesmí být přidáván do jiných medů uvedených v § 8.
Součástí vyhlášky je příloha č. 3, která definuje smyslové požadavky (konzistenci a vzhled, chuť, barva), fyzikálně-chemické požadavky (součet obsahu glukózy a fruktózy, obsah sacharózy, obsah vody, kyselost, hydroxymetylfurfural, obsah ve vodě nerozpustných látek, elektrická vodivost, aktivita diastázy).
Jednotlivé ukazatele charakterizují:
Obsah vody – při obsahu vody vyšším než 20% může být nastartován proces zkvašení, limit vyhláškou je do 20% včetně,
Obsah glukózy a fruktózy – jde o kvalitativní parametr medu, který je měřítkem pro rozlišení druhů medu,
Obsah sacharózy – menší obsah má význam pro stravitelnost medu,
39
Elektrická konduktivita – určuje zařazení do kategorií medu.
Smyslové hodnocení medu
Hodnotí se barva, vzhled, konzistence a vůně.
Barva medu – žlutá barva, barva světlá (nektarové a smíšené medy), tmavá barva (medovicové medy). Medy přehřáté vlivem karamelizace jsou tmavší než nezahřáté vzorky.
Vzhled medu – čirý, mírná opalescence, v případě, že není med zkrystalizovaný.
Konzistence medu – tekutá, po určité době krystalizuje, po krystalizaci hustě kašovitý, krystalizace může být přirozená nebo může jít o tzv. pastovaný med.
Vůně – charakteristická podle původu medu.
Poznámka: V rámci senzorického hodnocení degustátor hodnotí 6 vzorků medu, kdy se posuzuje chuť, konzistence a vůně. Mezi vzorky se konzumuje voda a nakrájený rohlík.
Fyzikálně chemické metody stanovení parametrů medu
Stanovení vody refraktometricky – hodnotí se refraktometrem se stupnicí indexu lomu, podle hodnoty indexu lomu při teplotě 20 °C se stanoví obsah vody v % (podle tabulek).
Interpretace parametru obsahu vody: Legislativa – 20 % (% hmotnosti nejvýše pro med květový a medovicový), vyšší obsah znamená sníženou údržnost medu nebo může jít o med, který začíná kvasit.
Stanovení obsahu cukrů – jde o stanovení glukózy a fruktózy (redukujících cukrů) a stanovení sacharózy. - redukující cukry – stanovení oxidoredukční titrací s využitím Fehlingova roztoku, - stanovení sacharózy – stanovení oxidoredukční analýzou, stanovení polarizací s využitím optické aktivity medu. 40
Titrační kyselost – stanovení neutralizační analýzou (alkalimetrické stanovení s využitím NaOH jako odměrného roztoku, indikátor fenolftalein), vyjádří se jako miliekvivalent na 1 kg medu.
Stanovení obsahu pevných látek ve vodě nerozpustných – jde o vážkovou metodu (gravimetrické stanovení),
Stanovení elektrické vodivosti – závisí na množství minerálních látek v medu. Čím je obsah vyšší, tím je i vyšší elektrická vodivost. Jde o konduktometrické stanovení.
Stanovení diastatické aktivity – jde o stanovení enzymu rozkládajícího škrob (diastázy), stanoví se barevnou reakcí s jódem a následně spektrofotometricky. Při stanovení se provádí slepý pokus na roztok škrobu a vlastní stanovení.
Stanovení hydroxymetylfurfuralu – spektrofotometrické stanovení nebo stanovení pomocí chromatografie HPLC.
Vlastnosti medu a vybrané biochemické aspekty
Krystalizace medu – jako jednu ze základních vlastností ji uvádí ve své práci Vorlová a kol. (2002). Vlastní krystalizace medu je vznik krystalků glukózy, kdy med se stává méně tekutým a získává pastovitou konzistenci.
Krystalizace medu je závislá na: - teplotě skladování medu (nejrychlejší při 15 ° C), - složení medu (podílu fruktózy, koloidů, vody, necukerných a minerálních látek).
Z cukrů má nejvyšší aktivitu vzhledem ke krystalizaci glukóza. Významným aspektem je poměr glukózy a fruktózy. Čím více glukózy, tím je krystalizace medu rychlejší.
Sladkost medu – sladká chuť je u různých druhů medů odlišná. Nejvyšší sladkost vykazuje monosacharid fruktóza.
41
Sladká chuť medu je ovlivněna následující faktory: - podíl monosacharidu fruktózy, - teplota, neboť při nižší teplotě se sladkost fruktózy zvyšuje, - přítomnost kyselin.
Viskozita medu – med má poměrně vysokou viskozitu, kterou ovlivňuje obsah monosacharidů. Viskozitu medu zvyšují koloidní látky.
Složení (vybrané složky) a ukazatele medu (Belitz a Grosch, 1992, In Vorlová a kol., 2002)
Průměrná hodnota (%)
Rozpětí hodnot (%)
Voda
17,2
13,4-22,9
Fruktosa
38,2
27,3-44,3
Glukosa
31,3
22,0-40,8
Sacharosa
1,3
0,3-7,6
Maltosa
7,3
2,7-16,0
Vyšší cukry
1,5
0,1-8,5
Minerální látky
0,17
0,02-1,03
Průměrná hodnota
Rozpětí hodnot
Celková kyselost
29,1
8,7-59,5
pH
3,9
3,4-6,1
Diastázové číslo
20,8
2,1-61,2
Komponent
Ukazatel
Zastoupení vybraných látek v medu
ENZYMY MEDU -
invertasa (sacharasa) – invertuje sacharosu na fruktosu a glukosu
-
glukosooxidasa – oxiduje glukosu na kyselinu glukonovou a peroxid vodíku, který je považován za součást antibakteriálních vlastností medu, optimální pH 6,1
-
amylasa (diastasa) – štěpí škroby obsažené v medu, jde o termolabilní enzym, jeho nízká aktivita je ukazatelem zahřátí medu, optimální pH 5,0 - 5,3
ORGANICKÉ KYSELINY -
med obsahuje asi 19 organických kyselin, hlavní kyselina je kyselina glukonová, druhou 42
je kyselina jablečná
MINERÁLNÍ LÁTKY -
celkový obsah 0,02-1,0 %, nejvyšší obsah je draslíku (světlé medy 205 mg/kg, tmavé medy 1676 mg/kg), dále zastoupen vápník, sodík, hořčík, fosfor, železo, síra, chlor, mangan, měď
VITAMINY -
zastoupen thiamin, riboflavin, niacin, pyridoxal, kyselina pantotenová a vitamin C (kyselina L-askorbová)
AMINOKYSELINY MEDU -
je zastoupena celá řada aminokyselin, nejvyšší podíl má prolin (59,65 mg/100 g), dále se v medu nachází fenylalanin, asparagin, tyroxin, histidin, tryptofan, kyselina asparagová, kyselina glutamová, alanin, glycin, cystin, valin, methionin, isoleucin, lysin, ornitin, arginin, leucin.
Pro celkový kontext odborných informací je třeba uvést, že vedle fyzikálně-chemického hodnocení se provádí i tzv. pylová analýza medu v úrovni kvalitativní a kvantitativní a dále mikrobiologická analýza medu.
Poznámka: Závěrem k problematice medu si dovolíme uvést informace týkající se využití medu publikované prof. MVDr. Vorlovou, Ph.D. s kolektivem (2002): -
protistresové účinky medu (vitaminy B1, B6 a hořčík),
-
pozitivní vliv na jeterní činnost (obsah cholinu – tj. lipotropní faktor, regenerace metabolismu tuků v játrech),
-
med má pozitivní vliv na snížení krevního tlaku (zastoupení hořčíku a draslíku),
-
pozitivně působí proti zubnímu kazu, má baktericidní účinek na bakterie zubního kazu.
43
2.2 PRAKTICKÁ ČÁST 2.2.1
Stanovení kyselosti medu
Úkol: Stanovte kyselost vzorků medu.
Princip: Stanovení kyselosti medu je založeno na alkalimetrickém stanovení s využitím odměrného roztoku hydroxidu sodného (NaOH) titrační metodou na acidobazický indikátor fenolftalein. Jde o metodu analytické chemie kvantitativní, odměrnou (volumetrickou) z acidobazických titrací (alkalimetrie).
Reagencie: -
Hydroxid sodný (c = 0,1 mol/l)
-
Fenolftalein (c = 1% etanolový roztok)
Pracovní postup: 1) navážíme 10 g medu (v případě tmavého medu činí navážka 5 g – pozor u hodnocení výsledku nutno násobit dvěma), 2) přidáme 75 ml destilované vody a rozmícháme tyčinkou, 3) přidáme 5 kapek fenolftaleinu, 4) titrujeme 0,1M-NaOH do stálého růžového zbarvení, které vydrží po dobu 10 sekund, vlastní titraci je nutno provést během 1 minuty, 5) výslednou spotřebu NaOH odečteme na desetiny mililitru.
Výpočet: Kyselost medu je vyjádřena jako miliekvivalent kyseliny na 100 g medu. Výsledek se vyjádří jako spotřeba NaOH, tj. kyselost medu. Při analýze navážky 5 g vzorku medu se výsledná spotřeba vynásobí dvěma.
Zhodnocení výsledku: Hodnoty kyselosti medu – med květový, med medovicový, med pekařský
44
Legislativní požadavky: Příloha č. 3 k vyhlášce č. 76/2003 Sb., kterou se stanoví požadavky pro přírodní sladidla, med, cukrovinky, kakaový prášek a směsi kakaa s cukrem, čokoládu a čokoládové bonbony, ve znění vyhlášky č. 43/2005 Sb. Ve smyslu tabulky 2 – Fyzikální a chemické požadavky Požadavek kyselost (mekv/kg nejvýše): Med květový – 50,0 Med medovicový – 50,0 Med pekařský (průmyslový) – 80,0 Poznámka: § 10 odst. 4 vyhlášky u medu nesmí být uměle změněna kyselost.
2.2.2
Stanovení aldóz medu
Úkol: Stanovte redukující cukry medu rozhodčí metodou.
Princip: Stanovení redukujících cukrů je založeno na využití odměrné analýzy – oxidoredukční titraci Fehlingova roztoku na indikátor.
Reagencie: -
Fehlingův roztok I
-
Fehlingův roztok II
-
Roztok invertního cukru c = 1%
-
Roztok invertního cukru c = 0,2%
-
Indikátor
-
Suspenze hydroxidu hlinitého
Pracovní postup: Konkrétní aplikační list k provedení úlohy bude součástí materiálů na praktická cvičení podle získaných druhů vzorků medu.
Výpočet: Bude součástí aplikačního listu v praktických cvičeních. 45
3 BIOCHEMICKÁ PROBLEMATIKA VITAMINU C 3.1 TEORETICKÁ ČÁST Vitamin C (kyselina L-askorbová) je významnou biomolekulou se svými typickými účinky v biochemických dějích a ve vztahu ke zdraví organismu.
Chemicky jde o derivát glukosy. Endiolové uspořádání na uhlících C2 a C3 molekuly dodává kyselině askorbové silné redukující účinky, kdy redukuje např. molekulární kyslík, cytochrom a, cytochrom c. Má antioxidační účinky. Její dehydrogenací vzniká kyselina Ldehydroaskorbová.
Účast vitaminu C v biochemických dějích: 1) Účastní se syntézy kolagenu, kdy je nutná pro hydroxylaci aminokyseliny prolinu na hydroxyprolin. Při nedostatku kyseliny L-askorbové je syntetizovaný kolagen nedostatečně hydroxylován, což se projeví poruchou krevních cév, dochází ke vzniku krvácivých stavů (onemocnění skorbut). 2) Kyselina L- askorbová usnadňuje absorpci železa ze střeva, kdy železnaté ionty jsou lépe resorbovány ze střeva než železité. 3) Účastní se syntézy žlučových kyselin, steroidgeneze v kůře nadledvin, syntézy adrenalinu z tyrosinu, udržuje metalo-kofaktory v redukovaném stavu, např. měďnatý iont v monooxygenázách, železnatý iont v dioxygenázách. Fyziologicky má vitamin C pro organismus člověka značný význam v souvislosti s účastí v metabolismu. Doporučený příjem je 80mg/ os /den (Směrnice Komise 2008/100/ES ze dne 28. října 2008, kterou se mění Směrnice Rady 90/496/EHS o nutričním označování potravin, pokud jde o doporučené denní dávky, převodní faktory pro energetickou hodnotu a definice).
Kyselina askorbová je důležitá pro mnoho fysiologických funkcí. Většina z těchto funkcí využívá redoxní potenciál kyseliny askorbové, která hraje spolu s tokoferolem a redukovaným glutathionem důležitou roli v systému antioxidační ochrany organismu. Je hlavním ve vodě rozpustným antioxidantem v plasmě a v tkáních.
46
Nejlepším zdrojem vitaminu C je ovoce a zelenina, dále pak orgány jako jsou játra a ledviny, naopak velmi malé množství je ve svalovině a minimální množství je v mléce, vejcích a medu. Rostliny syntetizují kyselinu askorbovou z karbohydráz a nejvyšší obsah mají například semena hlohu, černý rybíz, šípky, guava, jahody a citrusové plody. Ze zeleniny je to pak kapusta, paprika, brokolice, petržel a špenát.
Biosyntéza vitaminu C (kyseliny L-askorbové):
Pravděpodobně všechny zelené rostliny a většina živočichů (až na výjimky - např. člověk, někteří primáti a morče), jsou schopni vitamin C syntetizovat z glukosy přes cestu kyseliny glukuronové. Enzymy k tomu potřebné jsou lokalizovány v ledvinách obojživelníků, plazů a některých starších řádů ptáků. Pro ostatní ptáky a většinu savců platí, že jsou lokalizovány v játrech. Přesunutí syntézy vitaminu C z ledvin do většího orgánu jakými jsou játra savců a ptáků, pravděpodobně souvisí s větší potřebou syntézy teplokrevných živočichů. Zajímavá je stimulace syntézy kyseliny askorbové po expozici xenobiotiky, jako následek zvýšení produkce kyseliny glukuronové, která slouží ke konjugaci xenobiotik při jejich detoxikaci v organismu.
Některé skupiny zvířat ztratily během evolučního vývoje schopnost syntézy kyseliny askorbové. Nemohou exprimovat poslední enzym v syntéze L-gulonolakton oxidázu, který katalyzuje oxidaci L-gulonolaktonu na L-2-ketogulonolakton, který se pak spontánně izomeruje na kyselinu L-akorbovou.
Druhy živočichů, které jsou schopné vlastní syntézy, absorbují kyselinu askorbovou pouze pasivně. Naopak živočichové, kteří vyžadují přísun kyseliny askorbové potravou, absorbují vitamin C jak pasivním tak aktivním způsobem.
Transport plasmou je pak převážně
v redukované formě.
Oxidace kyseliny askorbové:
Kyselina askorbová je oxidována postupným odštěpením celkem dvou vodíků nejdříve reversibilně na kyselinu monodehydroaskorbovou dehydroaskorbovou.
47
a poté ireversibilně na kyselinu
askorbát
monodehydroaskorbát
dehydroaskorbát
Aby si kyselina askorbová zachovala antioxidační potenciál, je regenerována enzymaticky reduktasami nebo pomocí redukované formy glutathionu.
Funkce kyseliny askorbové v organismu: Biochemický redoxní systém, prooxidační potenciál (v přítomnosti Fe3+, Cu2+), funkce kosubstrátu pro monooxygenasy, účastní se syntézy kolagenu, katecholaminů jako donor elektronu pro dopamin β-monooxigenasu, při syntéze karnitinu je kofaktorem hydroxylasy, jako kyselina glukuronová se podílí na detoxikaci xenobiotik, slouží jako neenzymový antioxidant v systému ochrany proti peroxidaci lipidů, oxidaci proteinů a DNA volnými radikály kyslíku a dusíku.
Deficience vitaminu C a její projevy:
Denní doporučená dávka dle směrnic EU pro vitamin C je 80 mg na osobu. Obecně se doporučený denní příjem pohybuje od 60 do 200 mg, při zvýšení až na 1000 mg na den pro osoby po nemoci, nebo pro pacienty s respiračními a jinými chorobami. Nejznámějším projevem nedostatku vitaminu C jsou kurděje (skorbut), ale deficience se projevuje různými symptomy od únavy, nechutenství, poklesu imunity. Závažnými příznaky jsou atrofie kosterních svalů nebo zvýšená krvácivost kapilár.
Pokud je omezen nebo zcela zastaven přísun vitaminu C pro člověka, projeví se nedostatek jako kurděje neboli skorbut. Primárně se deficience projeví na mezenchymální tkáni jako defekt kolagenu, dále pak jako hemoragie v kůži, orgánech, kloubech a ve svalech, zeslabení kolagenních struktur v kostech či chrupavkách a jako výrazný symptom vypadáváním zubů. Malnutrice spojená s deficiencí vitaminu C u dětí je popisována jako Möeller-Barlowova choroba u dětí se stejnými projevy, jako má skorbut u dospělých.
48
Příznaky nedostatku vitaminu C u zvířat jsou pozorovány zejména u morčat, jako nepravidelný růst, hematomy (zvláště na zadních končetinách), velmi křehké kosti a jejich zvýšená lámavost. Obecně jsou pak pozorovány obdobné symptomy jako u lidí.
3.2 PRAKTICKÁ ČÁST 3.2.1
Stanovení obsahu kyseliny askorbové ve vlastní moči
Teoretická příprava: Biosyntéza kyseliny askorbové, funkce vitaminu C v organismu.
Úkol: Proveďte jodometrické stanovení koncentrace kyseliny askorbové ve vlastní moči.
Princip: Kyselina L-askorbová (vitamin C, lakton 2-oxo-L-gulonové kyseliny, m.h. = 176,12) obsahuje endiolové seskupení (tj. dva hydroxyly na dvojné vazbě) a působí silně redukčně. Po oxidaci za odštěpení vodíků přechází askorbát na dehydroaskorbát. V kyselém prostředí lze stanovit koncentraci kyseliny askorbové titrací odměrným roztokem jodu dle následující rovnice. Při indikaci bodu ekvivalence škrobovým indikátorem je výsledné zbarvení roztoku modré.
Rovnice reakce:
Askorbát
Dehydroaskorbát
Metoda stanovení je vhodná pro vodné roztoky kyseliny askorbové bez látek redukovatelných kyselinou askorbovou. U ostatních vzorků, pokud nejsou aplikovány postupy eliminující 49
rušící látky, je stanovení pouze orientační. Mezi látky redukované kyselinou askorbovou patří například bílkoviny, redukující cukry, antibiotika a látky s disulfidickými skupinami.
Reagencie: -
Roztok jodu c = 5 mmol/l
-
Roztok škrobu c = 1% - jako indikátor
-
Kyselina sírová c = 0,1 mol/l
-
Standardní roztok kyseliny askorbové c = 0,05%
Pracovní postup: Byretu naplníme odměrným roztokem jodu. K 5 ml moči v titrační baňce přidáme 0,5 ml 0,1 mol/l kyseliny sírové a 1 ml škrobového indikátoru. Za krouživého promíchávání titrujeme roztokem jodu, dokud se nadbytkem jodu nezbarví titrovaný roztok do stálého modrého zbarvení. Poté nedotitrováváme, i když se později zbarvení změní. Analýzu proveďte minimálně 2x. Další vzorek připravte těsně před titrací, jinak může dojít ke snížení spotřeby odměrného roztoku jodu vlivem vzdušné oxidace kyseliny askorbové. Spotřebu roztoku jodu odečteme na desetiny ml.
Z výsledků titrací vypočtěte průměrnou hodnotu a použijeme pro výpočet výsledné koncentrace kyseliny askorbové ve vlastní moči (pozor – stanovujete v 5 ml moči). Stejným pracovním postupem jako vzorek zpracujeme 5 ml standardního roztoku kyseliny askorbové.
Výpočet a vyhodnocení výsledků:
K výpočtu koncentrace kyseliny askorbové v moči použijeme trojčlenku a následující teoretický vztah, který byl vypočten pro daná činidla z výše uvedené rovnice chemické reakce:
1 ml roztoku jodu 5 mmol/l odpovídá 0,8807 mg kyseliny askorbové.
Vylučování kyseliny askorbové močí přepočtěte na diurézu muže – 2 000 ml moči/24 hod., ženy 1 500 ml moči/24 hod.
50
Vylučování kyseliny askorbové (vitaminu C) močí se pohybuje od 0,02 g až do 0,1 g/1000 ml moči.
Saturační test: Pro posouzení dotace organismu vitaminem C je možné provést „saturační“ test, ve kterém je sledována saturace organismu vitaminem C stanovením množství kyseliny L-askorbové vyloučené močí během 3 hodin po vypití roztoku obsahujícího 1 g této látky.Tři hodiny před analýzou kyseliny askorbové v moči se pacient vymočí. Poté ihned vypije roztok obsahující 1 g vitaminu C. Těsně před analýzou se opět vymočí a objem moči se změří. Dle uvedeného pracovního postupu se stanoví koncentrace kyseliny askorbové v moči jodometrickou titrací a vypočítá se množství kyseliny askorbové v naměřeném objemu moči (Mr= 176,12). Vyhodnocení výsledku: Organismus je saturován vitaminem C, vyloučí–li se během tříhodinové periody více než 50 mg kyseliny askorbové.
3.3 VITAMIN C
A JEHO OBSAH VE VYBRANÝCH KOMODITÁCH OVOCE
A ZELENINY
Nejlepším zdrojem vitaminu C je ovoce a zelenina, dále pak orgány jako jsou játra a ledviny, naopak velmi malé množství je ve svalovině a minimální množství je v mléce, vejcích a medu. Rostliny syntetizují kyselinu askorbovou z karbohydráz a nejvyšší obsah mají například semena hlohu, černý rybíz, šípky, guava, jahody a citrusové plody. Ze zeleniny je to pak kapusta, paprika, brokolice, petržel a špenát.
51
Obsah vitaminu C v mg/kg v jednotlivých komoditách. Zdroj dat: Perlín (1992)
Komodita
Vitamin C (mg/kg)
Komodita
Vitamin C (mg/kg)
Ananas
150-250
Mandarinky
350
Angrešt
330-480
Maliny
230
Banány
90-320
Mango
100-350
Borůvky
90-160
Melouny
130-590
Brambory
80-400
Meruňky
30
Brokolice
900-1500
Mrkev
50-100
Broskve
70-100
Mrkev
50-100
Brusinky
120
Okurka
65-110
Celer
100
Papája
620-980
Cibule
90-100
Paprika (různé druhy)
620-3000
Citrony
300-640
Paprika - koření
1930
Česnek
150-160
Pažitka
430
Fazolové lusky
90-300
Pepř - koření
1250-2000
Grapefruity
240-700
Petržel kadeřavá
1500-2700
Hrášek
80-410
Pomeranče
300-600
Hroznové víno
20-50
Pór
150-300
Hrušky
20-40
Rajčata
80-380
Chřest
150-400
Rybíz červený a bílý
200-500
Jablka
15-50
Rybíz černý
1100-3000
Jahody
400-700
Řepa salátová
70
Kapusta hlávková
700-1400
Salát hlávkový
60-300
Kapusta růžičková Kedluben
1000-1030
Šípky
2500-10000
280-700
Špenát
350-840
Kiwi
700-1270
Švestky
25-50
Křen
450-1200
Víno hrozny
20-50
Květák
50-1610
Višně, třešně
60-300
52
4 POUŽITÁ LITERATURA Anonymus. Příručka pro provozovatele potravinářských podniků. Praha: Ministerstvo zemědělství, 2010, 152 s. Combs G. F. Jr.: The Vitamins. Third Edition. Academic Press Inc., 2007, 608 s. Grieger, C. Holec, J. a kol. Hygiena mlieka a mliečnych výrobkov. Bratislava: Príroda, 1990, 397 s. Hálková, J., Rumíšková, M., Rieglová, J. Analýza potravin. Laboratorní cvičení. 2. vydání. Vydal RNDr. Ivan Straka-vydavatel odborných publikací, Újezd u Brna, 2001,160 s. Háslbachová, H. Včelařství (cvičení). Ediční středisko VŠZ Brno, 1992, 93 s. Kodíček, M. Biochemické pojmy výkladový slovník. Praha: VŠCHT, 2004, 171 s. Kopřiva, V., Bušová, M., Smutná, M., Nekvapil, T.: Biochemie potravin a biochemické laboratorní metody. Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, 2010, 54 s. Matyáš, Z. Analýza nebezpečí a kritické kontrolní/ochranné body, HACCP.Brno: SZÚ CHPŘ, 1993, 84 s. Matýšková, M. a kol. Systém managementu jakosti. Využití v laboratoři. Brno: Institut pro další vzdělávání pracovníků ve zdravotnictví v Brně, 2002, 87 s. Odstrčil, J., Odstrčilová, M. Chemie potravin. Brno: NCONZO, 206, 164 s. Perlín, C. a kol. Potravinové tabulky. Praha:Společnost pro výživu, 1992, 69 s. Príbela, A. Analýza potravin. (Cvičenie). 2. vydání. Slovenská technická univerzita v Bratislave, Chemickotechnologická fakulta, 1991, 394 s. Přidal, A. Včelí produkty – cvičení. Ediční středisko MZLU v Brně, 2005, 61 s. Steinhauser, L. a kol. Hygiena a technologie masa. Tišnov: LAST, 1995, 664 s. Štern, P. a kol. Obecná a klinická biochemie pro bakalářské obory studia. Praha: UK Nakladatelství Karolinum, 2005, 219 s. Štrobl, J. Analytická chemie-cvičení pro 4. ročník SPŠ technologie masa, obor zpracování masa. SNTL Praha, 1978, 150 s. Velíšek, J. Chemie potravin 1. díl. 2. vydání. Ossis Tábor, 2002, 332 s. Vorlová, L. Chemie potravin. (Návody k praktickým cvičením). Ediční středisko VFU Brno, 2001, 84 s. Vorlová, L. a kol. Med. Souborná analýza. Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, 2002, 67 s.
53
