VETERINARIA
Vol. 4 No. 3 Nopember 2011
Potensi Insektisida Karbofuran dalam Menginduksi Stress Oksidatif, Menurunkan Kholin Esterase dan Meningkatkan Kematian Sel Otak Masa Embrional Potential Carbofuran Induced Oxidative Stress, Decreased Choline Esterase and Increased Brain Cell Embryonal Death 1
Epy Muhammad Luqman, 2Ari Gunawan, 3Harjanto, 4I Ketut Sudiana, 1Widjiati 1
Departemen Anatomi Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan11 Unair 2 Departemen Anatomi dan Histologi Fakultas Kedokteran Unair 3 Departemen Fisiologi Fakultas Kedokteran Unair 4 Unit Mikroskop Elektron Fakultas Kedokteran Unair Kampus C Unair, Jl. Mulyorejo Surabaya-60115. Telp. 031-5992785, Fax. 031-5993015 Email :
[email protected] Abstract
The aim of this research was to determine the potential of carbofuran insecticide in inducing oxidative stress, lowers choline esterase (CHE) and increases cell death during embryonic brain development. Increased cell death during embryonic brain development leads to reduced fetal reflexes and motor function caused carbofuran contaminated during pregnancy. This laboratory experimental studies using 120 mice and carbofuran given by gavage with a fraction of the LD50 dose in mice pregnancy 6-15 days age. At the pregnancy 17 days age, mice were sacrificed and the fetal brain was taken to measure of fetal malonidialdehid (MDA) and choline esterase (CHE) levels, and made preparations to observe the expression of P53 and apoptotic cells undergoing Apopteg Apoptosis Detection Kit. The measurement results were presented in a descriptive variable. Conclusion, LD50 doses of carbofuran insecticides have been found in mice was 0.5 mg, choline esterase and total protein levels decreased as the dose given. Malonidialdehid levels (MDA) of fetal brain increased as the dose given. There were indications of a relationship between the expression of P53 by the number of apoptotic cells and so it is possible apoptotic cell death through the intrinsic pathway. Keywords : Carbofuran, Oxidative Stress, Choline esterase, cell death, fetal brain
Pendahuluan Karbofuran sering digunakan dalam pertanian karena mempunyai spektrum yang luas dalam mengontrol insekta dan nematoda. Manusia dan binatang dapat terkontaminasi karbofuran melalui air dan makanan. Karbofuran relatif kurang persisten di alam tapi berpotensial mengakibatkan neurotoxic, neurobehavioral dan neuropsycology yang serius. Penggunaan insektisida karbofuran yang serampangan dapat mengakibatkan kontaminasi terhadap lingkungan dan produk pangan asal pertanian maupun peternakan. Residu insektisida karbofuran dalam makanan dapat membahayakan organisme bukan sasaran insektisida (Eskenazi et al., 2008). Pada tahun 2001 di area perkebunan bunga di Ekuador yang terkontaminasi karbofuran, ditemukan
beberapa kasus bayi yang dilahirkan dengan kelainan penurunan refleks maupun kemampuan motorik. Pada usia anak-anak dijumpai kelainan perkembangan fungsi otak seperti penurunan kemampuan mengingat maupun daya konsentrasi (Handal et al., 2007). Cemaran karbofuran pada binatang menyebabkan stres oksidatif dan melemahkan fungsi kognitif, memori dan motorik (Kamboj et al., 2008). Mekanisme terjadinya penurunan reflek dan motorik pada bayi, penurunan kemampuan mengingat dan daya konsentrasi pada anak belum dapat dijelaskan. Klys et al. (1989) mengungkapkan bahwa ibu hamil yang tercemar karbofuran dapat mengalami pemulihan tetapi tidak pada fetus yang dikandung. Kematian sel karena nekrosis dijumpai pada hati, otak dan ginjal fetus sebanding dengan
157
Epy Muhammad Luqman dkk. Potensi Insektisida Karbofuran ...
kadar karbofuran dalam darah ibu. Gupta (1989) menyebutkan bahwa dua metabolit utama karbofuran yang mengakibatkan toksisitas dan dapat menembus barrier plasenta adalah 3hydroxycarbofuran dan 3-ketocarbofuran yang mengakibat kerusakan serius pada unit maternal plasenta fetal. Target utama aksi dari karbofuran adalah otak, hati, otot dan jantung (Gupta et al., 1994) dan efek pada otak lebih hebat dibanding dengan organ lain terutama pada hati (Rai and Sharma, 2007). Pemberian carbofuran secara oral terbukti merangsang reactive oxygen species (ROS) dalam otak tikus, pemberian karbofuran dengan dosis 1 mg/kg selama 28 hari dapat meningkatkan kadar malonidialdehid/MDA(Kamboj et al., 2008). Pemberian sub akut carbofuran secara intraperio-tonial terbukti meningkatan stress oksidatif otak seiring dengan peningkatan dosis. Pemberian sub akut carbofuran secara intraperiotonial dengan dosis 0.2, 0.4 dan 0.8 mg/Kg BB (ekuivalen dengan 10, 20 dan 40% LD50 selama 24 jam) meningkatkan stress oksidatif dengan meningkatkan MDA secara signifikan (12.50, 34.38 dan 59.38%). Peningkatan stress oksidatif ini meng-induksi aktivitas ensim antioksidan seperti superoxide dismutase (SOD) dan katalase dalam otak (Rai et al., 2007). Sudiana (2008) menyebutkan bahwa keberadaan ROS dapat memicu terbentuknya radikal hidroksil (OH*) yang dapat memutus rantai DNA atau menimbulkan perubahan susunan nukleotida pada DNA yang berakibat pada mutasi dan apoptosis. Keberadaan radikal hidroksil karena stres oksidatif juga dapat merusak semua sistem membran dalam sel seperti terjadi kebocoran pada membran pembungkus lisozim yang berakibat pada kematian sel (nekrosis). Pemahaman mekanisme kematian sel otak janin akibat cemaran insektisida karbofuran selama kebuntingan sangat diperlukan untuk memperoleh dasar molekuler penanganan dan pencegahan pemaparan karbofuran selama kebuntingan. Hal ini penting, karena dengan memahami mekanisme nekrosis dan apoptosis tersebut akan diketahui berbagai molekul signaling yang berperan, sehingga dapat diketahui molekul anti tertentu yang dapat digunakan untuk memotong rantai proses nekrosis apoptosis. Apabila nekrosis dan apoptosis dapat dicegah, sehingga penurunan reflek dan motorik pada bayi dapat dihindari. Materi dan Metode Penelitian Bahan dan Alat
158
Hewan coba yang digunakan pada penelitian ini adalah mencit (Mus musculus) betina (dara) berumur 10 minggu dengan berat badan 2530 gram dan mencit jantan umur 12 minggu yang diperoleh dari Veterinaria Farma Surabaya. Bahan pengukuran malonidialdehid (MDA) : analisis lemak peroksida (MDA/TBARS) berupa tabung reaksi ukuran 5 ml, sentrifuge, pH meter (Hanna instruments 8520), dan spektrofotometer tipe Coleman Junior II model 6/20. Reagen untuk analisis lemak peroksida dengan metode Thiobarbituric Acid Reactive Substances (TBARS) : H3PO4, etanol, aquabides, TCA (Trichloro Acetic Acid), TBA prod. E. Sigma Chemical (T : 5500), 1,1,3,3 tetramethoxypropane (TEP : T 1642) prod. Sigma Chemical. Prosedur Penelitian Mencit (Mus musculus) betina (dara) berumur 10 minggu dengan berat badan 25-30 gram dilakukan adaptasi lingkungan selama 7 hari. Hari ke 8 dilakukan penyuntikan PMSG dengan dosis 5 IU / ekor dan dilakukan penyuntikan HCG pada hari ke 10 dengan dosis 5 IU / ekor kemudian dikawinkan dengan mencit jantan umur 12 minggu. Mencitmencit tersebut kemudian dipelihara dalam kandang dan diberi makan secara ad-libitum. Pada hari ke 11 dilakukan pemeriksaan kebuntingan, bila pada vulva mencit betina sudah terlihat sumbat vagina maka hari tersebut dinyatakan sebagai hari ke-0 kebuntingan. Indukinduk bunting tersebut kemudian dikelompokan dalam kandang masing-masing 5 ekor. Pada penelitian ini menggunakan pendekatan LD50 karbofuran pada mencit. Dosis teratogenik yang diberikan berdasarkan fraksifraksi tersebut yang tidak mematikan fetus dan berpotensi menimbulkan efek kematian sel otak pada janin. Dua dosis yang digunakan dalam penelitian utama adalah dosis tertinggi dan terendah berdasarkan pengukuran kadar choline esterase serum induk dan kadar MDA otak janin. Sampel hewan coba berupa mencit betina umur kebuntingan 6-15 hari terhitung dari mulai tampak sumbat vagina, induk mencit diberikan secara gavage. Pada umur kebuntingan 17 hari, induk mencit dikorbankan kemudian dihitung indeks nekrosis dan apoptosis serta kadar ChE dan MDA. Pengukuran malonidialdehid (MDA) Untuk pengukuran kadar lemak peroksida digunakan cairan calon otak fetus umur kebuntingan 17 menggunakan metode MDA/ TBARS (Malondi-aldehide / Thiobarbituric Acid
VETERINARIA
Reaktif Sub-stance). Cara kerja dari metode ini adalah : cairan otak sebanyak 2 ml dalam tabung reaksi dimasukkan 250 ml plasma serta ditambahkan 250 ml aquabides untuk selanjutnya dicampur dengan cara di vortex. Setelah tercampur benar, kemudian ditambahkan 500 ml larutan TBA, dan selanjutnya tabung dipanaskan pada water bath dengan suhu 100ºC. selama 20 menit. Setelah 20 menit, tabung didinginkan pada air mengalir selama ± 10 menit, kemudian setelah dingin ditambahkan larutan TCA 70 % sebanyak 500 ml dan selanjutnya didiamkan selama 20 menit. Tabung kemudian disentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm. selama 15 menit. Selanjutnya nilai absorban dibaca terhadap warna merah yang terbentuk dengan menggunakan spektrofotometer tipe Coleman Junior II model 6/20. Pengukuran kadar choline esterase (ChE) Untuk pengukuran kadar ChE digunakan serum induk cairan otak fetus umur kebuntingan 17 menggunakan metode Knedel (Diagnostica Merck - Germany) Pemeriksaan apoptosis sel otak masa embrional dengan S7101 Apopteg Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit. Otak janin umur kebuntingan 17 difiksasi dengan buffer formalin 10% kemudian jaringan diproses dalam pemrosesan rutin sampai dalam bentuk blok parafin dan dipotong menggunakan mikrotom dengan ketebalan 5 dengan potongan seri kemudian direkatkan dengan gelas obyek menggunakan polilysin. Untuk penghitungan sel apoptotik, potongan jaringan diproses dengan S7101 Apoptag Plus Peroxidase. Pemeriksaan sel apoptosis dilakukan dengan metode Tunel assay. Prosedur pengambilan Data Ekspresi P53 pada setiap sampel dinilai secara semikuantitatif menurut metode Remmele yang sudah dimodifikasi yang disebut Indeks skala Remmele (IRS) (Novak et al., 2007). Indeks skala Remmele (IRS) merupakan hasil perkalian antara skor persentase sel yang positif mengekspresikan P53 (immunoreaktif) dengan skor intensitas warna yang dihasilkan pada sel. A Skor 0 : tidak ada sel positif Skor 1 : Sel positif kurang dari 10% Skor 2 : Sel positif antara dari 11% - 50% Skor 3 : Sel positif antara dari 51% - 80% Skor 4 : Sel positif antara dari lebih dari 80%
Vol. 4 No. 3 Nopember 2011
Skala semikuantitatif IRS merupakan hasil perkalian antara skor persentase sel positif (A) dengan Skor Intesitas reaksi warna (B) Pemeriksaan histopatologi ini ditujukan untuk mengetahui jumlah sel-sel neuron otak janin mencit yang mengalami proses apoptosis. Metode yang digunakan dalam pemeriksaan ini adalah metode kuantitatif, dimana jumlah sel apoptotik pada setiap sampel ditentukan dengan cara menjumlahkan semua sel apoptotik yang ditemukan pada 5 (lima) lapangan pandang yang berbeda, pada pembesaran 1000 kali. Pada pemeriksaan ini sel apoptotik menunjukkan warna coklat tua hingga kehitaman pada inti sel, sedangkan sel normal berwarna hijau kebiruan Hasil dan Pembahasan Penentuan LD50 Karbofuran sering digunakan dalam pertanian karena mempunyai spektrum yang luas dalam mengontrol insektisida dan nematoda. Karbofuran relatif kurang persisten di alam tapi berpotensial mengakibatkan neurotoxic, neurobehavioral dan neuropsycology yang serius (Rai and Sharma, 2007). Manusia dan binatang dapat terkontaminasi residu karbofuran melalui air dan makanan. Residu karbofuran pada tanaman ditemukan dengan kadar yang tinggi pada batang, daun, akar dan biji padi (Teerakun and Reungsang, 2005). Residu karbofuran beserta bahan metabolit dapat ditemukan pada kentang, jagung, bunga matahari, kapas, tebu, cengkih, merica, buah anggur dan pomace (FAO, 2010) serta bangkai burung nasar di Kenya (Otieno et al., 2010). Rentang batas maksimal residu (BMR) karbofuran yang diperbolehkan dalam makanan berkisar antara 0,05 -0,5 mg/Kg BB, BMR 0,05 mg/Kg BB pada produk asal ternak seperti daging dan lemak, BMR 0,2 mg/Kg BB pada beras dan BMR 0,5 mg/Kg BB pada kentang (FAO, 2010). Karbofuran yang digunakan dalam penelitian ini adalah Furadan 3 G dalam bentuk granul yang lazim digunakan di pertanian dan perkebunan. Oleh sebab itu perlu dilakukan penentuan LD50 dan dalam penelitian ini ditemukan dosis LD50 karbofuran sebesar 0,5 mg. B Skor 0 : tidak ada reaksi warna Skor 1 : Intensitas warna rendah Skor 2 : Intensitas warna sedang Skor 3 : Intensitas warna kuat
159
Epy Muhammad Luqman dkk. Potensi Insektisida Karbofuran ...
Tabel 1. Penentuan Dosis LD50 Insektisida Karbofuran pada Mencit Dosis Jumlah mencit yang mati Jumlah mencit yang hidup 2 mg 6 (100%) 0 (0%) 1,5 mg 6 (100%) 0 (0%) 1 mg 6 (100%) 0 (0%) 0,5 mg 3 (50%) 3 (50%) 0,1 mg 0 (0%) 100 (0%) Tabel 2. Bobot dan panjang janin dari induk yang dipapar insektisida karbofuran pada kebuntingan hari ke 6 hingga hari ke 15 Kelompok Panjang (Cm) Bobot (Gr) Kontrol 2 0,72 1/24 LD50 = 0,02 mg 1,8 0,50 1/16 LD50 = 0,03 mg 1,91 0,57 1/12 LD50 = 0,04 mg 1,82 0,58 1/8 LD50 = 0,06 mg Tidak bisa digunakan karena menyebabkan kematian 55,55 % induk selama 10 kali / hari pemberian karbofuran 1/6 LD50 = 0,08 mg Tidak bisa digunakan karena menyebabkan kematian 66,66 % induk selama 10 kali / hari pemberian karbofuran ¼ LD50 = 0,13 mg Tidak bisa digunakan karena menyebabkan kematian 100 % induk selama ½ LD50 = 0,25 mg 10 kali / hari pemberian karbofuran Tabel 3. Jumlah janin dari induk yang dipapar insektisida karbofuran pada kebuntingan hari ke 6 hingga hari ke 15 Kelompok Jumlah (ekor) Resorbsi (ekor) Kontrol 10,80 1 1/24 LD50 = 0,02 mg 13,50 3 1/16 LD50 = 0,03 mg 7 3 1/12 LD50 = 0,04 mg 14,27 5 1/8 LD50 = 0,06 mg 10,67 6 1/6 LD50 = 0,08 mg 8 8 Dosis ini berbeda dengan dosis yang yang ditetapkan CEPA (California Environmental Protection Agency, 2000) pada mencit sebesar 1 – 2,5 mg dan Extonet (2010) sebesar 2 mg (Tabel 1). Toksisitas akut karbofuran dilaporkan pada beberapa spesies dengan masing-masing LD50 : 6,4 – 14,1 mg/kg pada tikus; 18,5 mg/kg pada anjing dan 25 – 38,5 mg/kg pada ayam. Tikus kurang sensitif terhadap toksisitas karbofuran dengan LD50 antara 250 – 500 mg/kg (California Environmental Protection Agency, 2000). Menurut Extonet (2010), toksisitas akut karbofuran dilaporkan pada beberapa spesies dengan masing-masing LD50 secara oral : 5 sampai 13 mg / kg pada tikus, 2 mg / kg pada mencit dan 19 mg / kg pada anjing. Hasil yang sangat variatif menunjukan variasi spesies hewan coba yang digunakan termasuk kemurnian galur mencit yang dgunakan. Demikian halnya karbofuran yang digunakan juga menentukan toksisitas pada hewan coba. Pemilihan karbofuran berasal dari produk pabrik dengan
160
merk Furadan 3G dengan alasan untuk mendapatkan hasil riil pengaruh pencemaran karbufuran pada produk pertanian dan perkebunan di masyarakat. Dengan harapan tidak ada perbedaan hasil penelitian jika penelitian ini menggunakan karbofuran murni (pro analyze). Penentuan dosis uji Penentuan dosis uji didasarkan potensi insektisida karbofuran dalam menghambat fungsi motorik dan tidak menyebabkan hambatan pertumbuhan dan perkembangan organ, sehingga ditentukan dosis fraksi LD50 sebesar 0,5 mg yang tidak menurunkan bobot dan panjang badan. Secara deskripsi memang terjadi penurunan antara kontrol dengan perlakuan, namun relatif tidak ada perbedaan diantara perlakuan melalui fraksi dosis LD50 (Tabel 2). Demikian halnya jika menggunakan jumlah fetus per litter dengan jumlah resorbsi perlitter juga tidak bisa digunakan dasar untuk menentukan dosis pada penelitian utama (Tabel 3).
VETERINARIA
Vol. 4 No. 3 Nopember 2011
Hal ini tidak mudah menentukan 2 dosis yang akan digunakan pada peneltian utama jika tidak perebadaan diantara perlakuan. Karbofuran memberikan efek toksik pada fetus tikus dengan dosis 5 mg/kg yang dipaparkan pada hari kebuntingan ke 7 – 19 mengakibatkan penurunan jumlah fetus hidup perlitter dan menurunkan bobot fetus. Pada kelinci karbofuran dipaparkan dengan dosis 0,12 – 2 mg/kg pada hari kebuntingan ke 6 – 18 tidak didapatkan perbedaan terhadap jumlah fetus, bobot fetus dan abnormalitas secara genetik (CEPA, 2000). Tabel 4. Kadar choline esterase (ChE) dan total protein serum induk setelah dipapar insektisida karbofuran pada kebuntingan hari ke 6 hingga hari ke 15 Kelompok Choline Total esterase protein (U/l) (g/dl) Kontrol 8408 6,3 1/24 LD50 = 0,02 mg 5881 5,8 1/16 LD50 = 0,03 mg 5525 5,2 1/12 LD50 = 0,04 mg 4408 4,9 1/8 LD50 = 0,06 mg 4144 3,5 Tabel 5. Kadar choline esterase (ChE) dan total protein otak janin dari induk yang dipapar insektisida karbofuran pada kebuntingan hari ke 6 hingga hari ke 15 Kelompok Choline Total esterase (U/l) protein (g/dl) Kontrol Tidak 14,4 terdeteksi 1/24 LD50 = 0,02 mg Tidak 13,9 terdeteksi 1/12 LD50 = 0,04 mg Tidak 11,2 terdeteksi 1/8 LD50 = 0,06 mg Tidak 8,4 terdeteksi
Mekanisme kerja karbofuran (juga insektisida pada umumnya dan cholinotoxic lainnya seperti etanol dan nicotin, selanjutnya disebut dengan anti ChE) menghambat aktivitas ChE dengan cara mengikat ChE membentuk ikatan kompleks dan menutup reseptor ACh baik reseptor nicotinic (N-cholinoreceptor) maupun muscarinic (M-cholinoreceptor) (Faiman et al., 1991). Ncholinoreceptor menerima rangsangan ACh dari ujung saraf otot lurik, ganglion saraf autonom dan sedikit SSP, sedang M-cholinoreceptor menerima rangsangan ACh dari ujung saraf otot polos, kelenjar eksokrin dan endokrin (Ballantyne and Marrs, 1992). Pengukuran kadar ChE lebih sering dilakukan untuk mengetahui pengaruh pemaparan insektisida dibanding dua ensim yang lain. Sebagian besar carbamat seperti insektisida alkylcarbamate mempunyai mekanisme menghambat aktivitas serine esterase (ensim golongan ester) terutama ChE (Ballantyne and Marrs, 1992; Jin and Kitos, 1996). Pengukuran kadar ChE berasal dari cairan otak, plasma maupun sel darah merah (Alvares, 1992) dan pengukuran kadar ChE otak merupakan sampel yang paling baik digunakan sebagai indikator akibat terpapar insektisida (Zinkl et al., 1984). Pada semua sistem saraf vertebrata dan serangga terdapat pusat-pusat sinaps yang akan mengalirkan sinyal berupa senyawa kimia ke otot maupun atau neuron yang lain. Senyawa kimia tersebut berupa neurotransmitter yang disebut dengan acetylkholine (ACh). ACh yang terbentuk akan segera mengalami hidrolisis oleh ChE menjadi choline dan asam asetat.
Tabel 6. Kadar malondialdehi (MDA), ekspresi P53 dan jumlah sel apoptotik otak janin dari induk yang dipapar insektisida karbofuran pada kebuntingan hari ke 6 hingga hari ke 15 Kelompok Kontrol 1/24 LD50 = 0,02 mg 1/16 LD50 = 0,03 mg 1/12 LD50 = 0,04 mg 1/8 LD50 = 0,06 mg 1/6 LD50 = 0,08 mg
MDA / nmol MDA/mg protein 125 172 223 305 372 -
Ekspresi P53
Sel Apoptotik
3 4 2 12 3 2
101 4 0 7 0 2
161
Epy Muhammad Luqman dkk. Potensi Insektisida Karbofuran ...
A. Ekspresi P53 pada otak janin
B. Sel otak janin yang mengalami apoptosis Gambar 1. Ekspresi P53 (A) dan Sel otak janin yang mengalami apoptosis (B) dari induk yang dipapar insektisida karbofuran pada kebuntingan hari ke 6 hingga hari ke 15. Pemberian carbofuran secara oral terbukti merangsang reactive oxygen species (ROS) dalam otak tikus, pemberian karbofuran dengan dosis 1 mg/kg selama 28 hari per oral dapat meningkatkan kadar malondialdehid/MDA (Kamboj et al., 2008). Pemberian sub akut carbofuran secara intraperitoneal terbukti meningkatan stres oksidatif otak seiring dengan peningkatan dosis. Pemberian sub akut carbofuran secara intraperitoneal dengan dosis 0.2, 0.4 dan 0.8 mg/Kg BB (ekuivalen dengan 10, 20 dan 40% LD50 selama 24 jam) meningkatkan stres oksidatif dengan meningkatkan MDA secara signifikan (12.50, 34.38 dan 59.38%). Peningkatan stres oksidatif ini dapat menurunkan aktivitas ensim antioksidan seperti
162
superoxide dismutase (SOD) dan katalase (CAT) dalam otak (Rai and Sharma, 2007). Penurunan aktivitas katalase dalam merespon induksi karbofuran dapat mengurangi perlindungan terhadap radikal bebas. Penurunan secara simultan aktivitas SOD dan katalase menyebabkan otak lebih rentan terhadap induksi stres oksidatif karbofuran (Kamboj et al., 2006). Pembentukan radikal bebas harus dieliminasi untuk menghindari kerusakan sel menggunakan scavenger enzyme seperti superoksida dismutase (SOD) dan katalase. SOD berperan mengubah radikal superoksida (O2*) menjadi hidrogen peroksida (H2O2) sedang katalase mengubah hidrogen peroksida menjadi air (H2O) dan oksigen (O2) (Sudiana, 2008). Labih lanjut Sudiana (2008) menyebutkan bahwa keberadaan ROS dapat memicu terbentuknya radikal hidroksil (OH*) yang dapat memutus rantai DNA atau menimbulkan perubahan susunan nukleotida pada DNA yang berakibat pada mutasi dan apoptosis. Keberadaan radikal hidroksil karena stres oksidatif juga dapat merusak semua sistem membran dalam sel melalui peningkatan peroksidasi lipid akan mengakibatkan cedera dan kematian sel neuron (Gupta et al., 2007). Residu insektisida karbofuran dalam makanan dapat membahayakan organisme bukan sasaran insektisida (Eskenazi et al., 2008). Pada tahun 2001 di area perkebunan bunga di Ekuador yang terkontaminasi karbofuran, ditemukan beberapa kasus bayi yang dilahirkan dengan kelainan penurunan refleks maupun kemampuan motorik. Pada usia anak-anak dijumpai kelainan perkembangan fungsi otak seperti penurunan kemampuan mengingat maupun daya konsentrasi (Handal et al., 2007). Cemaran karbofuran pada binatang coba menyebabkan stres oksidatif dan melemahkan fungsi kognitif, memori dan motorik (Kamboj et al., 2008). Induksi karbofuran menyebabkan kerusakan oksidatif yang signifikan pada korteks serebrum, serebellum, dan batang otak (Farage-Elawar, 1989). Induksi karbofuran pada korteks serebrum dapat menurunkan fungsi motorik dan terdapat korelasi yang kuat antara hambatan fungsi mitokondria terhadap penurunan fungsi motrorik (Kamboj et al., 2008). Otak mengandung 80% sel neuron yang berperan dalam meneruskan informasi ke sumsum tulang belakang dalam mengontrol fungsi motorik (Ideguchi et al., 2010). Kematian sel terjadi melalui nekrosis atau apoptosis, ke dua jalur tersebut memiliki mekanisme yang berbeda secara histologis dan biokimia. Stimulus kematian (misal, iskemia)
VETERINARIA
sering menjadi penyebab kematian sel secara langsung yang disebut nekrosis. Pada apoptosis, stimulus kematian dengan mengaktifkan kaskade caspase yang mengatur penghancuran sel. Nekrosis merupakan proses patologis, sedang apoptosis merupakan bagian dari perkembangan normal (apoptosis fisiologis), namun juga terjadi dalam berbagai penyakit (apoptosis patologis) (Friedlander, 2003). Secara histologis, kematian sel nekrotik disebabkan pembengkakan mitokondria dan inti, kerusakan organel dan kondensasi kromatin di sekitar inti diikuti oleh pecahnya membran inti dan sitoplasma serta degradasi DNA. Pecahnya intergritas membran akan melepaskan isinya termasuk protease dan lisosim, menginduksi terjadinya respons inflamasi dengan pelepasan sitokin oleh makrofag yang berdekatan dan kemudian membersihkan sel yang rusak serta memulai dengan proses perbaikan. Proses nekrosis terjadi dengan cepat sehingga kematian sel nekrotik sangat sulit untuk diobati atau dicegah (Friedlander, 2003). Kematian nekrotik sel pada sistem saraf pusat dapat terjadi akibat iskemia akut atau cidera otak atau spinal. Keadaan ini terjadi pada daerah dengan kerusakan berat akibat kolapsnya secara mendadak proses biokimiawi, yang menyebabkan munculnya radikal bebas dan eksitotoksin (misalnya glutamat, sitotoksik sitokin, dan calsium) (Friedlander, 2003; Linnik, 1993). Dalam jalur p53 sitosolik apoptosis, inti p53 menginduksi ekspresi Puma yang pada gilirannya melepaskan p53 sitosolik aktif dalam sitoplasma melalui pengikatan Bcl-XL. Kemudian, p53 Bax sitosolik menginduksi translokasi oligomerisasi dan mitokondria. Akumulasi dari p53 dalam sitosol sebagai konsekuensi dari transportasi intraselular normal atau monoubiquitination stabil adalah sumber utama untuk p53 mitokondria. Dalam mitokondria, p53 Bax dan Bak menginduksi oligomerisasi, antagonizes Bcl-2 dan Bcl-XL efek antiapoptotic, dan bentuk kompleks dengan cyclophilin D dalam membran mitokondria. Ini menyebabkan gangguan yang ditandai perubahan dalam membran mitokondria dan selanjutnya pelepasan faktor apoptogenik. Sel yang mati melalui apoptosis p53-dependent biasanya mengikuti jalur mitokondria, meskipun p53 juga dapat memodulasi kematian sel melalui reseptor kematian. Selain itu, bukti yang paling menunjukkan bahwa kontribusi kunci dari p53 untuk apoptosis terutama bergantung pada aktivitas transkripsi. p53 memiliki kemampuan untuk mengaktifkan transkripsi gen berbagai proapoptotic, termasuk anggota dari famili Bcl-2,
Vol. 4 No. 3 Nopember 2011
seperti protein BH-3 hanya Bax, Noxa, dan Puma. Dengan demikian p53 dapat memicu apoptosis dengan cara merepresi gen antiapoptotic, seperti survivin dan mengaktivasi kaskade caspase (Hoffman et al., 2002). Kesimpulan Dosis LD50 insektisida karbofuran pada mencit sebesar 0,5 mg, kemudian kadar choline esterase dan total protein induk yang dipapar insektisida karbofuran pada kebuntingan hari ke 6 hingga hari ke 15 mengalami penurunan seiring dengan dosis yang diberikan. Demikian halnya dengan kadar total protein otak janinnya. Kadar malonidialdehid (MDA) otak janin dari induk yang dipapar insektisida karbofuran pada kebuntingan hari ke 6 hingga hari ke 15 mengalami peningkatan seiring dengan dosis yang diberikan. Terdapat indikasi hubungan antara ekspresi P53 dengan jumlah sel-sel apoptotik sehingga dimungkinkan kematian sel apoptosis melalui jalur intrinsik. Daftar Pustaka Alvares AP. 1992. Pharmacology and toxicology of carbamates. In : Clinical and Experimental Toxicology of Organophosphat and Carbamates. Ballantyne B. and T. C. Marrs (ed). Butterworth-Heinemann Ltd. Ballantyne B and Marrs TC. 1992. Overview of the biological and clinical aspects of organophosphat and carbamates. In : Clinical and Experimental Toxicology of Organophosphat and Carbamates. Ballantyne B and Marrs TC (ed). ButterworthHeinemann Ltd. California Environmental Protection Agency, 2000. Carbofuran. Public Health Goals for Chemicals in Drinking Water. California Environmental Protection Agency. Eskenazi B, Rosas LG, Marks AR, Dradman A, Harley K, Holland N, Johnson C, Fenster L and Barr DB. 2008. Pesticide Toxicity and The Developing Brain. Basic & Clinical Pharm & Toxicol. 102: 228-236. Faiman MD., Chu F., Hart BW. and Kitos PA. 1991. Covalent binding of chick embryo proteins by the alkylthiocarbamate molinate. Toxicologist;11(1). Extonet. 2010. Carbofuran. Extension Toxicology Network. http://extoxnet.orst.edu/pips/ carbofur.htm. [diakses : 29 September 2010].
163
Epy Muhammad Luqman dkk. Potensi Insektisida Karbofuran ...
FAO. 2010. Carbofuran. http://www.fao.org/ag/ AGP/AGPP/Pesticid/JMPR /Download /97_eva/Carbofu2.PDF. [Diakses : 13 Oktober 2010] Friedlander RM. 2003. Mechanisms of disease Apoptosis and Caspases in Neurodegenerative Diseases. The new england journal of medicine. 1365-1375. Gupta RC, S Milatovic, WD Dettbarn, M Aschner and D. Milatovic. 2007. Neuronal Oxidativer Injury and Dendritic Damage Induced by Carbofuran : Protection by Memantine. Toxicol Appl Pharmacol 219:97-105. Gupta RC and WL. Kadel. 1989. Prevention and antagonism of acute carbofuran intoxication by memantine and atropine. J. Toxicol. Environ. Health 28,111–122. Gupta RC, JT Goad and Kadel WL. 1994. Carbofuran-induced alterations (in vivo) in high-energy phosphates, creatine kinase (CK) and CK isoenzymes. Arch Toxicol 65: 304–310 Handal AJ, B Lozoff, J Breih and SD Harlow. 2007. Effect of Community of Residence on Neurobahioral Development infant and Young Children in a Flower-Growing Region of Ecuador. Environ Health Perspect. 115(10): 128-133. Hoffman WH, S Biade, JT Zilfou, J Chen and M Murphy. 2002. Transcriptional repression of the anti-apoptotic survivin gene by wild type p53. J Biol Chem 277(5):3247-57, 2002. Ideguchi M, TD Palmer, LD Recht and JM Weimann. 2010. Murine embryonic stem cell-derived pyramidal neurons integrate into the cerebral cortex and appropriately project axons to subcortical targets. J Neurosci.20;30(3):894-904.
164
Kamboj SS, V Kumar, A Kamboj and Sandir. 2008. Mitochondrial Oxidative Stress and Dysfunction in Rat Brain induced by Carbofuran Exposure. Cell Mol. Neurobiol. Springer. DOI 10.1007/s10571 -008-9270-5. Linnik MD, RH Zobrist and MD Hatfield. 1993. Evidence supporting a role for programmed cell death in focal cerebral ischemia in rats. Stroke;24:2002-9. Kłys M, Kosuń J, Pach J and Kameńczak A.1989. Carbofuran poisoning of pregnant woman and fetus per ingestion.J Forensic Sci. 34(6):1413-6. Novak M, JA Madej and P Dziegeil. 2007 Intensity of Cox 2 expression inCell of Soft Tissue Fibrosarcomas in Dog As Related to Grade of Tumor malignation. Bull Vet inst Pulawy 51, 275-279. 2007. Otieno PO, JO Lalah, M Virani, IO Jondiko and Schramm. 2010. Carbofuran and its toxic metabolites provide forensic evidence for furadan exposure in Vulture (Gyps africanus)in Kenya. Bull Environ Contam Toxicol. 84 : 536-544. Rai DK and B Sharma. 2007. Carbofuran Induced Oxidative Stress In Mamalian Brain. Mol Biotechnol. DOI 10.1007/s12033-0070046-9. Humana Press Inc. Sudiana IK. 2008. Patobiologi Molekuler Kanker. Salemba Medika, 35-52. Teerakun M and A Reungsang. 2005. Determination of plant species for the phytoremediation of carbofuran residue in rice field soils. Songklanakarin J.Sci. Technol. 27 (5) : 967 – 973
