POTENSI ANTIOKSIDASI EKSTRAK DAUN SANGITAN (Sambucus javanica Reinw ex Blume ) SEBAGAI HEPATOPROTEKTOR PADA TIKUS
METHA ISMU RUSTANDI
PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2006
ABSTRAK METHA ISMU RUSTANDI. Potensi Antioksidasi Ekstrak Daun Sangitan (Sambucus Javanica Reinw ex Blume) Sebagai Hepatoprotektor Pada Tikus. Dibimbing oleh SULISTIYANI dan ERVIZAL A.M ZUHUD. Penelitian ini bertujuan menguji daya ha mbat ekstrak air dan ekstrak etanol 70 % daun sangitan (S. javanica Reinw ex Blume) dalam mencegah kenaikan konsentrasi lipid peroksida darah pada tikus yang mengalami gangguan fungsi hati. Sebanyak 25 ekor tikus dibagi menjadi empat kelompok yang terdiri atas kelompok normal yang hanya dicekok akuades, kelompok parasetamol dicekok parasetamol sebanyak 500 mg/Kg BB sebagai model hewan yang mengalami gangguan fungsi hati, dan 2 kelompok perlakuan yaitu kelompok parasetamol yang diberi ekstrak daun sangitan, yaitu: 1) ekstrak etanol dosis 267 mg/Kg BB, dan 2) ekstrak air dosis 267 mg/Kg BB. Konsentrasi lipid peroksida diukur dengan metode asam thiobarbiturat pada minggu ke-0, 1, 2, 3, dan 5 dengan menggunakan spektrofotometri. Kelompok parasetamol memiliki nilai konsentrasi lip id peroksida sebesar 0.96 ± 0.26 µM atau 60.42 % lebih tinggi daripada kelompok normal sebesar 0.38 ± 0.25 µM. Hal ini menandakan parasetamol memicu timbulnya radikal bebas yang akan mengganggu fungsi hati. Kelompok ekstrak air memiliki nilai konsentrasi lipid peroksida sebesar 0.54 ± 0.17 µM atau 43.75 % lebih rendah dari pada kelompok parasetamol. Kelompok ekstrak etanol memiliki nilai konsentrasi lipid peroksida sebesar 0.65 ± 0.24 µM atau 32.29 % lebih rendah daripada kelompok parasetamol. Hasil penelitian menunjukkan ekstrak daun sangitan memiliki efek hepatoprotektor dengan bertindak sebagai antioksidan yang menghambat peroksidasi lipid.
ABSTRACT METHA ISMU RUSTANDI. The Antioxidant Potency from Extract Sangitan (Sambucus Javanica Reinw ex Blume) Leaf as Hepatoprotector in Rats. Under the Direction of SULISTIYANI and ERVIZAL A.M ZUHUD. The research objective was to test the ability of water extract and 70 % ethanol extract from Sangitan (Sambucus Javanica Reinw Ex Blume) leaf to inhibit the increasing concentration of lipid peroxides in the serum of rats with liver disfunction. Twenty five rats were divided into four groups, the control group was given aquadest, the paracetamol group was given 500 mg/Kg BW of paracetamol to disturb its liver function, and two paracetamol groups which received extract as follows: 1) 267 mg/Kg BW of ethanol extracts, 2) 267 mg/Kg BW of water extract. The lipid peroxides concentrations were measured with thiobarbituric acid assay at week 0, 1, 2, 3, and 5 using spectrofotometry. The lipid peroxides concentrations of the paracetamol group was 0.96 ± 0.26 µM or 60.42 % higher than the normal control (0.38 ± 0.25 µM). This is indicated the ability of paracetamol to produce free radicals and to distur b the liver fungtions. The water extract groups have concentration of lipid peroxides (0.54 ± 0.17 µM) or 43.75 % lower than paracetamol groups. The lipid peroxides concentration of the ethanol extract was 0.65 ± 0.24 µM or 32.29 % lower than paracetamol groups. The result indicates that the sangitan leaf extract showed hepatoprotector effect in rats by acting as antioxidant that inhibited the lipid peroxides.
POTENSI ANTIOKSIDASI EKSTRAK DAUN SANGITAN (Sambucus javanica Reinw ex Blume ) SEBAGAI HEPATOPROTEKTOR PADA TIKUS
METHA ISMU RUSTANDI
Skripsi Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains Pada Program Studi Biokimia
PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2006
Judul Skripsi :Potensi Antioksidasi Ekstrak Daun Sangitan (Sambucus javanica Reinw ex Blume) Sebagai Hepatoprotektor pada Tikus Nama :Metha Ismu Rustandi NIM :G44101043
Disetujui Komisi Pembimbing
drh. Sulistiyani. M.Sc, Ph.D. Ketua
Ir. Ervizal A.M Zuhud, MS Anggota
Diketahui Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor
Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, MS NIP 131473999
Tanggal Lulus:
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Cilacap pada tanggal 30 April 1983 sebagai anak pertama dari tiga bersaudara, anak dari pasangan Subronto dan Wahyuningsih. Tahun 1989 penulis pindah ke Jakarta. Tahun 2001 penulis lulus SMU Negeri 73 Jakarta dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis memilih program studi Biokimia, Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah aktif menjadi pengurus Ikatan Mahasiswa Kimia (Imasika) (2002/2003), dan sebagai Kepala Bidang Pembinaan Anggota Himpunan Mahasiswa Islam (HMI) (2004/2005) Komisariat FMIPA IPB. Pernah menjabat sebagai Administrasi Asrama Mahasiswa Felicia IPB. Penulis melakukan praktik lapangan di PT Indofood Sukses Makmur Bogasari Flour Mills selama satu bulan yaitu pada bulan Juli 2004. Pelatihan yang pernah diikuti diantaranya pelatihan internet (2002), pelatihan pembuatan embedding dan nata de coco (2004).
PRAKATA Alhamdulillah penulis ucapkan kepada Allah SWT yang telah memberikan kesempatan kepada saya untuk menyelesaikan penelitian ini. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biokimia Hewan dan Tumbuhan Departemen Biokimia FMIPA IPB. Penelitian ini meliputi kegiatan pengkajian ekstrak daun sangitan (Sambucus javanica Reinw ex Blume) dengan judul Potensi Antioksidasi Ekstrak Daun Sangitan (Sambucus javanica Reinw ex Blume) Sebagai Hepatoprotektor pada Tikus. Penulis berterimakasih kepada drh. Sulistiyani M.Sc., Ph.D selaku ketua komisi pembimbing dari Departemen Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam serta Ir. Ervizal A.M Zuhud, MS selaku anggota komisi pembimbing dari Laboratorium Konservasi Sumber Daya Hutan Fakultas Kehutanan Institut Pertania n Bogor yang telah membimbing kegiatan penelitian ini. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada seluruh staf Laboratorium Biokimia antara lain Bapak Arya, Bapak Katma, Ibu Iis, Ibu Merry atas bantuan teknisnya. Terima kasih kepada teman seperjuangan terutama Maman, Wida, Dini, Anton, Rani serta teman-teman Asrama Mahasiswa Felicia IPB. Ucapan terimakasih juga saya sampaikan kepada Bapak, Ibu, Henny, dan Fauzan atas segala do’a dan kasih sayangnya selama ini serta dukungannya baik secara materil maupun moral. Semoga karya ini dapat bermanfaat bagi pembaca.
Bogor, Juli 2006
Metha Ismu Rustandi
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR….....................................................................................
iv
DAFTAR LAMPIRAN………………………………………………………..
iv
PENDAHULUAN..............................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA.................................................................................... Tanaman Sangitan (Sambucus javanica Reinw ex Blume)...................... Parasetamol dan Gangguan Fungsi Hati................................................... Antioksidan...............................................................................................
1 1 2 3
BAHAN DAN METODE..................................................................................
4
HASIL DAN PEMBAHASAN.......................................................................... Penapisan Fitokimia................................................................................ Analisis Potensi Antioksidan....................................................................
7 7 7
SIMPULAN DAN SARAN...............................................................................
9
DAFTAR PUSTAKA........................................................................................
9
LAMPIRAN.......................................................................................................
11
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Sangitan (Sambucus javanica Reinw ex Blume) ..........................................
2
2 Reaksi propagasi pada peroksida lipid..........................................................
3
3 Reaksi pembentukan radikal peroksil ...........................................................
3
4 Konsentrasi lipid peroksida rata-rata selama perlakuan........................... ....
8
5 Konsentrasi lipid per oksida rata rata perminggu selama perlakuan berdasarkan luas daerah di bawah kurva ........................................................................... 8
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Tahap penelitian ............................................................................................
12
2 Prosedur ekstraksi daun sangitan...................................................................
12
3 Rancangan percobaan....................................................................................
13
4 Pembuatan kurva standar...............................................................................
13
5 Absorbans dan kurva s tandar TMP (1,1,3,3-tetrametoksipropana) ...............
14
6 Prosedur pengukuran konsentrasi lipid peroksida serum ..............................
15
7 Hasil konsentrasi lipid peroksida pada serum darah .....................................
16
8 Hasil uji statistik ............................................................................................
17
9 Uji fitokimia ..................................................................................................
18
1
PENDAHULUAN Hepatitis B merupakan masalah kesehatan masyarakat yang serius baik di dunia maupun di Indonesia karena jumlah penderitanya yang semakin meningkat. Lebih dari 2 milyar penduduk dunia pernah terkena penyakit ini. Hingga saat ini diperkirakan terdapat sekitar 400 juta orang p enduduk dunia yang mengidap hepatitis B. Harga obat yang tinggi belum bisa menjamin kesembuhan 100 % (Dalimartha 2005). Penyebab penyakit hepatitis ini dapat disebabkan oleh virus, bakteri, dan obat-obatan. Pola hidup yang tidak teratur merupakan penyebab utama penyakit ini. Pola konsumsi, olahraga, dan istirahat perlu diperhatikan agar dapat terhindar dari penyakit. Negara dengan mayoritas penduduk berusia panjang seperti Jepang mempunyai menu tradisional yang kaya akan kacangkacangan, sayur dan buah serta kebiasaan minum teh hijau. Pada masyarakat eskimo yang sering mengkonsumsi ikan, tidak atau jarang ditemukan menderita penyakit jantung. Studi lain menyatakan bahwa kelompok masyarakat yang terbiasa mengkonsumsi susu fermentasi ternyata juga mempunyai rata-rata usia lebih panjang. Pola makanan tersebut banyak mengandung antioksidan yang penting bagi kesehatan (Trilaksani 2003) . Penuaan dan penyakit degeneratif seperti penyakit yang berhubungan dengan gangguan fungsi hati disebabkan oleh stres oksidatif. Kerusakan hati dapat diamati dengan cara pengamatan fisiologis hati dan analisis serum. Analisis yang sering digunakan untuk mengetahui adanya gangguan fungsi hati adalah analisis SGOT dan SGPT (Dalimartha 2005). Analisis lipid peroksida juga sering digunakan untuk mengetahui adanya kerusakan hati. Untuk membuat model hewan yang mengalami ganguan fungsi hati digunakan obat parasetamol dalam dosis tinggi yang mampu merusak sel-sel hati dengan pembentukan radikal bebas. Berbagai upaya pengobatan gangguan fungsi hati secara klinis telah dilakukan, namun cara ini memerlukan biaya yang mahal dan menyebabkan adanya efek samping yang merugikan. Oleh karena itu, penelitian mulai dialihkan pada cara-cara pengobatan tradisional yang dapat dijangkau masyarakat umum, sesuai dengan semboyan ”Back to the nature”. Masyarakat telah menggunakan tanaman sangitan (Sambucus javanica Reinw ex Blume) untuk mengobati penyakit hati, pengobatan ini hanya dibuktikan secara
pengalaman saja, secara ilmiah diperlukan pengujian terhadap pengalaman yang ada agar dapat digunakan sebagai obat secara luas. Secara ilmiah belum diketahui khasiat antioksidan ekstrak air dan ekstrak etanol daun sangitan (S. javanica Reinw ex Blume) dalam mencegah kerusakan hati. Oleh karena itu penelitian ini bertujuan menguji daya hambat ekstrak air dan ekstrak etanol 70 % daun sangitan (S. javanica Reinw ex Blume) dalam mencegah kenaikan konsentrasi lipid peroksida darah tikus akibat pemberian parasetamol. Hipotesis penelitian ini yaitu ekstrak air dan ekstrak et anol 70 % daun tanaman sangitan (S. javanica Reinw ex Blume) dapat menghambat kenaikan konsentrasi lipid peroksida darah tikus. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah mengenai khasiat antioksidan tanaman sangitan (S. javanica Reinw ex Blume) secara in vivo, serta dapat dijadikan dasar pengembangan tanaman sangitan (S. javanica Reinw ex Blume) menjadi produk obat yang dapat dipakai secara luas oleh masyarakat.
TINJAUAN PUSTAKA Sangitan ( S. javanica Reinw ex Blume) Sangitan (S. javanica Reinw ex Blume) (Gambar 1) merupakan tanaman asli Indonesia, menyukai tempat -tempat basah dan banyak ditemukan tumbuh liar di tepi-tepi rawa, padang rumput, jalan setapak sekitar sawah atau ditanam penduduk sebagai tanaman hias pekarangan, kadang-kadang ditanam sebagai tanaman pagar. Umumnya tanaman ini menyukai tempat-tempat yang tidak terlalu kering atau terlalu lembab di dataran rendah sampai ketinggian 1.000 m dpl. Sangitan (S. javanica Reinw ex Blume) merupakan tanaman perdu, tahunan, tegak, tinggi 1-4 m, batang bulat, berkayu dengan percabangan yang banyak (Dalimartha 2005). Daun sangitan (S. javanica Reinw ex Blume) termasuk daun majemuk menyirip gasal ganda dua tidak sempurna, memiliki 511 anak daun yang letaknya menyirip. Helaian anak daun bertangkai, berbentuk elips memanjang sampai lanset, panjang 4-8 cm, lebar 1.5-3 cm, ujung runcing, tepi gerigi, gundul tidak berambut, warna permukaan atas hijau tua, dan permukaan bawah daun hijau muda. Ukuran bunga kecil-kecil, berwana putih, kelopak kecil berlekuk malai rata, keluar dari ujung ranting dan berbau harum. Buahnya buah batu yang menyerupai buni, diameter 3-4 mm, buah yang masak berwarna
2
hitam dapat dimakan. Jumlah biji 1-3 buah. Sangitan (S. javanica Reinw ex Blume) dapat diperbanyak dengan setek atau biji (Hutapea 1994). Bagian yang dapat digunakan sebagai obat adalah seluruh bagian tanaman yang dijemur sampai kering jika akan disimpan. Sangitan (S. javanica Reinw ex Blume) disebut kelak nasi (Melayu), kerak nasi (Sunda), abur (Aceh), babal at (Bengkulu), brobos kebo (Jawa), dan halemaniri (Tidore). Klasifikasi tanaman sangitan (S. javanica Reinw ex Blume) dapat di uraikan sebagai berikut: divisi spermatophyta, sub divisi angiospermae, kelas dicotiledoneae, bangsa rubiales, suku caprifoliaceae, marga sambucus, dan jenis Sambucus javanica Reinw ex Blume (Hutapea 1994). Manfaat tanaman sangitan yaitu seluruh bagian tanaman berkhasiat sebagai peluruh kencing (diuretik), menghilangkan bengkak akibat terkena pukulan, keram/kejang pada kaki, nyeri pada tulang, dan bengkak/edema (timbunan cairan dalam jaringan) di kaki, dan melancarkan sirkulasi. Akar berkhasiat meredakan kolik (antipasmodik) dan menghilangkan pembengkakan akibat terbentur, tulang patah (fraktur), rematik, pegal linu, sakit kuning, badan bengkak karena timbunan cairan pada penyakit ginjal, beri-beri, disentri, radang saluran napas kronis (bronkitis kronis), dan eripelas (infeksi kulit akut yang disebabkan oleh Streptococcus sp). Buah berkhasiat peluruh kencing, pembersih darah, pencahar dan perangsang muntah. Bunga digunakan untuk pengobatan kulit terbakar sinar matahari, bercak hitam di wajah (freckles), dan menghaluskan kulit (Dalimartha 2005). Tumbuhan ini mengandung minyak atsiri, sianogenik glukosida, asam ursolik, a sitosterol, KNO 3, minyak essensial, sitosterol , a-amyrin palmitat, dan tanin. Buah sangitan (S. javanica Reinw ex Blume) mengandung saponin dan flavonida (Dalimartha 2005).
Gambar 1.
Sangitan (Sambucus javanica Reinw ex Blume)
Parasetamol dan Gangguan Fungsi Hati Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Katzu menunjukkan bahwa penggunaan parasetamol dalam dosis yang tinggi dapat menyebabkan gangguan fungsi hati yang disebut nekrosis hati. Dosis parasetamol sebanyak 7 g/hari atau lebih dapat menimbulkan nekrosis hati sedangkan dosis 15 g/hari dapat menimbulkan kerusakan hati yang lebih luas (Susana 1987). Hasil penelitian oleh Silvana menunjukkan mencit yang diberi parasetamol dengan dosis 500 mg/kg BB menunjukkan kerusakan hati mencit tersebut (Susana 1987). Parasetamol akan mengalami biotranformasi melalui reaksi konjugasi dengan asam glukuronat atau glutation dan hasilnya diekskresi melalui urin. Sisa parasetamol mengalami biotranformasi dengan sistem sitokrom P-450 yaitu suatu sistem enzim yang terdapat di dalam retikulum endoplasma. Parasetamol yang teroksidasi berubah menjadi N-asetilimin benzokuinon, suatu senyawa yang toksik dan reaktif (Susana 1987). Senyawa radikal ini dapat bereaksi dengan molekul penyusun sel hati contohnya fosfolipid (Gambar 2). Reaksi ini dapat menyebabkan berubahnya komposisi membran sel hati. Menurut Manson perubahan membran sel menyebabkan kerusakan sel hati dan kemudian dapat menimbulkan nekrosis hati (Susana 1987). Kerusakan hati menyebabkan meningkatnya lipid peroksida darah karena lipid peroksida tubuh tidak dapat lagi didetoksifikasi dalam hati. Menurut Thomas, hati memiliki mekanisme antioksidasi radikal bebas (Nasetilimin benzokuinon) melalui reaksi konjugasi dengan beberapa senyawa dalam hati seperti glutation, asam glukuronat, glisin dan asetat. Jumlah radikal bebas yang melebihi ketersediaan senyawa-senyawa penetralisir dalam hati memungkinkan terjadinya reaksi antara radikal bebas dan membran sel hati (Susana 1987). Hati adalah organ terbesar dan secara metabolisme paling kompleks di dalam tubuh. Organ ini terlibat dalam metabolisme makanan serta sebagian besar obat dan racun. Sebagian besar racun memasuki tubuh melalui sistem gastrointestinal, dan setelah diserap, racun dibawa oleh vena porta hati ke hati. Hati akan mengubah senyawa racun menjadi kurang toksik dan lebih mudah larut air, sehingga lebih mudah dieksresikan (Casarett dan Doull’s 1989). Senyawa racun dapat menyeb abkan berbagai jenis efek toksik pada berbagai organel dalam sel hati sehingga
3
Radikal bebas dalam tubuh dapat terbentuk (Gambar 3) sehingga tubuh akan mengalami kerusakan organ. Kerusakan diawali dari rusaknya lipid membran. Radikal bebas dapat diatasi dengan antioksidan. Antioksidan dapat didefinisikan sebagai senyawa yang dapat memberikan elektron kepada radikal bebas yang terbentuk. Antioksidan dapat terjadi pada enzim yang mengubah senyawa radikal bebas menjadi senyawa yang stabil. Enzim superoksida dismutase (SOD) mengubah radikal O2- menjadi H 2O2 dan O2. O2- + O 2- + H + + H +
SOD
H2O2 + O 2
Mekanisme kerja antioksidan pada senyawa radikal ada tiga macam yaitu: (1) antioksidan primer yang berperan untuk mengurangi pembentukan radikal bebas baru dengan memutus reaksi berantai dan mengubahnya menjadi produk yang lebih stabil. Antioksidan primer ini terdiri atas superoksida dismutase (SOD), katalase, dan glutation peroksidase. Ketiga antioksidan di atas dapat merubah radikal superoksida menjadi air. (2) antioksidan sekunder yang berperan untuk mengikat radikal bebas dan mencegah amplifikasi radikal. Antioksidan sekunder yang berperan terdiri dari vitamin C, B, E,
.
. Pengambilan hidrogen oleh radikal
Penataan ulang
.
Diena terkonjugasi
.
Antioksidan
-H
o-o
dapat menyebabkan kerusakan hati seperti steatosis, nekrosis, kolestasis, dan sirosis. Steatosis (perlemakan hati) adalah hati yang mengandung berat lipid lebih dar i 5 %. Racun seperti tetrasiklin dapat menyebabkan banyak butiran lemak kecil dalam suatu sel sementara etanol menyebabkan butiran lemak besar yang menggantikan inti. Mekanisme yang paling umum adalah rusaknya pelepasan trigliserida hati ke plasma. Hal inilah yang biasa diukur dalam penentuan penyakit hati. Nekrosis hati adalah kematian hepatosit dan juga merupakan suatu manifestasi toksik yang berbahaya tetapi tidak selalu kritis karena hati mempunyai kapasitas pertumbuhan kembali yang luar biasa. Kolestasis merupakan jenis kerusakan hati yang biasanya bersifat akut, ini lebih jarang ditemukan dibandingkan dengan perlemakan hati dan nekrosis. Sirosis ditandai oleh adanya septa kolagen yang tersebar di sebagian besar hati. Sirosis berasal dari nekrosis sel tunggal karena kurangnya mekanisme perbaikan. Kemudian keadaan ini menyebabkan aktivitas fibroblastik dan pembentukan jaringan parut (Lu 1995).
Radikal peroksil Gambar 2. Reaksi propagasi pada peroksidasi lipid
Gambar 3. Reaksi pembentukan radikal peroksil betakaroten, dan senyawa-senyawa fitokimia. (3) antioksidan tersier yang berperan sebagai mekanisme biomolekuler. Antioksidan tersier terdiri atas enzim perbaikan DNA, dan metionin sulfoksida reduktase (Kartikawati 1999). Prof. Bernhard Watzl dari Institute of Nutritional Physiology (FRCN) Karlshure, Jerman menyatakan bahwa fitokimia terdiri dari karotenoid, fitosterol, saponin, glukosinlates, polifenol, protease inhibitors, monoterpen, dan fitoestrogen sulfid. Fitokimia memberikan aroma khas, rasa dan warna tertentu bagi tanaman dalam berintegrasi dengan lingkungan, dan salah satu yang menyebabkan manusia memilihnya. Sebagai komponen bioaktif, fitokimia memberi dampak faali, metabolisme secara endogen dan eksogen melalui berbagai mekanisme reaksi tubuh. Fitokimia mempunyai efek biologi yang efektif menghambat pertumbuhan kanker, sebagai antioksidan, mempunyai sifat menghambat pertumbuhan mikroba, menurunkan kolesterol darah, menurunkan kadar glukosa darah, bersifat antibiotik, dan menimbulkan efek peningkatan kekebalan. Dari sekitar 30.000 fitokimia yang sudah diketahui sekarang, sebanyak 5.000-
4 10.000 terdapat dalam bahan pangan. Hampir 400.000 jenis tanaman mengandung fitokimia (Arnelia 2002). Para ahli percaya bahwa sayur, buah dan biji-bijian dapat mencegah timbulnya kanker dan menurunkan risiko terjadinya tumor. Setelah diteliti lebih jauh ternyata komponen yang ada dalam bahan pangan nabati itu adalah vitamin, mineral, serat dan fitokimia. Untuk itu salah satu pusat penelitian kanker di Amerika yaitu National Cancer Institute dan European School of Oncology Task Force on Diet, Nutrition and Cancer merekomendasikan untuk mengkonsumsi buah dan sayuran yang cukup untuk mencegah terjadinya penyakit kanker. Fitokimia sudah terbukti dapat mencegah timbulnya kanker kolon, payudara, usus dan lambung. Isoflavon yang banyak terdapat pada kedelai, ginseng, buah dan sayur dapat menurunkan risiko mendapatkan kanker payudara (Arnelia 2002). Senyawa fenolik kurkumin dari kunyit dan polifenol katekhin dari teh bersifat protektif terhadap kanker lambung dan usus. Fitoestrogen selain diduga dapat menunda menopause pada wanita, juga sangat ampuh dalam mencegah kanker. Tripsin inhibitor yang selama ini diduga dapat menurunkan penyerapan protein, ternyata dapat mencegah timbulnya kanker. Bowman -Birk Inhibitor (BBI) merupakan salah satu tripsin inhibitor yang terdapat dalam kedelai, dapat mencegah terjadinya kanker kolon dan hati. Dilaporkan bahwa hanya BBI yang dapat mencegah terjadinya kanker dan tidak untuk jenis inhibitor lainnya (Arnelia 2002). Stres oksidatif adalah keadaan ketidakseimbangan antara prooksidan dan antioksidan. Keadaan stres oksidatif sebetulnya dapat diinduksi oleh berbagai faktor, antara lain adalah kurangnya antioksidan atau kelebihan produksi radikal bebas. Radikal bebas sebetulnya diproduksi secara fisiologis oleh sel sebagai konsekuensi logis pada reaksi biokimia dalam kehidupan aerobik. Namun, jika radikal bebas berlebihan dan antioksidan seluler tetap jumlahnya atau lebih sedikit, maka kelebihan radikal bebas ini tidak bisa dinetralkan dan akan berakibat pada kerusakan sel itu sendiri. Kondisi stres oksidatif yang berakibat pada kerusakan sel, dapat menyebabkan terjadinya percepatan proses penuaan, dan bisa menimbulkan penyakit jantung, kanker dan diabetes mellitus (Arnelia 2002). Fitokimia yang bersifat antioksidan aktif adalah karotenoid, polifenol, fitoestrogen,
inhibitor-protease dan sulfida. Karotenoid seperti lycopene dan canthaxanthin, adalah jenis antioksidan yang punya kemampuan tinggi dalam memproteksi oksidasi yang disebabkan oleh radikal bebas. Sedangkan polifenol dikenal sebagai antioksidan tanaman yang sangat superior. Polifenol dari anggur merah dan flavanol quercentin adalah fitokimia yang sukses mencegah oksidasi LDL (low density lipoprotein) dan kolesterol, sehingga dapat mencegah timbulnya penyakit kronis (Arnelia 2002).
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Tikus yang digunakan adalah galur Spraqlue dawley, berkelamin jantan, berumur 2 bulan, bobot 190-270 gram, dan berjumlah 25 ekor. Tikus diadaptasikan selama 1 bulan untuk menghindari stres yang dapat mempengaruhi kandungan serum darah yang akan diambil dan untuk menyeragamkan pola hidup masing-masing kelompok perlakuan. Di dalam masa adaptasi ini, tikus hanya diberi pakan standar dan tidak diberi perlakuan apaapa. Pada akhir masa adaptasi, dilakukan pengambilan darah untuk mengetahui kadar lipid peroksida serum sebagai rataan kadar lipid peroksida tikus yang digunakan dalam percobaan. Bahan yang digunakan adalah daun sangitan (S. javanica Reinw ex Blume) yang diperoleh dari Fakultas Kehutanan IPB, ditanam di Laboratorium Konservasi Sumber Daya Hutan, Program Studi Konservasi Sumber Daya Hutan Fakultas Kehutanan IPB, parasetamol, etanol, asam asetat, 1.1.3.3tetrametoksipropana, TBA (Thiobarbituric acid, asam tiobarbiturat) 1%, n-butanol : piridin (15:1 v/v), H2SO4, asam fosfotungstat 10%, NaOH, H2 SO 4 pekat, dietil eter, asam asetat anhidrida, kloroform, amoniak, pereaksi Dragendorf, pereaksi Meyer, pereaksi Wagner, metanol, akuades dan HCl. Alat yang digunakan adalah rotary vapour evaporator , alat untuk ekstraksi, spektrofotometer Genesys 10 W, pH meter dan sentrifus Hettich model Universal D7200/1200-16 serial # 20927. Metode Ekstraksi Daun Reinw ex Blume)
Sangitan
(S.
javanica
Ekstraksi dilakukan dalam dua cara yaitu dengan akuades dan etanol 70 %. Cara yang
5 pertama yaitu daun diekstrak dengan akuades. Ekstraksi dilakukan dengan cara daun sangitan (S. javanica Reinw ex Blume) kering dipotong kemudian diselupkan di dalam akuades dan dididihkan pada suhu 100o C selama 2 jam. Hal ini berdasarkan kebiasaan masyarakat dalam mengkonsumsi jamu yaitu diekstrak dengan air panas. Cara yang kedua yaitu dengan menggunakan pelarut etanol 70 %. Ekstraksi dengan etanol 70 % dilakukan dengan mencelupkan daun sangitan pada larutan etanol 70 % kemudian didihkan pada suhu 70 oC selama 2 jam. Ektraksi dilakukan sebanyak 4 kali untuk masing-masing pengekstrak baik dengan pelarut air maupun etanol 70 % (v/v). Larutan yang didapat disaring dengan kain kasa kemudian filtrat disaring kembali dengan kertas saring. Filtrat hasil penyaringan kedua ini dihilangkan pelarutnya dengan alat rotary vapour evaporator hingga pekat. Filtrat yang telah pekat dikeringkan dalam oven bersuhu 40 oC hingga kering. Analisis Fitokimia (Harbone 1987). Uji Alkaloid. Ekstrak daun sangitan sebanyak 1 gram ditambahkan 10 mL kloroform dan beberapa tetes amoniak. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan dengan H2SO4 . Fraksi H 2SO 4 diambil kemudian ditambahkan pereaksi Dragendorf, Meyer, dan Wagner. Terdapatnya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan putih pada pereaksi Meyer, endapan merah pada pereaksi Dragendorf, dan endapan coklat pada pereaksi Wagner. Sebagai pembanding digunakan daun tapak dara s ebanyak 1 gram. Uji Saponin. Ekstrak daun sangitan sebanyak 1 gram ditambahkan air secukupnya dan dipanaskan selama lima menit. Larutan tersebut didinginkan kemudian dikocok. Timbulnya busa sampai selang waktu 10 menit menunjukkan terdapatnya saponin. Sebagai pembanding digunakan kulit daging buah klerak sebanyak 1 gram. Uji Flavonoid dan Senyawa Fenolik. Ekstrak daun sangitan sebanyak 1.0 gram ditambah metanol sampai terendam lalu dipanaskan. Filtratnya ditambah NaOH 10 % (b/v) atau H2 SO 4 pekat. Terbentuknya warna merah karena penambahan NaOH 10 % (b/v) menunjukkan adanya senyawa fenolik hidrokuinon sedangkan warna merah yang terbentuk akibat penambahan H2 SO4 pekat menunjukkan adanya senyawa flavonoid. Sebagai pembanding digunakan biji pinang sebanyak 1 gram.
Uji Triterpenoid dan Tteroid. Ekstrak daun sangitan sebanyak 1 gram ditambah 25 mL etanol lalu dipanaskan dan disaring. Filtratnya diuapkan lalu ditambahkan eter. Lapisan eter ditambah pereaksi Lieberman Buchard (3 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes H2 SO 4 pekat). Warna merah atau ungu menunjukkan kandungan triterpenoid pada sampel sedangkan warna hijau menunjukkan kandungan steroid. Sebagai pembanding digunakan daun som jawa sebanyak 1 gram. Uji Tanin. Ekstrak daun sangitan sebanyak 1 gram ditambahkan air kemudian dididihkan selama beberapa menit. Larutan ini disaring dan filtratnya ditambah FeCl3 (b/v). Warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan terdapatnya tanin. Sebagai pembanding digunakan daun teh sebanyak 1 gram. Hewan Coba dan Rancangan Penelitian Tikus dibagi menjadi empat kelompok. Masing–masing kelompok terdiri atas enam ekor tikus. Keempat kelompok tikus diberi pakan standar selama penelitian yaitu dari minggu ke-0 sampai minggu ke-5. Hewan coba tersebut diadaptasikan selama satu bu lan untuk menyeragamkan cara hidup dan pola makannya. Tikus kelompok I merupakan kontrol normal yang selama penelitian hanya diberi pakan standar dan dicekok akuades hingga minggu ke-5. Tikus kelompok II adalah kelompok kontrol parasetamol yang dicekok parasetamol dosis 500 mg/kg BB selama 4 minggu yaitu minggu ke-1 sampai minggu ke-5. Kedua kelompok lainnya kelompok III dan IV merupakan kelompok perlakuan. Kedua kelompok ini dicekok satu macam ekstrak yang berbeda dari minggu ke0 sampai minggu ke-5. Perlakuan sebagai berikut, kelompok III dicekok ekstrak air daun sangitan (S. javanica Reinw ex Blume) dengan dosis 267 mg/Kg BB, kelompok IV dicekok ekstrak etanol 70 % daun sangitan (S. javanica Reinw ex Blume) dengan dosis 267 mg/Kg BB. Dua kelompok ini juga diberi parasetamol peroral dengan dosis 500 mg/kg dari minggu ke-1 sampai minggu ke-5. Darah tikus diambil dari vena ekor sebanyak 5 kali yaitu pada minggu ke-0, 1, 2, 3, dan 5. Dosis Penggunaan Ekstrak Daun Sangitan (S. javanica Reinw ex Blume ) Dosis ekstrak daun sangitan (S. javanica Reinw ex Blume) yang digunakan didasarkan pada dosis yang digunakan masyarakat tradisional yaitu 40 gram per hari. Apabila
6 berat badan manusia rata-rata diasumsikan sebesar 60 Kg dan perolehan kembali sebesar 40 %, maka dosis yang digunakan sebesar 267 mg/Kg BB perhari dengan perhitungan sebagai berikut: Residu hasil ekstraksi sebanyak 40 %: 40 1000 mg = × 40 gram × = 16.000 mg 100 1gram Dosis yang digunakan per kilogram berat badan per hari :
=
16000 mg 60 Kg
dalam 2.0 mL air destilata. Prosedur selanjutnya sama dengan yang dilakukan pada larutan standar. Sebelum penambahan 15 mL n-butanol : piridin pada sampel, dilakukan penambahan HCl sampai pH larutan 1.6-1.7. Analisis Data Data kadar lipid peroksida dianalisis secara statistik dengan menggunakan metode rancangan acak lengkap (RAL) (Gaspersz 1994). Model rancangan tersebut adalah:
Yij = µ + τ i + ε ij
= 267 mg / KgBBperhar i keterangan:
Oleh karena itu, dalam pengujian digunakan dosis 267 mg/Kg BB.
ini
Analisis Daya Antioksidasi Sangitan (S. javanica Reinw ex Blume) Daya oksidasi sangitan (S. javanica Reinw) ditentukan dengan pengukuran kadar lipid peroksida di dalam serum darah tikus (modifikasi metode Yagi 1968). Pengukuran Larutan Standar 1.1.3.3 Tetrametoksipropana (TMP). Larutan stok pereaksi 1.1.3.3 - tetrametoksipropana (TMP) konsentrasi 6 M dibuat menjadi 0.075; 0.15; 0.3; 0.6; 0.75; 1.5; 3.0 µM. Tiap larutan dipipet sebanyak 2 mL kedalam tabung reaksi dan ditambahkan 0.5 mL TBA 1 % dalam pelarut asam asetat 50 %. Tahap selanjutnya tabung diinkubasi pada suhu 95°C selama 60 menit dan didinginkan dalam suhu kamar. Tabung yang telah dingin ditambah 0.5 mL air destilata serta 15 mL n-butanol : piridin (15:1 v/v). Tabung ini selanjutnya dikocok menggunakan vorteks dan disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm (1600 xg) selama 15 menit. Lapisan atas (fase organik) diambil dan diukur absorbansnya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 532 nm . Pengukuran Lipid Peroksida Serum Darah Tikus. Serum darah tikus diambil sebanyak 0.3 mL kemudian ditambah 1.2 mL H2SO4 0.083 N dan dibiarkan selama 5 menit pada suhu ruang 27 -28°C. Larutan ini disentrifugasi pada 3000 rpm (1600 xg) selama 20 menit. Supernat an yang diperoleh dibuang sedangkan peletnya ditambah H2 SO 4 0.083 N sebanyak 1.2 mL dan 0.15 mL asam fosfotungstat 10 %. Larutan ini disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm (1600 xg) dengan tipe rotor 1200 selama 15 menit. Endapan yang diperoleh dari sentrifugasi disuspensikan
µ
τi
= =
eij
=
i
=
i
=
i
=
i
=
pengaruh rataan umum pengaruh perlakuan ke-i, i = 1, 2, 3, 4 pengaruh galat perlakuan ke-i dan ulangan ke-j, j= 1,2,3,4,5 1 adalah perlakuan pemberian pakan standar saja dan cekok akuades 2 adalah perlakuan pemberian pakan standar dan cekok parasetamol 3 adalah perlakuan pemberian pakan standar, parasetamol dan ekstrak air 4 adalah perlakuan pemberian pakan standar, parasetamol dan cekok ekstrak etanol 70 %
Perbedaan pengaruh perlakuan diuji dengan uji lanjutan Beda Nyata Terkecil (BNT). Pengolahan data menggunakan software SPSS versi 12.
HASIL DAN PEMBAHASAN Penapisan Fitokimia Hasil penapisan menunjukkan adanya kandungan alkaloid di dalam ekstrak daun sangitan (Tabel 1) kandungannya sama dengan penelitian Ruswandi (2005) dan Adji (2004) yang terdapat alkaloid di ekstrak saponinnya. Sebagai pembanding digunakan tanaman tapak dara yang memiliki jumlah kandungan alkaloid yang relatif lebih banyak. Kandungan saponin pada daun sangitan juga ditemukan akan tetapi hanya pada ekstrak etanol saja sedangkan pada ekstrak air tidak ada. Sedangkan penelitian Ruswandi (2005) saponin terdapat di keduanya.
Tabel 1. Hasil uji fitokimia daun sangitan Ekstrak Ekstrak Pembanding air etanol Alkaloid +++ +++ +++++ (tapak dara) Saponin ++ +++++ (biji klerak) Flavonoid + ++++ (biji pinang) Fenolik hidrokuinon +++ (biji pinang) Triterpenoid + +++ (daun som jawa) Steroid + +++ +++++ (daun som jawa) Tanin +++ ++ +++++ (teh) Keterangan: + = sedikit , +++ = sedang, ++++ = sangat banyak Daging biji klerak yang digunakan sebagai rendah bila dibandingkan dengan kelompok pembanding banyak mengandung saponin. parasetamol. Secara umum pada minggu ke-3 Flavonoid hanya terdapat pada ekstrak air konsentrasi lipid peroksida semua kelompok saja, sedangkan fenolik hidrokuinon tidak perlakuan maksimum kemudian mengalami terdapat di ekstrak air maupun ekstrak etanol. penurunan pada minggu ke-5. Penurunan ini Sedangkan penelitian Ruswandi (2005) disebabkan karena pengaruh dari sistem imun terdapat fenolik di ekstrak air. Biji pinang yang ikut berpartipasi dalam menurunkan digunakan sebagai pembanding untuk kedua konsentrasi lipid peroksida seperti interleukinsenyawa tersebut. 2 (IL-2) dan enzim SOD yang mengubah Kandungan triterpenoid dan steroid pada senyawa radikal menjadi senyawa yang stabil ekstrak air dan ekstrak etanol memiliki (Kartikawati 1999). Kerusakan hati kandungan yang sama akan tetapi kandungan mengakibatkan tidak bekerjanya hati ekstrak etanol memiliki kandungan yang lebih sebagaimana mestinya dalam mengubah tinggi daripada ekstrak air. Pembanding yang senyawa parasetamol menjadi senyawa digunakan untuk uji triterpenoid dan steroid radikal bebas sehingga menurunkan adalah daun som jawa. Som jawa hanya konsentrasi lipid peroksida yang terbentuk. mengandung s enyawa steroid sedangkan Untuk melihat rataan keseluruhan senyawa triterpenoidnya tidak didapat. Steroid peningkatan konsentrasi lipid peroksida, yang ada di ekstrak air mungkin disebabkan digunakan perhitungan daerah di bawah kurva karena senyawa steroid berikatan dengan konsentrasi lipid peroksida. Hasil perhitungan senyawa yang larut air. Hal ini juga sesuai merupakan gambaran konsentrasi lipid dengan penelitian Ruswandi (2005). peroksida per minggu ditampilkan pada Ekstrak air dan teh mengandung tanin Gambar 5. Kelompok normal memiliki nilai sesuai dengan penelitian Ruswandi (2005) kons entrasi lipid peroksida sebesar 0.38 ± serta Anonim (2002). Sedangkan ekstrak 0.25 µM. Kandungan lipid peroksida etanol tidak mengandung tanin. kelompok normal memiliki kandungan yang paling rendah bila dibandingkan dengan Analisis Potensi Antioksidan kelompok yang lainnya. Sedangkan untuk kelompok parasetamol didapatkan konsentrasi Selama masa perlakuan konsentrasi lipid lipid peroksida sebesar 0.96 ± 0.26 µM atau peroksida rata-rata diamati tiap minggu. Pada 60.42 % lebih tinggi bila dibandingkan Gambar 4 terlihat bahwa kelompok dengan kelompok normal. Hal ini parasetamol semakin meningkat konsentrasi menandakan parasetamol mengoksidasi lipid lipid peroksidanya selama masa perlakuan. membran sel hati dan mengganggu fungsi hati Hal ini berbeda dengan kelompok normal hewan coba. Kelompok ekstrak air memiliki yang hanya dicekok akuades, kurva konsentrasi lipid peroksida sebesar 0.54 ± konsentrasi lipid peroksida rata-rata per 0.17 µM atau 43.75 % lebih rendah dari nilai minggunya memiliki kecenderungan datar. konsentrasi lipid peroksida kelompok Pemberian cekok akuades pada tikus parasetamol. Kelompok ekstrak etanol kelompok normal berfungsi untuk memiliki nilai konsentrasi lipid peroksida memberikan efek stres yang sama dengan sebesar 0.65 ± 0.26 µM atau 32.29 % lebih kelompok yang lain. akan tetapi yang rendah daripada kelompok paraset amol dicekokkan hanya akuades sehingga oksidasi sedangkan perlakuan ekstrak etanol yang lipid peroksida tidak terbentuk. Kelompok dilakukan Ruswandi (2005) memiliki nilai ekstrak air dan ekstrak etanol cenderung sebesar 30.95 % lebih rendah dari kelompok meningkat, akan tetapi peningkatan parasetamol. Hal ini menandakan perlakuan konsentrasi lipid peroksida tersebut lebih Uji
ekstrak mahkota dewa dan sangitan tidak berbeda jauh. Kenaikan konsentrasi lipid peroksida kelompok ekstrak air dan ekstrak etanol daun sangitan lebih rendah bila dibandingkan dengan perlakuan ekstrak saponin yang dilakukan Adji (2004) yaitu dengan kenaikan sebesar 74.4 %. Hal ini menandakan bahwa ekstrak daun sangitan memiliki pengaruh yang lebih besar dari ekstrak saponin. Kandungan lipid peroksida pada kelompok normal dapat disebabkan karena proses metabolisme misalnya di koenzim Q pada transfer elektron yang menghasilkan radikal O2- (Marks et al 2000). Hal ini akan menyebabkan lipid teroksidasi membentuk lipid peroksida. Pada kelompok parasetamol konsentrasi lipid peroksida yang terbentuk banyak dikarenakan sel-sel hati tidak mampu mencegah reaksi oksidasi yang dilakukan oleh radikal bebas N-asetilimin benzokuinon hasil metabolisme parasetamol. Proses antioksidasi hanya dilakukan secara alami oleh enzim enzim yang terdapat di dalam tubuh yang jumlahnya lebih sedikit daripada jumlah radikal bebas yang terbentuk. Hal ini sesuai dengan penelitian Ruswandi (2005) yang menyatakan bahwa kelompok parasetamol mengalami peningkatan konsentrasi lipid peroksida selama perlakuan dengan konsentrasi lipid peroksida 89.36 % lebih tinggi dari kelompok normal dan Adji (2004) dengan konsentrasi lipid peroksida 129.5 % lebih tinggi dari kontrol normal. Penyebab lain yaitu kerusakan sel hati menyebabkan meningkatnya lipid peroksida darah. Ekstrak air menghambat kenaikan konsentrasi lipid peroksida akibat oksidasi radikal bebas. Senyawa-senyawa fitokimia yang terkandung di dalam ekstrak air diduga merupakan senyawa antioksidan sekunder yang berperan untuk mengikat dan mencegah
1,2 1 Konsentrasi (µM)
Gambar 4 Konsentrasi lipid peroksida rata rata selama perlakuan
amplifikasi radikal bebas. Senyawa fitokimia tersebut di duga kuat adalah flavonoid. Kandungan flavonoid terdapat pada ekstrak air akan tetapi pada ekstrak etanol tidak didapati. Ekstrak air mampu menurunkan konsentrasi lipid peroksida lebih rendah dari ekstrak etanol. Walaupun hasil analisis menunjukkan adanya potensi antioksidan (Gambar 5), tetapi efektifitas dari senyawa yang terkandung pada ekstrak air dan ekstrak etanol masih rendah dalam pencegahan oksidasi lipid. Penurunan potensi antioksidasi ekstrak daun sangitan dapat dipengaruhi oleh daya serap senyawa antioksidan ke dalam tubuh. Pengukuran sampel serum dengan menggunakan TBA memiliki prinsip memurnikan lipid peroksida dari senyawasenyawa lain seperti protein kemudian senyawa lipid peroksida diikat oleh senyawa TBA. Senyawa gabungan lipid peroksidaTBA tersebut akan diukur absorbansnya pada panjang gelombang 532 nm. Absorbans yang didapat dikonversi menjadi satuan konsentrasi (µM) dengan kurva standar TMP. Serum darah yang direaksikan dengan H2SO 4 akan menyebabkan ikatan lipid dengan senyawa lain putus sehingga lipid akan lepas dari senyawa lain seperti protein (Roswiem 1992). Penggunaan asam fosfotungstat menyebabkan protein mengendap.Sentrifugasi menyebabkan lipid turut serta mengendap bersama protein. Pelet hasil sentrifus mengandung lipid peroksida. Penambahan TBA 1 % dalam asam asetat akan menyebabkan pengikatan lipid peroksida yang sebelumnya telah mengalami perubahan bentuk dari padatan pelet yang rapat menjadi
0,8 0,6 0,4 0,2 0 1
Gambar 5
2 3 Kelompok Perlakuan
4
Konsentrasi lipid peroksida rata rata per minggu selama perlakuan berdasarkan luas daerah di bawah kurva. Kelompok normal (1), parasetamol (2), ekstrak air (3), dan ekstrak etanol (4).
renggang. Hal ini akan memudahkan TBA dan lipid peroksida untuk bereaksi dan membentuk senyawa lipid peroksida-TBA. Panas yang digunakan dalam inkubasi akan mempercepat reaksi yang terjadi antara lipid peroksida dengan TBA. Penambahan HCl hingga pH 1.7 berfungsi untuk menghilangkan senyawa-senyawa yang masih melekat pada lipid dan pemberian n-butanol:piridin (15:1 (v/v)) akan mengendapkan pengotor-pengotor yang telah lepas dari lipid akibat pemberian HCl. Sentrifugasi akan mengendapkan pengotor sehingga supernatan yang didapat hanya senyawa lipid peroksida-TBA (Yagi 1968). Kompleks warna yang terbentuk berwarna merah muda.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Pemberian ekstrak air dan ekstrak etanol daun sangitan dapat menghambat proses oksidasi sebesar 43.75 % dan 32.29 % lebih rendah daripada kelompok parasetamol. Saran Perlu dilakukan pemeriksaan histopatologi untuk memeriksa tingkat kerusakan hati tikus akibat pemberian parasetamol selain itu pengujian aktivitas enzim katalase dengan metode kolorimetri untuk mengetahui aktivitasnya dalam mengubah senyawa radikal bebas. Perlu dilakukan uji ekstrak daun sangitan dengan tanaman lain secara bersamaan untuk melihat potensinya.
DAFTAR PUSTAKA Adji P. 2004. Daya antioksidasi ekstrak saponin akar kuning (Arhangelisia flava(L)Merr) terhadap radikal bebas parasetamol sebagai hepatoprotektor pada tikus putih galur sparague dawley [skripsi]. Bogor: FMIPA IPB [Anonim]. 2002. Sangitan (Sambucus javanica Reinw.) natural. http://www.minggupagi.com/print.php? sid=4035. [24 Juni 2005]. Arnelia. 2002. Fitokimia komponen ajaib cegah PJK, DM dan kanker. http://www.kimianet.lipi.go.id/utama.c gi?artikel&1100397943&2 [24 Juni 2005].
Casarett, Doull’s. 1989. Toxicology: The Basic Science of Poisons. New York: Macmillan Pubishing Company. Dalimartha S. 2005. Ramuan Tradisional untuk Pengobatan Hepatitis. Jakarta: Penebar Swadaya. ------------------. 2005. Sangitan (Sambucus javanica Reinw.) natural. http://cybermed.cbn.net.id/detil.asp?kat egori=natural&newsno=97. [12 april 2005] -----------------. 2005. Sangitan (Sambucus javanica Reinw.) http: //www. pdpersi. co.id/pdpersi/news/alternatif_ dalam.php3 [21 Maret 2005] Gaspersz V. 1994. Metode Perancangan Percobaan. Bandung: CV ARMICO Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Ed ke-2. Bandung: ITB. Hutapea JR. 1994. Inventaris Tanaman Obat Indonesia (III). Jakarta: Depkes RI. Kartikawati D. 1999. Studi efek protektif vitamin C dan E terhadap respon imun dan enzim antioksidan pada mencit yang dipapar paraquat [skripsi]. Bogor: Program Pascasarjana IPB. Lu C. 1995. Toksikologi Dasar: Asas, Organ Sasaran, dan Penilaian Risiko. Edi Nugroho, penerjemah. Ed ke-2. Jakarta: UI Press. Marks DB, Allan DM, Colleen MS. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar: Sebuah Pendekatan Klinis. Brahm U Pendit, penerjemah. Jakarta: EGC. Roswiem AP. 1992. Biokimia Dasar . Jakarta: UI Press. Ruswandi D. 2005. Penghambatan peroksidasi lipid oleh ekstrak buah mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) pada gangguan fungsi hati tikus akibat parasetamol [skripsi]. Bogor: FMIPA IPB. Susana. 1987. Pengaruh pemberian seduhan rimpang temulawak terhadap hepatotositas parasetamol pada mencit
jantan [skripsi]. Yogyakarta: Fakultas Farmasi UGM. Trilaksani W. 2003. Antioksidan: jenis, sumber, mekanisme kerja dan peran terhadap kesehatan [term paper ]. Bogor: Program Pascasarjana IPB. Yagi KLN, Ohama H. 1968. Assay for serum lipid peroxide. Vitamin 39: 05 -110.
LAMPIRAN
Lampiran 1 Tahap penelitian Daun sangitan (S. javanica Reinw ex Blume) kering 25 gram
Refluks
Rotavapour hingga pekat
dikeringkan dalam oven 40oC hingga kering
ekstrak
Uji pada hewan coba
Analisis fit okimia
Lampiran 2 Prosedur ekstraksi daun sangitan Daun sangitan (S. javanica Reinw ex Blume) kering 25 gram
Erlenmeyer 500 mL
Erlenmeyer 500 mL
akuades 200 mL
etanol 70 % 200 mL
Panaskan 100 oC, 2 jam
Panaskan 70 oC, 2 jam
Rotavapour hingga pekat
Rotavapour hingga pekat
Keringkan dalam oven 40oC hingga kering
Keringkan dalam oven 40oC hingga kering
Lampiran 3 Rancangan percobaan Adaptasi hewan coba satu bulan
Kelompok I Hewan coba dicekok akuades
Kelompok II Hewan coba dicekok parasetamol
Kelompok III Hewan coba dicekok ekstrak air dan parasetamol
Kelompok IV Hewan coba dicekok ekstrak etanol 70 % dan parasetamol
Pengambilan darah pada minggu ke-0,1,2,3,5
Analisis darah: pengukuran kadar lipid peroksida darah Lampiran 4 Pembuatan kurva standar Tetrametoksipropana 6M pengenceran 0.075µM 0.15µM 0.3µM 0.6µM 0.75µM 1.5µM 3.0µM tiap larutan dipipet 2 mL + 0.5 mL TBA 1% (dalam asam asetat 50%) Tujuh tabung reaksi Inkubasi T=100oC t=60 menit Tujuh tabung reaksi (dingin) Sentrifus 3000 rpm Supernatan diukur pada λ=532 nm
Lampiran 5 Absorban dan kurva standar TMP (1,1,3,3 – tetrametoksipropana) Hari ke-1 A-1
rataan
A-2
stdev
0
Kurva Standar TMP
Blanko
0
0
0
0,075
0,006
0,006
0,006
0
0,15
0,009
0,008
0,0085
0,000707
0,3
0,015
0,013
0,014
0,001414
0,6
0,023
0,021
0,022
0,001414
0,75
0,03
0,026
0,028
0,002828
1,5
0,06
0,053
0,0565
0,00495
3
0,128
0,124
0,126
0,002828
Absorbansi pada 532 nm
sampel
y = 0,0409x R 2 = 0,9946
0,15 0,1 0,05 0 0
1
2
3
4
3
4
Konsentrasi (uM)
Hari ke-2 A-1
A-2
rataan
stdev
Kurva Standar TMP
Blanko
0
0
0
0
0,075
0,005
0,006
0,0055
0,000707
0,15
0,011
0,008
0,0095
0,002121
0,3
0,016
0,013
0,0145
0,002121
0,6
0,024
0,021
0,0225
0,002121
0,75
0,033
0,026
0,0295
0,00495
1,5
0,056
0,053
0,0545
0,002121
3
0,125
0,124
0,1245
0,000707
A-1
A-2
rataan
Absorban pada 532 nm
sampel
0,15
y = 0,0401x + 0,0006 R2 = 0,9937
0,1 0,05 0 0
1
2 Konsentrasi (uM)
Hari ke-3 stdev
Kurva Standar TMP
Blanko
0
0
0
0
0,075
0,006
0,003
0,0045
0,002121
0,15 0,3
0,009 0,015
0,01 0,012
0,0095 0,0135
0,000707 0,002121
0,6
0,023
0,034
0,0285
0,007778
0,75 1,5
0,03 0,06
0,023 0,056
0,0265 0,058
0,00495 0,002828
3
0,128
0,127
0,1275
0,000707
A-2
rataan
stdev
0,15 Absorban pada 532 nm
sampel
y = 0,0414x + 0,0005 R2 = 0,9941
0,1 0,05 0 0
1
2
3
4
Konsentrasi (uM)
Hari ke-4 A-1
Blanko
0
0
0,075
0,003
0,15
0,01
0,3
Kurva standar TMP
0
0
0,005
0,004
0,001414
0,013
0,0115
0,002121
0,012
0,017
0,0145
0,003536
0,6
0,034
0,024
0,029
0,007071
0,75
0,023
0,031
0,027
0,005657
1,5
0,056
0,059
0,0575
0,002121
3
0,127
0,124
0,1255
0,002121
rataan
stdev
absorban pada 532 nm
sampel
y = 0,0406x + 0,0013 R2 = 0,9932
0,15 0,1 0,05 0 0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
Konsentrasi (uM)
Hari ke-5 A-1
A-2
Kurva Standar TMP
Blanko
0
0
0
0
0,075
0,007
0,006
0,0065
0,000707
0,15 0,3
0,013 0,015
0,012 0,015
0,0125 0,015
0,000707 0
0,6
0,025
0,026
0,0255
0,000707
0,75
0,035
0,032
0,0335
0,002121
1,5
0,057
0,054
0,0555
0,002121
3
0,119
0,123
0,121
0,002828
Absorban pada 532 nm
sampel
0,14
y = 0,0387x + 0,0029
0,12
2
R = 0,9945
0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 0
1
2
Konsentrasi (uM)
3
4
Lampiran 6 Prosedur pengukuran konsentrasi lipid peroksida serum 0.3 mL serum +1.2 mL H2SO 4 0.083N, t=10 menit + 0.15 mL asam fosfotungstat 10%, t=5 menit Sentrifugasi 3000 rpm, t=20 menit pelet dipisahkan Pelet +1.2 mL H2SO 4 0.083N, + 0.15 mL asam fosfotungstat 10%, t=5 menit, T=27 oC Sentrifugasi 3000 rpm, t=15 menit pelet dipisahkan Pelet 2 mL akuades + 0.5 mL TBA 1% (dalam asam asetat 50%) Inkubasi T=95oC, t=60 menit dinginkan
Akuades 0,5 mL + HCl sampai pH 1.6-1.7 + butanol:piridin Sentrifus 3000 rpm (1600 xg) Supernatan (Lapisan atas)
Diukur pada λ=532 nm
16
Lampiran 7 Hasil konsentrasi lipid peroksida pada serum darah Kelompok
Negatif
No tikus 1 3 11 15 17 24 25
rataan stdev
Ekstrak air
0,36 0,36 0,38 0,41 0,38 0,36 0,38 0,01
0,11 0,83 0,45 0,59 0,86 0,47 0,55 0,27
1,05 0,61 0,93 0,76 0,71 0,24 0,72 0,25
5 7
0,37 0,12
0,33 0,33
0,69 0,81
mati 0,56
0,75
9 14 19 21
0,1 0,12 0,42 0,42 0,26 0,16
0,53 0,73 0,63 0,66 0,54 0,16
0,57 1,15 1,29 0,06 0,76 0,43
1,13 1,03 0,63 1,1 0,89 0,24
0,7 0,39 0,29 0,73 0,57 0,14
2 6 12 13 16 22
0,32 0,59 0,46 0,2 0,07 0,39 0,34 0,19
0,76 0,18 0,46 1,16 0,83 0,96 0,72 0,34
1,15 1,05 1,32 1,03 1,12 1,17 1,14 0,09
1,64 1,77 1,47 1,25 1,05 0,39 1,26 0,47
1,11 1,22 1,01 0,96 1,35 0,88 1,09 0,1
rataan stdev
pencarian konsentrasi lipid peroksida dengan menggunakan rumus persamaan y = 0,0401x + 0,0006 contoh perhitungan: y = absorbans x = konsentrasi
[uM] 0,55 0,34 0,39 0,18 0,47 0,05 mati 0,33 0,11
0,42 0,07 0,27 0,32 0,34 0,32 0,29 0,12
rataan stdev
Positif
Konsentrasi (µM) Lipid Peroksida [µM] [µM] [µM] 0,28 0,35 1,52 0,23 0,18 0,61 0,21 0,25 0,17 0,18 0,66 0,46 0,68 0,25 0,36 0,33 0,25 0,36 0,26 0,42 0,21 0,31 0,34 0,53 0,16 0,15 0,43
4 8 10 18 20 23
rataan stdev
Ekstrak etanol
[µM] 1,34 0,27 0,17 0,2 0,29 0,29 0,1 0,38 0,43
y = 0.055 x = 0.012 – 0.0006 0.0401 x = 0.28
jadi untuk absorbans 0.012 didapatkan konsentrasi sebesar 0.28 µM
0,67 0,67 0,91 1,06 0,36 mati 0,74 0,19
Lampiran 8 Hasil Uji Statistik ANOVA KONSEN
Between Groups Within Groups Total
Sum of Squares 1.165 .466
df 3 21
1.631
Mean Square .388 2.220E-02
F 17.492
Sig. .000
24
Multiple Comparisons Dependent Variable: KONSEN LSD
(I) PERLAK 1.00
2.00
3.00
4.00
Mean Difference (J) PERLAK (I-J) 2.00 -.1479 3.00 -.2245 4.00 -.5845* 1.00 .1479 3.00 -7.6667E-02 4.00 -.4367* 1.00 .2245 2.00 7.667E-02 4.00 -.3600* 1.00 .5845* 2.00 .4367* 3.00 .3600*
Std. Error 8.290E-02 8.290E-02 8.290E-02 8.290E-02 8.603E-02 8.603E-02 8.290E-02 8.603E-02
Sig. .089 .013 .000 .089 .383 .000 .013 .383
8.603E-02 8.290E-02 8.603E-02 8.603E-02
.000 .000 .000 .000
*. The mean difference is significant at the .01 level.
99% Confidence Interval Lower Bound Upper Bound -.3826 8.686E-02 -.4592 1.019E-02 -.8192 -.3498 -8.6861E-02 .3826 -.3202 .1669 -.6802 -.1931 -1.0194E-02 .4592 -.1669 .3202 -.6036 .3498 .1931 .1164
-.1164 .8192 .6802 .6036
Lampiran 9. Uji Fitokimia
Alkaloid Dragendorf
Alkaloid Meyer
Alkaloid Wagner
Fenolik Hidrokuinon
Flavonoid
Saponin
Steroid dan Triterpenoid
Tanin
