POLIMORFISME GEN FEKUNDITAS (BMPR1B DAN BMP15) PADA KAMBING KACANG, SAMOSIR DAN MUARA MOCHAMAD SYAIFUL RIJAL HASAN

POLIMORFISME GEN FEKUNDITAS (BMPR1B DAN BMP15) PADA KAMBING KACANG, SAMOSIR DAN MUARA

MOCHAMAD SYAIFUL RIJAL HASAN

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul “Polimorfisme Gen Fekunditas (BMPR1B dan BMP15) pada Kambing Kacang, Samosir dan Muara” adalah benar hasil karya saya sendiri dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum pernah diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, Juni 2011 Mochamad Syaiful Rijal Hasan

ABSTRACT MOCHAMAD SYAIFUL RIJAL HASAN. Polymorphism of fecundity genes (BMPR1B and BMP15) on Kacang, Samosir and Muara goats. Under supervision of ACHMAD FARAJALLAH and RADEN RORO DYAH PERWITASARI. Several Indonesian local goats are prolific. Fecundity was controlled by fecundity genes such as Bone Morphogenetic Protein Receptor 1B (BMPR1B), Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP15) and Growth Differentiation Factor 9 (GDF9). The present study aimed to identify the genetic diversity of fecundity genes (BMPR1B and BMP15) on three Indonesian local goats, namely Kacang, Samosir, and Muara, using PCR-RFLP and nucleotide sequencing methods. The PCR-RFLP’s showed that all sample of three Indonesian local goats are monomorphic. Verification result by nucleotide sequencing found two substitution were G72T on BMPR1B gene exon 8 and G43A on BMP15 gene exon 2. Both of the mutation were not part of recognizing site of restriction enzymes. Furthermore, the genetic diversity was identified for exon 1 and exon 2 of BMP15. Nucleotide sequence of exon 1 of BMP15 gene was monomorphic among the three Indonesian local goats. On the other hand, there are three mutant alleles were found on exon 2 among the three Indonesian local goats. Two mutant alleles of A325G and C398G were found on Kacang goats population. One mutant allele was C34T on Muara goats population. The population of Samosir goats have identically sequence of BMP15 exon 2. The phylogenetic tree based on coding sequence exon 2 showed that Kacang, Samosir and Muara goats clustered with several local goats in the world. Moreover, the phylogenetic tree also defined Kacang, Samosir and Muara goats as monoovulation group. Keyword : BMPR1B, BMP15, gene, Kacang goat, Samosir goat, Muara goat

RINGKASAN MOCHAMAD SYAIFUL RIJAL HASAN. Polimorfisme Gen Fekunditas (BMPR1B dan BMP15) pada Kambing Kacang, Samosir dan Muara. Dibimbing oleh ACHMAD FARAJALLAH dan RADEN RORO DYAH PERWITASARI. Indonesia memiliki potensi keanekaragaman hayati yang tinggi. Salah satunya adalah kambing lokal. Beberapa kambing lokal di Indonesia memiliki sifat unggul, antara lain bersifat prolifik. Sifat prolifik ini dikendalikan oleh gen fekunditas, antara lain Bone Morphogenetic Protein Receptor 1B (BMPR1B), Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP15) dan Growth Differentiation Factor 9 (GDF9). Gen BMPR1B yang dikenal sebagai FecB terletak pada kromosom 6 dan diekspresikan oleh sel oosit dan sel granulosa dalam ovarium. Mutasi pada FecB yang berkaitan dengan sifat prolifik adalah substitusi A746G yang menyebabkan substitusi asam amino Q249R. Adapun gen BMP15 yang dikenal sebagai FecX terletak di kromosom X dan hanya diekspresikan di dalam sel-sel oosit. Beberapa alel mutan pada gen BMP15 yang berhubungan dengan sifat prolifik adalah FecXI (Inverdale), FecXH (Hanna), FecXB (Belclare), FecXG (Galway), FecXL (Lacaune) dan FecXR (Rasa Aragonesa). Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman genetik gen fekunditas (BMPR1B dan BMP15) pada kambing Kacang, Samosir dan Muara menggunakan metode PCR-RFLP dan sekuensing nukleotida. Penelitian ini dibagi menjadi dua tahap. Tahap pertama, PCR-RFLP gen BMPR1B ekson 8 dengan menggunakan enzim AvaII dan gen BMP15 ekson 2 dengan menggunakan enzim HinfI. Tahap kedua, sekuensing nukleotida gen BMP15 ekson 1 dan 2. Hasil PCR-RFLP, baik gen BMPR1B maupun gen BMP15 menunjukkan bahwa semua sampel dari kambing Kacang, Samosir dan Muara merupakan tipe liar atau non-prolifik dan bersifat monomorfik. Hal ini tidak sesuai dengan data lapangan bahwa beberapa sampel yang diperoleh mempunyai jumlah anak sekelahiran lebih dari satu. Hasil ini mengindikasikan bahwa metode PCR-RFLP gen BMPR1B dan BMP15 tidak dapat dijadikan sebagai alat deteksi pada kambing Kacang, Samosir dan Muara. Hasil verifikasi dengan metode sekuensing menggunakan primer yang sama menunjukkan bahwa mutasi G72T pada gen BMPR1B dan mutasi G43A pada gen BMP15 bukan bagian dari situs pengenalan dari enzim restriksi yang digunakan. Hasil sekuensing nukleotida ruas ekson 1 gen BMP15 tidak menunjukkan polimorfisme antar ketiga kambing lokal Indonesia, tetapi beberapa situs ditemukan berbeda dengan kambing-kambing lainnya. Adapun hasil sekuensing nukleotida pada daerah ekson 2-nya ditemukan 3 varian nukleotida antar ketiga kambing lokal Indonesia. Populasi kambing Kacang memiliki dua alel mutan yaitu A325G dan C398G. Populasi kambing Muara menunjukkan satu alel mutan yaitu C34T, sedangkan populasi kambing Samosir bersifat monomorf.

Pohon filogeni berdasarkan coding sequence ekson 2 menunjukkan bahwa ketiga kambing lokal Indonesia berada dalam satu kelompok dengan kambingkambing lokal di dunia. Selain itu, pohon filogeni juga menempatkan kambing dalam kelompok hewan yang bersifat monoovulasi. Dari hasil penelitian ini menunjukkan bahwa kondisi prolifik dikendalikan secara aditif dan pleitropik. Selain itu, diduga ada peranan gen-gen yang lain yang mengatur sifat prolifik pada kambing.

© Hak Cipta milik IPB, tahun 2011 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB yang wajar Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya Tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

POLIMORFISME GEN FEKUNDITAS (BMPR1B DAN BMP15) PADA KAMBING KACANG, SAMOSIR DAN MUARA

MOCHAMAD SYAIFUL RIJAL HASAN

Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Biosains Hewan

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Prof. Drh. Arief Boediono PhD.

Judul Tesis

: Polimorfisme Gen Fekunditas (BMPR1B dan BMP15) pada Kambing Kacang, Samosir dan Muara

Nama

: Mochamad Syaiful Rijal Hasan

NRP

: G352090161

Disetujui Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si Ketua

Dr. Ir. R.R. Dyah Perwitasari, M.Sc Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Biosains Hewan

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Bambang Suryobroto

Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc. Agr

Tanggal Ujian : 11 Juli 2011

Tanggal Lulus :

 

 

PRAKATA Buku ini berisi hasil penelitian yang berjudul Polimorfisme Gen Fekunditas (BMPR1B dan BMP15) pada kambing Kacang, Samosir dan Muara sebagai prasyarat untuk memperoleh gelar Magister Sains dari Mayor Biosains Hewan, Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Penulis mengucapkan terima kasih atas segala bimbingan dan saran dalam menyelesaikan penelitian ini kepada Bapak Dr. Achmad Farajallah dan Ibu Dr. R.R. Dyah Perwitasari selaku Dosen Pembimbing. Ucapan Terima kasih penulis sampaikan kepada Prof. Drh. Arief Boediono PhD. selaku Penguji Luar Komisi atas saran dan arahannya. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Departemen Agama Republik Indonesia atas Program Beasiswa Utusan Daerah (BUD) pada Sekolah Pasca Sarjana Institut Pertanian Bogor. Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan atas sebagian bantuan dana penelitian dari kegiatan Kerjasama Kemitraan Penelitian Pertanian dengan Perguruan Tinggi (KKP3T) tahun 2010 dengan judul “Identifikasi Tiga Gen Fekunditas pada Empat Jenis Kambing Lokal (Kacang, Peranakan Etawah, Samosir dan Muara)”. Penulis menyampaikan terima kasih kepada Pimpinan dan Karyawan Lokalit Kambing Potong Sei putih, Medan serta beberapa pemilik kambing di Kabupaten Tapanuli Utara dan Kabupaten Samosir. Terima kasih juga kepada zoo corner community, Dr. Aron Batu Bara, Wildan Najmal Muttaqin M.Si dan Eryk Andreas M.Pt serta semua teman-teman atas kekeluargaannya. Ungkapan terima kasih yang tiada tara penulis persembahkan kepada Aba, Ummi dan Cak Lutfi atas dukungan do’a dan curahan kasih sayangnya. Ungkapan cinta pada istri dan putraku (Alkhoiriyatur Raudiatul Jannah “DIAH” dan Sayyid Husein Ahmadinejad “ZEN”) atas kesetiaan, ketulusan dan kesabarannya dalam mengobarkan semangat tuk terus melangkah dalam susah dan senang menatap masa depan. Akhirnya tiada gading yang tak retak. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Juni 2011 Mochamad Syaiful Rijal Hasan

RIWAYAT HIDUP Penulis adalah putra kedua dari dua bersaudara dari pasangan H.M. Hasan Abdus Syafik dan Hj. Siti Rohmah Eja Rahmawati. Penulis lahir di Jember-Jawa Timur pada 02 Februari 1981. Penulis lulus dari SMUN Kalisat pada tahun 1998, kemudian melanjutkan pendidikan pada jenjang sarjana di Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA), Jurusan Biologi, Universitas Negeri Jember tahun 1999. Pada tahun 2004 penulis dapat menyelesaikan studi S1. Penulis bekerja sebagai guru swasta yang memegang mata pelajaran biologi di Madrasah Aliyah Al Badri di Jember hingga saat ini. Pada tahun 2009, Alhamdulillah penulis mendapat kesempatan memperoleh beasiswa utusan daerah di Sekolah Pascasarjana Program Studi BioSains Hewan, Institut Pertanian Bogor dari Departemen Agama Republik Indonesia.

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL………………………………………......….………..

Halaman xvi

DAFTAR GAMBAR………………………………………………........

xvii

DAFTAR LAMPIRAN……………….…………………………….…...

xvii

1 PENDAHULUAN Latar Belakang………………………..………………….……… Tujuan Penelitian……………………………………....………... Manfaat Penelitian………………………………..…..……...…..

1 4 4

2 GEN FEKUNDITAS (BMPR1B DAN BMP15) PADA TIGA KAMBING LOKAL INDONESIA PENDAHULUAN……………………………………...……… BAHAN DAN METODE.............................................................. Waktu dan Tempat………………………………….....…… Pengambilan Sampel Darah Kambing…………………….…. Ekstraksi DNA……………………..……………………….... Amplifikasi Gen BMPR1B dan BMP15…………………...… Analisis Gen BMPR1B dan BMP15 Menggunakan PCR-RFLP dan Sekuensing………………… HASIL…………………………………………………….…….. PEMBAHASAN………………………………………………... SIMPULAN………………………………….………………..... 3

5 6 6 6 7 7 8 9 10 12

POLIMORFISME GEN BMP15 PADA KAMBING KACANG, SAMOSIR DAN MUARA PENDAHULUAN…………………………………………….… BAHAN DAN METODE.............................................................. Sampel DNA dan Amplifikasi Gen BMP15……………..…… Penentuan Genotip dengan Metode Sekuensing…………... HASIL…………………………………………………………… PEMBAHASAN………………………………...………………. SIMPULAN……………………………………………………...

13 14 14 14 15 17 19

4

PEMBAHASAN UMUM…………………………………….……..

21

5

SIMPULAN DAN SARAN………………………..………..….…...

25

DAFTAR PUSTAKA…………………………………………………....

27

LAMPIRAN…………………………………………………………….. 

33

DAFTAR GAMBAR Halaman 1

Penampilan Tiga Kambing Lokal Indonesia………………………………….

2

2

Amplikon gen BMPR1B……………...…………….……….........…............

9

3

Amplikon gen BMP15 ekson 2…………………………………………….....

9

4 Mutasi substitusi G→T gen BMPRIB nukleotida ke-72 pada kambing Kacang, Samosir dan Muara…………………………..….

10

5 Mutasi substitusi G→A gen BMP15 nukleotida ke-43 pada kambing Kacang, Samosir dan Muara .……………………..…………..

10

6

15

Amplikon gen BMP15 ekson 1 dan 2 pada kambing Kacang………………

7 Mutasi substitusi gen BMP15 pada kambing Kacang ……………….....

16

8 Mutasi substitusi C34T pada kambing Muara ……………………...…

16

9

Pohon filogeni kambing lokal Indonesia berdasarkan daerah coding sequence gen BMP15 ekson 2 menggunakan program MEGA 4 dengan metode Neighbour-joining dengan bootstrap 1000x. Angka di percabangan menunjukkan nilai bootstrap……....................................................……..……

17

DAFTAR TABEL Halaman 1 Jumlah sampel darah kambing………………………………...……......

7

2 Alel mutan pada gen BMP15……………….………….…………………….

18

DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Informasi sekuens gen BMP15 pada Capra hircus breed Guizhou White…………………………………………………..

33

2 Beberapa spesies yang digunakan dalam analisis pohon filogeni gen BMP15 ekson 2…………………………………………………………

35

3 Hasil pensejajaran coding sequence Ekson 2 Gen BMP15 kambing lokal Indonesia terhadap beberapa spesies Mamalia, burung dan ikan (No. merujuk pada nama spesies yang ada di lampiran 2). Nomor tiga baris di bagian atas dibaca secara vertikal).………….………… ……...

36

.

1   

PENDAHULUAN  

Latar Belakang Indonesia memiliki sumber daya alam dengan keragaman genetik yang melimpah. Salah satu diantaranya adalah ternak kambing lokal Indonesia yang telah beradaptasi dengan kondisi geografis setempat. Kambing di Indonesia merupakan ternak ruminansia kecil dengan jumlah paling tinggi di Asia Tenggara (Sodiq & Taufik 2003). Beberapa kambing lokal Indonesia seperti kambing Kacang, Samosir dan Muara memiliki keunggulan karena bersifat prolifik (Gambar 1). Kambing Kacang merupakan kambing asli Indonesia. Kambing Kacang merupakan kambing penghasil daging dengan rata-rata litter size 1.56–1.98 anak per kelahiran (Hoda 2008). Kambing Kacang memiliki ukuran tubuh sedang dengan corak warna yang sangat beragam mulai dari putih, hitam, coklat ataupun kombinasi dari ketiga warna tersebut. Kambing Samosir dipelihara oleh penduduk di Pulau Samosir, Kabupaten Toba Samosir dan sering digunakan sebagai bahan upacara persembahan salah satu aliran kepercayaan (Parmalim). Kambing Samosir memiliki ciri khas berupa warna bulu dominan putih dengan ukuran tubuh sedang. Adapun kambing Muara telah lama beradaptasi di Kecamatan Muara Kabupaten Tapanuli Utara dengan kondisi topografi yang bergununggunung. Ciri khas Kambing Muara adalah ukuran tubuhnya paling besar diantara kambing Kacang maupun kambing Samosir. Kambing Muara memiliki corak warna yang bervariasi seperti pada kambing Kacang. Sifat prolifik yaitu kemampuan mempunyai anak lebih dari satu dalam satu kali kelahiran. Sifat prolifik pada ternak ruminansia dapat dibedakan menjadi dua kelompok, yaitu monozigot dan multizigot. Kelompok monozigot mengovulasikan satu oosit, kemudian embrio muda yang terbentuk membelah menjadi dua atau lebih embrio yang mampu hidup. Kelompok ini akan menghasilkan anak kembar identik. Kelompok multizigot mengovulasikan lebih dari satu oosit dalam suatu waktu. Apabila ada beberapa oosit yang berhasil dibuahi maka ternak akan melahirkan lebih dari satu anak dalam satu kali periode kelahiran.

2   

Gambar 1 Penampilan Tiga Kambing Lokal Indonesia. Salah satu tahapan penting dalam sistem reproduksi adalah proses pematangan folikel hingga siap untuk diovulasikan yang dikenal dengan oogenesis. Folikel adalah oosit yang dilapisi oleh dua jenis sel somatik, yaitu sel granulosa dan sel theka. Tahap perkembangan folikel meliputi primordial, primer, sekunder, awal tersier (antral atau Graafian), akhir tersier dan pre ovulasi. Rangkaian proses oogenesis melibatkan beragam sinyal baik berupa hormon maupun faktor. Hormon merupakan sinyal molekul yang dihasilkan oleh sel endokrin dan didistribusikan melalui aliran darah menuju sel target atau ke seluruh tubuh. Beberapa hormon yang berperan dalam proses oogenesis antara lain Follicle Stimulating Hormone (FSH), estrogen, luteinizing Hormone (LH) dan progesteron. Hormon FSH berfungsi untuk merangsang pertumbuhan sel-sel folikel di sekeliling ovum. Folikel primordial akan tumbuh menjadi folikel de Graaf. Folikel de Graaf akan menghasilkan hormon estrogen yang berfungsi merangsang kelenjar hipofisis untuk mensekresikan hormon LH. Hormon LH akan merangsang terjadinya ovulasi. Sisa folikel dari proses ovulasi akan membentuk korpus luteum yang selanjutnya menghasilkan progesteron. Hormon

3   

progesteron berperan dalam menghambat kelenjar hipofisis untuk mensekresikan FSH dan LH. Faktor merupakan suatu sinyal molekular yang dihasilkan oleh suatu sel untuk merangsang kerja dari sel lain di sekitarnya. Faktor diedarkan melalui difusi cairan matriks ekstra selular. Faktor dikelompokkan sebagai sinyal parakrin. Salah satu contoh sinyal parakrin yang berperan dalam proses oogenesis adalah anggota super famili Transforming Growth Factor β (TGF β), diantaranya Bone Morphogenetic Protein Receptor 1B (BMPR1B) dan Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP15). BMP15 merupakan suatu faktor pertumbuhan yang berfungsi dalam mengatur proliferasi dan diferensiasi sel granulosa di awal perkembangan folikel (Otsuka et al. 2000). BMPR1B merupakan reseptor bagi beberapa faktor BMP termasuk BMP15 (ten Dijke et al. 2003). Sifat prolifik dikendalikan oleh gen-gen yang dikelompokkan sebagai gen kesuburan (fecundity genes) (Davis 2004). Gen BMPR1B atau activin-like kinase 6 (ALK 6) dikenal sebagai FecB. Gen BMPR1B terletak pada kromosom 6 yang diekspresikan oleh sel oosit dan sel granulosa. Mutasi substitusi A746G atau pada tingkat asam amino mutasi Q249R pada FecB akan meningkatkan laju ovulasi rata-rata 1.5 dan rataan litter size 1.0 pada heterozigot carrier. Mutasi yang sama pada homozigot carrier akan meningkatkan laju ovulasi rata-rata 3.0 dengan rataan litter size 1.5 (Mulsant et al. 2001; Souza et al. 2001; Wilson et al. 2001; Davis 2005). Gen BMP15 atau GDF9B dikenal sebagai FecX terletak di kromosom X dan diekspresikan oleh sel oosit. Mutasi pada gen BMP15 pertama kali dilaporkan oleh Galloway et al. (2000). Mutasi pada FecX berkorelasi dengan peningkatan laju ovulasi dan litter size pada genotip heterozigot carrier, sedangkan pada genotip homozigot carrier dapat menyebabkan sifat steril. Ada enam alel mutan yang sudah diketahui pada gen BMP15 yaitu FecXI (Inverdale), FecXH (Hanna), FecXB (Belclare), FecXG (Galway), FecXL (Lacaune) dan FecXR (Rasa Aragonesa) (Galloway et al. 2000; Hanrahan et al. 2004; Bodin et al. 2007; Martinez-Royo et al. 2008). Mutasi substitusi Q239Ter pada gen BMP15 yang berkorelasi dengan sifat prolifik adalah FecXG. Situs mutan tersebut ternyata bisa dikenali sebagai situs restriksi enzim HinfI. Dengan begitu, deteksi dini terhadap sifat prolifik

4   

kemudian dikembangkan oleh Hanrahan et al. (2004) pada domba menggunakan teknik PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism). Metode PCR-RFLP merupakan metode untuk mendeteksi ada tidaknya mutasi pada situs pemotongan yang khas suatu enzim restriksi. Pada beberapa populasi ternak, PCR-RFLP terbukti sebagai metode deteksi mutasi substitusi yang cepat dan akurat. Pemanfaatan teknik PCR-RFLP dapat digunakan untuk meningkatkan produktivitas hewan ternak melalui skrining dan pendeteksian hasil persilangan (Pardhesi et al. 2005). Apabila mutasi substitusi tidak terjadi pada situs pemotongan suatu enzim restriksi, maka metode pendeteksiannya bisa dilakukan dengan metode SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) ataupun perunutan nukleotida (DNA sequencing). Metode sekuensing DNA lebih akurat dalam mendeteksi kejadian mutasi tetapi relatif mahal dan membutuhkan waktu yang lama.

Tujuan penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman gen fekunditas (BMPR1B dan BMP15) pada tiga kambing lokal Indonesia, yaitu kambing Kacang, Samosir dan Muara dengan menggunakan metode PCR-RFLP dan sekuensing.

Manfaat Penelitian Penelitian ini dapat dimanfaatkan sebagai informasi awal tentang keragaman genetik gen fekunditas (BMPR1B dan BMP15) pada tiga kambing lokal Indonesia yaitu kambing Kacang, Samosir dan Muara.

Hasil yang

diharapkan adalah apabila metode deteksi cepat PCR-RFLP ditemukan berkorelasi dengan sifat prolifik, maka hasilnya dapat digunakan sebagai metode deteksi dini sifat prolifik.  

5   

GEN FEKUNDITAS (BMPR1B DAN BMP15) PADA TIGA KAMBING LOKAL INDONESIA PENDAHULUAN Sifat prolifik adalah kemampuan untuk melahirkan lebih dari satu anak sekaligus dalam satu kali periode kelahiran. Sifat prolifik dikendalikan oleh gengen yang dikelompokkan sebagai gen kesuburan (fecundity genes). Ada tiga jenis gen Fec yang sudah diidentifikasi pada ruminansia kecil, yaitu Bone Morphogenetic Protein Receptor type 1B (BMPR1B), Growth Differentiation Factor 9 (GDF9) dan Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP15) (Galloway et al. 2000; Souza et al. 2001; Hanrahan et al. 2004). Gen BMPR1B atau activin-like kinase 6 (ALK 6) dikenal sebagai FecB. Gen BMPR1B terletak pada kromosom 6 yang diekspresikan oleh sel oosit dan sel-sel granulosa. Mutasi pada FecB terjadi karena substitusi A746G pada cDNA yang menyebabkan substitusi asam amino Q249R (Mulsant et al. 2001; Souza et al. 2001; Wilson et al. 2001). Mutan heterozigot carrier akan mengalami peningkatan laju ovulasi rata-rata 1.5 dengan rataan litter size 1.0. Sedangkan mutan homozigot carrier akan mengalami peningkatan yang lebih tinggi yaitu laju ovulasinya rata-rata 3.0 dengan rataan litter size 1.5 (Davis 2005). Gen BMP15 atau FecX terletak di kromosom X dan diekspresikan oleh sel oosit. Anggota super famili Transforming Growth Factor β (TGF β) ini disebut BMP15 karena secara struktural dapat dikelompokkan ke dalam anggota BMP (Dube et al. 1998). Selain itu, BMP15 juga dikenal sebagai GDF9B karena kemiripannya dengan GDF9 (Laitinen et al. 1999). Mutasi pada FecX berkorelasi dengan peningkatan laju ovulasi dan litter size pada genotip heterozigot carrier, sedangkan pada genotip homozigot carrier dapat menyebabkan sifat steril. Ada lima alel akibat mutasi titik (single substitution) pada FecX yang telah ditemukan, yaitu FecXI (Inverdale), FecXH (Hanna), FecXB (Belclare), FecXG (Galway) dan FecXL (Lacaune) (Galloway et al. 2000; Hanrahan et al. 2004; Bodin et al. 2007). Selain itu, ada satu alel yang disebabkan oleh mutasi delesi 17 pb yang disebut FecXR (Rasa Aragonesa) (Martinez-Royo et al. 2008). Metode PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism) merupakan metode deteksi mutasi yang cepat dan akurat

6   

dalam skala massal. Metode PCR-RFLP memanfaatkan adanya situs pemotongan yang khas dari suatu enzim restriksi untuk mendeteksi terjadinya mutasi pada suatu fragmen DNA. Metode sekuensing DNA menghasilkan data yang lebih akurat karena berdasarkan perunutan nukleotida. Metode sekuensing relatif mahal dan membutuhkan waktu yang lama. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi keragaman genetik gen fekunditas (BMPR1B dan BMP15). Populasi ternak yang diteliti adalah tiga kambing lokal Indonesia meliputi kambing Samosir, kambing Muara dan kambing Kacang dengan metode PCR-RFLP dan sekuensing.

BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Mei 2010 sampai dengan Januari 2011 di Laboratorium bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Pengambilan Sampel Darah Kambing Sampel darah kambing Kacang yang digunakan adalah koleksi Loka Penelitian Kambing Potong Sei Putih, Sumatera Utara. Berdasarkan catatan yang tersedia, dari total 25 ekor kambing, 14 ekor bersifat prolifik atau setidaknya pernah melahirkan anak lebih dari satu per kelahiran, sedangkan 11 ekor yang lain selalu beranak tunggal (Tabel 1). Kambing Samosir diambil dari peternakan rakyat di Kabupaten Samosir (60 ekor) dan Kambing Muara di peternakan rakyat di Kabupaten Tapanuli Utara, Provinsi Sumatera Utara (35 ekor). Pembagian sifat prolifik atau tidaknya didasarkan pada wawancara terhadap pemilik kambing. Sampel darah diambil dari vena jugularis menggunakan jarum venoject yang dihubungkan dengan tabung vakum sekitar 2 ml dari setiap ekor kambing. Darah yang diperoleh langsung diawetkan dalam alkohol absolut 2x volume darah.

7   

Tabel 1 Jumlah sampel darah kambing Jenis Kambing Prolifik Non Prolifik + Unknown Kacang 14 11 Samosir 24 36 Muara 9 26

Jumlah 25 60 35

Total 47 73 120 Prolifik: jumlah anak 2-5, Non prolifik: jumlah anak 1, unknown: tidak diketahui

Ekstraksi DNA Ekstraksi genom DNA dilakukan menggunakan Genomic DNA Mini Kit for Fresh Blood (GeneAid) yang dimodifikasi untuk sampel darah yang diawetkan dalam alkohol. Modifikasi yang dilakukan bertujuan untuk menghilangkan alkohol sebelum dilakukan proses ekstraksi DNA. Sampel darah dalam alkohol sebanyak 1mL disentrifugasi 2000 g selama 5 menit. Endapan sel dicuci dengan menambahkan akuades steril hingga volume total 1.5 mL dan didiamkan selama 20 menit. Pencucian ini dilakukan sebanyak dua kali. Sel-sel darah yang telah bersih dari alkohol disuspensikan dengan bufer pelisis 100 µL, kemudian ditambahkan enzim Proteinase K 0.01-0.5 µg/mL dan diinkubasi pada suhu 60 0C selama 30 menit. Pemisahan bahan organik non-DNA dan pemurnian molekul DNA dilakukan sesuai dengan prosedur dari Genomic DNA Mini Kit.

Amplifikasi Gen BMPR1B dan BMP15 Ruas ekson 8 gen BMPR1B dan ekson 2 gen BMP15 diamplifikasi dengan mesin TaKaRa Thermal Cycler dalam reaksi PCR 12 µL. Komposisi pereaksi terdiri atas sampel DNA sekitar 10 ng, primer forward dan reverse masing-masing 0.5 µL 25 mM, dan KAPA Taq Ready Mix DNA polymerase 6 µL (KAPATaq DNA polymerase 0.05 U/µL, bufer polimerase dengan Mg2+.25 mM dan setiap dNTP masing-masing 0.4 mM). Kondisi PCR, yaitu predenaturasi 94 0C selama 5 menit, (denaturasi 94 0C selama 60 detik, penempelan primer 58 0C selama 90 detik, pemanjangan 72 0C 90 detik) sebanyak 30 siklus, pemanjangan akhir pada suhu 72 0C selama 10 menit, dan penyimpanan dilakukan pada suhu 4 0C. Amplikon dimigrasikan pada elektroforesis gel poliakrilamida 6% dengan

8   

menggunakan penanda DNA Ladder 100 pb (Generay Biotech), kemudian dilanjutkan dengan pewarnaan perak (Byun et al. 2009). Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi ruas ekson 8 dari gen BMPR1B adalah primer forward AF84 5’-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG dan primer reverse AF85 5’-GATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC yang akan menghasilkan produk PCR sebesar 137 pb (Wilson et al. 2001). Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi ruas ekson 2 gen BMP15 adalah primer forward AF86 5’-CTTCTTGTTACTGTATTTCAATGAGAC dan primer reverse AF87 5’-GATGCAATACTGCCTGCTTG yang akan menghasilkan produk PCR sebesar 135 pb (Hanrahan et al. 2004).

Analisis Gen BMPR1B dan BMP15 Menggunakan PCR-RFLP dan Sekuensing  

Amplikon gen BMPR1B dipotong dengan enzim AvaII (G/GACC) (Boehringer Mannheim, GmbH-Germany). Sebanyak 3 µL amplikon direaksikan dengan enzim restriksi AvaII 7.5 U pada suhu 37 0C yang diinapkan semalaman. Amplikon yang tidak terpotong disebut dengan tipe liar. Hewan tipe liar tidak memiliki situs pemotongan sehingga panjang fragmen DNAnya tetap 137 pb. Amplikon yang terpotong akan memiliki panjang fragmen DNA 109 pb dan 28 pb disebut mutan homozigot carrier. Amplikon yang terpotong dan memiliki tiga jenis fragmen DNA yaitu 137 pb, 109 pb dan 28 pb disebut mutan heterozigot carrier. Amplikon gen BMP15 dipotong dengan enzim Hinf I (G/ACT) (Boehringer Mannheim, GmbH-Germany). Amplikon sebanyak 3 µL ditambah enzim HinfI 7.5 U. Suspensi diinkubasi semalam pada suhu 37 0C. Amplikon yang terpotong menjadi dua fragmen DNA masing-masing 110 pb dan 25 pb disebut dengan hewan tipe liar. Amplikon yang tidak terpotong mempunyai panjang fragmen DNA 135 pb disebut mutan FecXG . Hasil PCR-RFLP kemudian diverifikasi dengan metode sekuensing. Seluruh amplikon gen BMPR1B dicampur menjadi satu. Hal ini juga dilakukan pada semua amplikon gen BMP15. Campuran amplikon dibagi menjadi dua kelompok besar yaitu A (gen BMPR1B) dan B (gen BMP15). Sekuensing

9   

dilakukan pada campuran amplikon A dan B menggunakan primer yang sama dengan amplifikasi awal.

HASIL Amplifikasi gen BMPR1B menggunakan primer AF84 dan AF85 menghasilkan fragmen DNA dengan panjang 137 pb (Gambar 2A). Hasil pemotongan enzim AvaII (G/GACC) pada semua sampel memperlihatkan satu pola yang sama, yaitu amplikon tidak terpotong (Gambar 2B).   1    2     3      4      5    6     M 

1   2     3     4     5     6   M  2oo pb

 2oo pb 

137 pb

137 bp

1oo pb

1oo pb

A

B

 

Gambar 2 Amplikon gen BMPR1B (A) Amplikon awal (B) Amplikon setelah dipotong dengan Ava II (M) Marker 100 pb (1-6) Kambing Muara. Amplifikasi gen BMP15 menggunakan primer AF86 dan AF87 menghasilkan fragmen DNA dengan panjang 135 pb (Gambar 3A). Hasil pemotongan dengan enzim HinfI (G/ACT) memperlihatkan bahwa semua sampel terpotong menjadi 110 pb dan 25 pb (Gambar 3B).

 1   2     3      4      5    6    M 

    1    2     3      4     5      6   M  2oo pb 

2oo pb

135 pb

110 pb  100 pb 

1oo pb 

A B Gambar 3 Amplikon gen BMP15 ekson 2 (A) Amplikon awal (B) Amplikon setelah dipotong dengan HinfI (M) Marker 100 pb (1-6) Kambing Kacang. Hasil analisis gen BMPR1B dan BMP15 berdasarkan PCR-RFLP pada kambing Kacang, Samosir dan Muara ini kemudian diverifikasi dengan sekuensing. Hasil

10   

sekuensing pada gen BMPR1B dari ketiga kambing lokal Indonesia menunjukkan adanya mutasi substitusi G→T pada posisi basa nukleotida ke-72 (Gambar 4). Pada hasil sekuensing nukleotida pada gen BMP15 ditemukan mutasi substitusi G→A pada posisi basa nukleotida ke-43 (Gambar 5).

Gambar 4 Mutasi substitusi G→T gen BMPRIB nukleotida ke-72 pada kambing Kacang, Samosir dan Muara.

Gambar 5 Mutasi substitusi G→A gen BMP15 nukleotida ke-43 pada kambing Kacang, Samosir dan Muara.

PEMBAHASAN Salah satu faktor yang menentukan keberhasilan metode PCR-RFLP adalah kerja enzim restriksi yang maksimal. Satu unit enzim restriksi adalah kemampuan untuk memotong substrat DNA sebanyak 1 μg dalam 50 μL reaksi selama 60 menit. Pada penelitian ini, PCR-RFLP dilakukan dengan menggunakan enzim restriksi yang cukup tinggi yaitu 7.5 U dan waktu yang cukup lama yaitu diinkubasi selama semalam. Hal ini untuk menjamin bahwa semua amplikon dapat terpotong dengan sempurna. Oleh karena itu, kondisi amplikon gen BMPR1B yang tidak terpotong bukan disebabkan enzim restriksi tidak bekerja dengan baik, tetapi disebabkan amplikon tidak memiliki situs pemotongan enzim AvaII (G/GACC).

11   

Hasil PCR-RFLP gen BMPR1B dan BMP15 pada kambing Kacang, Samosir dan Muara menyimpulkan bahwa ketiga kambing lokal Indonesia merupakan tipe liar. Ternak dengan genotip tipe liar bersifat non prolifik (Wilson et al. 2001; Hanrahan et al. 2004). Hal ini berlawanan dengan fakta bahwa beberapa sampel yang diperoleh di lapangan dari ketiga kambing lokal Indonesia ini bersifat prolifik. Oleh karena itu, metode PCR-RFLP terhadap gen BMPR1B dan BMP15 tidak dapat digunakan sebagai alat untuk mendeteksi sifat prolifik pada ketiga kambing lokal Indonesia. Selain pada kambing Indonesia, metode PCR-RFLP juga tidak bisa digunakan untuk mendeteksi sifat prolifik berdasarkan gen BMPR1B dan BMP15 kambing lokal Iran (Deldar-Tajangookeh et al. 2009), enam jenis kambing China, yaitu Boer, persilangan Boer x Huanghuai (BH), Huanghuai, Haimen, Nubi dan Matou (Hua et al. 2008). Selain pada kambing, metode

deteksi

sifat

prolifik

menggunakan

metode

PCR-RFLP

yang

dikembangkan oleh (Davis et al. 2002; Hanrahan et al. 2004), ternyata tidak bisa bekerja dengan baik pada domba Sangsari Iran (Kasiriyan et al. 2009), 19 domba prolifik dari berbagai negara (Davis et al. 2006), domba Shal (Ghaffari et al. 2009), lima jenis domba Mesir, yaitu Rahmani, Ossimi, Awassi, Barki dan persilangan Awassi x Barki (EL-Hanafy & El-Saadani 2009), dan lima jenis domba Mediterania dan Afrika Utara, yaitu Barbarine, Queue Fine de L’ Quest (Tunisia), Noire de Thibar (Tunisia/Perancis), Sicilo-Sarde (Italia) dan D’man (Maroko) (Vacca et al. 2010). Selain itu, Chu et al. (2010) mengungkapkan bahwa polimorfisme gen BMPR1B pada kambing Jining Grey tidak berkorelasi dengan sifat prolifik. Polley et al. (2009) menyatakan bahwa pada kambing Black Bengal India, gen BMP15 adalah monomorfik, sedangkan polimorfisme pada gen BMPR1B ditemukan berkorelasi dengan sifat prolifik. Beberapa kejadian yang paralel dengan hasil PCR-RFLP gen BMPR1B dan BMP15 yang monomorfik pada tiga kambing lokal Indonesia menunjukkan bahwa SNP (single nucleotide polymorphisme) yang dijadikan dasar untuk membuat metode PCR-RFLP hanya berlaku pada satu bangsa ternak saja. Hal ini berarti analisis korelasi yang telah dibuat (Davis et al. 2002; Hanrahan et al. 2004) hanya berlaku untuk satu bangsa ternak saja. Walaupun begitu, penetapan sifat prolifik dalam penelitian ini adalah berbasis jumlah anak yang dilahirkan. Adapun

12   

gen BMP1RB dan BMP15 bekerja pada sel granulosa (Dube et al.1998; Mulsant et al. 2001) sehingga ada peluang kambing Kacang, Samosir dan Muara memiliki lebih dari satu oosit yang diovulasikan.

SIMPULAN Hasil PCR-RFLP gen BMPR1B dan BMP15 pada kambing Kacang, Samosir dan Muara menunjukkan bahwa semua sampel merupakan tipe liar. Hasil sekuensing pada kambing Kacang, Samosir dan Muara menunjukkan mutasi substitusi G72T pada gen BMPR1B dan mutasi substitusi G43A pada gen BMP15. Kedua mutasi ini tidak berkaitan dengan situs restriksi pada enzim AvaII dan HinfI.

13   

POLIMORFISME GEN BMP15 PADA KAMBING KACANG, SAMOSIR DAN MUARA PENDAHULUAN Super famili Transforming Growth Factor β (TGF β) merupakan suatu faktor pertumbuhan berupa molekul protein yang berfungsi sebagai sinyal ekstra seluler. Super famili TGF β terdiri dari TGF β

1,2,3

, Anti Mullerian Hormone

(AMH), 2 Inhibin (A dan B), 3 Aktivin (A,B, dan AB), sekitar 20 macam Bone Morphogenetic Protein (BMP1 – BMP20) dan setidaknya 9 Growth Differentiation Factors (GDF1-GDF9) (Dirangkum oleh Knight dan Glister 2006). Gen Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP15) atau FecX terletak di kromosom X yang ekuivalen dengan Xp11.2-p11.4 pada manusia dan diekspresikan hanya pada sel oosit (Galloway et al. 2000). BMP15 berfungsi dalam mengatur proliferasi dan diferensiasi sel granulosa di awal perkembangan folikel (Otsuka et al. 2000). Mutasi pada gen BMP15 dapat meningkatkan laju ovulasi dan litter size pada mutan heterozigot carrier dan menyebabkan sifat steril pada mutan homozigot carrier. Ada enam alel mutan pada Fec X yang telah ditemukan yaitu lima alel berupa mutasi titik yaitu Fec XI (Inverdale), Fec XH (Hanna), Fec XB (Belclare), Fec XG (Galway) dan Fec XL (Lacaune) (Galloway et al. 2000; Hanrahan et al. 2004; Bodin et al. 2007) dan satu alel berupa mutasi delesi 17 pb yaitu Fec XR (Rasa Aragonesa) (Martinez-Royo et al. 2008). Mutasi substitusi pada Fec XI, Fec XL dan Fec XB menyebabkan adanya perubahan asam amino non conserve berturut-turut pada posisi 31, 53 dan 99 pada proprotein BMP15. Mutasi substitusi Fec XH dan Fec XG menyebabkan stop kodon prematur berturut-turut pada posisi 291 dan 239 dari proprotein BMP15. Adapun mutasi delesi (Fec XR) mengubah kerangka pembacaan kodon mRNA yang menyebabkan stop kodon prematur pada posisi 208 dari proprotein BMP15. Metode sekuensing merupakan pengembangan teknik yang berkaitan dengan DNA. Metode ini menghasilkan informasi yang lebih akurat karena berdasarkan pada perunutan nukleotida dari suatu fragmen DNA. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman genetik gen BMP15 pada tiga kambing lokal Indonesia yaitu kambing Kacang, Samosir dan Muara.

14   

BAHAN DAN METODE  

Sampel DNA dan Amplifikasi Gen BMP15 Jumlah dan jenis sampel DNA kambing yang dipergunakan sama dengan sampel DNA pada bab sebelumnya. Amplifikasi gen BMP15 dilakukan dengan mesin TaKaRa Thermal Cycler. Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen BMP15 ekson 1 dan ekson 2 didesain dengan mengacu pada Capra hircus breed Guizhou White berdasarkan data GenBank dengan No. Akses FJ429281 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (Lampiran1). Pasangan primer forward AF218 5’-GATGCAAAGAGGACAATTTAGAAGACC dan primer reverse AF219 5’CCCACCAGAACAATATAGTATGATAACTC digunakan untuk amplifikasi ekson 1. Amplifikasi ekson 2 dilakukan dengan menggunakan pasangan primer forward AF222 5’-TGCAGGCTCCTGGCACATACAGAC dan primer reverse AF223 5’TCACCTGCATGTGCAGGACTGGG. Reaksi PCR dilakukan dalam volume 12 µL, yang terdiri atas sampel DNA sekitar 10 ng, primer forward dan reverse masingmasing 0.5 µL 25 mM, dan KAPA Taq Ready Mix DNA polymerase 6 µL (KAPATaq DNA polymerase 0.05 U/µL, bufer polimerase dengan Mg2+.25 mM dan setiap dNTP masing-masing 0.4 mM). Kondisi PCR, yaitu predenaturasi 94 0

C, selama 5 menit, (denaturasi 94 0C, 60’, penempelan primer ekson 1 60 0C,

90’, pemanjangan 72 0C, 90’) sebanyak 30 siklus, pemanjangan akhir pada suhu 72 0C selama 10 menit, dan penyimpanan dilakukan pada suhu 4 0C. Kondisi PCR untuk ekson 2 sama kecuali penempelan primer yaitu 64

0

C. Amplikon

dimigrasikan pada gel poliakrilamida 6% dengan penanda DNA Ladder 100 pb (Generay Biotech) yang dilanjutkan dengan pewarnaan perak (Byun et al. 2009).

Penentuan Genotip dengan Metode Sekuensing Amplikon dari jenis kambing yang sama dicampur, sehingga ada tiga kelompok besar yaitu sampel kambing Kacang (K), kambing Samosir (S), dan kambing Muara (M). Proses sekuensing dilakukan pada hasil pencampuran amplikon dengan menggunakan primer yang sama seperti proses amplifikasi awal. Hasil sekuensing berupa grafik elektroforegram diedit secara manual dengan software Bioedit versi 7.0.9.0 (Hall 1999). Urutan nukleotida yang sudah benar

15   

kemudian disejajarkan dan dianalisis lebih lanjut dengan program MEGA4.0 (Tamura et al. 2007) dan Genetyx-win 4.1. Analisis filogeni kambing lokal Indonesia dilakukan berdasarkan daerah coding sequence gen BMP15 ekson 2 menggunakan metode Neighbour-joining (NJ) dengan bootstrap 1000x. Data sekuen pembanding yang digunakan diperoleh dari data GenBank yaitu Pongo abelii : XM_002831651, Pan troglodytes : XM_529247,

Macaca

mulatta

:

XM_001083980,

Equus

caballus

:

XM_001496223, Jining Grey : EU743938, Homo sapiens : AF082350, Gallus gallus : AY729025, Bos Taurus : DQ463368, Yunling Black : EU847284, Boer : EU847289, Black Bengal : EU888137, Guizhou White : FJ429281, Markhoz : GU732196, Ovis aries : AF236079, Mus musculus : NM_009757, Rattus norvegicus : NM_021670, Bubalus bubalis : EF375880 dan Carassius gibelio : HQ179985. (Lampiran 2 dan 3).

HASIL Amplifikasi gen BMP15 ekson 1 yang diapit oleh primer forward AF218 dan primer reverse AF219 menghasilkan fragmen DNA sepanjang 574 pb (Gambar 6A). Amplifikasi gen BMP15 ekson 2 yang diapit oleh primer forward AF222 dan primer reverse AF223 menghasilkan fragmen DNA sepanjang 861 pb (Gambar 6B).        1     2     3     4    5    6           M 

     1     2      3      4     5      6    M

861 pb 574 pb

100 pb

100 pb

A B Gambar 6 Amplikon gen BMP15 ekson 1 dan 2 pada kambing Kacang (A) ekson 1 = 574 pb (B) ekson 2 = 861 pb (M) Marker 100 pb (1-6) Kambing Kacang. Hasil sekuensing menunjukkan bahwa gen BMP15 pada daerah ekson1 memiliki urutan nukleotida yang identik pada ketiga populasi kambing lokal Indonesia (kambing Kacang, Samosir dan Muara). Pada daerah ekson 2

16   

ditemukan 3 varian nukleotida yang berbeda antar populasi kambing lokal Indonesia. Pada populasi kambing Kacang ditemukan dua macam mutasi substitusi (Gambar 7). Pertama, transisi A→G pada posisi nukleotida ke-325 yang bersifat mutasi bisu karena tidak menyebabkan perubahan asam amino ke-108 yaitu tetap sebagai lisin. Kedua, transversi C→G pada posisi nukleotida ke-398. Mutasi ini bersifat mutasi netral karena menyebabkan perubahan asam glutamat menjadi glutamin pada posisi asam amino ke-133 namun tidak merubah fungsi protein.

A B Gambar 7 Mutasi substitusi gen BMP15 pada kambing Kacang (A) Mutasi substitusi A325G (B) Mutasi substitusi C398G.  

Gambar 8 Mutasi substitusi C34T pada kambing Muara. Populasi kambing Muara menunjukkan satu mutasi substitusi C34T (Gambar 8). Mutasi ini tidak menyebabkan adanya perubahan asam amino pada posisi ke-11 yaitu tetap sebagai leusin. Pada populasi kambing Samosir tidak ditemukan adanya variasi nukleotida. Hasil analisis pohon filogeni berdasarkan daerah coding sequence ekson 2 menunjukkan bahwa ketiga kambing lokal Indonesia berada dalam satu kelompok

17   

dengan berbagai jenis kambing di dunia, seperti Boer, Ghuizou White, Black Bengal, Markhoz, ataupun Yunling Black (Gambar 9).

Gambar 7 Pohon filogeni kambing lokal Indonesia berdasarkan daerah coding sequence gen BMP15 ekson 2 menggunakan program MEGA 4 dengan metode Neighbour-joining dengan bootstrap 1000x. Angka di percabangan menunjukkan nilai bootstrap. Pada pohon filogeni tampak percabangan yang memisahkan kelompok hewan yang bersifat monoovulasi dengan kelompok hewan yang bersifat poliovulasi dengan nilai bootstrap 100. Kelompok hewan yang bersifat monoovulasi meliputi beberapa hewan ruminansia dan primata. Kelompok hewan yang bersifat poliovulasi terdiri atas Mus musculus dan Rattus norvegicus yang merupakan hewan rodensia. Adapun Gallus gallus dan Carassius gibelio terlihat berada pada kelompok terluar dalam pohon filogeni.

PEMBAHASAN Gen BMP15 pada kambing terdiri dari dua ekson dan satu intron yang menyandikan sebanyak 394 asam amino berdasarkan Capra hircus breed Guizhou White

pada

basis

data

GenBank

dengan

No.

Akses

FJ429281

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (Lampiran 1). Analisis sekuen gen BMP 15

18   

menunjukkan bahwa ketiga populasi kambing lokal Indonesia (kambing Kacang, Samosir dan Muara) memiliki urutan nukleotida yang identik pada ekson 1. Hal ini kemungkinan karena pada daerah ekson 1 terdapat daerah yang menyandikan bagian sinyal peptida dalam pembentukan protein BMP15 sehingga bersifat sangat stabil. Ada enam alel mutan pada gen BMP15 yang telah diketahui berkorelasi dengan sifat prolifik pada mutan heterozigot carrier dan menyebabkan sifat steril pada mutan homozigot carrier. Mutasi pada keenam alel ini semuanya terjadi pada bagian ekson 2 (Tabel 2). Tabel 2. Alel mutan pada gen BMP15 Nama Alel I

Mutasi DNA

Mutasi Protein

Ekson

Domba

Referensi

FecX (Inverdal)

T579A

V31D

2

Romney

Galloway et al. (2000)

FecXH (Hanna)

C544T

Q23stop

2

Romney

Galloway et al. (2000)

G

C718T

Q239Ter

2

B

G1100T

S99I

2

Belcrare

Hanrahan et al. (2004)

L

G635A

C53Y

2

Lacaune

Bodin et al. (2007)

FecX (Galway) FecX (Belclare) FecX (Lacaune) R

FecX (R.Aragonesa) del c.525_541

W154NfsX55

2

Belcrare,Cambridge Hanrahan et al. (2004)

Rasa Aragonesa

Royo,A.M. et al (2008)

Polimorfisme ditemukan pada gen BMP15 ekson 2 tiga kambing lokal Indonesia. Pada populasi kambing Kacang ditemukan ada dua jenis mutasi. Pertama, mutasi bisu yaitu transisi A325G . Kedua, mutasi netral yaitu transversi C398G yang menyebabkan perubahan asam glutamat menjadi glutamin namun tidak merubah fungsi BMP15. Asam glutamat adalah asam amino yang bermuatan negatif sedangkan glutamin adalah asam amino dengan rantai samping yang tidak bermuatan. Populasi kambing Muara hanya mempunyai satu mutasi bisu yaitu C34T, sedangkan populasi kambing Samosir tidak mengalami mutasi. Fungsi BMP15 pada setiap spesies bersifat khas (specific species) terkait dengan perbedaan laju ovulasi antar species (Hashimoto et al. 2005). BMP15 pada mamalia berfungsi sebagai faktor pertumbuhan dan proliferasi sel granulosa. BMP15 juga berperan dalam menghambat sensitivitas folikel terhadap Follicle Stimulating Hormone (FSH) dengan menekan ekspresi dari reseptor FSH (Otsuka et al. 2000). Penelitian yang dilakukan oleh Yan et al. (2001) menunjukkan bahwa tikus yang sudah diinaktivasi (knock out) gen BMP15 nya tidak menunjukkan sifat steril tetapi hanya mengalami penurunan laju ovulasi (sub fertil). Mc Mahon et al.

19   

(2008) menyimpulkan bahwa sifat poliovulasi ini ternyata dipengaruhi oleh jumlah ekspresi gen BMP15 yang lebih sedikit. Hal ini berdasarkan penelitiannya dengan menggunakan tikus transgenik oocyt specific overexpression BMP15. Mutasi gen BMP15 pada ruminansia kecil menyebabkan sifat prolifik pada genotip heterozigot dan sifat steril pada genotip homozigot (Galloway et al. 2000; Hanrahan et al. 2004; Bodin et al. 2007; Martinez-Royo et al. 2008). Zhang et al. (2009) mengungkapkan bahwa pada beberapa jenis sapi ditemukan adanya mutasi delesi 4 pb yang menyebabkan perubahan reading frame dan menghasilkan stop kodon prematur, namun mutasi ini tidak berkorelasi dengan sifat prolifik pada genotip heterozigot. Polimorfisme gen BMP15 pada manusia diketahui berhubungan dengan human dizygotic (DZ) namun tidak signifikan (Zhao et al. 2008). Pada ikan zebra, BMP15 berfungsi untuk mencegah terjadinya perkembangan dan pematangan prematur oosit dengan menekan sensitivitas folikel terhadap maturation inducing hormone (MIH) pada pertumbuhan awal dari folikel (Clelland et al. 2007).

SIMPULAN Hasil sekuensing daerah ekson 1 menunjukkan bahwa kambing Kacang, Samosir dan Muara memiliki urutan basa nukleotida yang identik. Polimorfisme ditemukan pada daerah ekson 2 karena ada tiga varian mutan. Populasi kambing Kacang memiliki dua jenis alel mutan yaitu A325G dan C398G. Pada Populasi kambing Muara ada satu alel mutan yaitu C34T, sedangkan populasi kambing Samosir tidak memiliki varian mutan. Analisis pohon filogeni memperlihatkan bahwa kambing Kacang, Samosir dan Muara terletak dalam satu kelompok dengan beberapa kambing lokal di dunia. Pada pohon filogeni tampak percabangan yang memperlihatkan hubungan genetik antara kelompok hewan monoovulasi dan poliovulasi.

20     

21   

PEMBAHASAN UMUM

Hasil PCR-RFLP gen BMPR1B dan BMP15 pada tiga kambing lokal Indonesia (kambing Kacang, Samosir dan Muara) memperlihatkan bahwa semua sampel monomorfik yaitu bersifat tipe liar. Metode deteksi PCR-RFLP gen BMPR1B dan BMP15 seperti yang dilaporkan pada beberapa penelitian (Galloway et al. 2000; Wilson et al. 2001; Davis et al. 2002; Hanrahan et al. 2004) mengungkapkan bahwa sampel yang bersifat tipe liar adalah non prolifik. Hal ini tidak sesuai dengan fakta bahwa beberapa sampel kambing Kacang, Samosir dan Muara yang diperoleh di lapangan bersifat prolifik. Hasil sekuensing gen BMPR1B dan BMP15 dengan primer yang sama ternyata memperlihatkan adanya polimorfisme pada kedua gen tersebut. Namun alel mutan yang ditemukan pada gen BMPR1B dan BMP15 ini tidak berkorelasi dengan situs pemotongan enzim restriksi. Hal ini menyimpulkan bahwa metode PCR-RFLP gen BMPR1B dan BMP15 ini tidak dapat digunakan sebagai alat deteksi pada populasi kambing Kacang, Samosir dan Muara. Deteksi sifat prolifik berdasarkan metode PCRRFLP gen BMPR1B pada beberapa jenis domba Cina menunjukkan bahwa gen FecB berkaitan dengan sifat prolifik yang tinggi pada ternak seperti Huyang, Small Tail Han, Cele, Duolang dan Chinese Merino strain prolifik, sebaliknya pada ternak yang bersifat non prolifik seperti Mongolia, Chinese Merino, Tan, Xinjiang, Hulunbeier, Inner Mongolia FineWool dan Northeastern Half-fuzz tidak ditemukan gen FecB. Adanya perbedaan distribusi gen FecB pada beberapa jenis domba Cina menunjukkan bahwa gen BMPR1B sangat berkorelasi dengan perbedaan bangsa pada ternak (Dirangkum oleh Hua & Yang 2009). Untuk mengembangkan metode penanda genetik seperti Marker-assisted selection membutuhkan tahapan yang cukup panjang sehingga harus diperhatikan rasio antara keuntungan dan biaya yang dibutuhkan (Davis & DeNise 1998). Pada penelitian ini, selanjutnya lebih difokuskan untuk mengidentifikasi keragaman genetik gen BMP15 ekson 1 dan ekson 2 pada ketiga kambing lokal Indonesia. Sifat prolifik secara alamiah disebabkan pematangan folikel yang terjadi secara serentak sehingga menghasilkan lebih dari satu folikel matang. Gen BMP15 mengekspresikan protein yang berfungsi sebagai sinyal molekular untuk

22   

menginduksi kerja dari sistem hormonal selama proses pembentukan folikel. Protein BMP15 memiliki dua peran penting yaitu pertama, sebagai faktor pertumbuhan dan proliferasi sel granulosa. Kedua, menghambat sensitivitas folikel terhadap FSH dengan menekan ekspresi dari reseptor FSH (Otsuka et al. 2000). Ada enam alel mutan pada gen BMP15 yang diketahui berkorelasi dengan sifat prolifik pada genotip heterozigot carrier dan sifat steril pada genotip homozigot carrier yaitu T579A, C544T, C718T, G1100T, G635A dan delesi 525_541 (Galloway et al. 2000; Hanrahan et al. 2004; Bodin et al. 2007; Martinez-Royo et al. 2008). Mutasi yang terjadi pada gen BMP15 diketahui dapat menyebabkan pertumbuhan dan proliferasi sel granulosa menjadi terhambat, sebaliknya ekspresi dari reseptor FSH menjadi maksimal. Hal ini menyebabkan terbentuknya beberapa folikel yang lebih kecil dan lebih sensitif terhadap FSH. Folikel-folikel ini kemudian mengalami pematangan dini (Fabre et al. 2006). Kondisi prolifik yang ditandai dengan adanya peningkatan laju ovulasi akan meningkatkan jumlah anak yang dilahirkan. Pada penelitian ini, ada tiga alel mutan yang ditemukan pada daerah ekson 2 yaitu A325G dan C398G pada kambing Kacang dan C34T pada kambing Muara. Mutasi yang terjadi berupa mutasi bisu dan mutasi netral sehingga tidak mengubah fungsi dari protein BMP15. Penentuan sifat prolifik pada penelitian ini berdasarkan jumlah anak. Adapun sifat prolifik dapat diindikasikan dengan dua parameter yaitu laju ovulasi dan jumlah anak. Ada kemungkinan bahwa kambing yang beranak satu sebenarnya mampu untuk mengovulasikan lebih dari satu oosit. Apabila kambing memiliki lebih dari satu embrio maka akan membutuhkan lebih banyak suplai makanan. Adanya defisiensi nutrisi dapat menyebabkan kegagalan reproduksi (Hunter 1981). Umumnya manajemen pemberian pakan pada ternak masih dilakukan secara tradisional, sehingga kurangnya suplai makanan dapat berdampak terhadap kematian dini. Suplai makanan yang berkualitas dapat menginduksi peningkatan laju ovulasi pada ruminansia kecil yang bersifat prolifik ataupun non prolifik (Dirangkum oleh Robinson et al. 2006). Sifat prolifik bersifat aditif karena ada beberapa faktor yang turut berperan dalam menentukan fenotip. Sifat prolifik dipengaruhi oleh kesuksesan dari proses

23   

reproduksi. Ada beberapa faktor yang dapat menyebabkan kegagalan reproduksi yaitu infeksi, defisiensi nutrisi, penyimpangan anatomi saluran kelamin, fase luteal yang singkat (sekresi progesteron yang tidak memadai) atau korpus luteum yang tetap utuh, perkembangan ovarium berkista, berahi yang tidak disertai ovulasi atau berahi diam (ovulasi tanpa ditandai berahi) dan pengaruh merusak dari estrogen tanaman (Hunter 1981). Sifat prolifik dapat diinduksi dengan beberapa perlakuan variasi jenis pakan (De Santiago-Miramontes et al. 2008) ataupun hormonal (Lehloenya & Greyling 2009). Suplai makanan yang memadai dan pemberian mikro nutrisi juga dapat memacu peningkatan laju ovulasi, meningkatkan kualitas sperma dan ovum, berperan dalam perkembangan dan kelangsungan hidup embrio (Dirangkum oleh Robinson et al. 2006). Sifat prolifik juga bersifat pleiotropik, yaitu dikendalikan oleh beberapa gen. Ada kemungkinan selain gen BMPR1B dan BMP15, ada beberapa gen lain yang mempengaruhi sifat prolifik pada kambing Kacang, Samosir dan Muara. Pada penelitian He et al. (2010) yang menggunakan tiga kambing lokal Cina mengungkapkan bahwa gen BMPR1B, BMP15 dan GDF9 adalah monomorfik. Polimorfisme ditemukan pada gen INHα yang berkorelasi dengan sifat prolifik. INHα merupakan suatu glikoprotein yang berfungsi sebagai inhibitor terhadap sintesis dan sekresi FSH dari kelenjar pituitari. Cao et al. (2010) mengungkapkan bahwa sifat prolifik pada kambing Jining Grey berkaitan dengan mutasi yang terjadi pada gen KiSS-1. KiSS peptin berfungsi untuk menstimulasi GnRH untuk melepas FSH dan LH secara langsung melalui Gprotein-coupled receptor 54 (GPR54) untuk menghasilkan inisiasi pubertas.

24     

25   

SIMPULAN DAN SARAN  

Hasil analisis gen BMPR1B dan BMP15 dengan metode PCR-RFLP menunjukkan bahwa semua sampel dari ketiga kambing lokal Indonesia monomorfik. Hasil sekuensing dengan primer yang sama menunjukkan adanya mutasi substitusi G72T pada gen BMPR1B dan mutasi substitusi G43A pada gen BMP15. Namun kedua mutasi ini tidak berkaitan dengan situs restriksi. Hasil sekuensing nukleotida gen BMP15 daerah ekson 1 menunjukkan bahwa ketiga kambing lokal Indonesia memiliki urutan nukleotida yang identik. Polimorfisme ditemukan pada daerah ekson 2. Populasi kambing Kacang memiliki dua varian alel mutan yaitu A325G dan C398G. Populasi kambing Muara menunjukkan satu varian alel mutan yaitu C34T, sedangkan populasi kambing Samosir tidak bervariasi. Hasil analisis pohon filogeni berdasarkan coding sequence ekson 2 memperlihatkan bahwa ketiga kambing lokal Indonesia berada dalam satu kelompok dengan kambing-kambing lokal di dunia dan termasuk kelompok monoovulasi. Penelitian ini memberi gambaran awal keragaman genetik gen fekunditas (BMPR1B dan BMP15) pada kambing Kacang, Samosir dan Muara. Untuk itu, perlu diteliti lebih lanjut pada fragmen yang lebih luas dari kedua gen. Selain itu, perlu diteliti gen lain yang memiliki potensi polimorfisme yang berkaitan dengan tingkat kesuburan kambing-kambing lokal Indonesia. Penelitian lanjutan tentang gen yang berkaitan dengan sifat prolifik perlu dilakukan untuk mengembangkan metode deteksi pada kambing lokal Indonesia. Peningkatan manajemen pakan perlu dilakukan untuk memaksimalkan potensi sifat prolifik pada kambing lokal untuk mencegah adanya kematian embrio selama di dalam rahim.

26   

27   

DAFTAR PUSTAKA Bodin L, Di Pasquale E, Fabre S, Bontoux M, Monget P, Persani L, Mulsant P. 2007. A novel mutation in the bone morphogenetic protein 15 gene causing defective protein secretion is associated with both increased ovulation rate and sterility in Lacaune sheep. Endocrinol 148:393–400. Byun SO, Fang Q, Zhou H, Hickford JGH. 2009. An effective method for silverstaining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal Biochem 385:174–175. Cao GL, Chu MX, Fang L, Di R, Feng T, Li N. 2010. Analysis on DNA sequence of KiSS-1 gene and its association with litter size in goats. Mol Biol Repr 37:3921-3929. Chu MX, Zhao XH, Zhang YJ, Jin M, Wang JY, Di R, Cao GL, Feng T, Fang L, Ma YH, Li K. 2010. Polymorphisms of BMPR-IB gene and their relationship with litter size in goats. Mol Biol Repr 37:4033-4039. Clelland ES, Tan Q, Balofsky A, Lacivita R and Peng C. 2007. Inhibition of premature oocyte maturation: a role for bone morphogenetic protein 15 in zebrafish ovarian follicles. Endocrinol 148:5451-5458. Davis GP, DeNise SK.1998. The impact of genetic markers on selection. J Anim Sci 76:2331–2339. Davis GH, Galloway SM, Ross IK, Gregan SM, Ward J, Nimbkar BV, Ghalsasi PM, Nimbkar C, Gray GD, Subandriyo, Inounu I, Tiesnamurti B, Martyniuk E, Eythorsdottir E, Mulsant P, Lecerf F, James P, Hanrahan, Bradford GE, Wilson T. 2002. DNA tests in prolific sheep from eight countries provide new evidence on origin of the booroola (FecB) mutation. Biol Repr 66:1869–187. Davis GH. 2004. Fecundity genes in sheep. Anim Repr Sci 82–83:247–253. Davis GH. 2005. Major genes affecting ovulation rate in sheep. Genet Sel Evol 37:S11–S23. Davis GH, Balakrishnan L, Ross IK, Wilson T, Galloway SM, Lumsden BM, Hanrahan JP, Mullen M, Mao XZ, Wang GL, Zhao ZS, Zeng YQ, Robinson JJ, Mavrogenis AP, Papachristoforou C, Peter C, Baumung R, Cardyn P, Boujenane I, Cockett NE, Eythorsdottir E, Arranz JJ, Notter DR. 2006. Investigation of the booroola (FecB) and inverdale (FecXI) mutations in 21 prolific breeds and strains of sheep sampled in 13 countries. Anim Repr Sci 92: 87–96.

28   

Deldar-Tajangookeh H, Shahneh AZ, Zamiri MJ, Daliri M, Kohram H, NejatiJavaremi A. 2009. Study of BMP-15 gene polymorphism in Iranian goats. Afr J Biotechnol 8:2929-2932. De Santiago-Miramontes MA, Rivas-Mu˜noz R, Mu˜noz-Guti´errez M, Malpaux B, Scaramuzzi RJ, Delgadillo JA. 2008. The ovulation rate in anoestrous female goats managed under grazing conditions and exposed to the male effect is increased by nutritional supplementation. Anim Repr Sci 105: 409–416. Dube JL, Wang P, Elvin J, Lyons KM, Celeste AJ, Matzuk MM. 1998. The bone morphogenetic protein 15 gene is x-linked and expressed in oocytes. Mol Endocrinol 12:1809–1817. EL-Hanafy AA, El-Saadani MA. 2009. Fingerprinting of FecB gene in five egyptian sheep breeds. Biotechnol Anim Husbandry 25:205-212. Fabre S, Pierre A, Mulsant P, Bodin L, Pasquale E, Persani L, Monget P, Monniaux D. 2006. Regulation of ovulation rate in mammals: contribution of sheep genetic models. Repr Biol Endocrinol doi:10.1186/1477-7827-420 Galloway SM, McNatty KP, Cambridge LM, Laitinen MPE, Juengel JL, Jokiranta TS, McLaren RJ, Luiro K, Dodds KG, Montgomery GW, Beattie AE, Davis GH, Ritvos O. 2000. Mutations in an oocyte-derived growth factor gene (BMP15) cause increased ovulation rate and infertility in a dosagesensitive manner. Nat Genet 25:279–283. Ghaffari M, Nejati-Javaremi A, Rahimi G. 2009. Detection of polymorphism in BMPR-IB gene associated with twining in Shal sheep using PCR-RFLP method. Int J Agric Biol 11: 97–99. Hanrahan JP, Gregan SM, Mulsant P, Mullen M, Davis GH, Powell R, Galloway SM. 2004. Mutations in the genes for oocyte-derived growth factors GDF9 and BMP15 are associated with both increased ovulation rate and sterility in Cambridge and Belclare sheep (Ovis aries). Biol Reprod 70:900–909. Hashimoto O, Moore RK, Shimasaki S. 2005. Posttranslational processing of mouse and human BMP-15: potential implication in the determination of ovulation quota. Proc Natl Acad Sci USA 102:5426–5431. He Y, Ma X, Liu X, Zhang C, Li J. 2010. Candidate genes polymorphism and its association to prolificacy in Chinese Goats. J Agric Sci 2:88-92 Hoda A. 2008. Studi karakterisasi, produktivitas dan dinamika populasi kambing Kacang (Capra hircus) untuk program pemuliaan ternak kambing di Maluku Utara. [Disertasi]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

29   

Hua GH, Chen SL, Ai JT, Yang LG. 2008. None of polymorphism of ovine fecundity major genes FecB and FecX was tested in goat. Anim Repr Sci 108:279–286. Hua GH, Yang LG. 2009. A review of research progress of FecB gene in Chinese breeds of sheep. Anim Repr Sci. 116:1–9. Kasiriyan MM, Hafezeyan H, Sayahzadeh H, Jamshidi R, Asghari SR, Irajeyan GH, Buesagh H. 2009. Genetic polymorphism FecB and BMP15 genes and its association with litter size in Sangsari sheep breed of Iran. J Anim Vet Adv 8:1025-1031. Hunter RHF. 1981. Fisiologi dan teknologi repruksi hewan betina domestik. Putra H, penerjemah; Bandung: ITB Pr. Terjemahan dari: physiology and technology of repruction in female domestic animals. Knight PG and Glister C. 2006. Focus on TGF-β signalling TGF- β superfamily members and ovarian follicle development. Repr 132: 191–206. Laitinen M, Vuojolainen K, Jaatinen R, Ketola I, Aaltonen J, Lehtonen E, Heikinheimo M, Ritvos O. 1998. A novel growth differentiation factor-9 (GDF-9) related factor is co-expressed with GDF-9 in mouse oocytes during Folliculogenesis. Mech Dev 78:135–140. Lehloenya KC, Greyling JPC. 2010. The ovarian response and embryo recovery rate in Boer goat does following different superovulation protocols, during the breeding season. Small Ruminant Res 88:38–43. Martinez-Royo A, Jurado JJ, Smulders JP, Marti JI, Alabart JL, Roche A, Fantova E, Bodin L, Mulsant P, Serrano M, Folch J, Calvo JH. 2008. A deletion in the bone morphogenetic protein 15 gene causes sterility and increased prolificacy in Rasa Aragonesa sheep. Anim Genet 39:294–297. Mc Mahon HE, Hashimoto O, Mellon PL and Shimasaki S. 2008. Oocyte-specific overexpression of mouse bone morphogenetic protein-15 leads to accelerated folliculogenesis and an early onset of acyclicity in transgenic mice. Endocrinol 149:2807-2815. Mulsant P, Lecerf F, Fabre S, Schibler L, Monget P, Lanneluc I, Pisselet C, Riquet J, Monniaux D, Callebaut I, Cribiu E, Thimonier J, Teyssier J, Bodin L, Cognie Y, Chitour N, Elsen JM. 2001. Mutation in bone morphogenetic protein receptor-1B is associated with increased ovulation rate in Booroola Merino ewes. Proc Natl Acad Sci 98:5104–5109. Otsuka F, Yao Z, Lee TH, Yamamoto S, Erickson GF and Shimasaki S. 2000. Bone morphogenetic protein-15 identification of target cells and biological functions. J Biol Chem 275:39523-39528.

30   

Pardeshi VC, Sainani MN, Maddox JF, Ghalsasi PM, Nimbkar C, Gupta VS. 2005. Assessing the role of FecB mutation in productivity of Indian sheep. Current sci 89: 887-890. Polley S, De S, Batabyal S, Kaushik R, Yadav P, Arora JS, Chattopadhyay S, Pan S, Brahma B, Datta TK, Goswami SL. 2009. Polymorphism of fecundity genes (BMPR1B, BMP15 and GDF9) in the Indian prolific Black Bengal goat. Small Ruminant Res 85:122–129. Robinson JJ, Ashworth CJ, Rooke JA, Mitchell LM, McEvoy TG. 2006. Nutrition and fertility in ruminant livestock. Anim Feed Sci Technol 126:259–276. Sodiq A, Tawfik ES. 2003. The role and breeds, management system, productivity and development strategies of goats in Indonesia: a review. J Agric Rur Dev in the Trop 104:71-89. Souza CJ, MacDougall C, Campbell BK, McNeilly AS, Baird DT. 2001. The Booroola (FecB) phenotype is associated with a mutation in the bone morphogenetic receptor type 1B (BMPRIB) gene. J Endocrinol 169:R1– R6. ten Dijke P, Korchynskyi O, Valdimarsdottir G, Goumans MJ. 2003. Controlling cell fate by bone morphogenetic protein receptors. Mol Cell Endocrinol 211:105-13. Vacca GM, Dhaouadi A, Rekik M, Carcangiu V, Pazzola M, Dettori ML. 2010. Prolificacy genotypes at BMPR1B, BMP15 and GDF9 genes in North African sheep breeds. Small Ruminant Res 88:67–71. Wilson T, Wu XY, Juengel JL, Ross IK, Lumsden JM, Lord EA, Dodds KG, Walling GA, McEwan JC, O’Connell AR, McNatty KP, Montgomery GW. 2001. Highly prolific Booroola sheep have a mutation in the intracellular kinase domain of bone morphogenetic protein IB receptor (ALK-6) that is expressed in both oocytes and granulosa cells. Biol Repr 64:1225–1235. Yan C, Wang P, DeMayo J, DeMayo FJ, Elvin JA, Carino C, Prasad SV, Skinner SS, Dunbar BS, Dube JL, Celeste AJ and Matzuk MM. 2001. Synergistic roles of bone morphogenetic protein 15 and growth differentiation. Mol Endocrinol 15: 854-866.

Zhang L-P, Gan Q-F, Zhang X-H, Li1 H-D, Hou1 G-Y, Li1 J-Y, Gao1 X, Ren HY, Chen J-B, Xu1 S-Z. 2009. Detecting a deletion in the coding region of the bovine bone morphogenetic protein 15 gene (BMP15). J Appl Genet 50:145–148.

31   

Zhao ZZ, Painter JN, Palmer JS, Webb PM, Hayward NK, WhitemanDC, Boomsma DI, Martin NG, Duffy DL and Montgomery GW. 2008. Variation in bone morphogenetic protein 15 is not associated with spontaneous human dizygotic twinning. Human Repr 23:2372–2379.

32     

33   

LAMPIRAN

Lampiran 1. Informasi sekuens gen BMP15 pada Capra hircus breed Guizhou White Capra hircus breed Guizhou White bone morphogenetic protein 15 precursor (Bmp15) gene, complete cds LOCUS DEFINITION

FJ429281 1536 bp DNA linear MAM 30-NOV-2008 Capra hircus breed Guizhou White bone morphogenetic protein 15 precursor (Bmp15) gene, complete cds. ACCESSION FJ429281 VERSION FJ429281.1 GI:214010965 KEYWORDS . SOURCE Capra hircus (goat) ORGANISM Capra hircus Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Laurasiatheria; Cetartiodactyla; Ruminantia; Pecora; Bovidae; Caprinae; Capra. REFERENCE 1 (bases 1 to 1536) AUTHORS Lin,J.B., Du,Z.Y., Qin,C., Wang,J.F. and Ran,X.Q. TITLE Polymorphism of BMP15 Gene in Guizhou White Goats JOURNAL Xumu Yu Shouyi 39 (12), 21-24 (2007) REFERENCE 2 (bases 1 to 1536) AUTHORS Ran,X.Q., Wang,J.F. and Lin,J.B. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (30-OCT-2008) School of Animal Science, Guizhou University, Xueshi Road, Guiyang, Guizhou 550025, China FEATURES Location/Qualifiers source 1..1536 /organism="Capra hircus" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:9925" /chromosome="X" /sex="female" /country="China: Guizhou" /PCR_primers="fwd_seq: gatgcaaagaggacaatttagaagacc, rev_seq: cccaccagaacaatatagtatgataactc" /PCR_primers="fwd_seq: tgcaggctcctggcacatacagac, rev_seq: tcacctgcatgtgcaggactggg" /note="breed: Guizhou White" gene 1..>1536 /gene="Bmp15" mRNA join(1..543,680..>1536) /gene="Bmp15" /product="bone morphogenetic protein 15 precursor" exon 1..543 /gene="Bmp15" /number=1 5'UTR 1..215 /gene="Bmp15" CDS join(216..543,680..1536) /gene="Bmp15" /note="TGF-beta family member" /codon_start=1 /product="bone morphogenetic protein 15 precursor" /protein_id="ACJ61256.1" /db_xref="GI:214010966" /translation=MVLLSILRILLLWGLVLFMEHRVQMTQVGQPSIAHLPEAPTLPLIQELLEEAPGKQ QRKPRVLGHPLRYMLELYQRSADASGHPRENRTIGATMVRLVRPLASVARPLRGSWHIQTLDFPLRPNR VAYQLVRATVVYRHQLHLTHSHLSCHVEPWGQKSPTNHFPSSGRGSPKPSLLPKTWTEMDIMEHVGQKL WNHKGRRVLRLRFVCQQPRGSEVLEFWWHGTSSLDTVFLLLYFNDTQSVQKTKPLPKGLKEFTEKDPSL LLRRARQAGSIASEVPGPSREHDGPESNQCSLHPFQVSFQQLGWDHWIIAPHLYTPNYCKGVCPRVLYY GLNSPNHAIIQNLVNELVDQNVPQPSCVPYKYVPISILLIEANGSILYKEYEGMIAQSCTCR" sig_peptide 216..293

34   

mat_peptide

gap exon

variation

/gene="Bmp15" 1159..1533 /gene="Bmp15" /product="bone morphogenetic protein 15" 575..674 /estimated_length=unknown 680..>1536 /gene="Bmp15" /number=2 1454 /gene="Bmp15" /note="FecXB mutation" /replace="t"

ORIGIN 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 675 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501

gatgcaaaga ggacaattta gaagacctct aaacatagga cctgcctgcc agcctttcat agcctggatg ctgttaccca tgtaaaagga atcagaacat gttgctgaac accaagcttt tccttcttct ttggggactg gtgcttttta ggcagccctc tattgcccac ctgcctgagg tagaagaagc ccctggcaag cagcagagga atatgctgga gctgtaccag cgttcagctg ccattggggc caccatggtg aggctggtga gaggtgagtt atcatactat attgttctgg [gap 100 bp] Expand Ns tgcagg ctcctggcac aaccgggtag cataccaact agtcagagcc actcattccc acctctcctg ccatgtggag tttccttctt caggaagagg ctccccaaag atggatatca tggaacatgt tgggcaaaag cgactccgct tcgtatgtca gcagccaaga ggcacttcat cattggacac tgtcttcttg cagaagacca aacctctccc taaaggcctg ctcttgagga gggctcgtca agcaggcagt gagcatgatg ggcctgaaag taaccagtgt cagctgggct gggatcactg gatcattgct ggagtatgtc ctcgggtact atactatggt aaccttgtca atgagctggt ggatcagaat tatgttccca ttagcatcct tctgattgag gagggtatga ttgcccagtc ctgcacatgc

ttttggttca ttttccttgc aaggtttaaa tcaagatggt tggaacatag cccctacctt agccgcgggt acgcaagtgg ggccgctggc tggg

ggagatccta cctatccttt gcgttatcct cctcctgagc ggtccaaatg gcccctgatt cttagggcat acaccctagg tagtgtagca

ccagaggaag gtggtagtgg ttgggctttt atccttagaa acacaggtag caggagctgc cccttacggt gaaaaccgca aggcctctca

atacagaccc actgtggttt ccctgggggc ccttccctgt ctctggaatc ggtagtgagg ttactgtatt aaagagttta attgcatctg tccctccacc ccccatctct ctcaattctc gtccctcagc gcaaatggga aggtga

tggactttcc accgccatca agaaaagccc tgcccaaaac acaaggggcg ttcttgagtt tcaatgacac cagaaaaaga aagttcctgg cttttcaagt ataccccaaa ccaatcatgc cttcctgtgt gtatcttgta

tctgagacca gcttcaccta aaccaatcac ttggacagag cagggttcta ctggtggcat tcagagtgtt cccttctctt cccctccagg cagcttccag ctactgtaag catcatccag cccttataag caaggagtat

35   

Lampiran 2. Beberapa spesies yang digunakan dalam analisis pohon filogeni gen BMP15 ekson 2 No Spesies

Jenis

01. Capra hircus

Kambing Kacang

-

Penelitian ini

02. Capra hircus

Kambing Samosir

-

Penelitian ini

03

Kambing Muara

-

Penelitian ini

Capra hircus

No. Akses

Keterangan

04. Capra hircus

Kambing Boer

EU847289

Data Genbank

05. Capra hircus

Kambing Black Bengal

EU888137

Data Genbank

06. Capra hircus

Kambing Markhoz

GU732196

Data Genbank

07. Capra hircus

Kambing Guizhou White

FJ429281

Data Genbank

08

Kambing Yunling Black

EU847284

Data Genbank

09. Capra hircus

Kambing Jining Grey

EU743938

Data Genbank

10. Ovis aries

Domba

AF236079

Data Genbank

11. Bos taurus

Sapi Taurus

DQ463368

Data Genbank

12. Bubalus bubalis

Kerbau Lumpur

EF375880

Data Genbank

13. Equus caballus

Kuda

XM_001496223

Data Genbank

14. Mus musculus

Mencit

NM_009757

Data Genbank

15. Rattus norvegicus Tikus sawah

NM_021670

Data Genbank

16. Macaca mulatta

Monyet mulata

XM_001083980

Data Genbank

17. Pan troglodytes

Simpanse

XM_529247

Data Genbank

18. Pongo abelii

Orang Utan

XM_002831651

Data Genbank

19. Homo sapiens

Manusia

AF082350

Data Genbank

20. Gallus gallus

Ayam

AY729025

Data Genbank

21. Carassius gibeli

Ikan Mas

HQ179985

Data Genbank

Capra hircus

36   

Lampiran 3. Hasil pensejajaran coding sequence Ekson 2 Gen BMP15 kambing lokal Indonesia terhadap beberapa spesies Mamalia, burung dan ikan (No. merujuk pada nama spesies yang ada di lampiran 2). Nomor tiga baris di bagian atas dibaca secara vertikal). 1 1234567890 01.CCGCCATCAG 02........... 03........... 04........... 05........... 06........... 07........... 08........... 09........... 10........... 11..........A 12..........A 13..........A 14..........A 15..........A 16..........T 17..........T 18..........T 19..........T 20.---------21.----------

1111111112 1234567890 CTTCACCTAA .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .........T .....T...G .....T...G ..C..A...T ..C..A.... ..C..A.... ..C..A.... ------------.TTT..T

2222222223 1234567890 CTCATTCCCA .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....C.T.A. T.A...A... T.....A... ...GC.T.A. ...GC.T.A. ...GCCG.A. ...GC.T.A. ---------GCACC.GAGG

3333333334 1234567890 CCTCTCCTGC .......... ...T...... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... T......... T......... T.....G... T......... T......... T......... ---------T...CTG..T

4444444445 1234567890 CATGTGGAGC .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... T......... ........AA ........A. .......... .......... .......... .......... ---------...CGCATCT

5555555556 1234567890 CCTGGGGGCA .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ......TC.. ......TC.. ......TC.. ......TC.. .T....TT.C .T....TC.C ......T... ......T... ......T... ......T... -------C.C T.CTTTTATC

6666666667 1234567890 GAAAAGCCCA .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ...G...... T...T...GG T...T.T.G. .......... .....A.... .....A.... .....A.... TC.G....TG TGTG..G.A.

7777777778 1234567890 AC-CAATCAC ..-....... ..-....... ..-....... ..-....... ..-....... ..-....... ..-....... ..-....... ..-....... ..-....... ..-....... ..-...C..G ..-...G... ..-...G... ..-...G... ..-...C... ..-...C... ..-...C... C.G.TGC.C. GA---G....

8888888889 1234567890 01.TTTCCTTCTT 02........... 03........... 04........... 05........... 06........... 07........... 08........... 09........... 10........... 11........... 12........... 13......C.... 14...A....... 15...---.C.A. 16.........C. 17...C.....C. 18...CT....C. 19...C.....C. 20.G.GG.CG.C. 21.G.---CA...

1 9999999990 1234567890 CAGGAAGAGG .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....G....T .TAA.TCG.. .TAA.TCG.. ...A.G...A ...A.G...A ...A.G...A ...A.G...A .C----TGT. ..A---..TC

1111111111 0000000001 1234567890 CTCCCCAAAG .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....T..... ....T..... ....A..... T...T..... T...T..... T..TG..... T.TG.....A T...T....A T...T....A T...T....A TG..GTGG.. T...TGC.G.

1111111111 1111111112 1234567890 CCTTCCCTGT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .........C .....T.CCA .....TTCTG T........A .........A .........A .........A .TGC.G.CTG TGAG.GTGTC

1111111111 2222222223 1234567890 TGCCCAAAAC .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........G. C.......G. ..T.....G. ..T.T...G. ..T.T...G. ..T.T..TG. ..T.T..CG. ..T.T..CG. ..T.T..CG. CTG.....G. AT.ATGGGT.

1111111111 3333333334 1234567890 TTGGACAGAG .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... G......... C......... C....G.... .....A.... .....A.... .....A.... .....A.... CCC.G.G.-C.C..AGCCT

1111111111 4444444445 1234567890 ATGGATATCA .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..A.....T. ...A....T. .......... .......... .......... .......... -----..CTG G....CCGA.

1111111111 5555555556 1234567890 TGGAACATGT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... CAC....CA. CAC.TTG.A. CCC.CTG.A. CAC....... CAC..TT... CAC...T... CAC...T... CTC.G.CCCA .CTG.TG.CA

1111111111 6666666667 1234567890 01.TGGGCAAAAG 02........... 03........... 04........... 05........... 06........... 07........... 08........... 09........... 10........... 11........... 12......G.... 13..C......G. 14..CA...G... 15..CA...G... 16..CA.....GA 17..CA.....G.

1111111111 7777777778 1234567890 CTCTGGAATC .......... .......... .......... .---...... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... T........A T........A

1111111111 8888888889 1234567890 ACAAGGGGCG .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....A..... G......A.. G......A.. .......A.. .......A.A

1111111112 9999999990 1234567890 CAGGGTTCTA .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .C....A... .......... .......... G..T.....T G..A..C..T ....A.C... ....A.C...

2222222222 0000000001 1234567890 CGACTCCGCT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..C....... ..C....... ........T. ........T.

2222222222 1111111112 1234567890 TCGTATGTCA .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....G..... ....G..... ....G..... ....G..... ..A.G..... ..A.G..... .TA.G..... .TA.G.....

2222222222 2222222223 1234567890 GCAGCCAAGA .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ......C.C. ........A. .....A..A. .....A..A. .....A..A. .....A..A.

2222222222 3333333334 1234567890 GGTAGTGAGG .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .A...C.... ..C.A....A ..C.A....A TA......T. .A.....GT.

37    18..CA.....G. 19..CA.....G. 20.CC.C.CC.-21.CAA..C.CGT

T........A T........A TC.C.CC.CG G..C.AGTCG

.......A.A .......A.A G.T-...C.. .A.GAT...C

....A.C... ....A.C... A..C.GA.AT AT.T..C.CT

........T. ........T. .AC.C..TA. .TTTG.TCA.

.TA.G..... .TA.G..... .TA.-CCC.. .ATCGATG..

.....A..A. .....A..A. ...AA..GC. TA.AA.....

.A...A.GT. .A.....GT. .C.CAG.... AC.-ACAT.C

2222222222 4444444445 1234567890 01.TTCTTGAGTT 02........... 03........... 04........... 05........... 06........... 07........... 08........... 09........... 10........... 11....G...... 12....G...... 13.........C. 14.C..G...... 15.C.......C. 16.G.......C. 17.G.......C. 18.G.......C. 19.G.......C. 20.GA.GCTGACC 21.CAGG.CTA..

2222222222 5555555556 1234567890 CTGGTGGCAT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .C........ .C........ .C........ .---...... .---...... .---...... .---...... .------TGC ACACATCG.A

2222222222 6666666667 1234567890 GGCACTTCAT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....TGA... ....TGA.C. ........G. .......... .......... .......... .....A..TG AA.G....CC

2222222222 7777777778 1234567890 CATTGGACAC .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .T........ .C.....TGT .C.....TGT .C.......T .C........ .C........ .C.......T .G.GC..TC. ACC.CA....

2222222222 8888888889 1234567890 TGTCTTCTTG .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..G....... ......T... ..C....... ..C....... ..C....... ..C....... ..C....... ..C....... G.C.GAGCC. CA.....GA.

2222222223 9999999990 1234567890 TTACTGTATT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... C....C.... C....C.... .......... .....C.G.. .....C.... .....C.... CC..G.CCGC C.C.A..T..

3333333333 0000000001 1234567890 TCAATGACAC .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..G....... .......T.. .......T.. .......T.. .......T.. C.CGCCGTC. G.TGCTCTT.

3333333333 1111111112 1234567890 TCA---GAGT ...---.... ...---.... ...---.... ...---.... ...---.... ...---.... ...---.... ...---.... ...---.... ...---.... ...---.... ...CAAA... CG.TGAC..A .G.TGA.... ...TAAA..C ...TAAA..C ...TAAA..C ...TAAA..C C.T---.C.G .TGGAG...A

3333333333 2222222223 1234567890 01.GTTCAGAAAA 02........... 03........... 04.........G. 05.........G. 06.........G. 07.........G. 08.........G. 09.........G. 10.........G. 11.........G. 12.........G. 13..G......G. 14.....---.GG 15..C..---.GG 16.A.......GG 17.A...G...GG 18.A.......GG 19.A...G...GG 20.ACC.-----21.AC--------

3333333333 3333333334 1234567890 CCAAACCTCT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ......T... GT....T... .T....T... .T....T... .T...TT... .T...TT... .T...TT... -----.T..C --..TGAG.C

3333333333 4444444445 1234567890 CCCTAAAGGC .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .....GG... ...C.G.... TG.A.G.... TG.A.G...T T..C.GG... T..C.GG... T..C..G... T..C.GG... T...CCTCTT TGTGG..T.G

3333333333 5555555556 1234567890 CTGAAAGAGT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........A. T..G.G..A. .AAG.G.... .AAG.G.... A..G.G.... A..G.G.... A..GTG.... A..G.G.... .CTC..CGAC GG...GC.C.

3333333333 6666666667 1234567890 TTACAGAAAA .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ...TG....G .A..T..T.G .A..T..T.G .C.TG....G .C.TG....G .C.TG....G .C.TG....G ACC.GC.GCG .C..GCCCCT

3333333333 7777777778 1234567890 AGACCCTTCT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... G...G..... G..AT..... G..AT..C.. G..AT...T. G..AT..CT. G..AT..CT. G..AT..CT. G...T..C.C TTCT.GCC.C

3333333333 8888888889 1234567890 CTTCTCTTGA .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .........C T.....A..C T....TA..C ......C--......C--......C--..---.C--GGAGC..--C AGGA..C---

3333333334 9999999990 1234567890 GGAGGGCTCG .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ......T... ....T.TC.. ....T.TC.. ....AA.C.. ....AA.C.. ....AA.C.. ....AA.C.. ..C.CAGC.. .TC..T.CAA

4444444444 0000000001 1234567890 01.TCAAGCAGGC 02........... 03........... 04........... 05..G........ 06........... 07........... 08........... 09........... 10........... 11........... 12........... 13.G......... 14.G......T.. 15.G...A..T.. 16.A.......AT 17.A.......AT 18.A.......AT 19.A.......AT

4444444444 1111111112 1234567890 AGTATTGCAT .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........T. .......... .......... .......... .......... .....G.GG. ..C....A.. ..C..A.... G....CT..G G....CT..G G....CT..G G....CT..G

4444444444 2222222223 1234567890 CTGAAGTTCC .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .G........ .......... .......... ....G....T ....T.CCT. ....T..C.. ....G...A. ....G...A. ....G...G. ....G...A.

4444444444 3333333334 1234567890 TGGCCC-CTC ......-... ......-... ......-... ......-... ......-... ......-... ......-... ......-... ......-... ......-... ......-... ......-... .T.T..-T.. .T.T..-T.. ..C.T.-T.. ..C.T.-T.. ..C.T.-T.. ..C.T.-T..

4444444444 4444444445 1234567890 CAGGGAGCAT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .C.C....G. TCA...A... TCA...A..G .TCAA.A.G. .TCAA.A... .TCAA.A... .TCAA.A...

4444444444 5555555556 1234567890 GATGGGCCTG .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..C....... ..C....... ..A....... ......T... ...A..T... AG........ AG........ AG........ AGC.......

4444444444 6666666667 1234567890 AAAGTAACCA .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......T.T .......... .......... T..A...... T..A...... ...A...... ...A...... ..GA...... ...A......

4444444444 7777777778 1234567890 GTGTTCCCTC .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

38    20.G.GC.-.... ..GGAC..T. ..CC.CGA.. ..C..GG..A .CT.CG.G.. .CC..AGGG. .C.AA.G.G. C..C.....G 21.GG....T..G ..C..C.TC. ....CA.C.. CAA.TA-.AA GCAA.G...G A.CA.CGTGA CC.AA..... ...CAAG..G 4444444444 8888888889 1234567890 01.CACCCTTTTC 02........... 03........... 04........... 05........... 06........... 07........... 08........... 09........... 10........... 11........... 12........... 13...T.....C. 14...T....ACA 15...T....ACA 16.........C. 17.........C. 18.........C. 19.........C. 20..G.T.C..C. 21....T.C.AC.

4444444445 9999999990 1234567890 AAGTCAGCTT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .....G.... .......... .......... .......... .......T.. .G........ .G........ .......... ..A....... .......... ..A....... CC........ GT..G.C...

5555555555 0000000001 1234567890 CCAGCAGCTG .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ...C...T.. ...C..A..A ...T..AT.. ..GC...... ..GC...... ..GC...... ..GC...... .GCC...... .A.AG.TT..

5555555555 1111111112 1234567890 GGCTGGGATC .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..T....... ..T....... ..T....... ..T....... ..T.....C. ..A.....C.

5555555555 2222222223 1234567890 ACTGGATCAT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .T........ ..........

5555555555 3333333334 1234567890 TGCTCCCCAT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... C......... C......... .......... ......T.G. ........G. ........C. .......... ........C. ........C. C......... ...G.....C

5555555555 4444444445 1234567890 CTCTATACCC .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... T....C.... T....C.... T....C.... T....C.... .G...C.A.. AAG..C.AT.

5555555555 5555555556 1234567890 CAAACTACTG .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....T..... ....T..... .......... .......... .......... .......... .GCG...... .TC.T.....

5555555555 6666666667 1234567890 01.TAAGGGAGTA 02........... 03........... 04........... 05........... 06........... 07........... 08........... 09........... 10........... 11........... 12........... 13.........CC 14....A...A.C 15....A...A.C 16....A...ACT 17....A...ACT 18....A...ACT 19....A...ACT 20.......C..G 21...T...T.AT

5555555555 7777777778 1234567890 TGTCCTCGGG .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..C....... ...A...... ...A..G.A. ....TC..A. ....TC..A. ....T...A. ....TC..A. ..C..A...C ........TA

5555555555 8888888889 1234567890 TACTATACTA .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .....C.... .....C.... .....C.... .....CG... ..T..CC... ..T..CC... .....CG.G. .....CG.G. .....CG.G. .....CG.G. .C..CCGGG. .C..GC.T..

5555555556 9999999990 1234567890 TGGTCTCAAT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......C.. .......... .......... .......... .......... .......... .......... ......A... ..A....... .......... .......... .......... C..CTA.C.C C..CTA....

6666666666 0000000001 1234567890 TCTCCCAATC .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..A.....C. ..A.....C. ..C....... ..C....... ..C....... ..C....... G.G.....C. ..A.....C.

6666666666 1111111112 1234567890 ATGCCATCAT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .C........ .......... .......... .......T.. .C.....T.. .......T.. .C.....T.. .C...G.GG. ....G.....

6666666666 2222222223 1234567890 CCAGAACCTT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .....G.... T....G.... A....G.... T......... T......... T......... T......... G......T.G G....CAT.A

6666666666 3333333334 1234567890 GTCAATGAGC .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....G..... .......... .......... .......... ........A. ........A. ......C..T A.....C..T A.....C..T A.....C..T ...C.CC... A...GC....

39    6666666666 4444444445 1234567890 01.TGGTGGATCA 02........... 03........... 04........... 05........... 06........... 07........... 08........... 09........... 10........... 11........... 12........... 13.....A..C.. 14..A...A.... 15..A...A...G 16........C.. 17........C.. 18.....A..C.. 19........C.. 20.........GC 21..T.GT..GGC 777777 222222 123456 01.GGGAGT 02....... 03....... 04....... 05....... 06....... 07....... 08....... 09....... 10....... 11....... 12....... 13....... 14....... 15....... 16....... 17....... 18....... 19....... 20...C..C 21.------

 

 

6666666666 5555555556 1234567890 GAATGTCCCT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..G....... ..G....... ..G....... C.G...A... C.G...G... ..G....... ..G...T..C ..G......C ..G......C C..C.....C AG..A....G

6666666666 6666666667 1234567890 CAGCCTTCCT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .C...C.... .......... ....T..... .G...C.... .G...C.... .G...C.... .G...C.... .G...C.... TT...C....

6666666666 7777777778 1234567890 GTGTCCCTTA .......... .......... .......... .......... .......G.. .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......G.. .......G.. .......G.. .......G.. .C.....C.. .C..T....-

6666666666 8888888889 1234567890 TAAGTATGTT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... C......... ...T.T.C.. .....T.C.. .......... .......... .......... .......... CCGC..CAGC ----------

6666666667 9999999990 1234567890 CCCATTAGCA .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .........C ..T..G.... ..T..G..T. ..A......G ..A......G ..A......G ..A.....TG .....C...G ----------

7777777777 0000000001 1234567890 TCCTTCTGAT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ....C..... .......... .....A.... .....A.... .....A.... .....A.... ....GA.... ----------

7777777777 1111111112 1234567890 TGAGGCAAAT .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... C......... ....A.C..C .......... .......... ........G. .......... .......... CC..CACG.C ----------