Technologický projekt 3. semestr Mgr. 2014/2015
POKUSNÁ LABORATORNÍ EXTRUZE, STANOVENÍ EXPANZNÍHO FAKTORU A SLOŽENÍ VSTUPNÍHO A VÝSTUPNÍHO MATERIÁLU Vedoucí práce: Doc. Ing. Evžen Šárka, CSc., Ing. Petra Smrčková, PhD. Místnosti: Budova B: 47, S 41.
Úkol Práce: Připravit premixy z jemné kukuřičné krupice s přídavkem vody 20%, 10%, 5% na hmotnost vzorku. Tyto premixy postupně nadávkovat do laboratorního extrudéru KE19/25 a odebrat reprezentativní vzorky. V odebraných vzorcích stanovit sušinu, expanzní faktor, obsah rezistentního a celkového škrobu a proměřit viskozitní křivky na RVA. Průběh projektu: První den: Příprava premixů - laboratorní extruze (místnost 47, S 41) 1. Příprava premixů (přídavek vody). 2. Laboratorní extruze a vyčištění extrudéru. 3. Stanovení expanzního poměru. 4. Mletí vzorků. Druhý a třetí den: Analytické rozbory (místnost 47) 1. Stanovení sušiny vstupního a výstupního materiálu. 2. Stanovení rezistentního škrobu a celkového škrobu. 3. Proměření viskozitních křivek na RVA.
1. den 1. PŘÍPRAVA PREMIXŮ PRO EXTRUZI K20: Navážíte 0,5 kg jemné kukuřičné krupice do mísy hnětače. Přidáte 100 g destilované vody. Vodu postupně přidáte ke kukuřičné krupici a promícháte 5 minut na hnětači. Vzorek uložíte cca na 1 hod odpočívat v zazipovaném igelitovém pytli. K10: Navážíte 0,5 kg jemné kukuřičné krupice do mísy hnětače. Přidáte podle uvážení koření a necháte 1 min promíchat na hnětači. Do Kádinky navážíte 1g chloridu sodného a přidáte tolik vody, aby konečná hmotnost roztoku byla 50g. Roztok chloridu sodného přilejete k okořeněné kukuřičné krupici a promícháte 5 minut na hnětači. Vzorek uložíte cca na 1 hod odpočívat v zazipovaném igelitovém pytli. K5: Navážíte 0,5 kg jemné kukuřičné krupice do mísy hnětače. Přidáte podle uvážení koření a necháte 1 min promíchat na hnětači. Do Kádinky navážíte 0,5 g chloridu sodného a přidáte tolik vody, aby konečná hmotnost roztoku byla 25g. Roztok chloridu sodného přilejete k okořeněné kukuřičné krupici a promícháte 5 minut na hnětači. Vzorek uložíte cca na 1 hod odpočívat v zazipovaném igelitovém pytli.
2. EXTRUZE (VIZ PŘÍLOHA 1) 1
3. PŘÍPRAVA VZORKŮ NA LABORATORNÍ ROZBORY 3.1. Mletí extrudátů na mlýně Perten 3.2. Založení 16 hodinové Inkubace vzorků s pankreatickou α-amylasou pro stanovení rezistentního škrobu (viz kapitola 5.1 na str. 3)
2. den Úkol: Stanovte ve vstupním a výstupním materiálu rezistentní a celkový škrob, sušinu na sušících vahách a viskozitní křivky pomocí přístroje RVA 4500. 4. PROMĚŘENÍ VISKOZITNÍCH KŘIVEK NA RVA Princip metody: Analyzátor RVA 4500 je rotační viskozimetr, jenž funguje na bázi nejnovější technologie Rapid Visco Analyser, která se vyznačuje variabilním ohřevem, chlazením a možností míchání, resp. aplikace smykového tření ve vzorku během měření. Je vhodný pro různé aplikace, při nichž uživatelé potřebují získat přesné údaje o viskozitě materiálů. Příkladem může být testování kvality výrobků na bázi škrobu. RVA 4500 díky programovému vybavení umožňuje různá nastavení a lze s ním provádět celou řadu různých testů, zpracovávat údaje do podoby grafů a nakonec také analyzovat získané výsledky. K dispozici jsou také standardizované zkušební profily, z nichž některé jsou schváleny Americkou společností pro cereální chemiky (AACC) a Mezinárodní společností pro cereální vědu a technologii (ICC). Postup měření: 4.1. Výběr testu 1. běžte do menu Run a vyberte Select Configuration to Run (Vybrat konfiguraci ke spuštění testu). 2. Ze seznamu vyberte konfigurační soubor testu s názvem Extrudáty_kukuřice a klikněte na Open (Otevřít). 3. Pokud budete vyzváni, zadejte název projektového souboru. 4. Pokud budete vyzváni, zadejte údaj o hmotnosti vzorku. 5. Nyní se otevře okno kalkulátoru. 4.2. Výpočet hmotnosti vzorku pomocí kalkulátoru Program TCW obsahuje kalkulátor pro výpočet hmotnosti vzorku, kterým je možné rychle vytvořit korekci na obsah vlhkosti, tím, že spočítáte množství vzorku a vody, které chcete použít k jeho přípravě. Kalkulátor pro výpočet hmotnosti vzorku můžete nechat zobrazit automaticky před každým testem. Zobrazená data jsou následně uložena do projektového souboru a mohou být zobrazena v projektovém reportu.
2
1. Vložte požadovanou „standard sample weight“ 3g pro vzorek kukuřice. 2. Vložte požadovanou „standard water weight“ jmenovitě 25,0 g. 3. Vložte hodnotu základní vlhkosti (Moisture Basis) (12 %). 4. Vložte hodnotu naměřené vlhkosti vašeho vzorku do kolonky Moisture content (např. 13,5 %). 5. Zaškrtněte políčko Fix water weight (Zafixovat hmotnost vody). 6. Hmotnosti vzorku a vody budou automaticky vypočítány a zobrazeny v okně. Po dokončení stiskněte tlačítko Close (Zavřít). 4.3. Příprava vzorku 1. Navažte 25 g destilované vody do hliníkové nádobky. 2. Na lodičku navažte vzorek s přesností na dvě desetinná místa podle hodnoty vypočtené pomocí kalkulátoru. 3. Těsně před začátkem testu kvantitativně převeďte vzorek do hliníkové nádobky s vodou. Zavřete gumovou zátkou a důkladně promíchejte. 4. Vložte do nádobky míchadlo a několikrát jím pohybujte výrazně nahoru a dolů. Všechny zbytky vzorku, které ulpívají na stěnách, setřete dolů do vody. 4.4. Vložení vzorku do analyzátoru 1. Zkontrolujte, že stavové světýlko bliká zeleně, což znamená, že přístroj dosáhnul požadované teploty pro provádění testů. 2. Vložte míchadlo s lopatkami do nádobky a zasuňte jeho horní hranu do úchytu. 3. Zkontrolujte, že míchadlo je dobře usazeno jeho silnějším zatlačením proti úchytu. 4. Pomalu zasuňte věž s motorem dolů, dokud neuslyšíte cvaknutí. Poté jej okamžitě uvolněte. Stavové světýlko změní svou barvu ze zelené na oranžovou a ihned dojde ke spuštění testu.
3
4.5. Ukončení testu 1. Změní se barva stavového světýlka z oranžové na zelenou a dojde k vysunutí vzorku z analyzátoru. Pootočte rukou úchyt míchadla tak, aby otvor mířil směrem k vám. 2 Pomocí izolačních ochranných rukavic odolných teplu vyndejte nádobku s míchadlem tak, že ji uchytíte pevně za její horní část a vytáhnete směrem k sobě. 3 Nádobku s míchadlem umyjte. RVA 4500 je připraven k analýze dalšího vzorku. 5. STANOVENÍ REZISTENTNÍHO A CELKOVÉHO ŠKROBU ENZYMOVĚ Při stanovení celkového a rezistentního škrobu budete používat enzymový set: Resistant starch procedure ( Megazyme, Irsko). Postup stanovení je založen na standardní mezinárodních metodách (AOAC method 2002.02 a AACC Method 32-40.01)
Princip metody Umletý vzorek se inkubuje s pankreatickou α-amylasou a amyloglukosidasou (AMG) po dobu 16 hodin ve vodní lázni 37°C teplé za intenzivního třepání. Během tohoto kroku dochází působením dvou enzymů ke ztekucení stravitelného škrobu (nerezistentního) a jeho hydrolýze na glukosu. Hydrolýza se ukončí přídavkem ekvivalentního množství denaturovaného etanolu a rezistentní škrob zůstane po odstředění v nerozpustném podílu. Nerozpustný podíl se dvakrát promyje 50% denaturovaným etanolem s následným odstředěním. Kapalný podíl se důkladně slije a uchová pro stanovení rozpustného škrobu. Rezistentní škrob přítomný v nerozpustném podílu se rozpustí v 2M KOH za intenzivního míchání v ledové lázni. Vzniklý roztok se zneutralizuje pomocí acetátového pufru a škrob je kvantitativně hydrolyzován na glukosu působením AMG. Glukosa je stanovena po reakci s glukoso oxidasovým/peroxidasový činidlem (GOPOD), které tvoří barevný komplex s glukosou a její obsah je stanoven spektrofotometricky při 510 nm. Obsah glukosy v roztoku je přímo úměrný obsahu rezistentního škrobu ve vzorku. Nerezistentní škrob (stravitelný škrob) se stanoví tak, že se sbírají do 100 ml odměrné baňky etanolové frakce, kterými byl promýván vzorek po inkubaci s pankreatickou αamylasou a amyloglukosidasou (AMG). Po úpravě objemu na 100 ml se také stanoví obsah glukosy pomocí GOPODu. Postup měření: 5.1. Inkubace vzorků 16 hodin s pankreatickou α-amylasou (Provádí se 1.den) 5.1.1 Přesně navažte 100 ± 5 mg vzorku přímo do zkumavky se závitem a jemně poklepejte zkumavkou, abyste zajistili, že se vzorek dopadne až na dno. 5.1.2 Připravte se roztok pankreatické α-amylasy (10 mg/ml), tak že se naváží 0,2 g pankreatické α-amylasy do 50 ml kyvety a pak se přidá 20 ml pufru s maleátem sodným a 0,2 ml amyloglukosidasy. Vniklá suspenze se nechá 5 minut míchat na laboratorní třepačce. Potom se odstředí 10 minut při 3000 rpm. 4
5.1.3 Do každé zkumavky přidejte 4,0 ml pankreatické α-amylasy (10 mg/ml) obsahující AMG (3 U/ml). (musí se připravovat každý den nová, těsně před použitím) 5.1.4 Pevně zavřete zkumavky, dobře promíchejte na vortexu a položte je vodorovně do vodní lázně s třepačkou. Zkumavky vyrovnejte ve směru pohybu třepačky (viz obrázek 3).
Obr. 3. Připevnění zkumavek s víčkem na rám třepací vodní lázně pomočí gumových úponů 5.1.5 Inkubujte zkumavky při 37°C za kontinuálního třepání 200 úderů/min, po dobu přesně 17 hodin. (Poznámka: pro lineární pohyb je nastavení 100 na vodní lázni ekvivalentní 200 úderům/minutu, 100 dopředu a 100 dozadu). 5.2. Oddělení nerezistentního (stravitelného) škrobu (2. den) 5.2.1 Vyndejte zkumavky z vodní lázně a odstraňte přebytek povrchové vody papírovou utěrkou. Sundejte uzávěry ze zkumavek a přidejte 4,0 ml etanolu (99 %) a intenzivně pro míchejte na vortexu. 5.2.2 Odstřeďte zkumavky při 3000 rpm po dobu 10 minut (nezavřené). 5.2.3 Opatrně slijte supernatanty do 100 ml odměrné baňky a resuspendujte nerozpustný podíl ve 2 ml 50% etanolu za intenzivního míchání na vortexu. Přidejte dalších 6 ml 50% etanolu, promíchejte zkumavky a odstřeďte opět při 3000 rpm po dobu 10 minut. 5.2.4 Znovu slijte supernatanty každý vzorek do stejné odměrné baňky jako v bodě 5.2.3, poté opakujte znovu resuspendaci a odstředění ještě jednou jako v bodě 5.2.3. 5.2.5 Opatrně slijte supernatanty znovu do příslušných odměrných baněk a převraťte zkumavky nad filtračním papírem, aby se odsála přebytečná tekutina. 5.2.6 Objem slitých roztoků supernatantů získaných odstředěním počáteční inkubace se supernatanty získanými z následných dvou promytí 50 % etanolem doplňte v odměrné baňce destilovanou vodou do 100 ml. Dobře promíchejte a použijte ke stanovení rozpustného škrobu. Inkubaci s GOPOD činidlem provádějte společně s inkubací rezistentního škrobu.
5
5.3. Stanovení rezistentního škrobu 5.3.1 Do každé zkumavky přidejte magnetické míchací tyčinky (5 x 15 mm) a 2 ml KOH (c=2 mol.l-1) a resuspendujte nerozpustný podíl (a rozpusťte RS) mícháním po dobu 20 minut v ledové vodní lázni na magnetické míchačce (viz obr. 4
Obr. 4. Vodní lázeň s ledem umístěná na magnetickém míchadle (tyčinková míchadla jsou uvnitř zkumavek) 5.3.2 Do každé zkumavky přidejte 8 ml acetátového pufru (c=1,2 M, pH 3,8) a míchejte na magnetické míchačce. Okamžitě přidejte 0,1 ml AMG (3300 U/ml), dobře promíchejte a umístěte zkumavky do vodní lázně o 50°C. Inkubujte zkumavky po dobu 30 minut a každých 10 minut promíchejte na vortexu. 5.3.3 kvantitativně přeneste obsah zkumavky do 100 ml odměrné baňky, vyjměte magnetické míchadlo a zkumavku třikrát propláchněte destilovanou vodou. Poté doplňte objem odměrné baňky na 100 ml a dobře promíchejte. Odstřeďte alikvotní podíl roztoku při 3000 rpm po dobu 10 minut. 5.3.4 Z každého alikvotního podílu pipetujte dvakrát 0,1 ml roztoku do skleněných zkumavek (l6x100 mm), Přidejte 3,0 ml činidla GOPOD a inkubujte při 50°C po dobu 20 minut. (využijte pro stanovení rezistentního škrobu, měříme) 5.3.5 Z každé odměrné baňky (viz bod 1.10) pipetujte dvakrát 0,1 ml roztoku do skleněných zkumavek (l6x100 mm) a inkubujte se 3,0 ml rekčního činidla GOPOD po dobu 20 minut při 50°C. Měřte absorbanci při 510 nm proti slepému pokusu (ΔANS). Vypočítejte obsah stravitelného (nerezistentního) škrobu. 5.3.6 Spolu s každou sadou vzorků inkubujte také slepý pokus, který připravíte smícháním 0,1 ml acetátového pufru (c = 0,1 M, pH 4,5) a 3,0 ml reakčního činidla GOPOD a dále 4 standardy glukosy připravené smícháním 0,1 ml glukózy (1 mg/ml) a 3,0 ml reagenčního činidla GOPOD. Měřte absorbance každého roztoku při 510 nm proti slepému pokusu
6
5.4. Výpočet obsahu rezistentního, stravitelného (nerezistentního) a celkového škrobu 5.3.1 rezistentní škrob 𝐹𝑉
1
𝑥(%) = ∆𝐴𝑅𝑆 ∗ 𝐹 ∗ 0.1 ∗ 1000 ∗ 𝑥𝑅𝑆(%) = ∆𝐴𝑅𝑆 ∗
𝐹 𝑤
100 𝑤
∗
162
(1)
180
∗ 𝐹𝑉 ∗ 0.9
(2)
Kde je: x…obsah škrobu ve vzorku (%) ∆𝐴𝑅𝑆 …absorbance rezistentního škrobu měřená proti slepému pokusu 𝐹 =
100(𝜇𝑔 𝐷−𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑦) 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒 100 𝜇𝑔 𝐷−𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑦
…Přepočet absorbance na μg
FV…konečný objem (ml) 0.1…objem analyzovaného vzorku (ml) 1
…Přepočet z μg na mg
1000 100 𝑤
…Přepočet obsahu škrobu na procenta a navážku mouky
w…navážka vzorku (mg) 0.9 =
162 180
…přepočet z volné D-glukosy na anhydroglukosu, která je přítomná ve škrobu
5.3.2 Nerezistentní (stravitelný) škrob 𝑥𝑁𝑆(%) = ∆𝐴𝑁𝑆 ∗
𝐹 𝑤
∗ 𝐹𝑉 ∗ 0.9
(3)
∆𝐴𝑁𝑆 … absorbance stravitelného škrobu měřená proti slepému pokusu 5.3.3 celkový škrob xTS se vypočte: xTS = xRS + xNS 6. STANOVENÍ SUŠINY NA SUŠICÍCH VAHÁCH Princip metody: Principem metody je thermogravimetrické stanovení vlhkosti sypkého materiálu. Používají se sušicí váhy na stanovení vlhkosti a sušiny. Tyto váhy obsahují dva halogenové křemenné zářiče, každý o výkonu 200 W. Teplotu sušení lze nastavit v rozmezí 40 až 250°C, krok 1°C. Po spuštění programu probíhá plně automatické sušení do konstantní hmotnosti.
7
Postup měření: Do hliníkové misky se na sušicích váhách naváží 2 g vzorku. Zavře se poklop a stiskne tlačítko „Start “. Po 10 - 15 minutách svítí na displeji pouze symbol + a hodnota sušiny v hmotnostních procentech. Stanovení sušiny proveďte dvakrát. 3. den Dokončení rozborů.
8
