MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie
Expresní profil transkripčního faktoru NFκ κB v průběhu makrofágové diferenciace Diplomová práce
Brno 2008
Markéta Kaucká
Na tomto místě bych ráda poděkovala svému školiteli prof. RNDr. Janu Šmardovi, CSc., že mi umožnil pracovat v Laboratoři buněčné diferenciace, za podporu, pomoc a čas, které mi věnoval a odbornému poradci RNDr. Petru Vaňharovi za cenné rady, trpělivost, pomoc a jeho čas. Mé poděkování patří i všem členům laboratoře za vstřícnost a vytvoření skvělého prostředí.
Obsah 1.
Úvod…………………………………………………………………………….. 4
1.1.
Transkripční faktor NFκB (jaderný faktor kappa B)…………………………….. 4
1.2.
Aktivace NFκB……………………………………………………….………….. 6 1.2.1. Kanonická aktivační dráha NFκB ………………………......…………… 8 1.2.2. Nekanonická aktivační dráha NFκB …………..………………….……... 10
1.3.
Post-translační úpravy v aktivační dráze NFκB ………………………………….10 1.3.1. Regulace odpovědi fosforylací NFκB ……………………………………10 1.3.2. Regulace odpovědi acetylací NFκB ……………………………………...11
1.4.
Buněčná linie BM2………………………………………………………………. 11
1.5.
Diferenciační činidla ……………………………………………….……………. 12 1.5.2. Trichostatin A (TSA)……………………………………………............... 13 1.5.3. 12-O-Tetradekanoylforbol-13-acetát (TPA)…………………………….... 14
1.6.
Krvetvorba………………………………………………………………………..15 1.6.1. NFκB v myeloidní linii…………………………………………………... 15 1.6.1.1. NFκB a aktivace makrofágů……………………………..................16
2.
Materiál a metody………………………………………………………....… 18
2.1.
Materiál…………………………………………………………………………....18 2.1.1. Buněčné linie……………………………………………………………...18 2.1.2. Růstová média…………………………………………………………..... 18 2.1.3. Chemikálie a roztoky…………………………………………………...... 19 2.1.4. Diferenciační činidla…………………………………………………....... 19 2.1.5. Použité plazmidy……………………………………………………….... 19 2.1.6. Použité přístroje………………………………………………………….. 19 2.1.7. Použitý software………………………………………………………..... 20
2.2.
Metody………………………………………………………………………….... 20 2.2.1. Transformace bakteriálních buněk………………………………............. 20 2.2.2. Izolace plazmidové DNA s použitím kolon Qiagen (Maxiprep)……….... 21 2.2.3. Izolace plazmidové DNA s použitím kolon Qiagen (Miniprep)……….... 23 2.2.4. Transaktivační testy……………………………………………………… 23 2.2.5. Přechodná transfekce buněk MCF-7…………………………………….. 25
2.2.6. Zamražování buněk BM2…………………………………………..……. 26 2.2.7. Cytocentrifugace…………………………………………………………. 26 2.2.8. Gelová elektroforéza nukleových kyselin……………………………….. 27 2.2.9. Izolace celkové RNA…………………………………………………….. 28 2.2.10. Reverzní transkripce (převod RNA do cDNA)………………………….. 29 2.2.11. Real-time PCR…………………………………………………………… 30 2.2.12. Restrikční štěpení plazmidové DNA a příprava inducibilního expresního vektoru…….. ……………………………………….…..…… 31
3.
Výsledky………………………………………………………………………. 35
3.1.
Navození diferenciace u buněk BM2 působením trichostatinu A a forbol esteru TPA………………………………………………………………………. 35
3.2.
Expresní profil transkripčního faktoru NFκB v průběhu diferenciace………….. 39 3.2.1. Optimalizace metody kvantitativní PCR v reálném čase…........………… 39
3.3.
Stanovení exprese podjednotek NFκB………………………………………….. 43 3.3.1. Kinetika exprese podjednotky p50………………………………………. 43 3.3.2. Kinetika exprese podjednotky p52………………………………………. 45 3.3.3. Kinetika exprese podjednotky c-Rel……………………………………. 46 3.3.4. Kinetika exprese podjednotky RelB……………………………………... 47 3.3.5. Kinetika exprese podjednotky p65………………………………………. 48
3.4.
Rozdíl expresních profilů neovlivněných BM2 a buněk terminálně diferencovaných vlivem TPA a TSA…………………..………………………... 50
3.5.
Příprava expresního vektoru pro inducibilní expresi IκB∆n…………..………... 51
4.
Diskuze…………………………………………………………………………… 56
5.
Závěr………………………………………………………………………………62
6.
Summary………………………………………………………………………… 63
7.
Seznam použité literatury…………………………………………………… 64
1. Úvod
1.
Úvod
1.1. Transkripční faktor NFκ κB (jaderný faktor kappa B) NFκB byl poprvé objeven v laboratoři Davida Baltimora v roce 1986. Byl identifikován jako protein, který je potřebný pro zajištění exprese genů specifických pro B buňky. Váže se na dekamerickou sekvenci (5´ GGG ACT TTC C 3´) v intronovém zesilovači kappa lehkého imunoglobulinového řetězce ve zralých B buňkách a plazmatických buňkách, avšak neváže se na tuto oblast v nezralých pre-B buňkách (Sen a Baltimore, 1986). Vazebná aktivita NFκB je indukována celou škálou nitrobuněčných a mimobuněčných podnětů. NFκB je přítomen ve většině živočišných buněčných typů. Vazebné místo pro NFκB má sekvenci 5´ GGG RNW YYC C 3´ (kde R=purin, Y=pyrimidin, N=libovolná báze, W=adenin nebo thymin) a nachází se v promotorech a zesilovačích značného množství inducibilních genů. NFκB se účastní řady buněčných procesů, které odpovídají na různé podněty jako jsou např. stres, cytokiny, volné radikály, ultrafialové záření nebo bakteriální a virové antigeny (Baeuerle, 1991). Významně se podílí na imunitní a zánětlivé odpovědi, diferenciaci, buněčném růstu, apoptóze a na transkripci z virových promotorů (Jimi a Gosh, 2005). Deregulace NFκB nastává u rakoviny, zánětu, autoimunitních onemocněních, septického šoku a virové infekce (Yamamoto a Gaynor, 2001). Do rodiny NFκB/Rel patří tyto proteiny: p105/p50 (NFκB1), p100/p52 (NFκB2), RelB, c-Rel, p65 (RelA) a virový onkoprotein v-Rel (Hayden a Gosh, 2004; Baldvin, 1996). Spojují se v homo- či heterodimery a vytvářejí tak transkripční regulační komplexy, známé jako nukleární faktor kappa B. Transkripční aktivita je specifikována složením dimerů (Perkins et al., 1992), závisí také na jejich buněčné lokalizaci a jejich asociaci s inhibitorovými proteiny IκB. Charakteristickým znakem podjednotek NFκB je vysoce konzervovaná N-koncová doména, zahrnující přibližně 300 aminokyselin, která se označuje jako Rel homologní doména (RHD). Tato oblast je vyžadována pro vazbu na DNA, dimerizaci, jadernou lokalizaci (obsahuje NLS-jaderný lokalizační signál) a pro vazbu inhibitoru IκB (Obr. 1). Proteiny Rel/NFκB se dělí do dvou skupin. Proteiny c-Rel (a jeho virový homolog v-Rel), RelB a p65 mají jednu či více transaktivačních domén na C-konci a jsou přímo syntetizovány 4
1. Úvod jako transkripčně aktivní proteiny. Podjednotky p50 a p52 jsou vytvářeny jako delší prekurzory o velikostech 105 kDa (p50) a 100 kDa (p52) a musí být proteolyticky upraveny (Karin a Ben-Neriah, 2000). Mají dlouhé C-koncové domény a ty obsahují mnohonásobné kopie ankyrinových motivů, které slouží k inhibici těchto i ostatních molekul NFκB/Rel. Prekurzorový protein p105 je na p50 zkracován převážně konstitutivně, zatímco zkrácení p100 na p52 je přesně regulováno a je závislé na signálech (Beinke a Ley, 2004).
Obr. 1 Struktura proteinů NFκB/Rel, inhibičních proteinů IκB a kináz IκB (IKK). Rodina NFκB/Rel obsahuje 5 členů: p65 (RelA), c-Rel, RelB, p50 a p52. Jsou charakterizovány evolučně konzervovanou Rel homologní doménou (RHD) o délce asi 300 aminokyselin. Tato oblast zajišťuje vazbu na DNA, jadernou lokalizaci a dimerizaci podjednotek. Podjednotky p65, c-Rel a RelB obsahují transaktivační doménu na C konci, která je vyžadována pro aktivaci exprese cílových genů. Rodinu inhibičních proteinů IκB tvoří 7 členů: IκBα, IκBβ, IκBγ, IκBε, Bcl-3, p105 a p100. Liší se počtem ankyrinových repeticí, jejichž počet se pohybuje mezi 5 a 7 opakováními. Rodina kináz IκB (IKK) zahrnuje IKKα (IKK1), IKKβ (IKK2), IKKγ/NEMO a IKKε/IKKi. První dva proteiny tvoří katalytické podjednotky vysokomolekulárního (~700 kDa) kinázového komplexu a IKKγ slouží jako regulační podjednotka. IKKε/IKKi je nekanonický člen IKK rodiny, který se uplatňuje v alternativní aktivační NFκB dráze. Upraveno podle www.alexis-biochemicals.com
Aktivní transkripční faktor NFκB musí obsahovat alespoň jeden protein s transaktivační doménou, která je nezbytná pro aktivaci genové exprese. Nejčastější formou transkripčního faktoru NFκB v buňkách je heterodimer p50/p65. I ostatní podjednotky se však mohou spojovat v homo- či heterodimery a fungovat jako transkripční regulátory. Výjimkou je RelB, který se nemůže spojovat v homodimery. Složení podjednotek v NFkB se liší v závislosti na buněčném typu, vlastnostech indukujícího podnětu nebo na době působení tohoto stimulu. Přesné pochopení mechanismu aktivace a působení NFkB je komplikováno faktem, že existuje mnoho homodimerních a heterodimerních kombinací faktorů NFκB/Rel. Jednotlivé proteiny NFκB/Rel mají odlišné biologické funkce, přesná fyziologická funkce 5
1. Úvod každého jednotlivého proteinu není zcela známa. Například homodimery z jednotek p50 nebo p52 postrádají transaktivační doménu, proto působí na genovou expresi spíše inhibičně a děje se tak konkrétně kompeticí o místa κB s dalšími komplexy NFκB (Franzoso et al., 1997; May a Ghosh, 1997). Studie na myších prokázaly základní funkce jednotlivých proteinů Rel/NFκB (Gerondakis et al., 1999). Ztráta podjednotky p65 zapříčiní embryonální letalitu způsobenou degenerací jater, zatímco ztráta jakékoliv jiné podjednotky způsobí deficit imunity bez vývojových vad. Vazba inhibičních proteinů ovlivňuje aktivitu dimerů NFκB. IκBα mnohem silněji inhibují komplexy p50/p65 než p50/RelB nebo p50/c-Rel, zatímco IκBβ má stejnou inhibiční aktivitu pro všechny tři komplexy (Baeuerle a Baltimore, 1988). Všechny dimery NFκB se mohou vázat na běžnou vazebnou sekvenci, ale některé kombinace NFκB podjednotek k ní vykazují vyšší afinitu. Dimer p50/p65 se s vysokou afinitou váže na sekvenci 5´ GGG RNN YYC C 3´, zatímco p65/c-Rel preferuje sekvenci 5´ HGG ARN YYC C 3´ (kde H=A, C nebo T; R=purin; Y=pirimidin; N=libovolná báze). NFκB bývá často označován jako hlavní zprostředkovatel imunitní odpovědi. Tento transkripční faktor dokáže aktivovat široké spektrum bakterií a virů (Gosh et al., 1998). Pro jeho správnou funkci je důležitá přesná regulace odpovědi na odlišné podněty. Vazba ligandů na receptory jako jsou TCR (T buněčné receptory), BCR (B buněčné receptory), IL-1R (interleukin 1 receptor), TNFR („tumor necrosis factor receptor“), BAFF-R („B-cell activating factor receptor“), LTβR („lymphotoxin β receptor“) a TLR („Toll-like receptors“) (Silverman a Maniatis, 2001; Bonizzi a Karin 2004) spouští regulaci exprese cytokinů (Lenardo et al, 1989), chemokinů, růstových faktorů, povrchových adhezivních molekul, imunoreceptorů, dalších transkripčních faktorů, regulátorů apoptózy a efektorových enzymů. NFκB má také významný vliv na vývoj tkání a orgánů během embryogeneze a na vývoj a fyziologii tkání (kost, nervový systém, epitely) v dospělosti. Je hlavním regulátorem odpovědí na stres (oxidativní, fyzický, po vystavení jistým chemickým látkám) a u některých buněčných typů blokuje apoptózu. Transkripční aktivita NFκB je regulována na více úrovních (množství IκB proteinů a kombinace NFκB podjednotek).
1.2. Aktivace NFκ κB V nestimulovaných buňkách se proteiny NFκB nachází v cytoplazmě v neaktivní formě. Jsou asociovány s inhibičními proteiny rodiny IκB (Bauerle a Baltimore, 1996), nejčastěji s IkBα, IkBβ a NEMO/IκBγ (Whiteside a Israel, 1997). Do rodiny proteinů IκB 6
1. Úvod patří dále Bcl-3, IkBε a prekurzorové proteiny p100 a p105. Všechny tyto proteiny jsou charakterizovány přítomností 5-7 ankyrinových repeticí (30-33 aminokyselinové sekvence), které se skládají a následně se vážou na dimerizační doménu podjednotek NFκB (Hatada et al., 1992). Interakce mezi inhibičními proteiny a proteiny rodiny NFκB je umožněna právě těmito repetitivními ankyrinovými doménami, které zajišťují vazbu mezi dvěma proteiny. Protein Bcl-3 interaguje specificky s homodimery p50 nebo p52 a s heterodimerem p50/p52 a může spustit expresi genů κB, ačkoliv patří do rodiny inhibičních proteinů (Bours et al., 1993; Dechend et al., 1999). Prekurzor p100 se běžně nachází v komplexu s RelB, C-koncová oblast p100 reprimuje transkripční aktivitu RelB (Solan et al., 2002). Zkrácení p100 a uvolnění dimeru p52/RelB je spouštěno nejméně třemi členy nadrodiny TNF (CD40, LTβR a BAFF-R) (Yamamoto a Gaynor, 2004). Vazbou IκB na NFκB se ovlivňuje lokalizace dimeru v buňce, a v důsledku překrytí jaderného lokalizačního signálu (NLS) NFκB, který se nachází u C-konce Rel homologní domény NFκB proteinů (Henkel et al., 1992). Dříve se předpokládalo, že proteiny IκB udržují NFκB v cytoplazmě překrýváním jaderných lokalizačních signálů obou podjednotek dimerního komplexu. IκBα ale dokáže překrýt NLS pouze jedné podjednotky dimeru, takže dochází k částečné konstitutivní translokaci do jádra buňky. Zároveň probíhá export komplexu NFκB-IκBα z jádra, který je mnohem účinnější než přesun neaktivního komplexu do jádra, pomocí NES (nuclear export signal) (Huang et al., 2000), který obsahuje na svém N-konci IκBα a nikoliv IκBβ. Stejně jako IκBα, také IκBε se nachází střídavě mezi jádrem a cytoplazmou navázaný na NFκB dimery (Lee a Hannink, 2002). Inhibiční protein IκBβ dokáže zakrýt oba NLS a proto udržuje NFκB dimer trvale v cytoplazmě (Tam a Sen, 2001; Malek et al., 2001). Geny kódující podjednotky c-Rel a RelB společně s prekurzorovými proteiny NFκB1 a NFκB2 obsahují ve svých promotorech elementy κB, které jsou inducibilní NFκB. Proto se složení komplexů NFκB a tím indukce a exprese širokého spektra genů může průběžně měnit. Není zatím zcela známé, zda-li se určité podjednotky dají nahradit jinými. NFκB1 (p50) a NFκB2 (p52) jsou vysoce konzervované. Myši deficientní v jedné z těchto podjednotek se vyvíjejí zcela normálně, pokud ale deficience postihne obě zmíněné podjednotky, dochází k blokádě osteoklastové diferenciace vedoucí k chybám v remodelaci kostí a osteopetróze (Franzoso et al., 1997; Iotsova et al., 1997). Komplexy obsahující p50 či p52 se tedy mohou navzájem nahrazovat a podobně p50 může částečně kompenzovat nedostatek RelB (Weih et al., 1997), p65 (RelA) a c-Rel. 7
1. Úvod
1.2.1. Kanonická aktivační dráha NF-κ κB Klasická signální dráha aktivace NFκB se uplatňuje v odpovědích na bakteriální a virové infekce nebo při vystavení prozánětlivým cytokinům (stimulace cytokinem TNFα nebo interleukinem-1). Vede k sérii modifikací kinázového komplexu (Israel, 2000), který má 700-900 kDa a skládá se ze dvou katalytických podjednotek IKKα (IKK1) a IKKβ (IKK2) a z regulační podjednotky IKKγ/NEMO („NFκB essential modulator“) (Karin, 1999), která je nezbytná pro aktivaci celého komplexu sjednocením signálů z nadřazených kináz a receptor-asociovaných proteinů (Viatour et al., 2005). Dochází k ubikvitinaci a fosforylaci IKKγ a k fosforylaci dvou serinových zbytků v aktivační smyčce kinázové domény IKKβ (S177 a S181) nebo IKKα (S176 a S180). Aktivovaný IKKβ dále fosforyluje IκBα na serinech 32 a 36, to vede k polyubikvitinaci na lysinech 21 a 22. Fosforylovaný IκBα je rozeznáván a označen Skp1/Cul1/F-box proteinβ-TrCP ubikvitin-ligázovým komplexem, který zajistí okamžitou degradaci ubikvitinovaného IκBα proteazomem 26S (Chen, 2005). Uvolněním dimeru NFκB se odkryje jaderný lokalizační signál a to umožní jeho translokaci do jádra buňky (Karin a Ben-Neriah, 2000) a vazbu na promotory cílových genů. Ve většině buněčných typů aktivace kanonické dráhy zajistí lokalizaci NFκB dimeru do jádra během několika málo minut. Podjednotky IKKα a IKKβ jsou z 52% strukturně identické, mají protein kinázovou doménu blízko N-konce a motivy LZ (leucinový zip) a HLH (helix-smyčka-helix) u C-konce. IKKγ/NEMO postrádá kinázovou doménu, ale obsahuje sekvenci zajišťující vazbu protein-protein a C-koncový motiv LZ. Myši postrádající NEMO umírají během embryonálního vývoje díky rozsáhlé apoptóze v játrech (Rudolph et al., 2000). V NEMO-deficientních buňkách nelze detekovat žádnou aktivitu NFκB. NEMO je lokalizován na chromozomu X a mutace v genu kódujícím tento protein jsou spojovány s dvěma onemocněními: incontinentia pigmenti (Smahi et al., 2000) a anhidrotickou ektodermální dysplazií s imunodeficiencí (Doffinger et al., 2001). IKKα a IKKβ přednostně vytváří heterodimery, které mohou přímo fosforylovat S32 a S36 IkBα. IKKβ je vyžadována pro inducibilní degradaci IκB závislou na fosforylaci a IKKα přednostně fosforyluje prekurzor p100, což je nezbytné pro zkrácení na p52 (Senftleben et al., 2001). IKKβ je cílem nejčastěji prozánětlivých stimulů, zatímco IKKα se účastní morfogenní signalizace (Delhase et al., 1999; Hu et al., 1999) a je zahrnuta v signalizaci indukované lymfotoxiny (Matsushima et al., 2001). 8
1. Úvod Nejběžnějším dimerem NFκB uvolňovaným touto klasickou aktivační dráhou je p50/p65. Jeho aktivace je spojována se zvýšenou transkripcí genů kódujících chemokiny (Guo et al., 2004; Lee et al., 2004), cytokiny (Pikarsky et al., 2004; Lee et al., 2004), adhezivní molekuly (Wilson et al., 2001; Yoshimura et al., 2001) a inhibitory apoptózy (Lee et al., 2004; Abdel-Mageed et al., 2003). Význam této dráhy spočívá zejména v zajištění přežití zralých imunitních buněk během bakteriální infekce nebo při stimulaci proteiny během akutního zánětu (Ghosh a Karin, 2002; Liou, 2002). Kanonická NFκB odpověď bývá nejčastěji ukončena indukcí genové exprese IκBα aktivovaným NFκB. Nově syntetizované inhibitorové proteiny mohou vstupovat do jádra, vázat se na jaderný NFκB a lokalizovat ho zpět do cytoplazmy (Obr. 2).
9
1. Úvod Obr.2 Dimery NFκB jsou v cytoplazmě buněk přítomny v komplexu s inhibičními proteiny rodiny IκB. Pod vlivem nejrůznějších stimulů dochází přes nejrůznější kinázy k fosforylaci kináz IκB, které dále fosforylují inhibiční proteiny IκB a tím je označí k degradaci. Uvolněný dimer NFκB je pak translokován do jádra. Tento aktivní komplex se váže na regulační oblasti cílových genů a tím ovlivňuje jejich expresi. Převzato z: www.sigma.com
1.2.2. Nekanonická aktivační dráha NF-κ κB Některé aktivátory NFκB jako jsou např: CD40, CD30, CD27, RANK („receptor activator of NFκB“), lymfotoxin-β receptory (Ramakrishnan et al., 2004), B buněčný aktivující faktor TNF rodiny, LMP-1 viru Epstein-Barrové („latent membrane protein-1“) spouští nekanonickou alternativní dráhu NFκB, která nevyžaduje fosforylaci a degradaci IκB a vede k tvorbě a uvolnění aktivních dimerů p52/RelB (Liao a Sun, 2003). Je zahájena aktivací NIK („NFκB-inducing kinase“), která aktivuje homodimer IKKα. Tato kináza fosforyluje podjednotku p100 na C-konci a zajistí tím její ubikvitinaci a následné proteolytické zkrácení proteazomem 26S na p52 (Qing et al., 2005). C-konec p100 obsahuje ankyrinové repetice, které zajišťují cytoplazmatickou lokalizaci. Zkrácená podjednotka p52 se ve spojení s RelB translokuje do jádra. (Bonizzi a Karin, 2004). Tato aktivační dráha je závislá pouze na IKKα a NIK, nikoliv na IKKβ a IKKγ (Senftleben a Karin, 2002). Dimer p52/RelB a alternativní aktivační dráha se nejvýznamněji uplatňují ve vývoji a udržování sekundárních lymfatických orgánů (Dejardin et al., 2002).
1.3. Post-translační úpravy v aktivační dráze NFκ κB Po uvolnění aktivních dimerů z inhibičních komplexů s proteiny IκB dochází k post-translačním úpravám dimerů NFκB nebo histonů cílových genů. Mezi úpravy patří fosforylace a acetylace a určují sílu a délku trvání transkripční odpovědi NFκB (Rahman et al., 2004; Greene a Chen, 2004).
1.3.1. Regulace odpovědi fosforylací NFκ κB Na podjednotce p65 byla nalezena nejméně 4 místa obsahující serin, které slouží jako akceptory fosfoskupiny a zvyšují tak transaktivační aktivitu NFκB. Jedná se o seriny S276, S311 v oblasti Rel homologní domény a S529 a S536 v oblasti transaktivační domény (Hu 10
1. Úvod et al., 2004; Duran et al., 2003). Proces fosforylace zajišťují různé kinázy, např.: fosfatidylinositol 3-kináza (PI3K) (Kang et al., 2003), glykogen-syntáza kináza 3β (GSK3β) (Buss et al., 2004), kinázy z rodiny protein-kináz (PKAc, PKCξ) (Zhong et al., 1997) a mitogen- a stres-aktivující kináza 1 (MSK1) (Vermeulen et al., 2003). Fosforylace transkripčního faktoru zajistí rychlé sjednocení vnitrobuněčných signálů. Fosforylovaná p65 snadněji váže transkripční kofaktory a v některých případech (p65 fosforylovaná na serinu S311 kinázou PKCξ či na S276 kinázou PKAc nebo MK1) snadněji odstraňuje transkripčněrepresivní histon-deacetylázové komplexy, které bývají navázány na κB zesilovače cílových genů (Okazaki et al., 2003; Zhong et al., 2002) .
1.3.2. Regulace odpovědi acetylací NFκ κB Stejně jako fosforylace, je i acetylace NFκB a histonů obklopujících cílové geny důležitým regulačním mechanismem funkce NFκB v jádře (Quivy a Van Lint, 2004). Transkripce závislá na NFκB často vyžaduje nejrůznější koaktivátory, které disponují histonacetyl-transferázovou aktivitou (HAT). Odpovědí na stimulaci TNFα nebo TPA je acetylace p65 v míře odpovídající velikosti signálu (Rahman et al., 2002). Na této podjednotce je pět hlavních acetylačních míst, jedná se o lysiny 122, 123, 218, 221 a 310. Modifikace těchto míst upravuje určité odpovědi. Acetylace lysinu 221 posiluje vazbu p65 na DNA a oslabuje spojení s IκBα. Acetylace lysinu 310 je vyžadována pro plnou transkripční aktivitu podjednotky p65, ale neovlivňuje vazbu na DNA či IκBα. Pravděpodobně acetylovaný lysin 310 vytváří vazebné místo pro transkripční koaktivátor. Acetylace lysinů 122 a 123 vykazuje spíše negativní efekt na transkripci zprostředkovanou NFκB oslabením vazby p65 na zesilovač κB (Kiernan et al., 2003). Podobně i u podjednotky p50 dochází k acetylaci, nejčastěji na lysinech 431, 440 a 441, které posilují vazbu na DNA a zvýší tak NFκBaktivační schopnost heterodimerů obsahujících p50 (Furia et al., 2002). Obecně acetylace na různých místech jednotlivých podjednotek má za následek odlišné efekty, mezi něž patří zejména ovlivnění síly vazby na DNA, regulace transkipční aktivity a vazby ihibitoru IκB.
1.4. Buněčná linie BM2 Tato modelová buněčná linie byla připravena pomocí nezralých kuřecích buněk myeloidní linie, které byly infikované virem ptačí myeloblastózy (AMV-„avian 11
1. Úvod myeloblastosis virus“). Tyto buňky byly injikovány do kuřecích embryí a následně byly z jejich kostní dřeně izolovány buňky transformované tímto virem (Moscovici et al., 1982). Jedná se o monoblasty obsahující onkogen v-myb, který je zkrácenou variantou buněčného genu c-myb a je součástí genomu transformujícího retroviru. c-Myb je jaderný protein o velikosti 75 kDa, patřící do rodiny transkripčních faktorů Myb. Účastní se krvetvorby a je jejím hlavním regulátorem. Gen c-myb je exprimován ve všech nezralých hematopoetických proliferujících prekurzorech. Jak inhibice, tak silná aktivace exprese tohoto genu ovlivňuje proliferaci a diferenciaci hematopoetických buněk (Fu a Lipsick, 1997). Proteiny rodiny Myb mají specifickou N-koncovou doménu tvořenou třemi tandemovými repeticemi (R1, R2 a R3), která umožňuje vazbu proteinu na DNA. Dále obsahují C-koncovou negativní regulační doménu a mezi nimi se ve střední části molekuly nachází transaktivační doména. Protein v-Myb (45 kDa) je na C konci kratší o 199 a na N-konci o 71 aminokyselin. Kromě toho můžeme uvnitř onkoproteinu nalézt 10 rozdílů v sekvenci aminokyselin oproti proteinu c-Myb (Lipsick a Wang, 1999). V důsledku zkrácení onkoproteinu na N-konci, chybí první tandemová repetice R1 a to snižuje jeho schopnost vazby na DNA (Lipsick, 1996). Funkce transaktivační domény je narušena zkrácením C-konce, jehož důsledkem je také poškozená funkce negativně regulační domény. Dalším důsledkem výše uvedených změn je zvýšená schopnost onkogenní aktivace (Gonda et al., 1989). Expresí onkogenu v-myb vzniká protein p45v-myb, který znemožňuje dokončení monocytické/makrofágové dráhy a udržuje tak buňky v nediferencovaném stavu. BM2 in vitro aktivně proliferují jako neadherentní monoblasty. Jejich diferenciační schopnost lze obnovit působením forbolového esteru (TPA) nebo inhibitorem histonových deacetyláz trichostatinem A (TSA).
1.5. Diferenciační činidla Forbolovým esterem je možné indukovat diferenciaci buněk BM2 do stádia jednojaderných makrofágů (Symonds et al., 1984). Po aplikaci TSA dochází k fúzi buněk a diferenciaci do stádia mnohojaderných makrofágů (Nemajerová et al., 2003).
12
1. Úvod
1.5.1. Trichostatin A TSA je organická sloučenina (Tab. 1), která působí jako antimykotické antibiotikum a je produkována Streptomycetami. Patří do skupiny inhibitorů odvozených od kyseliny hydroxamové, přičemž hydroxamová skupina je analogem substrátu HDAC, acetylovaného lyzinu (Obr. 3). Inhibice deacetylační aktivity HDAC způsobená interakcí TSA s katalytickým centrem HDAC je reverzibilní (Finnin et al., 1999). TSA selektivně inhibuje enzymy rodiny histondeacetyláz (HDAC) u savců (Yoshida et al., 1990) a inhibuje buněčný cyklus u eukaryot. Trichostatin se běžně používá k pozměnění genové exprese. Inhibitory deacetyláz (HDI) obecně zvyšují celkovou míru acetylace histonů Bylo prokázáno, že HDI inhibují růst, indukují apoptózu a diferenciaci u různých nádorových linií. HDI jsou nyní prověřovány v klinických testech jako potencialní protinádorová terapeutika, pro svou schopnost zvýšit expresi proapoptotických genů a tím snížit životnost rakovinových buněk a zpomalit proces kancerogeneze (Minucci et al., 2001). Dalším možným protinádorovým mechanismem jejich působení na dediferencované nádorové buňky je navození jejich diferenciace a znemožnění dalšího dělení. Systematický název (IUPAC)
7-[4-(dimethylamino)phenyl]-N-hydroxy-4,6dimethyl-7-oxohepta-2,4-dienamide
Molekulová hmotnost
302,37 g/mol
Sumární vzorec
C17H22N2O2
Tab. 1
Obr 3. Konstituční vzorec trichostatinu A
13
1. Úvod
1.5.2. Tetradekanoylforbolacetát TPA je také znám pod názvem forbol-12-myristát-13-acetát nebo pod zkratkou PMA (Tab. 2). Tento forbolový diester je silný nádorový promotor. Využívá se k přímé aktivaci protein kinázy C (PKC), Ca2+- a fosfolipid-dependentní serin/threonin kinázy. PKC je klíčovým enzymem v signálové transdukci a důležitým regulátorem cytoskeletálních funkcí. Protein kináza C je obvykle aktivována diacylglycerolem (DAG), ale TPA dokáže díky podobnosti jeho funkci plně nahradit (Obr. 4) (Kikkawa, 1989). TPA se v přírodě vyskytuje v rostlinách rodu Croton pocházející z jihovýchodní Asie. TPA je již používáno v léčbě pacientů trpících myeloidní leukémií (Strair et al., 2002) Systematický název (IUPAC)
12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate
Molekulová hmotnost
616,83 g/mol
Sumární vzorec
C36H56O8
Další názvy / zkratky sloučeniny
TPA,
PMA,
Phorbol
myristate
Tetradecanoylphorbol acetate Tab. 2
Obr 4. Konstituční vzorec tetraforbolesteru
14
acetate,
1. Úvod
1.6. Krvetvorba Jako
krvetvorba
se
označuje
vysoce
organizovaný
proces,
ve
kterém
z hematopoetických kmenových buněk („Hematopoietic Stem Cell“ - HSC) vznikají vlivem nejrůznějších růstových a diferenciačních faktorů všechny druhy krevních buněčných komponent. Pluripotentní kmenové buňky začínají vznikat od třetího až čtvrtého týdne embryonálního vývoje, extraembryonálně ve žloutkovém váčku (Durand a Dzierzak, 2005) a intraembryonálně v oblasti zvané AGM („Aorta Gonads Mesonephros“) (Godin a Cumano, 2005). Ve žloutkovém váčku vznikají primitivní erytroidní buňky a některé myeloidní prekurzory. V oblasti AGM dochází ke vzniku všech kmenových hematopoetických buněk, které se poté usazují ve fetálních játrech a v kostní dřeni dospělých jedinců, odtamtud jsou později krevní elementy přeneseny cirkulací krve do jater, brzlíku a sleziny. Buňky HSC jsou schopné vytvořit jakoukoliv linii krevních buněk. Kromě glykoproteinu CD34 neexprimují žádný jiný povrchový marker typický pro jednotlivé linie krevních buněk (Smith, 2003) a mají schopnost sebeobnovy. Buňky HSC se vyskytují v kostní dřeni, slezině, játrech a pupeční šňůře. V těle existuje stálá zásoba buněk HSC, díky které dochází k průběžnému doplňování krevních buněk. Pod vlivem specifických transkripčních faktorů tyto buňky diferencují a z HSCs vznikají progenitorové krevní buňky, které již nejsou schopny sebeobnovy. Z pluripotentních kmenových buněk vznikají multipotentní HPC („Hematopoietic progenitor Cell“) a z nich další diferenciací multipotentní progenitorové buňky dvou linií: lymfoidní (CLP-Common Lymphoid Progenitor) a myeloidní (CMP-Common Myeloid Progenitor). Do lymfoidní linie řadíme B- a T-lymfocyty, NK buňky („natural killer“) a do myeloidní větve patří erytrocyty, makrofágy, monocyty, trombocyty, granulocyty, dendritické buňky a mikrogliové buňky. Obě linie se dále dělí, diferencují až dávají vzniknout unipotentním buňkám progenitorovým (Obr. 5). Ty mají na svém povrchu receptory, které po stimulaci spouští diferenciaci do buněk jedné konkrétní linie.
1.6.1. NFκ κB v myeloidní linii NFκB je součástí diferenciace a aktivace makrofágů, granulocytů, osteoklastů, dendritických buněk a erytrocytů. V každé jednotlivé linii buněk a v každém vývojovém stupni se uplatňují specifické kombinace NFκB/Rel proteinů (Obr. 5). Produkce c-Rel 15
1. Úvod je spojena s lymfocyty, monocyty, granulocyty a erytrocyty, zatímco RelB se tvoří převážně v dendritických buňkách a lymfocytech. Gen kódující podjednotku p52 (p100) je nejvíce exprimován v epitelu žaludku, dendritických buňkách a lymfocytech. Skutečnost, že proteiny NFκB/Rel jsou produkovány zejména v hematopoetických buněčných liniích, naznačuje velký význam NFκB v imunitních funkcích. Myši deficientní pro IκBα vykazují zvýšenou tvorbu myeloidních kolonií („CFU-GEMM - granulocyte/ erythroid/ monocyte/ macrophage colony-forming units“), z čehož můžeme usuzovat, že klasická aktivační dráha NFκB přispívá k diferenciaci těchto linií (Gerondakis, 1999). Delece podjednotek cRel a p65 postihuje rané myeloidní progenitory. GM-CSF („granulocyte-macrophage colony-stimulating factor“) interaguje se svým receptorem a indukuje diferenciaci myeloidního progenitoru do granulocytů nebo makrofágů. IKK2 interaguje s α řetězcem GM-CSF receptoru během tohoto procesu (Ebner et al., 2003). 1.6.1.1. NFκ κB a aktivita makrofágů Makrofágy mají velmi důležitou funkci ve vrozené imunitě. Při bakteriální infekci fagocytují zbytky buněk a produkují hydrolytické a proteolytické enzymy, stejně tak cytokiny a růstové faktory. Interakce mikrobiálních molekul s TLRs makrofágů vede k aktivaci NFκB a tím k indukci exprese prozánětlivých cytokinů, chemokinů a antiapoptických proteinů. Další úlohou makrofágů je prezentování antigenů aktivovaným T buňkám a právě tím se podílejí na získané imunitě. Zatímco
v prekurzorech
monocytů
lze
detekovat
nízkou
aktivitu
NFκB,
po diferenciaci do stádia makrofágů indukovanou TPA zaznamenáme aktivaci IKK a s tím spojenou aktivitu NFκB (Pennington et al., 2001). Během tohoto procesu chrání NFκB buňky před apoptózou. Makrofágy deficientní pro TRAF-6 („TNF receptor-associated factor 6“) vykazují sníženou aktivitu NFκB doprovázenou zvýšenou hladinou apoptózy. Za klíčový cílový gen NFκB je považován p21WAF1/Cip1, který je důležitý pro přežívání buněk. Makrofágy deficientní pro IKK2 mají poškozenou apoptózu (Hsu et al., 2004). Další antiapoptický gen zahrnutý v přežívání makrofágů je protein Bfl1/A1 z rodiny Bcl-2. Také byla identifikována nová funkce IKK1 v makrofázích. Je prokázáno, že zatímco IKK2 ovlivňuje aktivaci NFκB v makrofázích, IKK1 ji v těchto buňkách inhibuje. Nedostatek aktivity IKK1 (deficience nebo exprese dominantně negativního proteinu) zesiluje aktivaci NFκB a je doprovázena zvýšenou antigen-prezentující aktivitou T buňkám, zvýšeným zánětem a odstraňováním bakterií (Li et al., 2005). Aktivita NFκB v makrofázích myší, které exprimují kináza-deficientní IKK1, 16
1. Úvod místo divokého typu (modulace fosforylace p65 na serinu 536) vede ke zrychlenému obratu transkripčního faktoru (Lawrenc et al., 2005).
Obr. 5. NFκB v hematopoetické diferenciaci. Během krvetvorby je důležitá tkáňově specifická exprese transkripčního faktoru NFκB. Zatímco proteiny p50 a p65 se nacházejí téměř ve všech liních a vývojových stádiích, ostatní proteiny NFκB/Rel se objevují v jistých buněčných typech. Exprese c-Rel je vymezena prostředím monocytů, lymfocytů, granulocytů a erytrocytů. RelB je převážně exprimován v dendritických buňkách (DC) a lymfocytech, p52 je exprimován v epitelu žaludku, v dendritických buňkách, makrofázích a lymfocytech. Převzato z Bottero V., Withoff S. a Verma I.M. 2006. NFκB and the regulation of hematopoiesis. Cell Death and Differentiation 13;785-797.
17
2. Materiál a metody
2. Materiál a metody 2.1. Materiál 2.1.1. Buněčné linie Eukaryotické: BM2 (Moscovici et al., 1982) – buněčná suspenzní linie, kuřecí monoblasty transformované virem AMV MCF-7 (Brooks et al., 1973) – buněčná adherentní linie, epiteliální buňky adenokarcinomu mléčné žlázy Prokaryotické: Escherichia coli DH5α
2.1.2. Růstová média Médium pro kultivaci buněk BM2: DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium, Sigma) obohacené o: fetální telecí sérum (5%, Gibco BRL) kuřecí sérum (5%, Sigma) inaktivované teplotou 56°C po dobu 1 h glukóza (4,5 g/l, Sigma) 1 x MEM - neesenciální aminokyseliny (Sigma) L-glutamin (2 mM, Sigma) pyruvát sodný (1 mM, Sigma) streptomycin (100 µg/ml, Sigma) a penicilin (100 U/ml, Sigma) Médium pro kultivaci buněk MCF-7: RPMI 1640 médium (Sigma) obohacené o: fetální telecí sérum (10%, Sigma) L-glutamin (2 mM, Sigma) streptomycin (100 µg/ml, Sigma) penicilin (100 U/ml, Sigma) LB médium pro kultivaci bakterií: trypton (10 g/l) kvasinkový extrakt (5 g/l) NaCl (10 g/l) 18
2. Materiál a metody doplněno vodou do celkového objemu 1 l
2.1.3. Chemikálie a roztoky 1 x PBS (Phosphate Buffered Saline): NaCl…………...8,0 g KCl…………….0,2 g KH2PO4………..0,2 g Na2HPO4………2,31 g doplněno do 100 ml vodou; pH 7,4
2.1.4. Diferenciační činidla Trichostatin A (TSA; Sigma) ředěno 100x v metanolu. Výsledná koncentrace pro navození diferenciace je 12 ng/ml Forbolový ester (TPA; Sigma) ředěno v dimetylsulfoxidu (DMSO) (0,1 mg/ml). Výsledná koncentrace pro navození diferenciace je 250 ng/ml
Další použité chemikálie a roztoky jsou uvedeny u jednotlivých metod.
2.1.5. Použité plazmidy pNFκB-Luc (Stratagene) pSVNeo (dar prof. Lipsicka) pNEBR-X1 (New England BioLabs, Inc.) pNEBR-R1 (New England BioLabs, Inc.) pCMV4-IκB∆n (dar prof. Ballarda) pCMV4 (Invitrogen)
2.1.6. Použité přístroje Inverzní mikroskop Nikon Diaphot 300 (zvětšení 10x10; 10x40) Inverzní mikroskop Nikon TMS (zvětšení10x10; 10x20) Fotoaparát Olympus C4000 Fotoaparát Canon PowerShot A95 Luminometr Turner TD-20e Luminometer 19
2. Materiál a metody Spektrofotometr PharmaciaBiotech Ultrospec 2000 Nanodrop 1000 Spectrophotometer Termocykler Peltier Thermal Cycler PTC-200 (MJ Research) Termocykler pro Real-Time PCR 7500 Real Time PCR system (Applied Biosystems)
2.1.7. Použitý software Primer Express® (Applied Biosystems) Statistica (Statsoft) 7500 Real Time PCR system (Applied Biosystems) Canon PowerShot A95
2.2. Metody 2.2.1. Transformace bakteriálních buněk Transformační pufr: PIPES (piperazin-1,2-bis[2-etansulfonová kyselina], 10 mM) CaCl2 x 2 H2O (15 mM) KCl (250 mM) přidat 950 ml destilované vody pH 6.7, vyrovnat pomocí KOH přidat MnCl2 x 4 H20 (10,9 g) doplnit vodou do objemu 1000 ml, sterilizovat
SOB: Bacto Tryptone (5 g) Bacto Yeast Extract (1,25 g) 5M NaCl (0,5 ml) 2M KCl (0,3215 ml) doplnit vodou do 245 ml přidat 1M MgSO4 x 7 H2O (2,5 ml) přidat 1M MgCl2 x 6 H2O (2,5 ml) sterilizovat
20
2. Materiál a metody SOC: k 250 ml SOB média přidat 2M glukózu (2,5 ml, sterilní)
Postup: 1.
Bakterie rozmrazit na ledu.
2.
Alikvotovat bakterie do předchlazených zkumavek.
3.
Přidat DNA – max 50 ng v konečném objemu 5 µl. Jako kontrolu použijeme vzorek s přidaným stejným objemovým množstvím TE pufru.
4.
Inkubovat na ledu 30 min.
5.
Zahřát v termobloku 42 °C po dobu 1 min.
6.
Zchladit na ledu po dobu 2 min.
7.
Zahřát po dobu 10 min při teplotě 37°C.
8.
Přidat 500 µl SOC média.
9.
Bakterie inkubovat při 37°C po dobu 20 min
10.
Stočit 5000 rpm po dobu 1 min, odstranit 500 µl supernatantu, rozsuspendovat pelet ve zbylém objemu.
11.
Suspenzi vyset na agarové misky s antibiotikem (ampicilin 50µg/ml).
12.
Inkubovat přes noc při 37°C.
2.2.2. Izolace plazmidové DNA s použitím kolon Qiagen (Maxiprep) Chemikálie a roztoky: P1: RNázaA (100 µg) TrisCl (50 mM, pH 8.0) EDTA (10 mM) P2: NaOH (200 mM) SDS (1%) P3: K-acetát (3 M, pH 5.5) QBT: NaCl (750 mM) MOPS (50 mM, pH 7.0) 21
2. Materiál a metody etanol (15%) Triton X-100 (0,15%) QC: NaCl (1 M) MOPS (50 nM, pH 7.0) etanol (15%) QF: NaCl (1,25 M) TriCl (50 mM, pH 8.5) etanol (15%)
Pracovní postup: 1.
Inokulovat 1 kolonii v 1-2 ml LB obsahující ampicilin (50 µg/ml) a kultivovat na třepačce při 37°C po dobu 8 hodin.
2.
Po dosažení přiměřené hustoty inokulovat touto kulturou 500 ml LB/Amp.
3.
Kultivovat na třepačce přes noc při 37°C.
4.
Centrifugovat 5000 rpm, 10 min, při 22°C.
5.
Odstranit supernatant.
6.
Rozsuspendovat pelet v 10 ml pufru P1 obsahujícím RNázu A (100 µg/ml).
7.
Přenést do 50 ml zkumavky a přidat 10 ml pufru P2, jemně promíchat převrácením, nechat stát 5 min při pokojové teplotě.
8.
Přidat 10 ml předchlazeného pufru P3, promíchat, za občasného převrácení zkumavky nechat na ledu 20-30 minut, dokud se jasně neoddělí vysrážené komplexy DNA a proteinů od čirého roztoku obsahujícího plazmidovou DNA.
9.
Centrifugovat 10000 rpm při 4°C po dobu 30min.
10.
Před skončením centrifugace ekvilibrovat kolonu 10 ml pufru QBT.
11.
Po centrifugaci a odkapání QBT pufru nanést supernatant na kolonu.
12.
Po vykapání promýt kolonu 2 x 20 ml pufru QC.
13.
Přenést kolonu do čisté zkumavky a eluovat plazmid přidáním 15 ml pufru QF.
14.
K eluované DNA přidat 10,5 ml izopropanolu a promíchat.
15.
Centrifugovat 10000 rpm při 4°C po dobu 30min.
16.
Slít supernatant, sraženou DNA promýt 5 ml 70% etanolu, nechat vysušit 5-10 min a rozpustit DNA v 500 µl pufru TE o pH 8.0.
17.
Po úplném rozpuštění změřit koncentraci DNA na spektrofotometru. 22
2. Materiál a metody
2.2.3. Izolace plazmidové DNA s použitím kolon Qiagen (Miniprep) Chemikálie a roztoky: Jsou dodávány jako součást QIAprep Spin Miniprep Kitu (Qiagen) a jejich přesné složení není známo.
Postup: 1.
Inokulovat 1 kolonii v 1-2 ml LB média obsahujícím ampicilin (50µg/ml) a kultivovat na třepačce 12 - 16 hodin v 37°C.
2.
Centrifugovat 5000 rpm po dobu 10 min při 4°C.
3.
Rozsuspendovat pelet v 250 µl pufru P1 a přenést do mikrozkumavky.
4.
Přidat 250 µl pufru P2 a promíchat několikanásobným (4-6krát) převrácením.
5.
Přidat 350 µl pufru N3 a ihned promíchat několikanásobným (4-6krát) převrácením.
6.
Centrifugovat při 14000 rpm 10 min.
7.
Přenést supernatant na kolonku.
8.
Centrifugovat při 14000 rpm 30-60 s. Odstranit supernatant.
9.
Promýt kolonku přidáním 500 µl pufru PB a centrifugovat 14000 rpm 30 – 60 s. Odstranit supernatant.
10.
Promýt kolonku přidáním 750 µl pufru PE a centrifugovat 14000 rpm 30 – 60 s.
11.
Odstranit supenatant a ještě jednou centrifugovat 14000 rpm po dobu 1 min.
12.
Umístit kolonku do čisté mikrozkumavky. Nakapat do středu kolony 50 µl pufru EB (10 mM Tris-Cl, pH 8.5), nechat 1 min odstát a poté centrifugovat 14000 rpm 1 min.
13.
Změřit koncentraci DNA na spektrofotometru.
2.2.4. Transaktivační testy Sklízení buněk
Postup: 1.
Odsát médium z misek (v případě suspenzních buněk přenést médium s buňkami do 15ml zkumavky a centrifugovat 1500 rpm 5 min). Promýt buňky 2 ml 1xPBS.
2.
Odsát PBS. Seškrabat buňky v 500 µl 1xPBS a přenést suspenzi do Eppendorfovy zkumavky. 23
2. Materiál a metody 3.
Centrifugovat buňky 1500 rpm po dobu 5 min při pokojové teplotě.
4.
Odsát supernatant, pelet rozsuspendovat v 100 µl 0,25M Tris pH 7,5.
5.
Lyzovat buňky 3 cykly prudkého zamražení/rozmražení v izopropanolové lázni, na suchém ledu či v mrazícím boxu -84ºC.
6.
Po posledním rozmražení extrakty centrifugovat 5 min na maximální výkon.
7.
Přenést supernatant do nové Eppendorfovy zkumavky a uchovat na ledu nebo v -84°C.
ß-gal assay z extraktů přechodně transfekovaných buněk
Chemikálie a roztoky: 100x Mg: 0,1 M MgCl2 4,5 M ß-merkaptoetanol 1x ONPG: 4 mg/ml ONPG (Sigma) rozpuštěno v 0,1 M sodium fosfátu, pH 7.5 0,1 M sodium fosfát mix: 41 ml 0,2 M Na2HPO4.2H2O 9 ml 0,2 M NaH2PO4.2H2O 50 ml H2O Postup: 1.
Připravit ß-gal master mix tak, aby na každý vzorek připadala směs: 4 µl Mg solution 100x 88 µl ONPG 1x 268 µl sodium fosfátu pH 7,5
2.
Odebrat 40 µl buněčného extraktu pro každý vzorek.
3.
Ke každému vzorku na ledu přidat 360 µl ß-gal master mix.
4.
Inkubovat v 37°C, dokud se neobjeví žlutavé zabarvení.
5.
Pokud je většina vzorků v optimálním zabarvení, zastavit reakci přidáním 667 µl 1M Na2CO3.
6.
Měřit optickou densitu při 420 nm. Lineární rozsah je 0,2-0,8.
7.
Pokud je některý ze vzorků mimo interval linearity, je třeba zopakovat měření pro všechny vzorky s příslušnou úpravou koeficientu ředění extraktů. Minimální objem tolerovaný při ředění extraktu je 1 µl. 24
2. Materiál a metody 8.
Podle vzorce OD x ředění / 40 určit pro každý vzorek počet ß-gal jednotek na 1 µl.
Luciferázová assay z extraktů přechodně transferovaných buněk
Chemikálie a roztoky:
Luciferin stock solution: D-luciferin (1 mM, Sigma) glycylglycin (25 mM, pH 7.8, Sigma) Alikvotovat po 1 ml ve světlotěsných Eppendorfových zkumavkách, uchovat v – 70°C
Luciferase assay buffer: glycylglycin (25 mM, pH 7.8, Sigma) K fosfát (15 mM) MgSO4 (15 mM) EGTA (4 mM) ATP (2 mM) DTT (1 mM)
Postup: 1.
10 µl lyzátu přenést do 90 µl 0,25M Tris pH 7.5.
2.
Přidat 360 µl luciferase assay buffer, přenést do luminometrické kyvety a vortexovat.
3.
Přenést do komůrky luminometru, přidat 200 µl pracovního roztoku luciferinu (luciferin stock solution ředěný 5x vodou, doplněno DTT do konečné koncentrace 2mM) a zaznamenat údaj o absolutní luciferázové aktivitě na luminometru.
4.
Relativní luciferázovou aktivitu každého vzorku stanovit jako podíl absolutní luciferázové aktivity a ß-gal aktivity na 1 µl extraktu.
2.2.5. Přechodná transfekce buněk MCF-7 Transfekční činidla: Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent (Invitrogen) Medium: Opti-MEM (Gibco) 25
2. Materiál a metody RPMI kultivační médium pro buňky MCF-7 Transfekční směs: 100 ml Opti-MEM 2 µg celkové DNA (0,5 µg pβgal + 0,5 µg pNFκBluc + 1 µg pCMV4-IκB∆n resp. pCDNA4) 4 µl Lipofectamine™ 2000
Postup: 1.
Připravit buněčnou suspenzi o hustotě 5x105 buněk/5 ml média pro kultivaci BM2.
2.
Přikapat transfekční směs k buněčné suspenzi.
3.
Inkubovat cca 24 hod při 37ºC v 10% CO2.
4.
Druhý den vyměnit médium.
5.
Provést selekci přidáním antibiotika G418 (konečná koncentrace 400 µg/ml).
2.2.6. Zamražování buněk BM2 Zamražovací roztok: DMSO (0,2 ml) FCS (1,8 ml)
Postup: 1.
Centrifugovat 10 ml čerstvé rostoucí kultury 1500 rpm 5 min.
2.
Během centrifugace připravit vychlazený zamražovací roztok.
3.
Pelet resuspendovat ve 2 ml připraveného zamražovacího roztoku.
4.
Suspenzi rozdělit po 1 ml do označených zamražovacích zkumavek a 20 min nechat inkubovat v ledové lázni.
5.
Zkumavky inkubovat přes noc v -70°C.
6.
Zamražené kultury uchovávat v tekutém dusíku.
2.2.7. Cytocentrifugace Roztoky: Fixační a barvící roztoky jsou součástí soupravy Diff-Quik (Dade Behring, Newark, USA)
26
2. Materiál a metody Postup: 1.
Buňky kultivovat za přítomnosti induktorů diferenciace za dané koncentrace, 1x105 buněk převést do zkumavky, promýt v 1xPBS a resuspendovat ve 100 µl 1xPBS.
2.
Přenést vzorky do kyvet v centrifugační aparatuře a centrifugovat 4 min 500g.
3.
Vzorky na sklíčkách nechat krátce oschnout, poté zafixovat ponořením sklíčka do fixačního roztoku (metanol) na 1 vteřinu, opakovat 5x.
4.
Obarvit jádra ponořením sklíčka do eosinu na 1 vteřinu, opakovat 5x.
5.
Obarvit cytoplazmu ponořením sklíčka do thiazinu na 1 vteřinu, opakovat 5x.
6.
Přebytek barviva na sklíčku opatrně opláchnout vodou a vzorky nechat oschnout.
7.
Morfologii buněk analyzovat mikroskopicky.
2.2.8. Gelová elektroforéza nukleových kyselin Příprava 1% agarózového gelu
Chemikálie a roztoky: TRIS-acetátový pufr (TAE): 0,04 M Tris-acetát 0,002 M EDTA pH 8,2 Postup: 1.
Do 100 ml TAE přidat 1 g agarózy.
2.
Rozvařit v mikrovlnné troubě.
3.
Roztok zchladit na 50˚C, přidat 6 µl ethidiumbromidu a nalít do plastikové vany s hřebínkem.
4.
Nechat gel ztuhnout přibližně 30 min.
5.
Po utuhnutí agarózy přenést gel do elektroforetické vany, opatrně vytáhnout hřebínek a převrstvit gel TAE pufrem.
Nanesení vzorku do agarózového gelu a provedení elektroforézy
Chemikálie a roztoky: Marker: standard molekulových hmotností - 1kb DNA Ladder (Invitrogen) Nanášecí pufr: 10x Loading Buffer (Takara) 27
2. Materiál a metody
Postup: 1.
10 µl vzorku DNA o koncentraci 50 – 100 ng/µl smíchat na proužku parafilmu s 1 µl nanášecího pufru a přenést do jamky v gelu.
2.
Nastavit hodnoty napětí, popř. proudu a nechat probíhat elektroforézu tak dlouho, dokud barvivo neurazí vzdálenost alespoň 1/2 délky gelu.
3.
Gel vyhodnocovat pod UV světlem o vlnové délce 302 nm.
2.2.9. Izolace celkové RNA Chemikálie a roztoky: Pro izolaci RNA byly použity roztoky, které jsou součástí GenElute™Mammalian Total RNA Miniprep Kit (Sigma)
Postup: Pro tuto metodu byl použit GenElute™Mammalian Total RNA Miniprep Kit (Sigma) 1.
Suspenzní buňky přenést do 15 ml zkumavky, centrifugovat 1500 rpm 5 min, opatrně odsát supernatant, promýt buňky rozsuspendováním v 1 ml 1xPBS, znovu centrifugovat 1500 rpm 5 min a opět opatrně odstranit supernatant. Přisedlé buňky po odsátí média a po promytí 1 ml 1xPBS uvolnit z kultivační misky mechanicky či přidáním 2 ml EDTA v 1xPBS. Přenést do 15 ml zkumavky, centrifugovat 1500 rpm po dobu 5 min a opatrně odstranit supernatant.
2.
Připravit si lyzační roztok (na 1 ml Lysis solution přidat 10 µl 2-merkaptoetanolu).
3.
Pelet lyzovat přidáním 350-500 µl lyzačního roztoku (takto připravený lyzát je možno uchovat v -84˚C pro pozdější izolaci i několik měsíců).
4.
Přenést lyzát na kolonku s modrým proužkem, centrifugovat 16000 rpm 2 min.
5.
K supernatantu přidat stejný objem 70% etanolu, jemně promíchat.
6.
Supernatant s přidaným etanolem přenést na kolonku s červeným proužkem, centrifugovat 16000 rpm 30 sek.
7.
Odstranit tekutinu, která protekla do spodní části zkumavky s kolonkou. Kolonku promýt 500 µl Wash solution I, centrifugovat 16000 rpm 30 sek.
8.
Odstranit tekutinu ze spodní části zkumavky, promýt kolonku 500 µl Wash solution II, centrifugovat 16000 rpm 30 sek.
28
2. Materiál a metody 9.
Odstranit tekutinu ze spodní části zkumavky, promýt kolonku 500 µl Wash solution II, centrifugovat 16000 rpm po dobu 2 min pro úplné vysušení kolonky.
10.
Kolonku přenést do nové zkumavky a centrifugovat 16000 rpm 30 sek.
11.
Kolonku přenést do nové zkumavky a RNA eluovat z kolonky přidáním 50-60 µl Elute solution, centrifugovat 16000 rpm po dobu 1 min.
12.
Izolovanou RNA uchovávat na ledu pro změření čistoty a koncentrace.
13.
Změřit čistotu a koncentraci eluované RNA spektrofotometricky při 280/260 a 230/260 nm.
14.
RNA je možné uchovávat v -84˚C po dobu několika měsíců.
Po celou dobu izolace je nutné pracovat sterilně, pracovní plochu flow-boxu očistit od RNáz.
2.2.10. Reverzní transkripce (převod RNA do cDNA) Chemikálie a roztoky: Používané roztoky jsou z Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kitu (Applied Biosystems)
Master mix (pro 20 µl reakci): 5x RT pufr (4 µl) dNTP Mix (2 µl) 10x RT náhodné oligonukleotidy (1 µl) reverzní transkriptáza (0,5 µl) inhibitor RNáz (0,5 µl) RNA vzorek Doplnit vodou bez RNáz do celkového objemu 20 µl.
Postup: 1. Připravit směs primerů, vody a vzorku RNA (celkový objem 13 µl). 2. Zahřát na 65˚C 10min. 3. Přidat mastermix složený z dNTP směsi, RT polymerázy, inhibitoru RNáz a reakčního pufru. 4. Umístit na led a opatrně promíchat. 5. Rozpipetovat po 7 µl master mixu do zkumavek. 29
2. Materiál a metody 6. Krátce zcentrifugovat při malých otáčkách pro odstranění vzduchových bublin. 7. Umístit zkumavky do termocykleru. 8. Nastavení termocykleru: I. 55˚C/30 min. II. 85˚C/10 min. III. 4˚C/∞ 9. Připravit směs, kde bude reverzní transkriptáza nahrazena vodou, jako kontrola nepřítomnosti genomové DNA.
2.2.11. Real-Time PCR A) Optimalizace primerů Chemikálie a roztoky: Power SYBR®Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)
Postup: 1.
Podle tabulky 3 připravit směsi reagentů do 96-jamkové destičky.
2.
Destičku vložit do termocykleru a po skončení reakce vyhodnotit, ve které jamce došlo k největší amplifikaci.
3.
Takto optimalizujeme účinnost primerů, stanovíme optimální koncentraci primerů a poměr jednotlivých složek pro reakce Real-Time PCR.
Jamky
A1 - A4 A5 - A8 A9 - A12 B1 - B4 B5 - B8 B9 - B12 C1 - C4 C5 - C8 C9 - C12 D1 - D4 D5 - D8 D9 - D12 E1 - E4
PCR Master Mix (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
5 µM Fwd primer (µl) 0,5 0,5 0,5 3,0 3,0 3,0 9,0 9,0 9,0 0,5 0,5 0,5 3,0
5 µM Rew primer (µl) 0,5 3,0 9,0 0,5 3,0 9,0 0,5 3,0 9,0 0,5 3,0 9,0 0,5
Templát (10 ng/µl) (µl)
Deionizovaná voda (µl)
Celkem (µl)
5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 0,0 0,0 0,0 0,0
19,0 16,5 10,5 16,5 14,0 8,0 10,5 8,0 2,0 24,0 21,5 12,5 21,5
50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
30
2. Materiál a metody E5 - E8 E9 - E12 F1 - F4 F5 - F8 F9 - F12
25 25 25 25 25
3,0 3,0 9,0 9,0 9,0
3,0 9,0 0,5 3,0 9,0
0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
19,0 13,0 15,5 13,0 7,0
50 50 50 50 50
Tab. 3 Nastavení optimalizace primerů pro dvoukrokovou Real-Time PCR
B) Optimalizace množství cDNA vkládané do reakce Pro každý pár primerů připravit reakci s: 500 ng, 50 ng, 5 ng, 500 pg, 50 pg a 5 pg a po skončení reakce stanovit optimální množství cDNA.
C) Real-time PCR Chemikálie a roztoky: Power SYBR®Green PCR Master Mix (Applied Biosystms)
Postup: Pro real-time PCR reakce používáme koncentrace primerů a cDNA stanovené předešlými reakcemi. Exprese podjednotek NFκB normalizovat vůči endogenní kontrole glyceraldehydfosfát dehydrogenáze (GAPDH). 1.
K 83 ng vzorku cDNA přidat optimální koncentraci primerů a 12,5 µl Power SYBR®Green PCR Master Mixu. Doplnit do 25 ml deionizovanou vodou. Pro každý vzorek připravit minimálně 3 paralelní reakce.
2.
Současně připravit reakce s endogenní kontrolou, tedy s primery pro GAPDH, opět ve třech opakováních.
3.
Jako negativní kontroly použít pro každý pár primeru (i GAPDH) směs, kde: a) objem cDNA je nahrazen stejným objemem vody b) objem cDNA je nahrazen stejným objemem izolované celkové RNA.
4.
Odstranit vzduchové bubliny centrifugací.
5.
96-jamkovou destičku vložit do termocykleru a po skončení reakce vyhodnotit.
2.2.12. Restrikční štěpení plazmidové DNA a příprava inducibilního expresního vektoru
31
2. Materiál a metody Jako expresní vektor jsme používali pNEBR-X1 RheoSwitch Mammalian Inducible Expression System od New England BioLabs, Inc.
1.
Nejprve štěpit vektor pNEBR-X1 restrikčním enzymem EcoRV a současně vyštěpit IκB∆n z plazmidu pCMV4 restrikčním enzymem SmaI podle následující tabulky (Tab. 4): 10x pufr č. 10x BSA (µl) enzym - (µl)
DNA (µl)
voda
- (µl) X1 neštěp.
pufr 3- 2
2
0
1,5
14,5
X1 EcoRV
pufr 3- 2
2
EcoRV - 1
1,5
13,5
IκB∆n neštěp.
pufr 4 - 2
2
0
3
15
IκB∆n SmaI
pufr 4 - 2
2
SmaI - 3
3
12
Tab. 4 2.
Množství DNA vkládané do restrikčních reakcí jsou 4 µg.
3.
Restrikční reakci nechat probíhat 1 hod, enzym EcoRV štěpí při 37ºC a enzym SmaI při 25ºC.
4.
Z každé reakční směsi (celkový objem je 20 µl) odebrat 5 µl, na proužku parafilmu je smíchat s 0,5 µl nanášecího pufru a takto připravené vzorky nanést na 1% agarózový gel. Současně nanést 5 µl 1kB DNA ladder. Tímto krokem je nutné ověřit produkty restrikční reakce.
5.
Ke zbylým 15 µl s naštěpenými produkty přidat 1,5 µl 3M sodium acetátu a 50 µl 96% etanolu, čímž vysrážíme DNA.
6.
Centrifugovat 30 min při 4ºC 16000 rpm.
7.
Opatrně odsát supernatant a ke každému vzorku přidat 700 µl 70% etanolu, centrifugovat 10 min při pokojové teplotě a 16000 rpm.
8.
Odsát opatrně supernatant, nechat DNA dokonale vyschnout a pak ke každému vzorku přidat 20 µl 10 mM TrisCl a nechat rozputit.
9.
Připravit další restrikční reakci podle následující tabulky (celkový reakční objem je 20 µl) (Tab. 5):
32
2. Materiál a metody Pufr č.2 (µl) Enzym HindIII (µl)
Voda (µl)
Restrikční směs (µl)
X1EcoRV + HindIII
2
1
2
15
IκB∆nSmaI + HindIII
2
1
2
15
IκB∆nSmaI
2
0
2
16
Tab. 5
10. Nechat reakci běžet 1 hod při teplotě 37ºC. 11.
Po skončení reakce nanést 5 µl směsi X1EcoRV+HindIII a IκB∆nSmaI s 0,5 µl nanášecího pufru a 20 µl směsi IκB∆nSmaI+HindIII s 2 µl nanášecího pufru na 1% agarózový gel a ověřit správnost štěpení.
12.
Z gelu eluovat vyštěpený fragment IκB∆n, poté ověřit na 1% agarózovém gelu.
Ligace naštěpeného vektoru pNEBR-X1 a vyštěpeného inzertu Iκ κB∆ ∆n 1. Připravit ligační směs podle následující tabulky (1 díl vektoru=2 µl; 1 díl inzertu=1 µl, celkový reakční objem je 10 µl) (Tab. 6), před přidáním pufru a ligázy zahřát směsi inzertu, vektoru a vody na 45ºC po dobu 5 min. Po té zchladit 2 min na ledu a následně přidat zbývající dvě složky reakční ligační směsi.
vektor (µl) inzert (µl)
pufr (µl)
ligáza (µl)
voda (µl)
vektor bez inzertu
2
0
1
0,5
6,5
2 vektor : 1 inzert
4
1
1
0,5
3,5
1 vektor : 1 inzert
2
1
1
0,5
5,5
1 vektor : 2 inzert
2
2
1
0,5
4,5
Tab. 6
2.
Ligační reakci nechat běžet 18 hod při 16ºC.
3.
Polovinou ligační směsi transformovat kompetentní buňky DH5α, rozetřít na agarové misky s ampicilinem (50 µg/ml).
4.
Otestovat jednotlivé kolonie, izolovat z nich plazmidovou DNA (miniprep), štěpit podle následující tabulky (celkový reakční objem 20 µl) (Tab. 7):
33
2. Materiál a metody pufr 2 BSA pNEBR (µl)
10x
X1
vzorek
HindIII
miniprep (µl)
XhoI
voda (µl)
(µl)
(µl) X1 XhoI
2
2
0,5
0
0
0,5
15
X1 HindIII
2
2
0,5
0
0,5
0
15
X1 XhoI+HindIII
2
2
0,5
0
0,5
0,5
14,5
Vzorek z miniprepu
2
2
0
10
0,5
0,5
5
Tab. 7
5.
Reakci nechat probíhat 1 hod při teplotě 37ºC.
6.
Produkty restrikční reakce ověřit na 1% agarózovém gelu.
7.
Pozitivní kolonii rozpěstovat v 500 ml LB média s ampicilinem (50 µg/µl) a izolovat plazmidovou DNA (maxiprep).
34
3. Výsledky
3. Výsledky 3.1. Navození diferenciace u buněk BM2 působením trichostatinu A a forbol esteru TPA Buňky BM2 jsou neadherentní kulovité monoblasty, které aktivně proliferují v nediferencovaném stavu. Konstitutivně exprimují onkogen v-myb, který zabraňuje dokončení monocytické/makrofágové diferenciační dráhy. Diferenciaci lze navodit přidáním inhibitoru histonových deacetyláz trichostatinu A (TSA) nebo forbolového esteru (TPA). Po aplikaci těchto diferenciačních činidel zastavují buňky růst a diferencují v adherentní makrofágy. Pro indukci diferenciace jsme použili trichostatin A v koncentraci 12 ng/ml a morfologii živých buněk jsme sledovali v časových intervalech 0, 1, 2, 3 a 4 dny. Působením TSA přisedají během prvních dvou dnů na povrch kultivační misky, protahují svůj tvar a po třetím dnu od podání induktoru diferenciace fúzují a vytvářejí mnohojaderné adherentní makrofágy (Obr. 6). Forbolový ester jsme používali v koncentraci 250 ng/ml a morfologii buněk zaznamenávali v časových intervalech 0, 6, 12, 18 a 24 hod od podání diferenciačního činidla (Obr. 7). Po prvních 6 hod od podání diferenciačního činidla většina buněk přisedá na povrch kultivační misky a mírně mění svůj tvar. Po 24h působení TPA jsou BM2 přeměněné v adherentní jednojaderné makrofágy. Morfologické změny spojené s diferenciací buněk BM2 vyvolanou TPA a TSA jsme analyzovali rovněž světelnou mikroskopií po jejich cytocentrifugaci, fixaci a obarvení (Obr. 8). Potvrdili jsme tak vznik jednojaderných makrofágů po působení TPA a mnohojaderných makrofágů po aplikaci TSA. Pro potvrzení vlivu diferenciačních činidel na proliferaci BM2 buněk, jsme stanovovali počet živých buněk v časových úsecích 1, 2, 3, a 4 dny (TSA) a 6, 12, 18 a 24 hod (TPA) při počáteční hustotě 50.000 buněk/ml. Současně jsme v těchto časových intervalech stanovili i počet buněk u neovlivněných kontrol (Obr. 9).
35
3. Výsledky
TSA
Obr. 6 Morfologie buněk BM2 ovlivněných působením TSA v koncentraci 12 ng/ml. Čísla v levém dolním rohu udávají počet dnů působení TSA. Počáteční hustota buněk byla 200.000 buněk/ml. Fotografie byly pořízeny při stejném zvětšení.
36
3. Výsledky
TPA
Obr. 7 Morfologie buněk BM2 ovlivněných působením TPA v koncentraci 250 ng/ml. Čísla v levém dolním rohu udávají počet hodin působení TPA. Počáteční hustota buněk byla 200.000 buněk/ml. Fotografie byly pořízeny při stejném zvětšení.
37
3. Výsledky
Obr. 8 Morfologie neovlivněných buněk BM2, buněk BM2 ovlivněných TPA (250 ng/ml, 24 hod) a TSA (12 ng/ml, 4 dny). Neovlivněné BM2 a buňky po působení TPA jsme cytocentrifugovali, fixovali a obarvili soupravou Diff-Quik. Buňky po působení TSA jsme fixovali a barvili na kultivační misce. Po fixaci a obarvení jsme buňky sledovali optickou mikroskopií při stejném zvětšení. Jádra buněk jsou zbarvená modře a cytoplazma červeně.
TPA 140
počet buněk x 10
-4
120 100 80 neovlivněné TPA
60 40 20 0 čas (hod): 0
6
12
18
24
TSA 800
počet buněk x 10
-4
700 600 500 400
neovlivněné TSA
300 200 100 0 -100 čas (dny):0
1
2
38
3
4
3. Výsledky Obr.9. Proliferace buněk BM2, BM2 ovlivněných TPA (250 ng/ml) a TSA (12 ng/ml.) Počáteční hustota buněk byla 5x104/ml. Graf znázorňuje průměrné hodnoty ze 3 nezávislých experimentů a chybové úsečky ukazují směrodatné odchylky.
Většina buněk začíná diferencovat již 6hod po aplikaci TPA a zároveň se zastavuje dělení buněk a jejich počet dále významně nevzrůstá ve srovnání s neovlivněnými buňkami. Po aplikaci TSA buňky adherují během prvních 24 hodin, mění svůj tvar, zastavují dělení a zároveň některé umírají a proto se jejich počet nepatrně snižuje. Další snížení počtu buněk ovlivněných TSA je zřejmě důsledkem jejich fúze a vzniku mnohojaderných makrofágů. Rozdíl mezi buňkami ovlivněnými TPA a buňkami neovlivněnými je statisticky významný (P<0,0005). Na stejné hladině významnosti jsme zaznamenali rozdíl mezi TSA a neovlivněnými buňkami.
3.2. Expresní profil trankripčního faktoru NFκ κB v průběhu diferenciace Ke stanovení kinetiky exprese pěti podjednotek transkripčního faktoru NFκB jsme použili metodu kvantitativní PCR v reálném čase, která umožňuje měřit množství nukleových kyselin během každého amplifikačního cyklu. Cílem měření může být DNA, cDNA nebo RNA. Změny exprese genů kódujících podjednotky NFκB jsme studovali na úrovni RNA. Používali jsme Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System, software dodávaný s přístrojem a komerční kit Syber®Green Master Mix. Primery jsme navrhli v programu Primer Express®, následně je validovali a optimalizovali pro reakci. V každé reakci jsme použili dvě negativní kontroly pro ověření kvality amplifikace, v jedné byl objem cDNA nahrazen stejným objemem vody a ve druhé jsme použili izolovanou celkovou RNA o stejném objemu. V každé reakci jsme pomocí disociačních křivek u každého páru primerů ověřili specifitu amplifikace. Exprese podjednotek NFκB jsme normalizovali vůči endogenní kontrole glyceraldehydfosfát dehydrogenáze (GAPDH). GAPDH patří mezi tzv. provozní geny, jejichž exprese se během diferenciace buněk nemění.
3.2.1. Optimalizace metody kvantitativní PCR v reálném čase (qRT-PCR)
A)
navržení primerů
39
3. Výsledky Primery pro 5 podjednotek NFκB jsme navrhli v programu Primer Express® (Applied Biosystems). Při navrhování primerů jsme požadovali délku amplikonu mezi 50 a 150 bázemi, teplotu tání (Tm) mezi 58 a 60ºC, ideální délka primeru by se měla pohybovat okolo 20 bazí a %GC mezi 30 a 80%. V tabulce uvádíme přehled navržených, ověřených a používaných primerů (Tab. 8). Fwd Seq podjednotka Fwd délka Fwd Tm Produkt délka Produkt Tm 90 p50 20 59 80 GGTGACCGCCAATAGCTTGT 140 p52 25 58 84 AACCTCAGCTTTCCTTACTCATCTG 65 c-Rel 23 59 78 CCCTTTAATGTGCCTGAAGAACA 81 RelB 20 59 85 GAGGCCAAAAGGAGGAAACC 84 p65 22 58 82 GTGTGTGAAGAAACGGGAACTG podjednotka Rev délka Rev Tm Produkt délka Produkt Tm Rev Seq p50 20 59 90 80 GCCGTTCGTCCAGATTTTTG p52 22 59 140 84 GGAGCCTGTCTGTCATCTCCAT c-Rel 20 59 65 78 AGGCGGACAACGTTGAGATC RelB 20 59 81 85 TAGGGCGAAGGCTTCATCTG p65 20 58 84 82 TCCTCCATTGGCACATTGAA Tab. 8 Přehled navržených a používaných párů primerů pro podjednotky trankripčního faktoru NFκB s využitím programu Primer Express® (Applied Biosystems).
B)
ověření účinnosti primerů
Navržené primery a jejich účinnost jsme ověřili PCR a následnou separací produktů PCR elektroforézou v 3% agarózovém gelu. V reakci jsme použili cDNA z neovlivněných buněk BM2 v množství 250 ng/reakci a od každého jednotlivého primeru (koncentrace 20 µM) jsme použili 2,5 µl. Do jamek gelu jsme nanášeli vždy po 10 µl jednotlivých vzorků a 5 µl standardu molekulových hmotností (1kB ladder). Produkty PCR byly patrné po použití všech testovaných párů primerů (Obr. 10).
Obr. 10 Elektroforetogram 3% agarózového gelu s produkty PCR amplifikovanými pomocí jednotlivých párů primerů po obarvení ethidiumbromidem a zviditelnění UV světlem. Pro pokus jsme použili cDNA z neovlivněných buněk BM2. Jako negativní kontrola (NTC) byla u každého páru primerů provedena reakce za nepřítomnosti cDNA, kde bylo její objemové množství nahrazeno vodou.
40
3. Výsledky C)
validace primerů metodou standardních křivek Primery jsme validovali metodou standardních křivek, tj. křivek závislosti CT na
logaritmu hmotnosti cDNA vložené do reakce (Obr. 11). CT („cycle treshold“) je číslo cyklu, při kterým dojde k významnému nárůstu fluorescenčního signálu. Ze směrnic kalibračních přímek lze vypočítat (podle vzorců 1 a 2) účinnost amplifikace pro každý jednotlivý gen (Tab. 9). Výsledky kalibrace dále používáme při vyhodnocování každé qRT-PCR reakce (Pfaffl, 2001).
vzorec 1
vzorec 2
E udavá účinnost, s jakou dochází k amplifikaci v průběhu reakce (ideálně 2). Lze jej vypočítat z kalibračních křivek podle vzorce č. 2. K je směrnice kalibrační přímky (ideálně -3,3). primery pro:
E
p50
1,91
p52
1,98
c-Rel
2,05
RelB
2,00
p65
2,05
Tab. 9 Výsledky kalibrace primerů a určení účinnosti amplifikace (E) pro pět párů primerů NFκB podjednotek.
kalibrační křivky 40,00
p50 35,00
p52 CT
30,00
cRel 25,00
RelB
20,00
p65
15,00 -3
-2
-1
0 log C
1
2
3
Obr. 11 Kalibrační křivky pro pět párů primerů pro podjednotky NFκB. CT („cycle trehold“) udává číslo cyklu, ve kterém došlo k zaznamenatelnému nárůstu amplifikace cDNA. Log C je logaritmus koncentrace cDNA vložené do reakce.
41
3. Výsledky D)
ověření specifity primerů pomocí disociačních křivek
Při každé reakci jsme kontrolovali specifitu reakce a ověřovali, že nevznikají nespecifické produkty (např. dimery primerů) a dochází pouze k amplifikaci žádaného úseku DNA. K tomuto jsme používali disociační křivky pro všechny páry primerů v každé PCR reakci (Obr. 12).
1 2
3
4
5
Obr. 12 Disociační křivky pro jednotlivé podjednotky transkripčního faktoru NFκB byly součástí každé qRT-PCR reakce, pro ověření specifity reakce. 1-disociační křivka p50. 2-disociační křivka p52. 3-disociační křivka c-Rel. 4-disociační křivka RelB. 5-disociační křivka p65. Křivky znázorňují tvorbu jediného produktu v závislosti na čase (osa x).
42
3. Výsledky
3.3. Stanovení exprese podjednotek NFκB Optimalizací reakce jsme stanovili nejvhodnější koncentraci cDNA 83 ng/µl a koncentrace primerů byla stanovena pro všechny primery 0,9 µM, s výjimkou primeru p65Rew (levý), jehož optimální koncentrace pro reakci byla 0,3 µM. Expresi všech podjednotek jsme normalizovali vůči endogení kontrole GAPDH. Optimální koncentrace primerů pro GAPDH byla opět 0,9 µM. Do každé jamky bylo naneseno: 83 ng cDNA, 12,5 µl Power SYBR®Green PCR Master Mix, 0,9 µM primeru Fwd (pravý), 0,9 µM primeru Rew (levý, s vyjímkou p65Rew-0,3 µM) a voda doplněná do celkového objemu 25 µl. Všechny reakce byly provedeny v triplikátech. Pro každý pár primerů jsme připravili dvě kontrolní reakce (NTC). V jedné byl objem cDNA nahrazen stejným objemem vody a ve druhé byl objem cDNA nahrazen odpovídajícím objemem celkové izolované RNA. Všechny grafy jsme vytvořili ze středních hodnot s 25% a 75% percentilem.
3.3.1. Kinetika exprese podjednotky p50 Stanovili jsme hladinu exprese p50 (p105) v buňkách BM2 ovlivněných působením forbolového esteru TPA (250 ng/ml) v časových intervalech 6, 12, 18 a 24hod a v buňkách BM2 po aplikaci trichostatinu A (12 ng/ml) v intervalech 1, 2, 3 a 4 dny. Míru exprese jsme porovnávali s neovlivněnými buňkami BM2 (exprese 1,00). Statisticky významný nárůst jsme zaznamenali po 12hod působení TPA (P<0,05). Ještě po 18 hodinách lze detekovat statisticky významně (P<0,06) zvýšenou úroveň exprese podjednotky p50 ve srovnání s neovlivněnou kontrolou (Obr. 13). Statisticky významný nárůst exprese u buněk ovlivněných TSA (Obr. 14), které diferencují do adherentních mnohojaderných makrofágů, jsme zaznamenali v časech 1, 2 a 3 dny od aplikace diferenciačního činidla (P<0,05) (Obr. 14).
43
3. Výsledky
Kinetika exprese p50 - TPA 4
*
2
p50
E
-♦ CT
3
1 0 čas (hod): 0
6
12
18
24
Obr. 13 Exprese genu kódujícího podjednotku p50 v buňkách BM2 ovlivněných TPA (250 ng/ml, 6, 12, 18, a 24 hod), srovnávaná vůči expresi p50 v neovlivněných buňkách. Buňky jsme nasazovali v počtu 2x106/10 ml, v daných časových intervalech jsme izolovali celkovou RNA. Během Reverzní transkripcí jsme připravili cDNA p50. Do každé reakce jsme vkládali 83 ng cDNA. Výsledky jsou vytvořeny z pěti nezávislých experimentů. Symbol * značí statistickou významnost změny exprese během diferenciace ve srovnání s expresí genu pro podjednotku p50 v neovlivněných buňkách. Pro statistické vyhodnocení jsme použili program Statistica. Pro porovnání dat jsme použili dvouvýběrový F test pro rozptyl a dvouvýběrový T test. Ve zpracování výsledků jsme používali střední hodnoty a chybové úsečky značí 25% a 75% percentil.
Kinetika exprese p50 - TSA 35 30
E-π∝CT
25 20
*
15
* p50
*
10 5 0
den: 0
1
2
3
4
Obr. 14 Exprese genu kódujícího podjednotku p50 v buňkách BM2 po aplikaci trichostatinu A (časové úseky izolace celkové RNA 1, 2, 3, 4 dny), porovnávaná s expresí p50 v neovlivněných buňkách. Na buňky v počáteční hustotě 2x106/10 ml jsme působili trichostatinem A v koncentraci 12 ng/ml. Koncentrace cDNA vkládaná do reakce a způsob vyhodnocování výsledků byly totožné s předchozím experimentem (p50, TPA).
44
3. Výsledky
3.3.2 Kinetika exprese podjednotky p52 Stanovili jsme hladinu exprese p52 (p100) v buňkách BM2 ovlivněných forbolovým esterem TPA (250 ng/ml) v časových intervalech 6, 12, 18 a 24 hod a trichostatinem A (12 ng/ml) v časech 1, 2, 3 a 4 dny. Expresi jsme porovnávali vůči neovlivněným buňkám BM2 (exprese 1,00). Statisticky významný nárůst jsme zaznamenali po 24hod působení TPA (P<0,02) a po jedno-a dvoudenním působení TSA (P<0,03) (Obr.15, 16). Kinetika exprese p52 - TPA 4
*
E- ↓CT
3
p52
2 1
0
čas (hod):0
6
12
18
24
Obr. 15 Exprese genu pro podjednotku p52 v buňkách BM2 ovlivněných TPA (250 ng/ml, 6, 12, 18, 24 hod), srovnávaná vůči expresi p52 v neovlivněných buňkách. Počáteční hustota buněk byla 2x106/10 ml, izolovali jsme celkovou RNA a při reverzní transkripci jsme použitím polyA primerů zajistili přepis pouze mRNA. Při statistickém vyhodnocení jsme použili stejný postup jako u předchozích experimentů a stanovili jsme hladiny významnosti pro jednotlivé časové intervaly. Statistická významnost je označena symbolem *.
Kinetika exprese p52 - TSA 35 30
CT
15
-
20
E π
25 p52
*
10
*
5 0
den: 0
1
2
3
4
Obr. 16 Exprese genu kódujícího podjednotku p52 v buňkách BM2 při počáteční hustotě 2x106/10 ml po aplikaci trichostatinu A (12 ng/ml, časové úseky 1, 2, 3, 4 dny), porovnávaná s expresí p52 v neovlivněných buňkách. Postup experimentu i statistického vyhodnocení je stejný jako v předchozích případech.
45
3. Výsledky
3.3.3. Kinetika exprese podjednotky c-Rel Abychom zjistili vliv TPA a TSA na kinetiku exprese genu kódujícího podjednotku c-Rel, vystavili jsme buňky BM2 působení TPA po 6, 12, 18 a 24 hod a TSA po dobu 1, 2, 3 a 4 dnů. V uvedených intervalech jsme z buněk izolovali celkovou RNA, při reverzní transkripci jsme zajistili přepis mRNA. Pomocí primerů c-RelFwd a c-RelRew jsme amplifikovali cDNA odvozenou od transkriptu c-rel kvantitativní PCR v reálném čase. Zjistili jsme, že hladina transkriptu c-rel je mírně zvýšena v buňkách BM2 vystavených TPA po dobu 18 hod (P<0,07) a 24 hod (P<0,06) ve srovnání s buňkami neovlivněnými (Obr. 17). Statisticky významné zvýšení hladiny transkriptu c-Rel v buňkách BM2 po aplikaci trichostatinu A jsme zaznamenali ve všech časových intervalech. V časech 1, 2 a 3 dny po aplikaci TSA je statistická významnost P<0,05. Po 4 dnech od přidání induktoru je statistická významnost nárůstu exprese P<0,06 (Obr. 18).
Kinetika exprese c-Rel - TPA 4
*
*
2
cRel
E
-∈CT
3
1
0
čas (hod:) 0
6
12
18
24
Obr. 17 Kinetika exprese genu pro podjednotku c-Rel během diferenciace do stádia jednojaderných makrofágů vlivem TPA (250 ng/ml, 6, 12, 18, 24 hod) porovnávaná s neovlivněnými buňkami BM2. Počáteční hustota buněk, ze kterých jsme izolovali celkovou RNA, byla 2x106/10 ml. Do každé jamky qRT-PCR jsme vkládali 83 ng cDNA, vzniklé reverzní transkripcí mRNA. Po použítí dvouvýběrového F testu pro rozptyl a dvouvýběrového T testu jsme stanovili hladiny významnosti. Statisticky významné zvýšení exprese je označeno symbolem *.
46
3. Výsledky
Kinetika exprese c-Rel - TSA 35 30
CT
15
E ◊Π
20
-
25
*
c Rel
*
10
*
*
5 0
den: 0
1
2
3
4
Obr. 18 Postup experimentu i následné statistické vyhodnocení se shoduje s předchozími případy. Statistický významný nárůst exprese genu pro podjednotku c-Rel jsme zaznamenali v průběhu celé diferenciační dráhy do stádia mnohojaderných makrofágů u buněk po aplikaci TSA (hustota buněk na začátku experimentu byla 2x106/10 ml, koncentrace direnciačního činidla TSA 250 ng/ml, časové intervaly izolace celkové RNA z buněk byly 1, 2, 3, 4 dny).
3.3.4. Expresní profil podjednotky RelB Pro potvrzení rozdílů v kinetice exprese genu kódujícího podjednotku RelB jsme na buňky BM2 vystavili působení TPA (250 ng/ml), po dobu 6, 12, 18 a 24 hod a TSA (12 ng/ml), po dobu 1, 2, 3 a 4 dnů. Kinetiku exprese jsme stanovovali za výše zmíněných podmínek, opět ve srovnání s expresí v neovlivněných buňkách BM2. Po aplikaci TPA jsme nezaznamenali v průběhu celé diferenciační dráhy žádný statisticky významný nárůst exprese (Obr. 19). V případě TSA jsme zjistili významný nárůst hladiny transkriptu RelB 1 den po aplikaci induktoru (P<0,01) (Obr. 20).
47
3. Výsledky
Kinetika exprese RelB - TPA 4
E-◊ ΠCT
3
RelB
2
1
0
čas (hod): 0
6
12
18
24
Obr. 19 Exprese genu kódujícího podjednotku RelB v buňkách BM2 ovlivněných TPA (250 ng/ml, časové intervaly izolace celkové RNA byly 6, 12, 18 a 24 hod), srovnávaná vůči expresi RelB v neovlivněných buňkách. Počáteční hustota buněk byla 2x106/10 ml. Po izolaci celkové RNA jsme během reverzní transkripce zajistili přepis mRNA, při qRT-PCR jsme do každé jamky dávali 83ng cDNA. Graf je výsledkem zpracování dat z pěti nezávislých experimentů. S využitím programu Statistica jsme provedli analýzu získaných dat.
Kinetika exprese RelB - TSA 35 30
E- CT
25 20
RelB
15
*
10 5 0
den: 0
1
2
3
4
Obr. 20 Exprese genu kódujícího podjednotku RelB v buňkách BM2 při počáteční hustotě 2x106/10 ml po aplikaci trichostatinu A (12 ng/ml, časové úseky 1, 2, 3, 4 dny), porovnávaná s expresí RelB v neovlivněných buňkách BM2. Postup experimentu i statistického vyhodnocení je stejný jako v předchozích případech.
3.3.5. Expresní profil podjednotky p65 Pro stanovení vlivu TPA a TSA na kinetiku exprese genu kódujícího podjednotku p65 jsme vystavili buňky BM2 působení TPA po dobu 6, 12, 18 a 24 hod a TSA na 1, 2, 3 a 4 dny. V uvedených intervalech jsme z buněk izolovali celkovou RNA, během reverzní 48
3. Výsledky transkripce jsme zajistili přepis mRNA. Pomocí primerů pro p65 jsme amplifikovali cDNA odvozenou od transkriptu p65 metodou kvantitativní PCR v reálném čase. Zaznamenali jsme nárůst hladiny transkriptu p65 v buňkách BM2 vystavených TPA v době 12 a 24 hod (P<0,05) ve srovnání s buňkami neovlivněnými (Obr. 21). Statisticky významné zvýšení hladiny transkriptu p65 v buňkách BM2 po aplikaci trichostatinu A (Obr. 22) jsme zaznamenali v časových intervalech 1, 2 a 3 dnů (den 1 - P<0,04; den 2 - P<0,06; den 3 - P<0,04). . Kinetika exprese p65 - TPA 4
*
*
-
E ◊Π
CT
3
p65
2 1 0
čas (hod): 0
6
12
18
24
Obr. 21 Sledovali jsme průběh kinetiky exprese v buňkách BM2 ovlivněných TPA (250 ng/ml, 6, 12, 18, 24 hod) při diferenciaci do stádia jednojaderných makrofágů. Zaznamenali jsme statisticky významný nárůst (označen symbolem *) hladiny transkriptu p65 oproti hladině v neovlivněných buňkách. Množství cDNA používané v každé reakci na jednu jamku, postup i statistické vyhodnocení dat se opět shoduje s předchozími experimenty.
Expresní profil p65 - TSA 35 30
*
E- CT
25 20
p65
15
*
10
*
5 0
den: 0
1
2
3
4
Obr. 22 Sledování kinetiky exprese genu kódujicího podjednotku p65 v buňkách po aplikaci TSA (12 ng/ml, čas 1, 2, 3 a 4 dny, při počáteční hustotě buněk 2x106/10 ml). Postup při experimentu i následné statistické
49
3. Výsledky vyhodnocení získaných dat se shoduje s předchozími experimenty. Během diferenciační dráhy vedoucí do stádia mnohojaderých makrofágů dochází k významnému navýšení hladiny exprese oproti neovlivněným buňkám.
3.4. Rozdíly expresních profilů neovlivněných buněk BM2 a buněk terminálně diferencovaných vlivem TPA a TSA. Buňky BM2 jsou aktivně proliferující monoblasty, které rostou v suspenzi. Po aplikaci TPA (250 ng/ml) buňky diferencují a během 24hod vytvoří přisedlé jednojaderné makrofágy. Působením TSA (12 ng/ml) vznikají během 4 dnů přisedlé makrofágové polykaryony. Srovnání expresních profilů všech podjednotek transkripčního faktoru NFκB v nezralých nediferencovaných buňkách a v buňkách terminálně diferencovaných poskytuje obr. 23. Z obrázku vyplývá, že působením TPA i TSA exprese všech podjednotek NFκB stoupá, míra zvýšení však závisí na typu použitého induktoru. to znamená, že jednojaderné makrofágy a makrofágové polykaryony se liší v produkci jednotlivých podjednotek transkripčního faktoru NFκB. Statisticky významnou změnu hladiny exprese jsme zaznamenali v případě jednojaderných makrofágů (TPA) u podjednotek p52 (P<0,02), c-Rel (P<0,06) a p65 (P<0,04). A dále u mnohojaderných makrofágů v případě c-Rel (P<0,06) a p65 (P<0,09). .
Srovnání expresních profilů v nediferencovaných a terminálně diferencovaných buňkách BM2 7 6
*
*
4
-
E Η
CT
5
*
*
*
p50 p52 c-Rel RelB
3
p65 2 1 0 BM2 neovlivněné
TPA
TSA
Obr. 23 Nediferencované aktivně proliferující buňky BM2 byly použity jako standard vůči kterému jsme hodnotili nárůst exprese v terminálně diferencovaných buňkách BM2 po aplikaci dvou různých diferenciačních činidel. Působením TPA (250 ng/ml, 24hod) vznikaly adherentní jednojaderné makrofágy. Buňky ovlivněné
50
3. Výsledky TSA (12 ng/ml, 4 dny) fúzovaly a vyvinuly se v přisedlé mnohojaderné makrofágy. Počáteční hustota buněk byla 2x106/10 ml, po dosažení terminálně diferencovaného stádia (TPA 24 hod, TSA 4 dny) jsme izolovali celkovou RNA. Použitím náhodných oligonukleotidů při reverzní transkripci jsme přepsali mRNA do cDNA, kterou jsme následně vložili do reakce (83 ng/jamka). Graf je výsledkem zpracování dat z pěti nezávislých experimentů, které jsme vyhodnotili s použitím dvouvýběrového F testu pro rozptyl a dvouvýběrového T testu. Statisticky významné zvýšení hladiny transkriptů je označeno symbolem *.
3.5. Příprava expresního vektoru pro inducibilní expresi Iκ κB∆ ∆n Transkripční faktor NFκB má v buňkách řadu funkcí, mezi které patří regulace přežívání a apoptózy. Abychom zjistili, jestli je transkripční faktor NFκB pro diferenciační monocytickou/makrofágovou dráhu nepostradatelný, sestrojili jsme inducibilní expresní vektor kódující IκB∆n. Mutantní inhibiční protein IκB∆n nepodléhá fosforylaci a je tedy trvale navázán na proteiny rodiny NFκB/Rel. Jeho expresí v buňkách se zajistí trvalá lokalizace dimerů NFκB v cytoplazmě a zabrání se translokaci dimerů do jádra a následně vazbě na regulační oblasti genů. V budoucnu bude možné tento inducibilní vektor využít pro transfekci buněk BM2. Pomocný regulační plazmid pNEBR-R1, který bude vnesen do buněk současně s pNEBR-X1-IκB∆n, zajistí konstitutivní expresi receptoru pro RSL1 („RheoSwitch Ligand 1“). RSL1 je komerčně dodávaný induktor exprese pNEBR-R1 plazmidu. Přidáním RSL1 se aktivuje exprese z pNEBR-X1 (v našem případě se v buňkách začně exprimovat IκB∆n). Předpokládáme, že stabilní transfektanty BM2 exprimující IκB∆n nebudou schopny po přidání TPA či TSA diferencovat a tak prokážeme důležitost transkripčního faktoru NFκB v diferenciační makrofágové dráze. V prvním kroku jsme ověřili účinnost inhibice IκB∆n v buňkách MCF-7 stanovením jeho vlivu na transaktivační schopnost proteinu NFκB. Buňky MCF-7 jsme vybrali pro jejich vysokou účinnost přechodné transfekce a protože disponují aktivní klasickou aktivační dráhou NFκB. Buňky MCF-7 jsme transfekovali plazmidy cmvβgal, NFκBluc a pCMV4IκB∆n (resp. pCMV4) a po 48 hod jsme měřili relativní luciferázovou a beta-galaktozidázovou aktivitu. Výsledky transaktivačních testů prokázaly funkčnost pCMV4IκB∆n a jeho vliv na aktivitu transkripčního faktoru NFκB (Obr. 24). Zaznamenali jsme přibližně 190x sníženou aktivitu NFκB v buňkách MCF-7, které obsahovaly pCMV4IκB∆n, při hladině významnosti P<0,000005. Ověřili jsme tak funkčnost mutovaného IκB∆n a vhodnost jeho využití v inducibilním expresním vektoru.
51
3. Výsledky
Vliv IkBΗ Ηn na relativní luciferázovou aktivitu u buněk MCF-7
16000 14000
relativní luciferázová aktivita
12000 10000
8000 6000
4000 2000
0 pCDNA
IkBΗn
Obr. 24 Provedli jsme přechodnou transfekci buněk MCF-7 Lipofectaminem 2000 (4 µl). Transfekční směs obsahovala 100 µl média OPTIMEM, celkem 2 µg DNA, z nichž 1 µg IκB∆n (respektive pCDNA4), 0,5 µg plazmidu cmvβgal a 0,5 µg reportéru pNFκBluc. Transfekovali jsme 5x105 buněk na 5ml kultivační misce a po 48hod jsme buňky sklidili. Jednu polovinu buněk jsme použili pro beta-galaktozidázovou assay a druhou polovinu pro luciferázovou assay. Výsledný graf je vytvořen ze 3 nezávislých experimentů.
Dalším krokem bylo restrikční štěpení expresního inducibilního vektoru pNEBR-X1 a vyštěpení IkB∆n z pCMV4-IkB∆n. Použili jsme restrikční enzymy EcoRV (pNEBR-X1) a SmaI (IκB∆n). Postup a vkládané objemy (Tab. 4-7) jsou uvedeny na stranách 32-34. Produkty štěpení jsme ověřili elektroforetickou separací v 1% agarózovém gelu (Obr. 25). Následně jsme oba produkty naštěpili restrikčním enzymem HindIII. Objemy jednotlivých složek v reakci jsou uvedeny v tabulce č. 3. Produkty jsme opět ověřili na 1% agarózovém gelu. Celý reakční objem štěpení pCMV4-IκB∆n-SmaI enzymem HindIII jsme nanesli na 1% agarózový gel, po elektroforetické separaci produktů jsme z něj vyřízli a eluovali vyštěpený
52
3. Výsledky fragment IκB∆n. Eluovaný IκB∆n jsme ověřili elektroforetickou separací v 1% agarózovém gelu (Obr. 26).
←
A
B
C
D
E
Obr. 25 Ověření produktů restrikční reakce obarvených ethidiumbromidem a zviditelněných UV světlem separací v 1% agarózovém gelu. A - 5 µl standardu molekulových hmotností DNA (1kB ladder) B - 1,5 µl neštěpeného vektoru X1 (vytváří nadšroubovicovité formy) C – 5 µl vektoru X1 po štěpení restrikčním enzymem EcoRV (vektor je linearizován, označen šipkou) D – 3 µl neštěpeného plazmidu pCMV4 IκB∆n (vytvář nadšroubovicovité formy) E – 5 µl plazmidu pCMV4 IκB∆n po restrikčním štěpení enzymem SmaI (linearizován, označen šipkou)
←
←
A
B
C
Obr. 26 V 1% agarózovém gelu jsme elektroforetickou separací ověřili vyštěpení fragmentu IκB∆n a X1 vektor naštěpený HindIII a EcoRV. Produkty jsou zviditelněny ethidiumbromidem v UV světle. A - 5 µl standardu molekulových hmotností DNA (1kB ladder) B – 5 µl vyštěpeného a eluovaného IκB∆n (z celkového reakčního objemu 20 µl, označen šipkou) C – 5 µl vektoru X1 po štěpení restrikčními enzymy EcoRV a Hind III (označen šipkou)
53
3. Výsledky Provedli jsme ligaci (18hod při 16°C, složení ligačních směsí je uvedeno v tabulce 6). Další den jsme polovinou objemů ligačních směsí transformovali kompetentní bakterie (Escherichia coli DH5α). Za 24 hod jsme vybrali jednotlivé kolonie a nasadili minikultury. Za dalších 12-16hod jsme provedli izolaci plazmidové DNA (miniprep) a následně ověřovací štěpení. Použili jsme restrikční enzymy HindIII a XhoI (složení reakčních směsí je uvedeno v tabulce 5). Produkty jsme ověřili elektroforetickou separací v 1% agarózovém gelu. Pozitivní klon bakterií obsahující vektor X1-IκB∆n jsme nasadili do 500ml LB média s ampicilinem a za 12 hod provedli izolaci plazmidové DNA (maxiprep). Izolovaný vektor jsme štěpili restrikčními enzymy HindIII a XhoI a produkty separovali v 1% agarózovém gelu (Obr. 27).
←
←
A
B
C
D
E
Obr. 27 Elektroforetická separace produktů ověřovacího štěpení, zviditelněných etidiumbromidem v UV světle v 1% agarózovém gelu. Ke štěpení jsme použili enzymy HindIII a XhoI a ověřili jsme produkt ligace (č. 5), který jsme izolovali z transformovaných bakterií. A - 5 µl standardu molekulových hmotností DNA (1kB ladder) B - 1,5 µl neštěpený vektor X1 (tvoří nadšroubovicovité struktury) C - 3 µl vyštěpený fragment IκB∆n D - vektor X1 linearizovaný štěpením restrikčními enzymy EcoRV a HindIII E - 5µl X1- IκB∆n, štěpený restrikčními enzymy XhoI a HindIII (označen šipkami)
Připravili jsme a ověřili inducibilní expresní vektor pNEBR-X1-IκB∆n, který lze v budoucnu využít k průkazu funkce NFκB v makrofágové diferenciaci, jak popisujeme na straně 51.
54
Cíle diplomové práce
Cíle diplomové práce Exprese onkogenu v-myb zabraňuje buňkám linie BM2 dokončit monocytickou/ makrofágovou dráhu. Tento blok lze překonat působením forbolesteru TPA a nebo inhibitorem histonových deacetyláz trichostatinem A. Působením TPA buňky BM2 diferencují do stádia jednojaderných makrofágů. Naproti tomu po aplikaci TSA buňky diferencují do stádia mnohojaderných makrofágů. Je známo, že důležitý vliv na diferenciační dráhu má transkripční faktor NFκB, který je přítomen ve všech typech živočišných buněk, ale ve větší míře je produkován v hematopoetické linii. Cílem této diplomové práce je stanovit rozdíly v kinetice exprese genů pro jednotlivé podjednotky transkripčního faktoru NFκB v buňkách leukemické linie BM2 v průběhu diferenciace vyvolané TPA a TSA a porovnat expresní profily podjednotek NFκB u terminálně diferencovaných buněk vzniklých působením dvou zmíněných induktorů. Dalším cílem je připravit expresní vektor kódující inhibiční protein IκB, který bude vhodný k testu významnosti transkripčního faktoru NFκB v makrofágové difereciaci leukemických buněk BM2.
55
4. Diskuze
4. Diskuze Kinetiku exprese transkripčního faktoru NFκB jsme studovali v buněčné linii BM2. Buňky této linie jsou kulovité nezralé suspenzní monoblasty, které exprimují onkogen v-myb. Protein v-Myb patří do rodiny transkripčních faktorů, které se vyskytují v jádře, sekvenčně specificky se váží na DNA a regulují transkripci cílových genů. Protein v-Myb kromě jiného postrádá R1 segment v DNA vazebné doméně na N-konci a v negativně regulační doméně na C-konci je zkrácen o 199 aminokyselin. Tím je narušena funkce středové transaktivační domény a zvýšena transkripční a transformační aktivita proteinu. Buňky BM2 exprimující onkogen v-myb mají zablokovanou monocytickou/makrofágovou diferenciační dráhu. V prostředí zdravé kostní dřeně jsou vlivem jistých faktorů schopny diferencovat do zralých makrofágů. In vitro lze jejich diferenciaci navodit působením forbolového esteru TPA a inhibitorem histonových deacetyláz trichostatinem A. Pod vlivem TPA se BM2 nezralé blasty mění během 24 hodin v jednojaderné adherentní makrofágy (Symonds et al., 1984) a po působení TSA diferencují po 4 dnech v přisedlé makrofágové polykaryony (Šmarda a Lipsick, 1994). Z nezralých buněk BM2 i z diferencovaných makrofágů jsme izolovali celkovou RNA, přepisem mRNA jsme získali cDNA, kterou jsme dále používali pro analýzu exprese genů kódujících podjednotky NFκB metodou kvantitativní PCR v reálném čase. Trichostatin A patří mezi inhibitory histon-deacetyláz (HDACi). Jeho struktura je odvozena od kyseliny hydroxamové. Inhibuje aktivitu histondeacetyláz, tím zvýší celkovou acetylaci histonů v buňce. HDACi inhibují růst buněk, indukují apopózu a navozují diferenciaci u různých nádorových linií. Buněčný cyklus zastavuje v G1 fázi zvýšením hladiny proteinu p21WAF1/Cip1. TSA má výrazný protinádorový účinek, v současné době se využívá pro léčbu akutních myeloidních leukémií (Minucci et al., 2001). Tetraforbolester TPA je analogem diacylglycerolu (DAG), který v buňce slouží jako sekundární přenašeč signálu, který aktivuje proteiny rodiny PKC (protein kináza C) a reguluje tak v buňce mnoho funkcí, apoptózu, diferenciaci, růst. TPA se vmezeří do membrány buněk a může trvale aktivovat PKC. Forbolové estery se váží na C1 doménu protein kinázy C, konečným důsledkem je regulace aktivity cyklin-cdk (cyklin dependentní kináza) komplexů a exprese cdk inhibitorů. Stejně jako TSA je TPA využíván při léčbě akutní myeloidní leukémie. NFκB je univerzální transkripční faktor účastnící se mnoha procesů v buňkách a je ve většině živočišných buněčných typů. Kromě širokého spektra proteinů a receptorů imunitní odpovědi dokáže NFκB aktivovat expresi genů některých virů (HIV, cytomegalovirus) 56
4. Diskuze (Muller et al., 1993). Do rodiny NFκB/Rel patří pět proteinů: p50 (nfkb1, p105), p52 (nfkb2, p100), c-Rel, RelB a p65 (RelA). Dělí se na dvě skupiny, jedna (c-Rel, RelB a p65) obsahuje ve své struktuře transaktivační doménu, která je nezbytná k aktivaci cílových genů. Do druhé skupiny patří proteiny p50 a p52 a jejich prekurzory p100 a p105, nemají transaktivační doménu a jejich prekurzorová nezkrácena forma obsahuje ankyrinové repetice, které slouží k inhibici těchto i dalších podjednotek z rodiny NFκB/Rel. Aktivní transkripční faktor je dimer, který obsahuje alespoň jednu podjednotku s transaktivační doménou. Proteiny rodiny NFκB/Rel mohou vytvářet homodimery (s výjimkou proteinu RelB) i heterodimery. Existuje více než 10 možných kombinací. Každý dimer se specificky váže na jednu a více vazebných sekvencí κB. V současné době není objasněno, které dimerní kombinace mají jaké funkce a afinitu ke kterým vazebným sekvencím. Existují různé typy makrofágů, které se fenotypově i funkčně liší (Gordon, 1995). Exprese NFκB v nich je rozdílná a je zřejmě důležitým mechanismem, jak makrofágy dosahují své funkční specializace a exprese specifických sad genů, díky kterým pak plní různé funkce. Rozdíly v expresi a využívání jednotlivých podjednotek NFκB u odlišných typů makrofágů, při aktivaci T buněk, při zrání B buněk naznačují, že tyto změny jsou zásadní pro diferenciaci a vývoj krevních buněk a další plnění jejich funkcí. V makrofázích bývá během diferenciace první aktivován protein p65 a s postupem času se RelB stane hlavní složkou konstitutivní zásoby NFκB v jádrech těchto buněk (Francis et al., 1998). Rozdílný expresní profil terminálně diferencovaných stádií dvou typů makrofágů a odlišná kinetika exprese genů kódujících podjednotky transkripčního faktoru NFκB, které jsme zaznamenali v průběhu diferenciace, nasvědčuje, že jde o dráhy, při nichž dochází k tvorbě různých dimerních kombinací a následné expresi jistých sad genů. Potvrzují zároveň odlišný
morfologický
vzhled
buněk
po
aplikaci
TPA
a
TSA.
Před
stimulací
nediferencovaných buněk je určité menší množství dimerů NFκB zadržováno v cytoplazmě v neaktivní formě a v jádře jejich přítomnost nelze detekovat. Jedná se především o heterodimery proteinů p65 a p50. Vnější podněty zajistí translokaci dimerů do jádra fosforylací IκB (Didonato et al., 1995). Hlavní úloha NFκB při makrofágové diferenciaci spočívá v zajištění přežívání diferencujících se a diferencovaných buněk. Ochranný efekt má protein p21WAF1/Cip1 (Javelaud et al., 2000), který je regulován NFκB (Pennington et al., 2001). V terminálně diferencovaných buňkách jako jsou makrofágy je NFκB přítomen přímo v jádře ve velkém množství (Beg a Baltimore, 1996). Molekulární mechanismus regulace translokace transkripčního faktoru do jádra během makrofágové diferenciace není dosud zcela objasněn (Griffin et al., 1991). 57
4. Diskuze Podjednotka p50 je exprimována jako delší prekurzor, který musí být proteolyticky zkrácen na aktivní formu. Gen kódující p50 se nachází na chromozomu 4 v oblasti q24. Prekurzor má molekulovou hmotnost 105kDa a skládá se z 968-969 aminokyselin. Dochází k odštěpení C-koncové části prekurzoru, která obsahuje ankyrinové repetice. Ty zajišťují lokalizaci p105 v cytoplazmě a mohou inhibovat i dimer, obsahující kromě prekurzoru i aktivní protein Rel. Sekvenční analýzou cDNA kódující prekurzorový protein p105 byla zjištěna 70% homologie mezi kuřecím, myším a lidským proteinem p50. Myši deficientní v p50 nemají žádné vývojové defekty, ale vykazují četné odchylky či poškození v imunitních odpovědích a nespecifických odpovědích na infekci. Největší expresi lze detekovat v hematopoetických buňkách. Je součástí nejčastěji dimeru p50/p65, který má v buňce řadu funkcí a patří mezi nejčastější aktivní NFκB dimery. Podjednotka p52, stejně jako p50, je syntetizována jako delší prekurzor o molekulové hmotnosti 105 kDa, složený z 899 aminokyselin, který musí být na svou aktivní kratší formu proteolyticky zkrácen. Má velký význam při vývoji hematopoetických buněk. Gen kódující tuto podjednotku se nachází na chromozomu 10 v oblasti q24. Nejčastěji tvoří dimer s podjednotkou RelB, případně inhibiční heterodimer s p50. Ankyrinové repetice, které obsahuje nezkrácená forma proteinu, zadržují tento dimer v cytoplazmě. K aktivaci dimeru p52/RelB dochází nekanonickou NFκB aktivující dráhou. Heterodimer p50/p52 působí na transkripci inhibičně, protože ani jedna z podjednotek neobsahuje transaktivační doménu, která by mohla aktivovat expresi cílových genů. Protože obsahují Rel homologní doménu s vazebným místem pro DNA, váže se do regulačních oblastí genů a tak zabraňuje navázání aktivních dimerů. Podjednotka c-Rel je přímo syntetizována jako aktivní protein schopný vázat ostatní podjednotky a DNA a aktivovat expresi cílových genů. Gen se nachází na chromozmu 2 v oblasti p12-p13. Existují dvě sestřihové varianty, jedna má 619 aminokyselin a 69kDa a druhá obsahuje 587 aminokyselin a její molekulová hmotnost je 65kDa. Dospělí jedinci obratlovců exprimují c-rel téměř výhradně v hematopoetických buňkách (Brownell et al., 1987). V linii B lymfocytů se hladina c-rel transkriptů mění s vývojovým stupněm buněk (Grumont a Gerondakis, 1990) a to 5-10x při přeměně pre-B na zralé B buňky (Liou et al., 1994). K expresi c-rel dochází i v neutrofilech (Blackwell et al., 1994) a monocytech (Ziegler-Heitbrock, 1993). Příprava c-Rel -/- myší prokázala některé základní funkce této podjednotky (Kontgen et al., 1995). Myši vykazovaly poruchy proliferace B a T buněk, sníženou humorální imunitu a poruchu produkce IL-2, IL-3 a GM-CSF během aktivace T buněk (Gerondakis et al., 1996). c-Rel není nezbytný pro dozrávání monocytů a makrofágů 58
4. Diskuze z prekurzorových buněk u c-Rel -/- myší. Je ale důležitým transkripčním regulátorem genů patřících do imunitní odpovědi zprostředkovaná makrofágy (IL-6, TNFα, G-CSF, GM-CSF, iNOS) (Collart et al., 1990; Liebermann a Baltimore, 1990). c-Rel funguje jako pozitivní i negativní regulátor transkripce. V peritoneálních makrofázích c-Rel aktivuje expresi TNFα a iNOS, ale reprimuje expresi GM-CSF, G-CSF a IL-6. Předpokládá se, že jestli bude c-Rel pozitivní či negativní regulátor transkripce, ovlivňuje prostředí určitých buněčných typů (liší se jeho funkce v makrofázích, B a T buňkách a jejich stádiích) a také interakce s dalšími transkripčními faktory a podjednotkami NFκB (Grigoriadis et al., 1996). Gen kódující podjednotku RelB se nachází na chromozomu 19 v oblasti q13.32. Protein obsahuje 579 aminokyselin a jeho molekulová hmotnost je 66kDa. Tato podjednotka tvoří funkční heterodimery. Homodimery RelB nevykazují žádnou DNA-vazebnou aktivitu. Nejčastěji se váže na podjednotky p50 a p52. Exprese RelB je na rozdíl od ostatních podjednotek vymezena do prostředí lymfatických orgánů, zejména v dřeni brzlíku, slezině a v mízních uzlinách (Weih et al., 1994). Podílí se však i na diferenciaci krvních buněk. Společně s p50 a c-Rel se podílí na konstitutivní aktivitě NFκB v jádře pozorované v lymfatických orgánech (Lernbecher et al., 1993), během zrání B buněk a plazmatických buněk (Ammon et al., 2000). RelB deficientní myši postrádají konstitutivní aktivitu NFκB v jádrech ve zmíněných orgánech, dochází u nich k mnohočetným zánětlivým prosakováním neutrofilů a makrofágů, chybnému zrání dendritických buněk, vrozenému nevyvinutí brzlíku a dále mají chorobné zvětšení sleziny (Burkly et al., 1995). Všechny tyto vady vedou k nedostatečné prezentaci antigenů a následné smrti během několika týdnů po narození (Pettit et al., 1997). Vnější podněty (sérum, CD40 aktivace, působení LPS na B buňky nebo zvýšená vnitrobuněčná hladina cyklického adenosin monofosfátu-cAMP) vede k pomalému nárůstu množství RelB transkriptů (trvající hodiny), syntéze proteinu a jaderné lokalizaci (Olashaw, 1996). Reguluje časné geny imunitní odpovědi, geny pro mezibuněčné interakce a komunikaci, zesílení imunitní odpovědi na patogeny, buněčnou smrt a diferenciaci. Protein p21 chránící buňky před apoptózou je regulován právě proteinem RelB, který na úrovni transkripce stabilizuje onkogen c-myb (Suhasini a Pilz, 1999). Podjednotka p65 je nejznámějším NFκB/Rel proteinem, vyskytuje se v naprosté většině aktivních dimerů, nejčastěji ve spojení s podjednotkou p50. Existuje opět ve dvou sestřihových variantách, první má 246 aminokyselin a molekulovou hmotnost 28kDa a druhá obsahuje 551 aminokyselin a má 60kDa. Gen pro p65 je na chromozomu 11 v oblasti q13.1. Na rozdíl od podjednotek p52, RelB a c-Rel můžeme p65 najít téměř ve všech tkáních a buněčných typech. Na rozdíl od RelB je p65 hlavní složkou inducibilní zásoby NFκB 59
4. Diskuze (Lernbecher et al., 1993) a je silným transkripčním aktivátorem IκBα (Le Bail et al., 1993). Na rozdíl od RelB je protein p65 schopen přesunu do jádra během několika málo minut od působení stimulu, díky jeho cytoplazmatické zásobě. Podílí se na regulaci transkripce p50 (p105), p52 (p100) a c-Rel (Bren et al., 2001). p65 deficientní myši umírají během časného embryonálního vývoje, kdy nastane degenerace fetálních jater způsobená plošnou apoptózou (Doi et al., 1997). c-Rel p65 dvojitě deficientní (c-Rel -/- p65 -/-) myši vykazují stejný fenotyp, o pár dnů později, což naznačuje, že podjednotka c-Rel dokáže částečně nahradit efekt p65. Tyto dvojitě deficientní myši nevykazují poruchy krvetvorby, ale mají oslabenou imunitní odpověď zralých krevních buněk. p65 reguluje transkripci podjednotky RelB. Hladina mRNA v buňce může mít velkou výpovědní hodnotu, avšak existuje mnoho regulačních mechanismů, které ovlivní tvorbu samotného proteinu. U mnohojaderných makrofágů, které diferencují po aplikaci TSA, vzrůstá hladina mRNA u všech podjednotek ve stejných časových úsecích, svého maxima dosahují dva dny po aplikaci induktoru a po té hladina transkriptů všech podjednotek pozvolna klesá. Nejvyšší hladiny transkriptů dosahují podjednotky p65, c-Rel a RelB. Protein p65 je znám pro svou schopnost okamžité translokace do jádra a aktivace cílových genů, mezi něž patří i gen relb, jehož exprese vzrůstá s množstvím proteinu p65. Hlavní funkce proteinu c-Rel spočívá v regulaci exprese genů typických pro makrofágy (IL-6, TNFα, G-CSF, GM-CSF, iNOS). Diferencované makrofágy po 4 dnech od přidání diferenciačního činidla mají zýšenou hladinu mRNA pro tytéž 3 proteiny, které se pravděpodobně stávají součástí konstitutivní zásobárny regulačních NFκB proteinů. Ty jsou potřeba pro udržování diferencovaného stavu buněk, pro plnění specifických funkcí a pro okamžitou reakci jako odpověď na vnější podněty. U jednojaderných makrofágů vzniklých diferenciací po aplikaci TPA jsme nezaznamenali jednotný trend v kinetice proteinů NFκB. V tomto případě diferenciace trvá pouze 24hod. Nejvyšší hladinu mRNA jsme zaznamenali u proteinů p50, p65 a c-Rel, na konci diferenciační dráhy i u podjednotky p52. Dimer p50/p65 je nejčastějším aktivním dimerem v buňkách a je schopen nejrychlejší translokace do jádra aktivace transkripce cílových genů. Protein c-Rel, jehož transkript dosahuje nejvyšší hladiny po 24 hod od přidání induktoru, je potřebný pro expresi specifických genů, jimiž se vyznačují zralé makrofágy a zajištění jejich funkce. U terminálně diferencovaných jednojaderných makrofágů jsme zaznamenali nejvyšší hladinu mRNA pro proteiny p52, c-Rel a p65, mírně zvýšený je i transkript RelB, jehož exprese je zřejmě později aktivována proteinem p65. Tyto 4 proteiny jsou pravděpodobně součástí konstitutivní zásobárny proteinů NFκB v
diferencovaných makrofázích a zajišťují
diferencovaného stavu a plnění funkcí specifických pro tento typ makrofágů. 60
udržování
4. Diskuze Dále jsme se rozhodli prokázat nenahraditelnou funkci NFκB během diferenciace inhibicí tohoto transkripčního faktoru. Po přechodné transfekci plazmidem pCMV-IκB∆n, a současné aplikaci diferenciačního činidla buňky nepřežívají. Proto jsme se rozhodli připravit inducibilní expresní vektor s genem pro mutantní inhibiční protein (IκB∆n). Příprava stabilních transfektantů obsahujících plazmidy pNEBR-X1-IκB∆n a pNEBR-R1 (pomocný plazmid exprimující receptor pro komerčně dodávaný ligand RSL1, který aktivuje expresi plazmidu pNEBR-X1-IκB∆n) by nám měla umožnit prokázat vliv NFκB v makrofágové diferenciaci. Před konstrukcí inducibilního vektoru jsme ověřili účinnost genu IκB∆n v plazmidu pCMV-IκB∆n v buňkách MCF-7. Tuto linii jsme vybrali pro její vysokou efektivitu transfekce a protože má aktivní klasickou aktivační dráhu NFκB (neaktivní dimery jsou lokalizovány v cytoplazmě v komplexu s inhibičními proteiny, k uvolnění aktivních dimerů a translokaci do jádra dochází po fosforylaci a následné degradaci IκB). Předpokládáme, že stabilní transfektanty buněk BM2 obsahující námi připravený inducibilní expresní vektor pNEBR-X1-IκB∆n, nebudou schopny po aplikaci TPA, resp. TSA diferencovat.
61
5. Závěr
5. Závěr Kulovité suspenzní buňky leukemické linie BM2 konstitutivně exprimují onkogen v-myb a nemohou dokončit monocyt/makrofágovou diferenciační dráhu. Aplikací diferenciačních činidel jako je TPA a TSA lze blokádu překonat a vyvolat diferenciaci Fdo stádia jednojaderných makrofágů (TPA, 24 hod, 250 ng/ml) a nebo mnohojaderných makrofágů (TSA, 4 dny, 12 ng/ml). Sledovali jsme kinetiku exprese pěti podjednotek transkripčního faktoru NFκB v buňkách linie BM2 metodou kvantitativní PCR v reálném čase v průběhu obou diferenciačních drah. Expresi podjednotek NFκB diferencujících buněk jsme srovnávali s expresí těchto podjednotek v neovlivněných buňkách. Vytvořili jsme expresní profil transkripčního faktoru NFκB, který se u těchto dvou diferenciačních drah liší. Potvrdili jsme tak rozdílnost drah pozorovatelnou i na úrovni fenotypu. Z našich výsledků vyplývají rozdílné požadavky na expresi konkrétních genů, které jsou typické pro dva druhy makrofágů, účast rozdílných kombinací podjednotek na těchto diferenciačních drahách a odlišné konstitutivní zásobárny proteinů NFκB, které zajišťují udržování specifických funkcí. Vytvořili jsme inducibilní expresní vektor, obsahující dominantně negativní variantu inhibičního proteinu IκB, který nemůže být fosforylován a proto zůstává permanentně navázán na dimer NFκB. Zajistí tak zadržení neaktivních dimerů NFκB v cytoplazmě, znemožní jejich translokaci do jádra buňky, vazbu na regulační oblasti genů a ovlivnění exprese cílových genů. Transfekcí buněk tímto vektorem budeme schopni prokázat funkci NFκB v diferenciaci buněk BM2 do stádií makrofágů. Předpokládáme, že buňky exprimující IκB∆n nebudou schopny po přidání induktorů diferencovat. Pro ověření aktivity NFκB v diferenciaci navrhujeme transfekovat buňky BM2 reportérovým konstruktem NFκB obsahující gen pro luciferázu a měřit relativní luciferázovou aktivitu neovlivněných buněk a diferencujících se buněk po aplikaci TPA a TSA. Použitím různých kombinací siRNA pro jednotlivé proteiny NFκB bude možné určit význam jednotlivých proteinů nebo jejich kombinací v makrofágové diferenciaci.
62
6. Summary
6. Summary BM2 cells constitutively express the v-myb oncogene of AMV and can not undergo terminal differentiation of the monocyte/macrophage pathway. These non-adherent cells can be induced to follow differentiation either into adherent mononuclear macrophages upon treatment with TPA (250 ng/ml, 24 hours) or into multinuclear adherent macrophages upon treatment with TSA (12 ng/ml, 4 days). Using qRT-PCR we analyzed the expression kinetics of the NFκB transcription factor subunits in both these pathways. We determined the expression profiles of these subunits in differentiating cells and in cells that were not induced to terminal differentiation. The differences of the NFκB expression profiles between the two macrophage differentiation pathways confirm differences of phenotype of both cell types we observed. Our results suggest that there are specific gene expression profiles typical for these two macrophage cell types allowing participation of distinct NFκB subunits on these pahways and constitutive pools of proteins needed for specific macrophage functions. In addition, we constructed inducible expression vector, coding for mutant variant (IκB∆n) of the IκB inhibitory protein which can not undergo phosphorylation. Therefore, it is permanently linked to NFκB dimer. IκB∆n retains the NFκB dimers in cytoplasm and prevent their translocation to the nucleus and binding to regulatory sequences of the NFκB target genes. Transfection of BM2 cells with this construct should demonstrate importance of the NFκB function for macrophage differentiation of these cells. We hypothesize that IkB∆n-transfected cells will not be able to differentiate upon treatment with TPA or TSA. Transcription activation function of NFκB in differentiating cells determined by luciferase assays will further prove if activity of NFκB trancription factor is essential. Using various combinations of siRNA specific for the NFκB proteins the relevance of single subunits or their combinations for macrophage differentiation pathway will be established.
63
7. Seznam použité literatury
7. Seznam použité literatury Abdel-Mageed, A. B., Bajwa, A., Shenassa, B. B., Human, L., Ghoniem, G. M. 2003. NF-κB-dependent gene expression of proinflammatory cytokines in T24 cells: possible role in interstitial cystitis. Urol Res. 31:300-305. Ammon, C., Mondal, K., Andreesen, R., Krause, S. W. 2000. Differential expression of the transcritption factor NF-kappaB during human mononuclear phagocyte differentiation to macrophages and dendritic cells. Biochem Biophys Res Commun 268(1):99-105. Baeuerle, P. A. 1991. The inducible transcription activator NF-KB: regulation by distinct protein subunits. Biochim. Biophys. Acta 1072:63-80. Baeuerle, P. A., Baltimore, D. 1988. I kappa B: a specific inhibitor of the NF-kappaB transcription factor. Science 242(4878):540-6. Baeuerle, P. A., Baltimore, D. 1996. NF-kappa B: ten years after. Cell 87(1):13-20. Baldvin, A. S. Jr. 1996. The NFκB, IκB proteins: new discoveries and insights. Annu Rev Immunol 14:649-83. Beg, A. A., Baltimore, D. 1996. An essential role for NF-kappaB in preventing TNF-alphainduced cell death. Science 274(5288):782-4. Beinke, S., Ley, S. C. 2004. Functions of NF-kappaB1 and NF-kappaB2 in immune cell biology. Biochem. J. 382, 393-409. Blackwell, T. S., Holden, E. P., Blackwell, T. R., DeLarco, J. E., Christman, J. W. 1994. Cytokine-induced neutrophil chemoattractant mediates neutrophilic alveolitis in rats: association with nuclear factor kappa B activation. Am. J. Resp. Cell Mol. Biol 11:464472. Bonizzi, G., Karin, M. 2004. The two NF-κB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 25: 280–288. Bours, V., Franzoso, G., Azarenko, V., Park, S., Kanno, T., Brown, K., Siebenlist, U. 1993. The oncoprotein Bcl-3 directly transactivates through kappa B motifs via association with DNA-binding p50B homodimers. Cell 72, 729-739. Bren, G. D., Solan, N. J., Miyoshi, H., Penington, K. N., Pobst, L. J., Paya, C. V. 2001. Transcription of the RelB gene is regulated by NF-kappaB. Oncogene 20(53):7722-33. Brooks, S. C., Locke, E. R., Soule, H. D. 1973. Estrogen receptor in human cell line (MCF-7) from breast carcinoma. J Biol Chem. 248(17):6251-3.
64
7. Seznam použité literatury Brownell, E., Mathieson, B., Young ,H. A., Keller, J., Ihle, J. N., Rice, N. R. 1987. Detection of c-rel-related transcripts in mouse hemopoietic tissues, fractionated lymphocyte populations and cell lines. Mol. Cell. Biol 7:1304-1309. Burkly, L., Mulrey, N., Blumenthal, R., Dimitrov, D. S. 1995. Synergistic inhibition of human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein-mediated cell fusion and infection by an antibody to CD4 domain 2 in combination with anti-gp120 antibodies. J Virol 69(7):4267-73. Buss, H., Dorrie, A., Schmitz, M. L., Frank, R., Livingstone, M., Resch, K., Kracht, M. 2004. Phosphorylation of serine 468 by GSK-3β negatively regulates basal p65 NF-κB activity. J Biol Chem 279:49571-49574. Chen, Z.J. 2005. Ubiquitin signalling in the NF-κB pathway. Nat. Cell Biol 7:758–765. Collart, M. A., Baeuerle, P., Vassalli, P. 1990. Regulation of tumor necrosis factor alpha transcription in macrophages: involvement of four kappa-B-like motifs and of constitutive and inducible forms of NF-kappaB. Mol. Cell. Biol 10:1498-1506. Dechend, R., Hirano, F., Lehmann, K., Heissmeyer, V., Ansieau, S., Wulczyn, F. G., Scheidereit, C., Leitz, A. 1999. The Bcl-3 oncoprotein acts as a bridging factor between NF-kB/Rel and nuclear co-regulators. Oncogene 18:3316–23. Dejardin, E., Droin, N. M., Delhase, M., Haas, E., Cao, Y., Makris, C., Li, Z. W., Karin, M., Ware, C. F., Green, D. R. 2002. The lymphotoxin-β receptor induces different patterns of gene expression via two NF-κB pathways. Immunity 17:525-535. Delhase, M., Hayakawa, M., Chen, Y., Karin, M. 1999. Positive and negative regulation of IκB kinase activity through IKK_ subunit phosphorylation. Science 284:309–313. DiDonato, J. A., Mercurio, F., Karin, M. 1995. Phosphorylation of I kappa B alpha precedes but is not sufficient for its dissociation from NF-kappa B. Mol. Cell. Biol 15:1302-1311. Doi, T. S., Takahashi, T., Taguchi, O., Azuma, T., Obata, Y. 1997. NF-kapa B Rel A-deficient lymphocytes: normal development of T cells ad B cells, impaired production of IgA and IgG1 an reduced proliferative responses. J Exp Med 185(5):953-61. Döffinger, R., Smahi, A., Bessia, C., Geissmann, F., Feinberg, J., Durandy, A., Bodemer, C., Kenwrick, S., Dupuis-Girod, S., Blanche, S., Wood, P., Rabia, S. H., Headon, D. J., Overbeek, P. A., Le Deist, F., Holland, S. M., Belani, K., Kumararatne, D. S., Fischer, A., Shapiro, R., Conley, M. E., Reimund, E., Kalhoff, H., Abinun, M., Munnich, A., Israël, A., Courtois, G., Casanova, J. L. 2001. X-linked anhidrotic
65
7. Seznam použité literatury ectodermal dysplasia with immunodeficiency is caused by impaired NF-kB signaling. Nat Genet 27:277–85. Duran, A., Diaz-Meco, M. T., Moscat, J. 2003. Essential role of RelA Ser311 phosphorylation by zetaPKC in NF-κB transcriptional activation. EMBO J 22:3910-3918. Durand, C., Dzierzak, E. 2005. Embryonic beginnings of adult hematopoietic stem cells. Haematologica 90:100-108. Franzoso, G., Carlson, L., Xing, L., Poljak, L., Shores, E. W., Brown, K. D., Leonardi, A., Tran, T., Boyce, B. F., Siebenlist, U. 1997. Requirement of NF-kappaB in osteoclast and B-cell development. Genes Dev 11(24):3482-96. Ebner, K., Bandion, A., Binder, B. R., de Martin, R., Schmid, J. A. 2003. GMCSF activates NF-kappaB via direct interaction of the GMCSF receptor with IkappaB kinase beta. Blood 102: 192–199. Finnin, M. S., Donigian, J. R., Cohen, A., Richon, V. M., Rifkind, R. A., Marks, P. A., Breslow, R., Pavletich, N. P. 1999. Structures of a histone deacetylase homologue bound to the TSA and SAHA inhibitor. Nature 401(6749):188-93. Francis, D. A., Sen, R., Rice, N., Rothstein, T. 1998. Receptor-specific induction of NF-kappaB components in primary B cells. Int Immunol 10(3):285-93. Franzoso, G., Carlson, L., Xing, L., Poljak, L., Shores, E. W., Brown, K. D., Leonardi, A., Tran, T., Boyce, B. F., Siebenlist, U. 1997. Requirement for NF-κB in osteoclast and B-cell development. Genes Dev 11:3482–3496. Fu, S. L., Lipsick, J. S. 1997. Constitutive expression of full-length c-Myb transforms avian cells characteristic of both the monocytic and granulocytic lineages. Cell Growth Differ 8:35–45. Furia, B., Deng, L., Wu, K., Baylo, S., Kehn, K., Li, H., Donnelly, R., Coleman, T., Kashanchi, F. 2002. Enhancement of nuclear factor-κB acetylation by coactivator p300 and HIV-1 Tat proteins. J Biol Chem 277:4973-4980. Gerondakis, S., Strasser, A., Metcalf, D., Grigoriadis, G., Scheerlink, J.-P. Y., Grumont, R. J. 1996. Rel deficient T cells exhibit defects in the production of interleukin-3 and granulocyte-macrophage colony stimulating factor. Proc. Natl Acad. Sci. USA 93:34053409. Gerondakis, S., Grossmann, M., Nakamura, Y., Pohl, T., Grumont, R. 1999. Genetic approaches in mice to understand Rel/NF-kappaB and IkappaB function: transgenics and knockouts. Oncogene 18: 6888–6895. Ghosh, S., Karin, M. 2002. Missing pieces in the NF-κB puzzle. Cell 109 Suppl:S81-S96. 66
7. Seznam použité literatury Ghosh, S., May, M. J., Kopp, E. B. 1998. NF-κB and Rel proteins: Evolutionarily conserved mediators of immune responses. Annu. Rev. Immunol. 16: 225–260. Godin, I., Cumano, A. 2005. Of birds and mice: hematopoietic stem cell development. International Journal of Developmental Biology 49: 251-257 Gonda, T. J, Buckmaster, C., Ramsay, R. G. 1989. Activation of c-myb by carboxyterminal truncation: relationship to transformation of murine haemopoietic cells in vitro. EMBO J 8:1777–83. Gordon, S. 1995. The macrophage. BioEssays 17:977-986. Greene, W. C., Chen, L. F. 2004. Regulation of NF-κB action by reversible acetylation. Novartis Found Symp 259:208-217. Griffin, G. E., Leung, K., Folks, T. M., Kunkel, S., Nabel, G. J. 1991. Induction of NF-kappa B during monocyte differentiation is associated with activation of HIV-gene expression. Res Virol 142(2-3):233-8. Grigoriadis, G., Zhan, Y., Grumont, R. J., Metcalf, D., Handman, E., Cheers, C., Gerondakis, S. 1996. The Rel subunit of NF-kappaB-like transcription factors is a positive and negative regulator of macrophage gene expression: distinct roles for Rel in different macrophage populations. EMBO J 15(24):7099-107 Grumont, R. J., Gerondakis, S. 1990. The murine c-rel protooncogene encodes two mRNAs the expression of which is modulated by lymphoid stimuli. Oncogene Res 5:245-254. Guo, M., Sahni, S. K., Sahni, A., Francis, C. W. 2004. Fibrinogen regulates the expression of inflammatory chemokines through NF-κB activation of endothelial cells. Thromb Haemost. 92: 858-866. Hatada, E. N., Nieters, A., Wulczyn, F. G., Naumann, M., Meyer, R., Nucifora, G., McKeithan, T. W., Scheidereit, C. 1992. The ankyrin repeat domains of the NF-kappa B precursr p105 and the protooncogene bcl-3 act as specific inhibitors of NF-kappa B DNA binding. Proc Natl Acad Sci USA. 89(6):2489-93. Hayden, M. S., Ghosh, S. 2004. Signaling to NF-kappaB. Genes Dev 18(18):2195-224. Henkel, T., Zabel, U., van Zee, K., Muller, J. M., Fanning, E., Baeuerle, P. A. 1992. Intramolecular masking of the nuclear location signal and dimerization domain in the precursor for the p50 NF-kappa B subunit. Cell. 68(6):1121-33. Hsu, L. C., Park, J. M., Zhang, K., Luo, J. L., Maeda, S., Kaufman, R. J., Eckmann, L., Guiney, D. G., Karin, M. 2004. The protein kinase PKR is required for macrophage apoptosis after activation of Toll-like receptor 4. Nature 428:341–345.
67
7. Seznam použité literatury Hu, J., Nakano, H., Sakurai, H., Colburn, N. H. 2004. Insufficient p65 phosphorylation at S536 specifically contributes to the lack of NF-κB activation and transformation in resistant JB6 cells. Carcinogenesis 25:1991-2003. Hu, Y., Baud, V., Delhase, M., Zhang, P., Deerinck, T., Ellisman, M., Johnson, R., Karin, M. 1999. Abnormal morphogenesis but intact IKK activation in mice lacking the IKKα subunit of IκB kinase. Science 284:316–320. Huang, T. T., Kudo, N., Yoshida, M., Miyamoto, S. 2000. A nuclear export signal in the N-terminal regulatory domain of IkappaBalpha controls cytoplasmic localization of inactive NFkappaB/IkappaBalpha complexes. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 97, 10141019. Iotsova, V., Caamano, J., Loy, J., Yang, Y., Lewin, A., Bravo, R.. 1997. Osteopetrosis in mice lacking NF-κB1 and NF-κB2. Nat. Med 3:1285–1289. Israel, A. 2000. The IKK complex: an integrator of all signals that activate NF-κB? Trends Cell Biol 10:129-133. Javelaud, D., Wietzerbin, J., Delattre, O., Besancon, F. 2000. Induction of p21Waf1/Cip 1 by TNFalpha requires NF-kappaB activity and antagonizes apoptosis in Ewing tumor cells. Oncogene. 19(1):61-8. Jimi, E., Ghosh, S. 2005. Role of nuclear factor-kappaB in the immune system and bone. Immunol Rev. 208:80-7. Kang, J. L., Lee, H. S., Pack, I.S ., Hur, K. C., Castranova, V. 2003. Phosphoinositide 3-kinase activity leads to silica-induced NF-κB activation through interacting with tyrosine-phosphorylated I(κ)B-α and contributing to tyrosine phosphorylation of p65 NFκB. Mol Cell Biochem 248:17-24. Karin, M. 1999. How NF-kB is activated: the role of the IkB kinase (IKK) complex. Oncogene 18, 6867–6874. Karin, M., Ben-Neriah, Y. 2000. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity. Annu Rev Immunol. 18:621-63. Kiernan, R., Bres, V., Ng, R. W., Coudart, M. P., El Messaoudi, S., Sardet, C., Jin, D. Y., Emiliani, S., Benkirane, M. 2003. Post-activation turn-off of NF-κB-dependent transcription is regulated by acetylation of p65. J Biol Chem 278:2758-2766. Kikkawa, U., Kishimoto, A., Nishizuka, Y. 1989. The protein kinase C family: heterogenity and its implications. Annu. Rev. Biochem 58: 31-44. Kontgen, F., Grumont, R. J., Strasser, A., Metcalf, D., Li, R., Tarlington, D., Gerondakis, S. 1995. Mice lacking the c-rel proto-oncogene exhibit defects in 68
7. Seznam použité literatury lymphocyte proliferation, humoral immunity, and interleukin-2 expression. Genes Dev 9:1965-1977. Lawrence, T., Bebien, M., Liu, G. Y., Nizet, V., Karin, M. 2005. IKKalpha limits macrophage NF-kappaB activation and contributes to the resolution of inflammation. Nature 434: 1138–1143. Le Bail, O., Schmidt-Ullrich, R., Israel, A. 1993. Promoter analysis of the gene encoding the I kappa B-alpha/MAD3 inhibitor of NF-kappa B: positive regulation by members of the rel/F-kappa B family. EMBO J 12(13):5043-9. Lee, S. H., Hannink, M. 2002. Characterization of the nuclear import and export functions of Ik B(e). J Biol Chem 22:22. Lee, S., Hong, J., Choi, S. Y., Oh, S. B., Park, K., Kim, J. S., Karin, M., Lee, S. J. 2004. CpG oligodeoxynucleotides induce expression of proinflammatory cytokines and chemokines in astrocytes: the role of c-Jun N-terminal kinase in CpG ODN-mediated NFκB activation. J Neuroimmunol 153:50-63. Lenardo, M. J., Fan, C. M., Maniatis, T., Baltimore, D. 1989. The involvement of NF-KB in interferon gene regulation reveals its role as widely inducible mediator of signal transduction. Cell 57:287-294. Lernbecher, T., Muller, U., Wirth, T. 1993. Distinct NF-kappa B/Rel transcription factors are
responsible
for
tissue-specific
and
inducible
gene
activation.
Nature
365(6448):767-70. Li, Q., Lu, Q., Bottero, V., Estepa, G., Morrison, L., Mercurio, F., Verma, I. M. 2005. Enhanced NF-\{kappa\}B activation and cellular function in macrophages lacking I\{kappa\}B kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 12425–12430. Liao, G., Sun, S. C. 2003. Regulation of NF-κB2/p100 processing by its nuclear shuttling. Oncogene. 22:4868-4874. Liebermann, T. A., Baltimore, D. 1990. Activation of interleukin-6 gene expression through the NF-cB transcription factor. Mol. Cell. Biol 10:2327-2334. Liou, H. C., Sha, W. C., Scott, M. L., Baltimore, D. 1994. Sequential induction of NF-kappaB/Rel family proteins during B cell terminal differentiation. Mol. Cell. Biol., 14:5349-5359. Liou, H. C. 2002. Regulation of the immune system by NF-κB and IκB. J Biochem Mol Biol 35:537-546. Lipsick, J. S. 1996. One billion years of Myb. Oncogene. 13(2):223-35. Lipsick, J. S., Wang, D. M. 1999. Transformation by v-Myb. Oncogene 18(19):3047-55. 69
7. Seznam použité literatury Malek, S., Chen, Y., Huxford, T., Ghosh, G. 2001. IkappaBbeta, but not IkappaBalpha, functions as a classical cytoplasmic inhibitor of NF-kappaB dimers by masking both NFkappaB nuclear localization sequences in resting cells. J.Biol. Chem 276, 45225-45235. Matsushima, A., Kaisho, T., Rennert, P. D., Nakano, H., Kurosawa, K., Uchida, D., Takeda, K., Akira, S., Matsumoto, M. 2001. Essential role of nuclear factor (NF)-κB-inducing kinase and inhibitor of κB (IκB) kinase alpha in NF-κB activation through lymphotoxin beta receptor, but not through tumor necrosis factor receptor I. J Exp Med 193:631–636. May, M. J., Ghosh, S. 1997. Rel/NF-kappa B and I kappa B proteins: an overview. Semin Cancer Biol 8:63–73. Minucci, S., Nervi, C., Lo Coco, F., Pelicci, P. G. 2001. Histone deacetylases: a common molecular target for differentiation treatment of acute myeloid leukemias? Oncogene 20(24):3110-5. Moscovici, C., Zeller, N., Moscovici, M. G. 1982. Continuous lines of AMV-transformed nonproducer cells: growth and oncogenic potential in the chick embryo. In: Revoltella, R.F., Basilico, C., Gallo, R.C., Pontieri, G.M., Rovera, G., Subak-Sharpe, J.H. (eds.): Expression of differentiated function in cancer cells. Raven Press: 325-449. Muller, J. M., Ziegler-Heitbrock, H. W. L., Bauerle, P. A. 1993. Nuclear factor kappa B, a mediator of lipopolysaccharide effcts. Immunobiology 187:233-256 Nemajerova, A., Smarda, J., Jurdic, P., Kubala, L., Soucek, K., Smardova, J. 2003. Trichostatin A suppresses transformation by the v-myb oncogene in BM2 cells. J Hematother Stem Cell Res 12:225–35. Okazaki, T., Sakon, S., Sasazuki, T., Sakurai, H., Doi, T., Yagita, H., Okumura, K., Nakano, H. 2003. Phosphorylation of serine 276 is essential for p65 NF-κB subunitdependent cellular responses. Biochem Biophys Res Commun 300:807-812. Olashaw, N. E. 1996. Inducible activation of RelB in fibroblasts. J Biol Chem 271(48):30307-10. Pennington, K. N., Taylor, J. A., Bren, G. D., Paya, C. V. 2001. IkappaB kinasedependent chronic activation of NF-kappaB is necessary for p21(WAF1/Cip1) inhibition of differentiation-induced apoptosis of monocytes. Mol Cell Biol 21:1930–1941. Perkins, N. D., Schmid, R. M., Duckett, C. S., Leung, K., Rice, N. R., Nabel, G. J. 1992. Distinct combinations of NF-KB subunits determine the specificity of transcriptional activation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1529-1533.
70
7. Seznam použité literatury Pettit, A. R., Quinn, C., MacDonald, K. P., Cavanagh, L. L., Thmas, G., Townsend, W., Handel, M., Thomas, R. 1997. Nuclear localization of RelB is associated with effective antigen-presenting cell function. J Immunol 159(8):3681-91. Pfaffl, M. W. 2001. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res 29(9):45. Pikarsky, E., Porat, R. M., Stein, I., Abramovitch, R., Amit, S., Kasem, S., GutkovichPyest, E., Urieli-Shoval, S., Galun, E., Ben-Neriah, Y. 2004. NF-κB functions as a tumour promoter in inflammation-associated cancer. Nature 431:461-466. Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. 2005. Regulation of NF-κB2 p100 processing by its cis-acting domain. J Biol Chem 280:18-27. Quivy, V., Van Lint, C. 2004. Regulation at multiple levels of NF-κBmediated transactivation by protein acetylation. Biochem Pharmacol 68:1221-1229. Rahman, I., Gilmour, P. S., Jimenez, L. A., MacNee, W. 2002. Oxidative stress and TNF-α induce histone acetylation and NF-κB/AP-1 activation in alveolar epithelial cells: potential mechanism in gene transcription in lung inflammation. Mol Cell Biochem 234235:239-248. Rahman, I., Marwick, J., Kirkham, P. 2004. Redox modulation of chromatin remodeling: impact on histone acetylation and deacetylation, NF-κB and pro-inflammatory gene expression. Biochem Pharmacol 68:1255-1267. Ramakrishnan, P., Wang, W., Wallach, D. 2004. Receptor-specific signaling for both the alternative and the canonical NF-κB activation pathways by NF-κB-inducing kinase. Immunity 21:477-489. Rudolph, D., Yeh, W. C., Wakeham, A., Rudolph, B., Nallainathan, D., Potter, J., Elia, A. J., Mak, T. W. 2000. Severe liver degeneration and lack of NF-kB activation in NEMO/IKKgammadeficient mice. Genes Dev 14:854–62. Sen, R., Baltimore, D. 1986. Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer sequences. Cell 46(5):705-16. Senftleben, U., Cao, Y., Xiao, G., Greten, F. R., Krahn, G., Bonizzi, G., Chen, Y., Hu, Y., Fong, A., Sun, S. C., Karin, M. 2001. Activation by IKKα of a second, evolutionary conserved, NF-κB signaling pathway. Science 293:1495–1499. Senftleben, U., Karin, M. 2002. The IKK/NF-kappaB pathway. Crit Care Med 30:18-26. Silverman, N., Maniatis, T. 2001. NF-κB signaling pathways in mammalian and insect innate immunity. Genes & Dev 15: 2321–2342.
71
7. Seznam použité literatury Smahi, A., Courtois, G., Vabres, P., Yamaoka, S., Heuertz, S., Munnich, A., Israël, A., Heiss, N. S., Klauck, S. M., Kioschis, P., Wiemann, S., Poustka, A., Esposito, T., Bardaro, T., Gianfrancesco, F., Ciccodicola, A., D'Urso, M., Woffendin, H., Jakins, T., Donnai, D., Stewart, H., Kenwrick, S. J., Aradhya, S., Yamagata, T., Levy, M., Lewis, R. A., Nelson, D. L. 2000. Genomic rearrangement in NEMO impairs NF-kB activation and is a cause of incontinentia pigmenti. The International Incontinentia Pigmenti (IP) Consortium. Nature 405:466–72. Smith, C. M. D. 2003: Hematopoietic stem cells and hematopoiesis. Cancer control 10: 9-16 Solan, N. J., Miyoshi, H., Carmona, E. M., Bren, G. D., Paya, C. V. 2002. RelB cellular regulation and transcriptional activity are regulated by p100. J. Biol. Chem. 277, 14051418. Strair, R. K., Schaar, D., Goodell, L., Aisner, J., Chin, K. V., Eid, J., Senzon, R., Cui, X. X., Han, Z. T., Knox, B., Rabson, A. B., Chang, R., Conney, A. 2002. Administration of a phorbol ester to patients with hematological malignancies: preliminary results from a phase I clinical trial of 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate. Clin Cancer Res 8:2512–8. Suhasini, M., Pilz, R. B. 1999. Transcriptional elongation of c-myb i regulated by NF-kappaB (p50/RelB). Oncogene 18(51):7360-9. Symonds, G., Klempnauer, K. H., Evan, G. I., Bishop, J. M. 1984. Induced differentiation of avian myeloblastosis virus-transformed myeloblasts: Phenotypic alternation without altered expression of the viral oncogene. Molecular and Cellular Biology. 4: 2587-2593 Šmarda, J., Lipsick, J. S. 1994. c-Myb prevents TPA-induced differentiation and cell death in v-Myb transformed monoblast. Oncogene 9(1):237-45. Tam, W. F., Sen, R. 2001. IkB family members function by different mechanisms. J Biol Chem 276:7701–4. Vermeulen, L., De Wilde, G., Van Damme, P., Vanden Berghe, W., Haegeman, G. 2003. Transcriptional activation of the NF-κB p65 subunit by mitogen- and stress-activated protein kinase-1 (MSK1). EMBO J 22:1313-1324. Viatour, P., Merville, M. P., Bours, V., Chariot, A. 2005. Phosphorylation of NFkB and IkB proteins: implications in cancer and inflammation. Trends Biochem Sci 30:43–52 Weih, F., Carrasco, D., Bravo, R. 1994. Constitutive and inducible Rel/NF-kappa B activities in mouse thymus and spleen. Oncogene 9(11):3289-97. Weih, F., Durham, S. K., Barton, D. S., Sha, W. C., Baltimore, D., Bravo, R. 1997. p50-NF-_B complexes partially compensate for the absence of RelB: severely increased pathology in p50_/_ relB_/_ double-knockout mice. J. Exp. Med. 185:1359–1370. 72
7. Seznam použité literatury Whiteside, S. T., Israel, A. 1997. IκB proteins: structure, function and regulation. Semin. Cancer Biol. 8: 75–82. Wilson, S. J., Wallin, A., Della-Cioppa, G., Sandstrom, T., Holgate, S. T. 2001. Effects of budesonide and formoterol on NF-κB, adhesion molecules, and cytokines in asthma. Am J Respir Crit Care Med 164:1047-1052. Yamamoto, Y., Gaynor, R. B. 2001. potential of inhibition of the NfkappaB pathway in the treatment of inflammation and cancer. J. Clin. Invest. 107: 135-142. Yamamoto, Y., Gaynor, R. B. 2004. IkappaB kinases: key regulators of the NF-kappaB pathway. Trends Biochem. Sci. 29: 72-79. Yoshida, M., Kijima, M., Akita, M., Beppu, T. 1990. Potent and specific inhibition Therapeutic of mammalian histone deacetyase oth in vivo and in vitro by trichostatin A. J Biol Chem. 265(28):17174-9 Yoshimura, S., Bondeson, J., Foxwell, B. M., Brennan, F. M., Feldmann, M. 2001. Effective antigen presentation by dendritic cells is NF-κB dependent: coordinate regulation of MHC, co-stimulatory molecules and cytokines. Int Immunol. 13:675-683. Zhong, H., May, M. J., Jimi, E., Ghosh, S. 2002. The phosphorylation status of nuclear NF-κB determines its association with CBP/p300 or HDAC-1. Mol Cell 9:625-636. Zhong, H., SuYang, H., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Ghosh, S. 1997. The transcriptional activity of NF-κB is regulated by the IκB-associated PKAc subunit through a cyclic AMP-independent mechanism. Cell 89:413-424. Ziegler-Heitbrock, H. W. L., Sternsdorf, T., Liese, J., Belohradsky, B., Weber, C., Wedel, A., Schreck, R., Bauerle, P., Strobel, M. 1993. Pyrrolidine dithiocarbamate inhibits NF-KB mobilization and TNF production in human monocytes. J. Immunol 151:6986-6993.
73
