K"OLONLENYOMAT A
Pneumonologia Hungarica C. FOLYOIRATBOL
r
t. ,;
Pneumcnol
sgfa Hungarica
(Tuberkulozis
es ttidobetegsegek)
XL. 83-88. 1987.
Orszaqos Koranyi TEC es Pulmonoloqiai Lruezet (joigazgato f6or'vos: Schu eiqer Ouo dr.) kozlemenye
Szerum theophyllin-szint meghatarozas HPLC es RIA m6dszerekkel lrta: S Z ElT Z AND R A s, J A K A BAG N E S, DEBRECZENI LOr"AND DR.
A klinikai gyakorlatban igen fontos az effektiv terapiat biztosit6 szerum theophyllin-ssintmonitorozasa, mivel legalabb 10 mgjl koncentracio szukseges a terapias szerumszint kialakitasahoz, Ugyanakkor, a theophyllin az ugynevezett "szuk terapias ablaku" szerek koze tartozik, mert nem-kivanatos (toxikus) mellekhatasai mar 20 mgjl szerum koncentracional megjelenhetnek. Az irodalomban szamos m6dszerrel talalkozunk a szerum theohpyllin-szint meghatarozasara. Klinikai-farmakol6giai celra a HPLC es aRIA eljarasokat reszesitik elOnyben, mig rutin feladatok megoldasara kulonbozo spektrofotometrias m6dszereket hasznalnak. Ujabban az AccuLevel™- Theophylline Test (Syntex Medical Diagnostics, Division of Syva, Palo Alto, California, USA) gyorstesztet javasoljak, mellyel percek alatt meghatarozhato a szerum theophyllin koncentracio. Elsosorban hazaivegyszeres merestechnikai lehetosegekre alapozva modosi: tottak Adams es mtsai [1] HPLC-re kidolgozott modszeret es meresi eredme" nyeiket a Clinical Assay 125I-theophylline Kit, Radio Immuno Assay eredme" nyeivel hasonHtottuk ossze. M6dszer A vizsgalatok soran 39 human verrninta theophyllin-szintjet,hasonHtottak OS8zeHPLC es RIA eljarasokkal. A vermintakat olyan betegekb61 nyertek, akik THEOPHTARD® (Biogal, Debrecen) nyujtotthatesu theophyllin keszftmenyt kaptak (2 X 1 tabl., 1 tabIetta = 300 mg theophyllin). HPLC-meres,' A vel' alakos elemeitol centrifugalassal (2500/perc, 20 perc) elktilonitets szerum 240 pl-ehez 10 pi cc. HCV:at adtak es az elegyet jol osszeraztak, A theophyllint szerves oldoszerbe raztak at: 4,0 mlkloroform: i-propil-alkohol, 20 : 1, majd 30 masodperces keveres kovetkezett, Vortex mixeren. A 4,0 ml razokeverekbe el6zaleg 5 pg 8-CI-theophyllin belso standardot adtak. A keveres utan a szerves fazis 2,0 ml-et beparoltak, a maradekot 125 III abszolut metanolban vettek fel es 20 Ill-t vittek HPLC meghatarozasra. Bereridezes : Labor MIM HPLC Model 2010, oszlop : hossz: 250 mm, belso atmer6: 4 mm; toltet: Lichrosorb® RP-I8, szemcsemeret.: 7 ura, szobahdmersekletfi ; eluens: 10 resz acetonitril10 resz metanol - 80 resz foszfat puffer (1/15 M KH2P04 + +1/15 M Na2HP04) pH 4,85; aramlasi sebessegr, 1 ml/pere, erzekeles 273 nm-nel, 0,1 A; rekorder 1 mV, papfrsebesseg : 1 cm/perc [1]. RIA-meghatarozas',' 0,1 ml standardoldatot 0,1 ml125i-dal jelzett theophyllin-oldattal elegyitettek es a keverekot jol osszeraztdk. Hozzaadt.ak az anti-theophyllin-oldatot (0,1 ml}, melyet. keveres es 20 perces, 37 cC-on torten6 inkubalas kovetet.t, A kotott es szabad aktivitast 1,0 ml precipitalo antiszerummal kulomtettek el. A kemcsoveket 2500/perc fordulaton, 30 percig centrifugaltdk. A feluluszo fazist. eltavolitot.te.k es a esapadek radioaktivitesat a Gamma gyar MK 350/B automata mintavaltojaval egy beepitett gamma-szamldlon mertek. Vizsgalataik soran a Clinical Assay 125I-theophylline Kit-tel dolgoitak. ,
83
2
3
4
j 1: 20 )J9/ml
Theobromin Theophyllin 8~CI-Theophyllin Koffein
2:: 20 )J9/ml 3:: 20 )J9/ml 4:: 20 ,ug/ml 1. abm. Xantin
amaloqok eloalasztasa HP
La
eljarassal
AREA Th/8-CI-Th
•
I 1,25+
Q5
J,25
y ::OP12 (~o,017).0,049 (~0,OO14)x n=ll;
o 2. abra. Kalibracios
qorbe (T h
5
10·
r=0,9981
15
20
)..Jg
ml-1 Th
= T heophtardJ5J, 8-Ol- Th = 8-0l-theophyllin,
belso standard ) '.,"
84
" .... '
o
....~
.
~. 0. •••: •••••••
y-min=O,149 x -mme S
y-max=1,2 x-rT'ox= 20
3. abra. 22 alkalommal, 4 koncentraci6-enek (5-10-15-20 mg· L _1) 3 paraLLelatlagab6l ·szamitott theophyUin kalibraci6s gorbe : Y= -0.0209 (±0.0132) 0.0502 (±0.0009)x, ahol az x-tengely a theophymn koncentraci6kat az y-tengely pedig az extinkci6s ertekeket jelOli. Aregresszi6 vaMdi (Fr(1.86)=2683), laz egyes koncentraci6khoz tartoz6 extinkci6sertekek killOnboznek I(Fk(3,84)=884),es a regresszi6 va16ban egyenes (FY(2,w=0.5314). A pontozott gorbe a regresszi6s egyenes 95%-os konfidencia intervallumat jeUHi.
+
st 12 Max=0,232V T0=W
Min=0,0128V T=3,906
n=800
.:'-;2
•
\ ..
•
4. abra. HPLC kromatogram ertekelese ZX Spectrum+hobby szcimitogeppel. Az cibran ldthat6, hogy a jeszilltsegtartomciny '1).0128 - 0.232 V kozott vciltozik. Az 5 perces meresi idotartam aiatt n=800 alkalommal tortent mintavetelezes. Az anaUzisre kijelOlt szakasz (ido-ablak) T=3.906 perc volt. Az I-el .jeloU csacs az ismeretlen theophyllin-t, ,a 2-es a 20mg. L-1 8-Cl-theophyHin (belso standard) mennyiseget jelOU. Csucsmagasagok: 1=0.149V, 2=0.235V. Csucs alatti teriitetek: 1=0.0369, 2=0.0805. Retenci6s idok: 1=0.543 perc, 2=3.224 perc. A cstlcsok idotartama: 1=0.708 perc, 2=0.932 perc. lA csucsok jerdesege: 1=0.835, 2=1.031. A bels6 standartlhoz hasonlitva az ismeretlen theophyllin csscs alatti terillete: 45,9%.
Ertekelis: Alkalmazott HPLC m6dszeriikkel a xantin-anal6gokat j6l elvalasztot.t.ak, ahol az egyes vegyiiletek retenci6s idoaranya a 8-Cl-theophyllinhez kopest a kovetkezo volt: theobromin 0,52, theophyllin 0,76, koffein 1,37 (1. abra ), A kromatogram csucsait terirletarany becslessel ertekeltek ki. Ennek soran a szerurnban merb theophyllm-csucs teriiletet vonatkoztattak a belso standardkent hasznalt. 8-Cl-theophyllin csucsanak teriiletere. A kalibracios gorbeket a 2. es 3. dbrdk mutabjak. A m6dszer erzekenysege - 3 paralel merest vegezve - kb. 0,5 mgfl volt.
85
RIA pq/mt 20
o
15
10
o
0
0
0
00 0 0 0
00 0
0
0 0
0
0
5 o
Y=0,402(!0,71)+
0,944 (! 0,071) x
r = 0,9085
n =39
~-----+------+-----~------~----~HPLC
O
5. abra. RIA-H
10
PLC theophyllin
15
20
meqhauirozas
Ilg/ml
osszejuggese
A kromatogram csucsainak ertekelese meglehet6sen idoigenyes feladat, ezert erre a celra egy programcsomagot fejlesztettek ki, egy ZX Spectrum +48 K hobby szamftogepre, A program alakfelismeresi algoritmusokat tartalmaz a osucsok megkeresesere, figyelembe veve az alapvonal drift jet, a zajt stb. Ezutan meghatarozza a csucsokhoz tartoz6 ertekeket : startpont, csucsmagassag, csucs alatti teriilet, retenci6s id6, a csucs ferdesege (skewness). A program ban kijelolheto a bels6 standard csucsa, melynek csucs-alatbi teruletet egybevethetjiik az ismeretlen esucs-alattd teriilettel. Egy ilyen ertekelest mutat be a 4, abra. ARIA eredmenyeket a Scatchard-fuggveny linearizalt szakaszarol, mint kalibracios egyenesr6l olvastak le, A m6dszer erzekenysege kb. 0,3mg/1 theophyllin, reprodukalhatosaga 90-100% volt. ARIA specificitasa theophyllinre es aminophyllinre 100% volt. A kalibracios gorbek szamitasanal a csoportositott regresszi6s analizis modszeret alkalrnaztak. A regresszi6s egyenes szamitdsakor rneghatarozbak az interceptet (a), az intercept hibajat (Sa), a regresszios koefficienst (b) es a regresszi6s koefficiens hibajat (Sb). Vizsgliltak tovabba, hogy az egyes standard d6zisok meresekor a kromatogram csucs-teruletek elternek-e egymastol, es megallapitot.tdk a regresszi6s egyenes Iinearitasat is [4].
Eredmenyek Meghataroztak az extrakciohatasfokat, Fiziologias NaCI oldathoz es gy6gyszermentes human szerumhoz azonos mennyisegfi standard theophyllin-oldatot adtak es a visszamert koncentraeiokat osszehasonlitottak. fgy az extrakci6 merteke atlagosan 99,61%-nak ad6dott es a fiziologias NaCl oldatbol es a szerumbol visszamert konoentraciok kozott szignifikans ktilonbseg nem volt (p >0,05). Eredmenyeiket az 5. abran lathatjuk. A regresszi6s egyenlet Y = 0,402 (±0,71) + 0,944 (± 0,071)X volt, ahol Y =RIA meresi eredmenyek, X=HPLC meresi eredmenyek. Ebbdl lathato, hogy aRIA m6dszer atlagosan 0,402 mg/IreI mert magasabb ertekeket, mint a HPLC. 86
/
M eqbeezelee Mas kutat6k [8J EM IT (Enzyme Multiplied Immunoassay Technique), FP lA (Fluorescent Polarisation Immunoassay), SLF lA (Substrate Labeled Fluorescent Immunoassay) es NIIA (Nephelometric Immunoassay) metodikakkal vegzett theophyillin szerum-szint mereseket hasonlitottak ossze HPLC meghatarozaaokkal. Eredmenyeiket az I. tablazaton lathatjuk, Itt a regresszi6s koefficiensek 0,90 es 1,31 kozott valtoztak. Jelen szerzok mereseinel a regresszi6s koefficiens 0,944 volt, igy a ket meresi elrendezes kozel azonos specifitasra utal. A regresszi6s egyenletekben szereplo interceptek az I. tablazatban lathatoak, ahol az interceptek ertekei ( - 2,63) es 1,39 kozott valtoznak, ugyanakkor az intercept erteke sajat mereseiknel 0,402 volt. Ez a korulmeny arra utal, hogy a rendelkezesukre a116HPLC kesztilek (Labor MIM Model 2010) I. tabtcza: Beteqek theophyUin verszintjeinek osszehasoniito vizsgillata HPLC is kUlonbOzo lmmuno Assay techniMkkal (OeUerich es mtsai 1982) x = fiiggetlen valtozo, y = fiiggo valtozo, A regresszi6s egyenletet az Y = a + bx jeloli, n = adatparok szama, r = korrelacios koefficiens M6dszer y EMIT& EMITb SLFIAc SLFIAd NIIA NIIA FPIA FPIA EMITe FPIA SLFIAf NIIA RIAg
x
vs vs vs vs vs vs vs vs vs vs vs vs vs
HPLC HPLC HPLC' EMITa HPLC EMITa HPLC EMITa HPLC HPLC HPLC HPLC HPLC
n
b
a '
120 38 43 43 35 51 73 94 27 23 15 11 39
0,97
-0,10 -1,19 -1,26 0,06 0,60 0,79 -0,01 -0,03 0,69 1,39 -0,57 -2,63 0,402
I,ll
1,12 1,00 0,93 0,94 1,00 1,08 0,90 0,87 1,28 1,31 0,94
r 0,98 0,97 0,98 0,94 0,96 0,95 0,99 0,94 0,98 0,99 0,91 0,93 0,9085
a Eppendorf ACP 5040 EMIT-vizsgalat b Eredeti EMIT-vizsga1at, EMIT/LAB Systemen elvegezve c charge: 9 008 032 d charge: 2021 e Eppendorf Enzymautomata 5010 keszuleken vegzett EMIT-vizsgalat lAmes Fluorostat System-en vegzett SLFIA-vizsgalat g sajat meresek
ea az alkalmazott
metodika megkozelitoen azonos erzekenysegfi a Clinical Assay 125I-theophylline Kit RIA modszerrel es az adatok a klinikumban j6l hasznosithat6ak. Egy atfogobb vizsgalat soran [2J 29 korhaz laboratoriumanak Euphyllin merestechnikai keszsege kerlilt osszehasonlitasra. A laborat6riumokba kuldott 86 mintabol 24 az elfogadhat6 hibahataron kivtil volt. Ez az adat ovatossagra int es igazolja a tobbszori ismetelt meghatarozas jelentdseget. Kulonosen veszeIyes, ha a szerum theophyllin-szinteket alabeesuljuk, mivel a theophyllin eliminacio nem linearis kinetikai tulajdonsagai miatt mar kis merteku dozisemeles is jelentos szerum koncentracio valtozast eredmenyezhet. Celszerfi, ha a theophyl87
linmereseket egy szisztemas hibaval dolgoz6 laborat6riumban vegezzuk. Megfelelf terapias szint biztositasa indokolja az individualis farmakokinetikai vizsgalatokat., melyek kulonosen az ambulans betegek szamara megterheloek. Ezert szamos szamit6gepes farmakokinetikai programot dolgoztak ki, melyek oktat6program formajaban mar zsebszamologepen is (Texas Instruments Mod. 59) futtathat6ak. Egy szamltogepes program segitsegevel [3] a beteg sulya, eletkora, korelozmenyei, az alkalmazott gy6gyszer d6zisa es nehany konstans megadasaval a kulonfele idd-Intervallumokban meghatarozhatoak a varhato szerumszintek, es a napi adagolasok szamat61 fuggoen megallapithat6 valamely tetszoleges idopontban a theophyllin szerumkoncentracio. Kivanatos lenne hasonl6 programok hazai elterjedese is: N aszlady [7] sajat fejlesztesu Diana programjat ajanlja erre a celra. Theophyllin szerummeghatarozasokat vegezhetunk fluorimeirtas [6], vagy spektrofotometrias [5] eljarasokkal is. K oszonetnyilvanitas K5sz5netiinket
fejezziik ki Nagy 'I'amas assziszt.ens kolleganknak
az abrak elkeszf-
teseert.
(jsszejoglalas Magyar vegyszerekkel es HPLC berendezessel szerum theophyllin-szint mereseket vegeztek, human mintakbol. A meresi eredmenyeket osszehasonlitottak aRIA m6dszer (Clinical Assay 125I-theophylline Kit) meresi eredmenyeivel. A HPLC eljaras megkozelitcen azonos erzekenysegfinek bizonyult, mint aRIA es az adatok a klinikumban j61 hasznosithat6ak (HPLC-me1'es erzekenysege: 0,5 mgjl, RIA m6dszer erzekenysege : 0,3 mg/l theophyllin). IRODALOlVI 1. Adams, R. P., Vandemat·k, P. L., Schmidt, G. J.: Clin. Chem. 22, 1903 (1976). 2. Bonham, A., Hendeles, L., Vaughan, L., Weinberger, M.: Amer. Rev. Resp. Dis. 122, 829 (1980). - 3. Olosson, R. G.: Amer, J. Pharmaeol. Educ. 45, 9 (1981). - 4. Hajtman, B.: Bevezetes a matematikai sbat.iszt.ikaba., Akaderniai Kiad6, Budapest. 1968. - 5. Hohnadel, D. C., Grave, 1'. H., Alonzo, P.: Anal. Toxicol. 2, 6 (1978). - 6. Meola, J. M., Brown, H. H., Swift, Clin. Chem. 25, No. 10. 1835 (1979). - 7. Naszlady, A., Rodek, I.: Pneumonol, Hung. Kozles alatt.-8. Oellerich, M., Hannemann, P., Kulpmann, W. R., Beneking, M., Sybrecht, G. W.: Der Interist 23,641 (1982).
r..
A. S z e i t z, A. J a k a b, L. D e b r e c zen i: Serum theophylline examinations by HPLC and RIA Serum theophylline measurements were carried out in human samples aiding Hungarian chemicals and HPLC equipment. The HPLC-results were compared to the results obtained by RIA (Clinical Assay 125I-theophylline Kit). It was found that HPLC was nearly as sensitive as RIA and the results have clinical importance (sensitivity of HPLC: 0.5 mg/l ; sensitivity of RIA: 0.3 mg/l theophylline).
88
FeJeJ6s kiad6: dr. Petrus GyOrilY,az IfJusagl Lap- ~s KOnyvkiad6 V.tllaJat Igazgat6Ja R~val Nyomda, Budapest. F. v.: Horv.tth 16zsefn~
