Ph.D. értekezés. AZ α 1 -SAVAS GLIKOPROTEIN SZORPCIÓS TULAJDONSÁGAINAK FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS VIZSGÁLATA ÉS GYÓGYSZERANALITIKAI ALKALMAZÁSA

Ph.D. értekezés

AZ α1-SAVAS GLIKOPROTEIN SZORPCIÓS TULAJDONSÁGAINAK FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS VIZSGÁLATA ÉS GYÓGYSZERANALITIKAI ALKALMAZÁSA

Gyimesiné Forrás Krisztina

Témavezető: Dr. Szász György Professor Emeritus, a kémiai tudomány doktora

SEMMELWEIS EGYETEM GYÓGYSZERÉSZI KÉMIAI INTÉZET 2001.

Ph.D. értekezés Az α1-savas glikoprotein szorpciós tulajdonságainak folyadékkromatográfiás vizsgálata és gyógyszeranalitikai alkalmazása Gyimesiné Forrás Krisztina Témavezető: Dr. Szász György Professor Emeritus, a kémiai tudomány doktora Budapest, Semmelweis Egyetem Doktori Iskola, 2001 Program: A gyógyszerészeti tudományok korszerű kutatási irányai Összefoglaló A

bio-

és

gyógyszermolekulák

analitikai

meghatározásának

világviszonylatban

legelterjedtebb módszere a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia. Rohamosan terjed ezen belül is a királis molekulák vizsgálata, amit az a felismerés tett indokolttá, hogy az enantiomerek hatásának erősségében, esetleg a hatás jellegében és toxicitásában alapvető eltérések mutatkozhatnak. Az enantiomerek elválasztása, mennyiségi meghatározása és tisztaság vizsgálata napjainkban elengedhetetlen és időszerű gyógyszeranalitikai feladatok. Disszertációs munkámban célul tűztük ki a szervezetben is jelenlévő α1-savas glikoprotein (AGP) alapú királis állófázis szorpciós tulajdonságainak vizsgálatát, amely az enantioszelektivitás szempontjából alapvető fontosságú lehet. A kötődési vizsgálatokkal újabb adatokat szolgáltattunk a kromatográfiás mechanizmus tekintetében is, amely az irodalmi adatok alapján még kevéssé tisztázott. Ezen ismeretek alapján lehetőség nyílik adott gyógyszeranalitikai feladatok megoldására alkalmas mozgó fázis összetételek tervezésére, beleértve a preparatív elválasztást is. Elsőként szolgáltattunk adatokat az alacsony dielektromos állandójához képest igen nagy elúciós erejű dioxán kötődésére. Megállapítottuk, hogy mind az acetonitril, mind a dioxán kötődése pHfüggő: pH=7,2-nél telítési görbét ír le, míg pH=4,0-nél kétlépcsős, monoton görbével jellemezhető, amit a szelektor konformációváltozásával értelmeztünk. A konformációváltozás követésére és igazolására natív AGP-vel modellvizsgálatokat végeztünk. A kötődési meghatározás eredményeivel összhangban CD-spektroszkópiával megállapítottuk, hogy pH=4,0nél az acetonitril koncentráció emelésével az α-hélix szerkezetre jellemző CD-spektrum jelenik meg. Ezzel szemben pH=7,2-nél az acetonitril koncentráció növelése nem idéz elő érdemi változást a spektrumban. Az AGP fluoreszcencia-kioltásos vizsgálatával először határoztuk meg – 2,2,2-triklór-etanol felhasználásával – adott acetonitril koncentrációk jelenlétében az effektív dinamikus kioltási állandókat. Egyezésben a CD mérések eredményeivel megállapítottuk, hogy a savas tartományban növekvő acetonitril koncentrációk esetében a kioltó hatás nő, amit az AGP triptofán-részek fokozódó belső mozgásával magyarázunk. A fenti eredményeket is figyelembe véve, savas (ibuprofen), bázikus (propranolol) és semleges (norgesztrel) gyógyszermolekulák felhasználásával új, gyógyszerkönyvi enantiomer tisztaság vizsgálati célra alkalmas, validált módszereket dolgoztunk ki.

2

Ph.D. Thesis Investigation of the sorption properties and pharmaceutical application of α1 –acid glycoprotein by liquid chromatography Krisztina Gyimesi-Forrás Prepared under guidance of Prof. Dr. György Szász D.Sc., in the Institute of Pharmaceutical Chemistry, Semmelweis University, School of Ph.D. Studies, in 2001 Programme: Recent trends in pharmaceutical sciences Summary High performance liquid chromatography is the most widely used method for the analytical determination of bio- and drug molecules. The investigation of chiral substances is rapidly developing within that field, because it has been recognized that the pharmacodinamic effect, efficacy and also the toxicity of the enantiomers may differ. The separation and quantitation of the enantiomers and also the determination of the enantiomeric purity are all current and indispensable tasks for the pharmaceutical analysis. The aim of this work was to study the sorption properties of the α1–acid glycoprotein (AGP) based stationary phase, which may have crutial importance for the enantioselectivity. New binding data are presented for the mechanism of the chromatographic separation, which has not clarified in the literature yet. On the basis of these new findings the composition of the mobile phase for a given analytical separation can be designed, including the preparative separation, as well. Binding data for dioxan, known as a solvent with low dielectric constant, are determined at first time. It was found that the sorption of both acetonitrile and dioxane is pH-dependent: as at pH 7.2 the binding can be characterized by a saturation curve, while at pH 4.0 by a twostep, monotone curve. The pH-dependence of the adsorption has been explained by conformational changes of the selector, which were confirmed by CD-spectroscopic and fluorescence quenching study of the native AGP. In accordance with the binding study by increasing the acetonitril percentage at pH 4,0 a tipical α-helical peak was obsereved in the CD-spectrum. Opposite that at pH 7.2 the increase in the acetonitrile content does not result in any changes in the spectra. Effective dynamic quenching constants of AGP have been determined at given acetonitrile concentrations using 2,2,2-trichloroethanol as fluorescence quencher. In agreement with the results of the CD measurements at pH 4.0 it was found that the degree of quenching enhanced by increasing the amount of the acetonitrile, that can be explained by enhanced exposure of the buried tryptophan residues. Taking these results into account, new optimized and validated HPLC methods have been developed for compendial control in testing the enantiomeric purity of an acidic (ibuprophen), a basic (propranolol) and a neutral (norgestrel) drug molecule.

3

TARTALOMJEGYZÉK

1. BEVEZETÉS

6

2. CÉLKITŰZÉSEK

7

3. IRODALMI HÁTTÉR

8

3.1. A királis gyógyszervegyületek bevezetésének indokai és korlátai

8

3.2. Az enantiomer tisztaság meghatározása

10

3.1.1. Az enantiomer arány közvetlen meghatározásának módszerei

11

3.1.2. Az enantiomerek elválasztásán alapuló módszerek

15

3.1.2.1. Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás (HPLC) módszerek

17

3.1.2.1.1. Királis származékképzést követő elválasztás

17

3.1.2.1.2. Királis mozgó fázis additívek alkalmazása

19

3.1.2.1.3. Királis állófázisok alkalmazása

21

3.1.2.1.3.1. Az AGP-alapú folyadékkromatográfiás állófázis

28

3.1.2.1.3.1.1. Az AGP szerkezete

28

3.1.2.1.3.1.2. Az AGP tulajdonságai

32

3.1.2.1.3.1.3. Az állófázis előállítása

34

3.1.2.1.3.1.4. Az állófázis alkalmazása

35

3.1.2.1.3.1.5. Az állófázis stabilitása

37

4. KÍSÉRLETI RÉSZ

39

4.1. Anyagok, eszközök

39

4.1.1. Vegyszerek, modellvegyületek

39

4.1.2. Eszközök, készülékek

40

4.2. Vizsgálati módszerek

41

4.2.1. Az állófázis szorpciós tulajdonságainak gázkromatográfiás vizsgálata

41

4.2.2. Cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópiás vizsgálat

43

4.2.3. Fluoreszcencia-kioltásos vizsgálat

44

4.2.4. Az enantiomer tisztaság meghatározására szolgáló új módszerek

45

4.2.4.1. Az S-(+)-ibuprofen vizsgálata

46

4.2.4.2. Az S-(−)-propranolol vizsgálata

47

4.2.4.3. A D-(−)-norgesztrel vizsgálata

48

4.2.5. 4(3H)-kinazolon származékok enantiomerjeinek elválasztása

48

5. AZ EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

49

4

5.1. Új adatok a Chiral-AGP oszlop szorpciós tulajdonságaihoz

49

5.2. A natív AGP CD-spektroszkópiás vizsgálata

57

5.3. A natív AGP fluoreszcencia-kioltásos vizsgálata

59

5.4. A Chiral-AGP oszlop gyógyszeranalitikai alkalmazásai

64

5.4.1. Az enantiomer tisztaság meghatározására alkalmas

64

módszerek kidolgozása 5.4.1.1. Az S-(+)-ibuprofen enantiomer tisztaságának meghatározása

71

5.4.1.1.1. Vizsgálati módszer

71

5.4.1.1.2. Validálási teljesítményjellemzők

71

5.4.1.2. Az S-(−)-propranolol enantiomer tisztaságának meghatározása

74

5.4.1.3. A D-(−)-norgesztrel enantiomer tisztaságának meghatározása

76

5.4.2. Új 4(3H)-kinazolon származékok enantiomerjeinek elválasztása

79

6. MEGBESZÉLÉS

87

6.1. Az eredmények összefoglalása

87

6.2. Az eredmények hasznosítása

88

7. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

89

8. IRODALOMJEGYZÉK

90

9. MELLÉKLET

105

5

1. BEVEZETÉS

Az azonos konstitúciójú, de eltérő konfigurációjú bio- és gyógyszermolekulákat az élő szervezet teljesen különböző ágensként ismeri fel. Az utóbbi évtizedek gyógyszerkutatásai igazolták, hogy a racém hatóanyagok enantiomerjei hatásának erősségében, esetleg jellegében és toxicitásában is alapvető eltérések mutatkozhatnak. Ennek ellenére jelenleg az tapasztalható, hogy a gyógyszerek terápiás felhasználásában és a gyógyszerkönyvekben továbbra is többségben szerepelnek a racém módosulatok. Ennek oka elsősorban a királis szintézis és az elválasztás költségessége. Ugyanakkor egyre gyakoribb, hogy a farmakológiai hatást hordozó, eutomer forma a hivatalos. Várható és remélhető, hogy a jövőben mind nagyobb számban kerülnek forgalomba a hatásos konfigurációs izomert tartalmazó gyógyszervegyületek, mivel a disztomert minden esetben potenciális szennyezésnek kell tekinteni, amely a szervezet méregtelenítő rendszerét terheli és nemkívánatos mellékhatások előidézője lehet. Következésképpen az enantiomer tisztaság a gyógyszeripari termék piacképességének feltétele, amelynek vizsgálata a gyógyszerellenőrzés szempontjából elengedhetetlen és időszerű

feladat.

A

gyógyszer-törzskönyvező

hatóságok

az

új

racém

gyógyszermolekulák engedélyezéséhez a nemzetközi irányelveknek megfelelően ma már a farmakokinetikai és a farmakodinámiás paraméterek meghatározását a racém vegyületre és az egyes enantiomerekre külön-külön is előírják. A fentiekből következik, hogy a gyógyszerfejlesztés és a gyógyszerellenőrzés céljára jól reprodukálható, nagy érzékenységű sztereoszelektív analitikai módszerekre van szükség, amelyek közül napjainkban a királis nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) bizonyult legalkalmasabbnak. Az enantiomerek elválasztására jelenleg legelterjedtebb a királis állófázisok használata, közülük igen jelentősek a fehérje alapú, azaz biomimetikus szorbensek. Kézenfekvő volt ugyanis az a felismerés, hogy a szervezetben funkcionáló fehérjéket a kromatográfiás gyakorlatban is felhasználják. Egyike az elsőként alkalmazott szelektoroknak a Hermansson által immobilizált α1-savas glikoprotein (AGP), amely különböző kémiai szerkezetű vegyületek enantiomerjeinek elválasztására alkalmas és amelyet napjainkban is széles körben használnak gyógyszerkémiai, valamint gyógyszeranalitikai kutatási célokra.

6

2. CÉLKITŰZÉSEK

Jelen munka keretében célul tűztük ki a gyakorlatban használt különböző eluens-összetételek mellett, az AGP, ezen sajátos szerkezetű fehérje adszorpciós tulajdonságainak vizsgálatát, ami az enantioszelektivitás szempontjából alapvető fontosságú lehet. E célkitűzést annál inkább indokoltnak tartottuk, mivel az irodalmi adatok alapján az AGP-alapú oszlopon működő elválasztási mechanizmus még kevéssé tisztázott. Mivel ez utóbbi folyamatban igen jelentős tényező lehet a szelektor konformációváltozása, ennek igazolására, ill. követésére, natív AGP felhasználásával, cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópiás, valamint fluoreszcencia-kioltásos vizsgálatokat terveztünk beiktatni a kötődési meghatározásokkal azonos kísérleti körülmények mellett. A fenti kutatás eredményeit is felhasználva további célul tűztük ki a ChiralAGP



folyadékkromatográfiás

szélesítését.

E

munka

oszlop

keretében

gyógyszeranalitikai

különböző

kémiai

felhasználásának szerkezetű

királis

gyógyszermolekulák enantiomerjeinek elválasztására alkalmas, új kromatográfiás rendszereket kívántunk kifejleszteni. Arra törekedtünk, hogy a kidolgozott elválasztási módszerek egyaránt alkalmasak legyenek az enantiomerek (1) azonosítására; (2) mennyiségi meghatározására és (3) megfelelő érzékenységű tisztaság vizsgálatára. E célkitűzést azért is tartottuk indokoltnak, mert a gyógyszerkönyvekben az enantiomer tisztaság ellenőrzésére szelektív vizsgálat alig szerepel, általában csupán a fajlagos forgatóképesség értékének meghatározását írják elő. Mivel az AGP-t az említett feladatokra alkalmas királis szelektornak véltük, célul tűztük ki, hogy a kifejlesztett módszerek modellként is szolgáljanak, tehát minél szélesebb körben felhasználhatók, standardizálhatók, gyógyszerkönyvi célra is alkalmasak legyenek. Szem előtt tartottuk azt is, hogy az optimált rendszerek alkalmasak legyenek a gyógyszeranyagok és gyógyszerkészítmények enantiomer-stabilitásának ellenőrzésére, valamint az ipari méretekben történő sztereoszelektiv szintézis reakciólépéseinek és köztitermékeinek nyomonkövetésére, továbbá alapul szolgáljanak az AGP oszlopon végzett preparatív munkához is.

7

3. IRODALMI HÁTTÉR

3. 1. A királis gyógyszervegyületek bevezetésének indokai és korlátai Az enantiomerek előállítására és elválasztására alkalmas sztereoszelektív módszerek megjelenésével az elmúlt 20 év alatt a gyógyszerfejlesztés, a gyógyszerkutatás, a gyógyszerellenőrzés és a gyógyszertörzskönyvezés területén a kiralitás jelentősége nagymértékben megnövekedett [1-3]. Az Európai Unió, Japán és az Amerikai Egyesült Államok gyógyszertörzskönyvező hatóságainak a királis vegyületekkel szemben támasztott követelményei 1991 óta a harmonizációs törekvések eredményeként közelítenek egymáshoz [4-6]. Az ICH (International Conference on Harmonization) irányelvek a gyógyszerek nemzetközi piacképességét szolgálják a megfelelő gyógyszerminőség, biztonság és hatásosság szavatolása mellett. A gyógyszer-törzskönyvezéshez szükséges validált, analitikai meghatározásokat a farmakokinetikai és a farmakodinámiás vizsgálatok eredményei együttesen szabják meg és valamennyi gyógyszermolekula esetén a hatóság egyedi elbírálással él. A gyógyszergyártónak azt is meg kell indokolnia, ha az eutomer forma helyett a racém módosulat kifejlesztése mellett dönt. Ilyen okok közé tartozik például: (1) az in vivo egyirányú konfigurációs átalakulás, ami a nem-szteroid gyulladásgátló (NSAID) 2-aril-propionát származékok körében megy végbe. Az ibuprofen S-(+)-enantiomerje in vitro 160-szor hatékonyabb ciklooxigenáz (COX)-gátló, mint az R-(−)-antipód, azonban in vivo ez a különbség alig érzékelhető, ami az inaktív R-(−)-enantiomer S-(+)-izomerré történő egyirányú, sztereoszelektív metabolikus átalakulásának a következménye [7]; (2) a két enantiomer közel azonos hatáserőssége, amikor az eutomer használata nem jár klinikai előnyökkel, mint pl. a propafenon esetében [8]; (3) az in vivo racemizáció pl. oxazepám [9]; (4) a két izomer egymás hatását erősítő kölcsönhatása pl. a levometorfán analgetikus hatása az antipód jelenlétében szignifikánsan nő, mivel az inaktív dextrometorfán gátolja az eutomer metabolikus eliminációját [10]. Az utóbbi években a hatóságok részéről egyre nagyobb az igény a tiszta eutomer tartalmú gyógyszervegyületek forgalomba hozatala iránt. Ezzel párhuzamosan megfigyelhető, hogy a gyógyszergyárak számos, régebb óta racém vegyületként használt farmakon hatékony enantiomerjének kifejlesztése mellett döntenek, elsősorban 8

a kedvezőbb terápiás hatás biztosítása, a káros mellékhatások elkerülése és nem utolsó sorban a piacképesség érdekében. Így például az antihisztamin hatású Zyrtec készítmény (−)-cetrizin izomerjének szedatív mellékhatása a racém módosulathoz képest lényegesen kisebb mértékű, ezért az eutomerrel Európában már fázis III. klinikai vizsgálatokat végeznek [11]. A szelektív szerotonin visszavétel gátló fluoxetin jelenleg szintén racemátként van forgalomban (Prozac). Az S-fluoxetin az antipódjával azonos hatáserősségű, azonban a szervezetből lassabban ürül ki, a hosszú időtartamú kezelések során pedig nagymértékben kumulálódik [12]. Mivel a rövidebb kiürülési idő növeli az antidepresszív kezelés rugalmasságát, a szélesebb körű felhasználás és a kedvezőbb terápiás hatás biztosítása céljából a fázis II. vizsgálat alatt álló R-fluoxetin forgalomba hozatalát tervezik [11]. Az asztma kezelésére a racém albuterol a világ vezető bronchodilatátor készítménye. Ugyanakkor 1999-ben az Amerikai Egyesült Államok Élelmiszer – és Gyógyszerhatósága (FDA) a királis analitikai módszerekkel végzett vizsgálatok eredményei

alapján

törzskönyvezte

az

eutomert

(levalbuterol),

amely

biztonságosabbnak és hatékonyabbnak bizonyult [13]. Hasonlóképpen, Németországban forgalomban van az S-ketamin injekciós narkotikum, amelyből a racemáthoz képest alacsonyabb dózis szükséges az intenzívebb anesztetikus hatás miatt. Ennek következtében a hatás gyorsabban lecseng és a zavaró mellékhatások is jelentősen csökkennek [14]. Bár az NSAID 2-aril-propionsav származékok S-enantiomerjeinek COXgátlóként történő alkalmazása jelenleg inkább csak teoretikus értelemben előnyös, Ausztriában és Svájcban az S-(+)-ibuprofen már hivatalos. Az S-izomer rövidebb idő alatt fejti ki hatását; azonban, az újabb kísérleti adatok szerint az R-(−)-ibuprofen a racém elegy terápiás hatásához nemcsak az S-formába történő konfigurációs átalakulásával, hanem a COX-2 enzimindukciójának gátlásával is hozzájárul [15]. Mindezek alapján a nem-szteroid gyulladásgátlók tiszta enantiomerként történő felhasználásának ellentmondásai még összetettebbé válnak.

9

3.2. Az enantiomer tisztaság meghatározása

Amennyiben a gyógyszergyártó a kulcsfontosságú farmakológiai és toxikológiai vizsgálatok alapján az eutomer kifejlesztése mellett dönt, a gyógyszeranyag és a gyógyszerkészítmény enantiomer tisztaságát meg kell határoznia, ami a gyógyszeripari termék piacképességének feltétele. Az enantiomer tisztaság meghatározása napjaink gyógyszeranalitikájának egyik legfontosabb kérdései közé tartozik. Jelentősége alapján az értekezésben az enantiomer tisztaság meghatározására alkalmas módszerek külön alfejezetben kerülnek bemutatásra. Ezek a módszerek két csoportba sorolhatók annak alapján, hogy az enantiomerek arányát közvetlenül vagy elválasztásuk után mérik. Az enantiomer arány többféle módon is kifejezhető. Legelterjedtebb az enantiomer felesleg (e.e.), az enantiomer tisztaság (EP) vagy az optikai tisztaság (P) deklarálása, amelyeket általában százalékban adnak meg [16]. e.e.% = 100 (x∗-x) / (x∗+x), ahol

x∗ > x,

(1)

másképpen felírva e.e.% = 100 (2x∗-1), ahol

(2)

x∗ a feleslegben lévő, x a szennyező (minor) enantiomer móltörtje. EP% = 100 x∗ / (x∗ + x)

(3)

P% = 100 [α] / [α] max

(4)

ahol [α] a vizsgálandó vegyület fajlagos optikai forgatóképessége; [α]max az optikailag tiszta enantiomer fajlagos forgatóképessége.

10

3.2.1. Az enantiomer arány közvetlen meghatározásának módszerei Ezek a módszerek az enantiomer összetétel meghatározásához nem teszik szükségessé a sztereoizomerek elválasztását. Ebbe a csoportba tartozik a polarimetria, a cirkuláris dikroizmus (CD) és az optikai rotációs diszperzió (ORD) spektroszkópia, a nukleáris

magrezonancia

spektroszkópia

(NMR),

valamint

a

gyakorlatban

gyógyszeranalitikai célra kevésbé alkalmazott izotópjelzéses meghatározás, a differencia pásztázó (scanning) kalorimetria (DSC) és számos enzim-technika. Az NMR meghatározás kivételével valamennyi fent említett módszer a tiszta enantiomer standard mért értékén alapul, ezért az összehasonlításhoz a tiszta enantiomer meghatározására is szükség van. Polarimetria. A legrégebben és a legszélesebb körben alkalmazott metodika, amely ma is a gyógyszerkönyvek általános módszere az eutomer gyógyszervegyületek tisztaságának ellenőrzésére. Ennél a módszernél - mivel az optikai forgatóképesség (α) függ az oldatkoncentrációtól, a rétegvastagságtól, az oldószertől, a hőmérséklettől és a mérés hullámhosszától - a vizsgálati paraméterek standardizálása szükséges.

[α] °nmC =

100 ⋅ α l ⋅c

(5)

ahol α a mért optikai forgatóképesség (m°); l a rétegvastagság (dm); c az oldat koncentrációja (g/100ml). Mivel

az

optikai

tisztaság

kísérleti

úton

meghatározott

kiroptikai

tulajdonságokon alapul, számos metodikai hibát hordozhat, így a meghatározás az enantiomer összetételre vonatkozóan tetemes hibával járhat. Ezért általában sokkal megbízhatóbbak azok a módszerek, amelyek az egyes enantiomereket különböző ágensként ismerik fel. Mindezek ellenére a gyógyszerellenőrzésben csak egy fontos fizikai mutatószám, a fajlagos forgatóképesség értékének meghatározása terjedt el. A gyógyszerkönyvek ezeket a vizsgálatokat a legtöbb esetben a NaD-vonalán vagy a Hg-lámpa néhány

11

közeli spektrumvonalán végeztetik, amely hullámhosszon végzett mérések nem elég érzékenyek és az anyagra sem igazán jellemzőek. A meghatározás anyagigénye nagy, milligramm nagyságrendű. Mivel a módszer a királis molekulák optikai aktivitásán alapul, az alacsony fajlagos forgatóképességű izomerek esetén alkalmazhatósága az igen kis érzékenység miatt korlátozott. Így pl. a levodopa fajlagos forgatóképessége csak -12°, ami nem elegendő az optikai tisztaság ellenőrzéséhez. Formaldehides ciklizációt követően viszont a képződő tetrahidro-izokinolin származék fajlagos forgatóképessége 10-szerese a levodopáénak és a polarimetriás analízis elvégezhető [17]. Cirkuláris dikroizmus (CD) és optikai rotációs diszperzió (ORD). Az enantiomer szennyezések érzékenyebb meghatározására szolgálnak azok a kiroptikai módszerek (CD, ORD), amelyekkel vagy közvetlenül a kiroptikai jelek nagyságából vagy HPLC-s detektorként alkalmazva határozható meg az enantiomer arány. A módszer alkalmazhatóságának feltétele azonban a királisan perturbált molekulaszerkezet. [18]. Az igen kis moláris ellipticitású vegyületek előnytelen kiroptikai jelet adnak, ami megfelelő származékképzést tesz szükségessé. Engle és mtsai [19] pszeudoefedrin és efedrin enantiomer keverék enantiomer tisztaságát határozták meg Co(II)-tartarát komplexeik ellipticitásának mérése alapján. A reakció egyszerű ligandumcsere a tartarát és a királis farmakon között, amelynek során a CD spektrum hullámhossza a látható fény tartományába tolódik el. Amennyiben kettős CD/UV detektálással a minta ellipticitása és abszorbanciája egyszerre mérhető, a (6) egyenlet segítségével számolható a királis kémiai anyagra jellemző anizotrópia faktor (g), illetve a vele arányos G-érték [20].

12

G=

[θ ] ⋅ c ⋅ l =3298 g ε ⋅c⋅l

(6)

ahol ε a moláris abszorbancia (l x mol-1 x cm-1); c a koncentráció (mol x l-1); l az optikai úthossz (cm); [Θ] a moláris ellipticitás (° x cm2 x decimol-1). A G számértéke a két enantiomer esetén azonos abszolút értékű, ellentétes előjelű paraméter, amely keverékek esetében, adott hullámhosszon, az enantiomer összetétel függvénye. A G-érték abban a tartományban független a koncentrációtól, ahol mind az ellipticitás, mind az abszorpció a koncentráció lineáris függvénye. Az enantiomer tisztaság (EP) a fenti paraméterek felhasználásával a következő összefüggés szerint számolható:

EP % =

100 ⋅ G mért G tiszta

(7)

ahol Gtiszta a szennyezésmentes többségi enantiomer; G

mért

a vizsgálandó minta

mérése alapján számított G-érték. Következésképpen ennél a módszernél is szükség van a standard érték meghatározására. A fenti összefüggés alapján határozták meg Horváth és mtsai [21] a fenilglicin és a mandulasav enantiomer összetételét. Bertucci és Salvadori [22] a 3-metilciklopentolát és a 3-metil-dezmetil-diazepám esetében 0,1 %-os enantiomer szennyezést mutattak ki. Nukleáris magrezonancia spektroszkópia (NMR). Ez a módszer abban az esetben tesz különbséget az egyes enantiomerek között, ha azok alkalmas királis reagenssel kölcsönhatásba lépve diasztereomereket képeznek. A legrégebbi, Mislow és Mosher [23] által kidolgozott módszer homokirális származékképzők felhasználásán alapul. Az enantiomerek közvetlen meghatározása két módon valósítható meg, amelyek közül a Pirkle és mtsai [24] által 1966-ban bevezetett, királis oldószerek alkalmazása terjedt el

13

elsőként. Különösen gyakori az (R)-(−)-2,2,2-trifluor-1-fenil-etanol használata. A királis oldószer az egyes enantiomerek magjai között kémiai eltolódást indukál, amelynek megfelelően a csúcsok integrálásával az enantiomer arány közvetlenül fejezhető ki. A módszer előnye, hogy az oldószer enantiomer tisztasága nem befolyásolja az integrálás eredményét vagyis a csúcs-arányt, csak a csúcsok kémiai eltolódásaira van hatással. A speciális műszerigény azonban még nem teszi lehetővé a módszer rutinanalitikai felhasználását. A királis shift reagensek közül igen jelentősek a 6-os koordinációs számú lantanoida kelátkomplexek. Mint gyenge Lewis savak, az elektron-donor csoportokat tartalmazó vegyületekkel kölcsönhatásba lépnek, ami a kölcsönhatás közelében lévő magok alacsonyabb térerő irányába történő eltolódását okozza. Az eltolódás mértéke a diasztereomer-komplex stabilitása, valamint a mag és a paramágneses átmeneti fém ion (Eu3+, Pr3+) közötti távolság függvénye [25]. Hanna és mtsai [26] (S)-(−)-timolol maleát enantiomer összetételét határozták meg prazeodímium (Pr(3+)) shift reagenssel, ahol a szennyező antipód kimutatási határa 2%-nak, a visszanyerés 99,5±1,17%-nak adódott. Izotópjelzéses technika. Ez a módszer kétféleképpen alkalmazható az enantiomer tisztaság meghatározására. Egyik esetben jelzett racém vegyületet (izotóp-higításos módszer), míg a másik esetben jelzett tiszta enantiomert adnak az ismeretlen összetételű mintakomponenshez [27]. Mindkét eljárásnál két paraméter, a fajlagos optikai forgatóképesség, valamint az izotóp tartalom meghatározása szükséges. Az előbbi polarometriás, az utóbbi tömegspektrometriás úton vagy szcintillációs számláló felhasználásával határozható meg, ami a módszer alkalmazhatóságát jelentősen korlátozza. Enzim reakción alapuló meghatározás. Régóta ismert, hogy számos enzimreakció nagyfokú sztereospecificitást mutat [28]. Pasteur [29] már 1856-ban a racém borkősav reszolválásához Penicillium glaucum penészgombát használt, ami csak a (+)izomerrel lépett reakcióba. Amennyiben a királis enzimmolekulák az optikai antipódokkal lényegesen eltérő sebességgel képeznek diasztereomer vegyületpárokat, a reakció az alacsonyabb aktiválási energiájú enantiomerre nézve sztereospecifikus és analitikai célra is felhasználható. A módszert a gyakorlatban elsősorban aminosavak

14

meghatározására alkalmazzák, amely a szennyező enantiomer enzimatikus oxidációján vagy dekarboxilezésén alapul. A D - és az L - aminosav-oxidázok felhasználásával a többségi izomerben 0,1% minor komponens is kimutatható [30]. Ezzel szemben csak az L-aminosavak dekarboxilezése katalizálható enzimes úton, ezért a dekarboxiláz enzimekkel csak a D-aminosavak enantiomer tisztasága határozható meg. 3.2.2. Az enantiomerek elválasztásán alapuló módszerek Ebbe

a

csoportba

tartoznak

a

gyakorlati

szempontból

legjelentősebb

kromatográfiás és azokkal rokon elválasztástechnikai módszerek. Disszertációs munkámban a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) alkalmazása kerül részletesebb bemutatásra, ezért

a vékonyrétegkromatográfia

(TLC)

[31],

a

gázkromatográfia (GC) [32], a szuperkritikus folyadékkromatográfia (SCF) [33] és a kapilláris elektroforézis (CE) [34,35] tárgyalásától eltekintünk, csupán néhány összefoglaló munkát említünk meg. A GC technika alkalmazhatóságának e területen is határt szab, hogy a mintakomponens hőstabilitását, valamint megfelelő illékonyságát teszi szükségessé. A GC-MS kapcsolt technika megjelenése azonban az érzékenység növelése révén a GC gyógyszeranalitikai felhasználási körét is szélesíti. A szuperkritikus folyadékok viszkozitása a hagyományos értelemben vett folyadékok viszkozitásához képest lényegesen alacsonyabb, ami a mintakomponens gyorsabb diffúzióját teszi lehetővé. Ennek megfelelően az SCF módszerrel az analízis idő jelentős mértékben lerövidíthetőhető, a kromatográfiás felbontás (Rs) csökkenése nélkül. A gyakorlatban legelterjedtebb mozgó fázis a széndioxid, állófázisként a fehérje és a cellulóz-triacetát-alapú kolonnák kivételével valamennyi kereskedelmi forgalomban lévő királis HPLC-s oszlop felhasználható. A kapilláris elektroforézis a gyógyszeranalitika területén az 1990-es évek kezdetén jelent meg és a folyamatos térhódítás jellemzi, jelenleg azonban érzékenysége és pontossága még nem éri el a HPLC módszerét [36]. A királis HPLC területén szerzett tapasztalatokat felhasználva az enantiomerek elválasztására és meghatározására a CE számos módozata alakult ki, amelyeket az 1. táblázatban foglaltuk össze.

15

1. táblázat. A CE királis elválasztásra alkalmas módozatai CE módozat kapilláris zónaelektroforézis (CZE)

Királis szelektor ciklodextrinek (CD) [37], koronaéterek [38]

elektokinetikus kapilláris kromatográfia (EKC)

-felületaktív anyagok pl. epesavak és sóik [39]

-micelláris EKC (MEKC)

-ciklodextrinek:

-ciklodextrinnel módosított MEKC (CD-

[40]

MEKC)

-pl. 2-O-karboxi-metil-β-ciklodextrin [41]

pl.

hidroxi-etil-β-ciklodextrin

-töltéssel rendelkező ciklodextrin származékkal módosított EKC (CD-EKC) -affinitás EKC (AEKC)

-fehérjék pl. α1-savas glikoprotein, humán és szarvasmarha szérum albumin [42], -ionizált poliszacharidok pl. heparin [43], -makrociklusos antibiotikumok pl. rifampicin, amellyel az izoproterenolban 0,1% enantiomer szennyezést határoztak meg [44].

kapilláris gélelektroforézis (CGE)

poliakrilamid töltött

gélbe

kapilláris

pl.

ágyazott

ciklodextrinnel

hidroxi-etil-βCD–nel

a

terbutalin kevesebb, mint 1%-ban jelenlévő enantiomer szennyezését mérték meg [45]. kapilláris izotachoforézis (CITP)

ciklodextrinek

kapilláris elektrokromatográfia (CEC)

A kapilláris falára vagy szilárd hordozóra immobilizált királis szelektorok pl. α1-savas glikoprotein [46].

Várható, hogy a jövőben a módszer egyre jelentősebb lesz az enantiomer tisztaság meghatározásának területén is, hiszen anyagigénye kicsi, az analízis idő általában rövid, ami jelentős költségmegtakarításhoz vezethet. Az enantiomer szennyezés érzékeny és pontos meghatározására valamennyi előzőleg említett módszer közül napjainkban legelterjedtebb a királis HPLC, amely az utóbbi időkben folyamatos dinamikus fejlődésen ment keresztül. A módszer a minőségellenőrzés területén mind a minor (szennyező) enantiomer mennyiségének, mind a gyógyszermolekula sztereoizomer-stabilitásának rutinszerű vizsgálatára is alkalmas. A dinamikus metodikai fejlődést jellemzi, hogy a királis HPLC többféle változata is kialkalult. 16

3.2.2.1. Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás (HPLC) módszerek 3.2.2.1.1. Királis származékképzést követő elválasztás A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia megjelenésekor használt állófázisok akirálisok voltak, ezért az enantiomerek elválasztása csak ún. közvetett vagy indirekt úton,

a

kromatográfiás

elválasztást

megelőzően,

oszlop

előtti

királis

származékképzéssel volt megvalósítható [47]. Elsőként Nakanishi és mtsa [48] használta az NMR spektroszkópia területén korábban sikerrel alkalmazott királis származékképzőt, a Mosher reagenst terpén sztereoizomer keverék analízisére. Az irodalomban számos összefoglaló közlemény részletesen ismerteti a királis származékképző reagenseket és reakciókat [49-51]. Ezek azonban elsősorban az elválasztás általános és elméleti kérdéseivel, valamint biológiai minták vizsgálatával foglalkoznak annak ellenére, hogy a leírt módszerek többsége alapvetően alkalmas lehet az enantiomer tisztaság meghatározására is. Legjelentősebb reagensek például az acil-kloridok

és

anhidridek

(pl.

(S)-(+)-naproxen-klorid,

(R,R)-O,O-diacetil-

borkősavanhidrid), az izocianátok (pl. (R)-α-metil-benzil-izocianát), az izotiocianátok (pl.

2,3,4,6-tetra-O-acetil-β-D-glukopiranozil-izotiocianát)

és

egyéb

szerkezetű

vegyületek (pl. a fluoreszcens tulajdonságú (S)-(+)-2-tercier-butil-2-metil-1,3benzodioxolán-4-karbonsav),

amellyel

diacil-glicerin

származékok

pikomol

mennyiségű enantiomer szennyezését határozták meg [52]. Az indirekt HPLC módszer hátránya, hogy alkalmazásához számos feltételnek kell egyidejűleg teljesülnie: (1) Az-enantiomer tisztaság meghatározásához a homokirális származékképzőnek 100%-ban kell tartalmaznia a tiszta enantiomert, amit a következő egyenlet szemléltet: (R + S)

+

R’ + (S’)

→ I.

RR’ + SR’ + RS’ + SS’ II.

III.

IV.

ahol (R+S) a racém vegyület, R’ a királis származékképző, S’ a származékképzőben jelenlévő szennyező antipód, I-IV. a reakció során keletkezett kovalens kötésű diasztereomer származékok.

17

A királis származékképzőben szennyező komponensként jelenlévő S’-antipód a III. és IV. diasztereomer származékok képződéséhez vezet, amelyek a két főkomponenssel (I. és II.) enantiomer viszonyban állnak. Mivel az akirális kromatográfiával csak a diasztereomerek választhatók el egymástól, az I.-IV. vegyületeket tartalmazó minta analízise során két csúcs jelenik meg, amelyek közül az egyik kromatográfiás csúcs az I. és III., a másik pedig a II. és IV. vegyületeket tartalmazza. Következésképpen a módszer az (R+S) racém molekula enantiomer összetételére nem ad megfelelő értéket. Ezért a királis származékképző vegyület enantiomer tisztaságát az analitikai protokoll vizsgálat során minden esetben meg kell határozni. (2) A mennyiségi meghatározás pontosságának előfeltétele, hogy a reakció alatt sem a farmakon, sem a királis származékképző racemizációja vagy epimerizációja ne következzen be és a származékképzés kvantitatívan végbemenjen [53]. (3) A megfelelő funkciós csoportot tartalmazó enantiomerek és a királis reagens között végbemenő kémiai reakciók sebessége eltérő lehet, ezért a kinetikus reszolúció elkerülésére a származékképzőt feleslegben kell alkalmazni. A szükséges reagens mennyiséget, valamint a reakció időt pontosan meg kell határozni, ami a módszer kifejlesztésének időigényét jelentősen megnöveli. A módszer leglényegesebb előnyei közé tartozik, hogy alkalmas kromofór vagy fluorofór csoport bevitelével egyidejűleg a detektálás érzékenysége és szelektivítása is nagyságrendekkel növelhető [54]. Fontos azonban megjegyezni, hogy a keletkezett diasztereomer származékok UV vagy fluoreszcencia-jellemzői nem feltétlenül egyeznek meg, ezért a módszervalidálás során azt ellenőrizni kell. Például a propranolol enantiomerek (S)-(-)-fluoro-naproxen-izocianáttal képzett származékainak csúcs-terület aránya a fluorimetriás detektálás során 0,97-1,03 között változott [55]. A tisztaságvizsgálat eredményességét és érzékenységét befolyásoló lényeges szempont, hogy a szennyező csúcs a főcsúcs előtt eluálódjon. A módszer további nagy előnye, hogy általában szintetikus úton a királis származékképző vegyületek mindkét enantiomerje előállítható, így a kívánt elúciós sorrend a megfelelő reagens használatával biztosítható.

18

3.2.2.1.2. Királis mozgó fázis additívek alkalmazása Az enantiomerek hagyományos normál vagy fordított fázisú oszlopon történő elválasztásának másik lehetséges módja a királis mozgó fázis additívek alkalmazása. A módszert a direkt HPLC közé sorolják, mivel az átmeneti diasztereomer adduktumok nem az oszlop előtt, hanem közvetlenül a kromatográfiás rendszerben keletkeznek. A legjelentősebbek királis reagensek a ligandumcserés fémkomplexek [56], az ionpárképzők [57], a zárványkomplex-képzők [58] és a fehérjemolekulák [59]. Az enantiomerek elválasztása valamennyi esetben a diasztereomer adduktumok különböző stabilitási, valamint az álló-és mozgófázisra vonatkoztatott eltérő megoszlási állandóin alapul. 1979-ben Karger [60] alkalmazott elsőként fémkomplexeket danzil-aminosavenantiomerek fordított fázisú ligandumcserén alapuló kromatográfiás elválasztására. A módszert Davankov és mtsai [61] vizsgálták részleteiben az aminosav-antipódok analitikai, valamint preperatív elválasztása céljából. Az L-DOPA enantiomer tisztaságának meghatározására Aso [62] L-fenilalanin-CuII komplex tartalmú eluenst használt. A ligandumcserés módszer alkalmazhatósága kelátkomplex kialakítására képes elektron-donor

atomokat

tartalmazó

vegyületek

(aminosavak,

savamidok,

aminoalkoholok, hidroxisavak stb.) körére korlátozódik. Pettersson és Schill [63] az ionpár kromatográfia területén szerzett tapasztalataik felhasználásával vezették be királis ionpárképzőként a (+)-10-kámforszulfonsavat amino-alkohol enantiomerek normál fázisú rendszerben történő elválasztására. Ugyancsak sikerrel alkalmazták Szepesi és mtsai [64] mind a (+), mind a (-)-10kámforszulfonsavat a vinkamin nyolc sztereoizomerjének elválasztására és a gyógyászatban felhasznált (+)-cisz-izomer enantiomer tisztaságának meghatározására. Az optimált rendszerben a minor komponens kimutatási határa a (-)-cisz-vinkamin esetén 1%-nak, a (-)-cisz-apovinkaminsav-etilészter esetén 0,1%-nak adódott. E módszer esetében is az enantiomer tisztaság meghatározása szempontjából jelentős, hogy az optikailag tiszta ionpárképző antipódjának megválasztása lényegesen befolyásolja a szelektivítást, azaz a reagens ellentétes antipódját használva a diasztereomer ionpár elúciós sorrendje felcserélhető. A kromatográfiás rendszert meghatározó változók nagy száma és a komponensek retenciójára gyakorolt sokszor 19

ellentétes irányú hatása miatt azonban az elválasztás kísérleti paraméterei csak körülményesen optimálhatók. A legáltalánosabban használt királis mozgó fázis additívek a zárványkomplexképzők körébe tartozó ciklodextrinek (CD) és származékaik. Az α-CD-t hat, a β-CD-t hét, a γ-CD-t nyolc glükopiranóz-egység építi fel, ami a ciklodextrin molekulák hidrofób üregének eltérő méretét eredményezi. Az enantioszelektív elválasztás azon alapul, hogy az antipódok hidrofób részükkel a zárványkomplex-képző molekula toroidális üregébe illeszkednek és a sztérikus konfigurációtól függően a királis atom közelében lévő poláris szubsztituensek az üreg nyílásánál elhelyezkedő szekunder alkoholos hidroxil-csoportokkal hidrogén-hidas kölcsönhatást alakítanak ki [65]. Mindezek alapján a különböző szerkezetű vegyületek enantiomerjeinek elválasztásához megfelelő méretű királis szelektorok szükségesek. A levonorgesztrelben (D-(−)-norgesztrel) Gazdag és mtsai [66] γ-CD felhasználásával 0,1% L-(+)-norgesztrel szennyezést mutattak ki. A fehérje alapú királis állófázisok előfutáraiként már a mozgó fázisban oldott protein molekulák ígéretes királis szelektornak bizonyultak [59]. Az ilyen típusú kromatográfiás rendszer a széleskörű alkalmazhatóságon túlmenően a szelektív farmakon-protein kölcsönhatás vizsgálatára is egyaránt alkalmas lehet. A humán szérum albumin és az α1-savas glikoprotein azonban rendkívül drága, ezért királis szelektorként a fehérje molekulák napjainkban szinte kizárólag immobilizált formában kerülnek felhasználásra. Jóllehet, a nagyszámú, eltérő tulajdonságú additív folytán a királis mozgó fázison alapuló HPLC módszer széleskörű felhasználást nyerhetne, mivel azonban a királis szelektorok az elválasztást követően nem nyerhetők vissza, az esetek nagy részében a módszer igen költségesnek bizonyul. Mindez pedig a már ismertetett egyéb korlátozó

tényezőkkel

együtt

a

királis

kifejlesztéséhez, illetve elterjedéséhez vezetett.

20

folyadékkromatográfiás

állófázisok

3.2.2.1.3. Királis állófázisok alkalmazása A királis állófázisokon (CSP) végzett közvetlen enantiomer elválasztás a legszélesebb körben alkalmazott folyadékkromatográfiás módszer, amit e területen megjelent több száz közlemény is igazol. Meglepő módon azonban az enantiomer tisztaság meghatározásával foglalkozó dolgozatok száma még napjainkban is elenyésző. A szilikagél hordozóhoz kötött királis szelektor lehet kismolekulájú, szintetikus enantiomer, diasztereomer vagy természetes ill. szintetikus eredetű királis polimer, amelyek közül legelterjedtebbek a cellulóz, a ciklodextrin és a glikoprotein alapú oszlopok. A királis felismerés (elválasztás) az enantiomer molekulák és az immobilizált királis szelektor közötti átmeneti diasztereomer komplexek kialakulásán alapul. Termodinamikai szempontból ez akkor lehetséges, ha a két enantiomer királis szelektorral történő asszociációjának szabadenergia értékében eltérés mutatkozik, vagyis ∆∆G≠0. Az alacsonyabb szabadenergia értékű enantiomer-CSP komplex enantiomerje magasabb retenciós idővel vándorol, míg a nagyobb szabadenergia értékű komplex antipódja rövidebb idő alatt eluálódik az állófázisról. Az enantiomerek álló - és mozgó fázisra vonatkoztatott egyensúlyi állandóival (KR ill. KS) felírva a farmakon-CSP kölcsönhatáson alapuló szabadenergia változás értékeit (∆Go) (8), majd a két antipód esetén kifejezve a szabadenergia változások különbségét (∆∆Go) (9) a következő egyenletek írhatók fel [32]:

∆G° = -RTlnK ∆∆G° = ∆G°R - ∆G°S

(8) amennyiben

KR > KS

-∆∆G° = RTlnKR / KS= RTlnk’R / k’S = RTlnα

(9) (10)

ahol k’ a retenciós faktor;

α a szelektivitási faktor / enantioszelektivitás. A fentiek alapján a diasztereomer komplexek szabadenergia értékei közötti különbség a kromatográfiás rendszer sztereoszelektivításának nagyságát, míg a

21

vizsgálandó vegyület és a CSP között fellépő valamennyi királis és akirális kölcsönhatás eredő összege a mért retenciós időt határozza meg. Napjainkban már több, mint 100-féle királis kolonna van kereskedelmi forgalomban és számuk várhatóan a jövőben tovább emelkedik. [67]. Az irodalmi adatok azt tükrözik, hogy a királis állófázisokon végzett meghatározások száma rohamosan növekszik, hiszen a megfelelő szelektorok a racém vegyületek gyors és viszonylag egyszerű, rutinszerű analízisét teszik lehetővé. Többek között olyan molekulákét is, amelyek királis származékképzése a funkciós csoportok hiánya (pl.: szénhidrogének) vagy a könnyű racemizálódás miatt nem valósítható meg [68,69]. Az átmeneti diasztereomer komplexen belül a királis megkülönböztetés a Dalgliesh-féle hipotézis [70] szerint az ún. három-pontos kölcsönhatáson alapul, ami az enantiomer és a királis környezet között fennálló, minimum három, egyidejű kölcsönhatás eredménye. Mivel a kromatográfiás elválasztás nagyszámú kölcsönhatások eredőjének tekinthető, egy 105 elméleti tányérszámú oszlopon az enantiomerek és a királis állófázis között létrejövő kölcsönhatás már mindössze 42 J/mol szabadenergia érték különbség esetén alapvonal-elválsztást eredményez [71]. Bár számos CSP elválasztási mechanizmusa ismert, a legtöbb, elsősorban a természetes eredetű királis szelektor működését egyszerre több mechanizmus is befolyásolja, amelyek részleteiben még tisztázásra várnak [68]. A királis állófázisokon végzett meghatározások nemcsak analitikai, de preparatív szempontból is igen nagy jelentőségűek [72,73]. A gyógyszerfejlesztés korai fázisában egyre növekvő számban használnak preparatív és félpreparatív királis kolonnákat az új, hatékony királis gyógyszermolekulák tiszta enantiomerjeinek kinyerése céljából, ami új eszközként szolgál a kifejlesztés alatt álló királis vegyületek antipódjainak farmakológiai és toxikológiai vizsgálataihoz. Az eltérő szerkezetű állófázisok különféle lehetőségeket biztosítanak az analitikus számára a kívánt feladat megoldásához. Wainer [2] a királis kolonnákat öt alapvető csoportba osztotta az enantiomer és a CSP között létrejövő kölcsönhatások szerint. A kiterjedt kutatások eredményeként azonban folyamatosan jelennek meg újabb típusú királis szelektorok, amelyek nem minden esetben sorolhatók egyértelműen a Wainer-féle csoportokba. Említést érdemelnek közülük az Armstrong [74] által kifejlesztett makrociklusos antibiotikum (rifampicin, vankomicin és teikoplamin) alapú

22

szorbensek, ahol az elválasztás mechanizmusa leginkább a zárványkomplex-képzéshez hasonlítható, azonban a π-π, a dipólus-dipólus és a hidrogén-hidas kölcsönhatások mellett jelentős az ionos kölcsönhatások szerepe is. Teikoplamin alapú állófázison Doležalová és Tkaczyková [75] levodopa és metildopa, Cheung és mtsai [76] aril-oxifenoxi-propánsav enantiomer tisztaságának meghatározására alkalmas módszert dolgoztak ki. Pirkle és munkacsoportja [77] az NMR kutatások során szerzett tapasztalatok felhasználásával, az ún. három-pontos hipotézis alapján fejlesztette ki 1979-ben az első királis állófázist, amely a Wainer-féle osztályozás szerint az I. csoportba tartozik. A CSP-enantiomer komplex kialakításában π-π töltésátvitel, dipólus-dipólus kölcsönhatás, valamint hidrogén-hidas kötés vesz részt. A Pirkle-típusú normál fázisú kolonnák többsége kisméretű, szintetikus úton előállított aminosav származékot tartalmaz, ahol az egyik funkciós csoport a retenciós folyamatban döntő szerepet játszó töltésátviteli komplex kialakítása miatt aromás. A legismertebb π-akceptor szelektor a 3,5-dinitro-benzoil-fenilglicin, amely πdonor aromás gyűrűt tartalmazó racém vegyületek elválasztására alkalmas [78]. A legújabb kutatások eredményeként π-donor és π-akceptor csoportokat egyaránt tartalmazó szelektorok kerültek kifejlesztésre, mint pl.: a Whelk-O 1 oszlop, amelyet eredetileg az NSAID vegyületek enantiomerjeinek elválasztására szintetizáltak, jelenleg azonban szélesebb körű felhasználást nyernek, mint az eredeti Pirkle-típusú fázisok [79,80]. A II. csoportba tartozó állófázisok működésében a másodlagos kölcsönhatások mellett jelentős szerepet játszik a zárvány-komplex kialakulás. Ez a mechanizmus jellemző a cellulóz alapú szorbensekre, amelyek közül elsőként a cellulóz részleges hidrolízisével előállított természetes eredetű polimer, a mikrokristályos cellulóz-triacetát (MCTA) került felhasználásra [81]. A szorbens nagymértékű összenyomhatósága és inhomogén részecskemérete a hátrányos tulajdonságok közé tartozik, azonban nagy a kapacitása, alacsony az előállítási költsége és különféle szerkezetű, akár funkciós csoportot nem tartalmazó vegyületek elválasztására is alkalmas. Francotte és mtsai [82] behatóan vizsgálták az elválasztás mechanizmusát. Eredményeik igazolták Hesse és Hagel [83] eredeti elképzeléseit, miszerint a királis felismerés szempontjából alapvető

23

jelentőségű, hogy az enantiomerek a poliszacharid láncot felépítő glükóz egységek meghatározott térbeli elrendeződésű szerkezetébe beilleszkedjenek. A cellulóz-triacetát (CTA) immobilizálásával az állófázis hatékonysága és stabilitása jelentősen megnövekedett [84]. Okamoto és mtsai [85] további cellulóz, amilóz és más szénhidrátpolimer tribenzoát, valamint trisz-fenil-karbamát származékok előállításában vettek részt. Az irodalmi adatok alapján az enantiomer tisztaság meghatározására igen elterjedt a cellulóz trisz-(3,5-dimetil-fenil-karbamát) (Chiralcel OD) oszlop, amelynek felhasználásával pl.: Rustum és mtsa [86] a görcsgátló hatású R-tiagabin-klorid izomerben jelenlévő minor komponens kimutatási határát a többségi enantiomer mellett 0,03%-nak állapította meg. A gyógyszerkönyvek közül elsőként az Angol Gyógyszerkönyv (B.P.1998) ellenőrizteti az enantiomer tisztaságot királis HPLC módszerrel, amely az R-szelegilin vizsgálatára Chiralcel OD oszlopot ír elő [87a]. A cikkely követelménye szerint a kromatográfiás felbontás értéke (RS) ≥ 1,5, a szennyező antipód legfeljebb 0,5%-ban lehet jelen. Az Angol Gyógyszerkönyv azonos követelményt támaszt az (S)-dexklórfenil-amin-maleát esetében is, állófázisként azonban trisz-(3,5-dimetil-fenil-karbamát)amilózt alkalmaztat [87b]. Ez utóbbi vegyület 1999-ben hivatalossá vált az Európai Gyógyszerkönyvben (Ph.Eur.III.) is, amely az enantiomer tisztaság ellenőrzését a B.P.1998 megfelelő cikkelye szerint végezteti [88]. A III. csoport állófázisainál az enantioszelektivitás alapja a mintakomponensnek a szelektor királis üregébe történő megfelelő illeszkedése, a „host-guest” zárványkomplex képzés. A csoport klasszikus képviselője az Armstrong [89] által kifejlesztett, fordított fázisú rendszerben működő ciklodextrin (CD) alapú állófázis. Az elválasztás mechanizmusát a 3.2.2.1.2. fejezetben tárgyaltuk. A zárvány-komplex kialakulásának feltétele a mintakomponens királis centrumának közvetlen közelében lévő aromás gyűrű jelenléte. A kereskedelemben forgalomban lévő α-CD főleg az egy aromás gyűrűt tartamazó enantiomerek elválasztására alkalmas, a β-CD a naftil-csoport vagy a többszörösen szubsztituált fenil gyűrű jelenléte esetén biztosít megfelelő szelektivítást, míg a γ-CD a nagykiterjedésű vegyületek, pl. a szteroidok meghatározására alkalmas. A szélesebb körű felhasználhatóság céljából a cellulóz alapú fázisokkal analóg módon a ciklikus oligoszacharid molekulát felépítő glükózegységek szekunder

24

alkoholos hidroxil-csoportjainak származékképzésével további CD-alapú oszlopokat is kifejlesztettek [90]. A koronaéter alapú zárvány-komplex képző állófázis belső felülete hat darab oxigén jelenléte miatt poláris, míg külső felszíne apoláris tulajdonságú. A szelektor primer amino-csoportot tartalmazó enantiomerek elválasztására alkalmas, ahol a királis atomon vagy a közvetlen közelében lévő másik szénatomon az aromás gyűrű szubsztitúció a szelektivítást fokozza. Az enantiomerek királis üregbe történő illeszkedését a sztérikus kölcsönhatások mellett a protonált amino-csoport jelenléte segíti elő. Az oxigén atomok nemkötő elektronpárjai a szubsztituált ammónium ionokkal hidrogén-hidak kialakításával képeznek stabil komplexet [91]. Mivel mind a balra, mind a jobbra forgató koronaéter alapú állófázis kereskedelmi forgalomban van, lehetőség nyílik a szennyező antipód meghatározásakor a kedvező elúciós sorrend biztosítására. A királis felismerés mechanizmusa alapján ugyanebbe a csoportba tartoznak a Blaschke és mtsa [92] által kifejlesztett helikális poliakrilamid és polimetakrilamid alapú állófázisok, amelyek közül említést érdemel a poli-(N-akriloil-S-fenilalaninetilészter) származék [68]. A IV. típusú állófázisokat a Davankov [93] által meghonosított ligandumcserés folyadékkromatográfiás szorbensek alkotják. Az elválasztás - amint a 3.2.2.1.2. fejezetben ismertetettük - az eltérő stabilitású, reverzibilis terner diasztereomer fémkomplexek kialakulásán alapul. A komplex központi fémionja rendszerint Cu2+, a királis komplexképző ligandum egy kelátképzésre alkalmas, lehetőség szerint ciklusos α-aminosav, L-prolin vagy L-hidroxiprolin, amelyek a Cu2+ -vel igen hatékony királis szelektornak bizonyultak [94,95]. A módszer alkalmazása jelenleg csak a meglehetősen stabil kelátkomplexek kialakítására képes α-aminosav, valamint α-hidroxisav enantiomerek analízisére korlátozódik. A Wainer-féle osztályozás szerint az V. csoportba tartoznak a fehérje alapú állófázisok. A királis felismerésben egyaránt jelentősek a hidrofób és a poláris kölcsönhatások, azonban az elválasztás mechanizmusa valamennyi eddig tárgyalt szelektorral összehasonlítva a legösszetettebb. A fehérjék a biológiai rendszerekben különböző szerepet töltenek be. Többek között receptorok, mediátorok és enzimek

25

építőkövei, ezen kívül részt vesznek a farmakonok aktív transzport útján történő felvételében, szállításában, ami a gyógyszermolekulák reverzibilis kötődésén alapul és számos esetben nagyfokú sztereoszelektivítást mutat [96]. Például a nem szelektív βszimpatolitikus hatású propranolol in vitro sztereoszelektíven kötődik a humán α1–savas glikoproteinhez (AGP) és a humán szérum albuminhoz (HSA), azonban míg a humán AGP-hez az S-(−)-propranolol kötődik nagyobb affinitással [97], addig a HSA esetén fordított szelektivítást figyeltek meg [98]. A fehérjék azon tulajdonsága, hogy a farmakonokat reverzibilis módon, sztereoszelektíven képesek kötni, protein alapú királis állófázisok kifejlesztésére használható fel. A jelenleg forgalomban lévő állófázisok közül említendők a szilikagélre immobilizált AGP-t [99], HSA-t [100], szarvasmarha szérum albumint [101], csirketojás fehérje részéből izolált ovomukoidot (OVM) [102] és mikrobális eredetű cellobiohidrolázt [103] tartalmazó oszlopok. A fenti szelektorok egyik legelőnyösebb tulajdonsága, hogy egymástól lényegesen eltérő szerkezetű vegyületek esetében is alkalmazhatók. Azonban míg a cellobiohidroláz bázikus és semleges, az albumin savas és semleges karakterű molekulák analízisére használható, addig az AGP és az OVM egyaránt alkalmas savas, bázikus és semleges tulajdonságú farmakonok enantiomerjeinek elválasztására. Jelentőségüket

mutatja

az

is,

hogy

az

Európai

Gyógyszerkönyv

Gyógyszerkönyvi Bizottságának döntése alapján a kálcium-levofolinát - amely a Ph. Eur. IV. kiadásában lesz hivatalos – enantiomer tisztaságának ellenőrzésére a megfelelő cikkely Chiral-HSA oszlopot ír elő. A gyógyszerkönyv az alábbi követelményeket támasztja: RS≥1,5, a disztomer legfeljebb 0,5%-ban lehet jelen [104]. Bár a fehérje alapú állófázisok nagyfokú sztereoszelektivítást mutatnak, az egységnyi tömegű szilikagél hordozóra immobilizált viszonylag kis mennyiségű szelektor miatt az állófázis kapacitása meglehetősen alacsony. Napjainkban azonban az újabb technológiai eljárások a félpreparatív kolonnák megjelenéséhez vezettek, amelyekkel az optimált kromatográfiás rendszerből az egyes enantiomerek 100%-os királis tisztasággal nyerhetők ki [67]. A szelektorok komplex szerkezeti felépítése miatt a királis felismerést egyidejűleg többféle kromatográfiás mechanizmus határozza meg, amelyek máig sem ismertek részleteiben. A mintakomponensek kémiai szerkezetének és a mozgó fázis

26

összetevőinek a retencióra, valamint az enantioszelektivításra gyakorolt hatását szisztematikusan vizsgálva számos következtetés vonható le. Hasonlóképpen értékes információkat nyújtanak a natív fehérjemolekulák szerkezetvizsgálati módszerei (pl.: CD [105], fluoreszcencia spektroszkópia [106], UV differencia spektroszkópia [107]), amelyek segítségével a fehérjék esetleges konformációs átalakulásai követhetők nyomon. Valamenyi, az V. csoportba tartozó állófázis a nagyszámú hidrofób aminosavrész miatt fordított fázisú rendszerben működik. Ennek megfelelően a mozgó fázishoz adott szerves oldószer a legtöbb esetben mindkét enantiomer retencióját csökkenti a protein és a farmakon között fellépő hidrofób kölcsönhatás gyengítése révén, ugyanakkor az enantioszelektivitásra eltérő hatást gyakorolhat [108]. A változás előre pontosan nem jelezhető, mindig az adott vegyület szerkezete és a kromatográfiás rendszer összetétele együttesen határozza meg. Amennyiben a módosító az enantiomerekkel azonos kötőhelyhez kötődik, a retenciót csökkenti, amennyiben viszont eltérő kötőhelyhez kapcsolódik, az enzim-kémiából ismert allosztérikus kölcsönhatás

előidézője

lehet,

ami

egyúttal

megváltozásához is vezet [109].

27

a

kötőhelyek

tulajdonságainak

3.2.2.1.3.1. Az AGP-alapú folyadékkromatográfiás állófázis 3.2.2.1.3.1.1. Az AGP szerkezete Az α1–savas glikoprotein (AGP, orozomukoid) a humán plazma α1–globulin frakciójának alkotórésze, amelyet 1950-ben egymástól függetlenül izolált Winzler [110] és Schmid [111]. Winzler a perklórsavban oldékony plazmaproteinek, míg Schmid a plazma Cohn V. frakciójának etanolos kicsapását (14v/v% etanol:víz, pH=5,8, 5°C) követően oldatban maradt vegyületek analízise során mutatta ki az AGP-t, mint főkomponenst. Schmid ezt követően 40 évet áldozott a molekula szerkezetének és tulajdonságainak vizsgálatára, biológiai szerepének feltárására. 1972-ben leírta, hogy az AGP egyszerű polipeptid láncát 181 aminosavegység építi fel, amelynek N-terminálisa pirrolidin-karboxilsav, C-terminálisa szerin egység [112]. Közölte az 1. ábrán látható teljes aminosavsorrendet, a két diszulfid híd helyzetét az 5-ös és a 147-es, illetve a 72-es és 164-es cisztein-részek között, valamint a 21 helyen végbemehető aminosavcseréket [113]. *

20

PCA –Ile –Pro –Leu –Cys –Ala –Asn –Leu –Val –Pro –Val –Pro –Ile –Thr –Asn –Ala –Thr – Leu – Asp – Arg – Gln

*

40

Ile – Thr – Gly –Lys –Trp –Phe –Tyr – Ile – Ala –Ser –Ala –Phe –Arg –Asn –Glu –Glu –Tyr –Asn – Lys – Ser – Ala

*

60

Val –Glu –Glu –Ile – Gln –Ala – Thr –Phe –Phe –Tyr –Phe –Thr –Pro –Asn – Lys –Thr – Glu –Asp –Thr –Ile – Ala

*

80

Phe –Leu –Arg –Glu –Tyr –Gln –Thr –Arg –Gln –Asp –Gln –Cys –Ile –Tyr – Asn –Thr –Thr –Tyr – Leu –Asn – Phe Ser Ser

*

100

Val –Gln –Arg –Glu –Asn –Gly –Thr –Ile – Ser – Arg –Thr –Val –Gly –Gly –Gln –Glu – His –Val – Ala–His – Val Glu Arg Phe 120

Leu –Leu –Ile –Leu –Arg –Asp –Thr –Lys –Thr –Leu –Met –Phe –Gly –Ser – Tyr –Leu –Asp –Asp –Glu –Lys – Tyr Leu Ala Phe Asp Val Asn 140

Asn –Trp –Gly –Leu –Ser –Phe –Tyr –Ala –Asp –Lys –Pro –Glu –Thr –Thr – Lys – Glu –Gln –Leu –Gly–Glu – Val 160

Phe –Tyr –Glu –Ala –Leu –Asp –Cys –Leu –Cys –Ile – Pro –Arg –Ser –Asp – Val –Met –Tyr –Thr –Asp–Trp – Arg Lys Val 180

Lys –Lys –Asp –Cys –Glu –Pro –Leu –Glu –Lys –Gln –His –Glu –Lys –Arg –Lys - Gln –Glu –Glu –Gly –Glu – Ser–COOH

1. ábra. Az AGP aminosavsorrendje

28

Az AGP molekula disszociábilis funkciós csoportokkal rendelkező építőelemeinek szerkezetét, pKa értékét [114,115] és előfordulási számát foglalja össze a 2. táblázat. A nagyszámú

savas

tulajdonságú

aminosav-egység,

valamint

a

szénhidrátrész

felépítésében résztvevő tizennégy szialinsav molekula folytán a glikoprotein savas tulajdonságú, amit izoelektromos pontja pI≅2,7 jellemez [116]. 2. táblázat. Az AGP ionizálhazó szerkezeti elemei

Ionizálható komponens Aszparaginsav

CH2

CH2

Glutaminsav Tirozin

CH2

COOH

CH2

COO

4,2

12

4,5

20

OH

CH2

+ O + H

10,1

12

+

6,0

3

( CH )

2 4

CH2

+

NH

( CH2 ) 4

+

10,5

13

NH

15,0

11

≤3

14

+

+ H

+

N

(CH2 )4

NH3

C NH2

( CH )

+

C NH2 + H

NH

2 4

+

NH H2C OH

H2C OH HO CH

HO CH

HO

HO

+

CH

HO O

NHCOCH3

CH

OH

NH2

H

OOC

NHCOCH3 OH

OH CH2

+ H

CH

HO O

H

HOOC

+ H

NH2 + H

NH2

Szialinsav

+

H N

H N CH2

+ H

COO

-

CH2

Lizin

Szerin

Egység szám

-

CH2

COOH

CH2

Hisztidin

Arginin

pKa érték

Disszociábilis R szubsztituens

CH2

COOH

OH

CH

+ COO + H

2,1

1

NH2

Az AGP molekulasúlya 40 kDA, aminek – a glikoproteinek körében szokatlanul magas - 40%-át szénhidrátrész alkotja. A szénhidrátrész a 2. ábrán csillaggal jelzett 5 helyen, a 15, 38, 54, 75 és 85-ös helyzetben lévő aszparagin egységek β-karboxil csoportján keresztül N-glikozidos kötéssel kapcsolódik a polipeptidlánchoz [117]. Az elágazásokat tartalmazó cukorrész felépítésében N-acetil-glükózamin (GlnNAc), Dmannóz (Man), D-galaktóz (Gal), L-fukóz (Fuc) és N-acetil-neuraminsav (szialinsav)

29

vesz részt, amelyek közül az L-fukóz és a terminálisan elhelyezkedő szialinsav a glikoproteinek jellegzetes szénhidrátkomponensei. Mountreuil [118] 1980-ban H1 NMR spektroszkópiás vizsgálattal leírta a cukorkomponensek kapcsolódását és az elágazások számától függően bi-, tri- és tetraantennális szerkezetű, maximálisan 15 monoszacharidból álló oligoszacharid láncok jelenlétét igazolta. A 2. ábra az oligoszacharid láncok lehetséges szerkezetét mutatja, amelyek közül adott glikozidációs helyhez minden esetben csak egy lánc kötődhet. Valamennyi oligoszacharid-rész láncvégi tagjaként a galaktóz-egységekhez α(2→3) vagy α(2→6) glikozidos kötéssel szialinsav molekulák kapcsolódhatnak. Mindezen kapcsolódási lehetőségek alapján az irodalomban eddig több, mint 40 féle AGPszénhidrátrész szerkezetet írtak le [119]. Az AGP mikroheterogén jellegéhez tehát a fehérjeláncban előforduló nagyszámú aminosavcserén kívül a szénhidrátrész igen változatos felépítése is hozzájárul. A mikroheterogén szerkezet e jellemzői bizonyos patológiás esetekben diagnosztikus jelentőségűek lehetnek [120,121].

30

Galβ(1→4) GlcNAcβ(1→2) Manα(1→3) Manβ(1→4) GlcNAcβ(1→4) GlcNAcβ1→Asn Galβ(1→4) GlcNAcβ(1→2) Manα(1→6)

Galβ(1→4) GlcNAcβ(1→4) Galβ(1→4) GlcNAcβ(1→2) Manα(1→3) Manβ(1→4) GlcNAcβ(1→4)GlcNAcβ1→Asn Galβ(1→4) GlcNAcβ(1→2) Manα(1→6)

Fucα(1→3) Galβ(1→4) GlcNAcβ(1→4) Galβ(1→4) GlcNAcβ(1→2) Manα(1→3) Manβ(1→4) GlcNAcβ(1→4) GlcNAcβ1→Asn Galβ(1→4) GlcNAcβ(1→2) Manα(1→6)

Galβ(1→4) GlcNAcβ(1→4) Galβ(1→4) GlcNAcβ(1→2) Manα(1→3) Manβ(1→4) GlcNAcβ(1→4) GlcNAcβ1→Asn Galβ(1→4) GlcNAcβ(1→2) Manα(1→6) Galβ(1→4) GlcNAcβ(1→6)

Fucα(1→3) Galβ(1→4) GlcNAcβ(1→4) Galβ(1→4) GlcNAcβ(1→2) Manα(1→3) Manβ(1→4) GlcNAcβ(1→4) GlcNAcβ1→Asn Galβ(1→4) GlcNAcβ(1→2) Manα(1→6) Galβ(1→4) GlcNAcβ(1→6)

2. ábra. Az AGP felépítésében résztvevő szénhidrátláncok

31

3.2.2.1.3.1.2. Az AGP tulajdonságai Az AGP igen jól oldódik vízben és számos poláris szerves oldószerben (pl. 2-klóretanol) valamint etanol-víz 1:1 arányú elegyében. Oldékonysága adott rendszerben az ionerősség növelésével (5→20 mM NaCl) a globulinokra jellemző módon nő [122]. Az optikai forgatóképesség mérésével és CD spektroszkópiás analízissel kimutatható, hogy a fehérje 6 M urea vagy 4 M guanidin-klorid jelenlétében reverzibilisen, míg vizes oldatát 100 °C-on 24 órán keresztül forralva irreverzibilisen denaturálódik [123]. Az AGP konformációs módosulatai könnyen alakulnak át a natív formából α-hélix, βredőzött vagy random módosulattá, illetve helikális vagy β-redőzött szerkezetből nem rendezett formává. Ezeket a másodlagos szerkezeteket sajátos CD Cotton-hatás görbék jellemzik. [124]. Az AGP térbeli elrendeződése pontosan nem ismert, mivel a röntgendiffrakciós

meghatározás

a

szénhidrátrész

nagyfokú

konformációs

változatossága miatt nem végezhető el [125]. A molekula harmadlagos szerkezetéről azonban értékes információt nyújt a fehérje felszínén található ún. „szabad” és a molekula hidrofób belsejében levő ún. „rejtett” aminosav-egységek vizsgálata, amellyel a konformációs átalakulások is nyomon követhetők. Schmid [126] fluoreszcencia spektroszkópiás mérései alapján fiziológiás pH-n a triptofán (Trp) 122 az oldószermolekulák számára hozzáférhetőnek, a Trp 25 és Trp 60 „rejtett” aminosav-egységnek bizonyult. Karpenko és mtsai [127,128] fluorimetriás, valamint UV differencia spektroszkópiás meghatározással pH=7,0-es foszfát pufferben tíz „rejtett” karboxil - és kilenc „rejtett” tirozin-egységet mutattak ki. Az AGP egyike a legintenzívebben tanulmányozott plazmaproteineknek. Bár 50 éve izolálták, ismert a teljes aminosavszekvenciája, igazolt az immunglobulinok aminosavsorrendjével mutatott nagyfokú azonossága [129], leírták néhány biológiai vonatkozású tulajdonságát is, de biológiai szerepe mindeddig még nem pontosan tisztázott. Az AGP azon tulajdonsága, hogy stressz állapotok, valamint különböző megbetegedések hatására koncentrációja változik, patofiziológiai funkcióra enged következtetni. Az egészséges embernél mért plazmaszint értéke 0,55-1,34 g/L [130], amely nagymértékben emelkedik traumák pl. műtéti beavatkozások, bakteriális fertőzések

és

szívizominfarktus

következtében,

32

továbbá

bizonyos

krónikus

megbetegedések pl. rheumatoid arthritis, tuberkulózis és daganatos kórképek során [131]. A daganatos betegségek és az AGP heterogén formáinak kapcsolata kiterjedt kutatás tárgyát képezi, mivel bizonyos kórképek specifikus szénhidrát-szerkezettel jellemezhetők [132]. Kremmer [121] részletesen tanulmányozta az AGP tumor marker szerepét. Rosszindulatú daganatos megbetegedésekben az AGP plazmaszint, a fukóz és a szialinsavtartalom, valamint a tetra-antennális elágazású oligoszacharidláncok mennyiségének szignifikáns növekedését írta le az egészséges kontrollcsoporthoz képest. Az AGP, mint plazmafehérje számos gyógyszermolekulát köt meg, ezáltal jelentős mértékben hozzájárul az adott vegyület farmakokinetikai és farmakodinámiás jellemzőinek kialakításához. Az első AGP-farmakon kölcsönhatásról szóló közlemény 1971-ben jelent meg, amelyben Kopitar és mtsa [133] az értágító hatású dipiridamol specifikus kötődéséről számolt be. Az AGP elsősorban bázikus tulajdonságú farmakonok, többek között a β-adrenerg blokkolók [134], a pszichotróp hatású gyógyszermolekulák közül az imipramin és a klórpromazin [135], valamint az antiaritmiás

tulajdonságú

verapamil

[136]

fő

plazmakötőhelyének

bizonyult.

Számottevő továbbá a szteránvázas vegyületek, különösen a progeszteron [137] és néhány savas tulajdonságú farmakon pl. warfarin kötődése, amit Urien és mtsa írt le 1982-ben [138]. Annak ellenére, hogy a gyógyszervegyületek AGP-hez történő kötődése már évtizedek óta ismert, annak királis vonatkozásait csak az 1980-as évek közepétől vizsgálják. A kutatási eredmények azt mutatják, hogy a biológiai hatás szempontjából kevésbé aktív (+)-verapamil [139], valamint a farmakológiai hatást hordozó S-(−)propranolol [97], S-(+)-disopiramid [140] és S-(−)-warfarin [141] erősebben kötődik az AGP-hez, mint a megfelelő antipódok. Meglepő módon a sztereoszelektivítási faktor értéke valamennyi fent említett, egymástól lényegesen eltérő szerkezetű és farmakológiai hatású vegyületek esetén közel azonosnak (≈2) adódott [139]. Ennél jelentősebb

mértékű,

négyszeres

sztereoszelektivítást

mutat

a

β-adrenerg

szimpatomimetikus hatású (−)-izoproterenol [142] és a β-adrenerg blokkoló (−)tertatolol [143] eutomerek plazmakötődése.

33

Bár ismert az AGP elsődleges szerkezete, kevés információ áll rendelkezésre a kötőhely(ek) szerkezetére és helyzetére vonatkozóan. A farmakon-kötődési vizsgálatok alapján egy nagy és számos alacsony affinitású kötőhely jelenléte valószínűsíthető az AGP molekula felületén, amelyek funkciós csoportjai eltérő kémiai szerkezetű ligandumokkal képesek kölcsönhatásba lépni. Mivel a kötőhelyek struktúráját a fehérje harmadlagos szerkezete határozza meg, az AGP molekula környezetének változása pl. szerves oldószer jelenléte, a pH és az ionerősség módosítása a kötőhelyek aktuális kölcsönhatásképességét eltérő módon befolyásolja. Kuroda [144] vizsgálatai alapján az oligoszacharid láncok a kötőhely kialakításában közvetlenül ugyan nem vesznek részt, azonban a glikoprotein fiziológiás működéséhez a polipeptidlánc és a szénhidrátrész együttes jelenléte szükséges. A fehérjerész konformációjának megőrzésében ugyanis a szialinsavat tartalmazó szénhidrátrész jelentős szerepet játszik [145]. 3.2.2.1.3.1.3. Az állófázis előállítása

A fehérje alapú királis állófázisok közül elsőként 1983-ban Hermansson [97] immobilizálta szilikagél hordozóra a humán szervezetben is jelenlévő α1-savas glikoproteint. Az AGP-t nagyszámú humán plazma minta Cohn V. frakciójából izolálta Hao és Wickerhauser [146] módosított eljárása szerint. Az első generációs állófázis előállítása során (EnantioPac) a szelektort 10 µm részecske átmérőjű, nagy felületű és pórus átmérőjű (250 Å) dietil-amino-etil szilikagélhez adszorpcióval rögzítette, majd az egymással szomszédos proteinláncokat keresztkötésekkel stabilizálta. A keresztkötések kialakítása a glikoprotein szénhidrát-komponenseinek jelenlétén alapul (3. ábra). A cukrok alkoholos hidroxil-csoportjait nátrium-jodáttal aldehid csoportokká oxidálják, amelyek a fehérje N-terminális-részével Schiff-bázisokat képeznek. Ezt követően az imines csoportok nátrium-ciano-borohidriddel végzett redukciójával a hidrolitikus behatásokkal szemben stabilabb kötéseket hoznak létre [147]. A jelenleg forgalomban lévő második generációs Chiral-AGP oszlop esetében a keresztkötések kialakítását megelőzően a szelektort kovalens kötéssel immobilizálják a jóval kisebb pórustérfogattal jellemezhető (120 Å), gömbalakú, 5 µm részecske átmérőjű, porózus szilika hordozóhoz [148]. A kovalens kötésű immobilizáció és a hordozó jobb anyagi minősége következtében az állófázis működése és stabilitása jelentős mértékben javult. A keresztkötések kialakításával ugyan módosul a fehérje

34

konformációja, a fenotiazinvázas vegyületekkel végzett modellkísérlet alapján azonban a natív és az immobilizált AGP kötőhelyeinek tulajdonságai nagyfokú hasonlóságot mutatnak [59].

cukor-rész

cukor-rész

fehérje

N

O H C

NaIO4

H2N

CH

H C O

H2N

H C N

N CH

NaBH3CN

NH CH2

H2 C N H

HN CH2

3. ábra. Az AGP szelektor keresztkötéseinek kialakítása

3.2.2.1.3.1.4. Az állófázis alkalmazása A Chiral-AGP oszlop egyik legelőnyösebb tulajdonsága, hogy fordított fázisú rendszerként működik, lehetővé téve vizes alapú pufferek eluensként történő alkalmazását, így a kromatográfiás rendszerrel jól modellezhetők a biológiai folyadékterek. A retenció és a szelektivitás tág határok között változtatható a mozgó fázis összetételének módosításával, szerves oldószerek hozzáadásával, az eluens ionerősségének és pH-jának, valamint a puffer anyagi minőségének változtatásával, továbbá a hőmérséklet szabályozásával. A leggyakrabban alkalmazott mozgó fázisok egyike

a

pH=7,2-es,

0,01

M

foszfát

puffer,

amelyben

számos

gyógyszermolekula enantiomerjeinek alapvonal-elválasztása érhető el [149].

35

bio-

és

A szerves oldószerek közül legelterjedtebb az acetonitril, a 2-propanol és a metanol, amelyeket a retenció csökkentésére vezettek be. Metilfenobarbitál esetében azonban a mindössze 2v/v% 2-propanol alkalmazása nemcsak a 40 perces retenciós időt csökkentette le jelentős mértékben, hanem alapvonal-elválasztáshoz is vezetett [150]. Az enantioszelektivitás szempontjából döntő jelentőségű a szerves módosító anyagi minősége is, amit a verapamil példája igazol. Módosítóként 10v/v% acetonitrilt használva alapvonal-elválasztást tapasztaltak, míg az azonos retenciós időt biztosító 4v/v% 1-propanol jelenlétében a királis elválasztás nem ment végbe [149]. Szelektív kölcsönhatásra utal, hogy a warfarin enantiomerek elválasztása során módosítóként használt 15v/v% 2-propanolt 15v/v% acetonitrilre cserélve az elúciós sorrend megfordul [151]. Mindezek a példák a Chiral-AGP oszlop sajátos szorpciós tulajdonságait igazolják. Hermansson [152] behatóan vizsgálta az állófázis tulajdonságait, különös tekintettel a szerves módosítók kromatográfiás paraméterekre gyakorolt hatására. Meghatározta pH=7,2-es 0,01 M foszfát puffer alkalmazásakor az állófázison megkötődött acetonitril és 2-propanol mennyiséget, azonban az AGP konformációváltozását igazoló adatokhoz nem jutott. Schill és Arvidsson [153] a töltéssel rendelkező szerves módosítók – dimetiloktil-amin (DMOA) és oktánsav – bázikus, valamint savas tulajdonságú vegyületek retenciójára

kifejtett

hatását

vizsgálta

részletesen.

A

hidrofób

kötőhelyeken

ionpárképződés, a disszociábilis funkciós csoportot tartalmazó kötőhelyeken pedig ioncsere mechanizmus lehetőségéről számoltak be. A 3. táblázatban néhány példát említünk meg az AGP alapú szorbens felhasználására, megjegyezve, hogy alkalmazása az enantiomer tisztaság vizsgálatára viszonylag csekély mérvű. Görög és mtsa [154] a cisz-(+)-diltiazem enantiomerben <1% mennyiségben jelenlévő szennyező antipód kimutatására és mennyiségi meghatározására alkalmas módszert dolgozott ki. Egészen a közelmúltig azonban további, az enantiomer tisztaság meghatározására vonatkozó dolgozatot csupán Francotte [155] közölt, aki a valsartan 0,1%-ban jelenlévő minor komponensét határozta meg.

36

3. táblázat. A Chiral-AGP oszlop alkalmazásának néhány példája

Vegyület

Mozgó fázis

k’1

α

Irodalom

acenokumarol

10v/v% 2-propanol 0,01 M pH=7,0 foszfát pufferben

3,90 1,28

[156]

atenolol

0,01 M pH=7,2 foszfát puffer

4,58 1,31

[157]

bupivakain

6v/v% 2-propanol 0,01 M pH=7,2 foszfát pufferben

8,84 1,72

[158]

ciklopentolát

0,05M oktánsav 0,02 M pH=7,0 foszfát pufferben

3,5

1,5

[159]

diltiazem

10v/v% 2-propanol 0,01 M pH=7,0 foszfát pufferben

11,2 1,29

[154]

dizopiramid

0,5v/v% 2-propanol 0,02 M pH=4,1 acetát pufferben

2,78 3,41

[160]

ethotoin

0,01 M pH=4,5 foszfát puffer

4,06 3,82

[149]

flumecinol

10v/v% 2-propanol 0,01 M pH=7,0 foszfát pufferben

8,41 1,34

[154]

1,77 1,57

[149]

2-fenoxi-propionsav 0,01 M pH=5,5 foszfát puffer ibuprofen

0,01 M pH=6,5 foszfát puffer

5,5

1,5

[161]

ketoprofen

2,5mM DMOA 0,01 M pH=7,2 foszfát pufferben

5,26 2,08

[161]

mepivakain

6v/v% 2-propanol 0,01 M pH=7,2 foszfát pufferben

2,48 1,36

[158]

naproxen

0,5% metanol 0,01 M pH=6,5 foszfát pufferben

5,2

2,3

[161]

nimodipin

10v/v% 2-propanol 0,03 M pH=4,5 foszfát pufferben

9,8

1,29

[162]

oxprenolol

11,4v/v% etanol 0,01 M pH=7,0 foszfát pufferben

16,1 1,29

[157]

pindolol

15v/v% metanol 0,01 M pH=7,0 foszfát pufferben

13,9 1,21

[149]

prometazin

1v/v% acetonitril 0,01 M pH=4,0 acetát pufferben

7,68 1,32

[160]

valsartan

15v/v% 2-propanol 0,01 M pH=7,0 foszfát pufferben

6,04 1,82

[155]

verapamil

10v/v% 2-propanol 0,01 M pH=7,2 foszfát pufferben

15,6 1,32

[149]

warfarin

10v/v% acetonitril 0,01 M pH=7,0 foszfát pufferben

12,8 1,51

[156]

3.2.2.1.3.1.5. Az állófázis stabilitása Hermansson [163] mélyrehatóan vizsgálta az állófázis stabilitását is, többek között az injektált anyagmennyiség, a hosszantartó, folyamatos alkalmazás, a hőterhelés, a tiszta szerves oldószerek és a töltéssel rendelkező, akirális additívek kromatográfiás jellemzőkre gyakorolt hatását. A szelektor korlátozott kapacitása miatt általánosan elfogadott, hogy ideális esetben az injektált anyagmennyiség 3-5 nmol, ami még szimmetrikus csúcsot eredményezhet [148]. Az állófázison 40000-szeres oszloptérfogatnak megfelelő mennyiségű, 6v/v% 2-propanol-0,01 M pH=7,0-es foszfát puffer tartalmú eluens átáramoltatását követően a bupivakain és a mepivakain tesztvegyületek k’ és α értékei a vizsgálat kezdetén mért értékekhez képest kevesebb, mint 10%-os eltérést mutattak. A hőmérsékletet 76,5°C-ra emelve az oszlop 37

működésében lényeges változás nem volt tapasztalható. Ugyancsak jól tűri a szelektor a szerves oldószer jelenlétét, mivel tiszta 2-propanol (180 ml) 14 órán keresztül tartó áramoltatása a kromatográfiás elválasztáson szignifikánsan nem rontott. A fehérje denaturálódásának elkerülése végett azonban a szerves módosítók legfeljebb 25v/v% mennyiségben alkalmazhatók biztonsággal [148]. Ugyanakkor aminok, pl. DMOA, valamint magas szénatomszámú savak pl. oktánsav eluenshez történő hozzáadása - a módosító irreverzibilis kötődése miatt - az állófázis tulajdonságait lényegesen megváltoztatja. Így például fenotiazinvázas vegyületeknél a DMOA jelenléte a szelektivitást ugyan javítja, az oszlop élettartamát azonban jelentősen rontja [149]. Ennélfogva ionos additíveket csak az e célra rendszeresített állófázison célszerű alkalmazni.

38

4. KÍSÉRLETI RÉSZ

4.1. Anyagok, eszközök 4.1.1. Vegyszerek, modellvegyületek

A kromatográfiás eluensek készítéséhez HPLC minőségű acetonitril (Merck), dioxán (Fluka), 2-propanol (Chemolab) és etanol (95,5v/v%) (Merck) oldószereket használtunk fel. A dioxánt tisztítás céljából négy napon keresztül szilárd káliumhidroxidon

(Fluka)

tároltuk,

felhasználás

előtt

frissen

desztilláltuk

és

peroxidmentességét minden esetben 10%-os kálium-jodid oldattal ellenőriztük. A pufferkészítéshez analitikai minőségű dinátrium-hidrogén-foszfátot (Reanal), nátriumdihidrogén-foszfátot (Reanal), foszforsavat (Reanal), nátrium-hidroxidot (Reanal), nátrium-acetátot (Fluka), nátrium-kloridot (Ph. Hg. VII.) és kétszer desztillált vizet (Ph. Hg. VII.) használtunk. Az analitikai tisztaságú 1-butanolt a Fluka cégtől szereztük be. A CD- és a fluoreszcencia spektroszkópiás vizsgálatokhoz felhasznált natív α1savas glikoprotein a Sigma-Aldrich cégtől származik. A fluoreszcencia-kioltásos titráláshoz 2,2,2-triklór-etanolt (Fluka) és etilén-glikolt (Fluka) alkalmaztunk. Az enantiomer tisztaság meghatározás alapjául szolgáló optimált kromatográfiás rendszereket az alábbi modellvegyületek felhasználásával dolgoztuk ki:  (±)-atenolol (Sigma-Aldrich)  R-(+)-atenolol (Sigma-Aldrich)  S-(−)-atenolol (Sigma-Aldrich)  (±)-bupivakain (AstraZeneca)  (±)-klórtalidon (Biochemie)  (±)-fluoxetin (Lilly)  (±)-glutetimid (Richter Rt.)  (±)-hexobarbitál (ICN Magyarország Rt.)  (±)-ibuprofen (Sigma-Aldrich)  R-(−)-ibuprofen (Pharmacia-Upjohn)  S-(+)-ibuprofen (Sigma-Aldrich)  (±)-ketamin (Richter Rt.)

39

 (±)-metoprolol (Sigma-Aldrich)  (±)-norgesztrel (Richter Rt.)  D-(−)-norgesztrel (Sigma-Aldrich)  (±)-pindolol (Sigma-Aldrich)  (±)-propranolol (Sigma-Aldrich)  R-(+)-propranolol (Sigma-Aldrich)  S-(−)-propranolol (Sigma-Aldrich)  (±)-tolperizon (Richter Rt.)  R-(−)-tolperizon (Richter Rt.) A potenciális cholecystokinin (CCK) antagonista racém 4(3H)-kinazolon származékokat (1-6) a Semmelweis Egyetem Gyógyszerészi Kémiai Intézetének szerves kémiai munkacsoportja állította elő [164]. A vegyületek olvadáspontját Boeius olvadáspontmérő

készülékkel,

tisztaságát

vékonyrétegkromatográfiás,

valamint

fordított- és normál fázisú HPLC-vel ellenőrizték [165]. A homológ modellvegyületek spektrális (IR, NMR, UV) és röntgendiffrakciós adatai megfeleltek az 5.4.2. alfejezetben megadott szerkezeteknek [166]. 4.1.2. Eszközök, készülékek  ISCO M2350 izokratikus HPLC pumpa (Lincoln, NE USA)  10 µl-es hurokkal ellátott Rheodyne M7125 injektor (Cotati, CA USA)  ISCO V4 változtatható hullámhosszú UV detektor (Lincoln, NE USA)  Jones Chromatography M7955 oszlop-termosztát (Hangoed, Anglia)  Barspec Data System integrátor programcsomag  α1-savas glikoprotein tartalmú Chiral-AGP analitikai oszlop (100×4,0 mm I.D., szemcseátmérő 5 µm) (ChromTech, Hägersten, Svédország)  Chiral-AGP analitikai oszlop (150×4,0 mm I.D., 5 µm) (ChromTech, Hägersten, Svédország)  Chiral-AGP előtét-oszlop (50×4,0 mm I.D., 5 µm) (ChromTech, Hägersten, Svédország)  PHM3 pH-mérő készülék (Radiometer, Lyon, Franciaország)

40

 Ultrahangfürdő (Branson, Danbury, CT, USA)  Hewlett Packard M 5710A gázkromatográf, lángionizációs detektorral (Boblingen, Németország)  10% PEG 20M tartalmú Chromosorb W-AV-DMSC (80-100 mesh) üvegkolonna (2 m x 2 mm I.D.)  Jasco J-720 CD spektropolariméter (Tokyo, Japán)  Hitachi F-4500 fluoreszcencia spektrofotométer (Tokyo, Japán)  Statisztika 5.0 matematikai és statisztikai programcsomag

4.2. Vizsgálati módszerek 4.2.1. Az állófázis szorpciós tulajdonságainak gázkromatográfiás vizsgálata A Chiral-AGP kolonnán a gyakorlatban mozgó fázisként legáltalánosabban pH=7,2-es 0,01 M foszfát puffert alkalmaznak. Mivel egyes szerves oldószerek eluenshez történő hozzáadása számos esetben az enantioszelektivitást módosítja, indokoltnak tartottuk meghatározni az oszloptöltet felületén adszorbeálódó szerves módosító mennyiségét, ami a szelektivítás szempontjából alapvető fontosságú lehet. Vizsgálatainkat kiterjesztettük a savas tartományra (pH=4,0) is. A meghatározást, az általánosan használt acetonitril mellett, a korábbi kromatográfiás tapasztalataink alapján ígéretes módosítónak bizonyult [167] dioxán esetében is elvégeztük. A mozgó fázisok mind a pH=7,2-es, mind a pH=4,0-es 0,01 M foszfát puffer esetében 0,57–3,81 M (3, 5, 10, 15 és 20v/v%) acetonitrilt, valamint 0,11–1,90 M (1, 5, 10, 12 és 16v/v%) dioxánt tartalmaztak, figyelembe véve, hogy a szerves módosítók koncentrációjának felső határt szab a fehérje irreverzibilis denaturációja. Az általunk vizsgált koncentrációtartományok a gyártó által szavatolt határokon belül estek [148]. A Chiral-AGP oszlopon végzett meghatározásokhoz a pH=7,2-es és pH=4,0-es foszfát puffer oldatok minden esetben 0,01 M nátrium-dihidrogén-foszfát és dinátriumhidrogén-foszfát kétszer desztillált vizes oldatainak megfelelő térfogatú elegyítése útján készültek. A pH=4,0-es puffer beállításához 1 M foszforsavat használtunk. Az ionerősség állandó értékét (I=0,1 M) nátrium-klorid hozzáadásával biztosítottuk. A puffer oldatokat a felhasználás előtt G4 üvegszűrőn szűrtük, a szerves módosító hozzáadása után az eluenst ultrahangfürdőben gázmentesítettük. Valamennyi meghatározást 0,9

41

ml/perc áramlási sebesség mellett végeztük és a 23,0±0,1°C hőmérsékletet oszloptermosztát használatával biztosítottuk. Kötődési vizsgálatainkhoz 100×4,0 mm I.D., 5 µm szemcseátmérőjű analitikai Chiral-AGP kolonnát használtunk, amelyet az adott összetételű mozgó fázissal 3 órán keresztül kondicionáltunk. Az egyensúly beállását az eluátum gázkromatográfiás analízisével ellenőriztük. Az oszlop holttérfogatát (Vm) desztillált víz injektálásával határoztuk meg. Véleményünk szerint a desztillált víz a holttérfogat meghatározására ideális vegyület, mivel a vizes mozgó fázissal történő kondicionálás alatt a fehérje környezete vízmolekulákkal telítetté válik, ezért az injektálás során további vízmolekula már nem szorbeálódik a felületén. A holttérfogat értékét valamennyi mozgó fázis összetétel esetében 220 nm-nél végzett UV detektálás mellett 6 párhuzamos injektálás (10 µl) átlagaként adtuk meg. Az oszlopon jelenlévő összes acetonitril és összes dioxán mennyiséget gázkromatográfiás módszerrel határoztuk meg. Az adott összetételű eluensből az állófázison megkötődött szerves módosítót a nagyobb elúciós erejű 20v/v% etanol – kétszer desztillált víz összetételű mozgó fázissal szorítottuk le a pumpák és az injektor alapos átmosását követően. Az eluátumot belső standardot tartalmazó 25,00 ml-es mérőlombikba gyűjtöttük, majd 2 µl-es részletét a gázkromatográfba injektáltuk. Belső standardként 1-butanolt használtunk. A mérés során a GC üvegkolonna hőmérsékletét 90°C-on, az injektor hőmérsékletét 150°C-on, a N2 vivőgáz áramlási sebességét 20 ml/perc értéken tartottuk. A szorbensen megkötődött acetonitril vagy dioxán a 20v/v% etanol – víz tartalmú eluenssel a fenti kísérleti körülmények mellett maradéktalanul eluálódik, amit további, 20-szoros oszloptérfogatnak megfelelő mennyiségű etanolos mozgó fázis átáramoltatását követően az eluátum GC elemzésével igazoltunk. Az egyes mérések között a szorbenst, a regenerálás céljából, 200-szoros oszloptérfogatnak megfelelő mennyiségű kétszer desztillált vízzel mostuk. A kiértékelés ismert koncentrációjú acetonitril vagy dioxán, valamint a belső standard csúcs alatti területeinek hányadosából szerkesztett kalibrációs egyenes felhasználásával történt. A mérési eredményeket három párhuzamos meghatározás átlaga alapján számoltuk, a szórás valamennyi esetben 2-5%-on belül esett.

42

Az AGP felületén megkötődött szerves módosító mennyiségét (no, mmol/oszlop) az adott módosító eluátumban talált összmennyiségéből (nt, mmol/oszlop) a holttérfogatban (Vm) jelenlévő mennyiség (nm, mmol/oszlop) figyelembevételével számoltuk [168]: no = nt – nm

(11)

ahol nt a fent leírt módon GC módszerrel meghatározott szerves módosító mennyisége; nm a vizsgált összetételű mozgó fázisban jelenlévő szerves módosító névleges koncentrációjának és a holttérfogat értékének ismeretében volt számítható. Az acetonitril és a dioxán adszorpciós izotermáinak szerkesztéséhez a töltet tömegét az acélmentes kolonnából való eltávolítást, majd liofilizálást követően határoztuk meg. 4.2.2. Cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópiás vizsgálat A fehérje másodlagos szerkezetében bekövetkező változások CD módszerrel nyomon követhetők, mivel az α-hélix, a β-redőzött és a nem rendezett forma sajátos CD spektrummal rendelkezik. A CD meghatározásokat a kötődési vizsgálatokkal megegyező kísérleti feltételek mellett végeztük el. Az ellipticitásokat (Θ) 20 mm-es, 23,0±0,1°C-ra termosztált küvetták felhasználásával, 205-230 nm-es hullámhossztartományban mértük meg. Mivel a dioxán

a

vizsgált

hullámhossztartományon

belül

alacsony

transzmittanciával

rendelkezik, a CD spektrumok felvételét a dioxán tartalmú oldatok esetében nem tudtuk megbízhatóan elvégezni. Ezért a meghatározást először pH=7,2-es, valamint pH=4,0-es 0,01 M foszfát pufferben, majd 10, 15, 20 és 30v/v% acetonitril jelenlétében végeztük el. Az ionerősséget nátrium-klorid hozzáadásával tartottuk állandó értéken (I=0,1 M). A natív AGP koncentrációja minden esetben 0,05 mg/ml volt. A fehérje irreverzibilis denaturációjának elkerülése érdekében a 0,01%-os, adott pH értékű pufferrel készített AGP törzsoldathoz először a megfelelő térfogatú puffert, majd óvatos keverés mellett a számított térfogatú szerves módosítót mértük.

43

A CD és UV spektrumok felvétele „Hullámhossz” üzemmódban, az ellipticitás és az abszorbancia értékeinek mérése „Idő” üzemmódban történt. A „Hullámhossz” üzemmódban végzett méréseknél a következő kísérleti paramétereket állítottuk be: felbontás 0,2 másodperc, akkumulációk száma 4, sávszélesség 0,2 nm, válasz idő 2 másodperc, érzékenység 20 mfok, a felvétel sebessége 20 nm/perc. Az „Idő” üzemmód paraméterei: adatfelvétel ideje 4 perc, felbontás 0,2 másodperc, akkumulációk száma 3, sávszélesség 0,2 nm, válasz idő 4 másodperc, érzékenység 50 mfok. 4.2.3. Fluoreszcencia-kioltásos vizsgálat A fehérje felépítésében résztvevő aromás aminosavak a biomolekula ún. saját fluoreszcenciáját idézik elő, amelynek intenzitása a kioltó molekulákkal történő specifikus kölcsönhatás következtében csökken. A fluoreszcencia-kioltásos vizsgálatok lehetővé teszik a fehérjemolekulák bizonyos belső mozgásformáinak tanulmányozását [169]. A mérést mágneses keverővel ellátott, 23,0±0,1°C-ra termosztált, 1 cm-es küvettában végeztük. A CD vizsgálattal megegyező módon a 0,01%-os fehérje törzsoldat készítéséhez a natív AGP-t a megfelelő pH=7,2-es, illetve pH=4,0-es 0,01 M foszfát pufferben oldottuk. A méréssorozat alatt a fehérje koncentrációját 0,05 mg/ml állandó értéken tartottuk, amelynek abszorbanciája a gerjesztési hullámhosszon <0,1. A meghatározáshoz az AGP oldat 1,0 ml-es alikvot részletét a küvettába mértük, majd óvatos keverés mellett növekvő koncentrációban: 10, 20 és 30v/v%-ban acetonitrilt adtunk hozzá. A fluoreszcencia intenzitás (F) meghatározásához optimális tartományt választottunk, amely a teljes méréssorozat folyamán változatlan volt. Az intenzitást – mivel összehasonlító mérést végeztünk – relatív értékben adtuk meg. Az alkalmazott kísérleti paraméterek: gerjesztési hullámhossz 295 nm, a felvétel sebessége 800 nm/perc, PMT feszültség 700 V, válasz idő 0,1 perc, gerjesztési és emissziós résszélesség 5,0 nm. Az emissziós spektrumokat 250-500 nm hullámhossz tartományban vettük fel. Fluoreszcencia-kioltó vegyületként az Eftink és Ghiron [170] által széleskörben vizsgált nem-ionos, hidrofób tulajdonságú 2,2,2-triklór-etanolt (TCE) használtuk. A kioltásos titrálást a TCE - etilénglikol 1:1 térfogatarányú elegyével végeztük, ahol az etilén-glikol a TCE vizes fázisban történő oldódását segíti elő [171].

44

Az előírt összetételű puffert, illetve acetonitrilt tartalmazó AGP oldat 2,00 ml-es részletében a fluoreszcencia intenzitást (F0) először a kioltó-vegyület hozzáadása előtt határoztuk meg. Ezt követően a küvettában lévő vizsgálandó oldatot folyamatos keverés mellett 0,01-0,1 M koncentrációtartományban 2,2,2-triklór-etanol - etilénglikol elegyével titráltuk és az intenzitás értékét valamennyi esetben 337 nm emissziós hullámhosszon mértük meg. A vizsgált koncentrációtartományon belül a kioltó-vegyület vagy a fehérje szételegyedése, illetve kiválása nem volt észlelhető. A referencia oldatokat a vizsgálandó mintával azonos módon, az AGP hozzáadása nélkül készítettük. 4.2.4. Az enantiomer tisztaság meghatározására szolgáló új módszerek A kromatográfiás rendszerek optimálását a 4.1.1. alfejezetben felsorolt modellvegyületek esetében végeztük el. Az optimálás kiterjedt az eluens pH-jának, ionerősségének, a puffer anyagi minőségének, a szerves módosító koncentrációjának és típusának szisztematikus vizsgálatára. A retenciós faktor (k’) és a szelektivitási faktor (α) értékeit pH=4,0-es; 5,5-ös és 7,2-es 0,01 M foszfát puffer tartalmú eluensekben határoztuk meg. A pH=7,2-es foszfát puffer esetében a foszfát koncentráció kromatográfiás paraméterekre gyakorolt hatását 0,01 és 0,03 M koncentráció mellett tanulmányoztuk. A pH=4,0-es acetát tartalmú puffer esetében az acetát koncentráció 0,03 és 0,06 M volt, ahol a pH-t az ammóniumacetát megfelelő mennyiségének bemérése után jégecet hozzáadásával állítottuk be. A pH=7,2-es 0,01 M foszfát puffer tartalmú mozgó fázis alkalmazása során vizsgáltuk a 2-propanol, a dioxán, valamint az acetonitril retencióra és szelektivitásra kifejtett hatását. A 2-propanolt 0,5 és 1v/v%-ban, a dioxánt 1 és 5v/v%-ban, az acetonitrilt 5v/v%-ban alkalmaztuk. Állófázisként analitikai Chiral-AGP kolonnát (100×4,0 mm I.D., 5 µm) használtunk, amelyet Chiral-AGP előtét-oszloppal (50×4,0 mm I.D., 5 µm) kötöttünk sorba. A vizsgálandó oldatok koncentrációja 0,1 mg/ml volt, mivel a fehérje-alapú oszlopok korlátozott kapacitása miatt az állófázis felületére egy injektálással (10 µl) legfeljebb 35 nmol anyagmennyiség kerülhet. A modellvegyületeket metanolban oldottuk. Az oldószercsúcs retenciós idejét tekintettük a holtidő (t0) értékének. Az UV detektálást 220 nm-en végeztük, az ettől eltérő értékeket külön megadjuk. Az eluens

45

változtatásakor az állófázist 200-szoros oszloptérfogatnak megfelelő mennyiségű kétszer desztillált vízzel mostuk, majd a mozgó fázissal két és fél órán keresztül (300szoros oszloptérfogat) kondicionáltuk. A hosszabb ideig történő tároláshoz az oszlopon 20v/v% 2-propanol – kétszer desztillált víz elegyét áramoltattuk keresztül, majd az oszlopot hűtőszekrénybe helyeztük. Az S-(+)-ibuprofen, az S-(−)-propranolol és a D-(−)-norgesztrel vegyületek esetében az enantiomer tisztaság meghatározására alkalmas validált módszereket fejlesztettünk ki. A rendelkezésre álló antipódok enantiomer-feleslege (e.e.) a gyártók minőségbizonylatai szerint mindhárom esetben nagyobb volt, mint 99,8%, így azokat a meghatározások során standardnak tekintettük. 4.2.4.1. Az S-(+)-ibuprofen vizsgálata Az optimált mozgó fázis összetétele: pH=7,2-es 0,01 M foszfát puffer. A vizsgálandó oldatokat az alábbiak szerint készítettük el: pontosan mért 1 mg racém ibuprofent 10,00 ml metanolban oldottunk, majd a specifikusság igazolására 5 párhuzamos injektálást végeztünk. Ezt követően az S-(+)-ibuprofen 0,5 mg/ml, valamint az R-(−)-szennyező antipód 0,01 mg/ml koncentrációjú metanolos standard törzsoldatát készítettük el, amelyek megfelelő arányú elegyítésével a szennyező komponensre nézve 0,1; 0,5; 1; 2; 3; 4 és 5%-os oldatokat (vizsgálandó oldat 1-7) készítettünk. Ehhez valamennyi esetben az 1,00 ml 0,5 mg/ml koncentrációjú S-(+)-ibuprofen standard törzsoldathoz mértük a 0,01 mg/ml koncentrációjú R-antipód törzsoldat 50 µl, 250 µl, 500 µl, 1 ml, 1,5 ml, 2 ml, valamint 2,5 ml-es részletét, majd az elegyeket az eluenssel 5,00 ml-re egészítettük ki. A vizsgálandó oldatokat minden héten frissen készítettük és 4°C-on, hűtőszekrényben tároltuk. A validálási teljesítményjellemzőket az érvényben lévő ICH irányelvek szerint határoztuk meg [172]. A linearitás meghatározáshoz az 1-7 oldatok esetében 5-5 párhuzamos injektálást végeztünk. A mennyiségi meghatározás alapját mindenkor a kromatográfiás csúcs alatti terület értékek képezték. Az azonos napon és a három egymást követő napon végzett mérések pontosságát 3 különböző koncentráció értéknél (az R-(−)-ibuprofent 0,1; 3 és 5%-ban tartalmazó 1, 5 és 7 vizsgálandó oldat esetében) 3-3 párhuzamos injektálás alapján határoztuk meg és 95%-os konfidencia intervallumon belül a relativ szórás százalékában (R.S.D.%) fejeztük ki. Az átlagérték és a valós érték

46

közötti eltérés nagyságát fejezi ki a torzítatlanság, amit az előzőekkel azonos 3 koncentráció szinten, összesen 9 injektálás alapján határoztunk meg. A módszer torzítatlanságát a mért átlagérték és a névleges koncentráció viszonyításával, a visszanyerés %-ában adtuk meg. A kimutatási határ megállapításakor a jel/zaj arány minden esetben nagyobb volt 3:1-nél. A mennyiségi meghatározás határának azt a legalacsonyabb koncentráció értéket tekintettük, amely a 10:1 jel/zaj arány mellett megfelelő pontossággal és torzítatlansággal még mérhető volt. 4.2.4.2. Az S-(−)-propranolol vizsgálata Az optimált mozgó fázis összetétele: 0,5v/v% 2-propanol pH=4,0-es 0,01 M ammónium-acetát pufferben. Az egyes enantiomerek standard törzsoldatait a 4.2.4.1. alfejezetben leírtak szerint készítettük el, amelyek megfelelő higításaival az Rszennyező antipódra nézve 1; 2; 3; 4 és 5%-os oldatokhoz (vizsgálandó oldat 1-5) jutottunk. Ehhez valamennyi esetben a 0,5 mg/ml koncentrációjú S-(−)-propranolol standard törzsoldat 1,00 ml-es térfogatához mértük a 0,01 mg/ml koncentrációjú disztomer törzsoldatának 500 µl, 1 ml, 1,5 ml, 2 ml, valamint 2,5 ml-es részletét, amelyet az eluenssel 5,00 ml-re egészítettünk ki. Az oldatok készítése és tárolása, valamint a validálási teljesítményjellemzők meghatározása a 4.2.4.1. pont szerint történt azzal az eltéréssel, hogy a pontosság és a torzítatlanság megállapítására az 1, 3 és 5 vizsgálandó oldatokat használtuk.

4.2.4.3. A D-(−)-norgesztrel vizsgálata Az optimált mozgó fázis összetétele: 1v/v% dioxán pH=4,0-es 0,06 M ammónium-acetát tartalmú pufferben. Az UV detektálást λ=247 nm-en végeztük. A D(−)-norgesztrel 0,5 mg/ml koncentrációjú és a racém norgesztrel 0,02 mg/ml koncentrációjú standard törzsoldatainak megfelelő arányú elegyítésével a szennyező antipódra nézve 1; 2; 3; 4 és 5%-os oldatokat (vizsgálandó oldat 1-5) készítettünk. A validálási teljesítményjellemzőket a 4.2.4.2. alfejezetnek megfelelően határoztuk meg.

47

4.2.5. 4(3H)-kinazolon származékok enantiomerjeinek elválasztása Az optimálás során a mozgó fázis pH értékét pH=4,0-7,0 tartományon belül változtattuk. A pH érték beállításához 1 M nátrium-hidroxidot vagy foszforsavat használtunk. A szerves módosítók kromatográfiás paraméterekre gyakorolt hatását a fent említett pH tartományon belül acetonitril és 2-propanol esetében vizsgáltuk. Az acetonitrilt 7v/v% (1,33 M); 10v/v% (1,91 M) és 14v/v% (2,67 M), a 2-propanolt 4v/v% (0,53 M); 7v/v% (0,94 M) és 10v/v% (1,33 M) koncentrációban mértük a foszfát pufferhez. A kétféle szerves oldószer hatását pH=4,0-nél, pH=5,0-nél, pH=6,0nál és pH=7,0-nél ekvimoláris koncentrációk (1,33 M) jelenlétében hasonlítottuk össze. Az elválasztásokat Chiral-AGP előtét kolonnával sorba kapcsolt Chiral-AGP (150×4,0 mm I.D., 5 µm) analitikai oszlopon végeztük. A modellvegyületek metanolos oldatainak koncentrációja 0,01 mg/ml volt. Az UV detektálást a mintakomponensek abszorpciós maximumán, λ=225 nm-en végeztük. A kromatográfiás adatokat 3 párhuzamos injektálás (10 µl) alapján adtuk meg.

48

5. AZ EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

5.1. Új adatok a Chiral-AGP oszlop szorpciós tulajdonságaihoz Az AGP összetett szerkezeti felépítése és a lehetséges kölcsönhatások változatossága miatt a kötődési mechanizmus és annak királis vonatkozásai részleteiben még nem ismertek. Következésképpen a kromatográfiás elválasztásra alkalmas eluensösszetételeket többé-kevésbé empirikus úton keresik meg. A mozgó fázis összetevője – a fordított fázisú mechanizmusnak megfelelően – vizes tompító oldat, amihez többnyire szerves oldószert (módosítót) elegyítenek. A szerves módosítókat a retenciós idő csökkentésére vezették be, azonban számos esetben az enantioszelektivitást módosító hatásuk is megfigyelhető volt. Utóbbi nagymértékben függött a szerves oldószer anyagi minőségétől, koncentrációjától, esetenként az eluens pH-jától is. A mozgó fázis összetételének az enantioszelektivitásra gyakorolt hatása arra enged következtetni, hogy az AGP szorbens nagyszámú sztereoszelektív kötőhelyet tartalmaz, amelyek eltérő szerkezettel jellemezhetők [152]. Az is feltételezhető, hogy az oldószer-molekulák kompetícióban állnak az enantiomerekkel az AGP egyes hidrogén-donor, - akceptor és hidrofób tulajdonságú kötőhelyeiért. Jól ismert az is, hogy bizonyos szerves oldószerek reverzibilis konformációváltozást idézhetnek elő a fehérje szerkezetében, amivel a kötőhelyek tulajdonságaiban is változást hozhatnak létre [173]. A konformációváltozást a szerves módosítók előidézhetik a fehérje felületén történő adszorpciójuk révén, továbbá a közeg dielektromos állandójának csökkentésével, a fehérje harmadlagos szerkezetét stabilizáló intramolekuláris hidrogén-hidas, valamint elektrosztatikus kölcsönhatások gyengítése útján. A disszertációs munka keretén belül, a kromatográfiás mechanizmus további megismerése céljából, különböző koncentrációk mellett meghatároztuk a gyakorlatban elterjedt acetonitril, valamint az alacsony dielektromos állandójához képest (ε=2,2) igen jó elúciós erejűnek bizonyult dioxán Chiral-AGP állófázis felületén megkötődött mennyiségét. Vizsgálatainkat a leggyakrabban alakalmazott pH=7,2-es kémhatás mellett kiterjesztettük a savas, pH=4,0-es puffer tartalmú eluensekre is, mivel az AGP

49

szerkezeti tulajdonságai (pl.: protonálódás, konformáció) nagymértékben függenek a környezet pH-jától. Az AGP disszociábilis építőegységeinek pKa értékeit figyelembe véve (1. ábra) pH=4,0-nél a savas tulajdonságú aszparaginsav, glutaminsav és szialinsav egységek karboxil-csoportjai nagyobb részt disszociálatlan, míg a bázikus építőelemek aminocsoportjai teljesen protonált formában vannak jelen. Az AGP ezen protonáltsági állapota kedvező a hidrogén-akceptor tulajdonságú oldószerek és a szelektor között kialakuló hidrogén-hidas kölcsönhatások szempontjából. Mindezek alapján várható volt, hogy a különböző tulajdonságú szerves módosítók eltérő módon kötődnek a szorbens felületén. A kötődés mértékének számításához szükséges holttérfogat értéket (VM) valamennyi eluens-összetétel esetén desztillált víz hatszori injektálása alapján határoztuk meg: az adatokat a 4. táblázat tartalmazza. Az adszorpciós izotermák (4. és 5. ábra) megszerkesztéséhez szükséges volt az oszloptöltet tömegének ismerete, ami a 4.2.1. alfejezetben leírt meghatározás szerint 0,2668g-nak adódott. 4. táblázat. A Chiral-AGP oszlop holttérfogatának (VM) értékei a különböző eluensösszetételek esetében Szerves módosító koncentrációja acetonitril

dioxán

pH=4,0

pH=7,2

v/v%

M

VM, (ml±S.D.) n=6

VM, (ml±S.D.) n=6

3

0,57

0,743±0,004

0,738±0,008

5

0,96

0,747±0,016

0,720±0,020

10

1,90

0,741±0,035

0,693±0,026

15

2,86

0,742±0,037

0,675±0,020

20

3,81

0,772±0,010

0,693±0,012

1

0,11

0,731±0,013

0,702±0,034

5

0,57

0,702±0,008

0,693±0,005

10

1,14

0,738±0,018

0,675±0,026

12

1,46

0,738±0,000

0,738±0,038

16

1,90

0,693±0,016

0,711±0,028

50

Az acetonitril kötődési vizsgálatának eredményeit az 5. táblázat foglalja össze és a 4. ábra szemlélteti. A mozgó fázisok a 0,01 M pH=4,0-es, valamint pH=7,2-es foszfát pufferben a szerves módosítót 0,57-3,81 M (3-20v/v%) koncentrációban tartalmazták. 5. táblázat. Az acetonitril adszorpciójának pH-függése Chiral-AGP szorbensen Szerves módosító koncentrációja v/v% M

pH=4,0 Összes acetonitril mennyiség az oszlopon, nt (mmol/oszlop±SD)

pH=7,2

Megkötődött acetonitril mennyiség, no (mmol/oszlop) (mmol/g)

Összes acetonitril mennyiség az oszlopon, nt (mmol/oszlop±SD)

Megkötődött acetonitril mennyiség, no (mmol/oszlop) (mmol/g)

3

0,57

0,81±0,038

0,39

1,46

0,73±0,032

0,31

1,16

5

0,96

1,38±0,063

0,69

2,51

1,21±0,051

0,53

1,99

10 1,90

2,53±0,096

1,12

4,19

2,83±0,107

1,51

5,66

15 2,86

3,25±0,110

1,13

4,23

3,67±0,121

1,74

6,52

20 3,81

4,86±0,175

1,96

7,19

4,36±0,139

1,76

6,59

megkötődött mennyiség (mmol/g)

8 7 6 5 4 3 2 1 0

1

2

3

4

Acetonitril koncentráció az eluensben (M)

4. ábra Az acetonitril adszorpciós izotermái pH=4,0-nél (■) és pH=7,2-nél (●)

51

A 6. táblázatban és az 5. ábrán azonos kísérleti körülmények mellett, a dioxán adszorpciójára vonatkozó adatok láthatók 0,11-1,90 M (1-16v/v%) koncentrációtartományon belül. 6. táblázat. A dioxán adszorpciójának pH-függése Chiral-AGP szorbensen Szerves módosító koncentrációja v/v% M

pH=4,0 Összes dioxán mennyiség az oszlopon, nt (mmol/oszlop±SD)

pH=7,2

Megkötődött dioxán mennyiség, no (mmol/oszlop) (mmol/g)

Összes dioxán mennyiség az oszlopon, nt (mmol/oszlop±SD)

Megkötődött dioxán mennyiség, no (mmol/oszlop) (mmol/g)

1

0,11

0,15±0,007

0,07

0,27

0,16±0,008

0,08

0,30

5

0,57

0,74±0,031

0,33

1,24

0,66±0,032

0,26

0,97

10 1,14

1,56±0,062

0,70

2,62

1,72±0,071

0,94

3,52

12 1,46

1,79±0,063

0,69

2,59

2,00±0,078

0,97

3,63

16 1,90

2,78±0,086

1,46

5,47

2,28±0,069

0,96

3,59

megkötődött mennyiség (mmol/g)

6 5 4 3 2 1 0

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Dioxán koncentráció az eluensben (M)

5. ábra. A dioxán adszorpciós izotermái pH=4,0-nél (■) és pH=7,2-nél (●)

52

A mérési adatok azt mutatják, hogy a szelektor felületén mindkét módosító jelentős

mértékben

adszorbeálódik.

Mind

az

acetonitril,

mind

a

dioxán

koncentrációjának emelésével növekszik a megkötődött mennyiség. A kötődés a vizsgált koncentrációtartományon belül pH=7,2-nél telítési értéket ér el. Látható, hogy amíg az acetonitril jelenlétében a „plateau” 1,90 M koncentrációnál kezdődik, addig a dioxán már jóval alacsonyabb, 1,19 M koncentrációban a kötőhelyek telítését idézi elő. Az adszorpciós izotermákon (4. és a 5. ábra) megfigyelhető, hogy pH=7,2-nél a telítési görbék kezdeti szakaszai – az acetonitril és a dioxán 5v/v% koncentrációja esetén – enyhe töréspontot mutatnak, ami a szelektor konformációváltozására enged következtetni. Az eredményeket pH=4,0-nél összehasonlítva jól látszik, hogy az eluensben lévő szerves módosító koncentrációjának emelésével a megkötődött szerves oldószer mennyisége egy telítési szakaszt követően ismét jelentősen növekszik. Ez a növekedés az acetonitrilnél 2,86-3,81 M, a dioxán esetében lényegesen alacsonyabb, 1,46-1,90 M koncentrációk között figyelhető meg. E különbségek alapján feltételezzük, hogy a dioxán, mint kettős éter, kétfogú ligandumként kötődik az AGP bizonyos kötőhelyeihez. Az irodalomból jól ismert, hogy a natív fehérjék szerkezete jelentős mértékben változhat a pufferhez adott egészen kis mennyiségű szerves oldószer (pl.: etanol, dioxán) hatására [107,173]. Karpenko [127,128] a natív AGP harmadlagos szerkezetének vizsgálata során pH=7,2-nél a biomolekula belső részében 10 karboxil és 9 tirozin-rész jelenlétét igazolta. Kötődési vizsgálataink eredményei arra utalnak, hogy a pH=7,2-nél „rejtett” aminosav-részek pH=4,0-nél az oldószer-molekulák számára hozzáférhetővé válnak. Erre mutat, hogy az adszorpciós izotermák telítési szakaszait adott szerves oldószer koncentrációnál monoton növekedés követi, amit az AGP konformációváltozásával magyarázunk. A adszorpció pH-függését vizsgálva megállapítható, hogy az alacsonyabb szerves módosító koncentrációknál - acetonitrilnél 3 és 5v/v%, illetve dioxánnál 1 és 5v/v% - az adszorbeálódott mennyiségek között nincs szignifikáns eltérés. A magasabb koncentrációknál azonban a megkötődött mennyiség mindkét oldószer esetében pH=7,2-es kémhatásnál nagyobb. Ugyanakkor a telítést követően ez a tendencia megfordul és a szorbeálódott anyagmennyiség - különösen az 1,90 M dioxán esetében -

53

pH=4,0-nél lényegesen több. Figyelembe véve pH=4,0-nél az AGP protonáltsági állapotát, valamint a dioxán erős hidrogén-akceptor tulajdonságát, a telítést követő monoton növekedést új hidrogénkötések megjelenésével magyarázzuk. A fentiek alapján valószínűsíthető hogy az AGP szelektor felületén az eluens összetételében bekövetkező változás hatására megjelenő új aminosav-részek döntő többségben hidrogén-donor tulajdonságúak. Az adszorpciós meghatározás adatai és a (12) egyenlet felhasználásával molekuláris viszonylatban szerezhetünk értékes adatokat az állófázis borítottságáról (7. és 8. táblázat). A fajlagos felületnek az irodalmi adatot fogadtuk el, bár tudatában vagyunk annak, hogy ez csak egy közelítő érték, mivel a szelektor fajlagos felülete az adott kromatográfiás rendszer összetételétől nagymértékben függ és még gyártási sorozatonként is változhat.

N= ahol

no ⋅ N A

(12)

S ⋅ 10 18

N a megkötődött szerves módosító molekulák száma (molekula/nm2); no a megkötődött szerves módosító mennyisége (mol/oszlop); NA az Avogadro szám; S az állófázis fajlagos felülete (167m2/g [152]). 7. táblázat. Megkötődött acetonitril molekulák száma Acetonitril koncentráció

Megkötődött acetonitril, N (molekula/nm2)

v/v%

M

pH=4,0

pH=7,2

3

0,57

5,25

4,17

5

0,96

9,29

7,13

10

1,90

15,08

20,33

15

2,86

15,21

23,43

20

3,81

26,39

23,70

54

8. táblázat. Megkötődött dioxán molekulák száma Dioxán koncentráció

Megkötődött dioxán, N (molekula/nm2)

v/v%

M

pH=4,0

pH=7,2

1

0,11

0,94

1,07

5

0,57

4,44

3,50

10

1,14

9,42

12,65

12

1,46

9,29

13,06

16

1,90

19,66

12,93

A 7. és a 8. táblázat mutatja, hogy savas tartományban a megkötődött molekulák száma a telítést követően mintegy kétszeresére nő. A fenti adatok az oldószermolekulák kettős rétegének kialakulását tükrözik, ami ugyancsak a szelektor konformációváltozásának következménye lehet. A 7. táblázat szerint az acetonitril esetében ez a növekedés kisebb mértékű, ami arra enged következtetni, hogy az acetonitril második rétege a dioxánhoz képest lazább szerveződésű. A szerves módosítók kötődését azonos mólkoncentrációban (1,90 M) összehasonlítva megfigyelhető, hogy amíg pH=7,2-nél az acetonitril, addig pH=4,0-nél a dioxán kötődik szignifikánsan nagyobb mennyiségben az állófázis felületén. Ezek a különbségek jól tükrözik a két oldószer eltérő kölcsönhatásképességét. Az acetonitril gyenge hidrogén-akceptor, ugyanakkor könnyen polarizálható molekula, ezért elsősorban dipólus-dipólus, indukált dipólus-dipólus kölcsönhatásokban vesz részt. A dioxán azonban, mint kettős éter, a hidrofób kölcsönhatások mellett döntő mértékben a hidrogén-hidas

kölcsönhatások

kialakításában

vesz

részt.

Következésképp

valószínűsíthető, hogy az acetonitril és a dioxán az AGP-felületen sajátos kötőhelyekhez

kapcsolódik, ami ezen szerves

oldószerek

szelektív

eluotrop

tulajdonságaiban is megnyilvánul. Fentiek igazolására az alábbi modellkísérletet végeztük el. Azonos moláris koncentrációjú (1,90 M) acetonitrilt és dioxánt tartalmazó terner elegyből a fentiekkel megegyező módon meghatároztuk az állófázison egyidejűleg megkötődött szerves módosító mennyiségeket.

55

megkötődött mennyiség (mmol/oszlop)

2 1 ,8 1 ,6 1 ,4 1 ,2 1 0 ,8 0 ,6 0 ,4 0 ,2 0 A cC N pH = 4 ,0

D io pH = 4 ,0

A cC N pH = 7 ,2

D io pH = 7 ,2

■ 1,90 M szerves módosító a kétkomponensű eluensben, ■ 1,90 M acetonitril (AcCN) és dioxán (Dio) a háromkomponensű eluensben.

6. ábra. Az acetonitril és a dioxán együttes kötődése Az eredményeket oszlopdiagramon ábrázoltuk (6. ábra). Látható, hogy pH=4,0nél a terner elegyből megkötődött acetonitril és dioxán mennyiségekben lényeges eltérés nem mutatkozik. Az egymás jelenlétében szorbeálódott anyagmennyiségük azonban lényegesen nagyobb, mint az egyedi meghatározások során mért értékük. Ezzel szemben pH=7,2-nél megfigyelhető, hogy terner elegyből a dioxán szorpciója szignifikánsan nem változik, azonban dioxán jelenlétében az acetonitril megkötődött mennyisége több, mint felére csökken. Ez a megfigyelés jól magyarázható az enzimkémiából ismert allosztérikus hatással, amely két egymástól eltérő kötőhelyhez kapcsolódó ligandumok kölcsönhatásakor léphet fel. Az egyik ligandum kötődése ugyanis a fehérje konformációváltozását idézheti elő, ami megváltoztathatja a második ligandum kapcsolódását [174]. Modellkísérletünkkel a savas tartományban az egymást segítő ún. kooperatív, pH=7,2-nél a gátló, kompetitív allosztérikus hatás jelenlétét igazoltuk.

56

5.2. A natív AGP CD-spektroszkópiás vizsgálata A királis szelektor működésének további megismerése céljából az acetonitril fehérje konformációra gyakorolt hatását CD módszerrel vizsgáltuk a kromatográfiás gyakorlatban alkalmazott eluens-összetételek jelenlétében. Annak ellenére, hogy a natív és az immobilizált AGP viselkedése számos tekintetben különbözhet ugyan egymástól, a natív AGP CD-spektroszkópiás meghatározásának adatai jó egyezést mutattak a kötődési vizsgálat eredményeivel. A 7. ábrán megfigyelhető, hogy pH=4,0-es kémhatásnál az acetonitril koncentráció emelésével (0-30v/v%) a CD spektrumok negatív ellipticitásának (Θ) abszolút értékei növekednek, ami a fehérje másodlagos szerkezetének fokozatos változását tükrözi. A 20v/v%-os (3,81 M) acetonitril koncentráció jelenlétében, amely az adszorpciós izoterma monoton növekedő szakaszára esik, a negatív Cotton-hatás görbe maximuma 219 nm-ről az alacsonyabb hullámhosszak irányába, 217 nm-re tolódik el. Mindezen felül 209 nm-nél a spektrumban egy váll jelenik meg, ami egyértelműen igazolja a másodlagos szerkezet jelentős módosulását. A 30v/v% acetonitril mennyiségnél a változás már igen számottevő, mivel a 20v/v% szerves oldószer jelenlétében megfigyelt váll a Cotton-hatás görbe maximum értékévé alakul át (9. táblázat). Ez a 209 és 215 nm-nél kettős negatív maximummal rendelkező helikális csúcs a proteinláncban α-hélix szerkezet jelenlétét tükrözi [175]. A 8. ábra pH=7,2-nél mutatja a natív AGP CD spektrumait az acetonitril koncentráció függvényében. A 10v/v% acetonitril jelenlétében a fehérje környezetének megváltozásával egyidejűleg a CD spektrum negatív ellipticitás értéke kismértékben nő. Ugyanakkor a kötődési meghatározás eredményeivel összhangban (4. és 5. ábra) az acetonitril koncentráció további növelése az AGP szerkezetében érdemi változást már nem idéz elő, még 30v/v% módosító jelenlétében sem.

57

0

-10

-20

Θ (m°) -30

-40

-50 205

210

220

230

Hullámhossz (nm)

― 0v/v%; ― 10v/v%; ― 15v/v%; ― 20v/v% és ― 30v/v% acetonitril 0,01 M-os foszfát pufferben. 7. ábra. A natív AGP CD spektrumai pH=4,0-es kémhatás mellett 0

-10

-20

Θ (m°) -30

-40

-50 205

210

220

230

Hullámhossz (nm)

― 0v/v%; ― 10v/v%; ― 15v/v%; ― 20v/v% és ― 30v/v% acetonitril 0,01 M-os foszfát pufferben. 8. ábra. A natív AGP CD spektrumai pH=7,2-es kémhatás mellett

58

9. táblázat. A CD ellipticitás értékek (Θ) növekvő acetonitril koncentráció jelenlétében pH=4,0-nél és pH=7,2-nél Acetonitril koncentráció

pH=4,0

pH=7,2

(v/v%)

Θ λ=209nm (m°)

Θ λ=215nm (m°)

Θ λ=209n (m°)

Θ λ=220nm (m°)

0

-10,8541

-31,1816

-14,7298

-29,9114

10

-22,1176

-32,9573

-17,0858

-33,0023

15

-24,1868

-33,9925

-15,9050

-32,7867

20

-29,5140

-35,5638

-15,8659

-32,2430

30

-47,8081

-45,5598

-18,3172

-32,2468

5.3. A natív AGP fluoreszcencia-kioltásos vizsgálata Az α1-savas glikoprotein szerkezetében a szerves oldószer hatására végbemenő konformációváltozások további tanulmányozása céljából, a CD meghatározással azonos kísérleti körülmények mellett, a fehérje fluoreszcencia-kioltásos vizsgálatát is elvégeztük. A módszer a triptofán (Trp) és a tirozin (Tyr) aminosav-részek környezetében bekövetkező változásokon keresztül az AGP harmadlagos szerkezetéről nyújt értékes információt. A triptofánt és tirozint egyaránt tartalmazó fehérjékben a triptofán egységek fluoreszcenciája dominál. A Trp-részek szelektív gerjesztése 295 nm-es gerjesztési hullámhossz alkalmazásával érhető el. Az emissziós maximumot a pH=4,0-es foszfát pufferben 337 nm-nél, a pH=7,2-es tompító oldatban 336 nm-nél mértük. Mindkét érték a szabad Trp vizes oldatában mért 350 nm-es emissziós maximumhelyhez képest az alacsonyabb hullámhosszak irányába tolódik el, ami az AGP-ben jelenlévő egy vagy több triptofán-rész apoláris környezetére utal. Eftink és Ghiron [176] szerint a triptofán aminosav-részek exponáltságának mértékét a fluoreszcencia-kioltásos vizsgálatok eredményeivel sokkal megbízhatóbban lehet jellemezni, mint az emissziós spektrum maximumhelyével. A fehérjék belső fluoreszcencia intenzitása kioltó molekulák jelenlétében csökken. (A kioltást az irodalomban az angol „quenching effect”-ből származtatva Q-val jelölik). A kioltók két

59

csoportba sorolhatók: a sztatikus kioltók nem fluoreszkáló, vagy alig emittáló komplexet képeznek a fluorofórokkal; a dinamikus kioltók a gerjesztett állapotban lévő fluorofórokkal történő ütközések során átveszik annak energiáját és sugárzás nélkül szétszórják. Előbbiek nem változtatják meg a gerjesztési állapot élettartamát, a dinamikus kioltók azonban a kioltás mértékétől és az ütközések gyakoriságától függően csökkentik azt. Az indolvegyületek (Trp) meghatározására egyik legszélesebb körben alkalmazott apoláris tulajdonságú dinamikus kioltó-vegyület a 2,2,2-triklór-etanol (TCE)

[177].

A

kioltó-molekulával

szemben

a

fluorofór

aminosav-rész

hozzáférhetőségének sztérikus és kémiai akadályai lehetnek. Sztérikus gátat képezhet a fehérjemolekula nanoszekundum időegységig tartó oszcilláló konformációs mozgása, amely akadályozhatja a kioltó-vegyület fehérje-mátrixba történő bejutását. Kémiai gátat képez a fluorofór kémiai környezete, mivel a kioltó vegyület a polaritásával megegyező aminosav-részekkel lép energetikailag kedvező kölcsönhatásba. Mindezek alapján a kioltó-vegyület hozzáférésétől függően a fehérje fluoreszcencia intenzitása csökken, amelynek meghatározásával a fluorofórok mikrokörnyezetére vonatkozóan jutunk adatokhoz. A gerjesztett állapotban lévő fluorofór (T∗) gerjesztési energiáját Trón [178] szerint a következő folyamatok során veszítheti el, ha az oldatban kioltó-vegyület (Q) van jelen. 1 [T ∗] T∗ k → T + hν

∗] 2 [T T∗ k → T

k [T ∗][ ⋅ Q]

fluoreszcencia ,

sugárzás nélküli inaktiváció,

q Q + T∗   → T + Q

ütközéses kioltás.

(13)

(14)

(15)

A kioltót nem tartalmazó esetben a Φ0, illetve a kioltó jelenlétében meghatározható Φ kvantumhatásfok a sebességi állandókkal a következő módon fejezhető ki:

Φ0 =

k1 = k1 τ0, k1 + k 2

(16)

60

Φ=

ahol τ0

=

k1 , k1 + k 2 + k q ⋅ [Q ]

(17)

1 a kioltó molekulát nem tartalmazó rendszer gerjesztési állapotának k1 + k 2

élettartama (s). A dinamikus kioltás esetén a fluoreszcencia intenzitás mérési eredményeit az előbbi összefüggésekből, a Stern-Volmer egyenlet alapján értékeltük [179]:

F0 F

=

k q [Q ] Φ0 = 1+ = 1 + kq Φ k1 + k 2

τ0 [Q] = 1 + KSV [Q]

(18)

ahol F0 és F a kioltó-molekulát nem tartalmazó, illetve tartalmazó rendszer által emittált fluoreszcencia intenzitás; KSV a dinamikus kioltási állandó (M-1); [Q] a kioltó vegyület koncentrációja (M); kq a kioltási reakció kétmolekulás sebességi állandója (M-1s-1). Amennyiben a fehérje egynél több triptofán-részt tartalmaz – AGP esetében hármat – a kioltási vizsgálat eredményei alapján az un. effektív dinamikus kioltási állandó (Keff) számítható ki, amely az összes fluorofórra nézve egy átlagos értéket jelöl [176]. A 2,2,2-triklór-etanol jelenlétében mért F0/F értékek a kioltó koncentrációjával lineáris összefüggésben állnak, ahol az egyenes meredeksége a Keff dinamikus kioltási állandó értékének felel meg. A meghatározásokat a kromatográfiás kötődési vizsgálatnál és a CD-spektoszkópiás mérésnél alkalmazott, 0,01 M pH=4,0-es és pH=7,2-es kémhatású foszfát puffer és háromféle acetonitril koncentráció jelenlétében végeztük el. Az egyes oldószer-összetételeknél 3-3 párhuzamos mérést végeztünk, a szórás 1-4%-on belül esett. Az eredmények átlaga alapján szerkesztett Stern-Volmer egyeneseket a 9. és a 10. ábrán mutatjuk be. A mérési pontokra a legkisebb négyzetek módszerével, számítógépes statisztikai programcsomag segítségével egyenest illesztettünk, amelynek paramétereit a 10. és a 11. táblázat foglalja össze.

61

2,4 2,2 2,0

F0/F

1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,10

0,11

triklór-etanol koncentráció (M)

■ 0v/v%; ● 10v/v%; ▲ 20v/v% és ▼ 30v/v% acetonitril 0,01 M foszfát pufferben. 9. ábra. A fluoreszcencia-kioltás Stern-Volmer egyenesei (pH=4,0)

10. táblázat. A Stern-Volmer egyenesek paraméterei (pH=4,0) Acetonitril koncentráció v/v%

Keff ±S.D. (az egyenes meredeksége)

Tengelymetszet ±S.D.

Lineáris regressziós együttható (r)

Fpróba p<0,01

Mérések száma (n)

0

1,2702±0,0709

0,9812±0,0038

0,9804

321,6

15

10

6,0684±0,1721

1,0496±0,0095

0,9947

1216,7

15

20

7,3109±0,1633

1,0382±0,0039

0,9973

2397,8

15

30

12,5548±0,2101 1,0554±0,0032

0,9985

4325,4

15

62

1,35 1,30 1,25 F0/F

1,20 1,15 1,10 1,05 1,00 0,95 0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,10

0,11

triklór-etanol koncentráció (M)

■ 0v/v%; ● 10v/v%; ▲ 20v/v% és ▼ 30v/v% acetonitril 0,01 M foszfát pufferben. 10. ábra. A fluoreszcencia-kioltás Stern-Volmer egyenesei (pH=7,2)

11. táblázat. A Stern-Volmer egyenesek paraméterei (pH=7,2) Acetonitril koncentráció v/v%

Keff ±S.D. (az egyenes meredeksége)

Tengelymetszet ±S.D.

Lineáris regressziós együttható (r)

Fpróba p<0,01

Mérések száma (n)

0

2,6371±0,0862 0,9971±0,0046

0,9931

939,3

15

10

2,6447±0,0892 1,0137±0,0041

0,9939

1055,9

15

20

2,5853±0,1007 1,0249±0,0054

0,9902

632,6

15

30

3,0644±0,0883 1,0172±0,0047

0,9947

1216,7

15

A triklór-etanollal létrehozott fluoreszcencia intenzitás csökkenést alapvetően a fluoreszkáló aminosav-részek hozzáférhetősége határozza meg. Ennek megfelelően, minél erősebb hidrofób kölcsönhatásba lép a TCE a protein molekulával, annál nagyobb lesz a Keff kioltási állandó értéke. Az acetonitril koncentráció emelésével pH=4,0-nél a

63

Trp-részek fokozódó hozzáférhetősége figyelhető meg, amit a kioltási állandók értékeinek

jelentős

mértékű

növekedése

jelez.

A

hozzáférés

növekedését

konformációváltozással, az AGP triptofán-részek fokozódó belső mozgásával magyarázzuk. A vizsgált koncentrációtartományon belül a legjelentősebb változást 30v/v% acetonitril jelenlétében tapasztaltuk, amikor a Keff állandó kb. 10-szeresére nőtt a szerves oldószer távollétében mért értékhez viszonyítva. A fentiekkel szemben a pH=7,2-es foszfát puffer jelenlétében számított Keff kioltási állandók nagysága az acetonitril koncentrációjának növelésével nem változnak szignifikánsan. Mindez arra utal, hogy a fluoreszkáló aminosav-részek környezete a szerves oldószer hatására alapvetően nem módosul. Nagy valószínűséggel az acetonitril a fehérjéhez történő kötődése révén stabilizálja az AGP konformációját. A szerves oldószert nem tartalmazó pufferekben mért adatokat összehasonlítva megfigyelhető, hogy pH=4,0-nél a kioltó-vegyülettel végzett titrálás során a fluoreszcencia intenzitás csak kismértékben csökken (Keff=1,27), ami a savas pH-n kialakuló intramolekuláris hidrogénhidas kölcsönhatások konformációt stabilizáló szerepével magyarázható.

5.4. A Chiral-AGP oszlop gyógyszeranalitikai alkalmazásai 5.4.1. Az enantiomer tisztaság meghatározására alkalmas módszerek kidolgozása A vizsgálatba bevont gyógyszermolekulák szerkezeti képleteit a 11. ábra tartalmazza. Tekintettel az AGP-alapú állófázisok széleskörű felhasználhatóságára, modellvegyületeink

között

savas,

bázikus

és

semleges

tulajdonságú

gyógyszermolekulák is szerepelnek. Vizsgálataink során azzal a nehézséggel kűzdöttünk, hogy tiszta enantiomer csupán az atenolol, az ibuprofen, a norgesztrel, a propranolol, valamint a tolperizon vegyületek esetében állt rendelkezésünkre. A továbbiakban táblázatos formában foglaljuk össze a különböző összetételű mozgó fázisok alkalmazásakor számított retenciós faktor (k’) és szelektivitási faktor (α) értékeket.

64

atenolol

H2 C

H2N

klórtalidon

H2 C H C O

O

O

CH3

C H

N H

OH H2C

Cl

CH3

H2 C

CH3

O

N H

fluoxetin

H2C

O

H2 C

CH3 C H

N H

CF3

CH3

C O H

OH H3C

propranolol

H2 H2 C H C C O N H OH HN

C H

N

H3C

norgesztrel

N H

C H

H3C

H

CH3

CH2

OH

H

O

ibuprofen

CH3

CH3

H3C

glutetimid

hexobarbitál

C H

O

C H2

ketamin CH3 NH

NH H3 C N H

O

O

N CH3

11. ábra. A modellvegyületek szerkezete

65

OH

C H

CH3

O

O

CH

C

H H

CH3

H2 H C N C

C2 H 5

CH3

N H

CH3

tolperizon O

C H2

H3C O

CH2

CH3

H2 C

bupivakain

CH2

H2C

CH3

pindolol H2 H2 C H C C O N H OH

O

O

OH

metoprolol H2 C H C

NH2

S

O

O

Cl

Az optimálást kiterjesztettük a puffer anyagi minőségének megválasztására (12. táblázat), a mozgó fázis pH-jának változtatására (13. táblázat) és a különböző tulajdonságú szerves módosítók hozzáadására (14. táblázat). 12. táblázat. A puffer összetételének hatása a retencióra és az enantioszelektivitásra Foszfát koncentráció (M) pH=7,2

Atenolol k1’∗∗

α

Propranolol Hexobarbitál k1’

α

α

k1’

Ibuprofen k1’

α

Norgesztrel k1’

α

0,01

1,56 1,25*

n.e.

−

11,53 1,64* 0,91 1,45* 32,6

1,00

0,03

1,91

1,20

n.e.

−

11,22 1,86* 1,31 1,52* 30,5

1,00

0,03

h.e.

−

4,58 1,58* 2,68

1,00

n.e.

−

17,13 1,00

0,06

0,29

1,00

3,65 1,47* 1,00

1,51

n.e.

−

9,22 1,58*

Acetát koncentráció (M) pH=4,0

*: alapvonal-elválasztás; ∗∗: az elsőként eluálódó enantiomer retenciós faktora; n.e.: 60 percen belül nem eluálódik, h.e.: a holttérfogatban (VM) eluálódik a mintakomponens.

A

12.

táblázat

alapján

látható,

hogy

pH=7,2-nél

a

foszfát

puffer

koncentrációjának emelésével a bázikus tulajdonságú atenolol (pKa=9,3) enantiomerek retenciója növekszik. Mindez arra utal, hogy a protonált formában lévő enantiomerek és az állófázis negatív töltésű funkciós csoportjai között kialakuló ionos kölcsönhatás mellett az adott pH-n a retenciót domináns módon befolyásolja a kationos formában jelenlévő atenolol és a foszfát anion között kialakuló ionpárok megoszlása is. Egyidejűleg megfigyelhető, hogy a foszfát koncentráció emelése a fenti vegyület esetében a szelektivitás romlásához vezet. A semleges tulajdonságú norgesztrel és a gyenge sav típusú hexobarbitál (pKa=8,3) esetében a puffer koncentrációjának növelése a kromatográfiás elválasztást nem befolyásolja lényegesen. Az ibuprofen (pKa=5,2) retenciós faktora 0,03 M foszfát koncentrációnál szintén emelkedik, ami jelen esetben a szelektivitás kismértékű növekedésével is együtt jár. Az acetát koncentráció kromatográfiás paraméterekre gyakorolt hatását vizsgálva megállapítható, hogy pH=4,0-nél az atenolol antipódok retenciós faktorai a

66

koncentráció emelésével nem növekednek jelentősen, az ugyancsak bázikus tulajdonságú propranolol enantiomerek k’ értékeiben pedig csökkenés figyelhető meg. Mindez azt jelzi, hogy az acetát tartalmú eluenseknél a retenciós folyamatokban az ionpármegoszlás nem játszik döntő szerepet. A propranolol enantiomerjeinél a pH csökkentésével optimális retenciós faktor (k’=1-5) és alapvonal-elválasztás érhető el. Hasonlóképpen a norgesztrelnél az acetát puffer alkalmazása 0,06 M koncentrációban megfelelő

elválasztáshoz

vezet,

ugyanakkor

a

puffer

anyagi

minőségének

megváltoztatása az atenolol és a hexobarbitál enantiomerek esetében az alapvonalelválasztás megszűnését okozza. 13. táblázat. Az eluens pH hatása a retencióra és az enantioszelektivitásra Eluens

Atenolol

Metoprolol

Bupivakain Hexobarbitál

Ibuprofen

Norgesztrel

pH

k1’∗∗

α

k1’

α

4,0

h.e.

−

0,52

1,25

3,94 1,34* 6,01 1,30*

5,5

1,20

1,00

2,66

1,25

n.e.

−

7,68 1,35* 24,9

7,2

1,56 1,25* 12,10 1,38*

n.e.

−

11,53 1,64* 0,91 1,45* 32,61 1,00

α

k1’

α

k1’

Mozgó fázis: 0,01 M foszfát puffer; *: alapvonal-elválasztás;

k1’

α

n.e.

−

k1’

α

11,03 1,64*

1,31 25,82 1,28

**

: az elsőként eluálódó enantiomer

retenciós faktora; n.e.: 60 percen belül nem eluálódik, h.e.: a holttérfogatban (VM) eluálódik a mintakomponens.

Az eluens pH értékének 4,0-ről 7,2-re történő emelésével változik egyrészt a fehérjemolekula, másrészt a bázikus, valamint a savas tulajdonságú modellvegyületek protonáltsági állapota, ami együttesen befolyásolja a retenciót és a szelektivitást. Az AGP fő kötőhelye a kiterjedt kutatások eredményei alapján nagy valószínűséggel egy hidrofób üreg, amely nagyobb részt hidrofób aminosav-részeket pl.: triptofánt, fenilalanint, tirozint, leucint és izoleucint, ezen kívül számos bázikus, illetve savas tulajdonságú protolitikus csoportot tartalmaz [180]. A mérési eredmények azt tükrözik, hogy a bázikus tulajdonságú modellvegyületek retenciós mechanizmusában az ionos kölcsönhatás és az ionpár-megoszlás egyaránt jelentős szerepet játszik. A fenti kölcsönhatások retencióra gyakorolt hatását nagymértékben befolyásolja a mozgó fázis pH értéke, a puffer anyagi minősége, valamint koncentrációja. Mivel az AGP

67

izoelektromos pontja 2,7, a pH=4,0-7,2-es tartományon belül a szelektor negatív töltést hordoz, amelynek nagysága a pH emelésével növekszik. A protonált formában lévő bázikus tulajdonságú modellvegyületek a kötőhely negatív töltésű csoportjaival ionos kölcsönhatást alakíthatnak ki, ennek megfelelően a pH növelésével a retenciós faktor értékei is emelkednek (13. táblázat). Az erősen savas tulajdonságú ibuprofen esetében viszont a fenti körülmények mellett a k’ értékek csökkenése figyelhető meg, ami a modellvegyület ionizáltsági fokának növekedésével, vagyis a fordított fázisú rendszerben domináló hidrofób kölcsönhatások gyengülésével magyarázható. A semleges típusú norgesztrel enantiomereknél a mozgó fázis pH-jának emelésekor tapasztalt retenciós faktor növekedés csupán az állófázis protonáltsági állapotának változásával magyarázható. Ez utóbbi ugyanis reverzibilisen módosíthatja a fehérje konformációs állapotát és egyúttal az enantiomerek, valamint a mozgó fázisban jelenlévő ionok és módosítók AGP-felülethez történő kötődését is. 14. táblázat. A szerves módosító hatása a retencióra és az enantioszelektivitásra Módosító koncentráció (v/v%)

Atenolol k1’∗∗

Metoprolol

α

k1’

α

Pindolol k1’

Ketamin

α

Hexobarbitál

α

k1’

k1’

α



1,56

1,25

IPA 0,5

1,74

1,10

10,57

1,26∗

n.e.

−

n.e.

−

6,47

1,53∗

1

1,55

1,00

5,59

1,18

n.e.

−

22,39

1,20∗

2,84

1,53∗

Dioxán 1

2,49

1,00

5,50

1,16

24,27

1,06

15,35

1,26

3,26

1,37

∗

5

1,63

1,00

3,45

1,00

6,03

1,07

4,30

1,21∗

1,44

AcCN 5

1,26

1,00

3,72

1,00

12,56

1,40∗

7,54

1,22

1,77

∗

Klórtalidon

12,10

1,38

∗

n.e.

−

n.e.

−

11,53

1,64

∗

Ibuprofen

k1’

α

k1’

α

29,10

1,00

0,91

1,45∗

8,17

1,00

1,57

1,30∗

6,87

1,16

0,79

1,25

10,44

1,08

1,38

1,28

1,00

1,87

1,45∗

1,28

1,00

1,32

2,60

2,38∗

0,44

1,36

Mozgó fázis: 0,01 M pH=7,2-es foszfát puffer; *: alapvonal-elválasztás;

**

: az elsőként eluálódó

enantiomer retenciós faktora; n.e.: 60 percen belül nem eluálódik a mintakomponens.

Az atenolol és a metoprolol enantiomerek esetében pH=7,2-es kémhatású foszfát pufferben szerves módosító hozzáadása nélkül alapvonal-elválasztást értünk el (14. táblázat). A szerves oldószer jelenlétében azonban az enantioszelektivitás csökkenését, illetve

megszűnését

tapasztaltuk.

Ugyanakkor

a

pH=7,2-es

foszfát

puffer

alkalmazásával a bázikus tulajdonságú modellvegyületek közül a pindolol, a propranolol és a ketamin enantiomerek a magasabb lipofilitásnak megfelelően 60 percen belül sem eluálhatók az állófázis felületéről.

68

A pindolol és a ketamin vizsgálata során az optimális retenciós faktort szerves oldószer hozzáadásával értük el. A különböző típusú szerves módosítók közül a pindolol enantiomerek alapvonal-elválasztásához (α=1,40) 5v/v% acetonitril jelenléte volt szükséges, míg a ketamin izomerek megfelelő elválasztását (α=1,20) 1v/v% 2propanol alkalmazásakor értük el. A savas tulajdonságú modellvegyületek esetében is látható, hogy a szerves módosító hozzáadására a retenciós idő minden esetben csökken. Az enantioszelektivitás azonban a vegyület szerkezetétől és a módosító típusától függően változhat. Így például csökken, illetve megszűnik az ibuprofen és a hexobarbitál esetében, ugyanakkor a klórtalidon enantiomerek elválasztása csak 5v/v% dioxán vagy acetonitril jelenlétében volt elérhető. A 15. táblázatban összefoglaljuk a vizsgált modellvegyületeink enantiomer tisztaságának meghatározására alkalmas, alapvonal-elválasztást biztosító, optimált eluens-összetételeket és a hozzájuk tartozó retenciós faktor (k’), szelektivitási tényező (α), valamint kromatográfiás felbontás (RS) értékeket. Véleményünk szerint az általunk optimált

kromatográfiás

rendszerek

alkalmasak

lehetnek

standardizálható,

gyógyszerkönyvi célra is felhasználható, enantiomer tisztaság meghatározására, mivel az

RS

értékek

valamennyi

esetben

meghaladják

a

gyógyszerkönyvek

rendszeralkalmassággal szemben támasztott követelményeit (RS≥1,5). Ezen felül megfelelő félpreparatív kolonnával az enantiomerek izolálása is megvalósítható lehet, amelyre az utóbbi időben egyre nagyobb igény merült fel. Az enantiomer tisztaság vizsgálatot a savas tulajdonságú ibuprofen, a bázikus tulajdonságú propranolol és a semleges típusú norgesztrel vegyületek eutomerjei esetében végeztük el. Mindhárom meghatározásnál a szennyező minorkomponens a főcsúcs előtt eluálódott, ami a tisztaságvizsgálat szelektivitása és érzékenysége szempontjából igen kedvező. A módszer alkalmazhatóságát validálás útján állapítottuk meg. A validálási paramétereket az ICH (International Conference on Harmonisation) érvényben lévő irányelvei alapján adtuk meg [172]. Módszereinket a validálási teljesítményjellemzők alapján is alkalmasnak és megbízhatónak találtuk.

69

15. táblázat. Az enantiomer tisztaság vizsgálatára legalkalmasab, optimált eluens-összetételek

Vegyület

Optimált eluens

k1’∗

α

Rs∗∗

Atenolol

0,01 M pH=7,2-es foszfát puffer

1,56

1,25

1,50

Bupivakain

0,01 M pH=4,0-es foszfát puffer

3,94

1,34

1,66

2,01

1,88

2,97

1,92

1,75

2,12

3,90

1,69

1,61

0,01 M pH=4,0-es foszfát puffer + 1v/v% acetonitril 0,01 M pH=4,0-es foszfát puffer Glutetimid + 7v/v% 2-propanol 0,03 M pH=4,0-es acetát puffer Hexobarbitál + 1v/v% 2-propanol Fluoxetin

Ibuprofen

0,03 M pH=7,2-es foszfát puffer

1,31

1,52

1,89

Ketamin

0,03 M pH=5,5-ös acetát puffer

1,50

2,09

2,53

Klórtalidon

0,03 M pH=4,0-es acetát puffer + 0,5v/v% 2-propanol

1,76

3,46

3,68

Metoprolol

0,01 M pH=7,2-es foszfát puffer

12,10

1,38

1,54

9,80

1,38

2,07

12,56

1,40

2,15

Norgesztrel Pindolol

0,06 M pH=4,0-es acetát puffer + 1v/v% dioxán 0,01 M pH=7,2-es foszfát puffer + 5v/v% acetonitril

Propranolol

0,03 M pH=4,0-es acetát puffer

4,58

1,58

2,98

Tolperizon

0,01 M pH=4,0-es acetát puffer

1,36

1,96

2,03

∗

: az elsőként eluálódó enantiomer retenciós faktora; ∗∗: kromatográfiás felbontás, RS = 2 ⋅

t R 2 − tR 1 , w1 + w2

ahol tR2 az utolsóként, tR1 az elsőként eluálódó enantiomer retenciós ideje, w1 és w2 a kromatográfiás csúcsok alapvonalon mért szélessége [181]; a detektálás hullámhossza glutetimid esetében λ=250 nm, norgesztrel esetében λ=247 nm, a többi vegyület esetében λ=220 nm.

70

5.4.1.1. Az S-(+ +)-ibuprofen enantiomer tisztaságának meghatározása 5.4.1.1.1. Vizsgálati módszer Állófázis: Chiral-AGP (100x4,1 mm, 5 µm töltet, előtétkolonnával). Az optimált mozgó fázis összetétele: 0,03 M pH=7,2-es foszfát puffer. UV detektálás λ=220 nm, áramlási sebesség: 0,9 ml/perc, hőmérséklet: 23±0,1°C. Az injektált térfogat: 10 µl. A vizsgálandó oldatokat a 4.2.4.1. alfejezetben leírtak alapján készítettük el. 5.4.1.1.2. Validálási teljesítményjellemzők Specifikusság A specifikusság vizsgálatához mellékeljük a racém ibuprofen fenti módszerrel kapott kromatogramját (12. ábra), ahol az RS értéke 1,89, az R-(−)-ibuprofen tájékoztató retenciós ideje tR=3,70, az eutomeré tS=4,65 perc. A 13. ábra a 0,1% szennyező disztomert tartalmazó S-(+)-ibuprofen oldat kromatogramját tartalmazza, ahol tR=4,02, tS=5,00 percnek adódott.

12. ábra. A racém ibuprofen kromatogramja (c=0,1 mg/ml)

71

13. ábra. Az S-(+)-ibuprofenben 0,1% enantiomer szennyezés kimutatása Linearitás A linearitás vizsgálatát 7 különböző koncentráció szinten végeztük, szintenként 5-5, a 4.2.4.1. alfejezetben leírtak szerint készített oldatok felhasználásával. Az egyenes egyenlete: y = 1,39109 + 0,18294 X 12

Csúcs alatti terület x 10-5

10

8

6

4

2

0 0

10

20

30

40

50

Injektált mennyiség (ng)

14. ábra. Ibuprofen R-(−)-disztomer mennyisége és a csúcs alatti terület közötti összefüggés

72

A 14. ábra és a 16. táblázatban megadott paraméterek alapján az 1-50 ng/10 µl koncentrációtartományban

az

összefüggés

lineáris

és

adott

megbízhatósággal

egyenessel ábrázolható. 16. táblázat. Az S-(+)-ibuprofen enantiomer tisztaság meghatározásának validálási teljesítményjellemzői Linearitás Tengelymetszet (S.D.) Meredekség (S.D.) Korrelációs együttható (r) F p<0,01 Lineáris koncentrációtartomány (ng/10 µl) Mérési pontok száma Kimutatási határ (µg/ml) Mennyiségi meghatározás határa (µg/ml) Napon belüli ismételhetőség n=9 (R.S.D. %) 0,1µg/ml 3µg/ml 5µg/ml Napok közötti ismételhetőség n=9 (R.S.D. %) 0,1µg/ml 3µg/ml 5µg/ml Visszanyerés %-a n=9 ± R.S.D. % 0,1µg/ml 3µg/ml 5µg/ml

73

1,39109 ± 0,02352 0,18294 ± 0,00084 0,9998 19382,1 1-50 7 0,045 0,10 2,16 0,84 0,93 2,41 1,22 1,57 96,72 ± 2,84 101,81 ± 2,12 99,74 ± 1,90

5.4.1.2. Az S-(− −)-propranolol enantiomer tisztaságának meghatározása Vizsgálati módszer Állófázis: Chiral-AGP (100x4,1 mm, 5 µm töltet, előtétkolonnával). Az optimált mozgó fázis összetétele: 0,03 M pH=4,0-es acetát puffer. UV detektálás λ=220 nm, áramlási sebesség: 0,9 ml/perc, hőmérséklet: 23±0,1°C. Az injektálát térfogat: 10 µl. A vizsgálandó oldatokat a 4.2.4.2. alfejezetben leírtak alapján készítettük el. Specifikusság A specifikusság vizsgálatához mellékeljük a racém propranolol fenti módszerrel kapott kromatogramját (15. ábra), ahol az RS értéke 2,98, az elsőként eluálódó disztomer retenciós ideje tR=11,03, az eutomeré tS=16,27 perc. A 16. ábrán az 1% (10 ng/10 µl) szennyező disztomert tartalmazó S-(−)-propranolol oldat kromatogramja látható, ahol tR=7,88, tS=10,93 perc.

15. ábra. A racém propranolol kromatogramja (c=0,1 mg/ml)

74

16. ábra. Az S-(−)-propranololban 1% enantiomer szennyezés kimutatása Linearitás A 17. ábra és a 17. táblázatban megadott paraméterek alapján a 10-50 ng/10 µl koncentrációtartományban

az

összefüggés

lineáris

és

adott

megbízhatósággal

egyenessel ábrázolható. Az egyenes egyenlete: y = 0,04491 + 0,49095 X 25

Csúcs alatti terület x 10-5

20

15

10

5 10

20

30

40

50

Injektált mennyiség (ng)

17. ábra. Az R-(+)-propranolol mennyisége és a csúcs alatti terület közötti összefüggés

75

17. táblázat. Az S-(−)-propranolol enantiomer tisztaság meghatározásának validálási teljesítményjellemzői Linearitás Tengelymetszet (S.D.) Meredekség (S.D.) Korrelációs együttható (r) F p<0,01 Lineáris koncentrációtartomány (ng/10 µl) Mérési pontok száma Kimutatási határ (µg/ml) Mennyiségi meghatározás határa (µg/ml) Napon belüli ismételhetőség n=9 (R.S.D. %) 1µg/ml 3µg/ml 5µg/ml Napok közötti ismételhetőség n=9 (R.S.D. %) 1µg/ml 3µg/ml 5µg/ml Visszanyerés %-a n=9 ± R.S.D. % 1µg/ml 3µg/ml 5µg/ml

0,04491 ± 0,28844 0,49095 ± 0,00087 0,9995 3016,4 10-50 5 0,30 1,00 0,24 1,91 1,22 2,63 2,31 2,42 99,82 ± 2,62 104,33 ± 1,71 100,57 ± 1,23

5.4.1.3. A D-(− −)-norgesztrel enantiomer tisztaságának meghatározása Vizsgálati módszer Állófázis: Chiral-AGP (100x4,1 mm, 5 µm töltet, előtétkolonnával). Az optimált mozgó fázis összetétele: 1v/v% dioxán 0,06 M pH=4,0-es acetát pufferben. UV detektálás λ=247 nm, áramlási sebesség: 0,7 ml/perc, hőmérséklet: 23±0,1°C. Az injektált térfogat: 10 µl. A vizsgálandó oldatokat a 4.2.4.3. alfejezetben leírtak szerint készítettük. Specifikusság A specifikusság vizsgálatához mellékeljük a racém norgesztrel fenti módszerrel kapott kromatogramját (18. ábra), ahol az RS értéke 2,07 az elsőként eluálódó antipód retenciós ideje tL=14,73, az eutomeré tD=18,32 perc, valamint az 1% (10 ng/10 µl) szennyező disztomert tartalmazó D-(−)-norgesztrel oldat kromatogramját (19. ábra).

76

Utóbbi esetben a minorkomponens retenciós ideje tL=16,78, a főcsúcsé tD=19,15 perc volt.

18. ábra. A racém norgesztrel kromatogramja (c=0,1 mg/ml)

19. ábra. A D-(−)-norgesztrelben 1% L-(+)-norgesztrel szennyezés kimutatása

77

Linearitás A 20. ábra és a 18. táblázatban megadott paraméterek alapján a 10-50 ng/10 µl koncentrációtartományban

az

összefüggés

lineáris

és

adott

megbízhatósággal

egyenesnsel ábrázolható. Az egyenes egyenlete: y = 0,12168 + 0,04495 X 25

Csúcs alatti terület x 10-5

20

15

10

5 10

20

30

40

50

Injektált mennyiség (ng)

20. ábra. Az L-(+)-norgesztrel mennyisége és a csúcs alatti terület közötti összefüggés 18. táblázat. A D-(−)-norgesztrel enantiomer tisztaság meghatározásának validálási teljesítményjellemzői Linearitás Tengelymetszet (S.D.) Meredekség (S.D.) Korrelációs együttható (r) F p<0,01 Lineáris koncentrációtartomány (ng/10 µl) Mérési pontok száma Kimutatási határ (µg/ml) Mennyiségi meghatározás határa (µg/ml) Napon belüli ismételhetőség n=9 (R.S.D. %) 1µg/ml 3µg/ml 5µg/ml Napok közötti ismételhetőség n=9 (R.S.D. %) 1µg/ml 3µg/ml 5µg/ml Visszanyerés %-a n=9 ± R.S.D. % 1µg/ml 3µg/ml 5µg/ml

78

0,12168 ± 0,02105 0,04495 ± 0,00063 0,9993 5230 10-50 5 0,35 1,00 2,07 1,53 1,37 2,54 2,80 2,71 98,82 ± 2,64 101,05 ± 1,81 102,18 ± 1,28

5.4.2. Új 4(3H)-kinazolon származékok enantiomerjeinek elválasztása A Gyógyszerészi Kémiai Intézetben szintetizált homológ 4-oxo-3H-kinazolin származékok enantiomerjeinek elválasztásával egyrészt szélesítettük a Chiral-AGP állófázis alkalmazási körét, másrészt a szelektor szorpciós tulajdonságaira vonatkozóan is értékes információkhoz jutottunk. A racém modellvegyületek kémiai szerkezetét a 21. ábra mutatja.

CH3 N

CH3

N NH

O

O

N

R1

N

CH2 H2 C

Br R2

O Cl

R1

R2

1

H

5

CH2CH2COOC2H5

2

C6H6

6

CH2CH2COOH

3

C6H5-OCH3

4

C6H5-OC2H5

21. ábra. A vizsgált 4(3H)-kinazolon származékok szerkezete

A kinazolonok farmakológiai és gyógyszerkémiai jelentősége sokrétű. A gyűrűrendszer szubsztituenseinek változtatásával széles hatástani spektrum jelenik meg [182]. A fenti potenciális cholecystokinin antagonista vegyületek szerkezetük szerint két csoportba sorolhatók. A kinazolon gyűrű 2-es helyzetében szubsztituált származékok az R1 helyettesítőnek megfelelő savamid funkciós csoportot tartalmaznak. A másik csoport modellvegyületei a kinazolon gyűrű 2-es és 3-as helyzetében diszubsztituált származékok, amelyek közül a 6 vegyület karboxil-csoportottal rendelkezik. Mivel az irodalomból ismeretes a kinazolonok plazmafehérjéhez való kötődése, feltételeztük, hogy az AGP-alapú állófázis alkalmas a modellvegyületek enantiomerjeinek elválasztására [183]. A kiralitás centruma mind a hat vegyület esetében a kinazolon váz szubsztituensének C1’ atomja. Az AGP enantioszelektivitása feltehetően a kinazolin 79

gyűrű heteroatomja(i) és a szelektor poláris részei közötti kölcsönhatásból adódik. E kölcsönhatások erősségét mutatja, hogy az α értékekeket a szerves módosító koncentrációjának változása viszonylag csak kis mértékben befolyásolja. Más a helyzet a 6 karbonsavszármazéknál, amely anionos formában van jelen, ezért erős poláris kötést létesít a szorbens felületén, elmosva az enantiomerek közötti egyéb kötődési különbségeket. Az optimált kromatográfiás rendszerekben a 6 vegyülettől eltekintve az enantiomerek α=1,19-1,85 értékkel jellemezhető alapvonal-elválasztását értük el. Az optimálás során vizsgáltuk a szerves módosítók (acetonitril és 2-propanol) anyagi minőségének és koncentrációjának, valamint az eluens pH értékének a retencióra (k’) és az enantioszelektivitásra (α) gyakorolt hatását. 19. táblázat. A szerves módosító hatása a retenciós faktorra (k’) és az enantioszelektivitásra (α) Szerves módosító v/v%

M

1

2

3

4

5

k1’**

α

k1’

α

k1’

α

k1’

α

k1’

α

Acetonitril 7

1,33

1,36

1,61*

49,93

1,25*

24,22

1,22*

29,22

1,48*

28,67

1,13

10

1,91

0,69

1,46

15,34

1,13

8,34

1,30*

9,95

1,49*

11,35

1,17

14

2,67

0,30

1,42

5,46

1,09

2,72

1,33*

3,21

1,46*

4,67

1,19*

2-Propanol 4

0,53

1,10

1,85*

34,29

1,19*

22,99

1,33*

28,36

1,20*

20,94

1,19*

7

0,94

0,57

1,58

12,45

1,33*

8,98

1,38*

10,66

1,28*

8,92

1,23*

10

1,33

0,35

1,40

5,82

1,37*

4,36

1,42*

5,01

1,33*

4,21

1,26*

Mozgó fázis: szerves módosító 0,01 M pH=7,0-es foszfát pufferben; *: alapvonal-elválasztás;

**

: az

elsőként eluálódó enantiomer retenciós faktora.

A 19. táblázat eredményei azt mutatják, hogy mindkét szerves oldószer esetében a koncentráció növelésével a k’ értékek csökkennek, azonban az enantioszelektivitás a molekula szerkezetétől és a módosító anyagi minőségétől függően különbözőképpen változik. Az acetonitril koncentrációját 7v/v%-ról 14v/v%-ra emelve a 3 és az 5 vegyületnél a szelektivitás növekedését tapasztaltuk, ami mindkét esetben alapvonalelválasztáshoz vezetett. Ugyanakkor az 1 és 2 vegyületek 80

α értéke a fenti

oldószerösszetételek

mellett

határozottan

csökkent,

míg

a

4

vegyület

enantioszelektivitása gyakorlatilag változatlan maradt. Megfigyelhető, hogy a 2propanol koncentrációjának emelésével az 1 vegyület kivételével az összes mintakomponens szelektivitási faktora kismértékben növekedik. A fenti jelenség néhány lehetséges magyarázata a következő: (a) Kötődési vizsgálataink során igazoltuk, hogy a szerves oldószerek a szelektor felületén jelentős mértékben adszorbeálódnak, ami a fehérje konformációváltozásához vezethet. Ennek megfelelően az AGP kötőhelyének tulajdonságai módosulhatnak, ami a szelektivitást is lényegesen befolyásolhatja. (b) A szerves oldószer molekulák kompetícióban állnak az egyes enantiomerekkel az állófázis hidrofób, valamint hidrogénhidas kölcsönhatás kialakítására képes királis és akirális kötőhelyeiért. (c) Ezenkívül a módosítók a mintakomponens

enantiomerjeinek

szolvatálása

útján

is

befolyásolhatják

a

sztereoszelektiv kötődést. Mindezek alapján nem meglepő, hogy az igen gyenge hidrogén-akceptor tulajdonságú, elsősorban dipólus-dipólus kölcsönhatásba lépő acetonitril és a hidrogén-akceptor és donor tulajdonságot egyaránt mutató 2-propanol a modellvegyületek kromatográfiás viselkedését a fenti mechanizmussal eltérő módon befolyásolja.

81

50 45 40 35

k'

30 25 20 15 10 5 0 4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

pH

Mozgó fázis: 7v/v% (1,33 M) acetonitril 0,01 M foszfát pufferben; Vegyületek: ▲=

1; ▼ = 2; ♦ = 3; + = 4; ● = 5; ■ = 6. Egyéb körülmények a 4.2.5. alfejezetben.

22. ábra. A retenciós faktor (k’) pH-függése A 22. ábra az eluens pH-jának a retencióra kifejtett hatását mutatja 7v/v% (1,33 M) acetonitril jelenlétében. A várakozásnak megfelelően a pH emelésével a savas tulajdonságú 6 vegyület deprotonálódása fokozódik, ami a hidrofób kölcsönhatások gyengüléséhez, következésképpen a retenciós faktor csökkenéséhez vezet. A 23. ábrán azonban az is megfigyelhető, hogy az alkalmazott eluens-összetételek mellett sem a hidrofób, sem az elektrosztatikus kölcsönhatások nem vezettek a 6 vegyület enantiomerjeinek elválasztásához. Mivel a többi modellvegyület a vizsgált pH=4,0-7,0 tartományon belül gyakorlatilag semleges tulajdonságúnak tekinthető (a kinazolon gyűrűben lévő N1−amino csoport esetében pKa=2,4 [184]), a pH emelésével a k’ érték bármilyen változása kizárólag a szelektor szerkezetében bekövetkező változás következménye lehet. Ismeretes, hogy a fehérje szerkezetének módosulásakor a „rejtett aminosavegységek - amelyek között szerepelnek aromás gyűrűvel szubsztituáltak is – a fehérje felszínére kerülnek, ezáltal új kötőhelyként működhetnek. Ezt a feltételezést támasztja alá az a megfigyelésünk, hogy a 7v/v% acetonitrilt tartalmazó eluens esetén a pH növelésével a semleges típusú vegyületek retenciós faktora számottevően növekedett. Ez a változás a fenil-csoporttal szubsztituált 2 vegyület esetében volt a legkifejezettebb

82

(a pH-t 6,0-ról 7,0-re emelve k’ értéke a kétszeresére nőtt), ami arra enged következtetni, hogy pH=7,0-nél a szerkezeti átalakulás a modellvegyület aromás gyűrűje és az AGP kötőhelyek közötti π-π kölcsönhatások domináns szerepéhez vezet. Ugyanakkor az aromás gyűrű 4-es helyzetébe történő elektron-küldő csoport pl. metoxi vagy etoxi-csoport bevitelével a k’ értékek csak kisebb mértékben növekednek (3 vegyületnél 19,73→24,22, 4 vegyületnél 22,44→29,22), mivel a szubsztituensek módosítják az aromás rendszer elektron-eloszlását, következésképpen a π-π kölcsönhatások erősségét is.

1,7 1,6 1,5

α

1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

pH

Mozgó fázis: 7v/v% (1,33 M) acetonitril 0,01 M foszfát pufferben. Vegyületek: ▲ = 1; ▼ = 2; ♦ = 3; + = 4; ● = 5; ■ = 6. Egyéb körülmények a 4.2.5. alfejezetben.

23. ábra. Az enantioszelektivitás (α) pH-függése

A 23. ábrán az enantioszelektivitás pH-függése követhető nyomon 7v/v% (1,33 M) acetonitril jelenlétében. Megfigyelhető, hogy bár a 6 vegyület alapvonalelválasztását nem tudtuk elérni, ugyanakkor észter származékánál (5 vegyület) azonos kromatográfiás rendszerekben jó elválasztást kaptunk. Ennek megfelelően az 5 vegyületben az észter funkciós csoport jelenléte a királis elválasztás szempontjából jelentősnek bizonyul. A 4 vegyület α értéke a vizsgált pH tartományon belül gyakorlatilag változatlan, azonban a többi molekula esetében az enantioszelektivitás nagymértékben függ az eluens pH-jától. A 2 és 3 vegyületeknél a maximális 83

enantioszelektivitást pH=4,0-nél, míg a megfelelő minimum értéket pH=6,0-nál tapasztaltuk. Az 1 molekula α értéke a pH emelésével kezdetben nő, majd pH=6,0-7,0 között megközelítőleg állandó értéket ér el. Figyelembe véve, hogy a legnagyobb fokú enantioszelektivitást a kinazolon gyűrű 2-es helyzetében R1 helyettesítőként hidrogén atomot tartalmazó 1 vegyületnél észleltük, a királis felismerésben a hidrogén-hidas kölcsönhatások kialakulásának döntő szerepet tulajdonítunk. A 24. ábra azt mutatja, hogy az acetonitril koncentrációját 10v/v% (1,91 M)-ra emelve a semleges tulajdonságú vegyületek k’ értéke a vizsgált pH tartományon belül gyakorlatilag állandó, vagyis a kötőhelyek 7v/v% acetonitril jelenlétében tapasztalt szerkezeti átalakulása 10v/v% acetonitril hozzáadására nem megy végbe.

24 22 20 18 16

k'

14 12 10 8 6 4 2 0 4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

pH

Mozgó fázis: 10v/v% (1,91 M) acetonitril 0,01 M foszfát pufferben. Vegyületek: ▲=

1; ▼ = 2; ♦ = 3; + = 4; ● = 5; ■ = 6. Egyéb körülmények a 4.2.5.alfejezetben.

24. ábra. A retenciós faktor (k’) pH-függése A különböző tulajdonságú szerves módosítók kromatográfiás paraméterekre kifejtett hatását az alábbiak szerint hasonlítottuk össze. A 7v/v% (1,33 M) acetonitrillel azonos mólkoncentrációban, 10v/v% (1,33 M) 2-propanolt alkalmaztunk a kinazolon homológok királis elválasztására (25. ábra). Az alacsonyabb dielektromos állandójú 2propanol valamennyi modellvegyület enantiomerjeinek retenciós faktorát jelentős mértékben csökkentette, ugyanakkor a pH=4,0-7,0 tartományon belül a k’értékeket nem

84

módosította lényegesen. Ennek megfelelően a 25. ábra nagyfokú hasonlóságot mutat a 10v/v% (1,91 M) acetonitril jelenlétében mért adatokat ábrázoló grafikonnal (24. ábra). Mindez tehát arra utal, hogy az ekvimoláris koncentrációjú acetonitril hozzáadásakor tapasztalt, a fehérje kötőhelyeire közvetlen hatással lévő szerkezeti átalakulás 2propanol hatására nem figyelhető meg. A fenti eredményekkel igazoltuk, hogy a szerves módosítók hidrofób jellege és hidrogén-donor, valamint akceptor tulajdonsága döntő hatással van az AGP szerkezetére, amely meghatározza a retenciót és az enantioszelektivitást. 10 9 8 7

k'

6 5 4 3 2 1 0 4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

pH

Mozgó fázis: 10v/v% (1,33 M) 2-propanol 0,01 M foszfát pufferben. Vegyületek: ▲ = 1; ▼ = 2; ♦ = 3; + = 4; ● = 5; ■ = 6. Egyéb körülmények a 4.2.5. alfejezetben.

25. ábra. A retenciós faktor (k’) pH-függése

Az enantioszelektivitás pH-függését 10v/v% 2-propanol alkalmazása esetén a 26. ábra mutatja be. Látható, hogy az 1 és 4 vegyületek α értéke az azonos mólkoncentrációban alkalmazott acetonitril, míg a 2, 3 és 5 mintakomponensek megfelelő értékei a 2-propanol jelenlétében voltak lényegesen magasabbak.

85

1,7 1,6 1,5

α

1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

pH

Mozgó fázis:10v/v% (1,33 M) 2-propanol 0,01 M foszfát pufferben. Vegyületek: ▲ = 1; ▼ = 2; ♦ = 3; + = 4; ● = 5; ■ = 6. Egyéb körülmények a 4.2.5. alfejezetben.

26. ábra. Az enantioszelektivitás (α) pH-függése Modellkísérletünkkel igazoltuk, hogy a különböző tulajdonságú szerves módosítók a szorbens felületén lévő kötőhelyeket eltérő módon képesek befolyásolni. A fenti adatok azt tükrözik, hogy a mozgó fázis összetételétől függően a kinazolon váz szubsztituenseinek kismértékű változtatásával az enantioszelektivitás tág határok között módosul. Egyidejűleg az is megállapítható, hogy egy adott modellvegyület retencióját és enantioszelektivitását a mozgó fázis összetevők (jelen esetben a pH, a szerves módosító anyagi minősége és koncentrációja) minden esetben együttesen szabják meg.

86

6. MEGBESZÉLÉS

6.1. Az eredmények összefoglalása Az AGP oszlopon érvényesülő kromatográfiás mechanizmus további feltárásához meghatároztuk a szerves módosítók közül a gyakorlatban elterjedt acetonitril megkötődött mennyiségét a leggyakrabban alkalmazott pH=7,2-es kémhatás mellett a savas tartományban is (pH=4,0). Elsőként szolgáltattunk adatokat az alacsony dielektromos állandójához képest igen nagy elúciós erejű dioxán kötődésére. Megállapítottuk, hogy a két fenti szerves módosító adszorpciós izotermája azonos jellegű, a megkötődött mennyiségekben azonban jelentős eltérések mutatkoznak. Eredményeink szerint azonos moláris koncentráció (1,90 M) mellett pH=7,2-nél az acetonitril, míg pH=4,0-nél a dioxán kötődése szignifikánsan nagyobb. Megállapítottuk, hogy mindkét módosító kötődése pH-függő: pH=7,2-nél telítési görbét ír le, míg pH=4,0-nél – a vizsgált koncentrációtartományon belül – kétlépcsős, monoton görbével jellemezhető. A mennyiségi különbségekből arra következtettünk, hogy az acetonitril és a dioxán az AGP oszlopon sajátos kötőhelyekhez kapcsolódik, ami ezen szerves módosítók szelektív eluotróp tulajdonságaiban nyilvánul meg. A kötődés pH-függését az AGP szorbens konformációváltozásával értelmezzük, ugyanakkor figyelembe vesszük annak a lehetőségét is, hogy az oldószermolekulák az AGP-felületet több rétegben borítják. A szelektor konformációváltozásának követésére natív AGP-vel végeztünk modellvizsgálatokat. A kötődési meghatározás eredményeivel összhangban CDspektroszkópiával megállapítottuk, hogy pH=4,0-nél az acetonitril koncentráció emelésével a CD spektumok negatív ellipticitás értékei fokozatosan növekednek, 30v/v% acetonitril jelenlétében pedig az α-hélix szerkezetre jellemző spektrum jelenik meg. Ezzel szemben pH=7,2-nél az acetonitril koncentráció növelése nem idéz elő érdemi változást a spektrumban. Az AGP fluoreszcencia-kioltásos vizsgálatával először határoztuk meg - 2,2,2triklór-etanol (TCE) kioltó-vegyület felhasználásával – adott acetonitril koncentrációk jelenlétében az effektív dinamikus kioltási állandókat. Egyezésben a CD-spektroszkópiás vizsgálat eredményeivel megállapítottuk, hogy pH=4,0-nél az acetonitril koncentráció növelésével a kioltó hatás (az apoláris kioltó-molekula hozzáférése a fluorofór 87

környezetéhez ) szignifikánsan nőtt, míg pH=7,2-nél ez a változás nem volt számottevő. A hozzáférés növekedését konformációváltozással, az AGP triptofán-részek fokozódó belső mozgásával magyarázzuk. Savas

(ibuprofen),

bázikus

(propranolol)

és

semleges

(norgesztrel)

gyógyszermolekulák felhasználásával új, gyógyszerkönyvi vizsgálati célra alkalmas, validált módszereket dolgoztunk ki. Az optimált rendszerekben a kromatográfiás felbontás értékei (RS) valamennyi esetben meghaladják

a

gyógyszerkönyvek

rendszeralkalmassággal szemben támasztott követelményeit (RS≥1,5). Módszereinkkel a 0,1%-os (ibuprofen), illetve az 1%-os (propranolol, norgesztrel) mennyiségben meghatározható szennyező minorkomponens (disztomer) a főcsúcs előtt eluálódik, ami a tisztaságvizsgálat érzékenysége szempontjából igen előnyös. Elsőként alkalmaztuk az AGP-alapú állófázist 4(3H)-kinazolon származékok enantiomerjeinek elválasztására. A módszerek kidolgozása során megfigyeltük, hogy a semleges tulajdonságú homológ modellvegyületek retenciós faktor értékei az eluens pH-t 6,0-ról 7,0-re emelve 7v/v% (1,33 M) acetonitril jelenlétében növekednek. Ugyanakkor megállapítottuk, hogy az acetonitril koncentráció emelésével (10v/v%), valamint azonos moláris koncentrációjú (1,33 M) 2-propanol alkalmazásakor a fenti változások nem mennek

végbe.

Megfigyeléseinket

a

szelektor

tulajdonságainak

változásával

magyarázzuk, amelyet minden esetben a szerves módosító anyagi minősége és koncentrációja együttesen határoz meg.

6.2. Az eredmények hasznosítása Alapkutatás jellegű munkánkkal az AGP oszlopon érvényesülő kromatográfiás mechanizmus új részleteit tártuk fel. Ezen ismeretek alapján lehetőség nyílik az adott gyógyszeranalitikai

feladatok

megoldására

alkalmas

mozgófázis-összetételek

tervezésére, beleértve a preparatív kromatográfiás felhasználást is. A disszertációban bemutatott új módszerek közvetlenül alkalmasak gyógyszerkönyvi enantiomer szennyezés vizsgálati felhasználásra, egyben hasznos modellként szolgálhatnak az AGP hasonló célú további alkalmazásához.

88

7. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Köszönettel tartozom Dr. Noszál Béla egyetemi tanárnak, a kémiai tudomány doktorának, a Gyógyszerészi Kémiai Intézet igazgatójának, aki kutatómunkám elvégzését lehetővé tette, munkámat kezdettől fogva figyelemmel kísérte és értékes tanácsaival mindvégig segítségemre volt. Hálás köszönetemet fejezem ki témavezetőmnek, Dr. Szász György Professor Emeritusnak, a kémiai tudomány doktorának, korábbi intézetigazgatónak, aki az elméleti és gyakorlati problémák megoldásában mindvégig segítségemre volt, értékes szakmai tanácsaival nagymértékben hozzájárult közösen elért tudományos eredményeinkhez. Köszönettel tartozom Dr. Gergely Andrásnak, a kémiai tudomány kandidátusának, a CD mérések során nyújtott segítségéért, irányadó szakmai és baráti tanácsaiért. Köszönöm Dr. Papp Ottónak, a kémiai tudomány kandidátusának, a GC meghatározásokkal kapcsolatos segítségét és mindenkori hasznos tanácsait. Megköszönöm Dr. Báthory Gábornak és Dr. Mészáros György Ph.D. doktornak a fluoreszcencia spektroszkópiás vizsgálatok terén nyújtott segítségüket. Köszönöm Vértesiné Pelhős Katalinnak, Kovácsné Derzsi Ilonának, Matalinné Foór Ilonának és Asztalosné Túróczi Erzsébetnek, hogy gondos és lelkiismeretes munkájukkal segítettek a mérések kivitelezésében. Ezúton köszönöm meg az Országos Tudományos Kutatási Alapprogramok (OTKA F022080) és az Országos Műszaki Fejlesztési Bizottság támogatását. Hálásan köszönöm férjemnek és édesanyámnak azt az éveken át tartó segítséget, türelmet, megértést és szeretetet, amellyel a disszertáció elkészítéséhez nagymértékben hozzásegítettek. Nagyon köszönöm fiaimnak, Balázsnak és Marcinak végtelen türelmüket és határtalan szeretetüket, amiből mindig sikerült erőt merítenem.

89

8. IRODALOMJEGYZÉK

1.

Ariens, A., Soudijn, W., Timmermans, P. (Editors), Stereochemistry and Biological Activity of Drugs, Blackwell, Oxford, pp. 68-105., 1983.

2.

Wainer, I. W. (Ed.), Drug Stereochemistry. Analitical Methods and

Pharmacology, Marcel Dekker, New York, 2nd ed., pp. 245-397., 1993. 3.

Simonyi, M., Medicinal Research Reviews, 4, 359 (1984).

4.

The Commitee on Proprietary Medicinal Products (CMPM) Investigation of chiral active ingredients: Note for guidance. III/3501/91 (1992).

5.

The Food and Drug Administration (FDA) FDA’s policy statement for the development of new stereoisomeric drugs. Federal Register 57 (102), 222 (1992).

6.

Ministry

of

Health

and

Welfare

(MHW)

Guidelines

for

nonclinical

pharmacokinetic studies. June, Tokyo (1991). 7.

Hutt, A. J., Caldwell, J., J. Pharm. Pharmacol. 35, 693 (1983).

8.

Kroemer, H. K., Funck-Brentano, C., Silberson, D., J., Wood, A. J. J., Eichelbaum, M., Woosley, R. L., Roden, D. M., Circulation 79, 1068 (1989).

9.

Stromas, M., Šunjić, V., Kovać, T., Klasinc, L., Kajfez, F., Croat, Chem. Acta, 46, 265 (1974).

10. Cooper, M. J., Anders, M. W., Life Sci. 15, 1665 (1974). 11.

Tucker, G. T., The Lancet 355, 1085 (2000).

12.

Stinson, S. C., Cenear 76 (38), 1 (1998).

90

13.

Handley, D. A., Morlay, J., Expert Opinion in Investigational Drugs 7, 1601 (1998).

14.

White, P. F., Ham, J., Way, W. L., Trevor, A. J., Anesthesiology 52, 231(1980).

15.

Neupert, W., Brugger, R., Euchenhofer, C., Brune, K., Geisslinger, G., Br. J. Pharmacol., 122, 487 (1997).

16.

Eliel, E. L., Wilen, S.H., Mander, L.N., Stereochemistry of organic compounds, Wiley, New York, pp. 214-217., 1994.

17.

Chafetz, L., Chem, T. M., J. Pharm. Sci. 63, 807 (1974).

18.

Purdie, N., Analytical applications of CD to the forensic, pharmaceutical, clinical,and food sciences In: Purdie, N. and Brittain, H. G. (eds.) Analytical applications of Circular Dichroism, Amsterdam, Elsevier, pp. 241-278., 1994.

19.

Engle, A. R., Purdie, N., Anal. Chim. Acta 298, 175 (1994).

20.

Charney, E., The Molecular Basis of Optical Activity, Wiley, New York, pp. 72., 1979.

21.

Horváth, P., Gergely, A., Noszál, B., Talanta 44, 1479 (1997).

22.

Bertucci, C., Salvadori, P., Lopes-Guimaraes, L.F., J. Chromatogr-A., 666(1-2), 535 (1994).

23.

Pirkle, W. H., J. Am. Chem. Soc. 88, 1837 (1966).

24.

Pirkle, W. H., Beare, S. D., J. Am. Chem. Soc. 89, 5485 (1967).

25.

Whitesides, G. M., Lewis, D. W., J. Am. Chem. Soc. 92, 6979 (1970).

91

26.

Hanna, G. M., Lau-Cam, C. A. J. Pharm. Biomed. Anal. 13, 1313 (1995).

27.

Jacques, J., Collet, A., Wilen, S. H., Enantiomers, Racemats and Resolutions, Wiley, New York, pp. 152 1981., 1981.

28.

Greenstein, J. P., Winitz, M., The Chemistry of Amino Acids, Vol. 2., Wiley, New York, pp. 1738 1961., 1961.

29.

Beckett, A. H., Progr. Drug. Res. 1, 499 (1953).

30.

Karush, F., J. Am. Chem. Soc. 78, 5519 (1956).

31.

Contractor, S. F., Wragg, J., Nature, 208, 71 (1965).

32.

Allenmark, S., Chromatographic Enantioseparation: Methods and Applications, 2nd ed., Ellis Horwood series in analytical chemistry, pp.88-104., 1991.

33.

Macaudière,P., Caude, M., Rosset, R., Tambuté, A., In: Chiral Separations, Stevenson, D. and Wilson, I.D., (eds.), Plenum, New York, pp.115., 1988.

34.

Nishi, H., Terabe, S., J. Chromatogr. 694, 245 (1995).

35.

Fanali, S., J. Chromatogr. 735, 77 (1996).

36.

Baker, D., R., Capillary Electrophoresis, Willey, New York, pp.16., 1995.

37.

Altria, K. D., Walsh, A. R., Smith, N. W., J. Chromatogr., 645, 193 (1993).

38.

Castelnovo, P., Albanesi, C., J. Chromatogr. A., 715, 143 (1995).

39.

Terabe, S., Shibata, M., Miyashita, Y., J. Chromatogr., 480, 403 (1989).

92

40.

Kang, J. W., Zhang, X. M., Zhang, S. M., On, Q. Y., Chromatographia, 50, 317 (1999).

41.

Fillet, M., Bechet, I., Chiap, P., Hubert, Ph., Crommen, J., J. Chromatogr. A., 717, 203 (1995).

42.

Tanaka, Y., Terabe, S., Chromatographia, 44, 119 (1997).

43.

Abushoffa, A. M., Clark, B. J., J. Chromatogr. A., 700, 51 (1995).

44.

Ward, T. J., Dann, C., Blaylock, A., J. Chromatogr. A., 715, 337 (1995).

45.

deBoer, T., Ensing, K., J. Pharm. Biomed. Anal., 17, 1047 (1998).

46.

Li, S., Lloyd, D. K., Anal Chem., 65, 3684 (1993).

47.

Lindner, W., Indirect separation of enantiomers by liquid chromatography In. Chromatographic Chiral Separations (Eds. Zief, M., Crane, L., J.), Chap.4. Marcel Dekker Inc., New York 1988.

48.

Koreeda, M., Weiss, G., Nakanishi, K., J. Am. Chem. Soc., 95, 239 (1973).

49.

Gal, J., Indirect chromatographic methods for resolution of drug enantiomers synthesis and separation of diastereomeric derivatives. In: Drug Stereochemistry. Analitical Methods and Pharmacology,(Ed. Wainer I. W.), Marcel Dekker, New York, 2nd ed., pp. 65-106., 1993.

50.

Görög, S., Gazdag, M., J. Chromatogr. B. 659, 51 (1994).

51.

Lawrence, J. F., J. Chromatogr. Sci., 23, 484 (1985).

52.

Kim, J. H., Nishida, Y., Ohrui, H., Meguro, H., J. Chromatogr, 693, 241 (1995).

93

53.

Silber, B., Riegelman, S., J. Pharmacol. Exp. Ther. 215, 643 (1980).

54.

Langguth, P., Spahn, H., Merkle, H. P. J. Chromatogr. 55, 528 (1990).

55.

Martin, E., Quinke, K., Spahn, H., Mutschler, E. Chirality 1, 223 (1989).

56.

Lindner, W. F., Hirschböck, I., J. Liq. Chrom. and Rel Technol., 9, 551 (1986).

57.

Pettersson, C., Schill, G., J. Chromatogr., 204, 179 (1981).

58.

Sybilska, D., Zukowski, J., Bojarski, J., J. Liquid Chrom. and Rel. Technol., 9, 591 (1986).

59.

Hermansson, J., J. Chromatogr., 316, 537 (1984).

60.

Le Page, J., Lindner, W., Davies, G., Seitz, D., Karger, B. L., Anal. Chem. 51, 433 (1979).

61.

Davankov, V. A., Bochkov, A. S., Kurganov, A. A., Roumeliotis, P., Unger, K. K., Chromatographia 13, 677 (1980).

62.

Aso, Y., Yoshioka, S., Shibazaki, T., Uchiyama, M. Bunseki Kagaku 35, 314 (1986).

63.

Pettersson, C., Schill, G., Chromatographia 16, 192 (1982).

64.

Szepesi, G., Gazdag, M., Iváncsics, R., J. Chromatogr., 244, 33 (1982).

65.

Debowski, J., Sybilska, D., Jurczak, J. J. Chromatogr. 237, 303 (1982).

66.

Gazdag, M., Szepesi, G., Mihályfi, K., J. Chromatogr. 450, 145-155 (1988).

67.

Tertloth, G., LC GC Europe 12, 698 (1999).

94

68.

Francotte, E., Preparation of drug enantiomers by chromatographic resolution on chiral stationary phases In: The impact of stereochemistry on drug development and use, Aboul-Enein, H., Y., and Wainer, I.W., (eds.) Chemical Analysis Series, Vol.142, p.633-681., 1997.

69.

Snyder, L., R., Kirkland, J., J., Gljach, J., L., Practical Method Development, Wiley, New York, pp. 537-615., 1997.

70.

Dalgliesh, C.E., J. Chem. Soc., 137, 3940 (1952).

71.

Davankov, V.A., Adv. Chromatogr., 18, 139 (1980).

72.

Blaschke, G., J. Liq. Chromatogr. 9, 341 (1986).

73.

Francotte, E., J. Chromatogr. 666, 565 (1994).

74.

Armstrong, D. W., Tang, Y., Chen, S., Zhou, Y., Bagwill, K., Chen, J. R., Anal. Chem., 66, 1473 (1994).

75.

Doležalová, M., Tkaczyková, M., J. Pharm. Biomed. Anal., 19, 555 (1999).

76.

He, J.Y., Cheung, A.P., Struble, E., Wang, E., Liu, P., J. Pharm. Biomed. Anal., 22(3), 583 (2000).

77.

Pirkle, W.H., House, D. W., J. Org. Chem. 44, 1957 (1979).

78.

Pirkle, W.H., Finn, J., J. Org. Chem. 46, 2935 (1981).

79.

Pirkle, W.H., Welch, C.J., J. Liq. Chromatogr., 15(11), 1947 (1992).

80.

Pirkle, W.H., Welch, C.J., J. Chromatogr., 683, 347 (1994).

95

81.

Blackwell, J.,In: Cellulose and Other Natural Polymer Systems, (Ed. Brown Jr., R. M.,) Plenum, New York, pp. 403-428., 1982.

82.

Francotte, E., Wolf, R., M., Lohmann, D., Mueller, R., J. Chromatogr., 347, 25 (1985).

83.

Hesse, G., Hagel, R., Chromatographia 6, 277 (1973).

84.

Ichida, A., Shibata, T., Okamoto, I., Yuki, Y., Namikoshi, H., Toga, Y., Chromatographia 19, 280 (1984).

85.

Okamoto, Y., Aburatani, R., Hatada, K., J. Chromatogr., 448, 454 (1988).

86.

Rustum, A. M., Estrada, V., J. Chromatogr., 705, 111 (1998).

87.

British Pharmacopoeia 1998, The Stationery Office, London pp. 1153., 1998.

88.

European Pharmacopoeia-Supplement 1999. pp.424.

89.

Armstrong, D. W., Demond, W., J. Chromatogr. Sci., 22, 441 (1984).

90.

Chang, S. C., Reid III., G. L., Cheng, S., Chang, C. D., Armstrong, D. W., Trends Anal. Chem. 12, 144 (1993).

91.

Sousa, L. R., Sogah, G. D. Y. Hoffman, D. H., Cram, D. J., J. Am. Chem. Soc. 100, 4569 (1978).

92.

Blaschke, G., J. Liq. Chrom. and Rel. Technol., 9, 341 (1986).

93.

Davankov, V. A., Kurganov, A. A., Bochkov, A. S., Adv. Chromatogr., 22, 71 (1983).

94.

Gübitz, G., Jellenz, W., Santi, W., J. Chromatogr., 203, 377 (1981).

96

95.

Gübitz, G., Juffman, F., Jellenz, W., Chromatographia, 16, 203 (1982).

96.

Walle, T., Walle, U. K., TIPS, 4, 155 (1986).

97.

Walle, U. K., Walle, T., Bal, S. A., Olanoff, L. S., Clin. Pharmacol. 18, 718 (1984).

98.

Albani, F., Riva, R., Contin, M., Baruzzi, A., Br. J. Clin. Pharmacol. 18, 244 (1984).

99.

Hermansson, J., J. Chromatogr., 269, 71 (1983).

100. Domenici, E., Bertucci, C., Salvadori, P., Felix, G., Cahagne, I., Motellier, S., Wainer, I. W., Chromatographia, 29, 170 (1990). 101. Allenmark, S., Bomgren, B., Boren, H., J. Chromatogr., 264, 63 (1983). 102. Miwa, T., Miyakawa, T., Kayano, M., Miyake, Y., J. Chromatogr., 408, 316 (1987). 103. Erlandsson, P., Marle, I., Hansson, L., Isaksson, R., Pettersson, C., Pettersson, G., J. Am. Chem. Soc. 112, 4573 (1990). 104. PA/PH/Exp.3/T (00) 92,COM 105. Kodiček, M., Infanzōn, A., Karpenko, V., Biochim. Biophys. Acta, 1246, 10 (1995). 106. Havel, H.A., Kauffman, E.W., Plaisted, S.M., Brems, D.N., Biochemistry, 25, 6533-6538 (1986). 107. Herskovits, T.T., Gadegbeku, B., Jaillet, H., J. Biol. Chem., 245, 2588 (1970). 108. Allenmark, S., Andersson, S., J. Chromatogr. A, 666, 167 (1994).

97

109. Noctor, T. A. G., Wainer, I. W., J. Liq. Chrom. and Rel. Technol., 16(4), 783 (1993). 110. Weimer, H. E., Mehl, J. W., Winzler, R. J., J. Biol. Chem., 185, 561 (1950). 111. Schmid, K., J. Am. Chem. Soc. 72, 2816 (1950). 112. Ikenaka, T., Ishiguro, M., Emura, J., Kaufmann, H., Isemura, S., Bauer, W., Schmid, K., Biochemistry, 11, 3817 (1972). 113. Schmid, K., Kaufmann, H., Isemura, S., Bauer, F., Emura, J., Motoyama, T., Ishiguro, M., Nanno, S., Biochemistry, 12, 2711 (1973). 114. Karpenko, V., Sinkorová, L., Kodicek, M., Collect. Czech. Chem. Commun., 57, 641 (1992). 115. Karpenko, V., Sinkorová, L., Janácková, L., Collect. Czech. Chem. Commun., 58, 2701 (1993). 116. Schmid, K., The Plasma Proteins In: Putnam, F. W., (Ed): Academic Press, New York, pp. 183-228., 1975. 117. Schmid, K., Nimberg, R. B., Kimura, A., Yamaguchi, H., Binette, J. P., Biochim. Biophys. Acta, 492, 291 (1976). 118. Montreuil,J., Adv. Carbohydrat Chem. Biochem., 37, 157 (1980). 119. Agneray, J., Glycan Microheterogeneity Forms of Alpha 1-Acid Glycoprotein (AGP): Their Identification in Biological Fluids and Variations in Their Relative Proportions in Disease States. In: Alpha1-Acid Glycoprotein: Genetics, Biochemistry, Physiological Functions and Pharmacology,. Baumann, P., Eap, C. B., Müller, W. E., Tillement, J. P., (eds) Alan R. Liss, Inc., New York, pp. 47-65., 1989.

98

120.

Végh, S., Kremmer, T., Boldizsár, M., Gesztesi, K.A., Szajáni, B., Clin. Chim.

Acta, 203, 259 (1991). 121.

Kremmer, T., Boldizsár, M., Kovács, J., Paulik, E., Bencsik, K., Szajáni, B., J.

Liq. Chrom. and Rel. Technol., 18(6), 1207 (1995). 122. Schmid, K., J. Am. Chem. Soc., 75, 60 (1953). 123.

Yamagami, K., Schmid, K., J. Biol. Chem., 242, 4176 (1967).

124. Schmid, K., Kamiyama, S., Biochemistry, 2, 271 (1963). 125.

Schmid, K., Prog. Clin. Biol. Res., 300, 7 (1989).

126.

Schmid, K., Chen Li-Chuang, H., Occhino, C., Foster, J. A., Biochemistry, 15,

2245 (1976). 127. Karpenko, V., Kalous, V., Collect. Czech. Chem. Commun., 42, 45 (1977). 128. Svobodová, X., Karpenko, V., Kalous, V., Collect. Czech. Chem. Commun., 42, 1742 (1977). 129. Schmid, K., Emura, J., Schmid, M. F., Stevens, R. L., Nimberg, R. B., Int. J. Peptide Protein Res., 11, 42 (1978). 130. Yost, R. L., Devance, C. L., J. Pharm. Sci., 74, 777 (1985). 131. McNamara, P. J., Jewell, R. C., Gillespie,M. N., The interaction of alpha-1-acid glycoprotein with endogenous autocoids, in particular, platelet activating factor In: Alpha1-Acid Glycoprotein: Genetics, Biochemistry, Physiological Functions and Pharmacology,. Baumann, P., Eap, C. B., Müller, W. E., Tillement, J. P., (eds) Alan R. Liss, Inc., New York, pp.307-319., 1989.

99

132. Chandrasekaran E. V., Davila M., Nixon D., Mendicino J., Cancer Res., 44, 1555 (1984). 133. Kopitar, Z., Weisenberger, H., Arzneimittel-Forsch., 21, 859 (1971). 134. Lemaire, M., Tillement, J. P., Biochem. Pharmacol., 31, 359 (1982). 135. Schley, J., Müller-Oerlinghausen, B., J. Pharm. Pharmacol., 38, 102 (1986). 136.

Vogelsang, B., Echizen, H., Schmidt, E., Eichelbaum, M., Br. J. Clin.

Pharmacol., 18, 733(1984). 137.

Kute, T., Westphal, U., Biochim. Biophys. Acta, 420, 195 (1976).

138.

Urien, S., Albengres, E., Zini, R., Tillement, J. P., Biochem. Pharmacol., 22,

3687 (1982). 139.

Brunner, F., Müller, E., J. Pharm. Pharmacol., 39, 986 (1987).

140.

Lima, J. J., Jungbluth, G. L., Devine, T., Robertson, L. W., Life Sci., 35, 835

(1984). 141.

Müller, W. E., Stereoselective Plasma Protein Binding of Drugs, In: Wainer, I.

W., Drayer, D. E., (Eds.), Drug Stereochemistry. Analitical Methods and Pharmacology, Marcel Dekker, New York, pp. 227-244., 1988. 142.

Sager, G., Sandnes, D., Bessesen, A., Jacobsen, S., Biochem. Pharmacol., 34,

2812 (1985).

100

143.

Urien, S., Morin, D., Rocher, I., Tillement, J. P., Tertatolol high affinity binding

to α1-acid glycoprotein: Stereospecificity and consequences on plasma binding in disease states, In: Alpha1-Acid Glycoprotein: Genetics, Biochemistry, Physiological Functions and Pharmacology,. Baumann, P., Eap, C. B., Müller, W. E., Tillement, J. P., (eds) Alan R. Liss, Inc., New York, pp. 307-319., 1989. 144.

Kuroda, Y., Shibukawa, A., Nakagawa, T., Anal. Biochem., 268(1), 9 (1999).

145.

Olden, K., Parent, J. B., White, S., Biochim. Biophys. Acta, 650, 209 (1982).

146.

Hao, Y.L., Wickerhauser,M., Biochem. Biophys. Acta, 322, 99 (1973).

147.

Hermansson, J., Eur. Pat. No. EP0128886A2.

148.

Chiral-AGP Application Note No. 1, ChromTech AB, Norsborg, Sweden,

1988. 149.

Hermansson, J., Trends in Anal. Chem., 8, 251 (1989).

150.

Narayanan, S. R., J. Pharm. Biomed. Anal., 10, 251 (1992).

151.

Williams, R.C., Edwards, J.F., Potter, M.J., J. Liq. Chrom. and Rel. Technol., 16

(1), 171 (1993). 152. Enquist, M., Hermansson, J., J. Chromatogr., 519, 271 (1990). 153. Arvidsson, E., Jansson, S. O., Schill, G., J. Chromatogr., 591, 55 (1992). 154.

Görög, S., Herényi, B., J. Pharm. Biomed. Anal., 8, 837 (1990).

155. Francotte, E., Davatz, A., Richert, P., J. Chromatogr., 686, 77 (1996). 156. Fitos, I., Visy, J., Simonyi, M., Hermansson, J., Chirality, 5, 346 (1993).

101

157. Enquist, M., Hermansson, J., J. Chromatogr., 519, 285 (1990). 158. Hermansson, J., J. Chromatogr. A, 298, 67 (1984). 159. Schill, G., wainer, I. W., Barkan, S. A., J. Chromatogr. A, 365, 73 (1986). 160. Hermansson, J., Grahn, A., J. Chromatogr. A, 694, 57 (1995). 161. Hermansson, J., Hermansson, I., J. Chromatogr. A, 666, 181 (1994). 162. Lorenzi, E., Fell, A.F., Caccialanza, G., Massolini, G., Kitsos, M., J. Pharm. Biomed. Anal., 10, 909 (1992). 163. Hermansson, J., Eriksson, M., J. Liq. Chromatogr., 9(2,3), 621 (1986). 164.

Kökösi,J., Szabó, M., Őrfi, L., Magyar Szabadalom 209498, 1991.

165.

Szabó M., Kökösi, J., Őrfi, L., Acta Pharm. Hung., 65, 133-138 (1995).

166. Szabó M., Kökösi, J., Őrfi, L., Kovács, A., Hermecz, I., J. Heterocyclic Chem., 34, 21-25 (1997). 167. Szász, Gy., Gyimesi-Forrás, K., Budvári-Bárány, Zs., J. Liq. Chrom. Rel. Technol., 21, 2711-2724 (1998). 168.

Tilly-Melin, A., Askemark, Y., Wahlund, K.G., Schill, G., Anal. Chem., 51, 976-

983 (1979). 169.

Havel, H. A., Kauffman, E. W., Elzinga, P. A., Biochim. Biophys. Acta, 955, 154

(1988). 170.

Eftink, M. R., Ghiron, C. A., Anal. Biochem., 114, 199 (1981).

102

171.

Eftink, M. R., Zajicek, J, L., Ghiron, C. A., Biochim. Biophys. Acta, 491, 473

(1977). 172.

International Conference on Harmonization. ICH Harmonized Tripartite

Guidline, Validation of Analitical Procedures: Methodology October 1994. 173.

Brandts, J., Lumry, R., J. Phys. Chem., 67, 1484 (1963).

174. Honoré, B., Pharm. Toxicol., 66, 5 (1990). 175.

Sadler, A. J., Micanovic, R., Katzenstein, G. E., Lewis, R. V., Middaugh, C. R.,

J. Chromatogr., 137, 93 (1984). 176.

Eftink, M. R:, Ghiron, A., Biochemistry, 15, 672 (1976).

177.

Robbins,, D. J., Deibel, M. R., Barkley, M. D., Biochemistry, 24, 7250 (1985).

178.

Trón, L., Fehérjék fluoreszcenciás vizsgálata, Lumineszcencia a biológiában és

az orvostudományban, Szalay, L., Damjanovich, S. (szerk.) Akadémiai Kiadó, Budapest pp. 269-286., 1983. 179.

Lakowicz, J. R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, New

York, pp. 257-274., 1983. 180.

El-Gamal, S., Wollert, U., Müller, W. E., J. Pharm. Pharmacol., 34, 152 (1982).

181.

USP 24, The United States Pharmacopeia, United States Pharmacopeial

Convention, Inc., Rockwille, 1999. 182.

Barthwal, J. P., Tandon, S. K., Agarwal, V. K., Dixit, K. S., Parmar, S. S., J.

Pharm. Sci., 62, 613 (1973). 183.

Smart, G. A., Brown, S. S., Anal. Biochem., 35(2), 518 (1970).

103

184.

Almási, J., Takács-Novák, K., Kökösi, J., Noszál, B., Int. J. Pharm., 180, 1

(1999).

104

8. MELLÉKLET

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZŐ KÖZLEMÉNYEK

I.

Szász Gy., Gyimesi-Forrás K., Budvári-Bárány Zs.: Optimized and validated HPLC methods for compendial quality assesment III. Testing of optical purity applying α1-acid-glycoprotein stationary phase, J. Liq. Chrom. and Rel. Technol., 21 (6), 2535-2547, (1998)

II. Gyimesi-Forrás K., Szász Gy., Budvári-Bárány Zs., Gergely A.: New data on the sorption properties of α1-acid-glycoprotein chiral stationary phase, Chirality, 11, 212-217 (1999) III. Szász Gy., Budvári-Bárány Zs., Gergely A., Gyimesi-Forrás K.: Gyógyszerkönyvi tisztaságvizsgálati

feladatok

megoldása

nagyhatékonyságú

folyadék-

kromatográfiával, Acta Pharm. Hung., 69, 97-102 (1999) IV. Gyimesi-Forrás K., Szász Gy., Gergely A., Szabó M., Kökösi J.: Optical resolution of a series of potencial cholecystokinin antagonist 4(3H)-quinazolone derivatives by chiral liquid chromatography on α1-acid glycoprotein stationary phase, J. Chromatogr. Sci., 38, 430-434 (2000)

105