Egy mucin glikoprotein immunfelismerése Uray Katalin MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport 2011. december 9.
Mucin glikoproteinek A mucus (nyálka) alkotórészei Testcsatornák, mirigyek, belső szervek hámszövetei termelik Légutak, emésztő- és urogenitális rendszer, nyál Funkció: Hámfelület védelme a kiszáradástól mikroorganizmusoktól fizikai/kémiai ártalmaktól Nagy molekulatömeg > 200 kDa A gének és fehérjék ismétlődő szakaszokból állnak Magas Thr és/vagy Ser tartalom => O-glikozileződés > 50 %
Mucinok a rosszindulatú megbetegedésekben Mucintermelő szövetekből kiinduló karcinómák => Mucinok rendellenes termelődése
Szövetidegen mucin Túltermelődés
Rendellenes glikoziláció
Tumormarkerek
A mucin szénhidrát-oldalláncainak felépülése Egészséges
esetben
Tumoros
GalNAc GlcNAc Gal Fuc Sziálsav
Podolsky 1985, J Biol Chem 260, 8262
Új fehérje- és szénhidrátepitópok megjelenése
STn
SLex Lex Podolsky 1985, J Biol Chem 260, 8262
Új fehérje- és szénhidrátspecifikus ellenanyagok termelődése
STn
SLex Lex Podolsky 1985, J Biol Chem 260, 8262
MUC2 glikoprotein Gasztrointesztinális szekretált mucin vékony- és vastagbél Ismétlődő szakasz (~ 100x):
1PTTTPITTTTTVTPTPTPTGTQT23 Gum et al 1989 J Biol Chem 264:6480
~ 80% glikoziláció
MAb 996 monoklonális ellenanyag
Durrant et al 1994 Eur J Cancer 30A:355
A MUC2 glikoprotein ismétlődő szakaszának epitópszerkezete MAb 996 ellenanyag epitópja: Minimális epitóp:
18PTGTQ22
Optimális epitóp:
16PTPTGTQ22
Uray et al 1998 J Pept Sci 4, 319
P
T
T
T P T
T I
T T
T
P
T
T V
P
T
Q
T
T G
P
T
I P
T
Uray et al 1999, Arch Biochem Biophys 361, 65
Az epitópszerkezet pontosabb megismerése módosított epitóppeptidek segítségével
D-aminosav szubsztitúció
Glikoziláció
P
T
G
T Q
Az egyes aminosavak szerepe a kötődésben
N-terminális D-aminosav szubsztitúció hatása a MAb 996 kötődésre
100
% Inhibíciós% Inhibition Inhibition %
80
PTPTGTQ PTPTGTQ pTPTGTQ pTPTGTQ ptPTGTQ ptPTGTQ ptpTGTQ ptpTGTQ ptptGTQ ptptGTQ
60 40 20 0 0,001 -20
0,01
0,1
1
10
Natív peptid 1D 2D 3D 4D
100
Peptide concentration (mmol/l) Peptidkoncentráció (mM) Peptide concentration (mmol/l)
Uray et al 2000 Arch Biochem Biophys 378, 25
D-aminosav szubsztitúció az N- és C-terminális lebegő régióban: 3-3 D-amino acids
Kötődés a MAb 996 ellenanyaghoz
N-terminális D-aminosavak: Stabilitás szérumban 100
Peptid %
100
60
TPTPTGTQTPT TPTPTGTQtpt tptPTGTQTPT tptPTGTQtpt
40 20 0 0.001
0.01
0.1
1
10
Peptide concentration(mM) (mM) Peptidkoncentráció
Tugyi et al 2005, PNAS 102, 418
50 25 0 0
24
48 Time (hour) Idő (óra)
72
96
Idő (óra)
C-terminális D-aminosavak: Stabilitás lizoszóma kivonatban 100 75
Peptid %
% Inhibíciós % Inhibition
80
75
50 25 0 0
60
120 Idő Time (min) Idő(perc) (óra)
180
D-aminosav szubsztitúció az N-terminális lebegő régióban: 1-3 D-aminosav
Kötődés a MAb 996 ellenanyaghoz
N-terminális D-amino savak: Stabilitás szérumban 100
80
75
60
TPTPTGTQtpt tPTPTGTQtpt tpTPTGTQtpt tptPTGTQtpt
40 20
50 25 0 0
0 0.001
Peptid %
% Inhibíciós % Inhibition
100
0.01
0.1
1
24
48
Time (óra) (hour) Idő Idő (óra)
72
96
10
Peptide concentration(mM) (mM) Peptidkoncentráció Tugyi et al 2005, PNAS 102, 418
Stabilitás lizoszóma kivonatban
D-aminosav szubsztitúció a C-terminális lebegő régióban: 1-3 D-amino acids Stabilitás szérumban
Kötődés a MAb 996 ellenanyaghoz 100
100 Peptid %
75
% Inhibíciós % Inhibition
80
50 25
60
tptPTGTQTPT tptPTGTQTPt tptPTGTQTpt tptPTGTQtpt
40 20
0 0
24
48
Idő (óra)
72
96
Idő (óra)
Stabilitás lizoszóma kivonatban 100
0
75
0.01
0.1
1
Peptidkoncentráció Peptide concentration(mM) (mM)
10
Peptid %
0.001
50 25 0 0
Tugyi et al 2005, PNAS 102, 418
60
Time Idő (min) (óra)
Idő (perc)
120
180
D-aminosavakkal szubsztituált peptidek térszerkezete NMR spektroszkópia alapján
tptPTGTQTpt
TPTPTGTQTPT Tőke et al 2007 BBRC 358, 739
tpTPTGTQtpt
D-aminosav szubsztitúció az N- és C-terminális lebegő régióban: 1-1 D-aminosav Kötődés a MAb 996 ellenanyaghoz
Részleges stabilitás szérumban N-terminális D-aminosavakkal 100
100
Peptid %
75 50 25
TPTPTGTQTPT TPTPTGTQTPt tPTPTGTQTPT tPTPTGTQTPt
60
40
20
0 0.001
0 0
24
48
Idő (óra)
72
96
Stabilitás lizoszóma kivonatban C- terminális D-aminosavakkal 100
0.01
0.1
1
10
Peptide concentration(mM) (mM) Peptidkoncentráció
Tugyi et al 2005, PNAS 102, 418
75
Peptid %
% Inhibíciós Inhibition %
80
50 25 0 0
60
Time (min) 120 Idő (óra) Idő (perc)
180
D-aminosav szubsztitúció hatása TPTPTGTQTPT MAb 996 kötődés Szérum stabilitás Lizoszóma stabilitás
tPTPTGTQTPt
Hatékony ellenanyag kötődés, részleges stabilitás
tpTPTGTQtpt Hatékony ellenanyag kötődés, proteázokkal szembeni stabilitás
A MUC2 epitóp peptid glikozilezése 16PTPTGTQ22 16PT(GalNAcα)
PTGTQ22
16PTPT(GalNAcα)
GTQ22
16PTPTGT(GalNAcα) 16PT(GalNAcα)
Q22
PT(GalNAcα) GT(GalNAcα) Q22
Inazu & Mizuno, Noguchi Institute, Japan
Glikoziláció hatása a MAb 996 kötődésre 100
Inhibíciós % Inhibition %
80
IC50 (μM)
60
16PTPTGTQ PTPTGTQ22
16PT PT(GalNAc)PTGTQ (GalNAcα) PTGTQ22
40
16PTPT PTPT(GalNAc)GTQ (GalNAcα) GTQ22 16PTPTGT PTPTGT(GalNAc)Q (GalNAcα)
20
Q22
16PT PT(GalNAc)PT(GalNAc)GT(GalNAc)Q (GalNAcα) PT(GalNAcα) GT(GalNAcα)
0 0.0001
0.001
0.01
0.1
Peptide concentration (mmol/L) Peptidkoncentráció (mM)
1
16PTPTGTQ22
Q22
39 25 6.4 > 1000 > 1000
Az epitóp egyes aminosavjainak szerepe a MAb 996 ellenanyag kötődésben T19
X
G20
PTXTQ
PXGTQ PY GTQ
PTY TQ
PWGTQ
PTWTQ
PVGTQ
PTVTQ
PTGTQ
PTTTQ
PSGTQ
PTSTQ
PRGTQ
PTRTQ
PQGTQ
PTQTQ
P
PPGTQ
X
W S P
PTPTQ PTNTQ
PNGTQ PMGTQ
PTMTQ
T
PLGTQ
PTLTQ
PKGTQ
PTKTQ
PIGTQ
PTITQ
PHGTQ
PTHTQ
PGGTQ
PTGTQ
PFGTQ
PTFTQ
PEGTQ
PTETQ
PDGTQ
PTDTQ
PCGTQ
PTCTQ
PAGTQ
PTATQ 0
1
2
3
I
E D A 0
1
2
3
OD(405) OD(405)
Variábilitás megengedett Pro-szubsztitúció gyengíti a kötődést
Savas és nagy térkitöltésű aminosavak nagymértékben gyengítik a kötődést
Az epitóp egyes aminosavjainak szerepe a MAb 996 ellenanyag kötődésben T21
X
Q22
X
PTGTX
PTGXQ PTGTY
PTGY Q
PTGTW
PTGWQ
V
PTGTV
PTGVQ
PTGTT
PTGTQ
PTGTS
S
PTGSQ
PTGTR
PTGRQ
PTGTQ
PTGQQ
PTGTP
PTGPQ
PTGTN
PTGNQ
M
PTGTM
PTGMQ PTGLQ
L
PTGTL
L
PTGTK
PTGKQ
I
PTGTI
PTGIQ
PTGTH
PTGHQ
PTGTG
G
PTGGQ
PTGTF
PTGFQ
E
PTGTE
PTGEQ
PTGTD
PTGDQ
PTGTC
PTGCQ
A
PTGAQ
PTGTA 0
0
1
1
2
2 OD(405)
OD(405)
Csak a Ser (részben Ala, Gly, Leu) helyettesítheti a natív Thr-t
Hasonló méretű, apoláros aminosavak és Glu helyettesítheti a Gln-t
Az epitóp magjában a Gly20, Thr21 és Gln22 bármilyen helyettesítése csökkent ellenanyag kötődést okoz A Thr19 helyettesítése növelheti az ellenanyag felismerést
Thr19 glikozilációja is növelheti az ellenanyag felismerést 18P
T G T Q22
N M V F K I
S A P
S A G L
L I M V E
Az epitópszerkezet megismerése módosított epitóppeptidekkel D-aminosav szubsztitúció: MAb 996 kötődés + stabilitás Lehetőség aktív specifikus immunterápiára
Glikoziláció: 16PTPTGTQ22
P
T
G
T Q
Peptid – ellenanyag kölcsönhatás megismerése
Az egyes aminosavak szerepe a kötődésben
Köszönetnyilvánítás
Medzihradszky-Schweiger Hedvig Bősze Szilvia Kiskó Mária Schlosser Gitta Mák Marianna
Hollósi Miklós Majer Zsuzsa Vass Elemér
Tugyi Regina Tőke Orsolya
Toshiyuki Inazu Mamoru Mizuno
OTKA ETT EACR Soros CRC
Mike Price
CRC, University of Nottingham
