Pengaruh Metode Ekstrusi dan Sonikasi terhadap Karakteristik Liposom Meropenem Steril

Pengaruh Metode Ekstrusi dan Sonikasi terhadap Karakteristik Liposom Meropenem Steril Alfredo Fernando; Iskandarsyah Fakultas Farmasi Universitas Indonesia [email protected]

Abstrak Berbagai aplikasi reduksi ukuran partikel liposom telah dilakukan untuk memperoleh liposom SUV dengan pertimbangan distribusi sistemik yang baik dan pemenuhan kriteria filtrasi steril. Ekstrusi dan sonikasi merupakan metode reduksi ukuran partikel yang umum digunakan. Penelitian ini bertujuan melihat pengaruh metode ekstrusi dan sonikasi terhadap karakteristik liposom bila ditinjau dari morfologi, ukuran partikel, efisiensi penjerapan, dan sterilitas. Liposom dibuat secara hidrasi lapis tipis. Liposom hasil hidrasi diberikan dua perlakuan berbeda: ekstrusi 5 siklus dengan membran polikarbonat 0,45 µm dan sonikasi 2 kali 5 menit. Liposom terekstrusi dan tersonikasi disterilisasi filtrasi dengan teknik ekstrusi 1 siklus menggunakan membran polikarbonat 0,22 µm secara aseptik. Citra TEM menunjukkan bentuk sferis unilamelar dari globul liposom tersonikasi dan variasi bentuk globul pada liposom terekstrusi. Ekstrusi 5 siklus dan sonikasi menghasilkan liposom dengan rata-rata ukuran partikel berturut-turut 445,3 (PDI=0,49) dan 75,5 nm (PDI=0,323). Sterilisasi filtrasi 1 siklus cenderung meningkatkan rata-rata ukuran partikel dan keseragaman liposom terekstrusi, tetapi tidak berpengaruh terhadap liposom tersonikasi. Jumlah meropenem terjerap dalam liposom terhidrasi, terekstrusi, dan tersonikasi berturut-turut sebesar 67,99%, 32,93%, dan 72,76%. Proses ekstrusi steril menurunkan efisiensi penjerapan liposom terekstrusi (25,94%) dan tersonikasi (35,02%). Pengujian sterilitas dengan medium tioglikolat dan agar darah mengindikasikan adanya pertumbuhan bakteri.

Effects of Extrusion and Sonication Methods to The Characterizatic of Sterile Meropenem Liposome Abstract Various applications of liposome particle size reduction have been made to obtain SUV liposome with consideration of better systemic distribution and sterile filtration criteria fulfillment. Extrusion and sonication are two common methods of particle size reduction. This study aims to observe the effect of extrusion and sonication methods on the characterizatic of liposomes in terms of morphology, particle size, entrapment efficiency, and sterility. Liposome was produced by thin film hydration method. Hydrated liposome was given two different treatments: 5 cycles extrusion with 0.45 µm polycarbonate membrane and 2 sonication cycles for 5 minutes each. Furthermore, extruded and sonicated liposome were sterilized by filtration using 1 cycle extrusion techniques with 0.22 µm polycarbonate membrane aseptically. TEM image shows the unilamellar spherical globule of sonicated liposome and various globule forms of extruded liposome. 5 cycles extrusion and sonication produce liposome’s globule with mean particle size of 445.3 nm (PDI = 0.49) and 75.5 nm (PDI = 0.323) respectively. Sterile filtration increased mean particle size and uniformity of the extruded liposomes, but it didn’t influence the sonicated liposome. Meropenem entrapped in hydrated, extruded, and sonicated liposomes were respectively 67.99%, 32.93%, and 72.76%. Sterile extrusion process decreased the entrapment efficiency of extruded (25.94%) and sonicated (35.02%) liposome. Sterility testing with thioglikolat medium and blood agar indicate the presence of bacterial growth. Keywords : extrusion; liposome; meropenem; sonication

Pengaruh metode …, Alfredo Fernando, Ffarmasi UI, 2013

Pendahuluan Liposom sebagai salah satu sistem carrier menawarkan sejumlah keuntungan dalam sistem penghantaran obat: sebagai pembawa obat, baik hidrofilik maupun hidrofobik, merupakan salah satu solusi dalam mengatasi masalah buruknya bioavailabilitas obat (Jufri, Anwar, dan Djajadisatra, 2004); sifatnya yang biodegradable dan biocompatible (Sharma dan Sharma, 1997); pembawa berbagai zat aktif farmakologis (Lasic, 1998). Namun, liposom memiliki kekurangan terkait instabilitas fisika dan kimianya terhadap pH, garam empedu, dan enzim pencernaan, yang menjadi masalah dalam penghantaran obat (Jufri, 2004). Berbasis pada aplikasi liposom untuk penghantaran sistemik, secara parenteral pada khususnya, liposom harus memenuhi persyaratan sterilitas (Zuidam, et al., 2003). Bila instabilitas fisikakimia cenderung mengarah pada pemberian oral, maka dalam hal pemberian parenteral, masalah yang dihadapi adalah bagaimana memformulasi sediaan liposom yang steril dengan metode sterilisasi yang tersedia. Potensi degradasi komponen penyusun liposom akibat pemanasan dan radiasi menyebabkan metode sterilisasi panas dan radiasi gamma tidak dapat diterapkan untuk proses sterilisasi liposom. New (1990) telah menyarankan filtrasi steril sebagai satu-satunya metode yang cocok dalam preparasi liposom steril. Filtrasi steril melalui membran filtrasi berukuran 0,22 µm tidak akan merusak liposom SUV (Small Unilamellar Liposome), tetapi aplikasinya terbatas hanya untuk liposom berukuran lebih kecil dari 0,22 µm serta memiliki kemungkinan kontaminasi tambahan pada kemasan akhir (Torchilin dan Weissig, 2003). Oleh karena itu, diperlukan metode reduksi ukuran partikel sebelum sterilisasi filtrasi dan pengerjaan aseptik untuk mengatasi keterbatasan tersebut. Ukuran partikel liposom merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi biodistribusi liposom pasca pemberian sistemik. Pada umumnya, liposom berukuran besar dieliminasi lebih cepat dari sirkulasi darah dibandingkan liposom berukuran kecil. Kecepatan eliminasi liposom oleh sistem retikuloendotelial meningkat seiring dengan pertambahan ukuran partikel (Ishida, Harashima, Kiwada, 2002). Oleh karena itu, di samping pertimbangan perolehan liposom berukuran lebih kecil supaya dapat menembus membran filtrasi steril, metode reduksi ukuran partikel juga bertujuan untuk memperoleh distribusi sistemik yang lebih baik. Metode pengecilan ukuran partikel liposom yang umum dilakukan adalah ekstrusi dan sonikasi (Walde, Namani, Morigaki, Hauser, 2007). Penelitian terdahulu telah mengkaji berbagai aspek terkait pengaruh metode sonikasi dan ekstrusi terhadap karakteristik fisik


liposom. Aspek morfologi dari liposom tersonikasi telah diteliti menggunakan TEM (Zasadzinski, 1986). Sejumlah aspek terkait metode ekstrusi juga telah diteliti, yakni: jenis alat ekstruder, ukuran pori filter, jumlah siklus ekstrusi, dan penambahan siklus freeze-thaw dalam proses ekstrusi (Berger, et al., 2001). Perbedaan karakteristik fisik dan optik liposom juga ditemukan pada sonikasi dan ekstrusi (Lapinski, et al., 2007). Pemilihan meropenem sebagai model antibiotik didasarkan penelitian terdahulu yang menunjukkan bahwa enkapsulasi liposom dapat meningkatkan aktivitas antibakteri (Rolanda, 2012) dan diharapkan menghasilkan sediaan liposom yang efektif dalam penatalaksanaan infeksi Pseudomonas aeruginosa. Penambahan asam oleat diharapkan dapat meningkatkan fleksibilitas dan deformabilitas liposom dalam melewati pori kecil pada membran ekstrusi (Venuganti dan Perumal, 2009) serta meningkatkan aktivitas penghantaran sitoplasmik obat (Torchilin, Lukyanov, dan Klibanov, 1992). Penelitian ini akan melihat bagaimana pengaruh penggunaan metode ekstrusi dan sonikasi sebagai metode pengecilan ukuran partikel liposom terhadap karakteristik fisik (morfologi dan ukuran), efisiensi penjerapan, dan sterilitas liposom yang dihasilkan.

Tinjauan Teoritis Definisi liposom telah diinterpretasikan dalam berbagai aspek sejak penemuan pertamanya oleh Bangham pada tahun 1964. Bangham dan Horne (1964) menyebutkan bahwa liposom merupakan pembawa mikropartikulat atau koloidal, berdiameter 0,05 – 5,0 µm, dan terbentuk secara spontan ketika lipid tertentu dihidrasi dengan medium aqueous. Liposom merupakan vesikel artifisial kecil berbentuk sferis atau bulat dengan membran tersusun dari fosfolipid lapis ganda dan kolesterol, yang mampu mengenkapsulasi obat hidrofilik dan hidrofobik (Swarbrick, 2007). Berbasis pada sifat ampifil dari lipid lapis ganda sebagai bahan penyusun liposom, liposom dapat digunakan sebagai pembawa obat yang bernilai. Zat aktif obat yang bersifat hidrofilik akan terjerap pada bagian aqueous (bagian inti) dari vesikel sedangkan obat lipofilik akan terjerap pada bagian lipid (bagian membran) dari vesikel (Windholz, 1976). Komponen dasar penyusun liposom terdiri dari berbagai variasi lipid dan campurannya. Liposom dibentuk dari lipid alami (fosfolipid) maupun sintetik sebagai konstituen utama (Jufri, 2004), dan juga mengandung bahan sebagai konstituen tambahan membran lapis ganda seperti kolesterol dan lipid terkonjugasi polimer hidrofilik (Sharma dan Sharma, 1997). Fosfolipid merupakan jenis lipid yang sering digunakan dalam formulasi


liposom. Dalam berbagai formulasi liposom, fosfolipid alami sering menjadi pilihan utama, terutama fosfatidilkolin (Jufri, 2004). Liposom dapat diklasifikasikan berdasarkan komposisi penyusunnya dan berdasarkan ukuran serta jumlah lamelarnya. Berdasarkan komposisi dan tipe penghantaran obatnya, liposom dapat dikelompokkan menjadi 7 jenis, yakni: liposom konvensional, liposom sensitif pH, liposom sensitif temperatur, liposom kationik, stealth liposome, imunoliposom, dan liposom magnetik. Berdasarkan ukuran dan jumlah lamelar, liposom diklasifikasikan menjadi: Multilamellar Vesicles (MLV), Large Unilamellar Vesicles (LUV), dan Small Unilamellar Vesicles (SUV) (Varun, Sonia, Bharat, 2012; Sharma dan Sharma, 1997).

Metode Penelitian Bahan: Fosfatidilkolin telur (Sigma), kolesterol (Sigma), asam oleat (Merck), meropenem (Zhuhai Utd. Lab.), kloroform (Merck), metanol (Mallinckrodt), natrium klorida (Mallinckrodt), aquadest demineralisata (Brataco), gas nitrogen (teknis), medium tioglikolat cair (Difco), agar darah (Citotest). Alat: Timbangan analitik (Sartorius), pH meter (Eutech), spektrofotometer UV-VIS (Shimadzu UV-1800), rotary evaporator (Hahn Shin), vortex mixer (Health H-VM-300), mini extruder set (Avanti Polar Lipids), syringe gas tight (Hamilton), membran polikarbonat 0,45 dan 0,22 µm (Whatman), bath-sonicator (Elmasonic S-60-H), Transmission Electron Microscope (JEOL JEM-1400), mikroskop optik (Olympus), Particle Size Analyzer (Beckman Coulter Delsa Nano C), sentrifugator (Kubota 5100), kamera digital (Canon PS A2200), glass beads, termometer, tabung sentrifugasi (Corning-Sigma), labu bulat, dan peralatan gelas lainnya. Liposom dibuat dengan menggunakan metode hidrasi lapis tipis. Fosfatidilkolin, kolesterol, dan asam oleat (perbandingan molar 5:5:1 mol) ditimbang dan dilarutkan dalam 25 mL kloroform. Larutan dalam kloroform tersebut dievaporasi menggunakan alat rotary evaporator dengan suhu +60oC, kecepatan 60-160 rpm, dan kondisi vakum untuk menguapkan kloroformnya hingga terbentuk lapisan tipis. Lapisan tipis yang telah terbentuk kemudian dialiri dengan gas nitrogen, dan didiamkan selama 24 jam. Setelah 24 jam, lapisan tipis di dalam labu evaporator dihidrasi dengan larutan 1 mg/mL meropenem dalam larutan NaCl 150 mM sambil dikelupas dengan glass beads dengan kecepatan rotary evaporator sebesar 60 rpm tanpa penggunaan vakum hingga terbentuk suspensi berwarna putih susu hingga kekuningan. Suspensi kemudian di vortex selama 15 menit dan disimpan di dalam vial selama 24 jam di dalam lemari pendingin (Drulis-Kawa, 2006).


Liposom hasil hidrasi diberikan dua perlakuan berbeda, yakni ekstrusi dan sonikasi. Proses ekstrusi dilakukan menggunakan rangkaian alat mini extruder set dengan membran polikarbonat 0,45 µm sebanyak 5 siklus. Dalam proses sonikasi, dispersi liposom diletakkan dalam suatu bath-sonicator tepat di bagian tengah sonikator yang berdimensi 30 cm x 15,1 cm x 15 cm, berdaya input sebesar 150W, dan memiliki frekuensi sebesar 37 kHz. Temperatur selama proses sonikasi dipertahankan pada angka 60oC, dimana temperaturnya dapat diatur secara otomatis pada sonikator. Prosedur sonikasi dilakukan sebanyak 2 kali selama masingmasing 5 menit dengan interval istirahat 3 menit (Kim, et al., 2007; Memoli, Palermiti, Travagli, Alhaique, 1994). Selanjutnya, liposom terekstrusi dan tersonikasi disterilisasi filtrasi dengan teknik ekstrusi secara aseptik. Proses ekstrusi steril sebanyak 1 siklus dilakukan dengan membran polikarbonat 0,22 µm dan pengerjaannya dilakukan di bawah aliran udara laminar (LAF). Evaluasi karakteristik morfologi, ukuran partikel, dan efisiensi penjerapan dilakukan terhadap liposom terhidrasi, liposom terekstrusi, liposom tersonikasi, liposom terekstrusi steril, dan liposom tersonikasi steril. Evaluasi morfologi liposom dilakukan menggunakan mikroskop optik sebagai interpretasi awal pada liposom terhidrasi, terekstrusi, dan tersonikasi, serta TEM pada liposom terhidrasi, terekstrusi steril, dan tersonikasi steril. Pengukuran ratarata dan distribusi ukuran partikel dilakukan menggunakan PSA. Penentuan efisiensi penjerapan dilakukan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm, selama 60 menit, pada temperatur 2oC untuk memisahkan liposom dari obat bebas (tak terjerap). Selanjutnya, sedimen liposom didestruksi dengan penambahan metanol, dan supernatan metanol diukur serapannya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 297,4 nm. Efisiensi penjerapan dihitung dengan membandingkan konsentrasi obat terjerap pada supernatan metanol dengan konsentrasi meropenem yang ditambahkan di awal (1 mg/mL). Uji sterilitas liposom terekstrusi dan tersonikasi steril dilakukan menggunakan medium tioglikolat cair dan agar darah. Penggunaan agar darah sebagai media uji bertujuan untuk menghindari biasnya interpretasi hasil uji sterilitas karena kekeruhan sampel uji yang berupa suspensi liposom. Sebelum uji sterilitas dilakukan, perlu dilakukan purifikasi terhadap sediaan liposom dengan sentrifugasi pada kondisi kecepatan, waktu, dan temperatur yang sama saat pemisahan untuk penentuan efisiensi penjerapan. Indikasi pertumbuhan bakteri dapat dilihat melalui adanya kekeruhan pada medium tioglikolat pasca 1 hari inkubasi pada suhu 37oC dan munculnya koloni bakteri pada medium agar darah pasca periode inkubasi yang sama.


Hasil dan Pembahasan Tampilan visual liposom hasil semua perlakuan dapat dilihat pada gambar 1. Secara visual, diperoleh sediaan liposom hasil hidrasi dengan warna kuning muda (Pantone 3945U). Liposom hasil ekstrusi berwarna kuning muda hampir sama warnanya bila dibandingkan dengan liposom hasil hidrasi (Pantone 3945U). Liposom hasil sonikasi berwarna kuning muda tetapi lebih muda dibandingkan dengan liposom hasil hidrasi (Pantone 393U).

Gambar 1. Tampilan visual liposom hasil hidrasi (a), liposom terekstrusi (b-kiri), liposom tersonikasi (b-kanan), liposom terekstrusi steril (c-kiri), dan liposom tersonikasi steril (c-kanan) Pada gambar 2 dapat dilihat bahwa proses sonikasi dapat meningkatkan persen efisiensi penjerapan, sementara proses ekstrusi cenderung menurunkan efisiensi penjerapan liposom hasil hidrasi. Meningkatnya penjerapan pasca sonikasi disebabkan terjadinya reenkapsulasi meropenem saat proses sonikasi. Penembakkan gelombang ultrasonik yang dilakukan di atas temperatur transisi lipid dapat menyebabkan meropenem bebas yang tidak terjerap setelah proses hidrasi dapat kembali terjerap. Komponen lipid akan berada dalam fase gel dan pada saat konsentrasinya berada di atas Critical Aggregate Concentration (CAC) akan membentuk lipatan secara spontan dan menjerap meropenem bebas. Sementara itu, penurunan angka efisiensi penjerapan pasca ekstrusi disebabkan dua hal: pecahnya liposom pasca ekstrusi dan tertahannya meropenem pada membran ekstrusi. Tekanan yang terlalu kuat saat pendorongan syringe dapat menyebabkan liposom yang terbentuk pecah atau leaky sehingga meropenem akan lepas menjadi obat bebas. Setelah


terlepas, kemungkinan enkapsulasi kembali oleh komponen lipid tidak terjadi karena afinitas meropenem pada membran polikarbonat, yang menyebabkan meropenem tidak ikut terekstrusi dan tertahan pada membran. Penjabaran terkait ekstrusi di atas didukung oleh data efisiensi penjerapan hasil ekstrusi dan sonikasi steril, dimana pasca ekstrusi steril melewati membran berukuran 0,22 µm, nilai efisiensi penjerapan keduanya berkurang. Semakin kecil ukuran pori membran ekstrusi, maka akan semakin kuat pula tekanan yang dibutuhkan untuk melewatkan liposom yang berukuran lebih besar melalui membran ekstrusi. Akibatnya, kemungkinan leaky-nya obat terjerap dari liposom menjadi semakin besar, sehingga penjerapannya menurun.

Persentase Penjerapan (%)

80.00 70.00

67.99

72.76

60.00 50.00 40.00

32.93

35.02 25.94

30.00 20.00 10.00 0.00 Hidrasi

Sonikasi

Ekstrusi

Sonikasi Steril

Ekstrusi Steril

Gambar 2. Pengaruh ekstrusi dan sonikasi serta sterilisasi filtrasi terhadap efisiensi penjerapan meropenem dalam liposom Citra liposom hasil hidrasi dapat dilihat pada gambar 3. Gambar 3A menunjukkan suatu citra globul liposom tunggal yang diprediksi multilamelar dan berukuran kurang dari 500 nm akibat kaburnya citra dan kontras yang tidak terlalu baik. Citra yang blur dapat disebabkan oleh konsentrasi sampel uji yang terlalu pekat dan keberadaan komponen nonliposom dalam jumlah banyak yang menutupi obyek lain pada bagian yang lebih tebal dari film kaca TEM. Komponen non-liposom tampak pada gambar 3B pada obyek yang diberi tanda panah. Obyek ini dinamakan face-on disks atau circular disk-like structure sebagai globul dari campuran misel atau bentuk intermediet misel-liposom yang berasal dari komponen lipid yang terlepas dari bilayer (Almgren, Edwards, Karlsson, 2000; Bergstrand, 2003).


Keterangan : A. MLV dengan ukuran ± 400 nm; B. face-on disk (tanda panah).

Gambar 3. Citra TEM liposom hasil hidrasi Pencitraan TEM untuk liposom hasil ekstrusi steril dapat dilihat pada gambar 4. Pada bagian A, dapat dilihat persebaran globul liposom hasil ekstrusi, dimana bentuk globul yang dihasilkan beragam, ada yang sferis (bulat), elongated (memanjang), dan tidak beraturan. Pada globul yang sferis, liposom yang dihasilkan terlihat unilamelar. Bentuk globul yang tidak beraturan disebabkan oleh interaksi tarik-menarik globul-globul kecil membentuk agregat yang tidak teratur. Kecenderungan globul liposom hasil ekstrusi steril untuk beragregasi terlihat pada gambar 4D. Bagian B menunjukkan bentuk globul liposom yang hampir sferis dengan sedikit undulasi pada permukaan bilayernya (Zasadzinski, 1986). Pada bagian C, terlihat obyek berbentuk semacam garis halus (tanda panah) yang merupakan globul dari campuran misel seperti pada liposom hasil hidrasi. Bentuk obyek tersebut dinamakan edge-on disk atau side-on disk. Perbedaan face-on dan egde-on disk terletak pada visualisasi gambar dua dimensi dari struktur tiga dimensi pasca proses vitrifikasi (Almgren, Edwards, Karlsson, 2000).


Keterangan :

A. Globul berbentuk sferis unilamelar (tanda panah), memanjang, dan tak beraturan; B. Globul liposom sferis; C. edge-on disk (tanda panah); D. Globul yang saling beragregasi

Gambar 4. Mikroskopik liposom hasil ekstrusi steril dengan TEM Pencitraan TEM pada liposom hasil sonikasi steril menunjukkan globul liposom sferis yang unilamelar. Pada gambar 5A, dapat dilihat globul-globul liposom sferis yang tersebar hampir merata. Pada perbesaran 40.000 kali, diperoleh satu globul liposom sferis yang unilamelar dengan permukaan lamelar yang rata (Gambar 5B). Walaupun dihasilkan bentuk morfologi yang jelas, ukuran diameter globul yang dihasilkan dari citra TEM tidak sesuai dengan interpretasi data PSA, dimana pada citra TEM ukuran globul yang dihasilkan jauh lebih besar dibandingkan data PSA. Perbedaan hasil ukur ini disebabkan oleh agregasi dari globul liposom akibat faktor temperatur dan waktu penyimpanan. Kecenderungan globul liposom untuk saling beragregasi dapat terlihat pada bagian D, dimana tiga globul liposom kecil hendak bergabung membentuk suatu agregat yang lebih besar. Semakin lama waktu penyimpanan dengan temperatur yang kurang sesuai, maka akan terjadi perubahan struktur globul liposom menjadi semakin besar (Almgren, Edwards, Karlsson, 2000).


Keterangan :

A. Persebaran globul liposom hasil sonikasi steril; B. Globul liposom sferis unilamelar; C. Threadlike micelles (tanda panah); D. Liposom SUV (tanda panah hitam) dan agregasi globul liposom (anak panah putih).

Gambar 5. Mikroskopik liposom hasil sonikasi steril dengan TEM Indikasi produk hasil degradasi juga terlihat pada gambar 5C. Struktur seperti anyaman benang (threadlike micelles) pada bagian yang ditunjuk tanda panah mengacu pada pembentukkan produk hidrolisis fosfolipid. Namun, proses hidrolisis yang terjadi baru pada tahap awal dan menyebabkan kerusakan minor pada sebagian struktur globul liposom. Ketika sebagian fosfolipid terhidrolisis, liposom unilamelar masih terbentuk di sekitar kerusakan lamelar yang menyerupai anyaman benang tersebut (Bergstrand, 2003). Berdasarkan data pada grafik 6A, dapat dilihat bahwa liposom hasil hidrasi memiliki diameter rata-rata globul sebesar 2.059,4 nm. Setelah dilakukan proses ekstrusi dengan membran polikarbonat 0,45 µm sebanyak 5 siklus dapat dilihat terjadi penurunan ukuran


menjadi sebesar 445,3 nm, sementara itu proses sonikasi selama 2 kali 5 menit menghasilkan globul dengan diameter rata-rata 75,5 nm. Berdasarkan data tersebut dapat disimpulkan bahwa proses sonikasi dapat menghasilkan liposom dengan rata-rata ukuran partikel hampir 5 kali lebih kecil dibandingkan proses ekstrusi dengan membran berukuran 0,45 µm sebanyak 5 siklus. Pada dasarnya, ekstrusi akan menghasilkan globul liposom dengan ukuran rata-rata partikel mendekati ukuran pori membran ekstrusi.

Gambar 6. Pengaruh ekstrusi dan sonikasi serta sterilisasi filtrasi terhadap rata-rata (A) dan distribusi (B) ukuran partikel liposom Proses ekstrusi dengan membran polikarbonat berukuran 0,22 µm sebanyak 1 siklus (sterilisasi filtrasi) terhadap liposom hasil ekstrusi meningkatkan rata-rata ukuran partikel menjadi 691,9 nm. Peningkatan ukuran partikel tersebut dapat terjadi karena ketika


pendorongan syringe dihasilkan tekanan yang lebih besar dan lebih kuat untuk melewatkan partikel liposom melalui membran berukuran 0,22 µm dibandingkan 0,45 µm. Tekanan yang kuat dan kontinu akan menyebabkan globul liposom yang lebih besar tertahan pada membran yang berukuran pori lebih kecil. Ketika melewati membran, globul-globul liposom akan berkontak dan terjadi agregasi membentuk globul dengan ukuran yang lebih besar. Selain itu, faktor agregasi juga didorong oleh jumlah siklus ekstrusi yang hanya terdiri dari satu siklus. Proses ekstrusi satu siklus tidak dapat mereduksi ukuran partikel karena masih terdapat globul-globul liposom dengan ukuran besar setelah melewati membran ekstrusi dan tidak mengalami proses ekstrusi lebih lanjut. Kurangnya jumlah siklus ekstrusi didukung penelitian terdahulu yang menyatakan bahwa pada umumnya, perubahan struktur liposom terjadi pada 5 siklus pertama (Hope, 1993). Pada liposom hasil sonikasi, proses ekstrusi dengan membran polikarbonat 0,22 µm tidak memiliki pengaruh yang berarti terhadap rata-rata ukuran partikel, dimana hanya terjadi pertambahan ukuran sebesar 4,5 nm pada liposom hasil sonikasi steril. Hal tersebut disebabkan karena ukuran partikel liposom hasil sonikasi (75,5 nm) sudah lebih kecil dari ukuran pori membran ekstrusi steril (0,22 µm) sehingga proses ekstrusi steril tidak menyebabkan reduksi ukuran, melainkan hanya meloloskan globul-globul liposom hasil sonikasi yang ukurannya sudah lebih kecil. Walaupun tidak berpengaruh terhadap ukuran partikel, esensi ekstrusi dengan membran berukuran 0,22 µm tetap terarah pada jaminan sterilitas sediaan. Indeks polidispersitas (PDI) yang tertuang pada gambar 6B menunjukkan distribusi ukuran partikel globul liposom. Semakin kecil nilai PDI, maka suatu sediaan dikatakan semakin seragam atau homogen ukuran partikelnya. Liposom hasil hidrasi memiliki PDI sebesar 0,585. Dengan proses ekstrusi 5 siklus dengan membran polikarbonat 0,45 µm dan sonikasi 2 kali 5 menit, tingkat keseragaraman ukuran partikel liposom hasil hidrasi menurun menjadi berturut-turut 0,490 dan 0,323. Semakin seragamnya ukuran globul liposom dengan proses ekstrusi dan sonikasi menunjukkan bahwa proses reduksi ukuran partikel dapat menghasilkan liposom dengan ukuran yang lebih kecil dan lebih seragam. Bila dibandingkan data PDI liposom hasil ekstrusi dan sonikasi, proses sonikasi dapat menghasilkan distribusi ukuran yang lebih seragam dibandingkan proses ekstrusi. Hal tersebut disebabkan oleh waktu dan jumlah siklus sonikasi yang dilakukan. Dengan 2 kali proses sonikasi selama masingmasing 5 menit, probabilitas vesikel lipid yang terkena tembakan ultrasonik juga meningkat sehingga jumlah vesikel lipid dengan ukuran kecil juga meningkat dan diperoleh distribusi ukuran partikel yang lebih seragam. Proses ekstrusi 5 siklus dengan membran polikarbonat


0,45 µm menghasilkan tingkat polidispersitas yang lebih tinggi daripada sonikasi karena masih terdapat globul liposom dengan ukuran yang lebih besar dari ukuran pori membran ekstrusi akibat agregasi. Proses sterilisasi filtrasi terhadap liposom hasil sonikasi tidak memiliki pengaruh yang berarti karena globul liposom hasil sonikasi sudah berukuran lebih kecil daripada pori membran ekstrusi 0,22 µm, dimana indeks polidispersitas liposom hasil sonikasi steril menunjukkan angka 0,322. Sementara itu, proses ekstrusi dengan membran 0,22 µm telah berhasil menurunkan angka PDI liposom hasil ekstrusi (0,490) menjadi 0,286. Hal tersebut menunjukkan bahwa proses ekstrusi steril dengan membran polikarbonat berukuran 0,22 µm sebanyak 1 siklus dapat meningkatkan keseragaman ukuran partikel globul liposom di samping esensinya untuk proses sterilisasi. Pengujian sterilitas dilakukan terhadap liposom hasil ekstrusi steril dan sonikasi steril. Sebelum pengujian dilakukan, setiap komponen alat dan bahan yang digunakan untuk pengujian sterilitas diupayakan sedapat mungkin steril supaya tidak mengganggu pengamatan hasil sterilitas. Kedua sampel liposom juga harus dipisahkan terlebih dahulu dari obat bebas secara sentrifugasi yang prosesnya diupayakan se-aseptik mungkin supaya tidak membiaskan interpretasi hasil uji sterilitas. Pengujian sterilitas media dilakukan dengan menginkubasi tabung berisi medium tioglikolat pada temperatur 37oC selama 1 hari. Pelaksanaan uji sterilitas dilakukan triplo dengan menggunakan 3 kelompok uji, yakni kelompok kontrol, sampel liposom hasil ekstrusi steril, dan sampel liposom hasil sonikasi steril. Tiap tabung reaksi diisi dengan 9 mL medium tioglikolat cair dan 40 µL sampel liposom. Tabung reaksi yang hanya berisi medium tioglikolat saja digunakan sebagai kontrol. Semua tabung reaksi diinkubasi pada temperatur 37oC selama 1 hari. Setelah inkubasi, penggoresan pada medium agar darah dilakukan untuk semua tabung berisi sampel dan kontrol. Selanjutnya, medium agar darah yang telah digores diinkubasi pada temperatur dan periode waktu yang sama dengan medium tioglikolat. Pengamatan hasil uji sterilitas setelah 1 hari inkubasi terhadap kelompok inkubasi medium tioglikolat pada 37oC menunjukkan hasil yang negatif pada kedua sampel liposom. Seluruh tabung berisi 40 µL sampel liposom menunjukkan gejala kekeruhan seperti kapas yang menandakan adanya pertumbuhan bakteri. Sementara itu, kelompok kontrol yang hanya berisi medium tioglikolat tetap jernih. Penggunaan medium agar darah bertujuan untuk menghindari biasnya interpretasi hasil uji sterilitas dengan medium tioglikolat karena keruhnya sampel liposom yang diuji. Hasil pengamatan media agar darah berisi sampel yang telah diinkubasi adalah terbentuknya


koloni bakteri berwarna putih pada goresan kelompok sampel berisi liposom ekstrusi dan sonikasi steril, sementara pada goresan kelompok kontrol yang hanya berisi medium tioglikolat tidak menunjukkan adanya pertumbuhan koloni. Berdasarkan pengamatan menggunakan medium tioglikolat dan penggoresan pada agar darah, dapat disimpulkan bahwa sampel liposom uji (liposom ekstrusi steril dan sonikasi steril) tidak memenuhi kriteria sterilitas. Faktor penyebab hasil uji sterilitas sediaan liposom hasil ekstrusi dan sonikasi yang negatif adalah proses pengerjaan sterilisasi filtrasi dan pemurnian liposom dengan sentrifugasi secara aseptik dilakukan tidak maksimal. Pertama, waktu pengerjaan sterilisasi filtrasi yang cukup lama dan proses pemindahan sediaan berulang dari alat extruder ke dalam vial steril memungkinkan timbulnya kontaminasi. Kedua, metode sterilisasi alat-alat penunjang yang digunakan untuk proses sterilisasi filtrasi kurang memadai. Sebagai contoh, komponen alat mini extruder yang hanya disterilisasi dengan penyinaran sinar UV di dalam LAF dan pembilasan dengan alkohol 70%. Ketiga, kondisi ruang steril yang digunakan belum divalidasi sterilitasnya ketika hendak digunakan untuk proses sterilisasi sediaan liposom. Keempat, kondisi tube sentrifugator tanpa tutup yang sesuai turut memicu masuknya kontaminan. Parafilm yang digunakan sebagai penutup tube juga tidak dapat menjamin sterilitas karena potensi rusak atau bocornya plastik parafilm selama proses sentrifugasi. Terakhir, proses transportasi tube berisi sediaan liposom uji yang cukup jauh dengan alat sentrifugator juga diprediksi berpotensi menimbulkan kontaminasi.

Kesimpulan Citra TEM liposom hasil sonikasi steril menunjukkan globul unilamelar sferis dan indikasi terjadinya hidrolisis, sedangkan pada citra liposom hasil ekstrusi steril, globul liposom tampak sferis, memanjang, dan tidak beraturan, serta adanya indikasi komponen lipid yang tidak membentuk membran bilayer. Proses sonikasi meningkatkan efisiensi penjerapan meropenem pada liposom hasil hidrasi, sedangkan proses ekstrusi 5 siklus dan sterilisasi filtrasi cenderung menurunkan efisiensi penjerapan meropenem dalam liposom. Persentase efisiensi penjerapan liposom hasil hidrasi, ekstrusi, sonikasi, ekstrusi steril, dan sonikasi steril berturut-turut adalah 67,99%, 32,93%, 72,76%, 25,94%, dan 35,02%. Proses sonikasi menghasilkan liposom dengan rata-rata ukuran partikel dan indeks polidispersitas yang lebih kecil daripada ekstrusi 5 siklus dengan membran 0,45 µm. Ekstrusi steril 1 siklus dengan membran 0,22 µm meningkatkan rata-rata ukuran partikel dan keseragaman (menurunnya


indeks polidispersitas) liposom hasil ekstrusi, tetapi tidak berpengaruh terhadap rata-rata dan distribusi ukuran partikel liposom tersonikasi. Uji sterilitas terhadap liposom ekstrusi dan sonikasi steril menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri.

Saran Sebagai penutup dari jurnal ini, penulis menyampaikan sejumlah saran yang kiranya berguna untuk diperhatikan dalam penelitian selanjutnya. Dalam proses sonikasi, perlu dilakukan optimasi waktu dan siklus sonikasi serta frekuensi sonikator dalam rangka produksi liposom dengan karakteristik yang optimal. Terkait proses ekstrusi, perlu dilakukan penambahan siklus ekstrusi dan penggunaan membran dengan ukuran pori lebih kecil untuk menghasilkan liposom dengan rata-rata dan distribusi ukuran yang lebih baik. Untuk menjamin sterilitas sediaan liposom yang dihasilkan, perlu dilakukan optimasi prosedur kerja dan pemurnian liposom secara aseptik.

Daftar Referensi Almgren, M., Edwards, K., & Karlsson, G. (2000). Cryo transmission electron microscopy of liposomes and related structures. Colloids and Surfaces A: Psychochemical and Engineering Aspects , 174, 3-21. Bangham, A. H. (1964). Negative staining of phospholipids and their structural modification by surface-active agents as observed in the electron microscope. J . Mol. Biol. , 8, 660–668. Berger, N., Sachse, A., Bender, J., Schubert, R., & Brandl, M. (2001). Filter extrusion of liposomes using different devices: comparison of liposome size, encapsulation efficiency, and process characteristics. International Journal of Pharmaceutics, 223 , 55-68. Bergstrand, N. (2003). Liposome for Drug Delivery: from physicochemical studies to applications. Comprehensive Summaries of Uppsala Dissertations . Ishida, T., Harashima, H., & Kiwada, H. (2002). Liposome clearance. Bioscience Reports , 22 (2), 197-224. Jufri, M. (2004). Arah dan Perkembangan Liposome Drugs Delivery Systems. Majalah Ilmu Kefarmasian , 1 (2), 59-68. Jufri, M., Anwar, E., & Djajadisastra, J. (2004). Pembuatan niosom berbasis maltodekstrin DE 5-10 dari pati singkong (Manihot Utilissima). Majalah Ilmu Kefarmasian , 1 (1), 1020.


Lapinski, M. M., Castro-Forero, A., Greiner, A. J., Ofoli, R. Y., & Blanchard, G. J. (2007). Comparison of liposomes formed by sonication and extrusion: rotational and translational diffusion of an embedded chromophore. Langmuir , 23 (23), 1167711683. Lasic, D. D. (1998). Novel Applications of Liposomes. Tibtech , 16, 307-321. New, R. (1990). Liposomes: A Practical Approach. Oxford: IRL Press. Rolanda, E. (2012). Pengaruh enkapsulasi liposom terhadap aktivitas anibakteri gentamisin sulfat. Skripsi Sarjana Farmasi UI . Sharma, A., & Sharma, U. S. (1997). Liposomes in drug delivery: progress and limitations. International Journal of Pharmaceutics, 154 , 123-140. Swarbrick, J. B. (1994). Encyclopedia of Pharmaceutical Technology (3rd ed.). New York: Dekker. Torchillin, V. P., Lukyanov, A. N., & Klibanov, A. L. (1992). Interaction Between Oleic Acid-Containig pH-Sensitive and Plain Liposome. Federation of European Biochemical Societies , 305, 185-188. Torchillin, V., & Weissig, V. (2003). Liposomes: A Practical Approach (2nd ed.). New York: Oxforf University Press USA. Varun, T., Sonia, A., & Bharat, P. (2012). Niosomes and Liposomes - Vesicular Approach Towards Transdermal Drug Delivery. International Journal of Pharmaceutical and Chemical Sciences , 632-644. Venuganti, V., & Perumal, O. (2009). Nanosystem for Dermal and Transdermal Drug Delivery. In Y. Pathak, & D. Thassu, Drug Delivery Nanoparticles Formulation and Characterization. New York: Informa Healthcare. Walde, P., Namani, T., Morigaki, K., & Hauser, H. (2007). Formation and Properties of Fatty Acid Vesicles (Liposomes). In G. Gregoriadis, Liposome Technology: Liposome Preparation and Related Techniques (pp. 1-17). New York: Informa Healthcare USA, Inc. Windholz, M. (1976). The Merck Indek an Encyclopedia of Chemicals and Drugs (9th ed.). New Jersey: Merck and Co. Int. Rahway. Zasadzinski, J. A. (1986). Transmission Electron Microscopy observations of sonicationinduced changes in liposome structure. Biophys Journal , 1119-1130. Zuidam, N., van Winden, E., de Vrueh, R., & Crommelin, D. (2003). Stability, storage, and sterilization of liposomes. In V. W. Torchillin, Liposomes, A Practical Approach (2nd ed.). Oxford University Press.


Pengaruh Metode Ekstrusi dan Sonikasi terhadap Karakteristik Liposom Meropenem Steril

Recommend Documents