PENGARUH EKSTRAK ANDALIMAN TERHADAP HIDROFOBISITAS BAKTERI B. cereus, S. aureus dan S. typhimurium Adolf Parhusip 1 '
ABSTRACT Hydrophobicity is one of the characteristics surface ceil that can repiect its component which contains in the outer membran of the bacteria. The changing which can be happened to the component of the outer membran cell can effected to the changing of the hydrophobicity. The aim of the research is to find out the influence of the ethyiacetateand methanol andaliman extract to the hydrophobicity of B. cereus, S, aureus and S. typhimurium. The method of research is using BATH (Bacterial Adhesion Hydrocarbons). The result showed that the highest hydrophobicity can be found in B. cereus with 6% of the ethyl acetate extract is 79.58% and followed by S aureus (71.95%) and S.typhimurium (53.28%). Key words: Hydrophobicity, extract, andaliman
PENDAHULUAN Andaliman (Zanthoxyllum acanthopodium DC) merupakan rempah yang hanya tumbuh di kawasan Danau Toba Sumatera Utara dan dipergunakan sebagai bumbu masakan khas masyarakat Tapanuli. Secara llmiah sudah dibuktikan bahwa andaliman memiliki aktivitas antimikroba temadap bakteri patogen dan perusak pangan (Parhusip et al. 2003). Selanjutnya dilaporkan bahwa bakteri patogen B. cereus, S. aureus dan S. typhimurium pada fase eksponensial dengan lama kontak 8 jam merupakan kondisi paling labil dan ekstrak etilasetat memiliki diameter penghambatan terbesar terutama terhadap bakteri B. cereus (Parhusip 2004). Pelekatan sel bakteri pada inang terjadi kerana adanya interaksi hidrofobik dari komponen permukaan bakteri dengan sel inang. Salah satu adesin protein fimbrie yang bersifat hidrofobik, yang disebabkan oleh jumlah asam amino hidrofobik penyusun protein fimbie dan dipengaruhi oleh struktur tersier protein.Sifat hidrofobik fimbrie ini meningkatkan afinitas bakteri pada reseptor permukaan sel epitel (Rosenberg dan Sar 1990). Ini berarti sisi hidrofobik bakteri mempunyai peranan membentuk interaksi hidrofobik Dosen tidak tetap Jurusan Teknologi Pangan Universitas Pelita Harapan
Jurnal llmu dan Teknologi Pangan, Vol. 2, No. 2, Oktober 2004
dengan sei inang, sehingga kemungkinan bakteri tetap tinggal dipermukaan usus dan berkembang biak atau berpenetrasi kedalam jaringan. Antimikroba dapat menurunkan atau meningkatkan hidrofobisitas bakteri tergantung dari spesies bakteri dan senyawa antimikroba. Tujuan penelitian ini adalah mempelajari pengaruh penambahan ekstrak (nonpolar, semi polar dan polar) terhadap perubahan hidrofobisitas bakteri patogen seperti: Gram positip berspora, Gram positif non spora dan Gram negatif. METODOLOGI Bahan dan alat Bahan utama yang digunakan adalah n-oktana, heksana, etilasetat, metanol, Nutrien Broth (NB), buffer posfat, aquadest. Kultur murni yang digunakan adalah Bacillus cereus FNCC 57, Staphylococcus aureus FNCC 34 dan Salmonella typhimurium FNCC 0134. Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah tabung beruiir, mikro pipet, tips, senthfuse, spektrofotometer, vortex dan beberapa alat gelas lainnya. Prosedur kerja Ekstrak andaliman dilakukan dengan metode maserasi dengan menggunakan dua pelarut yaitu pelarut semipolar (etilasetat) dan pelarut polar (metanol) sehingga diperoleh ekstrak etilasetat dan ekstrak metanol. Masing masing ekstrak dibuat dengan konsentrasi 2%, 4% dan 6% lalu di uji hidrofobisitasnya terhadap bakteri B. cereus, S. aureus dan S. typhimurium. Penentuan hidrofobisitas bakteri dilakukan dengan modifikasi BATH pada hidrokarbon n-oktana, dengan cara Jones et al. (1991) dan Lee dan Yli (1996) sebagai berikut: sebanyak 4,8 ml suspensi bakteri yang mengandung 106 cfu/ml disentrifus pada 1900 g selama 15 menit. Supernatan kultur dibuang dan pelet bakteri ditambah 4,8 ml NB yang mengandung ekstrak andaliman dengan konsentrasi 2%, 4% dan 6%. Kontrol hidrofobisitas digunakan penambahan 1,07 ml bufer fosfat dan 3,73 ml media NB pada pelet bakteri, sehingga volume akhir menjadi 4,8 ml. Selanjutnya suspensi bakteri tersebut diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Kultur bakteri dipisahkan dengan cara sentrifus pada 1900 rpm selama 15 menit. Pelet yang terbentuk dicuci satu kali dengan Phospat Buffer Saline (PBS) pH 7.2 steril, diresuspensikan dalam PBS menjadi 4,8 ml.
24
Jurnai llmu dan Teknoiogi Pangan, Vol. 2, No. 2, October 2004
Setiap 4,8 ml suspensi bakteri 106 cfu/ml ditambahkan pada seri volume hidrokarbon 0,3, 0,6, 0,9, 1,2 dan 1,5 ml n-oktana dalam tabung yang tahan asam. Kemudian divortex dengan kecepatan konstan selama satu menit, dan diekuilibrasi pada suhu kamar selama 15 menit, sehingga terjadi pemisahan. Fase airdiambil secara perlahan-lahan menggunakan pipet pasteur, kemudian absorbansi diukur pada A 600 nm. Hidrofobisitas ditentukan berdasarkan persentase OD (optical density), pada fase air. Persen hidrofobisitas = 100 - (A x 100/A0), dimana A adalah OD dari suspensi baktei pada fase air setelah kontak dengan n-oktana dan Ao merupakan OD suspensi tanpa penambahan n-oktana yang mempunyai nilai hidrofobisitas setara dengan 0 persen. Keseimbangan volume n-oktana dengan suspensi bakteri ditentukan dengan membuat grafik dengan variabel volume hidrokarbon dan persen hidrofobisitas. Nilai hidrofobisitas ditentukan berdasarkan pengamatan dengan dua ulangan. Kriteria hidrofobisitas dari bakteri ditentukan berdasarkan kriteria Santos et al. (1990) yang dapat dilihat pada Tabel 5. Nilai hidrofobisitas pada kontrol menunjukkan sifat hidrofobisitas bakteri secara alami. Nilai perubahan hidrofobisitas diperoleh dari selisih pengurangan perlakuan kontrol dengan perlakuan ekstrak andaliman, jika perlakuan ekstrak andaliman mempunyai hidrofobisitas lebih besar daripada kontrol maka perlakuan ekstrak andaliman dapat meningkatkan hidrofobisitas (+) dan nilai perubahan hidrofobisitas lebih kecil berarti ekstrak andaliman menurunkan hidrofobisitas (-). Tabel 1. Kriteria hidrofobisitas bakteri Jenis uji hidrofobisitas Presipitasi Garam Salt Agregation Test (SAT) Nitrocelulosa Filter (NCF) BATH
Nilai
0,0-1,0 mol/lt 1,0-2,0 mol/lt 2,0-4,0 mol/lt >4,0 mol/lt >75% 50-75% <50% >50% 20-50% <20%
Kriteria
Kuat Moderat Lemah Negatif Kuat Moderat Negatif Kuat Moderat Negatif
Santos era/. (1990)
Jurnal ilmu dan Teknologi Pangan, Vol. 2, No.2, Oktober 2004
25
HASIL DAN PEMBAHASAN Semua bakteri uji memberikan respon positif terhadap n-oktana. Pengaruh ekstrak andaliman dengan berbagai pelarut terhadap hidrofobisitas secara kuantitatif ditentukan pada penambahan 0.9 ml n-oktana dan dapat dilihat pada Tabel 2. Pada perlakuan kontrol yaitu hasil pemisahan sel bakteri dengan buffer menunjukkan bahwa S. aureus mempunyai afinitas terhadap hidrokarbon sebesar 28.57 persen, B. cereus sebesar 30.02 persen dan S. typhimurium sebesar 30.04 persen. Ini menggambarkan bahwa S. cereus, S. aureus dan S. typhimurium tergolong bakteri hidrofobik moderat, sesuai dengan pemyataan Lachica (1990). Ekstrak etilasetat andaliman konsentrasi 4% dapat meningkatkan hidrofobisitas B. cereus sebesar 19.18%, S. aureus sebesar 18.85% dan S. typhimurium sebesar 8.72% masing-masing pada konsentrasi (6%), sebaliknya ekstrak metanol dapat menurunkan hidrofobisitas terhadap 6. cereus dan S. typhimurium sedangkan S.aureus meningkatkan hidrofobisitas dalam jumlah kecil. 1. B. cereus dan S. aureus B. cereus merupakan bakteri Gram positif pembentuk spora sedangkan S. aureus. Bakteri Gram positif mempunyai kecenderungan lebih sensitif dibandingkan dengan bakteri Gram negatif hal ini disebabkan karena perbedaan struktur dinding sel bakteri. Pada bakteri Gram positif Isebagian besar dinding selnya terdiri dari lapisan peptidoglikan dan asam teikoat, sedangkan pada bakteri Gram negatif dinding selnya terdapat lapisan terluar yang disebut membran luar yang terdiri dari lipopolisakarida, protein dan fosfolipid dan lapisan tipis peptidoglikan (Cano dan Colome 1986).
26
Jurnal llmu dan Teknologi Pangan, Vol. 2, No.2, 0ktober2004
Tabel 2. Pengaruh ekstrak etilasetat dan metanol andaliman terhadap hidrofobisitas bakteri pada penambahan 0.9 ml n-oktana % hidrofobisitas relatif terhadap buffer
Bakteri
Antibakteri
S. cereus
buffer etilasetat 2% etilasetat 4% etilasetat 6% metanol 2% metanol 4% metanol 6%
30.02 42.39 49.20 47.13 21.82 29.77 31.71
buffer etilasetat 2% etilasetat 4% etilasetat 6% metanol 2% metanol 4% metanol 6%
28.57 43.21 44.41 47.42 42.34 41.12 42.40
(+) (+) (+) (+) (+) (+)
buffer etilasetat 2% etilasetat 4% etilasetat 6% metanol 2% metanol 4% metanol 6%
30.04 37.76 36.50 38.76 25.62 27.05 28.79
(+) 7.72 (+) 6.46 (+) 8.72 (-) 4.42 (-) 2.99 (-)1.25
S. aureus
S. typhimurium
% Hidrofobisitas
(+) 12.37 (+) 19.18 (+) 17.11 (-) 8.20 (-) 0.25 (-)1.69
14.64 15.84 18.85 13.77 12.55 13.83
Hidrofobisitas B. cereus pada ekstrak etilasetat 6% paling tinggi yaitu sebesar 79.58% (Gambar 1a) dibandingkan pada ekstrak metanol yaitu sebesar 65.96% (Gambar 1b). Pada S. aureus ekstrak etilasetat sebesar 71.95% (Gambar 2a), ekstrak metanol sebesar 66.15% (Gambar 2b). Hal ini dapat dijelaskan bahwa sifat hidrofobisitas bakteri berhubungan dengan komponen dinding sel seperti fosfolipid, lipopolisakarida dan komponen luar sel seperti fimbrie dan kapsul. Komponen ini mempunyai fungsi penempelan pada sel inang dengan membentuk interaksi hidrofobik (Finlay dan Falkow 1997). Sifat hidrofobik pada B. cereus diekspresikan oleh adanya fimbrie (Lachica 1990) yang dimediasi oleh adanya protein 20.5 kDalton dan protein
Jurnai llmu dan Teknologi Pangan, Vol. 2, No. 2, Oktober 2004
27
ini mengandung asam amino lisin dan asam amino nonpolar (leusin dan isoleusin). Secara umum, peningkatan daya antibakteri yang seiring dengan penurunan polaritas (mendekati nonpolar) senyawa-senyawa antibakteri, akan lebih efektif menghambat pertumbuhan kelompok bakteri Gram positif dibandingkan bakteri Gram negatif (Branen dan Davidson 1993). Hal ini sejalan dengan hasil-hasil penelitian dari Farag ef al. ( 1989 ) dan Kim ef al. ( 1995 ) yang membuktikan bahwa komponen-komponen minyak atsiri yang bersifat semi polar sampai nonpolar, lebih kuat daya antibakterinya terhadap kelompok bakteri Gram positif dibandingkan kelompok bakteri Gram negatif.
ID
II
Dl
II WniHlknM
I]
II
'I
II
11
11
11
i]
i)
>1
yilnnAkiMi
Gambar 1. Pengaruh ekstrak etilasetat (a) dan (b) ekstrak metanol terhadap hidrofobisitas terhadap B. cereus pada hidrokarbon n-alkana
28
Jurnalllmu dan Teknologi Pangan, Vol. 2, No. 2, 0ktober2004
Gambar 2. Pengaruh ekstrak etilasetat (a) dan (b) ekstrak metanol terhadap hidrofobisitas terhadap S. aureus pada hidrokarbon n-alkana
2. S. typhimurium S. typhimurium merupakan bakteri Gram negatif. Perlakuan dengan ekstrak etilasetat pada bakteri yang dicobakan mempunyai kecenderungan yang sama yaitu meningkatkan hidrofobisitas terutama kaitannya dengan konsentrasi ekstrak. Semakin tinggi konsentrasi ekstrak etilasetat dan semakin banyak volume n-oktana yang ditambahkan menunjukkan peningkatan nilai hidrofobisitas terhadap B. cereus, S. aureus dan S. typhimurium. Jones et al. (1991) juga melaporkan hasil penelitiannya yaitu penambahan taurolidin 2.0% meningkatkan hidrofobisitas 5.13% pada E. coli dan 15.16% pada Staphylococcus saprophytics, sedangkan 0.075% klorheksidin asetat menurunkan hidrofobisitas 24.69% pada E. coli dan meningkatkan 36.72% pada S. saprophytics. Peningkatan dan penurunan hidrofobisitas pada bakteri yang disebabkan adanya senyawa aktif dalam ekstrak etilasetat andaliman dipengaruhi oleh spesies bakteri. Menurut Nikaido (1996) fosfolipid pada S.typhimurium banyak mengandung fosfatidiletanolamin yang mengandung asam amino polar dan lipopolisakarida (LPS) dengan komponen polisakarida yang relatif lebih tinggi, sehingga S.typhimurium mempunyai sifat hidrofobik moderat. Hidrofobisitas S. typhimurium berhubungan dengan faktor adesin yang disintesis melalui sistem
Jurnal llmu dan Teknologi Pangan, Vol. 2, No. 2, 0ktober2004
29
"Novo", karena penghambatan pada sintesisi protein tersebut mengakibatkan penurunan hidrofobisitas S. typhimurium (Rosenberg dan Sar 1990).
-Hua -Mill 11
-m,n
r^
•1
* * 71
1
1
Gambar 3. Pengaruh ekstrak etilasetat (a) dan (b) ekstrak metanol terhadap hidrofobisitas terhadap S. typhimurium pada hidrokarbon n-alkana Keragaman komponen penyusun dinding sel, komponen terluar membran dan komponen yang memberikan fungsi terhadap sifat hidrofobik bakteri menyebabkan setiap spesies dan strain mengekspresikan hidrofobisitas yang berbeda. Perubahan hidrofobisitas pada perlakuan ekstrak etilasetat lebih besar daripada ekstrak metanol (Gambar 3) Mengacu pada postulat Rosenberg dan Sar (1990) maka perubahan hidrofobisitas pada bakteri yang diakibatkan adanya komponen bioaktif yang terdapat dalam ekstrak andaliman yaitu alkaloid, glikosida, flavonoid dan steroid yang dapat dijelaskan sebagai berikut: (1) peningkatan hidrofobisitas pada B. cereus dan S. aureus, kemungkinan disebabkan oleh terekstraksinya komponen terluar sel yang bersifat hidrofilik, sehingga yang menonjol adalah LPS yang meningkatkan hidrofobisitas bakteri. Pernyataan ini dikemukakan Sunairi ef al. (1997) yaitu perubahan kapsul bakteri yang simetris karena adanya perlakuan antibakteri menjadikan bakteri lebih bersifat hidrofobik. Kemungkinan ini karena komponen aktif dalam ekstrak etilasetat bersifat surfaktan dan berinteraksi dengan senyawa lipoprotein dan memberikan efek peningkatan hidrofobik. (2) Penurunan hidrofobisitas pada S. typhimurium kemungkinan disebabkan oleh senyawa komponen aktif pada ekstrak metanol seperti fenolik hidrokuinon berinteraksi dengan fimbie dan mengakibatkan
30
Jurnal llmu dan Teknologi Pangan, Vol. 2, No. 2, 0ktober2004
penggumpalan protein subunit 20.5 kDalton, sehingga protein ini kehilangan struktur hidrofobiknya dan mengakibatkan hidrofobisitas bakteri menurun. Penurunan hidrofobisitas pada S. typhimurium karena senyawa fenolik hidrokuinon berinteraksi dengan protein yang disintesis pada sistem "Novo". Telah diketahui bahwa protein ini berperan meningkatkan hidrofobisitas B. cereus dan S. aureus, dengan adanya komponen biokatif pada ekstrak andaliman seperti alkaloid, glikosida, flavonoid dan steroid (Houghton dan Raman 1998) kemungkinan mengakibatkan perubahan struktur tersier protein atau senyawa tersebut menyisip pada sisi hidrofobik protein, sehingga mengakibatkan penurunan hidrofobisitas sel bakteri. KESIMPULAN Ekstrak etilasetat 6% memiliki hidrofobisitas lebih tinggi daripada ekstrak metanol 6% baik terhadap bakteri Gram positif (B. cereus dan S. aureus) dan Gram negatif (S. typhimurium).Pa6a bakteri B. cereus pengaruh ekstrak etilasetat 6% memiliki hidrofobisitas terbesar yaitu sebesar 79.58%, sedangkan pada ekstrak metanol 6% hidrofobisitasnya sebesar 65.96%. Perubahan hidrofobisitas bakteri B. cereus, S. aureus dan S. typhimurium menunjukkan adanya perubahan struktur permukaan sel bakteri DAFTAR PUSTAKA Brannen, A.L. dan P.M. Davidson. 1983. Antimicrobials in Foods. Marcel Dekker, Inc. New York. Brannen, A.L. 1993. Introduction To Use of Antimicrobials. Di dalam Davidson, P.M. dan A.L. Brannen (ed). Antimicrobials in Foods. 2nd Ed. Marcel Dekker. New York. Houghton, P.J. dan Raman, A. 1998. Laboratory Handbook for the Fractination of Natural Extracts. Thomson Science, London. Jones, D.,S.Gorman, D.F. Mccafferty and A.D. Woolfson. 1991. The Effects of Three non-antibitic, Antimicrobial Agents on the Surface Hydrophobicity of Certain Micro-organism Evaluated by Difference Methods. J. Appl. Bacteriol. 71:218-227 Kim, J.M., Marshal, M.R., Cornell, J.A., Boston, J.F. dan Wei, C.I. 1995. Antibacterial Activity of Carcacrol, Citral and Geraniols Againts Salmonella typhimurium in Culture Medium and Fish Cubes. J. Food Sci.,60(6): 1365-1368.
Jurnal llmu dan Teknologi Pangan, Vol. 2, No. 2, 0ktober2004
31
Lachica, R.V. 1990. Sigificance of hydrofobicity in the adhesieness of pathogenic Gram negative bacteria. In Doyle R.J. and M. Rosenberg. Eds. Microbial Cell Surface Hydrofobicity. American Siciety for Microbiology. Washington. D.C. Nikaido, H. 1996. Outer Membrane In Neidhardt F.C.Ed. Escherichi coli and Salmonella. ASM Press. Washington D.C. Parhusip A. 2003 Kajian Metode Ekstraksi Andaliman (Xanthophylum acanthopodium DC.) Terhadap Mikroba Patogen dan Perusak Pangan. Jumal llmu dan Teknologi Pangan. Jur. Tek. PanganUPH, Vol 1. No. 1 Parhusip A. 2004 Aktivitas Antibakteri Ekstrak Andaliman Pada Fase Pertumbuhan Bakteri Patogen. Jumal llmu dan Teknologi Pangan. Jur. Tek. Pangan UPH, Vol 2. No. 1 Rosenberg, E and N. Sar. 1990. Changes in bacterial surface hydrofobicity during morphogenesis and differentiation. In Doyle, R.J. and M. Rosenberg. Eds. Microbial cell surface hydrofobicity. American Societyof for Microbiology. Washington. DC. Santos, Y, I. Bandin, T.P. Nicto, D.W Bruno, A.E. Ellis and AT. Taranzo. 1990. Proposed criteria of hydrofobicity. In Lee, K.K. and K.C. Yii. 1996. A Comparison of Three Methods for Assying Hydrofobicity of Pathogenic Vibrios. J. Letters in Appl. Microbiol. 13:343-346. Sunairi M, N. Iwabuchi, Y. Yoshizawa, H. Murooka, H. Murosaki and M. Nakajima. 1997. Cell-surface hydrofobicity and scum formation of Rhodococcus rhodochrous strain with different colonial morphologies. J. Appl. Microbiol. 82:204-210.
32
Jurnai llmu dan Teknologi Pangan, Vol. 2, No. 2, 0ktober2004
