i
PENGARUH CONDITIONED MEDIUM RAT EMBRYONIC FIBROBLAST (CM-REF) DENGAN DAN TANPA LEUKEMIA INHIBITORY FACTOR (LIF) DALAM MEDIUM TERHADAP TINGKAT PROLIFERASI DAN SIFAT PLURIPOTENSI MESENCHYMAL STEM CELL SUMSUM TULANG TIKUS DALAM KULTUR IN VITRO
AGUS EFENDI
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
ii
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI Saya menyatakan bahwa skripsi dengan judul Pengaruh Conditioned Medium Rat Embryonic Fibroblast (CM-REF) dengan dan tanpa Leukemia Inhibitory Factor (LIF) dalam Medium terhadap Tingkat Proliferasi dan Sifat Pluripotensi Mesenchymal Stem Cell Sumsum Tulang Tikus dalam Kultur In Vitro adalah karya saya sendiri dengan arahan pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber Informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir skripsi.
Bogor, Agustus 2009
Agus Efendi NIM B04051499
iii
ABSTRAK AGUS EFENDI. Pengaruh Conditioned Medium Rat Embryonic Fibroblast (CM-REF) dengan dan tanpa Leukemia Inhibitory Factor (LIF) dalam Medium terhadap Tingkat Proliferasi dan Sifat Pluripotensi Mesenchymal Stem Cell Sumsum Tulang Tikus dalam Kultur In Vitro. Dibimbing oleh ITA DJUWITA dan NURHIDAYAT Sel punca (stem cell) adalah sel yang memiliki kemampuan memperbarui diri (proliferasi) dan dapat berdiferensiasi menjadi berbagai jenis sel dengan arahan yang diberikan sehingga stem cell sangat potensial digunakan sebagai terapi berbasis sel. Adult stem cell dapat diisolasi dari beberapa jaringan tubuh individu dewasa salah satu diantaranya adalah dari sumsum tulang. Stem cell di dalam kultur in vitro membutuhkan suatu media khusus yang dapat meningkatkan proliferasi dan menjaga pluripotensinya. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi tingkat proliferasi dan pluripotensi sel-sel kultur sumsum tulang tikus dalam medium modified Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (mDMEM) yang diberi conditioned medium rat embryonic fibroblast (CM-REF) dengan dan tanpa leukemia inhibitory factor (LIF). Sel-sel sumsum tulang tikus dikultur dalam mDMEM, mDMEM+CM-REF 25%, dan mDMEM+CM-REF 25%+LIF 10 ng/ml. Evaluasi dilakukan terhadap morfologi sel-sel sumsum tulang tikus yang berkembang dengan pewarnaan hematoksilin eosin (HE), sedangkan sifat pluripotensi sel-sel sumsum tulang tikus dievaluasi menggunakan pewarnaan alkalin fosfatase (ALP). Tingkat proliferasi diukur berdasarkan persentase bone marrow mesenchymal stem cell (BM-MSC). Hasil yang diperoleh dianalisis menggunakan uji statistik T-test. Hasil penelitian menunjukkan bahwa berdasarkan pengamatan morfologi terdapat 4 jenis sel hasil kultur sel sumsum tulang yaitu mesenchymal stem cell (yang menyerupai mesenkhimal dan fibroblas), hematositoblas, khondroblas dan osteoblas, serta progenitor sel saraf. Kultur sel sumsum tulang dalam medium mDMEM yang diberi CM-REF dengan dan tanpa LIF menunjukkan persentase BM-MSC meningkat secara signifikan (96%; 88%) setelah 10 hari kultur dibanding dalam medium mDMEM (47,8%). Berdasarkan pewarnaan alkalin fosfatase, persentase sel-sel yang pluripoten dalam medium mDMEM yang diberi CM-REF dengan dan tanpa LIF mengalami peningkatan dibanding dalam medium mDMEM. Kesimpulan dari hasil penelitian ini adalah bahwa pemberian CM-REF dengan dan tanpa LIF dapat meningkatkan jumlah dan mempertahankan sifat pluripotensi BM-MSCs. Kata Kunci : BM-MSC, morfologi, proliferasi, pluripotensi, , CM-REF.
iv
ABSTRACT AGUS EFENDI. The Effect of Conditioned Medium Rat Embryonic Fibroblast (CM-REF) with and without Leukemia Inhibitory Factor (LIF) in the Medium on the Proliferation Rate and Pluripotency of Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells In Vitro Culture. Under direction of ITA DJUWITA and NURHIDAYAT Stem cells are cells that have high ability to proliferate and are undifferented. Stem cells differentiation into many types of cells with appropriate induction lead stem cell as a potential cell-based therapy. Adult stem cells can be isolated from various tissue of adult body mostly the bone marrow. Stem cell tends to undergo differentiation spontaneously in vitro culture, therefore stem cell culture require a media that can maintain the proliferation and its pluripotency. This study aims to identify the bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) morphology, the proliferation rate and pluripotency in in vitro culture in modified Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (mDMEM) containing 25% CM-REF with and without LIF. The bone marrow cells were cultured in mDMEM, mDMEM with REF-CM 25%, and mDMEM with CM-REF 25% and LIF 10 ng / ml. Evaluation of cells morphology was performed after the hematoksilin eosin (HE) staining. The pluripotency of bone marrow stem cells were evaluated using the alkaline phosphatase (ALP) staining. Proliferation rate were evaluated based on the percentage of bone marrow mesenchymal stem cell (BM-MSC). Results were analyzed using the statistical test T-test. Based on the morphology, four types of cells are mesenchymal stem cells (mesenchymal cell fusiform and fibroblast celllike), hematocytoblast, osteogenik progenitor and neuron cells progenitor has been identified from bone marrow in vitro culture. Bone marrow cells in mDMEM with CM-REF with and without LIF showed that the percentage BM-MSC significantly increased (96%;88%) after 10 days in vitro culture. Based on the ALP staining, the percentage of cells showed pluripotency in mDMEM with CMREF with and without LIF were increased compared to in mDMEM. In conclution, the addition of CM-REF with and without LIF in bone marrow culture medium could increase the number of BM-MSC and maintained its pluripotency. Keyword : BM-MSC, morphology, proliferation, pluripotency, CM-REF.
v
RINGKASAN AGUS EFENDI. Pengaruh Conditioned Medium Rat Embryonic Fibroblast (CM-REF) dengan dan tanpa Leukemia Inhibitory Factor (LIF) dalam Medium terhadap Tingkat Proliferasi dan Sifat Pluripotensi Mesenchymal Stem Cell Sumsum Tulang Tikus dalam Kultur In Vitro. Dibimbing oleh ITA DJUWITA dan NURHIDAYAT Sel punca (stem cell) merupakan sel yang mempunyai karakteristik unik yaitu memiliki kemampuan memperbaharui diri melalui proses proliferasi dan tetap memiliki sifat pluripotensi (dapat berkembang menjadi berbagai jenis sel sesuai dengan arahan yang diberikan). Karakter stem cell tersebut berpotensi untuk digunakan sebagai sumber transplantasi pada terapi berbasis sel untuk pengobatan penyakit-penyakit degeneratif contohnya pada penyakit Parkinson's, jantung, diabetes mellitus, dan penyakit lainnya. Adult stem cell (ASC) merupakan salah satu jenis stem cell yang dapat ditemukan dari beberapa jaringan tubuh individu dewasa. Sumsum tulang potensial digunakan sebagai sumber ASC karena di dalam sumsum tulang tersedia ASC setiap waktu selama umur individu tersebut serta proses isolasinya lebih mudah dan tidak mengorbankan embrio seperti halnya pada isolasi embryonic stem cell (ESC). Sumsum tulang mengandung dua jenis ASC yaitu mesenchymal stem cell (MSC) dan haematopoietic stem cell. Populasi MSC di dalam sumsum tulang sangat sedikit (0,01%) sehingga untuk dapat digunakan harus di lakukan peningkatan jumlah secara in vitro. Stem cell di dalam kultur in vitro cenderung berdiferensiasi secara spontan menjadi berbagai jenis sel seperti osteoblas, khondroblas, dan adiposit, sehingga dalam sistem kultur stem cell diperlukan tambahan bahan seperti faktor pertumbuhan ke dalam medium untuk meningkatkan proliferasi dan menjaga pluripotensinya. Faktor pertumbuhan seperti basic fibroblast growth faktor (bFGF) dan yang beredar di pasaran memiliki harga yang tinggi, sehingga penggunaan conditioned media rat embryonic fibroblast (CM-REF) yang diperkirakan mengandung banyak faktor pertumbuhan dapat menggantikan bFGF. Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi gambaran morfologi, tingkat proliferasi dan pluripotensi bone marrow mesenchymal stem cell (BM-MSC) tikus hasil kultur in vitro dalam medium Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium dimodifikasi (mDMEM) yang ditambah CM-REF dengan dan tanpa leukemia inhibitory factor (LIF). Penambahan CM-REF dan LIF diharapkan mampu meningkatkan populasi stem cell Conditioned medium rat embryonic fibroblast diperoleh dari kultur otot fetus tikus umur 12-13 hari kebuntingan. Kultur sel-sel sumsum tulang dibagi menjadi 3 kelompok perlakuan berdasarkan kondisi medium yang digunakan yaitu (1) mDMEM, (2) mDMEM yang ditambah dengan CM-REF 25%, dan (3) mDMEM yang ditambah dengan CM-REF 25% dan LIF 10 ng/mL dengan 3 kali ulangan untuk masing-masing perlakuan. Sel-sel sumsum tulang tikus selanjutnya dikultur dalam inkubator dengan suhu 370C dan 5% CO2. Tiap perlakuan dilakukan pengamatan perkembangan sel pada hari ke-1, ke-4, ke-7 dan ke-10. Parameter yang diamati yaitu morfologi berbagai sel yang berkembang dengan
vi pewarnaan hematoksilin eosin (HE), persentase sel yang bereaksi positif terhadap alkalin fosfatase (ALP) dan persentase BM-MSC yang berkembang di dalam kultur. Morfologi sel dianalisis secara deskriptif. Data kuantitatif yang diperoleh dianalisa menggunakan uji statistik T-test dengan tingkat kepercayaan 95% Kultur in vitro sel sumsum tulang menghasilkan 4 kelompok sel yaitu BMMSC (mesenchymal cell-fusiform dan fibroblast cell-like), hematositoblas, khondroblas dan osteoblas serta progenitor sel saraf. Mesenchymal cell-fusiform memiliki morfologi berupa inti yang besar dan pucat dengan anak inti satu atau lebih serta penjuluran sitoplasma yang fusiform. Fibroblast cell-like berinti lebih kecil dan lebih gelap daripada mesenchymal cell-fusiform dengan sitoplasma berbentuk lonjong ataupun amorf. Hematositoblast memiliki inti bulat dan sitoplasma yang mengelilingi inti membentuk sel menjadi bulat. Progenitor sel syaraf mempunyai penjuluran sitoplasma yang akan membentuk akson maupun dendrit. Osteoblas dapat teridentifikasi dengan adanya koloni osteoblas. Identifikasi pluripotensi BM-MSC dilakukan berdasarkan reaksi sel terhadap ALP. Sel yang bereaksi positif ALP akan berwarna merah dan yang bereaksi negatif akan berwarna kuning. Sel yang bereaksi positif dalam kultur sel sumsum tulang yaitu hematositoblas dan BM-MSC. Kultur sel sumsum tulang dalam medium mDMEM menunjukkan penurunan persentase sel yang pluripoten dari hari ke-1 sampai ke-7 kultur. Sedangkan kultur dalam medium yang ditambah dengan CM-REF dengan dan tanpa LIF, sel yang pluripoten cenderung mengalami peningkatan persentase. Kultur sel sumsum tulang dalam mDMEM mudah mengalami penurunan persentase sel yang pluripoten karena stem cell dalam kultur in vitro mudah berdiferensiasi. Conditioned medium rat embryonic fibroblast baik dengan dan tanpa LIF dapat mencegah diferensiasi stem cell sehingga persentase sel yang pluripoten meningkat selama kultur in vitro. Bone marrow mesenchymal stem cell dalam ketiga medium yang berbeda menunjukkan adanya peningkatan persentase. Peningkatan persentase BM-MSC dalam medium yang ditambah CM-REF baik dengan dan tanpa LIF (96%. 88%) menunjukkan peningkatan yang berbeda nyata (P<0,05) dibandingkan dengan tanpa penambahan keduanya (47,8%). Conditioned medium rat embryonic fibroblast dan LIF merupakan faktor pertumbuhan yang dapat meningkatkan daya proliferasi stem cell sehingga persentase BM-MSC akan semakin meningkat dalam kultur in vitro. Kultur sel-sel sumsum tulang tikus menghasilkan bone marrowmesenchymal stem cell (mesenchymal cell-fusiform dan fibroblast-like), hematositoblas, osteoblas dan khondroblas serta progenitor sel saraf. Penambahan CM-REF dengan dan tanpa LIF ke dalam medium mampu menginduksi peningkatan proliferasi bone marrow-mesenchymal stem cell dan menjaga pluripotensinya. Pertumbuhan, diferensiasi dan pluripotensi dari kultur sumsum tulang sangat bergantung pada faktor-faktor yang ada di dalam CM-REF sehingga diperlukan adanya identifikasi serta penghitungan konsentrasi faktor-faktor yang di dalam CM-REF. Peneguhan terhadap identifikasi sel-sel yang berkembang dalam sumsum tulang memerlukan pewarnaan yang lebih spesifik seperti pewarnaan imunositokimia. Kata kunci: BM-MSC, morfologi, proliferasi, pluripotensi, , CM-REF.
vii
PENGARUH CONDITIONED MEDIUM RAT EMBRYONIC FIBROBLAST (CM-REF) DENGAN DAN TANPA LEUKEMIA INHIBITORY FACTOR (LIF) DALAM MEDIUM TERHADAP TINGKAT PROLIFERASI DAN SIFAT PLURIPOTENSI MESENCHYMAL STEM CELL SUMSUM TULANG TIKUS DALAM KULTUR IN VITRO
AGUS EFENDI
Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Hewan pada Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
viii Judul Skripsi
Nama NIM
: Pengaruh Condition Medium Rat Embryonic Fibroblast (CM-REF) dengan dan Tanpa Leukemia Inhibitory Factor (LIF) dalam Medium terhadap Tingkat Proliferasi dan Sifat Pluripotensi Mesenchymal Stem Cell Sumsum Tulang Tikus dalam Kultur In Vitro : Agus Efendi : B04051499
Disetujui:
Pembimbing 1
Pembimbing 2
Dr. Drh. Ita Djuwita, M.Phil 19590403 198601 2 002
Dr. Drh. Nurhidayat, MS 19630721 198803 1 002
Diketahui a.n. Dekan Wakil Dekan
Dr.Nastiti Kusumorini 19621205 198703 2 001
Tanggal Lulus:
ix
PRAKATA
Syukur Alhamdulillah kehadirat Allah SWT, karena berkat rahmat dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik. Skripsi ini berjudul Pengaruh Conditioned Medium Rat Embryonic Fibroblast (CM-REF) dengan dan Tanpa Leukemia Inhibitory Factor (LIF) dalam Medium terhadap Tingkat Proliferasi dan Sifat Pluripotensi Mesenchymal Stem Cell Sumsum Tulang Tikus dalam Kultur In Vitro; disusun berdasarkan hasil penelitian yang dilaksanakan pada Maret-Juli 2009, dan merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana kedokteran hewan pada Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Pada kesempatan ini tidak lupa penulis mengucapkan terima kasih yag sebesar-besarnya kepada: 1. Dr. Drh. Hj. Ita Djuwita, M.Phil dan Dr. Drh. Nurhidayat, MS, masingmasing selaku dosen pembimbing pertama dan kedua yang telah banyak memberikan arahan dan masukan hingga penyelesaian skripsi ini. 2. Dr. Drh. Upik Kesumawati, MS selaku dosen pembimbing akademik yang telah banyak memberikan bantuan serta nasehat selama menyelesaikan pendidikan S1. 3. Pak Wahyu dan staf laboratorium Embriologi FKH-IPB yang telah banyak membantu kelancaran penelitian ini. 4. Para staf laboratorium Embriologi dan laboratorium Anatomi yang membantu dalam kegiatan penelitian ini. 5. Keluarga tercinta, Ayah dan Ibu atas doa, kasih sayang, dukungan dan motivasinya. 6. Tiara Widyaputri atas doa, kasih sayang, dukungan dan motivasinya serta menemani saat suka dan duka.
x 7. Rekan Goblet FKH 42 atas suka duka, perjuangan, kekompakan, kerjasama dan semangatnya dalam menempuh pendidikan S1. 8. Proyek Penelitian Hibah Bersaing XV Ditjen Dikti Depdiknas yang telah membiayai penelitian ini.
Penulis menyadari skripsi ini masih jauh dari sempurna, dikarenakan keterbatasan pengetahuan penulis. Namun demikian penulis mengharapkan bahwa hasil penelitian ini dapat bermanfaat untuk berbagai pihak.
Bogor, Agustus 2009
Penulis
