PENETAPAN KADAR FLOROTANIN DALAM FRAKSI ETIL ASETAT ALGA MERAH (Laurencia papillosa (Forskal) Graville) DENGAN METODE KOLORIMETRI FOLIN CIOCALTEAU

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PENETAPAN KADAR FLOROTANIN DALAM FRAKSI ETIL ASETAT ALGA MERAH (Laurencia papillosa (Forskal) Graville) DENGAN METODE KOLORIMETRI FOLIN CIOCALTEAU

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh: Hendry Kurniawan NIM: 048114086

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2008



SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh: Hendry Kurniawan NIM: 048114086

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2008

ii


Penelitian untuk Skripsi


yang diajukan oleh : Hendry Kurniawan NIM: 048114086

telah disetujui oleh :

Pembimbing

Ign. Yulius Kristio Budiasmoro, M.Si. Tanggal : 12 November 2007

iii


iv


Roma 11:33 O, Alangkah dalamnya kekayaan, hikmat dan pengetahuan Allah! Sungguh tak terselidiki keputusan-keputusan-Nya dan sungguh tak terselami jalan-jalanNya!

Karya ini kupersembahkan untuk : Tuhan Yesus Kristus Sahabat, Penghibur yang tak pernah membiarkan aku ‘down’... Papa-Mama tercinta Sebagai ungkapan rasa hormat dan baktiku Meimeiku tercinta Sahabat-sahabatku serta almamaterku Segenap dosen dan karyawan USD Semua yang sedang membaca skripsi ini...

v


LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma : Nama

: Hendry Kurniawan

Nomor Mahasiswa

: 048114086

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul : “Penetapan Kadar Florotanin dalam Fraksi Etil Asetat Alga Merah (Laurencia papillosa (Forskal) Graville) dengan Metode Kolorimetri Folin Ciocalteau” beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis. Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal : 25 Februari 2008 Yang menyatakan

( Hendry Kurniawan )

vi


PRAKATA

Alleluia!! Terpujilah Tuhan Yang Maha Esa atas berkat kasih dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul “Penetapan Kadar Florotanin dalam Fraksi Etil Asetat Alga Merah (Laurencia papillosa (Forskal) Graville) dengan Metode Kolorimetri Folin Ciocalteau”. Penelitian ini barulah langkah awal perjalanan panjang penelitian tentang alga di bidang kosmetik dan farmasi. Skripsi ini disusun guna memenuhi salah satu syarat untuk mendapatkan gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) pada Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Dalam penulisan skripsi ini, penulis telah banyak mendapatkan bantuan baik materiil, moral maupun spiritual dan dukungan yang berupa bimbingan, dorongan, sarana maupun fasilitas dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini, penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih kepada: 1. Rita Suhadi, M. Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 2. Ign.Y. Kristio Budiasmoro,M.Si. selaku dosen pembimbing yang telah meluangkan waktu dan tenaga untuk memberikan bimbingan dan saran mulai dari penyusunan proposal hingga diselesaikannya skripsi ini. 3. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. dan Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt. selaku dosen penguji yang telah meluangkan waktu untuk memberikan masukan, saran selama penelitian.

vii


4. Dra. A. Nora Iska H., M.Si., Apt. selaku dosen penanggungjawab proyek penelitian payung dan ikut menemani selama penelitian, Abdul Rohman, S.F., Apt. (UGM) dan Christine Patramurti, M.Si., Apt. atas segala masukan, kepedulian saat penelitian mengalami permasalahan. 5. Dr. Sabikis, Apt. yang telah membantu menerjemahkan reaksi Folin yang terbenam lama dalam sebuah buku tua Harry Auterhoff & Knabe. 6. Prof. Roman Przybylski (University Drive Lethbridge), Dr. Jéssica de Matos Nunes (Universidade Federal do Rio Grande do Sul) yang mau berbagi pengalaman riset polifenol yang luar biasa. 7. Rekan tim peneliti, “Algae crew” (Elsa, Angel, Dewi, Andri, Fani, Dipta) yang mendukung, menyemangati selama penelitian dan penyusunan skripsi ini. 8. Teman-teman tim peneliti Teh, Wortel, Jagung, Pulveres yang menambah keceriaan selama di laboratorium. 9. Teman-teman FST’04, kelas B, terutama kelompok D4 (Ratna-Rizky, Widya), “The Dream Team” (Boriz, Yusak, Peter, Rike, Fani) yang kompak habis, dan selalu mengalami hal aneh selama praktikum. 10. Segenap staf laboran terutama di lantai IV dan kepala gudang (mas Otok) atas masukan, bantuan, kebersamaan, dan kerjasamanya selama penelitian. 11. Teman Reef’ers, bapak gembalaku pdt. Drs. Yos Hartono, S.Th., teman pastori: Om Edwin, Tony, Marihot, Pa Ce, mbak Yuni, kak Yetty. Serta pdt. Samuel Sakru (Boyolali) atas dukungan doa yang luar biasa.

viii


12. Semua pihak yang tak dapat penulis sebutkan satu per satu yang telah membantu penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.

Akhir kata, penulis menyadari bahwa penelitian dan penyusunan skripsi ini masih memiliki kekurangan mengingat keterbatasan penulis dalam penyusunan skripsi ini. Oleh sebab itu, penulis mengharapkan kritik dan saran atau mungkin ada

pertanyaan

dari

[email protected].

pembaca Semoga

sekalian, skripsi

kirimkan ini

ke

memberikan

alamat manfaat

email bagi

perkembangan ilmu pengetahuan di lingkungan akademis Universitas Sanata Dharma, syukur-syukur di tanah air. Selamat membaca...

Yogyakarta, Februari 2008 Penulis

ix


PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Yogyakarta, 4 Februari 2008 Penulis

Hendry Kurniawan

x


DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL……………………………………………………….......... ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING………………………............... iii HALAMAN PENGESAHAN…………………………………………….......…. iv HALAMAN PERSEMBAHAN……………………………………………...........v PRAKATA............................................................................................................ vii PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................................. x DAFTAR ISI.......................................................................................................... xi DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ xv DAFTAR TABEL................................................................................................ xvi DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................... xvii INTISARI............................................................................................................. xix ABSTRACT............................................................................................................ xx BAB I. PENGANTAR ............................................................................................ 1 A.

Latar Belakang ............................................................................................ 1

B.

Perumusan Masalah .................................................................................... 3

C.

Keaslian Karya ............................................................................................ 3

D.

Manfaat Penelitian ...................................................................................... 3 1. Manfaat teoritis ........................................................................................... 3 2. Manfaat metodologis................................................................................... 4 3. Manfaat praktis ........................................................................................... 4

E.

Tujuan Penelitian ........................................................................................ 4

xi


1. Tujuan umum: ............................................................................................. 4 2. Tujuan khusus: ............................................................................................ 4 BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA..................................................................... 5 A.

Alga atau Rumput Laut ............................................................................... 5

B.

Alga Merah ................................................................................................. 6

C.

Kandungan kimia Laurencia sp. ................................................................. 6

D.

Florotanin .................................................................................................... 7

E.

Ekstraksi...................................................................................................... 8

F.

Spektrofotometri Visibel dan Kolorimetri ................................................ 10

G.

Metode Folin Ciocalteau ........................................................................... 14

H.

Validasi Metode Analisis .......................................................................... 16 1. Akurasi ...................................................................................................... 16 2. Presisi ........................................................................................................ 16 3. Sensitivitas ................................................................................................ 17 4. Linearitas................................................................................................... 17 5. Range ........................................................................................................ 17 6. Spesifisitas ................................................................................................ 18 7. Detection Limit.......................................................................................... 18 8. Quantitation Limit..................................................................................... 18

I.

Kesalahan Dalam Metode Analisis ........................................................... 19 1. Kesalahan Sistematik (determinate errors) .............................................. 19 2. Kesalahan Tidak Sistematik (indeterminate errors) ................................. 20

J.

Keterangan Empiris................................................................................... 20

xii


BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ............................................................ 22 A.

Jenis Rancangan Penelitian ....................................................................... 22

B.

Variabel dan Definisi Operasional ............................................................ 22 1. Variabel Penelitian .................................................................................... 22 2. Definisi operasional .................................................................................. 22

C.

Bahan atau Materi Penelitian .................................................................... 23

D.

Alat Penelitian........................................................................................... 23

E.

Tata Cara Penelitian .................................................................................. 24 1. Preparasi Sampel Alga Merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville.... 24 2. Penetapan Kadar Air Serbuk Alga ............................................................ 24 3. Uji Kualitatif Senyawa Fenolik................................................................. 25 4. Isolasi Florotanin Kasar ............................................................................ 25 5. Optimasi Metode Kolorimetri dengan Folin-Ciocalteau........................... 26 a.

Pembuatan larutan uji dan larutan standar ........................................ 26

b.

Penetapan Operating Time (OT)....................................................... 26

c.

Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (

maks) .........................

27

6. Validasi Metode Analisis .......................................................................... 27 7. Pengukuran Kadar Polifenol Total............................................................ 28

F.

a.

Perlakuan pada larutan standar floroglusinol.................................... 28

b.

Perlakuan fraksi etil asetat alga merah.............................................. 29

Analisis Hasil ............................................................................................ 30 1. Akurasi ...................................................................................................... 30 2. Presisi ........................................................................................................ 30

xiii


BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................. 31 A.

Pengambilan Sampel..................................................................................... 31

B. Preparasi Sampel Alga merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville ........... 31 B.

Hasil Uji Kualitatif........................................................................................ 36 1. Uji pendahuluan ........................................................................................ 36 2. Uji polifenol .............................................................................................. 37 3. Uji tanin (zat samak) ................................................................................. 38

C.

Isolasi Florotanin Kasar ................................................................................ 38

D.

Dasar Reaksi Kolorimetri dengan Folin-Ciocalteau ..................................... 40

E.

Optimasi Metode Kolorimetri dengan Folin-Ciocalteau............................... 44 1. Penetapan Operating Time (OT)............................................................... 44 2. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (

maks) ..................................

45

F.

Hasil Validasi Metode Analisis..................................................................... 48

G.

Penetapan Kadar Florotanin Fraksi Etil Asetat Laurencia papillosa (Forskal) Graville .......................................................................................... 52

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN............................................................... 54 A.

Kesimpulan ............................................................................................... 54

B.

Saran.......................................................................................................... 54

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 55 LAMPIRAN.......................................................................................................... 59 BIOGRAFI PENULIS .......................................................................................... 73

xiv


DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1.

Struktur kimia beberapa polifenol alga .............................................. 8

Gambar 2.

Rangkaian alat sokhletasi................................................................. 10

Gambar 3.

Instrumentasi spektrofotometer visisbel .......................................... 11

Gambar 4.

Diagram radiasi elektromagnetik ..................................................... 12

Gambar 5.

Ionisasi senyawa fenol ..................................................................... 13

Gambar 6.

Proses oksidasi fenol oleh enzim polifenol oksidase (PPO) ............ 34

Gambar 7.

Reaksi saat penetapan kadar air dengan Karl Fischer...................... 35

Gambar 8.

Reaksi uji pendahuluan senyawa floroglusinol dan KOH ............... 36

Gambar 9.

Reaksi pembentukan kompleks gugus fenolik dan FeCl3 ................ 37

Gambar 10. Reaksi redoks dalam reaksi Folin-Ciocalteau .................................. 42 Gambar 11. Hasil pembacaan OT floroglusinol kadar 3,0 ppm dengan pereaksi Folin Ciocalteau................................................................. 45 Gambar 12. Hasil pembacaan

maks

floroglusinol 3 macam kadar

floroglusinol: 1,0; 3,0 dan 6,0 ppm setelah direaksikan dengan Folin Ciocalteau................................................................... 47 Gambar 13. Kurva baku hubungan kadar dan absorbansi floroglusinol setelah direaksikan dengan Folin Ciocalteau .................................. 51

xv


DAFTAR TABEL Halaman Tabel I.

Hasil uji pendahuluan kandungan senyawa fenolik Laurencia papillosa (Forskal) Graville ................................................................ 37

Tabel II. Hasil uji kandungan senyawa polifenol Laurencia papillosa (Forskal) Graville ................................................................................ 38 Tabel III. Data replikasi seri baku floroglusinol ................................................. 48 Tabel IV. Hasil validasi metode Folin-Ciocalteau .............................................. 49 Tabel V. Hasil penetapan kadar sampel florotanin kasar Laurencia papillosa (Forskal) Graville ................................................................ 52

xvi


DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1.

Surat Keterangan hasil identifikasi spesies alga merah ............. 59

Lampiran 2.

Data perhitungan kadar air dengan Karl Fischer........................ 61

Lampiran 3.

Data penimbangan replikasi seri baku floroglusinol.................. 62

Lampiran 4.

Contoh perhitungan seri kadar baku floroglusinol..................... 63

Lampiran 5.

Hasil scanning

maks

kadar floroglusinol 1,0 ppm setelah

direaksikan dengan Folin-Ciocalteau......................................... 63 Lampiran 6.

Hasil scanning

maks



Hasil scanning

maks



Hasil pembacaan absorbansi seri baku floroglusinol pada ketiga

Lampiran 9.

maks .........................................................................

65

Data recovery, kesalahan sistematik dan kesalahan acak dengan metode Folin-Ciocalteau ............................................................ 65

Lampiran 10.

Hasil analisis statistik regresi linear seri baku floroglusinol replikasi I.................................................................................... 66

Lampiran 11.

Hasil analisis statistik regresi linear seri baku floroglusinol replikasi II .................................................................................. 67

Lampiran 12.

Hasil analisis statistik regresi linear seri baku floroglusinol replikasi III ................................................................................. 67

Lampiran 13.

Parameter mean recovery........................................................... 68

xvii


Lampiran 14.

Parameter CV ............................................................................. 69

Lampiran 15.

Data penimbangan sampel fraksi etil asetat Laurencia papillosa (Forskal) Graville...................................... 69

Lampiran 16.

Data absorbansi sampel fraksi etil asetat Laurencia papillosa (Forskal) Graville ....................................................................... 70

Lampiran 17.

Contoh perhitungan kadar sampel.............................................. 70

Lampiran 18.

Foto hasil uji kualitatif kandungan florotanin serbuk alga merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville ................... 71

Lampiran 19.

Foto florotanin kasar dari fraksi etil asetat alga merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville...................................... 72

Lampiran 20.

Foto instrumen spektrofotometer UV - VIS Perkin Elmer Lambda- 20 ................................................................................ 72

xviii


INTISARI Tanaman laut alga merupakan salah satu kekayaan laut Indonesia yang sangat potensial, namun belum dimanfaatkan secara maksimal baik sebagai nutrisi makanan maupun agen biomedis. Salah satunya, alga merah Laurencia yang cukup melimpah di perairan Indonesia. Alga merah mengandung mikronutrien polifenol alga yang dikenal sebagai florotanin. Senyawa ini berupa unit-unit floroglusinol (1,3,5-trihidoksibenzena) yang berbeda dari tumbuhan terestrial. Tujuan penelitian ini adalah mendapatkan florotanin kasar dari alga merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville serta menetapkan kadar florotanin dalam fraksi etil asetat alga tersebut. Isolasi dilakukan menggunakan metode sokhletasi dengan pelarut metanol. Ekstrak kental yang diperoleh kemudian difraksinasi dengan kloroform, akuades, dan etil asetat untuk mendapatkan florotanin kasar. Konsentrasi polifenol total dalam florotanin kasar ditetapkan secara spektrofotometri dengan metode Folin-Ciocalteau, menggunakan standar floroglusinol yang dibuat seri konsentrasi baku 0,5 ; 1,0 ; 2,0 ; 3,0 ; 4,0 ; 5,0 ; dan 6,0 ppm dalam pelarut aseton 75 %. Standar floroglusinol dan sampel dibaca pada panjang gelombang maksimum 750,1 nm. Konsentrasi polifenol total dalam fraksi etil asetat alga merah yang didapat adalah 10,55-11,21 mg PGE (Phloroglucinol Equivalent)/g sampel. Kata kunci :

florotanin, polifenol, alga merah Laurencia papillosa, metode Folin-Ciocalteau

xix


ABSTRACT Seaweed algae is one of Indonesian’s sea treasures that really potential, but still haven’t been used maximally as well yet, either as food nutrition or biomedical agents. One of them is red algae Laurencia that abundant enough in Indonesian waters. The Red algae contains algae polyphenols micronutrient called phlorotannins. This compound is derived from phloroglucinol units (1,3,5trihydoxybenzene), that is differ from terrestrial plant polyphenols. The goals of this study is for getting crude phlorotannin from red algae Laurencia papillosa (Forskal) Graville and determining phlorotannin concentration in ethyl acetate fractional of alga that mentioned. Isolation have been done by soxhletation method with methanol solvent. The viscous extract that was gained, than was fractionated with chloroform, aquadest and ethyl acetate to gain crude phlorotannin. Concentration of total polyphenols in crude phlorotannin was determined by spectrophotometric with Folin-Ciocalteau method. Using phloroglucinol standard that was made in calibration series 0.5 ; 1.0 ; 2.0 ; 3.0 ; 4.0 ; 5.0 and 6.0 ppm with acetone 75 % solvent. The phloroglucinol standard and sample was scanned at 750.1 nm the maxima wavelength. Concentration of total polyphenols in ethyl acetate fractional of red algae has been investigated was 10.55-11.21 mg PGE (Phloroglucinol Equivalent)/g sample. Key words :

phlorotannin, polyphenols, red algae Laurencia papillosa, FolinCiocalteau method

xx


BAB I PENGANTAR

A. Latar Belakang Saat ini telah dikenal 8000 senyawa fenolik alam dengan struktur yang digambarkan sebagai suatu fenol (cincin aromatik yang berikatan sedikitnya dengan 1 gugus hidroksil) seperti asam kafeat, asam ferulat, kuersetin, apigenin, genistein, resveratrol, asam norhidroguaiaretat, asam karnosat, silimarin, polifenol teh, dan tanin (Svobodova et al., 2003). Salah satu mikronutrien dari tumbuhan alga adalah polifenol yang dikenal sebagai florotanin, merupakan senyawa polifenol yang tidak ditemukan pada tumbuhan terestrial (Burtin, 2003). Beberapa aktivitas biologik florotanin yang telah diteliti adalah antiproliferasi dan antioksidan (Nakamura et al., 1996; Kang et al., 2005a; Athukorala et al., 2006; Yuan & Walsh, 2006), antiinflamasi (Shin et al., 2006), inhibitor matriks metalloproteinase (Kim et al., 2006),

sitoprotektif

terhadap stres oksidatif (Kang et al., 2005b), dan inhibitor HIV-1 reverse transcriptase dan protease (Ahn et al., 2004). Sebagai negara yang dikelilingi oleh lautan, Indonesia memiliki potensi yang baik untuk mengembangkan dan memanfaatkan kekayaan lautnya terutama alga atau rumput laut (Sulistiyowati, 1992). Alga merah cukup melimpah di perairan Indonesia yang belum dimanfaatkan secara maksimal baik sebagai makanan ataupun agen biomedis. Selain itu, senyawa bioaktif dari lautan yang

1


2

telah dieksplorasi belumlah sebanyak dari daratan yang memiliki keterbatasan lahan tanah yang semakin sempit untuk pemukiman dan fasilitas lainnya. Diketahui pula, tanaman alga merah telah dikembangkan jadi beberapa produk kosmetika antioksidan karena merupakan agen pereduksi sebagaimana halnya dengan vitamin C, sehingga perlu dilakukan investigasi tentang kandungan aktif senyawa polifenolnya. Maka sebagai langkah awal untuk meneliti kandungan polifenol alga merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville dilakukan penelitian secara kualitatif dan kuantitatif polifenol totalnya agar dapat diketahui kandungan senyawa florotanin Laurencia papillosa (Forskal) Graville sebenarnya dan jika dilakukan uji penelitian

lanjutan dapat diketahui besarnya potensi

aktivitasnya sebagai bioaktif yang berguna menjaga kesehatan manusia. Penelitian mengenai estimasi kandungan polifenol total pada rumput laut dan ekstraknya yang terhitung sebagai ekivalen floroglusinol pernah dilakukan oleh Zhang et al. (2006) dengan metode sederhana berdasarkan reaksi kolorimetri Folin-Ciocalteau. Metode ini memiliki keunggulan dalam hal sensitivitasnya mengukur senyawa-senyawa yang memiliki gugus fenolik hingga tingkat part per million (ppm), memiliki reprodusibilitas dan linearitas yang baik, sederhana, hanya membutuhkan reagen Folin Ciocalteau sehingga metode ini masih digunakan hingga saat ini.


3

B. Perumusan Masalah Dari uraian di atas, maka permasalahan dalam penelitian ini difokuskan pada florotanin dalam fraksi etil asetat yang diisolasi dari alga merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville yang tersebar di pantai selatan Yogyakarta. Rumusan masalah yang ada sebagai berikut : 1. Apakah florotanin berupa florotanin kasar pada fraksi etil asetat dapat diisolasi dari alga merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville untuk diukur dengan metode Folin Ciocalteau? 2. Berapakah kadar florotanin dalam alga merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville yang diukur dengan metode Folin Ciocalteau?

C. Keaslian Karya Sepengetahuan peneliti, penelitian tentang penetapan kadar florotanin dalam fraksi etil asetat alga merah (Laurencia papillosa (Forskal) Graville) dengan metode Folin-Ciocalteau belum pernah dilakukan.

D.

Manfaat Penelitian

1. Manfaat teoritis Penelitian ini diharapkan dapat memberi informasi kandungan florotanin hasil isolasi dari alga merah (Laurencia papillosa (Forskal) Graville).


4

2. Manfaat metodologis Penelitian ini dapat menjadi acuan tentang penggunaan metode Folin Ciocalteau dalam penetapan kadar florotanin. 3. Manfaat praktis Memberi informasi kepada masyarakat kandungan polifenol alga merah (Laurencia papillosa (Forskal) Graville) yang bermanfaat bagi kesehatan sebagai antioksidan, antikanker, sediaan kosmetik tabir surya dan manfaat lain yang belum diteliti.

E.

Tujuan Penelitian

1. Tujuan umum: Tujuan umum penelitian ini adalah menetapkan kadar florotanin alga merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville. 2. Tujuan khusus: a. Dapat mengisolasi florotanin berupa florotanin kasar pada fraksi etil asetat alga merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville untuk diukur dengan metode Folin Ciocalteau. b. Mengetahui kadar florotanin dalam alga merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville yang diukur dengan metode Folin Ciocalteau.


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA

A. Alga atau Rumput Laut Rumput laut adalah tumbuhan yang tidak dapat dibedakan antara bagian akar, batang dan daun. Semua bagian tumbuhannya disebut thallus. Berdasarkan ukurannya dibedakan dua golongan yaitu mikro-algae dan makro-algae (Anonim, 1979). Makroalga (alga coklat, alga hijau, dan alga merah) merupakan tumbuhan laut yang dikonsumsi sehari-hari sebagai sayuran secara turun–menurun di Asia. Banyak penelitian epidemiologi mengaitkan antara konsumsi alga dan manfaatnya bagi kesehatan. Selain itu, makroalga telah banyak dieksplorasi di negara barat sebagai sumber phycocolloid seperti alginat, karagenan, dan agar. Di sisi lain, makroalga masih mengandung senyawa lain (makronutrien dan mikronutrien) yang mempunyai efek protektif terhadap kesehatan yang menarik untuk diteliti lebih lanjut. Makroalga merupakan sumber polisakarida yang tinggi (alginat dan fucoidan dari alga coklat, karagenan dan agar dari alga merah), selain itu juga makronutrien seperti mineral yang tinggi (yodium dari alga coklat dan kalsium), protein dan asam amino (pikobiliprotein dari alga merah dan biru), lipid dan asam lemak (asam linolenat dari alga hijau, asam eikosapentoat dan asam arakidonat), dan mikronutrien (vitamin C, vitamin E, polifenol, dan karotenoid) (Burtin, 2003). Jenis-jenis alga ini umumnya tumbuh dengan baik di daerah pasang surut atau di daerah yang selalu terendam air (subtidal) sampai batas kedalaman 200 m yang intensitas cahaya masih dapat ditembus (Kadi, 2007).

5


6

B. Alga Merah Red algae (Rhodophyta, Yunani :

(rhodon) = mawar +

(phyton) = tanaman, jadi tanaman merah) adalah kelompok besar sekitar 50006000 spesies dari kebanyakan marine algae adalah multiselular termasuk banyak dikenal sebagai ganggang laut (Thomas, 2002). Laurencia termasuk dalam ordo Ceramiales dan famili Rhodomelaceae (Al Amin & Razali, 1997). Kebanyakan coralline algae, mensekresikan kalsium karbonat dan memainkan peran membangun batu karang (Woelkerling, 1990). Alga merah seperti dulse (Palmaria palmata) dan nori sebagai masakan tradisional Eropa dan Asia dan digunakan untuk produk agar, karagenan dan bahan tambahan makanan lain (Thomas, 2002).

C. Kandungan kimia Laurencia sp. Laurencia

papillosa

(Forskal)

Graville

mengandung

polisakarida

carrageenan dan agar, dinding sel alga merah mengandung minor polisakarida xylan (Burtin, 2003). Laurencia obtusa mengandung seskuiterpen teroksidasi chamigrenelactone, asetogenin steroisomer neoisoprelaurefucin. Dua diterpen terhalogenasi 15-bromoparguer-9(11)-ene-16-ol dan 15-bromoparguer-7-ene-16ol dielusidasi dari L. nipponica. L. intricata memiliki diterpen laurenditerpenol. Rhodomela confervoides telah dikenal sebagai sumber derivat bromofenol (Blunt et al., 2006). Kandungan kalsium bisa setinggi 7 % dari bobot kering pada makroalga dan bisa mencapai 34 % pada alga berkapur lithotamne. Protein alga merah disebut dengan pikobiliprotein. Kandungan protein dan senyawa fenolik


7

bertolakbelakang, pada alga merah dan hijau memiliki kandungan fenol yang rendah dan protein yang tinggi. Lipid didapati hanya 1-5 % dari bobot kering alga menunjukkan suatu poli-asam lemak tak jenuh. Selain itu terdapat pula polifenol alga disebut florotanin (Burtin, 2003).

D. Florotanin Polifenol alga disebut juga florotanin, berbeda dengan polifenol dari tanaman teresterial yang berasal dari turunan asam galat dan asam ellagat, sementara

polifenol

algal

berasal

dari

unit-unit

floroglusinol

(1,3,5-

trihydroxybenzene) (Burtin, 2003). Kandungan tertinggi florotanin ditemukan dalam ganggang coklat, berkisar 5-15 % dari berat kering (Nagayama et al., 2002). Florotanin terdiri dari molekul dengan struktur dan tingkat polimerisasi yang heterogen yaitu phloroglucinol (2 %) dan oligomernya seperti eckol (trimer, 3 %), phlorofucofuroeckol A (pentamer, 28 %), dieckol (heksamer, 7 %), 8,8’–bieckol (hexamer, 7 %) dan lainnya (30 %). Florotanin dengan struktur dan tingkat polimerisasi yang heterogen memungkinkan senyawa ini mempunyai aktivitas biologik yang luas (Athukorala et al., 2006; Yuan & Walsh, 2006; Kang et al., 2005a). Floroglusinol berupa kristal putih pada suhu kamar, titik lebur 218 0C, rasa manis, tak berwarna dalam cahaya. Larut dalam 100 bagian air, 10 bagian alkohol, 0,5 bagian piridin. Praktis larut eter, protektif terhadap cahaya (Anonim, 1989).


8

Glombitza et al. menemukan floroglusinol bebas dalam Fucus vesiculosus dan mendeskripsikan isolasi beberapa polifloroglusinol dan dinamakan difucol, trifucol, serta campuran dua isomerik tetrafucol. Senyawa-senyawa ini diisolasi dan dikaraktersisasikan sebagai paracetates, yang strukturnya didapat dari data spektrum. Dari ganggang coklat yang lain, Bifurcaria bifurcata, diisolasi sebuah difenil

eter

dan

dikarakterisasikan

sebagai

paracetate.

Data

spektrum

menunjukkan senyawa ini, bernama bifuhalol yang lebih lanjut diduga sebagai prekursor tanin phaeophyta. Contoh struktur kimia senyawa-senyawa polifenol alga seperti pada gambar 1 (Anonim, 1978).

OH

OH HO

HO

OH

HO

OH

OH

HO

OH HO

(1)

O

OH

(2)

HO

OH

HO

(3)

OH OH HO HO HO

OH HO

OHHO

OH

OH

OH HO

OH HO

OH OH

HO

OHHO

HO

OH OH HO OH HO OH

HO

HO OH

(4)

(5)

OH

(6)

OH HO

Gambar 1. Struktur kimia beberapa polifenol alga : (1) Floroglusinol, (2) Difucol, (3) Bifuhalol, (4) Trifucol, (5) Isomer I Tetrafucol, (6) Isomer II Tetrafucol

E. Ekstraksi Ekstraksi adalah kegiatan penarikan zat yang dapat larut dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Faktor yang mempengaruhi kecepatan


9

penyarian adalah kecepatan difusi zat yang larut melalui lapisan batas antara cairan penyari dengan bahan yang mengandung zat tersebut. Pada waktu pembuatan simplisia (serbuk), beberapa sel ada yang dindingnya pecah dan ada yang masih utuh. Proses penyarian pada sel yang dindingnya masih utuh, zat aktif yang terlarut pada cairan penyari untuk keluar dari sel harus melewati dinding sel (Anonim, 1986). Ekstrak adalah sediaan kering, kental atau cair dibuat dengan menyari simplisia nabati atau hewani menurut cara yang cocok, diluar pengaruh cahaya matahari langsung (Anonim, 1979). Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana dan digunakan untuk simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari. Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif. Maserasi digunakan untuk penyarian simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari, tidak mengandung zat mudah mengembang dalam cairan penyari, tidak mengandung benzoin, stirak, dan lain-lain. Keuntungan penyarian dengan maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan. Kerugian maserasi adalah pengerjaan lama, penyariannya kurang sempurna (Anonim, 1986). Sokhletasi

merupakan

salah

satu

penyarian

berkesinambungan

menghasilkan ekstrak cair yang dilanjutkan dengan proses penguapan. Serbuk diisikan pada filter kertas berpori. Cairan penyari dalam labu dipanaskan hingga mendidih. Uap penyari mengembun karena didinginkan oleh pendingin balik. Embun turun melalui serbuk simplisia sambil melarutkan zat aktifnya dan kembali


10

ke labu. Cairan akan menguap kembali berulang seperti proses sebelumnya (Anonim, 1986). Rangkaian alat sokhletasi seperti gambar 2 (Evans, 2002).

Gambar 2. Rangkaian alat sokhletasi : A) tempat ekstraksi sampel, B) tempat solven

Metode sokhletasi mempunyai beberapa keuntungan antara lain, cairan penyari yang dibutuhkan lebih sedikit dan secara langsung hasil yang diperoleh lebih pekat. Serbuk simplisia disari oleh cairan penyari yang murni maka dapat menyari zat aktif lebih banyak dan penyarian dapat diteruskan tanpa menambah volume cairan penyari (Anonim, 1986).

F. Spektrofotometri Visibel dan Kolorimetri Spektrofotometer adalah suatu instrumen yang akan memecah radiasi polikromatis menjadi panjang gelombang berbeda. Instrumentasi seluruh spektrofotometer yang ada: 1) sumber radiasi kontinyu pada

tertentu, 2)

monokromator untuk memilih berkas sempit dari sumber spektrum, 3) sel sampel, 4) detektor, 5) pembaca respon detektor atau recorder (Christian, 2004). Instrumentasi spektrofotometer seperti pada gambar 3 (Cairns, 2005).


11

Gambar 3. Instrumentasi spektrofotometer visisbel

Sumber (source) untuk daerah tampak, adalah tungsten filament incandescent lamp. Sel sampel untuk visibel dari gelas atau kuarsa (Christian, 2004). Analisis spektroskopi adalah sains untuk menetapkan berapa banyak substansi yang ada di sampel secara akurat mengukur berapa besar cahaya yang diabsorpsi atau diemisikan oleh atom atau molekul di dalamnya (Cairns, 2005). Senyawa yang dapat menyerap radiasi cahaya tampak adalah senyawa berwarna yang memiliki elektron lebih mudah dipromosikan. Spektrum serapan elektronik ini dapat digunakan untuk analisis kuantitatif karena jumlah radiasi elektromagnetik yang diserap ada hubungannya dengan jumlah molekul penyerap (Silverstein & Murrill, 1991; Skoog et al., 1998), digambarkan sebagai berikut: T= A = log

It Io

= 10 -abc

(1)

1 = abc T

(2)

Keterangan: T

= persen transmittan

A = absorban (serapan)

Io

= intensitas radiasi yang

a = absorbansi molar

datang It

= intensitas radiasi yang

b = tebal kuvet c = konsentrasi analit

diteruskan

(Mulja & Suharman, 1995)


12

Cahaya adalah bentukan radiasi elektromagnetik, disebut demikian karena terdiri atas komponen elektrik dan komponen magnetis yang bergelombang bersamaan dengan arah tegak lurus dan tegak lurus terhadap arah perjalanan radiasi melewati ruang seperti gambar 4 berikut (Cairns, 2005).

Gambar 4. Diagram radiasi elektromagnetik

Panjang gelombang saat mencapai absorbans (A) tertinggi disebut dan karakteristik dari bagian kromofor (Christian, 2004). Pergeseran

maks

maks

menjadi

panjang gelombang lebih panjang dikenal sebagai batokromik atau red shift karena warna merah berada pada panjang gelombang yang panjang di akhir spektrum visibel. Pada kasus fenol yang merupakan asam lemah, ionisasi meningkatkan intensitas absorpsi cahaya dan posisi

maks

berpindah ke panjang

gelombang lebih panjang. Ini karena ionisasi dan kehilangan atom H sehingga menghasilkan ion H+ dengan muatan negatif penuh pada oksigen (ion fenoksida), yang dapat berinteraksi dengan cincin lebih efektif dari pasangan elektron bebas yang ada pada molekul tak terionkan. Gambar 5 menggambarkan proses ionisasi senyawa fenol (Cairns, 2005).


13

Gambar 5. Ionisasi senyawa fenol

Kolorimetri adalah suatu teknik pengukuran cahaya yang diabsorpsi oleh zat berwarna baik warna yang terbentuk dari asalnya maupun akibat reaksi dengan zat lain (Khopkar, 1990). Pemilihan prosedur kolorimetri untuk menentukan substansi tergantung pada pertimbangan sebagai berikut : 1. metode kolorimetri akan memberikan hasil yang lebih akurat pada konsentrasi rendah daripada titrimetri atau gravimetri. 2. metode kolorimetri sering digunakan pada kondisi di mana tidak ada titrimetri atau gravimetri. 3. metode kolorimetri memiliki beberapa keuntungan dalam hal spesifisitas (Vogel, 1978). Kriteria untuk analisis kolorimetri yang baik adalah : 1. Menghasilkan reaksi warna yang khusus Reaksi-reaksi yang ada sangat sedikit sekali untuk beberapa substansi tertentu, tetapi justru memberikan warna-warna yang banyak membentuk kelompok warna tersendiri yang hanya berhubungan dengan substansi khusus. 2. Adanya proporsi yang sesuai antara warna dan konsentrasi


14

Untuk kolorimeter visual sangat penting bahwa intensitas warna harus meningkat secara linier dengan konsentrasi substansi yang ditentukan. 3. Stabilitas warna Warna yang dihasilkan harus sama untuk mendapatkan hasil yang akurat. Hal ini menerapkan reaksi-reaksi warna yang akan dicapai secara maksimal. Waktu untuk mencapai warna yang maksimal harus cukup lama untuk mendapatkan pengukuran yang kurat. 4. Reprodusibel Prosedur kolorimetri harus memberikan hasil yang reprodusibel dalam kondisi yang spesifik. 5. Kejernihan larutan Larutan harus bebas dari pengotor jika pembanding yang dipakai dibuat dengan standar. Kekeruhan akan menyerap cahaya dengan baik (Vogel, 1978).

G. Metode Folin Ciocalteau Reagen Folin-Ciocalteau tersusun atas: 100 g natrium tungstat, 25 g natrium molibdat P, 50 mL asam fosfat P, 100 mL HCl P, 150 g lithium sulfat P, dan beberapa tetes brom P (Anonim, 1995). Metode Folin-Ciocalteau (Singleton & Rossi, 1965) sebagaimana dideskripsikan oleh Waterman dan Mole (1994) telah digunakan untuk mendeterminasikan fenol total. Metode Folin-Ciocalteau digunakan untuk menetapkan konsentrasi gugus-gugus hidroksil fenolik dalam sampel. Metode ini


15

tidak menyediakan data senyawa fenolik tertentu dalam ekstrak. Metode FolinCiocalteau berdasar atas kemampuan mereduksi gugus hidroksil fenolik dan sangat tidak spesifik namun dapat mendeteksi semua fenol dengan sensitivitas berbeda. Reaksi redoks dari fenolat terjadi di bawah kondisi basa mereduksi kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat dalam reagen menjadi suatu warna biru (Box, 1983). Pengujian dengan kolorimetri oksidasi/reduksi ini mengukur semua molekul fenol tanpa ada diferensiasi antara asam gallat, monomer, dimer dan senyawa fenolik yang lebih besar (Anonim, 2001). Paper pertama tentang metode ini dipublikasikan pertama kali pada 1927. Singleton dan Rossi (1965) membuktikan reprodusibilitas uji ini. Ini adalah suatu metode kuantitatif dan sensitif, tergantung pada derajat polimerisasi: Fenolik + basa + reagen FolinCiocalteau (F-C) + panas = produk berwarna biru. Absorpsi hasil reaksi polifenol anggur dan reagen F-C pada 755 nm (Anonim, 2001). Reagen Folin-Ciocalteau suatu agen pengoksidasi tersusun dari heteropolifosfotungstat–molibdat (Anonim, 2001). Reagen Folin-Ciocalteau merupakan larutan kompleks ion polimerik yang dibentuk dari asam fosfomolibdat dan asam heteropolifosfotungstat. Reagen ini mengoksidasi fenolat (garam alkali), sehingga mereduksi asam heteropoli menjadi suatu kompleks Mo-W. Fenolat hanya ada pada larutan basa tetapi reagen dan produknya tidak stabil pada kondisi basa. Reaksi tersebut menghasilkan warna biru ungu yang dapat diukur absorbansinya dengan spektrofotometer (Jansoon, 2005).


16

H. Validasi Metode Analisis Validasi suatu metode analisis adalah proses yang dibuat, dengan penelitian laboratorium agar karakteristik pelaksanaan metode memenuhi persyaratan aplikasi analisis yang diinginkan. Parameter-parameter validitas metode analisis antara lain akurasi, presisi, linearitas, spesifisitas, range, detection limit, dan quantitation limit (Anonim, 2005). 1. Akurasi Akurasi adalah derajat kepercayaan antara nilai yang terukur dan nilai sebenarnya. Nilai sebenarnya yang mutlak sangat sukar diketahui. Definisi yang lebih mungkin mengenai akurasi adalah kesesuaian antara nilai terukur dan nilai sebenarnya yang dapat diterima (Christian, 2004). Akurasi dihitung sebagai persentase recovery pengujian sejumlah analit yang diketahui jumlahnya atau sebagai perbedaan antara rata-rata dan nilai sebenarnya yang dapat diterima (Anonim, 2005). Menurut Mulja dan Hanwar (2003) akurasi untuk bahan baku 98-102 %, sedangkan untuk bioanalisis rentang akurasi 80-120 % masih bisa diterima. 2. Presisi Presisi suatu metode analisis adalah derajat kesesuaian antar hasil percobaan individual ketika metode itu diaplikasikan secara berulang pada sampel yang homogen (Anonim, 2005). Presisi bisa diekspresikan sebagai standar deviasi, koefisien variasi, sebagai rentang kepercayaan nilai rata-rata (Christian, 2004). Menurut Mulja dan Hanwar (2003), presisi yang baik


17

dinyatakan dengan nilai koefisien variasi (CV) yang < 2 % untuk kadar analit 98-102 %. 3. Sensitivitas Sensitivitas suatu metode analisis merupakan kemampuan metode analisis untuk memisahkan perbedaan kecil konsentrasi analit. Faktor yang mempengaruhi sensitivitas adalah kemiringan (slope) kurva baku dan presisi. Jika ada 2 metode analisis memiliki presisi yang sama namun salah satunya memiliki kemiringan kurva baku yang lebih curam maka metode yang disebut terakhir lebih sensitif, dan sebaliknya (Skoog et al., 1998). 4. Linearitas Linearitas suatu metode analisis merupakan kemampuan (pada rentang tertentu) untuk mendapatkan hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi (jumlah) analit di dalam sampel sehingga memberikan nilai koefisien korelasi yang lebih besar daripada nilai koefisien korelasi pada tabel statistik (Mulja & Suharman, 1995). 5. Range Range suatu metode analisis adalah interval antara konsentrasi terendah sampai konsentrasi tertinggi analit yang dapat diukur secara kuantitatif menggunakan metode analisis tertentu dan menghasilkan akurasi, presisi, linearitas yang memadai (Anonim, 2005).


18

6. Spesifisitas Spesifisitas didefinisikan sebagai kemampuan untuk mengukur dengan baik komponen lain dalam analit yang mungkin ada seperti pengotor, produk degradasi, dan komponen matriks (Anonim, 2005). Spesifisitas merupakan karakterisitik terpenting dari suatu metode sebagai salah satu parameter validasi yang utama (Mulja & Hanwar, 2003) 7. Detection Limit Detection limit adalah kadar terkecil analit yang masih dapat memberikan tanggap detektor yang tingginya 2-3 kali simpangan maksimum dari noise (derau) garis dasar (Mulja & Hanwar, 2003). Pada kasus prosedur analisis instrumental yang menghasilkan background noise. Menurut ICH (International Conference on Harmonization), rasio signal-to-noise yang dapat diterima adalah 2:1 atau 3:1 (Anonim, 2005). 8. Quantitation Limit Quantitation limit adalah kadar terkecil analit dalam sampel yang dapat ditetapkan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi percobaan yang dinyatakan. Menurut ICH, rasio signal-to-noise yang dapat diterima adalah 10:1 (Anonim, 2005).


19

I. Kesalahan Dalam Metode Analisis Kesalahan dalam metode analisis sangat sukar untuk dihilangkan namun sumber kesalahan tetap harus dibuat seminimal mungkin. Kesalahan dalam analisis kimia dapat dikategorikan menjadi 2 kelas utama, yaitu: 1. Kesalahan Sistematik (determinate errors) Kesalahan sistematik adalah hasil analisis yang menyimpang secara tetap dari nilai kadar yang sebenarnya karena proses pelaksanaan prosedur analisis, sehingga kesalahan ini disebut juga kesalahan prosedur (Mulja & Suharman, 1995). Kesalahan sistematik dapat disebabkan oleh beberapa faktor, antara lain: a. Kesalahan personil dan operasi Kesalahan ini disebabkan oleh cara pelaksanaan analisis, bukan karena metode. Kesalahan operasi umumnya bersifat fisis (bukan khemis), misalnya kesalahan pengamatan visual pada titik akhir titrasi, kekeliruan cara pencucian endapan, dan sebagainya. Jadi kesalahan ini bersifat individual dan sangat dipengaruhi oleh keterampilan analis dalam melakukan pekerjaan analisis. b. Kesalahan alat dan pereaksi Kesalahan ini disebabkan oleh pereaksi yang kurang murni, alat yang kurang valid atau pemakaian alat yang kurang tepat walaupun alatnya sendiri baik, contohnya pengambilan volume tepat dengan pipet ukur atau gelas ukur, penggunaan buret 50 mL (buret makro) untuk analisis mikro, dan sebagainya.


20

c. Kesalahan metode Kesalahan ini dapat disebabkan oleh kesalahan pengambilan sampel, kesalahan akibat reaksi kimia yang tidak sempurna, atau ikut mengendapnya zat-zat yang tidak diinginkan (Day & Underwood, 1986). Kesalahan sistematik dapat dihindari atau diperkecil dengan: 1). Mengkalibrasi instrumen dan melakukan koreksi secara berkala (biasanya tiap 3 bulan atau disesuaikan dengan frekuensi pemakaian alat). 2). Memilih metode dan prosedur standar dari badan resmi. 3). Memakai bahan kimia dengan derajat untuk analisis. 4). Meningkatkan pengetahuan dan keterampilan analis. 5). Melakukan penetapan blangko atau kontrol dengan zat baku. 6). Melakukan penetapan paralel (in duplo atau in triplo). 2. Kesalahan Tidak Sistematik (indeterminate errors) Kesalahan tidak sistematik adalah penyimpangan yang tidak tetap dari hasil penentuan kadar dengan instrumen yang disebabkan fluktuasi dari instrumen yang dipakai (derau). Penyebab kesalahan ini tidak dapat ditentukan dan tidak dapat dikontrol maka kesalahan ini disebut juga kesalahan acak (random error) (Mulja & Suharman, 1995).

J. Keterangan Empiris Penyarian florotanin alga merah dilakukan dengan cara sokhletasi karena hasil dengan cara maserasi didapat ekstrak yang kurang memadai. Selain itu, florotanin cukup stabil oleh pemanasan dilihat dari sifat fisika-kimia monomernya


21

floroglusinol. Florotanin yang ditetapkan kadarnya adalah fraksi etil asetat yang diuapkan pelarutnya dan dianggap sebagai florotanin kasar. Metode Folin-Ciocalteau dapat digunakan untuk menetapkan konsentrasi gugus-gugus hidroksil fenolik dalam sampel. Metode ini tidak menyediakan data senyawa fenolik tertentu dalam ekstrak. Metode Folin-Ciocalteau berdasar atas kemampuan mereduksi gugus hidroksil pada fenol sehingga tidak spesifik namun sangat sensitif untuk mendeteksi semua kandungan senyawa polifenol dalam fraksi etil asetat alga merah yang ingin ditetapkan kadarnya, sehingga yang diukur adalah kadar total polifenol alga yang ekivalen dengan standar floroglusinol. Dipilih standar floroglusinol karena merupakan unit monomer florotanin.


BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk dalam penelitian deskriptif non-eksperimental karena tidak ada intervensi atau perlakuan terhadap fenomena yang diamati.

B. Variabel dan Definisi Operasional 1. Variabel Penelitian a. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah volume cairan penyari untuk mengisolasi florotanin alga merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville, tempat panen alga di pantai Drini, masa panen pada bulan Mei, komposisi reagen saat analisis. b. Varibel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah umur alga yang dipanen (bukan tanaman budidaya), suhu dan kelembaban ruangan saat percobaan. 2. Definisi operasional a. Laurencia papillosa (Forskal) Graville adalah spesies alga merah yang diambil dari pantai Drini, Gunung Kidul, Yogyakarta pada bulan Mei. b. Ekstrak metanol adalah hasil ekstraksi serbuk alga dengan sokhlet menggunakan pelarut metanol sampai jernih.

22


23

c. Florotanin kasar adalah ekstrak kasar florotanin dari fraksi etil asetat yang diuapkan pelarut (etil asetat) seluruhnya. d. Kadar florotanin adalah konsentrasi polifenol total dihitung ekivalen dengan floroglusinol (mg PGE/g sampel) yang diukur pada panjang gelombang maksimum 750,1 nm mendekati teoritis hasil penelitian Zhang et al. dengan metode Folin Ciocalteau. C. Bahan atau Materi Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah sebagai berikut: Alga merah (Laurencia sp.) dari pantai Drini, Gunung Kidul, Yogyakarta diambil tanggal 21 Mei 2007. Metanol, kloroform, etil asetat, natrium karbonat (p.a. E. Merck, Germany), reagen Folin Ciocalteau (Sigma Chem, Co., USA.), akuades (Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma).

D. Alat Penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian adalah sebagai berikut: Seperangkat spektrofotometer UV-VIS Perkin Elmer Lambda 20, timbangan elektrik BP 160 dan scaltec SBC 22 readability 0,01 mg, mesin blender, vaccum rotary evaporator (Buchi), waterbath (Abo-tech), autoklaf, mikropipet 100-1000 l. (Acura 825, Socorex), tabung reaksi bertutup (Scott-Germany), alat-alat untuk sokhletasi, yaitu sokhlet, labu alas bulat (Schott Duran, Germany), alat sentrifus, corong pisah 500 mL, alat-alat gelas yang lazim digunakan untuk penelitian di laboratorium analisis (PYREX-GERMANY)


24

E. Tata Cara Penelitian 1. Preparasi Sampel Alga Merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville Alga merah (Laurencia papillosa (Forskal) Graville) dikumpulkan, dicuci dengan air mengalir dan dimasukkan dalam autoklaf selama 30 menit pada suhu 100 0C. Selanjutnya dikeringkan dalam oven dengan suhu 80-100 0C selama 6 hari sampai dapat dihancurkan dengan kekuatan tangan, diserbuk dengan blender, diayak dan dipilih serbuk yang lolos dengan derajat halus 20/30.

2. Penetapan Kadar Air Serbuk Alga Penetapan kadar air serbuk alga dilakukan dengan menggunakan metode Karl Fischer. Serbuk alga ditimbang dengan seksama 0,2 gram, kemudian ditambah 10 mL metanol, didiamkan selama 1 hari pada suhu kamar. Dilakukan pre-titrasi pada alat, lalu dilakukan uji kebocoran sesuai prosedur perintah pada alat, hingga didapat angka drift 10-50 pada alat. Standardisasi dilakukan dengan cara timbang spuit berisi air, kemudian dimasukkan 1 tetes air ke dalam alat. Lalu ditimbang kembali untuk ditentukan berat air yang dimasukkan. Kemudian dihitung kesetaraan air. Sebanyak 1 mL metanol dimasukkan dan titrasi dengan alat (blangko). Kemudian 1 mL sampel dimasukkan, titrasi dengan alat, hitung kadar air dalam sampel. Kadar air dalam sampel dihitung dengan rumus:

Kadar air =

x - blanko (10) x 100 % berat yang ditimbang

x = angka yang muncul pada alat (%), berat yang ditimbang = mg.


25

3. Uji Kualitatif Senyawa Fenolik a. Uji pendahuluan Sebanyak 1 mL filtrat alga ditambah 10 mL air, dipanaskan selama 30 menit. Larutan disaring dengan kapas. Larutan berwarna kuning sampai merah menunjukkan adanya senyawa yang mengandung kromofor dengan gugus hidrofilik. Jika ditambah KOH, warna larutan kuning sampai merah menjadi lebih pekat. b. Uji polifenol Sebanyak 1 mL filtrat alga ditambah 3 tetes pereaksi besi (III) klorida. Jika terjadi warna hijau-biru menunjukkan adanya polifenol. c. Uji tanin (zat samak) Sebanyak 1 mL filtrat alga

ditambah 1 mL NaCl 2 %. Bila terjadi

suspensi (endapan) disaring melalui kertas saring. Filtrat alga ditambah 5 mL larutan gelatin 1 %. Terbentuknya endapan warna putih menunjukkan adanya tanin.

4. Isolasi Florotanin Kasar Serbuk alga ditimbang sebanyak 40 g. Kemudian serbuk dimasukan ke dalam kantong khusus untuk sokhlet dan dimasukan dalam labu sokhlet. Setelah itu diberi pelarut metanol sebanyak 2 kali sirkulasi (1 sirkulasi = 70 mL) dalam tabung sokhlet. Proses sokhletasi dilakukan sampai tetesan pelarut jernih dengan suhu 100-120 0C. Setelah selesai, hasil sokhletasi diuapkan pelarutnya dengan menggunakan vacuum rotary evaporator sampai volume


26

yang kecil (1/10 dari volume mula-mula) dan ditambahkan kembali pelarut metanol hingga diperoleh 60 mL ekstrak metanol, kemudian ditambahkan 120 mL kloroform, dan 45 mL air dalam corong pisah. Corong pisah digojog perlahan dan didiamkan hingga memisah dan membentuk 2 lapisan. Lapisan atas dan lapisan bawah yang terbentuk dipisahkan, selanjutnya lapisan atas diekstraksi dalam corong pisah dengan etil asetat masing-masing sebanyak 75mL. Kumpulkan fraksi etil asetat, selanjutnya diuapkan, dan diperoleh ekstrak yang merupakan florotanin kasar.

5. Optimasi Metode Kolorimetri dengan Folin-Ciocalteau a. Pembuatan larutan uji dan larutan standar i. Pembuatan larutan intermediet floroglusinol Ditimbang dengan cara seksama 0,05 g standar floroglusinol, kemudian dilarutkan ke dalam aseton 75 % sampai volume 50,0 mL. Buat seri konsentrasi (0,005; 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; dan 0,06) ppm sebanyak 10,0 mL dengan pelarut aseton 75 %. ii. Perlakuan fraksi etil asetat alga merah Ditimbang dengan cara seksama 0,05 g fraksi polifenol, kemudian dilarutkan ke dalam aseton 75 % hingga volumenya 50,0 mL. b. Penetapan Operating Time (OT) Pipet 0,5 mL larutan intermediet 0,03 ppm dan dimasukkan ke dalam labu takar 50,0 mL yang mengandung 2,5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteau


27

yang telah diencerkan dengan akuades 1:1. Didiamkan selama 2 menit, kemudian ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9 M, dicampurkan sampai volume 50,0 mL dengan akuades. Operating time diukur dengan spektrofotometer visibel. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang teoritis hasil reaksi floroglusinol dengan Folin Ciocalteau (750 nm). c. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (

maks)

Pipet 0,5 mL larutan intermediet (0,01; 0,03; dan 0,06) ppm dan masukkan ke dalam labu takar 50,0 mL yang mengandung 2,5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteau yang telah diencerkan dengan akuades 1:1. Didiamkan selama 2 menit, kemudian ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9 M, dicampurkan sampai volume 50,0 mL dengan akuades. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu kamar selama OT (pada 15 menit pertama dan 15 menit kedua, campuran tersebut divortex selama 30 detik). Kemudian campuran reaksi disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit. Kemudian ketiga larutan tersebut di-scanning pada rentang panjang gelombang 400-900 nm dengan spektrofotometer visibel untuk melihat panjang gelombang maksimumnya.

6. Validasi Metode Analisis Pipet 0,5 mL untuk masing-masing larutan intermediet dan masukkan ke dalam labu takar 50,0 mL yang mengandung 2,5 mL pereaksi fenol FolinCiocalteau yang telah diencerkan dengan akuades 1:1. Didiamkan selama 2 menit,


28

kemudian ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9 M, dicampurkan sampai volume 50,0 mL dengan akuades. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu kamar selama OT untuk menyempurnakan reaksi sampai terbentuk warna biru (pada 15 menit pertama dan 15 menit kedua, campuran tersebut divortex selama 30 detik). Kemudian campuran reaksi disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum hasil scanning (

maks)

menggunakan spektrofotometer visibel. Ditentukan persamaan

kurva baku plot antara kadar baku floroglusinol dan absorbansi. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali untuk dihitung recovery, kesalahan sistematik, kesalahan acak dengan rumus sebagai berikut: Recovery =

kadar terukur × 100 % kadar sebenarnya

Kesalahan sistematik = 100 % – recovery Kesalahan acak =

standar deviasi (SD) × 100 % rata - rata kadar terukur

7. Pengukuran Kadar Polifenol Total a. Perlakuan pada larutan standar floroglusinol Pipet 0,5 mL untuk masing-masing larutan intermediet dan masukkan ke dalam labu takar 50,0 mL yang mengandung 2,5 mL pereaksi fenol FolinCiocalteau yang telah diencerkan dengan akuades 1:1. Didiamkan selama 2 menit, kemudian ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9 M, dicampurkan sampai volume 50,0 mL dengan akuades. Campuran tersebut diinkubasi


29

pada suhu kamar selama OT untuk menyempurnakan reaksi sampai terbentuk warna biru (pada 15 menit pertama dan 15 menit kedua, campuran tersebut divortex selama 30 detik). Kemudian campuran reaksi disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum hasil scanning (

maks)

menggunakan spektrofotometer visibel. b. Perlakuan fraksi etil asetat alga merah Pipet 10,0 mL larutan sampel alga merah dan dimasukkan ke dalam labu takar 50,0 mL yang mengandung 2,5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteau yang telah diencerkan dengan akuades 1:1. Didiamkan selama 2 menit, kemudian ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9 M, dicampurkan sampai volume 50,0 mL dengan akuades. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu kamar selama OT jam untuk menyempurnakan reaksi sampai terbentuk warna biru (pada 15 menit pertama dan 15 menit kedua, campuran tersebut divortex selama 30 detik). Kemudian, campuran reaksi disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum hasil scanning (

maks)

menggunakan

spektrofotometer visibel. Konsentrasi polifenol total dihitung ekivalen dengan floroglusinol (mg PGE/g sampel). Prosedur ini dilakukan sebanyak 3 kali replikasi dengan masing-masing replikasi ditetapkan sebanyak 2 kali dengan cara 2 kali pemipetan (duplo).


30

F. Analisis Hasil Analisis hasil dilakukan untuk mengetahui validitas metode yang digunakan dalam penelitian. Validitas metode dilihat dari beberapa parameter dengan mengacu rentang nilai yang dipersyaratkan Harmita (2004), sebagai berikut: 1. Akurasi Akurasi dinilai berdasarkan hasil perolehan kembali (recovery) dan kesalahan sistematik. Akurasi dikatakan baik jika nilai perolehan kembali rata-rata (mean recovery) berada dalam rentang 80-110 % jika konsentrasi analit yang diperiksa adalah 1 ppm (0,0001 %) dengan nilai kesalahan sistematik yang diterima <20 % (Harmita, 2004). Recovery dan kesalahan sistematik dihitung dengan rumus sebagai berikut: Recovery =

kadar terukur × 100 % kadar sebenarnya

Kesalahan sistematik = 100 % – recovery 2. Presisi Penilaian presisi berdasarkan nilai kesalahan acak atau coefficient of variation (CV). Presisi dikatakan baik jika nilai CV lebih kecil dari 4,1 % untuk rentang recovery yang dapat diterima 85-115 % (Harmita, 2004). Kesalahan acak diperoleh dengan rumus : Kesalahan acak =

standar deviasi (SD) × 100 % rata - rata kadar terukur


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Pengambilan Sampel Sampel alga merah didapat dari hasil panen petani setempat pada tanggal 21 Mei 2007 dari perairan dangkal pantai Drini, Gunung Kidul, Yogyakarta. Secara geografis berada di wilayah samudera Indonesia, pantai selatan pulau Jawa. Suhu perairan habitat laut alga sekitar 27-30 0C. Umur alga merah yang dipanen tidak diketahui pasti karena bukan merupakan hasil budidaya melainkan merupakan hasil panen langsung dari alam, meski informasi tentang perbedaan umur, masa panen, kondisi geografis habitat alga tumbuh dan spesies alga ini penting untuk diperhatikan karena dapat memberikan variasi kandungan polifenol alga. Selanjutnya jenis spesies alga merah yang didapat diidentifikasi dengan bantuan dari pihak laboratorium Sistematika Tumbuhan (Fakultas Biologi UGM, Yogyakarta). Hasil identifikasi, sampel alga merah termasuk dalam ordo Ceramiales, familia Rhodomelacaeae, genus Laurencia, spesies Laurencia papillosa (Forskal) Graville (lihat lampiran 1).

B. Preparasi Sampel Alga merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville Alga merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville dikumpulkan, dicuci dengan air tawar mengalir sebanyak dua kali untuk menghilangkan kotoran berupa debu, pasir (silikat), material laut bukan berasal dari alga merah yang ikut

31


32

terbawa dan mengotori sampel alga merah. Langkah pencucian ini perlu dilakukan dengan cermat agar pengotor tidak mengotori sampel yang ingin diteliti. Senyawa silikat juga dapat membentuk kompleks molibdat dari reagen Folin dalam suasana asam. Bentuk kompleks asam molibdat yang terbentuk H6[SiMo12O40].n H2O (Auterhoff & Knabe, 1978). Setelah itu, dilakukan langkah sortasi atau penyortiran terhadap alga yang dipanen agar materi dari jenis alga spesies lain atau bahan organik asing tidak tercampur dengan sampel alga merah karena alga tumbuh bersama-sama dalam satu habitat dengan alga atau rumput laut yang berbeda spesies juga, tidak hanya dalam bentukan populasi. Sampel yang didapat benar-benar merupakan alga merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville dilihat dari ciri morfologisnya. Bagian akar alga dibuang dengan pisau atau gunting karena alga umumnya berakar pada suatu karang sehingga bagian akarnya dibuang agar materi asing dari batu karang tidak ikut dan mengganggu hasil analisis. Secara umum tujuan sortasi untuk meminimalkan keberadaan materi organik asing karena materi organik maupun organic dust ini dapat menggangu hasil analisis. Organic dust ini dapat turut mereduksi kompleks asam dalam reagen membentuk warna kehijauan sesuai laporan penelitian Otto Folin. Namun hal ini tidak banyak memberi pengaruh pada hasil analisis, mengingat reagen FolinCiocalteau sendiri mengandung banyak stabilizer untuk mengatasi berbagai ketidakstabilan dari reagen termasuk karena organic dust ini, kandungan bromin dari reagen dapat menghilangkan hasil reduksi ini, sehingga tidak lagi membentuk warna menyerupai tinta kehijauan (Wu, 1920).


33

Selain itu, pada pengamatan saat dilakukan sortasi terdapat senyawa berupa kalsium seperti butiran kapur berwana putih yang melingkupi daerah sekitar thallus alga, kalsium ini merupakan produk alamiah alga yakni hasil kalsifikasi. Kalsium yang masih ada setelah dilakukan sortasi tidak akan mengganggu analisis. Senyawa Ca ini bukanlah reduktor sehingga praktis tidak mampu memiliki kemampuan mereduksi kompleks asam molibdat-fosfat pada reagen Folin-Ciocalteau yang digunakan. Setelah lolos proses sortasi maka ganggang merah diproses dalam autoklaf selama 30 menit pada suhu 100 0C untuk mendenaturasi protein yang ada dalam ganggang termasuk enzim polifenol oksidase atau Polyphenol Oxydase (PPO). Efek perlakuan panas terhadap aktivitas PPO menunjukkan pemberian suhu menyebabkan meningkatnya kecepatan reaksi antara enzim dan senyawa fenolik sebagai substratnya. Perlakuan pada 55 0C, membuat enzim inaktif secara parsial. PPO telah dilaporkan menjadi inaktif dengan direbus dalam air panas pada 100 0C selama 1,5 menit (Mustapha & Ghalem, 2007). Enzim PPO ini mengkatalisis hidroksilasi dari monofenol menjadi odifenol. Lebih lanjut, dapat mengkatalisis oksidasi o-difenol untuk membentuk okuinon. Proses polimerisasi o-kuinon ini cepat berlangsung menghasilkan pigmen berupa senyawa polifenol. Jika enzim PPO inaktif maka proses polimerisasi fenol tidak lagi berlangsung, membentuk polimer polifenol yang lebih panjang. Secara sederhana digambarkan pada gambar 6 (Sullivan et al., 2003).


OH

34

O

OH

O

OH

O

O Enzim PPO

Enzim PPO

o-kuinon

Gambar 6. Proses oksidasi fenol oleh enzim polifenol oksidase (PPO)

Hasil autoklaf dijadikan simplisia dengan cara dikeringkan dalam oven selama beberapa hari pada suhu 90 0C, agar menjadi simplisia alga merah kering dengan tingkat kekeringan tertentu sehingga mudah untuk dihancurkan dengan tangan kemudian diserbuk dengan alat blender bermotor. Alga harus benar-benar kering agar didapat partikel yang serbuk yang cukup halus. Kadar air atau lembab yang semakin rendah maka sel-sel tanaman alga menjadi lebih rapuh terhadap kekuatan mekanis mesin blender sehingga lebih mudah untuk dihaluskan menjadi serbuk. Derajat kehalusan serbuk yang diambil 20/30 dengan cara pengayakan agar diperoleh ukuran partikel serbuk yang lebih homogen dan partikel yang tidak terlalu besar atau kecil. Ekstraksi akan bertambah baik bila luas permukaan area spesifik serbuk simplisia yang kontak dengan cairan penyari semakin luas sehingga meningkatkan

efisiensi

ekstraksi serbuk simplisia alga. Sementara partikel

serbuk yang terlalu halus juga tidak menguntungkan karena dapat menyebabkan flogging (partikel-partikel kecil menyumbat pori-pori yang ada) pada filter saat sokhletasi sehingga proses ekstraksi serbuk alga menjadi terhambat. Selanjutnya dilakukan penetapan kadar air serbuk alga dilakukan dengan metode Karl Fischer karena metode ini spesifik mengukur

kadar air dalam analit


35

dan sensitif untuk mengukur sampel dalam jumlah yang sedikit serta akurat. Kadar air dari serbuk alga merah yang terukur dengan metode ini: • Replikasi I

: 8,53%

• Replikasi II

: 6,00 %

• Replikasi III

: 5,97 %

Hasil penetapan kadar air adalah 6,83 ± 1,469 %, masih memenuhi syarat atau masih di bawah 10 % sehingga dapat diterima sebagai simplisia kering untuk selanjutnya diekstraksi dengan cara sokhletasi. Hasil penetapan kadar air pada replikasi I berbeda jauh dari kadar yang didapat pada replikasi II dan III dimungkinkan oleh sampel yang menyerap lembab sebelum dilakukan analisis dengan Karl Fischer. Penetapan kadar air dengan metode Karl Fischer berdasar atas reaksi redoks antara SO2 dan I2 menghasilkan garam asam hidroiodat dan garam alkil sulfat. Reaksi redoks ini hanya berlangsung dengan adanya air seperti gambar 7, reaksi di bawah ini (Evans, 2002).

Gambar 7. Reaksi saat penetapan kadar air dengan Karl Fischer

Tujuan pengontrolan kandungan lembab di bawah 10 % ini untuk menekan pertumbuhan mikroba yang mampu menguraikan kandungan organik


36

ganggang sebagaimana yang disyaratkan dalam MMI (Materia Medika Indonesia) untuk simplisia tanaman umumnya.

B. Hasil Uji Kualitatif 1. Uji pendahuluan Pada prosedur pengujian ini filtrat alga ditambah air, dipanaskan selama 30 menit untuk menarik semua senyawa yang cukup polar termasuk polifenol yang larut air. Larutan disaring dengan kapas agar bagian yang tak larut air tidak mengotori analit. Hasil berwarna kuning sampai merah menunjukkan adanya senyawa yang mengandung kromofor (flavonoida, antrakuinon, senyawa fenolik lainnya) dengan gugus hidrofilik (gula, asam, fenolat, dan sebagainya). Hasil diperkuat dengan penambahan KOH, warna larutan menjadi lebih intensif. Karena senyawa fenolik mudah sekali teroksidasi dalam basa yang membuat warna lebih intensif seperti reaksi pada gambar 8 di bawah (Krumholz & Bryant, 1988). OH

HO

KOH

HO

OH

OH

HO

OH

Gambar 8. Reaksi uji pendahuluan senyawa floroglusinol dan KOH

Uji pendahuluan ini dilakukan untuk mengetahui kandungan senyawa fenolik dalam alga merah termasuk kandungan senyawa polifenol alga yang


37

memiliki banyak gugus-gugus fenolik dengan floroglusinol sebagai monomer. Hasil pengamatan sampel serbuk Laurencia papillosa (Forskal) Graville menunjukkan hasil positif mengandung senyawa fenolik, seperti tabel I berikut. Tabel I. Hasil uji pendahuluan kandungan senyawa fenolik Laurencia papillosa (Forskal) Graville

Perlakuan

Warna hasil reaksi

Pemanasan 30 menit

kuning pucat (+)

+ KOH

kuning lebih gelap (+)

2. Uji polifenol Sebanyak 1 mL filtrat alga ditambah 3 tetes pereaksi besi (III) klorida. Jika terjadi warna hijau-biru menunjukkan adanya polifenol. Hal ini disebabkan oleh terbentuknya kompleks ion Fe3+ dan gugus-gugus fenol yang membentuk kompleks warna hijau-biru seperti pada gambar 9 (Krumholz & Bryant, 1988).

OH O

6

+ FeCl3

OH

OH Fe3+

O

O

+ 3 HCl

OH

Gambar 9. Reaksi pembentukan kompleks gugus fenolik dan FeCl3

Uji polifenol ini memperkuat bukti adanya kandungan polifenol alga atau florotanin dalam Laurencia papillosa (Forskal) Graville. Hasil pengamatan


38

sampel serbuk Laurencia papillosa (Forskal) Graville menunjukkan hasil positif mengandung senyawa polifenol, seperti tabel II berikut.

Tabel II. Hasil uji kandungan senyawa polifenol Laurencia papillosa (Forskal) Graville

Warna sebelum reaksi Kuning pucat

Warna sesudah reaksi Biru gelap di bagian tengah (+)

3. Uji tanin (zat samak) Penambahan NaCl 2 % dimaksudkan untuk menghilangkan protein agar tidak terjadi reaksi positif palsu sehingga jika terjadi endapan protein maka disaring. Kemudian filtrat alga diberi gelatin jika hasil positif akan membentuk endapan karena tanin mampu menyamak kulit. Terbentuknya endapan menunjukkan adanya tanin yang inkompatibel dengan gelatin dalam HCl atau NaCl. Tanin memiliki afinitas yang kuat terhadap gelatin sehingga gelatin mengalami presipitasi (Thomas & Frieden, 1923). Alasan dilakukan uji tanin karena secara kimia tanin dan florotanin mirip sehingga florotanin dapat memberikan hasil positif juga terhadap uji tanin. Hasil pengamatan sampel serbuk Laurencia papillosa (Forskal) Graville menunjukkan hasil positif mengandung senyawa tanin, ada sedikit endapan putih di dasar. C. Isolasi Florotanin Kasar Serbuk alga yang ditimbang sebesar 40,004 g untuk selanjutnya diekstraksi dengan cara sokhletasi. Proses sokhletasi dilakukan sampai pelarut metanol pengekstraksi jernih untuk memastikan semua senyawa yang relatif polar


39

dapat ditarik dalam ekstrak metanol. Total lama proses sokhletasi selesai dilakukan selama 34 jam dan 5 menit ditandai dengan jernihnya metanol yang menyari serbuk alga di tabung sokhlet. Setelah selesai, hasil sokhletasi diuapkan pelarutnya dengan menggunakan vacuum rotary evaporator sampai volume yang kecil (1/10 dari volume mula-mula) agar diperoleh ekstrak yang lebih pekat konsentrasinya. Ekstrak metanol pekat ditambahkan metanol hasil kondensasi vacuum rotary evaporator hingga diperoleh 60 mL ekstrak metanol agar diperoleh proses fraksinasi dengan komposisi pelarut yang konstan. Selanjutnya ekstrak metanol ditambah 120 mL kloroform, dan 45 mL air. Terjadi pemisahan 2 lapisan antara lapisan atas dengan berat molekul (BM) lebih ringan yakni fraksi metanol-air yang membentuk ikatan hidrogen dan lapisan bawah adalah kloroform. Metanol-air lebih mudah menarik fraksi relatif polar seperti florotanin sehingga yang diambil adalah lapisan atas. Alasan pemilihan pelarut metanol karena metanol memiliki gugus hidroksil yang memungkinkan membentuk ikatan hidrogen intramolekuar dengan gugus hidroksil yang ada pada senyawa fenolik dan meningkatkan kelarutan polifenol dalam pelarut metanol. Sementara pelarut non polar seperti kloroform, digunakan untuk membuang lipid pada ekstrak metanol (Padda, 2006). Selanjutnya lapisan atas diekstraksi dengan etil asetat sebanyak dua kali agar semua fraksi florotanin dapat ditarik dengan lebih sempurna mengingat proses penarikan secara berulang jauh lebih efektif dibandingkan dengan sekali penarikan dengan volume penyari lebih besar sekaligus. Florotanin yang dapat ditarik dalam fraksi etil asetat dikumpulkan dan diuapkan etil asetatnya sehingga


40

diperoleh florotanin kasar yang akan menjadi analit untuk ditetapkan kadar polifenol totalnya dengan menggunakan reagen fenolik Folin-Ciocalteau.

D. Dasar Reaksi Kolorimetri dengan Folin-Ciocalteau Reagen yang digunakan adalah Folin-Ciocalteau (F-C) yang dalam kondisi stabil sebelum reaksi berwarna kuning dalam suasana asam. Reaksi F-C ini melibatkan reaksi antara ion fenolat dengan kompleks ion polimerik dari asamasam fosfomolibdat dan fosfotungstat (Anonim, 2006). Warna biru produk berasal dari oksidasi fenolat, dan asam heteropoli tereduksi secara parsial dari +6 menjadi campuran kondisi valensi +6 dan +5 menghasilkan produksi kompleks molibdenum-tungsten biru (Singleton & Rossi, 1965). Bagian reagen yang paling aktif dari reagen ini adalah molibdat sehingga kompleks warna yang terbentuk disebut molybdenum blue. Dalam bentuk tunggal, molibdat akan menjadi sukar larut dan membentuk koloidal (Auterhoff & Knabe, 1978). Oleh karena itu, molibdat dicampur dalam bentuk garam NaMolibdat dan diberikan asam fosfat (H3PO4) membentuk kompleks asam fosfomolibdat. Selain kompleks dengan fosfat, diketahui bahwa senyawa seperti arsenat, wolframat, silikat juga mampu membentuk kompleks asam dengan molibdat. Misalnya, jika membentuk kompleks dengan arsen maka kompleks asam yang terbentuk disebut arsenomolibdat. Reagen aktif F-C tersusun atas larutan asam berwarna kuning yang mengandung kompleks ion polimerik yang dibentuk dari asam heteropoli


41

(Singleton & Rossi, 1965). Asam heteropoli yang ada pada reagen F-C adalah asam tungstat dan asam molibdat. Kenyataanya reagen ini mengandung seri atau rangkaian polimerik yang memiliki bentukan umum dengan pusat atau sentral unit tetrahedral fosfat (PO43-) dikelilingi oleh beberapa unit oktahedral asam-oksi molibdenum. Struktur tungsten dapat dengan bebas bersubstitusi dengan molibdenum (Singleton & Rossi, 1965). Florotanin berupa polimer dengan unit monomernya floroglusinol memiliki 3 gugus hidroksil. Gugus hidroksil ini cukup reaktif dan merupakan pengarah orto, para dalam proses sintesis. Ketiga gugus hidroksil floroglusinol berada pada posisi meta, sehingga posisi orto dan para masih kosong dan akan mudah dioksidasi sehingga posisi posisi para, orto terisi oleh gugus hidroksil juga. Florotanin dan polifenol lainnya sangat tidak stabil dalam kondisi basa karena akan teroksidasi membentuk ion fenolat (C6H6O-) dan berlanjut akan membentuk senyawa kuinoid yang dapat membuat warna pigmen semakin intens biasanya berwarna kecoklatan. Susana basa saat reaksi diberikan oleh natrium karbonat, sehingga semua senyawa fenolik akan teroksidasi menjadi ion fenolat. Dan ion fenolat inilah yang akan mereduksi kompleks asam heteropoli dari fosfotungstat dan fosfomolibdat membentuk produk berwarna biru. Reduksi yang sempurna dari reagen ke status valensi yang lebih rendah merusak warna asalnya. Sifat alamiah sesungguhnya dari complex blue pigments hingga saat ini masih belum dapat dipastikan. Prinsip pembentukan pigmen biru


42

ini digunakan dalam analisis sebagai metode kolorimetri yang sudah lama diketahui (Singleton & Rossi, 1965). Warna biru yang dihasilkan setara dengan konsentrasi fenolat yang terbentuk artinya semakin besar konsentrasi senyawa fenolik maka semakin banyak pula ion fenolat yang terbentuk dan reagen F-C semakin rusak oleh reduktor dan warna biru yang dihasilkan semakin pekat setara dengan konsentrasi ion fenolat sehingga dapat dianalisis dengan spektrofotometer. Kompleks asam dari reagen F-C ini akan tereduksi membentuk produk yang berwarna dengan adanya suatu reduktor. Reagen F-C sendiri dapat bertindak sebagai agen pengoksidasi (oksidator). Reaksi Reduksi asam fosfomolibdat: H3PMo12O40 + 4e + 4 H+

H7[PMo12O40]

(Auterhoff & Knabe, 1978)

Reaksi Oksidasi fenol: O

OH

+ H2 O

oksidator

+ 4 H + + 4e

O

(C6H5OH)

(McMurry, 2004)

(C6H4O2)

Saat analisis terjadilah kesetimbangan reaksi redoks dari reagen F-C dan senyawa fenolik (gambar 10). O

OH

+ H7[PMo12O40]

+ H2O + H3PMo12O40

O

(C6H5OH)

(C6H4O2)

(senyawa biru)

Gambar 10. Reaksi redoks dalam reaksi Folin-Ciocalteau


Gugus fenol teroksidasi dengan cepat dalam larutan cukup basa

43

dan

menghasilkan ion-ion fenolat dalam konsentrasi cukup. Reagen F-C dan pigmen biru yang terbentuk tidak stabil dalam larutan basa. Reaksi melibatkan pengrusakkan reagen kuning yang aktif. Kebanyakan senyawa fenolik terionisasi sekitar 50 % pada pH 9-10. Karena porsi yang terionisasi bereaksi dengan reagen folin kesetimbangan akan bergeser dan akan lebih banyak lagi fenolat yang dihasilkan. Dibutuhkan waktu untuk reaksi ini untuk dapat mendekati sempurna. Reagen F-C harus tetap bertahan dalam kondisi basa, agar dapat bereaksi dengan semua fenolat. Untuk pertimbangan ini dibutuhkan kondisi optimum untuk alasan produksi reaksi yang cepat dan retensi waktu yang panjang untuk warna maksimum akan mencakup pertimbangan reagen fosfo-molibdo-tungstat kadar tinggi dan alkalinitas yang sedang (Singleton & Rossi, 1965). Terdapat banyak variasi dalam penggunaan metode Folin-Ciocalteau ini sendiri. Variasi yang ada mencakup perbedaan dalam pemilihan referensi standar, lama pemanasan reaksi, suhu, dan perbedaan hasil pengukuran panjang gelombang (Anonim, 2006). Referensi standar yang umum digunakan untuk analisis kandungan polifenol adalah asam galat, asam tanat, keursetin yang umum digunakan untuk sampel flavonoid dan floroglusinol. Alasan pemilihan standar floroglusinol adalah karena secara teoritis floroglusinol merupakan unit monomer florotanin alga. Diperkuat oleh hasil penelitian Zhang et al. (2006), didapat hasil pembacaan panjang gelombang maksimum produk berwarna kebiruan dari metode Folin-Ciocalteau, pada sampel alga A. nodosum dan baku floroglusinol sama-sama berada pada panjang


44

gelombang 750 nm atau adanya kesamaan karakteristik antara florotanin dengan baku floroglusinol saat direaksikan dengan reagen F-C.

E. Optimasi Metode Kolorimetri dengan Folin-Ciocalteau 1. Penetapan Operating Time (OT) Penentuan Operating Time (OT) sangat penting dalam pengukuran dengan metode analisis menggunakan prinsip kolorimetri karena warna hasil reaksi yang dihasilkan tidak selamanya stabil. Maka dari itu, perlu dicari rentang waktu setelah reaksi berlangsung agar hasil yang didapat memberikan absorbansi yang tetap stabil tidak menaik atau menurun nilainya agar data yang dihasil tetap reprodusibel dan valid. Jika telah diketahui rentang Operating Time (OT) maka pembacaan absorbansi hasil reaksi pada baku dan sampel harus dilakukan pada rentang OT yang telah diketahui. Dari hasil pembacaan OT, maka disimpulkan bahwa pada menit ke 50 hingga menit ke 90, reaksi menunjukkan nilai absorbansi yang stabil. Hal ini sesuai dengan yang diutarakan Singleton & Rossi (1965) pada pembahasan sebelumnya, dibutuhkan waktu bereaksi yang relatif panjang namun stabil sehingga untuk prosedur pembacaan absorbansi standar dan sampel selanjutnya dilakukan pada rentang OT yaitu menit ke 50-90. Hasil pembacaan OT standar floroglusinol sebagai berikut (gambar 11).


45

ABSORBANCE 0,600

0,500

0,400

0,300

0,200

0,100

Gambar 11. Hasil pembacaan OT floroglusinol kadar 3,0 ppm dengan pereaksi Folin Ciocalteau

2. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (

maks)

Panjang gelombang maksimum adalah panjang gelombang suatu senyawa mempunyai nilai absorbansi yang maksimum. Pembacaan absorbansi pada


46

panjang gelombang maksimum akan memberikan sensitivitas dan presisi analisis yang maksimal (Mulja & Suharman, 1995). Zhang et al. (2006) telah melakukan penelitian tentang estimasi kandungan polifenol total pada sampel rumput laut dan ekstraknya berdasarkan reaksi Folin-Ciocalteau. Mereka mendapatkan panjang gelombang maksimum untuk standar floroglusinol dan sampel A. nodosum adalah 750 nm. Karena itu, penentuan

maks

dilakukan pembacaan absorbansinya pada rentang 400-900 nm

agar dapat melihat puncak spektrum yang lebih jelas di sekitar 750 nm sebagai panjang gelombang teoritis. Digunakan 3 macam kadar baku floroglusinol untuk mengetahui panjang gelombang maksimum yakni dengan membaca spektrum plot panjang gelombang dan absorbansi senyawa hasil reaksi antara reagen Folin-Ciocalteau dengan baku floroglusinol kadar kecil 0,1 ppm, kadar tengah 0,3 ppm, kadar terbesar 0,6 ppm. Hasil yang didapat menunjukkan 3 puncak absorbansi maksimum pada panjang gelombang yang berbeda, yakni pada 0,1 ppm didapat didapat

maks

750,1 nm; dan 0,6 ppm didapat

maks

maks

758,7 nm; 0,3 ppm

743,4 nm.

Ada kecendrungan semakin besar konsentrasi baku floroglusinol maka panjang gelombang cendrung bergeser ke panjang gelombang yang lebih kecil. Artinya pada konsentrasi semakin kecil maka panjang gelombang semakin bergeser ke arah yang lebih besar. Ini dimungkinkan oleh ionisasi fenolik menjadi ion fenolat sehingga mampu mengabsorpsi cahaya pada tingkat energi lebih kecil atau panjang gelombang lebih besar.


47

Pada konsentrasi kecil, dengan suasana basa tetap dari Na2CO3 1,9 M maka lebih mudah mengoksidasi floroglusinol menghasilkan ion fenolat yang memiliki muatan negatif penuh pada oksigen (ion fenolat), yang dapat berinteraksi dengan cincin lebih efektif dari pasangan elektron bebas yang ada pada molekul tak terionkan sehingga meningkatkan intensitas absorpsi cahaya dan posisi

maks

berpindah ke panjang gelombang lebih panjang (Cairns, 2005).

absorbance unit(au) λ (wavelength)

Gambar 12. Hasil pembacaan maks floroglusinol 3 macam kadar floroglusinol: 1,0; 3,0 dan 6,0 ppm setelah direaksikan dengan Folin Ciocalteau

Dengan didapat 3 panjang gelombang maka seri baku telah dicobakan untuk dibaca pada ketiga panjang gelombang ini dan hasilnya absorbansi yang terbaca tidak berbeda jauh. Namun dipilih panjang gelombang tengah 750,1 nm


karena paling mendekati

maks

48

teoritis 750 nm, hasil reaksi floroglusinol dengan

reagen Folin-Ciocalteau (Zhang et al., 2006). Sesungguhnya tidak ada panjang gelombang maksimal teoritis yang pasti untuk mengukur sampel florotanin karena bukan merupakan senyawa tunggal tetapi merupakan campuran heterogen polimer polifenol dengan unit monomer berupa floroglusinol.

F. Hasil Validasi Metode Analisis Untuk mengetahui validitas metode Folin-Ciocalteau, maka dilakukan penetapan terhadap baku floroglusinol dengan replikasi sebanyak 3 kali pada panjang gelombang yang dipilih 750,1 nm dan didapat 3 persamaan kurva baku yang berbeda sebagai berikut:

Tabel III. Data replikasi seri baku floroglusinol Replikasi I Kadar floroglusinol Absorbansi (mg/100mL) 0,075 0,0512 0,138 0,1024 0,269 0,2048 0,405 0,3071 0,516 0,4095 0,648 0,5119 0,796 0,6143

Replikasi II Kadar floroglusinol Absorbansi (mg/100mL) 0,0553 0,070 0,1046 0,132 0,2091 0,257 0,3137 0,407 0,4182 0,514 0,5228 0,643 0,6274 0,712

Replikasi III Kadar floroglusinol Absorbansi (mg/100mL) 0,0504 0,074 0,1008 0,134 0,2016 0,255 0,3025 0,410 0,4033 0,506 0,5041 0,636 0,6049 0,724

Keterangan: Replikasi I : A = 0,0091; B = 1,265; r = 0,9996 Replikasi II : A = 0,0169; B = 1,182; r = 0,9968 Replikasi III : A = 0,0202; B = 1,198; r = 0,9980

Berdasarkan hasil perhitungan tabel di atas dapat dilihat bahwa nilai koefisien korelasi (r) untuk replikasi I (0,9996), replikasi II (0,9980) dan replikasi III (0,9966) lebih besar daripada r tabel dengan taraf kepercayaan 95 % dan df


49

(degrees of freedom) 5, yaitu 0,811 dan memenuhi persyaratan yaitu r hitung = 0,9996 (lebih besar dari 0,999). Hal ini berarti semua persamaan kurva baku tersebut mempunyai parameter linearitas yang baik dan dapat digunakan untuk menetapkan kadar florotanin dalam fraksi etil asetat Laurencia papillosa (Forskal) Graville. Parameter yang digunakan untuk menentukan validitas metode dalam penelitian ini adalah recovery, kesalahan sistematik dan kesalahan acak baku floroglusinol. Recovery dan kesalahan sistematik adalah parameter akurasi sedangkan kesalahan acak adalah parameter presisi. Berikut hasil mean recovery atau rata-rata recovery, rata-rata kesalahan sistematik, dan kesalahan acak atau CV yang didapat:

Tabel IV. Hasil validasi metode Folin-Ciocalteau

Kadar teoritis floroglusinol (ppm)

Rata-rata recovery (%) n = 3

Kesalahan acak (CV) (%)

0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0

Rata-rata kesalahan sistematik (%) n=3

90,67 95,90 98,72 105,51 100,26 101,29 97,97

10,60 3,22 1,63 3,07 2,22 2,29 3,03

11,69 3,35 1,65 2,91 2,21 2,26 3,09

Hasil perhitungan recovery dari tabel IV menunjukkan bahwa rata-rata recovery untuk semua seri kadar berada di dalam rentang recovery yang baik untuk bahan baku sebagai analit dengan kadar sekitar 1 ppm saat dianalisis, yaitu


50

80 – 110% (Harmita, 2004). Berdasarkan hasil ini berarti semua seri kadar memenuhi kriteria recovery yang baik. Kesalahan sistematik merupakan parameter lain untuk akurasi selain recovery. Nilai kesalahan sistematik yang baik dapat ditentukan dari rentang recovery dengan rumus: |P – 100%|, dengan P adalah nilai recovery. Rentang recovery yang baik adalah 80 – 110% dan berdasarkan rumus di atas didapatkan nilai kesalahan sistematik yang baik adalah

20%. Perhitungannya adalah sebagai

berikut : |80 % - 100 %| = 20 % dan |110 % - 100%| = 10 %. Hasil perhitungan kesalahan sistematik pada tabel IV menunjukkan nilai rata-rata kesalahan sistematik untuk semua seri kadar < 20 % atau memenuhi kriteria kesalahan sistematik yang baik. Hasil perhitungan kesalahan acak pada tabel IV menunjukkan bahwa seri kadar 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; dan 6,0 ppm memiliki nilai CV < 4,1 % yang disyaratkan untuk analisis yang baik dengan rentang recovery 85-115 % menurut sistem RSD (Relative Standard Deviation) (Harmita, 2004). Hanya kadar 0,5 ppm yang tidak memenuhi syarat karena CV-nya cukup besar yakni 11,69 %. Sementara menurut Mulja dan Hanwar (2003) presisi yang baik dinyatakan dengan nilai CV < 2 %, sehingga hanya 1 seri kadar yang memenuhi kriteria presisi yang baik, yaitu seri kadar 0,2 ppm yang memenuhi syarat ini. Hasil validitas dari recovery, kesalahan sistematik, kesalahan acak yang paling tidak memenuhi syarat pada pembacaan kadar 0,5 ppm. Hal ini dimungkinkan oleh sulitnya membuat konsentrasi baku terendah dalam seri baku


51

ini karena harus memipet volume yang cukup kecil 0,5 mL dari larutan stok baku sehingga risiko faktor kesalahannya paling besar. Persamaan kurva baku yang dipilih berdasar hasil recovery, kesalahan sistematik, kesalahan acak terbaik untuk penetapan kadar sampel adalah persamaan kurva baku replikasi I, yang paling baik dibandingkan replikasi II dan III. Persamaan ini dipilih karena nilai r-nya paling mendekati 1 dan intersep yang paling kecil. Nilai r yang mendekati 1 berarti ada korelasi antara peningkatan konsentrasi hasil reaksi floroglusinol dengan Folin-Ciocalteau dan kenaikan nilai respon absorbansi. Hubungan antara kadar floroglusinol dan nilai absorbansi dari persamaan baku yang dipilih (replikasi I) disajikan pada gambar 13 di bawah ini:

0,900 y = 1,265x + 0,0091 r = 0,9996

0,800 0,700 absorbansi

0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

Kadar floroglusinol (m g/100m L)

Gambar 13. Kurva baku hubungan kadar dan absorbansi floroglusinol setelah direaksikan dengan Folin Ciocalteau


52

G. Penetapan Kadar Florotanin Fraksi Etil Asetat Laurencia papillosa (Forskal) Graville Florotanin dalam crude phlorotannin dari fraksi etil asetat dilarutkan dalam aseton 75 % secara bertahap, karena selain dapat diekstraksi dengan alkohol, senyawa polifenol juga efektif ditarik dengan campuran aseton dan air yang juga relatif polar (Padda, 2006). Selain itu, kepentingan mengganti pelarut metanol dengan aseton saat penetapan kadar dengan Folin-Ciocalteau adalah agar tidak ada intervensi absorbansi warna dari pelarut karena alkohol masih memiliki gugus hidroksil (OH) yang cukup sensitif untuk mereduksi kompleks asam dalam reagen sehingga blangko juga nantinya akan dapat berwarna kebiruan, hal ini meningkatkan risiko kesalahan terhadap pembacaan nilai absorbansi analit yang didapat. Dengan menggunakan persamaan baku Y = 1,265 X + 0,0091 maka diperoleh data hasil pengukuran kadar florotanin fraksi etil asetat Laurencia

papillosa (Forskal) Graville menggunakan metode Folin-Ciocalteau, dengan replikasi 3 kali dan masing-masing replikasi dianalisis dengan duplo untuk mengurangi nilai kesalahan sistematik seperti yang disajikan pada tabel V:

Tabel V. Hasil penetapan kadar sampel florotanin kasar Laurencia papillosa (Forskal) Graville

Replikasi Kadar (mg PGE/g) (duplo) 1a 10,60 1b 10,45 2a 11,10 2b 11,25 3a 10,90 3b 10,95

Χ (mg PGE/g) 10,53 11,18 10,93


53

Kadar florotanin dalam fraksi etil asetat Laurencia papillosa (Forskal) Graville yang terukur dengan metode Folin-Ciocalteau ini adalah 10,55-11,21 mg PGE/g. Kadar florotanin yang didapat ini diestimasikan sebagai kadar polifenol total yang ekivalen dengan standar floroglusinol karena metode Folin-Ciocalteau ini tidak spesifik mengukur jenis polimer polifenol tertentu namun sangat sensitif terhadap seluruh senyawa yang memiliki gugus fenolik termasuk florotanin yang berupa campuran heterogen polifenol dengan tingkat polimer berlainan. Metode ini memiliki keunggulan dalam hal sensitivitasnya mengukur senyawa-senyawa yang memiliki gugus fenolik hingga tingkat part per million (ppm), memiliki reprodusibilitas dan linearitas yang baik, sederhana, hanya membutuhkan reagen Folin Ciocalteau dan kondisi basa, serta menghasilkan reaksi warna yang relatif cepat dan stabil dalam rentang waktu relatif panjang.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A.

Kesimpulan

1. Florotanin dapat diisolasi dari alga merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville untuk diukur dengan metode Folin Ciocalteau. 2. Kadar florotanin dalam fraksi etil asetat Laurencia papillosa (Forskal) Graville yang terukur dengan metode Folin-Ciocalteau adalah 10,55-11,21 mg PGE/g.

B.

Saran

1. Perlu dilakukan analisis terhadap struktur kimia florotanin apa saja yang terkandung dalam fraksi etil asetat dengan spektrofotometer IR dan GC-MS. 2. Perlu dilakukan langkah optimasi kondisi prosedur metode Folin-Ciocalteau dalam skripsi ini seperti pH dan suhu saat reaksi agar diperoleh hasil scan panjang gelombang maksimum yang sama untuk tiap konsentrasi baku. 3. Perlu dibandingkan validitas metode penetapan kadar dengan metode FolinCiocalteau ini dengan metode analisis senyawa fenolik lainnya seperti dengan AlCl3, FAS (Ferri Amonium Sitrat).

54


55

DAFTAR PUSTAKA Ahn, M. J., Yoon, K. D., Min, S.Y., Lee, J. K., Kim, J.H., Kim, T. G., Kim, S.H., Kim, N.G., Huh, H., and Kim, J., 2004, Inhibition of HIV-1 reverse transcriptase and protease by Phlorotannins from the brown alga Ecklonia cava, Biol. Pharm. Bull., 27(4), 544-547. Amin, Al, Razali, 1997, Kajian Kepelbagaian dan Taburan Rumpai Laut di Sekitar Desaru, Johor, Fakulti Sains Hayatuniversiti Kebangsaan Malaysia Bangi, pkukmweb.ukm.my/~ahmad/botani/amin.html, diakses tanggal 1 November 2007. Anonim , 1978, Marine Natural Products : Chemical and Biological Perspectives Vol. I, diedit oleh Paul J. Scheuer, 118-119, Academic press, New York. Anonim, 1979, Farmakope Indonesia, Edisi III, 4, Depkes RI, Jakarta. Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 11-25, Depkes RI, Jakarta. Anonim, 1989, The Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals Drugs and Biological, 1169, 11th Ed., Merck Inc., New York. Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, 1157, Depkes RI, Jakarta. Anonim, 2001, Product Development, Dry Creek Nutrition, www.activin.com/ DCNI Template.htm, diakses tanggal 27 Agustus 2007. Anonim, 2005, United State Pharmacopeia 28, 2749-2751, United State Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville. Anonim, 2006, Dietary Supplements Methods Executive Summary July 2006, AOAC International, www.aoac.org/dietsupp6/Dietary-Supplement-website/Jul2006.htm, diakses tanggal 13 November 2007. Athukorala, Y., Kim, K.N., and Jeon,Y.J., 2006, Antiproliferative and Antioxidant Properties of An Enzymatic Hydrolysate from Brown Alga Ecklonia cava, J.Fd.Chem.Toxicol., 44(7), 1065-1074. Auterhoff, H. and Knabe, J., 1978, Lehrbuch der Pharmazeutischen Chemie, 103, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Mbh., Stuttgart. Blunt, J.W., Copp, B.R., Munro, M.H.G., Northcotec, P.T. and Prinsep, M.R., 2006, Marine natural products, Nat. Prod. Rep., 22, 15. Burtin, P., 2003, Nutrional Value of Algas , Electron. J. Environ. Agric. Food Chem., France, 2 (4) , 498-500.


56

Box, J.D., 1983, Investigation of the Folin-Ciocalteu Phenol Reagent for the Determination of Polyphenolic Substances in Natural Waters, Water Res., 17, 511–525. Christian, G. D., 2004, Analytical Chemistry, Sixth Edition, 65, 66, 483, 484, John Wiley & Sons, Inc., United States of America. Cairns, D., 2005, Essentials of Pharmaceutical Chemistry, Second Edition, 151159, Pharmaceutical Press, London. Dahuri, R., 2003, The role of Marine Biotechnology in the Development of Marine Biomedical Product, Proceedings of International Symposium on Biomedicine, 18-19 September, 2003, 1-5, IPB, Bogor. Day, R. A. dan Underwood, A. L., 1986, Analisis Kuantitatif, Edisi V, 389-392, diterjemahkan oleh Aloysius Hadyana Pudjaatmaka, Penerbit Erlangga, Jakarta. Evans, W.C., 2002, Trease and Evans: Pharmacognosy, 15th Ed., 98, W.B. Saunders, London. Glombitza, K. W. and Keusgen , M., 1995, Fuhalols and deshydroxyfuhalols from the brown alga Sargassum spinuligerum, Phytochemistry, 38, 987-990. Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya, Majalah Ilmu Kefarmasian, I (3), 117 – 135. Jansoon, N., 2005, The Determination of Total Phenolic Compounds in Green Tea, 209.85.165.104/search?q=cache:Nj311vjKCdcJ:chemw.sc.mahidol.ac.th/sces s/scch108/2005_06_SCCH108Lab02.pdf+Folin-Ciocalteau+ method +colori metric&hl=en&ct=clnk&cd=9&gl=id, diakses tanggal 24 Oktober 2007

Kadi, A., 2007, Beberapa Catatan Kehadiran Marga Sargassum di Perairan Indonesia, www.oseanografi.lipi.go.id/volxxxno.42.pdf, diakses tanggal 20 Februari 2007 Kang, K.A., Lee, K.H., Chae, S., Koh,Y.S., Yoo, B.S., Kim, J.H., Ham, Y.M., Baik, J.S., Lee, N.H., and Hyun, J.W., 2005a, Triphlorethol-A from Ecklonia cava protects V-79-4 lung fibroblast against hydrogen peroxide induced cell damaged, Free Radic. Res., 39 (8), 883-892. Kang, K.A., Lee, K.H., Chae, S., Zhang, R., Jung, M.S., Ham, Y.M., Baik, J.S., and Hyun, J.W., 2005b, Cytoprotective effect of phloroglucinol on oxidative stress induced cell damaged via catalase activation, J.Cell Biochem., 97(3), 609-620.


57

Kim, M.M., Ta, Q.V., Mendis, E., Rajapakse, N., Jung, W.K., Byun, H.G., Jeon, Y.J. and Kim, S.K., 2006, Phlorotannins in Ecklonia cava extract inhibit matrix metalloproteinase activity, Life Sci., 79(15), 1436-1443. Khopkar, S.M., 1990, Basic Concepts of Analytical Chemistry, alih bahasa oleh Saptoraharjo, A., 193, 204, Universitas Indonesia Press, Jakarta. Krumholz, L.R. And Bryant, M.P., 1988, Characterization of the PyrogallolPhloroglucinol Isomerase of Eubacterium oxidoreducens, J. Bacteriol., Illinois, 170(6), 2478. McMurry, J., 2004, Organic Chemistry, 6th Ed., 618, Thomson Brooks/Cole, U.S. Mulja, M. dan Hanwar, D.,2003, Prinsip-prinsip Cara Berlaboratorium Yang Baik, Majalah Farmasi Airlangga, III, 71 – 72. Mulja, M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, 26-28, Airlangga University Press, Surabaya. Mustapha, K. and Ghalem, S., 2007, Effect of Heat Treatment on Polyphenol Oxidase and Peroxidase Activities in Algerian Stored Dates, AJB, 6(6), 790-794. Nagayama, K., Iwamura, Y., Shibata, I., Hirayama, I., and Nakamura, T., 2002, Bactericidal Activity of Phlorotannins from The Brown Alga Ecklonia kurome, JAC, 50, 889-893. Nakamura, T., Nagayama, K., Uchida, K., and Tanaka, R., 1996 , Antioxidant activity of phlorotannin isolated from the brown alga Eisenia bicyclis , Fisheries Sci., 62(6), 923-926. Padda, M.S., 2006, Phenolic Composition And Antioxidant Activity of Sweetpotatoes [Ipomoea batatas (L.) Lam], Dissertation, Punjab Agricultural University, 15. Shin, H.C., Hwang, H.J., Kang, K.J., and Lee, B.H., 2006, An oxidative and antiinflammatory agent for potential treatment of osteoarthritis from Ecklonia cava, Arch. Pharm. Res., 29(2), 165-171. Singleton, V.L. and Rossi, J.A., 1965, Colorimetry of Total Phenolics with Phosphomolybdic-Phosphotungstic Acid Reagent, Am. J. Enol. Vitic, 16, 147. Sulistiyowati, H., 1992, Komposisi dan Distribusi Alga di Pantai Pasir Putih, Kabupaten Situbondo (Laporan Penelitian), FKIP-UNEJ, Jember.


58

Sullivan, M., Thoma, S., Samac, D. and Hatfield, R., 2003, Cloning of Red Clover and Alfafa Polyphenol Oxydase Genes and Expression of Active Enzymes in Transgenic Alfafa, Molecular Breeding of Forage and Turf, 190. Susanto, A., 2006, Apa yang Terdapat dalam Rumput Laut?, Fak. Perikanan dan Ilmu Kelautan UNDIP, 129.70.123.66/~jlitheng/rumput/kandungan.html, diakses tanggal 1 November 2007. Svobodova, A., Psotova, J., and Walterova, D., 2003, Natural phenolics in prevention of UV-Induced Skin Damage (A Review), Biomed. Papers, 147(2), 137-145. Silverstein, B. and Murrill, 1986, Spectrometric Identification of Organic Compounds, Ed. V, diterjemahkan oleh A.J.Hartono, Amy Victro Purba, 306-308, Penerbit Erlangga, Jakarta. Skoog, D.A., Holler, F.J., and Nieman, T.A., 1998, Principles of Instrumental Analysis, 5th Ed., 11-14, 140, H. Brace College, Philadelphia. Thomas, D.,2002, Algas, Life Series, Natural History Museum, London. Thomas, A.W. and Frieden, A., 1923, The Gelatin-Tannin Reaction, 839, Industrial & Engineering Chemistry, Columbia University, NY. Vogel, A.I., 1978, A Text Book of Quantitative Inorganic Analysis, Fourth edition, 728, The English Language Book Society, Richard Clay Ltd., Bungay. Waterman, P.G. and Mole, S., 1994, Analysis of Phenolic Plant Metabolites: Extraction and Chemical Quantification, Blackwell Scientific Pub., 66-69. Woelkerling, W. J., 1990, "An Introduction", in K. M. Cole & R. G. Sheath: Biology of The Red Algae, 1–6, Cambridge University Press, Cambridge. Wu, H., 1920, Contribution to The Chemistry of Phosphomolybdic Acids, Phosphotungstic Acids, and Allied Substances, JBC, Boston, 189-220. Yuan, Y.V., and Walsh, N.A., 2006, Antioxidant and Antiproliferative Activities of Extract from a Variety of Edible Algas, J.Fd.Chem.Toxicol., 44, 11441150. Zhang, Q., Zhang, J., Shen, J., Silva, A., Dennis, D.A., and Barrow, C.J., 2006, A Simple 96-well Microplate Method for Estimation of Total Polyphenol Content in Algas, J. App. Phycol., 18, 445-450.


LAMPIRAN Lampiran 1. Surat Keterangan hasil identifikasi spesies alga merah

59


60


Lampiran 2. Data perhitungan kadar air dengan Karl Fischer Blangko: Berat air + spuit

= 8,6898 g

Berat spuit + sisa air

= 8,6694 g

Berat air yang dimasukkan

= 0,0204 g

Kadar air blangko

= 0,0349 %

Berat air blangko =

100 1

x 0,0349 = 3,49 mg

Replikasi I: Berat sampel = 2000,1 mg

Berat air sampel =

Kadar air sampel =

100 1

x 0,2056 = 20,56 mg

(20,56-3,49) 2000,1

x 10 x 100 % = 8,5346 %

Replikasi II: Berat sampel = 2001,6 mg

Berat air sampel =

Kadar air sampel =

100 1

x 0,1150 = 15,5 mg

(15,5-3,49) 2001,6

x 10 x 100 % = 6,0002 %

61


Replikasi III: Berat sampel = 2000,5 mg

Berat air sampel =

Kadar air sampel =

100 1

x 0,1543 = 15,43 mg

(15,43-3,49)

x 10 x 100 % = 5,9685 %

2000,5

Lampiran 3. Data penimbangan replikasi seri baku floroglusinol Replikasi I: Berat kertas + zat

= 0,45148

g

Berat kertas + sisa Berat zat

= 0,40029 = 0,05119

g (-) g

Berat kertas + zat

= 0,44613

g


= 0,39553 = 0,05060

g (-) g

Berat kertas + zat

= 0,49880

g


= 0,39798 = 0,10082

g (-) g

ad 50,0 mL aseton 75 %

Replikasi II:


Replikasi III:


62


63

Lampiran 4. Contoh perhitungan seri kadar baku floroglusinol Replikasi I: Konsentrasi stok baku floroglusinol = 51,19mg/50mL = 1,0238 mg/mL C1 = 0,5 . 1,0238 . 1/10. 0,5/50 . 102 mg/100mL

= 0,0512 mg/100mL

C2 = 1,0 . 1,0238 . 1/10. 0,5/50 . 102 mg/100mL

= 0,1024 mg/100mL

C3 = 2,0 . 1,0238 . 1/10. 0,5/50 . 102 mg/100mL

= 0,2048 mg/100mL

C4 = 3,0 . 1,0238 . 1/10. 0,5/50 . 102 mg/100mL

= 0,3071 mg/100mL

C5 = 4,0 . 1,0238 . 1/10. 0,5/50 . 102 mg/100mL

= 0,4095 mg/100mL

C6 = 5,0 . 1,0238 . 1/10. 0,5/50 . 102 mg/100mL

= 0,5119 mg/100mL

C7 = 6,0 . 1,0238 . 1/10. 0,5/50 . 102 mg/100mL

= 0,6143 mg/100mL

Lampiran 5. Hasil scanning

maks


direaksikan dengan Folin-Ciocalteau



maks

64




maks




65

Lampiran 8. Hasil pembacaan absorbansi seri baku floroglusinol pada ketiga maks

C flroglusinol (ppm) 0,477 0,953 1,905 2,859 3,812 4,765 5,718 A B r

758,7 nm 0,049 0,131 0,286 0,418 0,544 0,656 0,727 0,01598 0,131738 0,99425

Absorbansi pada λ maks 750,1 nm 0,070 0,126 0,306 0,423 0,549 0,653 0,732 0,02917 0,129576 0,99387

743,4 nm 0,050 0,123 0,281 0,420 0,543 0,659 0,732 0,01084 0,133349 0,99477

Lampiran 9. Data recovery, kesalahan sistematik dan kesalahan acak dengan metode Folin-Ciocalteau

0,512 1,024 2,048 3,071 4,095 5,119 6,143

Replikasi I Kadar hitung Absorbansi floroglusinol (ppm) 0,075 0,521 0,138 1,020 0,269 2,056 0,405 3,132 0,516 4,010 0,648 5,055 0,796 6,225

Kadar floroglusinol sebenarnya (ppm)

Replikasi II Kadar hitung Absorbansi floroglusinol (ppm)

Kadar floroglusinol sebenarnya (ppm)

0,553 1,046 2,091 3,137 4,182 5,228 6,274

0,070 0,132 0,257 0,407 0,514 0,643 0,712

0,446 0,982 2,061 3,325 4,280 5,394 5,990

Recovery (%)

Kesalahan sistematik (%)

101,848 99,607 100,419 101,977 97,926 98,742 101,346

1,848 0,393 0,419 1,977 2,074 1,258 1,346

Recovery (%)


80,756 93,896 98,562 106,999 102,340 103,179 95,479

19,244 6,104 1,438 6,999 2,340 3,179 4,521


Kadar floroglusinol sebenarnya (ppm) 0,504 1,008 2,016 3,025 4,033 5,041 6,049

Replikasi III Kadar hitung Absorbansi floroglusinol (ppm) 0,074 0,134 0,255 0,410 0,506 0,636 0,724

0,045 0,095 0,196 0,325 0,405 0,514 0,587

Recovery (%)


89,417 94,191 97,170 107,544 100,523 101,938 97,088

10,583 5,809 2,830 7,544 0,523 1,938 2,912

66

Lampiran 10. Hasil analisis statistik regresi linear seri baku floroglusinol replikasi I Correlations Pearson Correlation Sig. (1-tailed) N

ABSORBAN 1,000 1,000 , ,000 7 7

ABSORBAN KADAR ABSORBAN KADAR ABSORBAN KADAR

KADAR 1,000 1,000 ,000 , 7 7

Model Summary Model 1

R R Square 1,000a ,999

Adjusted R Square ,999

Std. Error of the Estimate ,008389

a. Predictors: (Constant), KADAR

Coefficientsa

Model 1

(Constant) KADAR

Unstandardized Coefficients B Std. Error 9,083E-03 ,006 ,126 ,002

a. Dependent Variable: ABSORBAN

Standardized Coefficients Beta 1,000

t 1,506 77,491

Sig. ,192 ,000


67

Lampiran 11. Hasil analisis statistik regresi linear seri baku floroglusinol replikasi II Correlations Pearson Correlation Sig. (1-tailed) N

ABSORBAN 1,000 ,997 , ,000 7 7


KADAR ,997 1,000 ,000 , 7 7


R R Square ,997a ,993



a. Predictors: (Constant), KADAR Coefficientsa

Model 1

(Constant) KADAR


Standardized Coefficients Beta ,997

t 1,043 27,054

Sig. ,345 ,000


Lampiran 12. Hasil analisis statistik regresi linear seri baku floroglusinol replikasi III Correlations Pearson Correlation Sig. (1-tailed) N


ABSORBAN 1,000 ,998 , ,000 7 7

KADAR ,998 1,000 ,000 , 7 7



R R Square ,998a ,996



a. Predictors: (Constant), KADAR

Coefficientsa

Model 1

(Constant) KADAR


Standardized Coefficients Beta ,998

t 1,639 35,363


Lampiran 13. Parameter mean recovery menurut Harmita (2004)

Sig. ,162 ,000

68


69

Lampiran 14. Parameter CV menurut Harmita (2004) Rentang yang RSD (simpangan dapat diterima baku relatif) (% klaim) (%) 98,5-101,5 0,41 97-103 0,82 95-105 1,4 90-110 2,8 90-125 4,8 85-115 4,1 75-125 6,9 50-150 13,7 (Berdasar taraf kepercayaan 99 %)

Lampiran 15. Data penimbangan sampel fraksi etil asetat Laurencia papillosa (Forskal) Graville Replikasi I: Berat kaca arloji + zat

= 15,28600

g

Berat kaca arloji + sisa Berat zat

= 15,23494 = 0,05106

g (-) g

Berat kaca arloji + zat

= 15,50446

g


= 15,45833 = 0,04613

g (-) g

Berat kaca arloji + zat

= 15,90818

g


= 15,86039 = 0,04779

g (-) g


Replikasi II:


Replikasi III:



70

Lampiran 16. Data absorbansi sampel fraksi etil asetat Laurencia papillosa (Forskal) Graville Scan pada = 750,1 nm Keterangan

Absorbansi

Rep1.1

0,283

Rep1.2

0,279

Rep2.1

0,268

Rep2.2

0,271

Rep3.1

0,272

Rep3.2

0,274

Lampiran 17. Contoh perhitungan kadar sampel Persamaan kurva baku: y = 1,2645 x + 0,0091 Replikasi I: Duplo 1

C1=

x = 0,2167 mg/100mL

2,167 . 10-3 mg/mL 0,05106 g

Duplo 2

C2=

y = 0,283

y = 0,279

50 1

x 50 mL = 10,60 mg/g

x = 0,2135 mg/100mL

2,135 . 10-3 mg/mL 0,05106 g

x

x

50 1

x 50 mL = 10,45 mg/g


71

Lampiran 18. Foto hasil uji kualitatif kandungan florotanin serbuk alga merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville Uji polifenol

Baku Floroglusinol

Alga Merah

Uji Tanin

Baku Floroglusinol

Uji pendahuluan alga merah

sebelum + KOH

sesudah +KOH

Alga Merah


72

Lampiran 19. Foto florotanin kasar dari fraksi etil asetat alga merah Laurencia papillosa (Forskal) Graville

Lampiran 20. Foto instrumen spektrofotometer UV - VIS Perkin Elmer Lambda- 20


73

BIOGRAFI PENULIS Hendry Kurniawan , penulis skripsi yang berjudul Penetapan Kadar Florotanin dalam Fraksi Etil Asetat Alga Merah (Laurencia papillosa (Forskal) Graville)

dengan

Metode

Kolorimetri

Folin

Ciocalteau, lahir di kota Samarinda, Kalimantan Timur pada tanggal 14 September 1986 dari pasangan Bapak Handojo Poerwanto dan Ibu Kong Phei Tjin. Penulis menyelesaikan pendidikan Taman KanakKanak di TK Kristen Kalam Kudus, Pekanbaru pada tahun 1991 hingga 1992 dan menyelesaikan pendidikan dasar di SD Kristen Kalam Kudus, Pekanbaru, tahun 1992 hingga tahun 1998. Pendidikan SLTP ditempuh pada tahun 1998 hingga 2001, di SLTP Santa Maria, Pekanbaru, dilanjutkan dengan menempuh pendidikan di SMU Negeri 1, Pekanbaru, pada tahun 2001 hingga 2002 dan diselesaikan di SMU BOPKRI 1, Yogyakarta tahun 2002 hingga 2004. Penulis melanjutkan kuliah di Fakultas Farmasi Univesitas Sanata Dharma, Yogyakarta pada 2004 hingga 2008. Selama kuliah, penulis pernah mengirimkan tulisian ilmiah bejudul “Uji Daya Analgetik Conotoxin pada Lendir Siput Laut

Cypraea tigris Linn.” pada PKM penulisan ilmiah yang

diselenggarakan Dirjen Pendidikan Tinggi Depdiknas (2007) dan pernah menjadi asisten dosen pada mata kuliah praktikum Kromatografi (2007), praktikum F.T.S. Steril (2008) dan praktikum F.T.S. Solid A/B (2008).

PENETAPAN KADAR FLOROTANIN DALAM FRAKSI ETIL ASETAT ALGA MERAH (Laurencia papillosa (Forskal) Graville) DENGAN METODE KOLORIMETRI FOLIN CIOCALTEAU

Recommend Documents