ii
PENENTUAN KONSENTRASI OPTIMUM SUPEROKSIDA DISMUTASE, LINEARITAS, DAN STABILITAS BIOSENSOR ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN ELEKTRODE PASTA KARBON
BARA TAUFAN SAFRIZAL
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011
ABSTRAK BARA TAUFAN SAFRIZAL. Penentuan Konsentrasi Optimum Superoksida Dismutase, Linearitas, dan Stabilitas Biosensor Antioksidan Menggunakan Elektrode Pasta Karbon. Dibimbing oleh DYAH ISWANTINI PRADONO dan TRIVADILA. Penelitian ini bertujuan mengoptimumkan konsentrasi superoksida dismutase (SOD) imobilisasi dan menentukan aktivitas SOD imobilisasi. Metode biosensor elektrokimia berbasis superoksida dismutase digunakan sebagai metode alternatif karena instrumentasi sederhana, sentitivitas tinggi, dan biaya rendah. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kondisi optimum untuk aktivitas SOD murni adalah konsentrasi 10 unit dengan waktu respons 4 detik. Elektrode pasta kabon yang terimobilisasi enzim mencapai kestabilan elektrode hingga 72 jam sebesar 85,7% dan mengalami penurunan kestabilan sesudahnya 72 jam. Hubungan konsentrasi substrat dan aktivitas SOD imobilisasi menghasilkan persamaan garis linear y = -2,2700 + 13,400x pada rentang konsentrasi xantina 0,200–0,275 mM dengan nilai r sebesar 0,9761. Hasil tersebut menunjukkan analisis ini memiliki linearitas yang tinggi dan untuk meningkatkan kestabilan aktivitas enzim diperlukan pendekatan dengan parameter analisis yang lain. Kata kunci: aktivitas enzim, biosensor antioksidan, superoksida dismutase
ABSTRACT BARA TAUFAN SAFRIZAL. Optimum Concentration Determination of Superoxide Dismutase, Linearity, and Stability of Antioxidants Biosensor Using Carbon Paste Electrode. Supervised by DYAH ISWANTINI PRADONO and TRIVADILA. The objectives of this research was to optimize the concentration of immobilized superoxide dismutase SOD and to determine the activity of the immobilized SOD. Electrochemical biosensor method based on superoxide dismutase is used as an alternative method due to simple instrumentation, high sentitivity, and low cost. The results showed that the optimum conditions for pure SOD activity is the concentration of 10 units with a response time of 4 seconds. The immobilized enzyme on the carbon paste electrode achieved its stability up to 72 hours for 85.7% and decreased thereafter. Substrate concentration relationships and SOD activity immobilization yield a linear equation y = -2.2700 + 13.400x in the concentration range from 0.200 to 0.275 mM xanthine with r value of 0.9761. The results of this analysis showed a high linearity and to improve the stability of the enzyme activity need another approach using analysis of other parameters. Keywords: antioxidant biosensor, enzyme activity, superoxide dismutase
PENENTUAN KONSENTRASI OPTIMUM SUPEROKSIDA DISMUTASE, LINEARITAS, DAN STABILITAS BIOSENSOR ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN ELEKTRODE PASTA KARBON
BARA TAUFAN SAFRIZAL
Skripsi sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011
v
Judul Skripsi : Penentuan Konsentrasi Optimum Superoksida Dismutase, Linearitas, dan Stabilitas Biosensor Antioksidan Menggunakan Elektrode Pasta Karbon Nama : Bara Taufan Safrizal NIM : G44070034
Disetujui Pembimbing II
Pembimbing I
Dr Dyah Iswantini Pradono, MAgr NIP 19670730 199103 2 001
Trivadila, SSi, MSi
Diketahui Ketua Departemen Kimia
Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi, MS NIP 19501227 197603 2 002
Tanggal lulus:
ii
PRAKATA Penulis memanjatkan puji dan syukur kepada Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga karya ilmiah yang bertema “Biosensor Antioksidan” dengan judul “Penentuan Konsentrasi Optimum Superoksida Dismutase, Linearitas, dan Stabilitas Biosensor Antioksidan Menggunakan Elektrode Pasta Karbon” dapat diselesaikan. Penelitian ini mengoptimumkan konsentrasi SOD murni imobilisasi serta menentukan aktivitasnya sebagai metode biosensor antioksidan sejak bulan Februari hingga Agustus 2011 di Laboratorium Bersama dan Laboratorium Kimia Fisik, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada Dr Dyah Iswantini Pradono, MAgr dan Trivadila, SSi, MSi selaku pembimbing yang selalu memberi bimbingan, motivasi, saran, dan meluangkan waktunya kepada penulis selama berkonsultasi. Terima kasih kepada Laboratorium Bersama yang telah memberikan fasilitas dan penggunaan peralatan selama penulis melaksanakan penelitian, serta kepada BUMN atas bantuan dana yang diberikan dalam penelitian. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Mama, kakak Nita Annisa Rachmi, dan adik Iqbal Zen Ramadhan Govinda, serta seluruh keluarga yang senantiasa mendoakan, memberi motivasi, dan kasih sayang tiada henti. Tidak lupa penulis ucapkan terima kasih kepada Pak Mail, Pak Nano, Bu Ai, dan para pegawai di Laboratorium Kimia Fisik, juga kepada Mas Eko, Pak Wawan dan Bu Heny, dan para pegawai di Laboratorium Bersama, serta kepada Laboratorium Analitik yang telah memberikan izin untuk menggunakan bahan untuk penelitian. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada rekan-rekan IPB dari luar Departemen Kimia, rekan-rekan dari Departemen Kimia, dan rekan-rekan Kimia 44 yang selalu memberi dukungan dan menjadi teman diskusi yang menyenangkan. Akhir kata, semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Desember 2011 Bara Taufan Safrizal
1
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Surabaya pada tanggal 9 Februari 1990 dari Papa Moch. Imron Fauzi dan Mama Sunarti. Penulis merupakan putra kedua dari tiga bersaudara. Tahun 2007 penulis lulus dari SMA Negeri 5 Kediri Jawa Timur dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis memilih mayor Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi pengajar PRIVAT SMA mata pelajaran, Fisika, Kimia, dan Matematika (2007-2008 dan 2011), pengajar mahasiswa S1 mata kuliah Fisika (2008-2010) di bimbingan belajar EXPRESS dibawah naungan Unit Kreativitas Mahasiswa (UKM) IAAS, pengajar mahasiswa S1 mata kuliah Kimia (2009-2010) di bimbingan belajar AVOGADRO dibawah naungan IMASIKA IPB, pengajar mahasiswa S1 mata kuliah Fisika (2009-Des 2011), Fisika Umum, Fisika Dasar, Kimia, Kimia Umum (Juli-Des 2011) di bimbingan belajar MAFIA CLUBS, serta menjadi pengajar PRIVAT mahasiswa S1 untuk mata kuliah Fisika dan Kimia pada tahun 2008 sampai sekarang (Des 2011), Fisika Umum, Fisika Dasar, Kimia Dasar, Kimia Umum (Juli-Des 2011). Penulis juga pernah menjadi asisten mata kuliah Praktikum Kimia Fisik S1 Kimia dan layanan pada tahun ajaran 2010/2011. Pada tahun 2008 penulis menjadi Juara II Pertandingan Catur saat Dies Natalis Asrama Sylvalestari ke-39, pemenang beregu Juara III Catur OMI IPB 2009, pemenang beregu Juara II Catur OMI IPB 2010, pemenang beregu Juara III Catur OMI IPB 2011, pemenang beregu Juara III Spirit FMIPA IPB 2011, dan pada tahun 2011 penulis berprestasi mendapat gelar Karate sebagai pemegang sabuk hitam “DAN I”. Penulis pernah mendapat bantuan dana dari SMA Negeri 5 Kediri tahun 2007, bantuan dana dari Walikota Kediri (2007), beasiswa Orang Tua Asuh (2007-2008), beasiswa BBM (2008), beasiswa dari Alumni Fakultas Kehutanan, beasiswa Eka Tjipta Foundation (2008-2009), beasiswa BUMN (2010-2011), penulis bergabung dalam kegiatan, organisasi: Keluarga Mahasiswa JayabayaKediri (KAMAJAYA KEDIRI) (2007-sekarang), Asrama Sylvalestari IPB tahun 2008-2009, dan Ikatan Mahasiswa Jawa Timur (IMAJATIM) (2008-2010), Ikatan Mahasiswa Kimia (IMASIKA) (2008-2009), aktif dalam Unit Kreativitas Mahasiswa (UKM): CUA (Chess Unity of Agriculture) (2007-sekarang), Karate (2007-sekarang), Koperasi Mahasiswa (KOPMA) (2008-2009), dan Perkumpulan Bahasa Korea (HANSAMO) (2008-2009). Penulis juga berkesempatan menjalani kegiatan Praktik Lapang di Laboratorium Pengolahan dan Proses di Balai Besar Industri Agro (BBIA) Bogor Jawa Barat pada tahun 2010.
2
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ vii DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... vii PENDAHULUAN ...................................................................................................1 BAHAN DAN METODE Alat dan Bahan ....................................................................................................1 Metode Penelitian ................................................................................................2 Modifikasi Elektrode Pasta Karbon menggunakan Ferosena sebagai Mediator .......................................................................................................... 2 Imobilisasi Enzim SOD pada Permukaan Elektrode Pasta Karbon Termodifikasi .................................................................................................. 2 Pengukuran Elektrokimia................................................................................ 2 Penentuan Stabilitas Elektrode........................................................................ 2 Pengoptimuman Konsentrasi SOD ................................................................. 3 Pengukuran aktivitas SOD secara Elektrokimia ............................................. 3 HASIL DAN PEMBAHASAN Pengoptimuman Aktivitas SOD Terimobilisasi ...................................................3 Penentuan Stabilitas Elektrode.............................................................................4 Penentuan Linearitas Pengukuran Aktivitas SOD ...............................................4 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ..............................................................................................................5 Saran.....................................................................................................................5 DAFTAR PUSTAKA ..............................................................................................6 LAMPIRAN .............................................................................................................8
3
DAFTAR GAMBAR Halaman 1
Data optimisasi SOD dengan konsentrasi xantina 2,1 mM. ............................. 3
2
Kurva stabilitas antara waktu terhadap aktivitas SOD. ..................................... 4
3
Kurva hubungan antara konsentrasi substrat dengan aktivitas SOD. ............... 4
4
Kurva Linearitas konsentrasi xantina (0,200; 0,225, 0,250; dan 0,275 mM). .. 5
5
Voltamogram linearitas pada konsentrasi xantina 0,200; 0,225, 0,250, dan 0,275 mM. .......................................................................................................... 5
6
Voltamogram siklik untuk bufer fosfat, XO, dan xantina. ............................... 5
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1
Elektrode rujukan, kerja, pembantu, dan sel elektrokimia, serta alat potensiostat/galvanostat .................................................................................... 9
2
Bagan alir kerja penelitian secara umum .......................................................... 9
3
Pembuatan elektrode pasta karbon dan imobilisasi enzim (Trivadila 2011) .. 10
4
Optimisasi konsentrasi SOD imobilisasi ........................................................ 11
5
Stabilitas elektrode pasta karbon yang diimobilisasi 10 unit SOD ................. 11
6
Pengaruh konsentrasi xantina terhadap aktivitas SOD imobilisasi................. 11
1
PENDAHULUAN Pengukuran kapasitas antioksidan dengan metode in vitro dan in vivo telah banyak diperkenalkan. Kapasitas antioksidan diukur melalui efek antioksidan untuk mengontrol proses oksidasi sehingga pengukuran aktivitas antioksidan perlu diperhatikan sumber radikal bebasnya (O’Brien et al. 2007). Antiradikal bebas (antioksidan) adalah bahan yang dalam kadar rendah dapat mencegah terjadinya oksidasi dari substrat yang mudah teroksidasi. Metode yang umum digunakan untuk mengukur sifat-sifat antioksidan adalah spektrofotometri, fluoresensi, kromatografi gas, kromatografi cairan (Prieto-Simon et al. 2008), voltametri siklik (Kilmartin 2001), dan biosensor (Campanella et al. 2005). Metode spektrofotometri memiliki kelemahan, yaitu sulit mengukur pada konsentrasi tinggi. Pengukuran antioksidan menggunakan metode spektrofotometri seringkali terkendala terhadap preparasi sampel, sebagai contoh metode 1,1-difenil-2pikrilhidrazil atau DPPH (Diphenyl Picril Hydrazil Hydrate) sangat peka terhadap cahaya sehingga harus dilakukan dalam kondisi gelap dan sangat dipengaruhi oleh tingkat kekeruhan. Metode ABTS atau 2,2bis-azino (asam 3-etil-benzotiazolina-6sulfonat) dan FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) juga sangat sensitif terhadap cahaya bahkan pembentukan ABTS memerlukan waktu inkubasi selama 12–16 jam dalam kondisi gelap (Tawaha et al. 2007). Pengukuran kapasitas antioksidan selain terkendala masalah preparasi sampel, juga ada beberapa pengukuran yang memerlukan peralatan yang mahal, seperti Kapasitas Serapan Radikal Oksigen dengan Fluorescen atau ORAC-FL (Oxygen Radical Absorbance Capacity with Fluorescein) dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau HPLC (High Pressure Liquid Chromathography) (Du et al. 2009). Oleh karena itu dibutuhkan metode yang lebih tepat, cepat, dan sensitif untuk mengukur sifat-sifat antioksidan. Biosensor merupakan suatu piranti yang memanfaatkan interaksi hayati untuk mendeteksi analat target (Hartati et al. 2005). Biosensor mengkombinasikan keunggulan analisis dari teknik elektrokimia dengan kespesifikan proses pengenalan hayati untuk menghasilkan sinyal listrik sebagai konsentrasi suatu analat (Wang 1994). Penelitian dan pengembangan biosensor sangat luas dan multidisiplin mencakup biokimia, ilmu bioreaktor, kimia fisik,
elektrokimia, elektronik, dan rekayasa perangkat lunak (Chaplin 2004). Biosensor elektrokimia merupakan alternatif metode yang dikembangkan untuk mengukur kapasitas antioksidan. Metode ini sangat menjanjikan, karena analisisnya cepat, membutuhkan instrumen yang tidak mahal, protokol operasi yang sederhana, dan biayanya rendah (Campanella et al. 2004). Metode biosensor berbasis enzim superoksida dismutase (SOD) digunakan untuk menguji aktivitas suatu sampel yang berpotensi sebagai antioksidan telah dilakukan oleh Campanella et al. (2004) dan Trivadila (2011). Enzim superoksida dismutase merupakan suatu metaloenzim yang bertindak sebagai intraseluler utama yang melindungi kerusakan sel karena radikal superoksida dengan cara mengkatalisis radikal O2- menjadi hidrogen peroksida (H2O2) dan oksigen (O2) berdasarkan reaksi 2O2- + 2H+ → O2 + H2O2 (Kankofer 2002). Pemanfaatan SOD untuk biosensor antioksidan telah banyak dilakukan. Hal ini dikarenakan beberapa kelebihan yang dimiliki oleh SOD, yaitu enzim ini spesifik mengakatalisis radikal superoksida menjadi oksigen dan peroksida (Donnely et al. 1989). Perkembangan biosensor antioksidan berbasis enzim SOD dengan pengukuran secara elektrokimia hingga saat ini baru pada tahap penelitian dan belum terdapat biosensor antioksidan komersial yang diproduksi. Penelitian oleh Trivadila (2011) telah mendapatkan parameter pH dan suhu yang optimum bagi aktivitas SOD murni yang berasal dari eritrosit sapi yang diimobilisasi pada pH 11 dan suhu 20 oC. Namun, penelitian yang telah dilakukan sebelumnya belum menentukan konsentrasi enzim SOD imobilisasi yang optimum sehingga penelitian ini mengoptimumkan konsentrasi SOD imobilisasi, linearitas pengukuran, dan juga stabilitas elektrode enzim yang dihasilkan. Penelitian bertujuan mengoptimumkan konsentrasi SOD imobilisasi, menentukan linearitas pengukuran, dan mengukur stabilitas elektrode pasta karbon terimobilisasi SOD yang dihasilkan untuk mengukur aktivitas SOD.
BAHAN DAN METODE Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan adalah eDAQ Potentiostat-Galvanostat yang dilengkapi dengan perangkat lunak Echem v2.1.0, elektrode Ag/AgCl, badan elektrode, platina,
2
sel elektrokimia (Lampiran 1), peralatan gelas, tabung mikro, pipet mikro, neraca analitik, pH meter, dan oven. Bahan-bahan yang digunakan adalah superoksida dismutase (SOD), xantina oksidase (XO), xantina, grafit, ferosena, dimetil sulfoksida (DMSO), parafin cair, larutan bufer fosfat pH 11, membran dialisis, dan jaring nilon. Metode Penelitian Metode penelitian ini meliputi, preparasi elektrode rujukan Ag/AgCl, modifikasi elektrode pasta karbon, imobilisasi enzim SOD pada permukaan elektrode pasta karbon, optimisasi serta stabilitas aktivitas SOD imobilisasi. Bagan alir penelitian secara umum dilampirkan pada Lampiran 2. Modifikasi Elektrode Pasta Karbon menggunakan Ferosena sebagai Mediator (Campanella et al. 1997, Ikeda et al. 1998) Sebanyak 1 mL DMSO digunakan untuk melarutkan 3 mg ferosena (mediator) dan campuran ditambahkan 100 mg grafit kemudian didiamkan selama 2 jam. Setelah 2 jam didiamkan, pelarut diuapkan menggunakan pengering vakum sehingga diperoleh grafit termodifikasi mediator. Grafit termodifikasi kemudian dicampur dengan parafin cair sampai membentuk pasta dengan perbandingan campuran 100 mg grafit termodifikasi dan 35 µL parafin cair. Pasta karbon yang terbentuk dimasukkan ke dalam badan elektrode hingga padat sampai permukaan. Permukaan gelas elektrode dihaluskan dan dibersihkan dengan amplas serta kertas minyak (Lampiran 3). Imobilisasi Enzim SOD pada Permukaan Elektrode Pasta Karbon Termodifikasi (Ikeda et al. 1998) Larutan SOD sebanyak 5 µL diteteskan pada permukaan elektrode pasta karbon kemudian didiamkan agar pelarutnya menguap. Selanjutnya permukaan elektrode dilapisi dengan membran dialisis, ditutup dengan jaring nilon dan diikat dengan parafilm. Elektrode kemudian direndam dalam larutan bufer fosfat 50 mM (pH 11) pada suhu 4 ºC ketika tidak digunakan, untuk memberikan keadaan yang sama dengan lingkungan sebenarnya. Elektrode dapat langsung digunakan untuk pengukuran aktivitas SOD dengan metode elektrokimia.
Pengukuran Elektrokimia Pengukuran elektrokimia metode voltametri siklik dilakukan dengan menggunakan seperangkat alat potensiostat/galvanostat eDAQ dan komputer beserta perangkat lunak pengolah data Echem v2.1.0. Elektrode yang digunakan, yaitu elektrode Ag/AgCl, platina, dan elektrode pasta karbon-enzim berturut-turut sebagai elektrode rujukan, counter, dan kerja. Parameter pengukuran diatur sebagai berikut; Mode: Cyclic, Initial E: 100 mV, Final E: 100 mV, Rate: 250 mV/s, Step W: 25ms, Upper E: 600 mV, Lower E: 50 mV, dan Range: 10V.
xantina
asam urat (Campanella 2000). Radikal superoksida dihasilkan oleh oksidasi dalam larutan xantin untuk asam urat dalam enzim xanthine oksidase. xantina+ H2O + O2
XO
>
asam urat + 2H+ + 2O2•-
Radikal superoksida dihasilkan melalui reaksi enzimatis xantina dengan xantina oksidase (XO). Selanjutnya radikal yang dihasilkan akan didismutasi membentuk O2 dengan katalis SOD melalui reaksi: 2O2•- + 2H+
SOD
>
O 2 + H 2O 2
Larutan bufer fosfat sebanyak 1,9 mL dan larutan XO 0,1 U/mL sebanyak 100 µL ditambahkan ke dalam sel pengukuran dan puncak arus anoda yang terbentuk diamati sebagai puncak blangko. Selanjutnya ditambahkan substrat xantina 2,1 mM sebanyak 1 mL dan diukur kembali perubahan atau kenaikan puncak arus anode yang terjadi. Penentuan Stabilitas Elektrode Stabilitas elektrode ditentukan dari pengukuran aktivitas enzim SOD setelah didapatkan kondisi optimum aktivitas SOD secara langsung melalui pengukuran arus yang didapat. Pengukuran aktivitas secara langsung dilakukan pada elektrode yang telah dibuat dengan imobilisasi enzim SOD pada permukaan elektrode. Nilai aktivitas yang diperoleh pada pengukuran awal dianggap aktivitas 100%. Aktivitas diukur ulang pada
3
Aktivitas SOD (%) =
I saat ke - jam (µA) × 100 % I saat awal (µA)
Pengoptimuman Konsentrasi SOD Optimisasi yang dilakukan untuk aktivitas SOD murni adalah optimisasi konsentrasi SOD pada pH dan suhu optimum (pH 11 dan suhu 20 ºC). Konsentrasi SOD imobilisasi yang digunakan pada elektrode pasta karbon adalah 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 20,0; dan 50,0 unit. Pengukuran Elektrokimia
aktivitas
SOD
secara
Uji aktivitas dilakukan dengan variasi rentang konsentrasi substrat xantina 0,200–0,325 mM (interval 0,05 mM) pada prosedur elektrokimia sebelumnya sehingga adanya hubungan linear digunakan koefisien korelasi (r) pada analisis regresi linear (y = a + bx). Linearitas dilakukan dengan variasi rentang konsentrasi substrat xantina 0,200–0,275 mM (interval 0,05 mM) pada prosedur pengukuran elektrokimia di atas, kemudian dibuat kurva hubungan antara konsentrasi substrat xantina dengan aktivitas SOD murni. Sebagai parameter adanya hubungan linier digunakan koefisien korelasi r pada analisis regresi linier y = a + bx. Hubungan linier yang ideal dicapai jika nilai b = 0 dan r = +1 atau -1 bergantung pada arah garis. Sedangkan nilai a menunjukkan kepekaan analisis terutama instrumen yang digunakan (Harmita 2004).
Trivadila (2011) dan Weniarti (2011), yaitu berurutan sebesar 0,12 µA pada konsentrasi Mn-SOD 701,02 µg/mL dan 0,43 µA pada konsentrasi SOD 1500 µg/mL, sedangkan aktivitas SOD murni yang didapatkan Trivadila (2011) sebesar 0,09 µA sehingga aktivitasnya lebih rendah dibandingkan dengan aktivitas yang didapat dalam penelitian ini. Perbedaan hasil ini dapat disebabkan karena adanya perlakuan yang berbeda saat penyimpanan elektrode pasta karbon-enzim. Elektrode disimpan dalam larutan bufer pH 11. Nilai Penyimpanan pada kondisi yang berbeda ini menyebabkan hasil pengukuran yang berbeda. Pengaruhnya terhadap pengukuran aktivitas SOD pada elektrode agar memberikan keadaan yang sama ketika tidak digunakan dengan saat pengukuran. Gambar 1 memperlihatkan secara umum semakin besar konsentrasi SOD, semakin besar kenaikan arus dan aktivitas maksimum yang dihasilkan, serta semakin cepat waktu yang dibutuhkan arus untuk mencapai maksimum. Hasil pengamatan aktivitas unit konsentrasi SOD dibawah 10 menunjukkan arus belum mencapai maksimum. 2.5 2 Irerata (µA)
tiap kurun waktu tertentu dan aktivitas yang tersisa diukur.
1.5 1 0.5 0 0,2 0,5 1,0 2,0
5,0 10,0 20,0 50,0
HASIL DAN PEMBAHASAN
waktu (jam)
Pengoptimuman Aktivitas SOD Terimobilisasi
Gambar 1 Data optimisasi SOD dengan konsentrasi xantina 2,1 mM.
Pengoptimuman aktivitas SOD imobilisasi untuk kerja optimum SOD ditentukan dengan menggunakan metode elektrokimia. Konsentrasi optimisasi SOD murni yang digunakan adalah 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 20,0; dan 50,0 unit pada larutan bufer fosfat pH 11, suhu 20 oC. Konsentrasi SOD memiliki nilai konsentrasi optimum 10 unit, karena arus rerata memiliki nilai terbesar dan nilai koefisien variasi berada pada persentase dibawah 10% sebesar 3,99%. Arus puncak oksidasi pada konsentrasi SOD optimum 10,0 unit sebesar 2,371 µA (Lampiran 4). Hasil ini lebih tinggi dari yang dihasilkan oleh
Berdasarkan hasil pengukuran, arus konsentrasi SOD pada 0,2 dan 0,5 unit memiliki koefisien variasi (KV) dan arus rerata (Irerata) negatif setiap ulangan pengukuran. Artinya pada 0,2 dan 0,5 unit aktivitasnya tidak ada atau sangat kecil. Irerata terbesar dihasilkan ketika konsentrasi SOD 10 unit, yaitu sebesar 2,3710 µA. Jadi dapat disimpulkan bahwa konsentrasi SOD yang optimum sebesar 10,0 unit. Konsentrasi SOD yang lebih besar dari 10,0 unit mengalami penurunan aktivitas. Arus puncak oksidasi tertinggi dihasilkan dalam waktu respon 4 detik. Waktu respon ini lebih baik dari
4
waktu respon rata-rata pada biosensor urea berbasis membran khitin, yakni 3-6 menit (Nazaruddin 2007) sedangkan biosensor elektrokimia untuk deteksi urutan DNA tanpa indikator hibridisasi waktu responnya sebesar 20 menit agar diperoleh deteksi pada DNA target (Hartati et al. 2007). Berbagai macam teknik immobilisasi telah digunakan, meliputi adsorpsi pada penyangga padat (Yao et al. 2007, Wang et al. 2009), pengikatan kovalen (Kunzelmann & Botther 2007, Wu et al. 1999) dan pemerangkapan dalam polimer (Fei et al. 2003, Li et al. 2004, Pan et al. 2005, Hiratsuka et al. 2008). Sol-gel menawarkan metode untuk mengimmobilisasi biomolekul agar dapat menunjukkan aktivitas fungsional biomolekul yang terselubungi dengan matriks yang berpori (Coradin et al. 2006, Gupta et al. 2007). Nur et al. (2010) mengembangkan teknik immobilisasi enzim kedalam silica gel dengan teknik sol-gel untuk membentuk sensor sebagai lapisan tipis yang dapat dipasangkan dengan teknik elektrokimia.
berturut-turut. Arus meningkat secara signifikan, yaitu sebesar lebih kurang 0,398 µA dan mencapai puncak dalam waktu 10 jam dan cenderung turun hingga mencapai waktu 168 jam. Salah satu faktor penentu kestabilan elektrode adalah kestabilan aktivitas enzim itu sendiri. Proses imobilisasi enzim pada permukaan elektrode diketahui dapat meningkatkan kestabilan enzim. Menurut Nur et al. (2010) imobilisasi enzim metode sol gel, enzim yang telah berhasil diimmobilisasi mempunyai aktivitas dan stabilitas yang cukup bagus sehingga dapat digunakan untuk aplikasi biosensor. Berdasarkan hasil pengujian diperoleh kondisi stabil elektrode dari pengukuran SOD setelah 72 jam inkubasi pada elektrode pasta karbon dengan enzim SOD imobilisasi karena aktivitas SOD (dalam 10-3 µA) dari 0 jam sampai dengan 72 jam tidak berbeda secara signifikan namun aktivitas SOD turun secara drastis setelah 72 jam. Penentuan Linearitas Pengukuran Aktivitas SOD
Penentuan Stabilitas Elektrode
400
Setelah diperoleh kondisi optimum, elektrode pasta karbon-SOD digunakan untuk mengukur aktivitas SOD imobilisasi dengan variasi substrat xantina, sehingga diperoleh hubungan antara konsentrasi substrat dengan aktivitas SOD Gambar 3. Konsentrasi xantina yang digunakan, yaitu antara 0,200–0,325 mM.
350 300
Aktivitas SOD (µA)
Aktivitas SOD (dalam 10 -3 µA)
Stabilitas elektrode ditentukan dari pengukuran aktivitas enzim SOD setelah didapatkan kondisi optimum aktivitas SOD secara langsung melalui pengukuran arus yang didapat. Stabilitas elektrode digambarkan sebagai hubungan waktu dan arus, ditunjukkan dalam Gambar 2.
250 200 150 100 50 0 0
2
10 24 waktu (jam)
48
72
1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0.175
120 168
0.200
0.225 0.250 [xantina] (mM)
0.275
0.300
waktu
Gambar 3 Kurva hubungan antara konsentrasi substrat dengan aktivitas SOD.
Arus puncak oksidasi pada saat pengukuran awal (waktu untuk jam ke-0) dikondisikan 100%. Kestabilan elektrode untuk 72 jam sebesar 85,68% dan semakin menurun sampai 4,52% untuk 168 jam. Pengukuran dilakukan sebanyak 6 ulangan pada hari yang sama (intraday) dan pada hari yang berlainan (interday) selama 5 hari
Hubungan linear diperoleh ketika mM konsentrasi xantina 0,200–0,275 (Gambar 4). Kurva yang dihasilkan memiliki persamaan garis y = -2,2700 + 13,400x dan R2 = 95,28%. Berdasarkan hasil pengujian, diperoleh koefisien regresi untuk linearitas sebesar 0,9761. Menurut ICH (1995 diacu dalam Chan 2004), nilai ini hampir memenuhi syarat yang ditetapkan, yaitu 0,9970. Nilai
Gambar 2 Kurva stabilitas antara terhadap aktivitas SOD.
5
yang semakin jauh dari nol disebabkan oleh semakin besarnya pengaruh matriks dalam substrat. Hal ini dapat mengganggu penentuan aktivitas SOD dalam variasi konsentrasi xantina sebagai substrat.
1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0.175
y = 13,4400x - 2,2700 r = 0,9761
2,0x10 -5 1,5x10 -5 1,0x10 -6 5,0x10 0,0 -6 -5,0x10 -5 -1,0x10 -5 -1,5x10 -5 -2,0x10 -5 -2,5x10 -5 -3,0x10 -5 -3,5x10 -5 -4,0x10 -5 -4,5x10 -5 -5,0x10 0,0
0.200
0.225 0.250 [xantina] (mM)
0.275
0.300
Gambar 4 Kurva Linearitas konsentrasi xantina (0,200; 0,225, 0,250; dan 0,275 mM). Linearitas dinyatakan dengan koefisien korelasi (r). Nilai koefisien korelasi yang tinggi menunjukkan hubungan yang linear antara konsentrasi xantina dengan aktivitas SOD. Gambar 6 menyajikan voltamogram siklik pada konsentrasi persamaan linearitas tersebut. 3 2 1 0 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -10 -11 0.0
-5
I (A)
Aktivitas SOD (µA)
koefisien yang tinggi menyatakan bahwa kenaikan konsentrasi, akan memberikan kenaikan arus yang sebanding. Semakin besar konsentrasi xantina maka aktivitas SOD semakin tinggi pada rentang konsentrasi xantina 0,200–0,275 Mm (Lampiran 6), sedangkan konsentrasi xantina lebih dari 0,275 mM mengalami penurunan aktivitas SOD.
0.200Unit 0.225Unit 0.250Unit 0.275Unit
Buferfosfat XO xantina
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
E (V) vs Ag/AgCl
Gambar 6 Voltamogram siklik untuk bufer fosfat, XO, dan xantina. Konsentrasi xantina yang digunakan pada kurva linearitas sebesar 0,200; 0,225, 0,250; dan 0,275 mM. Kisaran linear yang diperoleh dalam penelitian ini lebih kecil dibandingkan dengan penelitian Trivadila (2011), dalam teknik imobilisasi yang sama, hasil kisaran yang diperoleh lebih besar, yaitu 0,1–0,7 mM. Menurut Campanella et al. (2000), persamaan kurva linear y = (328,9 ± 6,4)x – (2,3 ± 1,3) dengan koefisien korelasi 0,9761 dengan kisaran variasi rentang konsentrasi substrat xantina 0,02–2,00 mM. Artinya hasil pada penelitian ini memiliki koefisien korelasi yang lebih sempit dengan hasil pada Campanella et al. sehingga pada penelitian ini dapat dikatakan baik.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
E (V) vs Ag/AgCl
Gambar 5 Voltamogram linearitas pada konsentrasi xantina 0,200; 0,225, 0,250, dan 0,275 mM. Linearitas juga dapat diketahui dari kemiringan garis, intersep, dan residual (Ermer & Miller 2005). Berdasarkan hasil pengujian didapat persamaan regresi linear untuk kurva garis y = -2,2700 + 13,400x. Berdasarkan persamaan tersebut didapat nilai intersep (a) sebesar -2,2700. Nilai intersep
Konsentrasi SOD imobilisasi yang optimum pada pH 11 dengan suhu 20 oC adalah konsentrasi 10 unit. Kurva linearitas konsentrasi xantina sebesar 0,200; 0,225, 0,250; dan 0,275 mM didapatkan persamaan garis y = -2,2700 + 13,400x dengan r = 0,9761 dan R² = 95,28%. Elektrode akan stabil bila disimpan dalam larutan bufer pH 11 pada suhu 20 oC selama 72 jam. Saran Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk meningkatkan kevalidan metode dan keajegan metode analisis melalui pendekatan metode dengan parameter yang lain.
6
DAFTAR PUSTAKA Campanella L, Favero G, Tomasetti M. 1997. A modified amperometric electrode for the determination of free radical. Sens. Actators B 44:559–565. Campanella L, Favero G, Persi L, Tomassetti M. 2000. Evaluation of radical scavenging properties of several plants, fresh or from a herbalist’s, using a superoxide dismutase biosensor. Pharmaceutical and Biomedical Analysis 24: 1055–1064. Campanella L, Bonanni A, Finotti E, Tomassetti M. 2004. Biosensors for determination of total and natural antioxidant capacity of red and white wines: comparison with other spectrophotometric and fluorimetric methods. Biosensors and Bielectronics 19: 641–651. Campanella L, Martini E, Tomasetti M. 2005. Antioxidant capacity of the algae using a biosensor method. Talanta 66: 902–911. Chaplin M. 2004. Apa biosensor?. [terhubung berkala]. http://www.lsbu. ac.uk/biology/enztech/biosensors.html. [24 Januari 2011]. Coradin T, Boissierre M, Livage J. 2006. SolGel Chemistry in Medicinal Science. Current Medicinal Chemistry 13: 99–108. Donnelly JK, Mc Lellan KM, Walker JL, Robinson DS. 1989. Superoxide Dismutase in Foods. A Review. J Food Chem. 33: 243-270. Du G, Li M, Ma F, Liang D. 2009. Antioxidant capacity and the relationship with polyfenol and Vitamin C in Actinidia fruits. J. Foodchem 113: 557– 562. Ermer J, Miller JH, editor. 2005. Method Validation in Pharmaceutical Analysis. Weinheim: Wiley-VCH. Fei J, Wu Y, Ji X, Wang J, Hu S, Gao Z. 2003. An Amperometric Biosensor for Glucose Based on Electrodeposited Redox polymer/Glucose Oxidase Film on a Gold Electrode. Analitical sciences, 19.
Gupta R, Chaudhury NK. 2007. Entrapment of Biomolecules in Sol-Gel Matrix for Applications in Biosensors: Problems and Future Prospects. Biosensors and Bioelectronics, 22p: 2387–2399. Harmita. 2004. Petunjuk pelaksanaan validasi metode dan cara perhitungannya. Majalah Ilmu Kefarmasian 1: 117–135. Hartati YW, Rochani S, Bahti HH, Agma M. 2005. Biosensor elektrokimia untuk deteksi urutan DNA tanpa indikator hibridisasi. [Seminar]. Bandung: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Padjadjaran. Hartati YW, Rochani S, Bahti HH, Agma M. 2007. Elektrokimia untuk Deteksi Urutan DNA Tanpa Indikator Hibridisasi. [Seminar]. Bandung: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Padjadjaran. Hattu N. 2009. Studi voltametri dan analisis antihistamin setirizin dihidroklorida dan deksklorfeniramin maleat dalam medium surfaktan menggunakan elektroda pasta karbon. [Disertasi]. Bandung: Program Studi Kimia, Institut Teknologi Bandung. Hiratsuka A, Fujisawa K, Muguruma H. 2008. Amperometric Biosensor based on Glucose Dehydrogenase and Plasmapolymerized Thin Films. Analitical sciences, 24. Huda M, Kurniawan F, Suprapto. 2010. Pembuatan elektrode pembanding Ag/AgCl dengan menggunakan membran komposit karbon-rotan. [Prosiding Skripsi]. Surabaya: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Sepuluh Nopember. [ICH] International Conference on Harmonization. 1995. Validation of Analytical Prosedures: Methodology Q2B [terhubung berkala]. www.ich.org. [20 Maret 2011]. Ikeda et al. 1998. Electrochemical monitoring of in vivo recronstitution of glucose dehydrogenase in Escherichia coli cells with externally added pyrroloquinoline quinone. J. Electroanal. Chem 449: 219–224.
7
and in and Vet
Tawaha K, Alali FQ, Gharaibeth M, Mohammad M, El-Elimat T. 2007. Antioxidant activity and total phenolic content of selected Jordanian plant species. J. Foodchem 104: 1372–1378.
Kilmartin PA. 2001. Electrochemical detection of natural antioxidant: principles and protocol. Antioxidant & redox signaling. Marry Ann Lieb Inc.
Trivadila. 2011. Biosensor antioksidan menggunakan superoksida dismutase Deinococcus radiodurans yang diimobilisasi pada permukaan elektrode pasta karbon dan parameter kinetikanya. [Tesis]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Kankofer M. 2002. Superoxide dismutase glutathione peroxidase activities bovine placenta: spectrophotometric electrophoretic analysis. Revue Med 153: 121–124.
Kunzelmann U, Bottcher H. 1997. Biosensor Properties of Glucose Oxidase Immobilized within SiO2 gels. Sensors and Actutors, 38–39: 222–228. Li CX, Deng KQ, Shen GL, Yu RQ. 2004. Amperometric Hydrogen Peroxide Biosensor Based on Horse Peroxidase labeled Nano-Au Colloids Immobilized on Poly (2,6-pyridinedicarboxylic acid) Layer by Cysteamine. Analytic Sciences 20: 1277–1281. Nazaruddin. 2007. Biosensor Urea Berbasis Biopolimer Khitin sebagai Matriks Immobilisasi. Jurnal Rekayasa Kimia dan Lingkungan 6: 41–44. Nur A, Dhini SUW, Febriana Y, Setyawan H. 2010 immobilisasi enzim glucose oxidase (god) dan horse radish peroxidase (hrp) untuk aplikasi biosensor dengan metode sol-gel. Seminar Rekayasa Kimia dan Proses. Surabaya: Fakultas Teknologi Industri, Institut Teknologi Sepuluh Nopember. O’Brien KB, Killoran SJ, O’Neill RD, Lowrya JP. 2007. Development and characterization in vitro of a catalasebased biosensor for hydrogen peroxide monitoring. Biosensors and Bioelectronics 22: 2994–3000. Pan D, Chen J, Yao S, Tao W, Nie L. 2005. An Amperometric Glucose Biosensor Based on Glucose Oxidase Immobilized in Electropolymerized Poly (oaminophenol) and Carbon Nanotubes Composite Film on a Gold Electrode. Analitic Sciences 21p: 367–371. Prieto-Simon B, Cortina M, Campas M, Calas-Blanchard C. 2008. Electrochemical biosensor as a tool for antioxidant capacity assessment. Sens Actuators B 129: 459–466.
Wang J. 1994. Analytical Electrochemistry. New York: VCH. Wang K, et al. 2009. Direct Electrochemistry and Electrocatalysis of Glucose Oxidase Immobilized on Glassy Carbon Electrode Modified by Nafion and Ordered Mesoporous. Journal of molecular Catalysis B: Enzymatic 58: 194–198 Weniarti. 2011. Biosensor antioxidant berbasis superoksida dismutase dari mikroba Indonesia yang diimobilisasi dalam nanokomposit zeolit alam Indonesia. [Tesis]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Wu J, Suls J, Sansen W. 1999. Amperometric Glucose sensor with Enzyme Covalently Immobilized by Sol-Gel Technology. Analitical science 15. Yao K, Zhu Y, Wang P, Yang X, Cheng P, Lu H. 2007. ENFET Glucose Biosensor Produced with Mesoporous Silica Microspheres. Materials Science and Engineering C 27p: 736–740.
8
LAMPIRAN
9
Lampiran 1
Elektrode rujukan, kerja, potensiostat/galvanostat
pembantu,
dan
sel
elektrokimia,
serta
alat
(a) Elektrode rujukan, kerja, pembantu, dan sel elektrokimia. (b) Seperangkat alat potensiostat/galvanostat
Lampiran 2 Bagan alir kerja penelitian secara umum
Preparasi elektrode pendukung Ag/AgCl dan elektrode pasta karbon serta modifikasi grafit dengan mediator
Imobilisasi SOD pada elektrode pasta karbon
Elektrode pasta karbon–SOD
Optimisasi konsentrasi SOD
Linearitas
Pengukuran elektrokimia
Stabilitas &aktivitas SOD imobiliasasi
10
Lampiran 3 Pembuatan elektrode pasta karbon dan imobilisasi enzim (Trivadila 2011)
parafin cair : grafit (1 : 2) campuran digerus
pasta karbon dimasukkan ke dalam badan elektrode hingga padat sampai permukaan permukaan karbon dihaluskan dengan kertas minyak
pipet mikro 5 µL enzim SOD diimobilisasi pada permukaan elektrode
pelarut diuapkan
permukaan elektrode dilapisi dengan membran dialisis
tutup dengan jaring nilon dan ikat dengan parafilm
elektrode disimpan dalam larutan bufer fosfat pH 11 dengan suhu 20 oC
11
Lampiran 4 Optimisasi konsentrasi SOD imobilisasi Konsentrasi SOD (unit) 0,2 0,5 1,0 2,0 5,0 10,0 20,0 50,0
∆Ipa (µA) -0,3977 -0,3583 0,4627 1,5845 1,5655 2,3710 0,3310 0,2445
Lampiran 5 Stabilitas elektrode pasta karbon yang diimobilisasi 10 unit SOD Waktu (jam) 0 2 10 24 48 72 120 168
Aktivitas SOD ∆I(µA (%) 0,360 0,375 0,398 100,00 0,369 92,71 0,359 90,20 0,341 85,68 0,191 47,99 0,018 4,52
Lampiran 6 Pengaruh konsentrasi xantina terhadap aktivitas SOD imobilisasi [Xantina] (mM)
Aktivitas SOD (μA)
0,200 0,225 0,250 0,275
0,481 0,660 1,089 1,458
12
