Proeeedings Seminar Pendayagunaan Untllk Kesejahteraan Masyarakat
Bandung, 26-27 September 1990 PPTN-BATAN
Reaktor Nllldir
PENENTUAN KARAKTERISTIKA ANTIBODI T4 UNTUK BAHAN PEREAKSI RIA Ratnawati Kukuh , Pringgo Soedigdo Pus at Penelitian Teknik Nuklir - Badan Tenaga Atom Nasional AJBSfRAK PENENTUAN KARAKTERISTIKA ANTIBODI T4 UNTUK BAHAN PEREAKSI RIA. Agar antiserum dapat digunakan untuk keperluan RIA maka harus memenuhi beberapa persyaratan yaitu mengandung antibodi dengan kespesifikan tinggi, cukup peka pada daerah kerja yang diinginkan serta mempunyai titer yang tinggi. Untuk men~i apakah antiserum T4 yang dihasilkan dapat digunakan untuk keperluan RIAmaka pada penelitian ini dilakukan 1.\iikarakteristika antiserum yaitu dengan menentukan nilai aviditas dan kespesifikan. Kespesifikan dievaluasi dengan mempelajari reaksi silang antiserum T4 terhadap berbagai senyawa yaitu 3,3,S-triiodo-L-tironina (Tg), diiodotironina (3,S-T2), 3-iodo-L-tirosina (MIT), 3,S-diiodo-L-tirosina (DIT).Hasil analisis menuDjukkan bahwa anti- serum T4 yang dihasilkan cukup spesifik untuk penentuan RIA. Aviditas antiserum atau harga K ditentukan dengan menggunakan kurva Scatchard yang menuDjukkan hubungan antara perbandingan fraksi terikat terhadap fraksi bebas (BIF) dan jumlah antigen terikat. Dari hasil percobaan diperoleh nilai K sebesar 3,6 x 1071/mol untuk kelinci 2,S3 kg dan 2,9 x 1071/mol untuk kelinci 2,39 kg. Limit deteksi yang dapat dicapai dengan antibodi T4 adalah 2,8 x 10,8 molll dan 3,4 x 10,8 molll berturut-turut untuk kelinci dengan berat 2,S3 kg dan kelinci dengan berat 2,39 kg. Dari hasil seluruh percobaan dapat disimpulkan bahwa antiserum T4 yang dihasilkan cukup memenuhi persyaratan untuk digunakan sebagai bahan pereaksi RIA. Hasil penelitian ini diharapkan akan sangat berguna bagi produksi kit T4 buatan dalam negeri.
AJBSTRACT DETERMINATION OF· THE CHARACTERISTICS OF T4 ANTIBODY FOR RADIOIMMUNOASSAY. Antisera for radioimmunoassay should meet a number of requirements such as having high spesificity, adequate sensitivity in the desired working range and high titre. In order to test the suitability of the T4 antiserum produced, the characteristics of the antiserum was studied by determining avidity and specificity. The specificity was evaluated through cross-reaction studies of the T4 antiserum with several compounds,i.e. 3,3,S-triiodo-L-thyronine (T2), diiodothyronine (3,S-T2), 3 iodo-L-tyrosine (MIT), 3,5-diiodo-L-tyrosine (DIT).The analytical results showed that the T4 antiserum produced is sufficiently specific for radioimmunoassay. The avidity or K value was calculated from Scatchard's plot which shows the relationship between the ratio of bound and free fractions and the amount of bound antigen. A K value of 3.6 x 1071/mole was obtained for the rabbit weighing 2.53 kg and 2.9 x 1071/mole for the one weighing 2.39 kg. The detection limits were found to be 2.8 x 10,8 molell and 3.4 x 10,8 molell respectively for the two rabbits. It can be concluded that the T4 antiserum produced meet requirement for radioimmunoassay and should make a significant contribution for the local production ofT4 kits.
PENDAHULUAN Antiserum adalah salah satu komponen te:rpenting dalam kit RIA. Agar antiserum dapat digunakan untuk keperluan RIA maka harus memenuhi beberapa persyaratan yaitu ml:!ngandung antibodi dengan kespesifikan dan aviditas yang tinggi, cukup peka pada daerah keIja yang diinginkan serta mempunyai titer yang tinggi [1,2]. Antiserum tidak dapat diseleksi atas dasar titer semata- mata. Antiserum dengan titer yang tinggi belum tentu memenuhi persyaratan untuk keperluan RIA. Untuk menguji apakah
antiserum dapat digunakan untuk keperluan RIA maka dalam penelitian ini dilakukan penentuan karakteristika antiserum lainnya. Kespesifikan adalah kemampuan antibodi untuk bereaksi dengan antigen yang dimaksud, tanpa disertai reaksi dengan antigen yang lain. Umumnya kespesifikan ini tidak bersifat mutlak, sehingga antibodi dapat bereaksi dengan molekul lain yang strukturnya mengandung persamaan dengan analit yang bersangkutan. Jika dalam plasma tidak terdapat senyawa lain yang mempunyai struktur yang se-
1
Proceedings Seminar Pendayagunaan Untuk Kesejahteraan Masyarakat
Bandung, 26·27 Septemb~r 1990
Reaktor Nuklir
PP1'N·BA1'AN
dengan ukuran 50 !!l,100!!1, 500 !!l,dan 1000!!1, rupa dengan senyawa yang harus ditentukan konsentrasinya, maka dapat diharapkan tidak dan tabung reaksi. akan ada gangguan dari zat lain. Akan tetapi TATAKERJA bagi banyak senya wayang mempunyai arti penPembuatan kurva baku dengan berbagai variasi ting secara biologis, terdapat sejumlah senyawa lain dengan struktur kimiawi yang serupa. Bia- pengenceran Mula-mula dilakukan pembuatan kurva sanya kita tidak menginginkan senyawa tersebaku dengan berbagai pengenceran antiserum, but ikut tertentukan dalam suatu penentuan, karena efek biologisnya berbeda. Jadi kespe- hingga diperoleh pengenceran yang memberisifikan antibodi merupakan salah satu faktor kan daerah keIja dengan kepekaan yang diiutama yang menentukan kualitas dari penen- nginkan. Untuk pembuatan kurva baku digutuan. Adanya reaksi silang akan mempenga- nakan 25 !!l larutan baku T4 dengan konsentrasi 0, 10, 50, 100, 150, dan 250 nmol/l. Kemuruhi hasil analisis [2,3]. Kepekaan suatu sistem penentuan RIA dian ditambahkan 100!!1T4 bertanda 1251clan sangat bergantungpada aktifitasjenis senyawa 100!!1 antiserum T4 (hasil pengenceran). Cambertanda dan aviditas antibodi. Aviditas atau puran diaduk dengan pengaduk vortex, diinkunilai K menggambarkan energi ikatan atau ke- basi selama 1 jam pada suhu kamar. Selankuatan ikatan antara antigen dan antibodi. jutnya ditambahkan 1 ml larutan PEG 18% untuk memisahkan fraksi terikat dan fraksi Pad a penentuan RIA nilai K menggambarkan bebas. Setelah dipusing, cairan dari setiap takepekaan dari suatu penentuan, makin kecil bung didekantasi dan keaktifan residu dicacah konsentrasi antigen yang akan ditentukan didengan menggunakan pencacah sinar-y. Properlukan antibodi dengan aviditas yang tinggi. tokol RIA untuk percobaan ini dapat dilihat Perhitungan nilai K dapat ditentukan dari pada Tabell. data kurva baku dengan menggunakan metode Tabell. Protokol RIA Scatchard. Harga K diperoleh dari kemiringan garis (slope)[4,5]. - n -25 25 :~5 10C -1 10 50 akb0 --(nmol/l) 125 10C 10( 10C likl5( 0 25( konsentrasi baku T4an up an100 voDalam penelitian ini antiserum T4 diuji T pe mb serum baku Cuplikding 18% an Antibebas PEG lum (!!l)kerja 12tl-T4 Larutan denganLarutan menentukan titer, daerah optimal, Serum Inkubasi suhu kamar selama 1 iam nilai aviditas dan kespesifikan. Kespesifikan dievaluasi dengan mempelajari reaksi silang antiserum T4 terhadap T3 ' 3,5- T2 ' MIT (3-iodo-L-tirosina), DIT (3,5-diiodo-L-tirosina), dan nilai aviditas ditentukan dari kurva Scatchard.
I
BAHAN DAN PERALATAN Bahan yang digunakan
Antibodi yang digunakan adalah antibodi hasil penelitian yang terdahulu yaitu antibodi dari kelinci 2,39 Kg dan kelinci 2,53 Kg. 3,5-diiodo-L-tirosina (DIT), 3-iodo-L-tirosina (MIT), 3,5-T2(diiodotironina), T3 ' polietilenglikol (PEG-6000), dapat diperoleh dari Sigma. NaN3, NaH2 P04 ' Na2 HP04 ' diperoleh dari E. Merck. Semua bahan mempunyai tingkat kemurnian pereaksi analitik. Selain itu digunakan pula serum bebas, T4 bertanda 1125,dan baku T4 produksi PPTN. Peralatan
Perala tan yang digunakan adalah alat pencacah sinar y (Miniassay type 6-20), alat pemusingyang diperlengkapi pendingin (lEC Centra-7R), alat pH meter (Metrohm HerisauE 520), alat freeze dryer (Labconco).Kecuali alatalat tersebut digunakan pula pipet ependorf
Pemusingan : selama 20 menit pada 2000 g. Dekantasi supernatan d~Il cacal1.eIl4~pl:!n. Ni,lai keakt~fan senyawa b~rtan':ia digu~k;~n untuk menentukan % ikatan. hasil seluruh percob~an dibuat grafili i Dari ... _;~-',j antara fraksi terikat dan konsentrasi T4 serta f<
i..
2
,~
,',
~."
•
Proceedings Seminar Pendayagunaon Untuk Kesejahteraan Masyaralwt
Brmdung, 26-27 September 1990 PPTN8ATAN
Reakror Nllklir
HASILDAN DISKUSI
gl'afik profil presisi yang menggambarkan hubungan antara % koefisien variasi (%CV) dengan konsentrasi.
Antiserum yang digunakan pada penelitian ini adalah antiserum yang diperoleh dari kelinci 2,53 kg dengan nilai titer 1 x 104 dan Plmentuan volum pereaksi optimal un/uk mendap,!tkan daerah kerja dan kepekaan yang diinginkan kelinci 2,39 kg dengan nilai titer 6 x 102 (hasil Setelah diperoleh pengenceran antiserum penelitian yang terdahulu). ynng tepat ditentukan pula volum pereaksiyang Antiserum tidak dapat diseleksi atas daoptimal untuk mendapatkan daerah kerja dan sar titer semata-mata. Keuntungan antiserum kopekaan yang diinginkan. Untuk maksud ini dengan titer tinggi ialah sedikit antiserum dadilakukan berbagai kombinasi dengan disain pat digunakan untuk sejumlah besar penentuan porcobaan sebagai berikut: [4,5,6]. Umumnya antiserum dengan pengen1. 25 ~llarutan bakuT4, 50 ~l T4bertan d a 1251, ceran tinggi memberikan kepekaan analisis 50 ~l antiserum T4 yang tinggi. Akan tetapi pada daerah kerja yang 2. 25 ~llarutan baku T4, 100 ~l T4 bertanda diinginkan sering tidak memberikan kondisi 1251, 50 ~l antiserum T4 yang optimal. Jadi untuk menentukan 3. 25 ~llarutan baku T4, 50 ~l T4 bertanda pengenceran antiserum optimal pada daerah 1251,100 ~l antiserum T4 kerja yang diinginkan dilakukan pembuatan 4. 25 I-!llarutan baku T4, 100 ~l T4 bertanda kurva baku dan kurva profil presisi dari 1251,100~l antiserum T4 berbagai pengenceran antiserum. Kurva profil presisi sangat berguna untuk 5. 50 ~llarutan baku T4 , 50 ~l T4 bertanda 1251. 00~l antiserum T4 mengetahui sej~uh mana kepekaan dan daerah Percobaan dilakukan sesuai dengan pro- kerja yang dapat dicapai dengan sistem analisis takol RIA yang tertera pada Tabel1. Dari selu- tersebut (7). Kurva profil presisi diperoleh ruh percobaan kemudian dibuat grafik antara dengan mengalurkan % CV terhadap fraksi terikat dan konsentrasi T4 serta grafik konsentrasi. Daerah kerja yang diinginkan profil presisi. adalah daerah konsentrasi yang memberikan Plmentuan aviditas kesalahan < 10%. Penentuan aviditas dilakukan setelah diUntuk memperoleh daerah pengenceran kdahui pengenceran antiserum dan volum pe- antiserum yang optimal dilakukan pengenceran reaksi optimal. Aviditas ditentukan dari kurva antiserum T4 antara 1/1000 -1/7500 untuk keS<:atchard yaitu hubungan antara B/F (fraksi linci dengan berat 2,53 kg dan 1/200 - 1/400 terikat/fraksi bebas) danjumlah antigen terikat untuk kelinci dengan berat 2,39 kg. Hasil opti(molm yang diperoleh dari data kurva baku. masi pengenceran antiserum T4 dapat dilihat Aviditas dinyatakan dengan harga K pada re- pada Gambar 1, Gambar 2, dan Tabel 2 (lihat aksi antigen-antibodi. Nilai K ini diperoleh da- halaman berikut). ri koefisien arah (slope) pada kurva Scatchard. Kurva profil presisi menunjukkan bahwa makin encer konsentrasi antibodi akan membeP~'nentuan kespesifikan antibodi T4 rikan limit deteksi yang makin rendah. Jadi Kespesifikan ditentukan dari reaksi silang apabila diinginkan penentuan pada konsentrasi 3,5-T2' DIT,MIT,dan T3, terhadap antibodi T4 yang sangat rendah diperlukan antibodi deU ntuk maksud ini dilakukan 5 seri percobaan. ngan tingkat pengenceran yang tinggi. WalauSori pertama dibuat kurva baku T4 dengan konsentrasi 0, 10, 50, 100, 150, dan 250 nmol/l pun antibodi dengan tingkat pengenceran tinggi dIm seri ke 2 hingga ke 5 dibuat kurva pengen- dapat mencapai limit deteksi yang rendah tetapi ceran berbagai senyawa tersebut dengan kon- presisi percobaan kurang baik karena nilai ikatsentrasi 10, 100, 1000, 10.000, 100.000 nmol/l. an maksimum (BolT) rendah. Hal ini akan memProsedur percobaan dilakukan sesuai dengan berikan bentuk kurva baku yang landai dan protokol yang terdahulu. Derajat reaksi silang akan mengurangi kepekaan analisis. Pada penentuan klinis untuk hormon tida.pat dihitung dengan membandingkan Ed 50 roksina (T4) daerah hipotiroida dan hipertiropa.da kurva baku T4 dengan Ed 50 pada kurva ida merupakan daerah yang sangat penting unpengenceran senyawa-senyawa T3 ' 3,5-T2 ' DIT, MIT. tuk pemeriksaan klinis, maka kurva baku harus mencakup kedua daerah tersebut. Dari hasil pengujian diperoleh bahwa pengenceran antibodi optimal adalah 1/2000 untuk kelinci dengan berat 2,53 kg, dan 1/300 untuk kelinci
3
Proceedings Seminar Pendayagunaan Untuh Kesejahteracm Masyarakat
Reaktor Nuhlir
13andung, 26-27 September 1990 PPTN-BATAN
",Ii)
a,
1
':::':"i2~",=".",_._.~_ "rcU:.~
pAdo.
nmol/l
I:Ct•.•••••••t,.••.•~
clka,tar'l ",Wc••t,'ftU •••1
o p."''Jenc.,-an .~oo;
•
r""'.nc.' ••..•
. C p.n9 ••.•c:.,-Qn •.•••'''00; p.ng_ •.•c:..rGn ,-",•.500;
•
p.n,_ncerGn J./200~ p.n9.ncer ••••.•
o
Gambar 1. Kurva baku dan kurva profil presisi pada berbagai pengenceran 2,53 kg ).
A
antiserum
T4 ( kelinci
-='-'~::~<:'\ '.
...
\';..
'/. ~ s.
..•
~~.
''0.\..
~ a
'"
.... ~t.
.',\\\".. ..
"0
'.~:-., a ••.••• 010
K
J~
'\ ..
..
1
'"
---to-
•
••• ',It ..•""
Q. •.
n
nil
\ ••• ~\,~.
01 / I
~,..,
~':,:;
••~ ••••
.tr-:'1....~.~~_ .•
Dn~tntuli
o P••.•9.roc:.,. ••••.•1/ .•00; • p."g.ru:.r_ •.• L/250;
Gambar 2. Kurva baku dan kurva profil presisi pada berbagai pengenceran 2,39 kg )..
4
•
p.n9 ••.•c.,-on
0 pon9.nc.,-..
antiserum
o
';;;-;-"IDI/I
, .••. :Joo
~.••. ~_oo
T4 ( kelinci
Proceedings Seminar Pendayagunaan Untuk Kesejahteraan Masyarakai
Bandung, 26-27 September 1990 PPTN-BATAN
Reaktor Nuklir
lang biasanya ditentukan sebagai perbandingan konsentrasi antigen spesifik terhadap konsentrasi senyawa yang mengadakan reaksi silang pada Ed 50 (BfBo = 50%) (1,3). Dari data yang diperoleh T 3 adalah antigen yang bereaksi silang terhadap antibodi T4 sedang untuk senyawa MIT,DIT,dan T2 derajat reaksi silangnya sangat keeil. Besar reaksi silang T 3 adalah 5,0 % atau 0,1 nmol/l untuk kelinei 2,53 kg dan 2,75 % atau 0,06 nmol/l untuk kelinei 2,39 kg. Dari data tersebut di atas ternyata reaksi silang T3 untuk kedua antiserum yang dihasilkan tidak memberikan perbedaan yang nyata. Kadar T 3 dalam serum darah normal berkisar antara 1,5 - 2,2 nmol/l, yang berarti jauh lebih kecil dari kadar T4 ' maka adanya reaksi silang tidak signifikan pengaruhnya terhadap hasil pengukuran konsentrasi T4 . Hasil penentuan reaksi silang terhadap antibodi T4 selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 4.
dengan berat 2,39 kg (Gambar 1,2).Pad a kondisi pengeneeran ini diperoleh daerah kerja yang c:ukup lebar. 'Pabel 2. Hasil optimasi pengeneeran antibodi 'P4'
berat 2.30 ke.
20 11 18 8Ed50 ----420 300 400 750 700 32 1000 20 19 45 -59,1 600 1000 5.5 11,8 57,6 130 BolT (%) 47,0 25,7 42,0 77,6 18,2 63,7 65,6 81,7 73,9 (nmol/l) 13,5 112,3 32,0 46,2 42,9 74,5, 63,2 65,3 67,5 presisi preSlSl Batas profil a. Kelinei dem1;anberat 2,53 kg. (nmol/l) (nmol/l) Pengeneer-
Tabel 4. Hasil penentuan reaksi silang terhadap antibodi T4' a. Kelinei dengan beratI 2,53 k Senvawa 100 5 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001
Dengan kondisi pengeneeran ini dilakukan pula penentuan volum pereaksi optimal untuk mendapatkan daerah kerja yang diinginkan. Hasil penentuan dari berbagai kombinasi pereaksi dapat dilihat pada Tabel 3, Gambar 3 dan 4, masing-masing untuk kelinei dengan berat 2,53 kg dan 2,39 kg. Dari data yang diperoleh ternyata disain penentuan dengan 25 f..lliarutan baku T4 (euplikan), 100 f..llT4 bertanda 1251, dan 100 f..llantiserum T4 memberikan hasil pereobaan yang eukup peka pada daerah kerja yang diinginkan yaitu antara 18 - 700 nmol/l 1.lntukkelinei dengan berat 2,53 kg dan 19 - 600 nmol/l untuk kelinci dengan berat 2,39 kg. Nilai normal T4 berkisar antara 60 - 150 nmol/l [5]. (lihat halaman berikut ). Mengingat bahwa untuk penentuan T4 dengan metode RIA tidak diperlukan pemisahan antibodi T4dari antibodi lainnya yang ada maka perlu dilakukan uji kespesifikan. Kespesifikan dapat dievaluasi dengan mempelajari reaksi Bilangantiserum T4terhadapsenyawa-senyawa yangmempunyai struktur molekulyang hampir :3ama.Adanya reaksi silang akan inenyebabkan hasil pengukuran eenderung terlalu tinggi. Ha:3ilpenent).lan reaksi silang terhadap antibodi :3pesifikT4 dapat dilihat pada Gambar 5 dan 6 (lihat halaman berikutnya). Derajat reaksi si-
b. Kelinei denean berat 2.39 k~. Senvawa T4
T3
MIT DIT 3,5 T2
100 2,75 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001
Dari hasil analisis dapat disimpulkan bahwa antiserum T4 yang dihasilkan eukup spes ifik. Kepekaan dari suatu sistem penentuan erat hubungannya dengan aviditas atau harga K antibodi. Maka untuk dapat memperoleh suatu sistem dengan kepekaan yang tinggi umumnya digunakan antiserum yang mempunyai aviditas tinggi. Aviditas atau harga K antiserum dapat dipelajari dengan menggunakan kurva Seatehard. Pada prinsipnya penentuan harga K sangat sederhana, teta pi dalam prakteknya sering
5
Bandllng, 26-27 September 1990 PPTN-BATAN
Proceedings Seminar Pendayaguncum Reaktor NukliJ' Untuk Kesejahteraan. Masyarakat
Tabel 3. Hasil optimum dari berbagai 15 250 400 19 600 18 700 370 17 8(nmol/l) 7,5-220 ---300 500 25 300Bo/l' 46,2 Ed 15,4 39,2 19,1 730 33,2 44,0 5020 20,6 42,0 45,7 13,4 Batas profil presisi(%) (nmol(l) (nmoI(l) 80,3 62,1 79,0 82,8 65,6 54,6 56,9 65,3 40,5 63,2 a. Kelinci dengan berat 2,53 kg. 100!AI !AI125I-T4 125I-T4 50 !AIlarutan f.!llarutan !AIIarutan baku !AIlarutan Kombinasi pereaksi b. dengan berat 25 Kelinci !AIIarutan baku
2,39 kg.
6
kombinasi
pereaksi.
Ban-dung, 26-27 September 1990 PPTN-BATAN
Pl'Ooeedings Seminar Penria)'agunaon. Reaktor Nuklir Untuk Kesejrihteraon. Masyarakat
'{, tV
1
---+
Kuuntrul
--+
ko" II ••Hui
••
potlo. k." •• ntru.o~ 0
'ra.il:.l t.rU••t: loa 1,.II..t
X • to..rlolCo."ba.ku: Y • I.Z':"T.1
o
25
J.J\
X,
iDO
."'\
Y,
&00
,..~ 2; (1\ z::II JJl
Z • o,..Ubodt
)C, :SO JJ\
• ao J.J~ V, 100 ~\ Y, JOO ""I %.:0 t:s ,..U X. ,n o U }.Il x. 100 }.It Y, 50 #1 Z
$01\
V,
T.•
""
J.JL 'Z
Y. 400
fit
2-
Gambar 3. Kurva baku dan kurva profil presisi pada berbagai kombinasi pereaksi ( kelinci 2,53
kg)
~I,~,
,.
r
q
",
0:.,
r
.•...
\~:'.. \ '." '~'~::;~-~?~!\-'''-''''''~1f<;;;;i~... ~,o'''' 100 f5D
nmol/I
UO
1000 n Mol/I
Kon,enrrui
x • \.(U"u\a.n bCLku: Y • 1:1.~:I_T./ Z • IISntlbodi T'" 2:1' ~l )c. aDo ,&It Y, sCa jJl. 2; 425 lolL X. :SO pi Y. 50 Jolt "Z • ~O #-ILx, 1.00 }Jl Y, .1.00 Ii' %:. 1$ }oJl X. !So }Jt y. SOD pI Z D ~ J.I\ )( •.• 00 J.I' Y, :tO}lt z:
o
Gambar 4. Kurva baku dan kurva profil presisi pada berbagai kombinasi pereaksi ( kelinci 2,39 kg)
7
Proceedings Seminar Pendayagunaan Untuk Kesejahteraan Masyarakat
Bandung, 26-27 September 1990 PPTN-BATAN
Reakwr Nuklir
.<0... •......•
'I, !B.
!~
.~ .
. • .•.o..•~-.o T,! .aoooo
____
•
"mol}1
Ko_.entrHi
Gambar 5. Hasil penentuan reaksi silang antibodi T4 (kelinci 2,53 kg).
~o~
"'r'~' .... "c:::::.:', .." •.•:':'~"':'." ",
80
''''
"
- ----------.-o
••
••. ", .'~' ,,,, ..,,,,,!, ~::
..0.•••
.,
-----
"",
'.
. '!
'0•
••
••••••••••••
r"C'U"U
'b '. _"'u
- •••
~'"
,
" 100000
nmol/l
Gambar 6. Hasil penentuan reaksi silang antibodi T4 (kelinci 2,39 kg).
8
Proceedings Seminar Pendayagunaan Untuh KesejahteraOR Masyarakai
Reaktor Nuhlir
Bandung, 26-27 September 1990 PP1'N-BATAN
mengalami banyak persoalan. Hal ini disebabkan karena antiserum yang dihasilkan adalah antiserum poliklonal yang mengandung beberapa populasi antibodi clansetiap antibodi memberikan harga K yang berbeda. Keadaan inilah yang memberikan kurva Seatehard sering tidak berupa garislurus tetapi berupa garis lengkung yang merupakan superposisi beberapa fungsi linier dari setiap antibodi spesifik. Pada Gambar 7 clan 8 terlihat bahwa kurva Seatehard merupakan superposisi dua fungsi linier dengan kemiringan masing-masing ialah K1 = 3,6x 107l1moldan~ = 8,8x 1051/moluntuk kelinci berat 2,53 kg dan K1 = 2,9 x 107 lImol dan K 2 = 9 x 105 limoI untuk kelinei berat 2,39 kg . Sekalipun antiserum yang dihasilkan adalah antiserum poliklonal yang mengandung heberapa populasi antibodi tetapi dengan dilakukannya pengeneeran antiserum, maka antihodi dengan konsentrasi yang rendah dapat diahaikan.
..
~
,,12 .c, :
., B
r
1
Gambar 8. Kurva penentuan aviditas antiserum T4 (kelinei 2,39 kg). l.G'
.,
0.'
Konu"trUi
(10.71'101/1)
pada berbagai konsentrasi dapat disimpulkan bahwa antibodi yang peka untuk penentuan T4 ialah kurva dengan kemiringan K1 . Harga K untuk antibodi yang umum digunakan dalam RIA berkisar antara 107- 10121/mol [2,4]. Harga K yang diperoleh untuk antiserum T4 dalam pereobaan ini relatifrendah (107l/mol). Kenyataan ini sering dijumpai apabila imunogen yang disuntikkan identik dengan material endogen pada hewan penerima. Sehingga antibodi yang dihasilkan akan bereaksi dengan kedua material tersebut, yang akan mengubah karakteristika dari antiserum. Antigen endogen akan berikatan dengan antibodi yang mempunyai aviditas tinggi. Apabila konstanta disosiasi reaksi ikatan antigen antibodi rendah, maka proses yang terjadi tak reversibel sehingga antiserum yang dihasilkan mempunyai aviditas relatifrendah [4]. Keterangan molekuler tentang hal ini belum diketahui seeara pasti dan masih perlu dipeeahkan. Mengingat bahwa T4 adalah zat yang endogen, maka aviditas antiserum T4 relatif rendah. Aviditas suatu antiserum menentukan limit deteksi dari suatu sistem penentuan. Limit deteksi adalah sebanding dengan 11K, maka limit deteksi yang dapat dieapai dengan antibodi T4 yang dihasilkan oleh kelinei 2,53 kg adalah 2,8 x 10-8 mol/l dan untuk kelinei 2,39 kg adalah 3,4 x 10-8mol/l. Limit deteksi dari kedua
r
..• ____
t
Gambar 7. Kurva penentuan aviditas antiserum T4 ( kelinei 2,53 kg ). Dari data kurva baku dengan menggunakan metode Seatchard diperoleh bahwa antiserum T 4 terdiri dari 2 populasi antibodi yaitu dengan kemiringan K1 dan ~ . Kedua nilai K ini menggambarkan kepekaan analisis untuk kedua jenis antibodi dalam serum yang dihasilk9.n.Dengan pereobaan menggunakan baku T4
9
Proceedings Seminar Pendayagunaan Untllk Kesejahteraan Masyarakai
Bandllng, 26-27 September }990 PPTN-BATAN
Reaktor Nllklir
antibodi yang dihasilkan tidak memberikan perbedaanyang nyata. Mengingat bahwa kadar hormon T4 dalam serum cukup tinggi antara 60 - 150 nmol/l maka antibodi T4 yang dihasilkan cukup peka untuk penentuan T4 . KESIMPULAN
Kondisi penentuan daerah keIja optimal diperoleh dengan melakukan pengenceran 1/2000 untuk kelinci 2,53 kg dan 1/300 untuk kelinci 2,39 kg, serta percobaan mengunakan 25 !AI baku/ cuplikan T4, 100 !AI T4berlanda 1251,
dan 100 !AI antiserum T4yang memberikan daerah kerja antara 18-700 nmol/l untuk kelinci 2,53 kg dan 19-600nmol/l untuk kelinci 2,39 kg. Hasil uji karakteristik antiserum menunjukkan bahwa antiserum T4 yang dihasilkan cukup spesifik untuk penentuan RIA dengan batas deteksi 2,8 x 10-8 molJI untuk kelinci 2,5:3 kg dan 3.4 xlO-8 molJIuntuk kelinci 2,39 kg. Antiserum yang dihasilkan cukup memenuhi persyaratan untuk digunakan sebagai bahan pereaksi RIA.
DAFTAR PUSTAKA
1. Anonim,"Laboratory Training Manual on Radioimmunoassay in Animal Reproduction", Technical Report Series No 223, IAEA, Vienna, 1984, 100-105. 2. Edward, R, "An Introduction", Immunoassay, William Heinemann Medical Books, London, 1985, 12-23. 3. Mera, V., "Preparation and Characterization of Antibody", Diklat Radioimmunoassay ke II, PPTN-BATAN, Bandung, 1988. 4. Chard, T., "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology",An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, 2ed., Elsevier Biomedical Press, Amsterdam, 1982,22-24,95-109. 5. Thorell, J.I., S.M. Larson, "Methodology and Clinical Application", Radioimmunoassay and Related Techniques, The C.V. Mosby Company, 1978, 11-31, 114-118. 6. Pillay, M.RA.and RS. Mani, "Radioimmunoassay", Ind. J. Pharm. Edu., 12, 1978, 172-183. 7. Ekins, RP., "Quality Control and Assay Design", Radioimmunoassy and Related Procedure:; in Medicine, vol. II, IAEA, Vienna, 1978, 39-56. DISKUSI
Salman Umar: Penandaan T4 menggunakan radioisotop 12512 1251 ini mempunyai beberapa kelemahan- kele·· mahan. Karena telah ditemukan radioisotop 1 31yang mempunyai sifat-sifat yang ideal, apakah tidak terbayang untuk mengembangkan kit RIA dengan penandaan 1231 tersebut. Ratnawati Kukuh: Mengingat bahwa radioisotop 1231 mempunyai waktu paruh yang pendek, sehingga untuk penandaan T4 kurang memenuhi syarat, sebab sebagai radioisotop penanda dibutuhkan radio·· isotop yang mempunyai waktu paruh yang cukup panjang (1251 mempunyai waktu paruh 60 hari), agar tidak diperlukan pembuatan antigen T4 bertanda yang berulang-ulang.
10
