Siti Darwati, dkk.
ISSN 0216 – 3128
19
PEMBUATAN KIT RIA 125I-PROGESTERON UNTUK PENENTUAN PROGESTERON DALAM SUSU SAPI Siti Darwati, Agus Ariyanto, Fitri Yunita, Gina Mondrida, Triningsih, Sutari dan Sri Setyowati P2RR – BATAN ABSTRAK Progesteron merupakan hormon yang tingkat kandungannya sangat menentukan kondisi reproduksi sapi ternak. Penentuan progesteron dalam jumlah yang sangat kecil dapat dilaksanakan dengan metoda radioimmunoassay (RIA) yang memiliki kepekaan dan kespesifikan yang tinggi. Kit RIA progesteron yang beredar saat ini diperoleh dari import dengan harga cukup mahal, sehingga perlu dikembangkan produksi kit RIA dengan harga cukup rendah. Dalam penelitian ini dikembangkan pembuatan kit radioimmunoassay (RIA) 125I-progesteron untuk penentuan progesteron dalam susu sapi dengan menggunakan metoda coated tube. Antiprogesteron poliklonal yang ditumbuhkan pada kelinci (titer 1:12,000) diimobilisasikan pada tabung polipropilen utuk mendapatkan antibody-coated tube. Senyawa 125I-progesteron sebagai tracer yang dibuat dengan metoda chloramin-T memberikan kemurnian radiokimia 97% dengan rendemen lebih dari 80% dan aktifitas spesifik 395 Ci/g. Senyawa progesteron bertanda radioaktif ini stabil selama 2 bulan terlihat dari parameter imunoreaktifitas (B/T %) dan ikatan non-spesisik (NSB %) serta kemurnian radiokimianya. Larutan standar progesteron dibuat dengan cara pelarutan didalam pelarut bovine-serum-albumin. Assay performace kit yang telah dihasilkan adalah B/T rata-rata 30%, NSB rata-rata 0.80% dengan sensitifitas pengukuran 2.3 ng/ml. ABSTRACT Progesterone is hormone which concentration is a desisive factor on cow’s reproduction. Determination of progesterone at a very low concentration can be performed using radioimmunoassay (RIA) of high sensitifity and specificity. Progesterone RIA kits in the market nowadays were obtained from commercial company which cost highly enough to encourage the development of RIA kit locally. This experiment developed production of 125I-Progesterone RIA kit to determine progesterone level in cow’s milk using coated tube methode. Polyclonal antiprogesterone generated in rabbits (of titer 1:12,000) was immobilized onto polypropilene tube in order to obtain antibody-coated tube. 125I-progesterone used as tracer made by chloramin-T method gave 97% radiochemical purity at 80 % yield and 395 Ci/g specific activity. The tracer showed stability for 2 months as shown in immunoreactivity (B/T %) and non specific binding (NSB %) parameters as well as its radiochemical purity. Series of progesterone standard solution was made with bovine-serum albumin. Assay performace of the kit is 30% average B/T, 0.80% NSB and sensitivity of measurement at 2.3 ng/ml.
PENDAHULUAN spek kespesifikan dan kepekaan cara-cara immunoassay, telah memungkinkan metoda ini banyak digunakan untuk penentuan berbagai jenis senyawa kimia. Selain itu, metoda ini juga reproducible dengan pengerjaan yang sederhana. Dengan demikian maka penggunaan metoda ini banyak dipakai baik dalam bidang klinis maupun non-klinis, khususnya untuk analisis steroid. Progesteron merupakan hormon steroid yang umumnya diproduksi oleh corpus luteum yang penting dalam pengaturan siklus haid.
A
Progesteron dalam darah berfungsi antara lain untuk masa pembuahan dan mempersiapkan kelenjar susu untuk sekresi air susu, mengetahui parameter infertilitas, evaluasi gangguan haid dan menilai fungsi plasenta selama kehamilan. Kadar progesteron dalam darah adalah minimum pada saat sebelum dan selama pembuahan dan menjadi maksimum pada hari ke 15. Bila pembuahan tidak terjadi maka akan terjadi degenerasi pada corpus luteum dan konsentrasi progesteron kembali ke keadaan semula dimana siklus pembentukan sel telur kembali terjadi. Konsentrasi progesteron dalam darah
Prosiding PPI – PDIPTN 2005 Puslitbang Teknologi Maju – BATAN Jogjakarta, 12 Juli 2005
20
ISSN 0216 – 3128
berhubungan erat dengan kesetaraan konsentrasinya dalam susu. Dalam nilai absolut, konsentrasi progesteron dalam susu lebih tinggi dibanding dengan konsentrasi serumnya disebabkan kelarutannya dalam lemak susu. Perubahan pada berbagai fase siklus pada serum maupun susu mempunyai pola yang sama. Jadi, untuk mengevaluasi kondisi reproduksi pada hewan ternak maka penentuan kadar progesteron dalam serum dapat digantikan dengan sampel susu. Penentuan progesteron dalam susu memberikan keuntungan dalam kesederhanaan pengambilan sampel dan dalam hal penentuan langsung tanpa memerlukan tahap pemisahan seperti memisahkan serum dari komponen darah lainnya. Tujuan penelitian ini adalah pembuatan kit RIA menggunakan metoda coated tube untuk penentuan progesteron dalam sampel susu sapi. Disini antibodi diimobilisasikan pada suatu fasa padat yaitu tabung polipropilen untuk memudahkan pelaksanaan assay, yaitu tidak diperlukan tahap pemisahan antara fraksi kompleks antigen (komponen analit dari sampel) yang terikat antibodi dengan fraksi antigen bebasnya. Kit ini pemakaiannya sederhana dan cepat serta reproducible. BAHAN dan TATA KERJA Bahan dan Peralatan Bahan mencakup: progesteron–11hemisuksinat–Tyrosine–Methyl-Ester untuk penandaan didapat dari BARC India, antiprogesterone dibuat di Pusat Pengembangan Radioisotop dan Radiofarmaka (P2RR). Tabung polipropilen berdasar bintang (75x12 mm) didapat dari Nunc. Kit 125I-progesteron untuk pembanding didapat dari DPC, dan 125I didapat dari Nordion. Senyawa kimia lainnya didapat dari Sigma. Peralatan mencakup: Multi-gamma-counter (GMS), vortex mixer (Thermolyne), kolom Sephadex G-25 (PD-10, Pharmacia), tabung reaksi (Eppendorf), pipet berbagai ukuran mulai 5-200l (Eppendorf). Tata Kerja Pembuatan anti-progesteron poliklonal Konjugasi progesteron-11-hemisuksinat ke molekul BSA untuk mendapatkan molekul immunogen dilakukan dengan memakai prosedur Thorell et al. Sebanyak 26 mg of progesteron-11hemisuksinat dicampurkan dengan 1mL dioxan
Siti Darwati, dkk.
dan 20 mL tri-N-butylamin (0.30 mmol). Campuran didinginkan sampai 11ºC, lalu ditambahkan 10 mL isobutilchloroformat. Kemudian campuran dibiarkan bereaksi pada 4ºC selama 20 menit. Sebanyak 4 mL larutan 84 mg BSA dalam campuran dioxan : air (1:1) ditambahkan kedalam campuran pada temperatur 4ºC, sambil dikocok selama 4 jam pada 4ºC. Kondisi pH diatur pada 8-9 dengan menggunakan NaOH 0.1M. Kemudian campuran didialisis selama 24 jam memakai aquadest. Kondisi pH dijaga pada 4.5 menggunakan HCl dan kemudian dibiarkan selama 4 hari pada 4ºC. Campuran reaksi disentrifuga pada 3500 rpm selama 15 menit. Supernatan dibuang dan endapannya dilarutkan kembali dengan 1 mL aquades. Sebanyak 200 mL NaHCO3 5 % ditambahkan kedalam campuran reaksi dan dialisis kembali selama 4 jam menggunakan aquades. Larutan konjugat yang dihasilkan disimpan pada temperatur -20ºC masing-masing sebanyak 40l per vial. Pembuatan emulsi untuk diinjeksikan ke kelinci dilakukan dengan mencampurkan 1 mL NaCl dan 1.2 mL Freund’s Adjuvant Complete dengan 3 vial konjugat progesteron diatas. Pencampuran dilakukan hingga terbentuk emulsi. Kemudian emulsi ini diinjeksikan secara subcutan pada beberapa posisi di daerah punggung kelinci. Injeksi untuk booster dilakukan pada selang waktu setiap satu bulan. Pembuatan senyawa progesteron bertanda 125I Penandaan progesteron dengan 125I menggunkan metoda chloramin-T. Tabung reaksi eppendorf berisi 2.5 g (10l) Progesteron-TME ditambahkan dengan 10 l bufer posfat 0.5M pH 7.5 (PB), 4 l (1mCi) Na-125 I dan 10 g (10 l) chloramin-T dalam 0,05 M PB pH 7.4 (konsentrasi 1mg/ml). Campuran reaksi dikocok dengan vortex mixer selama 1 menit pada temperatur ruang. Kemudian ditambahkan 25 g (25 l) Na2S2O5 dalam 0.05 PB pH 7.4 (konsentrasi 1 mg/ml) kedalamnya. Campuran reaksi dimasukkan kedalam kolom PD-10 yang telah dijenuhkan dengan BSA 5%. Kolom dielusi dengan PB 0.05 M pH 7.4. Masingmasing fraksi sebanyak 500 l diambil dan dicacah dengan pencacah sinar gamma. Karakterisasi progesterone bertanda radioaktif Immunoreaktifitas (B/T) dan Ikatan Nonspesifik (Non Specific Binding, NSB) untuk progesterone bertanda radioaktif diuji dengan
Prosiding PPI – PDIPTN 2005 Puslitbang Teknologi Maju – BATAN Jogjakarta, 12 Juli 2005
ISSN 0216 – 3128
prosedur sebagai berikut : Sebanyak 50 l larutan standar dengan konsentrasi nol dan 50 l progesterone bertanda radioaktif ditambahkan kedalam tabung yang telah di coated dengan anti-progesterone. Setelah tercampur dengan baik, tabung diiunkubasi selama 3 jam pada temperatur kamar. Tabung-tabung dicuci dua kali dengan 500 l bufer posfat 0.5M pH 7.5 yang mengandung 0,1% Tween-20, kemudian dekantasi dan dicacah dengan pencacah sinar gamma. Immobilisasi anti-progesterone pada tabung dengan dasar bintang Nunc Pembuatan coated tube ini dilakukan dengan mengadopsi prosedur dari Joint FAO/IAEA Programme in Animal Production and Health, “Self Coating Milk Progesterone RIA Kit“ dengan sedikit modifikasi. Sebanyak 50 L of anti-progesterone (pengenceran 1:12.000) dimasukkan kedalam labu ukur 50 ml dan ditambahkan bufer karbonat 0.05 M pH 9.6 hingga tanda batas. Larutan ini didistribusikan kedalam tabung Nunc masing-masing sebanyak 300 L. Seluruh tabung ditutup dengan parafilm kemudian diinkubasi selama semalam pada 40C. Kemudian dilakukan dekantasi diikuti pencucian tabung-tabung menggunakan 500L Tween-20 0.1% dalam aquadest. Pencucian dilakukan dua kali. Seluruh tabung disimpan dalam plastik tertutup pada 40C. Pembuatan larutan standar progesteron Serangkaian larutan standar progesteron dibuat dengan metoda pelarutan senyawa progesteron murni memakai pelarut bovin serum albumin 0.5% dalam bufer posfat 0.05M. Sejumlah 50 mg of progesteron (4-pregnen-3,20dione) dilarutkan dalam 12,5 ml pelarut diatas. Kemudian 0,5 ml larutan tersebut diencerkan menjadi 10 ml dengan pelarut bovin serum albumin 0.5% dalam bufer posfat 0.05M. Sebanyak 50 l larutan diencerkan lagi menjadi 50 ml dalam labu ukur. Dengan memakai larutan ini maka dibuat serangkaian larutan standar meliputi 0 ; 0.25; 0.5; 1; 5; 10; 20, 40 dan 80 ng/mL Protokol assay Sebanyak 200 l larutan progesteron dalam Bovin Serum Albumin 5% (sebagai larutan standar) pada berbagai konsentrasi dimasukkan kedalam tabung polipropilen Nunc dengan antibody-coated tube, dilanjutkan dengan
21
penambahan 300 l larutan 125I-progesteron dan 50 l emulsi susu colustrum pada setiap tabung. Untuk tabung keradioaktifan total maka tabung polipropilen tanpa antibody-coated tube diisi dengan 300 l larutan 125I-progesteron saja. Seluruh tabung ditutup dengan alumunium foil, kemudian dilakukan inkubasi selama 3 jam pada temperatur kamar. Selanjutnya seluruh tabung (kecuali tabung keradioaktifan total) dibuang supernatannya dan dilanjutkan dengan pencucian memakai 500 l larutan bufer posfat 0,05M pH 7,4 yang mengandung 0,5% Tween-20. Pencucian dilaksanakan dua kali. Tabung-tabung dicacah dengan pencacah sinar gamma. HASIL DAN DISKUSI Setelah satu injeksi primer dan delapan kali booster pada hewan percobaan, maka didapat hasil anti-progesteron dengan titer yang cukup tinggi pada 1:12,000 dengan volume 5 mL. Kurva titer antibodi dapat dilihat pada Gambar 1. Anti-progesterone yang dihasilkan kemudian diimobilisasikan ke suatu fasa padat dari tabung polipropilen Nunc berdasar bintang. Coated tube yang dihasilkan dipakai dalam assay selanjutnya.
Percent bound (B/T %)
Siti Darwati, dkk.
40 35 30 25 20 15 10 5 0 100
1000
10000
100000 1000000
Dilution of antibody
Gambar 1.
Pembuatan anti-progesteron poliklonal pada kelinci dengan titer 1:12.000.
Pembuatan tracer (125I-progesterone) menggunakan metoda chloramin-T telah dapat dilaksanakan dengan hasil yang optimal. Fraksi progesteron bertanda radioaktif yang dimurnikan dengan kolon PD-10 (Sephadex G-25, Pharmacia) didapat konsisten pada sekitar nomor 30 dengan nilai B/T sekitar 60-70% yang reprodusibel. Kemungkinan didapatnya nilai ikatan yang lebih tinggi bila menggunakan
Prosiding PPI – PDIPTN 2005 Puslitbang Teknologi Maju – BATAN Jogjakarta, 12 Juli 2005
ISSN 0216 – 3128
22
kolom yang lebih panjang dari PD-10 merupakan hal yang harus dibuktikan. Pemurnian tracer telah dilakukan dengan dua macam metoda, ekstraksi dan kromatografi kolom. Pada metoda ekstraksi, rendemen penandaan dan persen ikatan yang didapat sangat rendah, masing masing sebesar 57.1% dan 1.7%. Pada penggunaan Sephadex G-25 (PD-10, Pharmacia) yang dijenuhkan dengan BSA 1% untuk memurnikan hasil penandaan, maka persen ikatan dan kemurnian radiokimia yang tinggi telah didapat masing-masing sebesar 63.6% dan 92.0%, rendemen penandaan 28.67%. Untuk mempertinggi rendemen dilakukan pemurnian dengan menggunakan BSA 0,5% untuk
Siti Darwati, dkk.
penjenuhan kolom. Peningkatan hasil terlihat pada tahap ini (persen ikatan 57.2%, kemurnian radiokimia 93.3% dan rendemen 75.6%). Perbaikan lebih lanjut pada kualitas tracer terlihat apabila progesteron diiodinasi dengan menggunakan aktifitas radioisotop yang lebih tinggi. Pada penggunaan aktifitas 125I sekitar 1 mCi untuk penandaan, didapat hasil yang sangat baik ditinjau dari parameter persen ikatan, kemurnian radiokimia dan rendemen yaitu masing-masing sebesar 64.9, 99.2 dan 92.6%, disertai dengan nilai spesifik aktifitas yang tinggi pula. Kedapat-ulangan metoda ini terlihat dari nilai imunologi yang konsisten pada beberapa kali percobaan berikutnya.
Tabel 1. Hasil penandaan Progesteron-11--hemisuksinat-TME dengan 125I NO PROCEDURE Progesretone-TME PB 0,05 M pH 7.4 Na125I Chloramin-T Na2S2O5 Pemurnian
RENDEMEN IMMONOREAKTIFITAS B/T (%) NSB (%) Aktifitas spesifik (Ci/g) KEMURNIAN RADIOKIMIA 125 I-Prog (electrophoresis)
I 2.5g (10l) 10 l 500 Ci (2.2 l) 10g (10l) 25g (25l) CHCl3 extraction
II
III
IV
V
VI
VII
57.15%
2.5g (10l) 10 l 500 Ci (2.2 l) 10g (10l) 25g (25l) PD-10 dijenuhkan dengan 1%BSA 28.76%
2.5g (10l) 10 l 500 Ci (5l) 10g (10l) 25g (25l) PD-10 dijenuhkan dengan 0.5%BSA 75.66%
2.5g (10l) 10 l 1.05 mCi (4 l) 10g (10l) 25g (25l) PD-10 dijenuhkan dengan 0.5%BSA 92.60%
2.5g (10l) 10 l 1.15 mCi (4.5 l) 10g (10l) 25g (25l) PD-10 dijenuhkan dengan 0.5%BSA 92.80%
2.5g (10l) 10 l 1.28 mCi (5 l) 10g (10l) 25g (25l) PD-10 dijenuhkan dengan 0.5%BSA 98.52%
2.5g (10l) 10 l 1 mCi (4l) 10g (10l) 25g (25l) PD-10 dijenuhkan dengan 0.5%BSA 98.6%
1.7 0.3 114.3
63.6 0.8 55.6
57.2 0.4 151.3
64.9 0.7 390.7
48.3 0.3 426.6
52.5 0.7 473.0
50.8 1.4 394.4
-
92.0%
93.3%
99.2%
94.5%
89.0%
93.0%
Prosiding PPI – PDIPTN 2005 Puslitbang Teknologi Maju – BATAN Jogjakarta, 12 Juli 2005
ISSN 0216 – 3128
Untuk menguji imunologi pada fraksi yang dihasilkan dari pelaksanaan iodinasi progesteron maka digunakan 1 mCi Na125I dan 2,5g progesteron-TME dan kemudian dimurnikan dengan kolom PD-10. Hasil kromatogram dapat dilihat pada Gambar 2. Uji immunologi terhadap ketiga puncak kromatogram telah dilakukan dengan cara assay pada ketiga fraksi puncak kromatogram pada gambar 2 diatas. Puncak pertama dan kedua memberikan nilai immunologi yang rendah, sedangkan puncak ketiga memberikan nilai immunologi yang tinggi disertai kemurnian radiokimia yang tinggi pula. (Tabel 2). Beberapa percoban yang dilakukan berikutnya memberikan hasil yang sama
23
250000
Count per m inutes
Siti Darwati, dkk.
125I-Pr ogester one
200000 150000 l abel ed progder i v.
100000 50000 f r ee-iodi ne
0 0
10
20
30
40
50
T ube no
Gambar 2.
Kromatogram iodinasi Progesteron dengan metoda chloramin-T dan dimurnikan dengan kolom Sephadex (PD-10).
Tabel 2. Evaluasi 125I-Progesteron yang dihasilkan dengan metoda chloramin-T dan dimurnikan dengan kolom PD-10 Peak no 1 Peak no 2 Peak no 3 (free 125I) (non progesterone (tracer progesterone) bertanda radioaktif) NSB (%) 0.44 0.21 0.39 Bo/T (%) 13.60 1.49 68.93 Kemurnian radiokimia 87.45 13.73 93.29 Rendemen (%) 2.50 16.16 81.34 Kestabilan 125I-progesterone Kestabilan tracer 125I-progesteron diuji dengan menggunakan coated tube dengan antiprogesteron dari BARC (India) dan larutan standar DPC. Selama masa 9 minggu, tracer terlihat relatif stabil dengan kemurnian radiokimia 99.16% sampai 93% (CV=0.02%) dan persen ikatan 62.72 sampai 57.3% (CV= 0.03%) dan nilai ikatan non-spesifik yang stabil pada 1.60% sampai 0.58% (CV= 0.04%). Penurunan kualitas tracer terlihat pada umur tracer diatas 2 bulan (data tidak ditampilkan). Profil kestabilan 125I-progesteron dapat dilihat pada gambar 3.
Optimasi assay pada kit RIA progesteron telah dilakukan mencakup variasi pada berbagai temperatur dan waktu inkubasi. Assay dilakukan pada kondisi inkubasi selama tiga jam pada temperatur kamar, satu jam pada 37oC dan semalam pada 4oC. Kurva standar di buat untuk ketiga kondisi tersebut dan dapat dilihat pada gambar 4.
60 50 40
RT., 3 hours
30
37oC, 1hour 4 oC, overnight
20 100
10
Persen ikatan (B/T %)
90 80
0
NSB % Bo/T % Rad.Chem.Purity
70 60 50 40
0.01
0.1
1
10
100
Log. conc. Progesteron (ng/mL)
30
Gambar 4.
20 10 0 1
2
3
4
5
6
7
8
Waktu (minggu)
Gambar 3. Profil kestabilan 125I-progesteron Optimasi assay
Optimasi assay pada kit RIA Progesteron dengan variasi temperatur dan lamanya waktu inkubasi. Pelaksanaan assay pada 4oC selama semalam memberikan nilai imunologi pada standar nol (ikatam maksimum untuk kit) yang
Prosiding PPI – PDIPTN 2005 Puslitbang Teknologi Maju – BATAN Jogjakarta, 12 Juli 2005
60
ISSN 0216 – 3128
24
sedikit lebih tinggi dibandingkan dengan ikatan pada kit yang diinkubasi pada 37 oC selama semalam atau temperatur kamar selama satu jam. Karena perbedaan yang sedikit ini maka untuk percobaan selanjutnya assay dilakukan pada temperatur kamar selama tiga jam. Optimasi assay dengan variasi volume larutan standar mencakup 25, 50, 100 dan 200 l. Hasil yang diperoleh memperlihatkan volume larutan standar 200 l memberikan kurva standar yang lebih curam sehingga penentuan akan lebih sensitif (Gambar5).
Siti Darwati, dkk.
30 25 20
2 jam 3 jam 4 jam
10 5 0 0.01
0.1
1
10
100
Kons. Prog. (ng/ml)
Gambar 6.
30
1jam
15
Optimasi waktu inkubasi pada assay kit RIA-progesteron
Persen ikatan (B/T%)
25 20
25 ul std
35
50 ul std
15
30
100 ul std
10
200 ul std
25 50 ul tracer
5
20
0
15
100 ul tracer 200 ul tracer
0.1
1
10
300 ul tracer 400 ul tracer
100 10
Kons standar (ng/ml)
5
Optimasi volume larutan standar pada assay kit RIA-progesteron
Optimasi lamanya waktu inkubasi dilakukan pada 1 sampai 4 jam (Gambar 6). Inkubasi selama tiga jam pada temperatur kamar memberikan persen ikatan yang lebih tinggi dengan kurva standar yang lebih baik dibandingkan dengan hasil yang didapat pada inkubasi selama 1 atau 2 jam pada temperatur kamar. Inkubasi selama 4 jam pada temparetur kamar memberikan persen ikatan yang lebih tinggi tetapi pada konsentrasi tinggi kesensitifannya lebih rendah dibanding dengan inkubasi pada 3 jam. Dengan demikian maka waktu inkubasi yang optimal ditetapkan pada 3 jam temperatur kamar. Optimasi volume tracer dilakukan mencakup 50 l, 100 l, 200 l, 300 l dan 400 l dengan cacahan sekitar 20.000 cpm. Berbagai persen ikatan dari hasil assay dapat dilihat pada gambar 7. Hasil terbaik dengan persen ikatan maksimum tertinggi dengan kurva yang curam didapat untuk volume tracer 300 l.
0.1
1
10
100
Concentration of Progesterone (nmol/L)
Gambar 7.
Optimasi volume tracer assay kit RIA-progesteron
pada
Optimasi pada penggunaan konsentrasi tracer dilakukan dengan variasi konsentrasi 125Iprogesteron mulai 20,000 sampai 100,000 cpm per 300 l. Hasil yang didapat memberikan ikatan yang tinggi bila digunakan tracer pada 22,571 cpm, sehingga untuk assay selanjutnya digunakan tracer pada 20,000 cpm per 300 l. 35 30 Percent bound (B/T%)
Gambar 5.
0 0.01
25 100771cpm
20
68825 cpm 46613 cpm
15
34322 cpm 22571cpm
10 5 0 0.01
0.1
1
10
100
Proge s t. conc. (ng/m l)
Gambar 8.
Optimasi konsentrasi tracer pada assay kit RIA-progesteron
Prosiding PPI – PDIPTN 2005 Puslitbang Teknologi Maju – BATAN Jogjakarta, 12 Juli 2005
Siti Darwati, dkk.
ISSN 0216 – 3128
Bentuk kurva standar untuk kit RIAprogesteron dapat dilihat pada Gambar 9, dengan limit deteksi 2.3 ng/ml. Limit deteksi adalah konsentrasi progesteron nol ng/ml. yang dihitung sebagai 2x standar deviasi (2SD) pada 5 kali pengulangan. Intra assay pada 5 kali pengulangan (Tabel 3) dan inter assay pada 15 kali pengulangan (Tabel 4) telah dilakukan menggunakan 200 l larutan standar, 300 l 125I-progesteron dan inkubasi dilakukan selama 3 jam pada temperatur kamar. Data intra assay memberikan %CV yang rendah pada konsentrasi progesteron tinggi dan sedang (91.4 ng/ml dan 17 ng/ml) tetapi %CV tinggi pada konsentrasi progesteron rendah (6.3 ng/ml). Hasil yang mirip juga didapat untuk
Gambar 9.
Bentuk kurva standar kit RIAprogesteron.
Tabel 3. Intra Assay Jumlah pengulangan Rata-rata (ng/ml) 5 6.3 5 17.0 5 91.4
SD 0.22 0.27 1.48
% CV 3.57 1.64 1.63
Nomor 1 2 3
Tabel 4. Intra assay Jumlah pengulangan Rata-rata (ng/ml) 15 4.2 15 14.6 15 83.2
SD 0.18 0.56 3.12
% CV 4.25 3.86 3.76
Stability of progesterone RIA kit 100 80 B/Bo (%)
inter assay. Konsentrasi rendah memberikan %CV yang tinggi.
Nomor 1 2 3
Kestabilan kit dimonitor setiap minggu dengan menentukan persen ikatan pada setiap konsentrasi larutan standar progesteron (Gambar 10). Data yang didapat memberikan persen ikatan yang stabil pada lima minggu pertama, dan mulai mengalami penurunan persen ikatan setelah menginjak minggu berikutnya.
60
week 1 week 2 week 3 week 4 week 5
40 20 0 1
25
10
100
Conc of progesterone (ng/ml)
Gambar 10. Kestabilan kit RIA progesteron
KESIMPULAN Produksi kit RIA progesteron telah dapat dilakukan di Pusat Pengembangan Radioisotop dan Radiofarmaka, BATAN. Pereaksi tracer (125I-progesteron) yang dihasilkan memberikan kemurnian radiokimia sekitar 97% yang stabil selama dua bulan, sedangkan anti-progesteron yang didapat memberikan titer yang tinggi yaitu 1:12,000. Kit ini mempunyai karakteristik ikatan maksimum yang cukup tinggi yaitu sekitar 30% dan ikatan non spesifik yang sangat rendah yaitu sekitar 0.4%. Kit RIA yang dihasilkan stabil untuk waktu lima minggu setelah diproduksi. Tahap perbaikan kestabilan kit diperkirakan dengan memperbaiki kualitas coated tube yang dihasilkan dengan pengeringan coated tube pada alat freeze dryer. . UCAPAN TERIMA KASIH Terimakasih diucapkan kepada Bapak Totti dari P3TIR BATAN atas bantuan reagensia yang telah diberikan dan terimakasih kepada Bapak Gationo dari Balai Pendidikan dan latihan Agribi Peternakan, Cinagara.
Prosiding PPI – PDIPTN 2005 Puslitbang Teknologi Maju – BATAN Jogjakarta, 12 Juli 2005
26
ISSN 0216 – 3128
DAFTAR PUSTAKA 1. IAEA Regional Cooperative Agreement for Asia and The Pacific, RAS/5/035-Feed Supplementation and Reproductive Management of Cattle. Training Workshop on the Production of Iodinated Tracer for Self-Coating RIA of Progesterone, 8-12 May 2000, Office of Atomic Energy for Peace, Bangkok, Thailand. 2. Tarveen Karir, P.R. Chaudhuri, A. Samad, U.H. Nagvekar, N. Sivaprasad ; Development of Direct Radioimmunoassay of Progesterone in Bovine Milk, Immunoassay Labeled Compounds & Jonarki Medical and Biological Products Programme, Board of Radiation and Isotope Technology, DAE, Mumbai-400705 3. Kanchan Kothari, Ranji Lal and M.R.A. Pillai ; Development of A Direct Radioimmunoassay for Serum Progesterone, Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry Articles, Vol. 196, No.2 (1995) 331-338. 4. Kanchan Kothari and M.R.A. Pillai ; Preparation and Characterization of 125I labeled Progesterone Derivatives for the Development of A Radioimmunoassay for Progesterone, Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry Articles, Vol. 177, No. 2 (1994) 261-269 5. Kanchan Kothari and M.R.A. Pillai ;Direct Radioimmunoassay of Serum Progesterone Using Heterologous Bridge Tracer and Antibody, Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry, Vol. 231, Nos. 1-2 (1998) 77-82 6. Joint FAO/IAEA Programme in Animal Production and Health, Self-coating ‘Milk’ Progesterone RIA Kit, Bench Protocol Version – SCRIA 3.0, January 1997
7.
Siti Darwati, dkk.
J.I. Thorell and S.M. Larsen, Radioimmunoassay and Related Techniques, United States of America, 1978, p 258.
TANYA JAWAB Basuki Agung Pudjanto Dibanding dengan Kit impor, apa keuntungan/keunggulan Kit RIA yang dibuat sendiri? Bagaimana prospek pengembangan berikutnya? Siti Darwati Harga .Kit RIA 125I-Progresteron jauh lebih mahal dari Kit RIA yang diproduksi lokal di BATAN. Nilai ekonomis yang didapat dibanding bila digunakan metode konvensional dalam menentukan waktu hamil pada hewan ternak. Pengembangan berikutnya melakukan kerjasama dengan instansi lain sperti yang sedang dirintis dengan peternakan yang ada di Jawa Barat. Muryono Apa langkah ke depan dengan Kit RIA yang telah diperoleh? Darimana diperoleh bahan 125I? Siti Darwati Melakukan uji lapangan dengan menentukan konsentrasi progesteron dalam susu sapi dalam jumlah banyak, bekerjasama dengan program iptekda Batan. 125I diperoleh dari produksi di Pusat Pengembangan Radioisotop dan Radiofarmaka BATAN Serpong.
Prosiding PPI – PDIPTN 2005 Puslitbang Teknologi Maju – BATAN Jogjakarta, 12 Juli 2005
