RisalahPertemlJan IlmiahPeneliliandan Pengembangan Apll:tasiIsolopdan RadiaSl; 2(XJ1
PENDAHULUANPEMBUATAN KIT RIA MIKROALBUMINURIA UNTUK PEMERIKSAAN ALBUMINURIA SukiyatiDj., Siti Darwati,GinaM., Djoharly Ch., Triningsih, Sulairnan, Puji Widayati, Sri Setiyowati,Veronika,dan Yulianti S. PusatPengembangan RadioisotopdanRadiofannaka,BATAN, SeIpOng
ABSTRAK PEMBUA TAN KIT RIA MlKROALBUMINURIA UNTUK PEMERIKSAAN ALBUMINURIA. Telah dilakukanpembuatankit RIA mikroalbuminuriayangterdiri dari tracer 12~-HSA,standaralbwnin, dan antisera albumin dari BARC (hldia). Tujuandari penelitianadalahmencari formulasi kit mikroalbuminuria untuk metode RIA yang dapat digunakanuntuk diagnosisalbumin dalam kadar rendah (lebih rendah dari kadar albuminuria yang biasanya ditentukan dengan dipstik). Hasil penandaan125I-HSAmemberikan rendemenrata-rata96,2%,dengantingkat kemurnianradiokimia lebih besardari 90% sertaaktivitas jenis : (2,54 :t 0,28) Ci/g HSA. Kemurnianradiokimia tracer 12~-HSAyang dibuatcukup tinggi, yaitu 96,2% serta ikatan non spesifik cukuprendah « 1%). Diperolehpula bahwapersenikatanmaksimal(%B) cukup tinggi, yaitu 80,3%. Dibandingkandengan125I-HSA CIAE (China InstituteAtomic Energy) 125I-HSAyang dibuat mempunyaikualitasyang lebih baik. StandarHSA untuk kit RIA mikroalbuminuriaditentukanmenggunakan standarBARC (BhabaAtomic ResearchCentre,hldia), dan diperolehnilai yang cukup baik (penyimpangall masing-masingstandar< 100/0).Sensitivitaskit yang dibuat cukup tinggi, yaitu 1,4 jlg/ml sertamemberikan %CY untuk interassaydi bawah10%.Dari profil ketelitian diperolehdaerahkeIja 10 -500 jlg/ml.
ABSTRACT THE PREPARATION OF WCROALBUMIN RADIOIMMUNO-ASSA Y KIT FOR URINARY ALBUMIN DETECTION. Preparation of microalbuminwia RadioinunWtoassay (RIA) kit which is comprised of 1251HSA tracer, albumin standard and antisem has been done. The ptupose of this research is to prepare a good quality and high sensitivity of microalbwninwia RIA kit, which can detect low level of albuminuria in ~g/rnl level which can not be detected using existing dipstick method. The average radioiodination yield ofHSA was 96.25%, with radiochemical pwity more than 90%, and the specific activity was (2.54% :t 0.28%) Ci/g HSA. The maximwn binding of the tracer was reasonably high (more than 70%) and low non specific binding (NSB) of less than I % is observed. The deviation of the standard prepared is less thai} 10% for all level standards. Assay for sensitivity for five replications of zero standard gave the sensitivity of less than 1.4 ~ml. The working range of assayobtained from precision profile is 10 -500 ~rnl
PENDAHULUAN Mikroalbuminuria adalah keadaan fisiologis seseorangdi mana kadar albumin yang diekskresike dalam urine masih berada di bawah ambangkadar albwninuria. Pada kondisi tersebut albumin yang diekskresi ke dalam urine berkisar antara 20 -200 ~g/menit atau 30 -300 mg/1lari. Konsentrasi di alaS nilai tersebut disebut proteinuri dan dinyatakan Nephropathy(gagalginjal)[2, 3, 4, 5). Penentuankadar albwnin dalam jumlah mikro « 200 ~g/menit) pada pasiendiabetessangatpenting untuk deteksi dini mikroalbumin sebelum menjadi diabetes nephropathy (gagal ginjal), agar dapat dilakukanpencegahansebelunmya[2, 3,4). Saat ini penentuankadar albumin daillin urine dilakukan dengan metode DIPSFICK atau metode pengendapan dengan asam [I). Penentuan kadar albumindengancara DIPSFICKtidak sensitif,sehingga tidak dapat mendeteksi kadar albumin dalam mikroalbuminuria.Teknik RIA merupakancara teknik barn yang cukup sensitif daD spesiflk untuk penentuan kadarmikroalbuminuria [1, 2, 3, 4].
Prinsip penentuan kadar mikroalbuminuria menggunakanmetode RIA dapat dijelaskan sebagai berikut : Albumin 1251berkompetisi dengan albumin dari urine penderita terhadap antisera albumin (antibodi) dalam jumlah terbatas. Setelah diinkubasi dalam waktu tertentu, dilakukan pemisahan antara albumin terikat antisera dengan albumin bebas menggwIakanpereaksipemisahpolietilengiikol (pEG). Besarnyakeradioaktifanfraksi terikat di cacahdengan pencacahgamma(1) [1]. Pembuatan dan penggunaan kit mikroalbuminuriadi BhabhaAtomic ResearchCentre (BARC), India, barn sampai pada tahap uji klinis mikroalbumin di laboratorium belum sampai dipasarkan,sedangkandi ChinaAtomic Energy (ClAE), China, kit mikroalbuminuriatelah luas digunakandan dipasarkan. Tujuan dari penelitian ini adalah membuatkit RIA mikroalbuminuria untuk memenuhi kebutuhan domestikdalam penentuanalbumindalamkadar rendah di dalam urine. Dalam makalah ini, dilaporkan penelitian pendahuluan untuk produksi kit RIA mikroalbuminuria.
137
Risa/ah Peltemuan
Ilmiah Penelilian
dan Pengembangan
.'\Olikasi Isolop dan Radiasi, 2(X) 1
BAHAN DAN METODE
KH2PO4, 2,5 g NaCl dan 5 g ~Cl, kemudian ditamballkan 900 mI aquabides. Campuran larutan Bahan. Bahan dan pereaksi yang digunakan selanjutnyadisterilisasidalamautoclavepada suhu 120 untuk pembuatanurine sintetis antara lain Na2HPO4 °c selama 30 meDii. Setelah dingin lamtan basil bebas air, KH2PO4.7H2O,NaCI, ~CI dan Urea sterilisasi dimasukkanke dalam labu ukur 1 liter, masing-masingdiperolehdari E-MerckdaDPT. Harum kemudian ditambahkan25 g urea dan dikocok, dan Sari. Obat suntik gentamycinsulfat anti septik untuk ditamballkanlagi aquabidessampailamt, dan akhimya dimasukkangentamycin2 ml, kemudian di~bahkan pengawet(40 1lg/2ml) diperolehdari PT PrajaPh. HSA (Albumin serum manusia) yang digunakan sebagai aquabidessampaivolume 1000mI. Campurandikocok standar albumin adalah buatan Sigma. Oksidator perlahan-lahandan siap digunakan. Lamtan disimpan iodogen untuk iodinasi HSA buatanPierce,sedangkan padaSuI1U 0 -4 °C. Duajenis lamtanurine sintetis yang BSA (albumin serum sapi) daD tris bufer masingdibuatmasing-masing denganmenggunakanurea murni masing diperoleh dari E-Merck. Kloroform untuk (100%)daDurea40%. melarutkan iodogen, n-butilalkohol, etil alkohol dan Pembuatanlamtanstandaralbumin. Konsentrasi ~OH untuk uji kemurnianradiokimia dari E.Merck. lamtanstandaryang dibuatadalahantara0 ~g/mI -200 Antisera HSA buatan BARC (India). Polietilengiikol ~g/tn1daIl diberi labelsebagaistandarA = 0 ~g/tnl, B = untuk pemisahanserumalbumin terikat dan bebasdari 10 ~g/ml, C = 25 ~g/mI, D = 50 ~g/tnl, E = 100 ~g/mI danF = 200~g/ml. Pembuatan standardiIakukan mulai Sigma. dari standar tertinggi 200 ~g/mI sebagai standa:.F Peralatan. Mini assay y-counter tipe G-20 Standaryang lebih rendahA, B, C, D dan E dibuatdari buatan USA digunakan untuk pengukunm standar F dengan pengenceran yang sesuai keradioaktifan, kolom Sephadex G-25 PD-I0 menggilllakanurine sintetis,di dalamlabu takar 100mI. (pharmacia), Sentrifuga Allegra 21 Beckman digunakan Pembuatanpereaksipetnisah PEG 15 %. Ke untuk pemisahan fraksi J251-HSA dan 1251 bebas. dalamlabu takar 100 mI dimasukkan 15 g PEG yang dilamtkc1lldalam NaCl 1% dan volume dibuat sampai Pembuatan coated tube iodogen. Ke dalarn 100 mI. PEG 15% selalu dibuat barn (kurang dari 2 tabung reaksi dilariItkan 2 mg iodogendalam2 ml minggu)dandisimpanpadasuhu4 °C. kloroform. Untuk setiapiodinasi diarnbil 10 Ililarutan dan dimasukkan ke dalarn tabung reaksi pendek Penentuan standar P2RR dengan standar (volume 2 In!) untuk pellaDdaan.Larutan iodogen di BARC. Untuk mengetahui ketepatankadar standar dalam tabungdikeringkanpada subu 37 °C selama 5P2RR yang dibuat, penentuankadar standar diamati 6 jam di dalam incubator. Coatedtube iodogenditutup dengan menggunakan standar pembanding (Gold parafilm dan siap digunakan untuk penandaan(di standardari BARC, India). Sebagaipenmutdigunakan simpanpada4 °C). tracer dari CIAE (China)dan tracer dari P2RR. PenandaanHSA dengan 115LKe dalamcoated Pengujian kit RIA mikroalbuminuria I1sl. tube yang telah berisi 10 j.lg iodogendimasukkan50j.l1 Pengujian kit dilakukan dengan melakukan assay dan (100 j.lg) HSA dalam larutan dapar fosfat 0,2 M (I menentukan kurva standar, profil ketelitian. daernh kerja, nilai cuplikan kontrol dan %CV interassay. mg/0,5 ml), kemudianditambahkan2 j.lI NaJ25I(:t 230 j.lCi). Larutan diaduk dengan vorteks, dan reaksi dibiarkan berlangsung selmua 90 detik. Untuk menghentikanreaksiditambahkan250 ~ larutan~ ~ v BASIL DAN PEMBAHASAN fosfat 0,2 M, kemudian carnpuranreaksi dimumikan Hasil penandaan 125I-HS. A yang dilakukan 3 kali menggunakan kolom Sephadex G-25 (PD-I0) dan memberikan efisiensi penandaa10 46,1%, 98,42% dan dielusi dengan Iarutandapar tris 0,1 N pH 7,4. Hasil 94%. Hasil penandaan pertanIIa masih rendah karena elusi ditampung dalarn tabung reaksi 4 mI, masingpembuatan dan penyimpanan coated tube iodogen masing sebanyak I ml untuk 12 tabung. Tiap-tiap tabung reaksi kemudiandicacalldenganmenggunakan kurang baik, sehingga kemung!~nan sifat oksidatornya kurang kuat pada waktu digun.akan dalam penandaan. gammamini assay. Efisiensi penandaan yang kedua, memberikanbasil yang Kemurnian radiokimia llasil penandaan di cukup baik (98,42%) dan, pada penandaanketiga analisis dengankromatogafi menggunakanfasa diarn dengankertasWhatmanNo.1 dan fasa gerakcampuran terjadi penurunan basil penandmill (94 %). Hal ini disebabkan kaJrena menunumya daya n-butanol, etanol dan ~OH 0,1 M dengan oksidasi dari oksidator iodogen. Sebaiknyacoated tube perbandingan 3 : 2 : 1. Immunoreaktivitasnya iodogen digunakan maksimaII 2 minggu setelah ditentukandenganprotokol assay(TabeII.). pembuatan,sebabsifat oksidasinyatelah menunm bila digllilakan lcbih dari waktutersebut. Pembuatan urine sintetis. Urine sintetis Hasil perbandingankualitastracer P2RRdengan digunakan untuk melarutkan HSA, dalam pembuatan CIAE tersebut menu."1jukkanbahwa tracer P2RR standar HSA, pembuatan standar 0 dan untuk memberikankemurnian radiokimia cukup baik dan menentukan (%) NSB. Ke dalam botol 1 liter imunoreaktivitas lebil' tinggi dari tracer CIAE karena dimasukkan berturut-turut 64 g Na2HPO4 7 H2O, 15 g
138
Risa/ahPeltemuan //miah Pene/ilian dan Pengembangan l1/1/ikasi/SOIOpdan Radiasi 2(x) 1
kemungkinan tracer CIAE seialu tiba di P2RR sudah hampir daluwarsa (expired), tetapi tracer CIAE mempunyai NSB yang relatif agak rendah dari tracer P2RR. Oleh karena tracer China mempunyai B/f rendah dan telah hampir expired, maka untuk selanjutnya hanya digunakan tracer P2RR (Tabel 2). Hasil uji banding standar P2RR dengan standar BARC menggunakan tracer dari P2RR (standar BARC sebagai gold standard) didapat NSB untuk standar India (0,8%) lebih kecil dari standar P2RR (0,9%), tetapi ikatan B/f untuk standar 0 standar P2RR lebih baik (80,3%) dibanding standar BARC (76,2%). Dari basil pengujian standar menggunakan standar BARC, India diperoleh penyimpangan yang cukup besar dari beberapa standar, terutama bila digunakan urea dengan kadar 100% sebagai pelarut (matriks). Penggunaan urea 40% memberikan penyimpangan lebih kecil dibandingkan urea 100% (Tabel 3) untuk itu urea 40% digunakan sebagai matriks. Dari kurva standar (Gambar 2) dapat dilihat bahwa pada daerah barns antara mikroalbuminuria dan nephropathy (~ 200 ~g/ml), kecondongan kwva cukup tajam yang menwljukkan ballwa kepekaan assay cukup baik di daerah tersebut. Dari profil ketelitian (Gambar 3) dapat dilihat bahwa daerah kerja yang memberikan %CV < 10% cukup lebar yaitu 10 -100 ~g/ml. Dari basil penentuan nilai 0 dengan 5 kali replikasi, diperoleh sensitivitas (nilai rata-rata 0 :f: 2 SD) yang cukup baik yaitu 1,4 ~g/ml. Diperoleh pula bahwa nilai semua cuplikan kontrol yang mewakili nilai rendah. medium dan tinggi berada pada daerah rentang nilai yang seharusnya (Gambar 4). Dari basil pengujian yang dilakukan, dapat dikatakan bahwa kit RIA mikroalbuminuria yang dibuat mempunyai kualitas cukup baik, nalnun untuk dapat diaplikasikan secara klinis, masih perlu dilakukan validasi untuk menentukan kehandalan dari kit RIA mikroalbuminuria tersebut.
Tabell.
KESIMPULAN Hasil pembuatankit mikroalbuminuria125 I telah memberikanbasilyang cukupbaik. namun untuk dapat diaplikasikan secara klinis untuk penentuan mikroalbuminuria,masihperIn dilakukanpengujiandan validasi terhadap kit RIA mikroalbuminuria yang dibuat.. DAFTAR PUSTAKA 1. M.G.R. RAJAN, Dr., "Radioimmunoassaykit For UrinaryAlburnin"'. For the detection and quantitative determinationof rnicroaibuminuria for the used by the IAEA participants of RAS/6/208. Diabetic Nephropathy Thematic Progammeon HealthCare. 2. G.C. VIBRETI et al. "Microalbuminuria ~S a predictor of clinical nephropathy in ill;oUlindependentdiabetesmellitus." Lancet: (1982) 1430-32. 3. H.H. PARVING et aJ. "Early detectionof patient at risk of developing diabetic nephropathy longitudinal study of urinary albumin excretion, ActaEndocrinologica (1982) 100,550. 4. MOGENSEN C. "Microalbumin a predictor of clinical diabetic nephropathy(review). Kidney Int.3 1,(1987)687-9. 5. MARK E. COOPER.," Pathogenesis,prevention, and treabnent of diabetic nephropathy"., The Lancetvol. 352,Juli 18,(1998).
Protokol RIA kit mikroalbuminuria 1251
I ::~I;i) ;~tandar 2:25 2~ 252:25,:25 ,2~ 25 ~~ 25 ,2~ 25 ;~ ~k Sam1( I)
! "SA
1251(~)
I antisera (~)
200
2002~ 200
200
25 25
25
200
200
200
200
200
200
200
200
200
200
200
200
200
200
Vortex, inkubasipada37°C selama1jam atau2 jam pada suhukamar I PEG 15% (~)
10001000 1000 1000 1000
1000
1000
1000
1000
1000
Sentrlfugepada3000x g selama25 menit Dekantasisupematan Cacah
139
Risalah Pertemuan Ilmiah Penelitian dan Pengembangan Aplikasi Isotop din Radias~2(x) t
Tabel 2. Perbandingan kualitas tracer P2RR dengan tracer ClAE
-Keterangan NSB = % Ikatantidak spesifik Btr = % Ikatancacahanstandar0 dibagicacahantotal
Tabel3. PerbandinganstandarP2RR denganpembandingstandarBARC (India) menggunakan pelaroturine sintetisdengan: A. (Urea 40%)dan B. (Urea 100%)
Keterangan : NSB = Non spesifikbinding tracer untukpengujiandari P2RR N (pengulangan)= 4 kali Catatan: Dari basil pengamatan pelaruturine sintetisyang40%
Tabel 4. Nilai cuplikan kontrol menggwtakan kit RIA mikroalbuminuria
140
141
Risalah Pertemuan
Ilmiah Penelitian
dan Pengembangan
.I\Olikasi Isolop dan Radias~ 2(XJ.
500000 ~1251-HSA
400000 ~ 300000 +!
1u
20CKX10 +-
100000 ~ .: 3' o+-~ , ,j~:
-100000 11
4 .:~:
2
.~ -;-:
, :' ~ .: .:. : .: I ;1:~":~'2 "'4 "I
Jumlah Tabling
Gambar1. Hasil penandaanHSA dengan1251 Keterangan: IodinasiHSA menggunakan oksidatoriodogen,kemumian radiokirnianya> 90%
70
60 50
40
!::
*
aJ
30
20 10
200
40 "
35 30
CV%
25
20 I
"""" 10
oL-1
-,
0
1
2
Gambar3. Profil Ketelitian (imprecisionprofile) Kit RIA Mikroalbuminuria Catatan : daernhkerja yangmemberikan%CY < 10%cukup lebar yaitu (10 ->500 ~g/ml)
Risalah Pertemuan
Ilmiah Penelilian
dan Pengembangan
Aplikasi Isolop dan Radias~ 2{XJ I
250 200 150 100 50 0 1
2
4
3
5
6
Gambar 4. 'Control chart" Interassay kit microalbuminuria 1251
DISKUSI sUHARNI SADI 1. Dengankit yang andabuatapakahtelahdicobapacta pemeriksaandi laboratorium? 2. Dibandingkan yang standar China dan India bagaimanahasilnya?
2. Kendatipun mungkin lebih mahal, namun keunggulanteknik RIA (Mikroalbuminuria) cukup banyak: 3. Lebih peka (bisa mendeteksikonsentrnsialbumin < 20 mg/ml) pengerjaannyapun relatip lebih cepat. MARIA LINA
SUKIY AT! DJ 1. Belurn,akan dilakukankalau kita sudahyakin betul dengankualitasnya. 2. Bila standar China tersedia akan kita coba bandingkandenganstandarkita. YUMIAR TI 1. Berapaperkiraanharga1 setkit tersebut? 2. Bagaimana dibandingkan dengan harga metoda konvensional(untuk pemeriksaanlab) ? SUKIYA TI DJ 1. Harga pasti belum diketahui, namun beberapa komponenkit harganyacukup mahal,terutalnadari Chin:t
142
1. Dalam penyediaan kit RIA Mikroalbuminuria, digunakan urine sintetis sedangkan untuk aplikasinya dengan pure urine apakah basil yang didapattidak menunjukanperbedaan? 2. Apakah pemah dicoba denganmenggunakanpure urine bagaimana hasilnya dibandingkan dengan penggunaan urine sintesis? SUKIYATI DJ 1. Komposisi urine sintetis sudah digunakan dengan urine asli, jadi hasilnya tidak menunjukan perbedaan. 2. Belum pemah, Insya Allah akan kami coba melakukannya.
