Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2006
PENGAPLIKASIAN KIT RIA BATAN UNTUK PENGUKURAN PROGESTERON SUSU SAPI (Application of Batan RIA KIT to Detect Progesterone in Cow Milk) T. TJIPTOSUMIRAT, I. SUGORO dan B.J. TUASIKAL Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Radiasi - BATAN
ABSTRACT The aim of the experiment was to study the quality of BATAN progesterone RIA KIT by comparing it to the product in market. The experiment consist of obtaining milk free progesterone, progesterone standard: milk sampling, measurement of standard progesterone and samples. The result showed that standard linearity of BATAN RIA KIT could be accepted, i.e. 0,92 although was lower than that of the product in market, i.e. 0,98 and the correlation was 95%. Progesterone in samples were detected successfully by BATAN RIA KIT but the concentration was lower than the result revealed by the product in market. The result of progesterone concentration had the same pattern and the correlation was 96% after artificial insemination (AI). It is concluded that, BATAN RIA KIT could be used to detect milk progesterone. Key Words: RIA KIT, Progesterone, Milk ABSTRAK Tujuan dari percobaan ini adalah untuk mengetahui kualitas KIT RIA progesteron produk BATAN dengan membandingkan produk yang telah ada di pasaran. Tahapan percobaan terdiri dari pembuatan susu bebas progesteron, pembuatan standar progesteron, pengambilan sampel susu, pengukuran progesteron standar dan sampel serta siklus reproduksi. Hasil percobaan menunjukkan bahwa kelinieran standar KIT RIA BATAN cukup baik, yaitu sebesar 0,92 walaupun lebih rendah dibandingkan produk pasaran, yaitu 0,98 dengan nilai korelasi kedua persamaan garis adalah 95%. Progesteron dalam sampel susu berhasil dideteksi dengan KIT RIA BATAN tetapi kadarnya lebih rendah dibandingkan dengan hasil pengukuran produk pasaran. Hasil pengukuran progesteron setelah inseminasi buatan (IB) dengan menggunakan kedua KIT menunjukkan pola yang sama dengan nilai korelasi 96%. Kesimpulan berdasarkan uraian di atas adalah KIT RIA BATAN dapat digunakan untuk pengukuran progesteron dalam susu. Kata Kunci: RIA KIT, Progesteron, Susu
PENDAHULUAN Teknik radioimmunoassay (RIA) merupakan salah satu metode deteksi yang paling sensitif, yang didasarkan pada interaksi antigen-antibodi. Antigen (hormon) yang berlabel radioaktif dapat digunakan untuk mendeteksi kandungan hormon dalam sampel. Isotop yang dapat digunakan untuk teknik RIA adalah 3H, 14C, 125I dan lainnya. Pada teknik ini sejumlah antibodi diimobilisasi pada suatu fase padat, misalnya dinding tabung plastik. Sampel yang mengandung antigen (hormon progesteron) ditambahkan dengan sejumlah tertentu molekul berlabel (125I) yang akan berinteraksi dengan antibodi pada tabung.
Intensitas signal radiasi dari biomolekul berlabel radioaktif yang terikat pada antibodi yang menempel pada dinding tabung akan berbanding terbalik dengan konsentrasi biomolekul dalam sampel JOINT FAO/IAEA, (1984; 2001) Aplikasi RIA dalam litbang peternakan adalah untuk mengukur konsentrasi hormon progesteron sampel serum darah atau susu. Tujuan pengukuran progesteron ini adalah untuk mendeteksi pubertas ternak, gejala birahi, diagnosa kebuntingan dini, diagnosa kegagalan bunting lebih awal, mendukung program Inseminasi buatan, dan diagnosa kelainan reproduksi ternak. Dampak sosial ekonomi dari pengaplikasian teknik RIA
187
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2006
adalah menghemat pelayanan IB, bunting tepat waktu, produksi susu stabil, dan perbaikan keturunan JOINT FAO/IAEA, (1984), DOBSON, (2003) BATAN sebagai lembaga litbang melakukan penelitian pembuatan KIT RIA dengan harapan mampu membantu para peternak, selama ini selalu tergantung terhadap produk luar negeri. KIT RIA ini diproduksi oleh Pusat PRR dengan bahan yang digunakan seperti antibodi progesteron dan perunut 125I yang merupakan produk sendiri dan bekerjasama dengan Laboratorium Kesehatan dan Reproduksi Ternak – PATIR untuk Quality control dan sebagai pengguna. Metode yang digunakan adalah DPC, yaitu antibodi progesteron telah dilapisi di permukaan dasar tabung dan pemakai dapat langsung menggunakannya tanpa perlu melapisi sendiri. Pengukuran secara laboratorium telah menunjukkan hasil yang bagus tetapi pengujian secara lapangan belum dilakukan DOBSON, (2003). Dengan demikian tujuan dari percobaan ini adalah pengujian KIT RIA produk PRR dengan menggunakan sampel susu dari lapangan dan sebagai pembanding digunakan KIT RIA produk pasar. MATERI DAN METODE Pembuatan susu bebas progesteron Susu skim non lemak sebanyak 1 liter ditambah 5 g karbon aktif dan distirer selama 1 jam lalu dibiarkan semalam pada suhu 40C. Setelah itu dientrifugasi selama 15’ pada 3000 rpm suhu 40C dan disaring dengan kertas tisu untuk memisahkan karbon aktif kemudian ditambah 0,1 g sodium azide (1 tablet)/ 100 ml JOINT FAO/IAEA, (2001). Pembuatan standar progesteron Progesteron sebanyak 0,3145 g ditimbang dan dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml dan ditambahkan etanol sehingga diperoleh larutan stok A dengan konsentrasi 10 mM. Sebanyak 0,1 ml larutan stok A dipipet ke dalam labu ukur 10 ml lalu ditambahkan etanol dan diperoleh larutan stok B dengan konsentrasi 100 uM. Setelah itu sebanyak 1 ml larutan stok B dipipet ke dalam labu ukur 10
188
ml lalu ditambahkan etanol dan diperoleh larutan stok C dengan konsentrasi 10 uM. Dari larutan C dipipet sebanyak 0,025; 0,05; 0,10; 0,20; 0,40; 0,80 ml ke dalam botol Erlenmeyer 500 ml. Larutan pengencer etanol kemudian dievaporasikan di dalam laminair air flow. Setelah kering ditambahkan susu bebas progesteron sebanyak 200 ml untuk memperoleh konsentrasi progesteron 1,25; 2,50; 5,00; 10,00; 20,00; 40,00 nM dan dikocok. Larutan standar progesteron siap untuk digunakan JOINT FAO/IAEA, (2001). Pengambilan sampel susu Sampel susu sapi berasal dari koloni peternak sapi perah Binaan KUD Bayongbong, Garut. Sampel susu diambil dari sapi yang bunting dan dilakukan pada waktu pemerahan yang sama. Satu tablet sodium azide atau dikromat ditambahkan ke dalam 10 ml susu. Disentrifugasi pada 2000 g selama 15 menit pada 4°C atau suhu kamar. Bila disentrifugasi pada suhu kamar maka susu dimasukkan ke dalam kulkas selama 15 menit untuk mengeraskan lapisan lemak. Lemak dipisahkan dari susu dengan menggunakan sendok. Susu skim (bebas lemak) dipindahkan ke gelas penyimpanan dengan menggunakan pipet pasteur. Sampel susu dapat disimpan pada suhu 4°C JOINT FAO/IAEA, (2001). Pengukuran progesteron dengan menggunakan KIT RIA PRR Tabung diberi nomor. Nomor 1, 2, 3 dan 4 memakai tabung biasa, dan nomor selanjutnya memakai “coated-tube”. Larutan standar diaduk sempurna sebelum digunakan. Tabung nomor 1 dan 2 untuk pengukuran radioaktifan total (TRA). Pipet 100 µl larutan standar nol tanpa progesteron (konsentrasi 0 ng/ml) ke dalam tabung nomor 3 dan 4 (memakai tabung NSB). Pipet 100 µl larutan standar berbagai konsentrasi ke dalam tabung nomor 5 sampai 20. Pipet 100 µl larutan susu yang tidak mengandung progesteron ke dalam tabung nomor 3 sampai dengan 20. Pipet 200 µl sampel ke dalam tabung nomor 21 dan seterusnya. Pipet 200 µl 125I progesteron (tracer) ke dalam seluruh tabung. Inkubasi 3 jam pada suhu kamar. Cuci dua kali dengan
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2006
1000 µl larutan buffer pencuci. Dekantasi supernatan. Cacah dengan alat pencacah sinar gamma. Prosedur Kerja KIT RIA Progesteron PRR BATAN (2005).
multichannel Prosedur kerja KIT RIA 2005. Progesteron Orion.
Pengukuran progesteron dengan menggunakan KIT RIA pasar
Hasil percobaan dianalisis mengggunakan uji korelasi dengan bantuan program Excel.
Tabung assay yang telah dilapisi antibodi progesteron, larutan standar dan 125 I-progesteron antigen disiapkan. Tabung assay kemudian diisi dengan larutan standar, sampel, 125I-progesteron dan blank. Selanjutnya masing-masing tabung dan diinkubasi selama 3 jam. Kemudian sampel dikeringkan dengan cara menuangkan seluruh larutan dalam tabung dan dikeringkan dengan menggunakan kertas merang lalu diukur dengan gamma counter
Analis data
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil pengukuran progesteron standar dengan KIT RIA BATAN menunjukkan hasil yang cukup baik dengan persamaan garis y = 23,48x + 101,69 dan R2 = 0,92. Hasil pengukuran dengan RIA KIT produk pasar menunjukkan hasil yang lebih baik, dengan persamaan garis diperoleh: y = = -43,348x + 82,764, dan R2 = 0.98 (Gambar 1).
% Ikatan
110.0 100.0 90.0 80.0 70.0 60.0 50.0 40.0 0
0.5
1
% Ikatan
Log Kons (nM/L)
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
1.5 y = -23.48x + 101.69 R 2 = 0.9149
2
y = -43.348x + 82.764 2 R = 0.9778
0
0.5
1
1.5
2
Log Kons (nM/L) Gambar 1. Kurva standar progesteron dengan menggunakan KIT RIA BATAN (atas) dan produk pasar (bawah).
189
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2006
Meskipun memiliki nilai kelinieran yang tidak sebaik RIA KIT Produk Pasar dengan perbedaan sebesar 6,29%, hasil tersebut menunjukkan bahwa terjadi ikatan antara progesteron standar dengan antibodi yang cukup baik. Hasil pengukuran progesteron pada sampel susu dengan menggunakan KIT RIA BATAN menunjukkan hasil yang berbeda dengan KIT RIA produk pasar (Tabel 1). Konsentrasi progesteron produk pasar lebih tinggi dibandingkan dengan hasil dari RIA KIT BATAN dengan perbedaan berkisar 1,86 – 6,72 dan standar deviasi 1,61. Disamping itu, nilai konsentrasi progesteron antara kedua produk memiliki variasi yang cukup tinggi, yaitu 32,31%, sedangkan nilai korelasinya 68,21%. Kemungkinan yang menyebabkan hasil tersebut adalah sampel susu lapangan memiliki matriks yang lebih banyak sehingga mempengaruhi daya ikatan progesteron susu dengan antibodi IAEA (2000); KANCHAN et al. (1995) Hasil pengukuran progesteron dalam susu setelah IB menunjukkan adanya pola yang sama antara hasil kedua KIT, meskipun hasil pengukuran dengan produk pasar lebih tinggi
(Gambar 2). Nilai korelasi antara kedua kurva adalah 96% yang menunjukkan adanya hubungan yang nyata. Tabel 1. Pengukuran progesteron pada sampel susu
Konsentrasi progesteron Kit RIA (nM/L) BATAN
∆ Hasil
Komersial
2,20
8,92
6,72
2,40
6,37
3,97
2,41
8,57
6,16
1,37
7,04
5,67
0,69
6,55
5,86
1,23
2,55
1,86
2,50
4,6
3,91
1,07
6,46
5,77
Rata-rata
4,99
Standar Deviasi
1,61215
Kovariansi
32,30762
Korelasi
68,21226
Konsentrasi Progesteron (nM/L)
9 8 7 6 5
BATAN
4
Pasar
3 2 1 0 0
7
14
21
Waktu (hari)
Gambar 2. Konsentrasi progesteron susu untuk pengukuran keberhasilan inseminasi buatan (IB) dengan menggunakan KIT RIA BATAN dan produk pasar
190
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2006
KESIMPULAN
PROSEDUR KERJA KIT RIA PROGESTERON PRR. BATAN. 2005.
Berdasarkan uraian di atas adalah KIT RIA BATAN dapat digunakan untuk pengukuran progesteron dalam susu.
PROSEDUR KERJA KIT RIA 2005. PROGESTERON ORION.
DAFTAR PUSTAKA JOINT FAO/IAEA, 1984. Technical Reports Series No. 233: Laboratory Training Manual on Radioimmunoassay in Animal Reproduction, IAEA. JOINT FAO/IAEA. 2001. Programme Animal Production & Health – Bench Protocol Version 1.1 June 2001. DOBSON, H. 2003. Laboratory Handbook for Postgraduate, Post Docs & Other Visitors: Veterinary Reproduction Unit. Faculty of Veterinary Science. Leahurst.
IAEA 2000. Regional Cooperative Agreement for Asia and The Pacific, RAS/5/035-Feed Supplementation and Reproductive Management of Cattle. Training Workshop on the Production of Iodinated Tracer for SelfCoating RIA of Progesterone, 8 – 12 May 2000. Office of Atomic Energy for Peace, Bangkok, Thailand. KANCHAN KOTHARI, L.A.L. RANJI and M.R.A. Pillai. 1995. Development of A Direct Radioimmunoassay for Serum Progesterone. J. Radioanalytical and Nuclear Chemist. Articles. 196(2): 331 – 338.
DISKUSI Pertanyaan: 1. Apa urgensinya mengetahui kadar progesterone susu sapi? 2. Batasan standar KIT RIA BATAN kenapa dapat digunakan untuk pemeriksaan progesterone sedangkan nilai yang diperoleh antaraKIT RIA BATAN dan produk komersial jauh berbeda. Jawaban: 1. Dapat mengetahui kegagalan IB lebuh cepat karena progesterone susu diperiksa pada hari ke0, 10 dan 21 setelah IB. Dapat juga menetahui gangguan reproduksi pada sapi dengan pemeriksaan sample susu dari sapi yang bermasalah seperti silent heat atau repeat breeder. 2. Jika dilihat dari kurva standar dari KIT RIA BATAN dan komersial nilai R2 masih > 0,90 berati cukup baik. Sedangkan nilai pengujian sample susu dengan KIT RIA BATAN dan komersial memang ada perbedaan cukup layak untuk substitusi KIT RIA import.
191
