PROSIDING SEMINAR NASIONAL REKAYASA KIMIA DAN PROSES 2004 ISSN : 1411 - 4216
PEMISAHAN ENZIM GLUKOAMILASE DARI KALDU FERMENTASI MENGGUNAKAN MEMBRAN ULTRAFILTASI. Rofiq Sunaryanto, Kaseno Balai Pengkajian Bioteknologi BPP Teknologi Kawasan PUSPIPTEK Serpong Tangerang Banten 16314 Phone :021-7560562 ext.1547 Fax.021-7560208 e-mail ;
[email protected] Abstrak Telah dilakukan pemisahan enzim glukoamilase dari kaldu fermentasi dengan menggunakan membran ultrafiltrasi dan penentuan bobot molekul protein enzim. Kultivasi dilakukan melalui kultur media padat menggunakan isolat lokal Aspergillus niger BCS. Untuk memisahkan biomassa dengan enzim glukoamilase dalam media terfermentasi dilakukan ekstraksi kultur dengan larutan bufer asetat pH 4.6. Filtrat enzim glukoamilase diendapkan dengan pelarut organik. Padatan enzim dilarutkan kembali dalam bufer pH 4.7 dan dipekatkan dengan membran ultrafiltrasi. Pemekatan dilakukan sebanyak 5, 10, dan 15 kali. Hasil pemekatan diuji bobot molekulnya dengan elektroforesis SDS PAGE. Dari hasil percobaan diperoleh informasi bahwa semakin tinggi hasil kali pemekatan filtrat enzim dengan ultrafiltrasi sampai dengan 10 kali pemekatan aktivitas spesifik enzim semakin besar.Pada pemekatan filtrat enzim 15 kali terjadi penurunan aktivitas spesifik, deaktifasi enzim semakin tinggi. Pemekatan filtrat enzim sebanyak 5, 10, dan 15 kali menghasilkan aktivitas spesifik berturut turut 139,2, 174.5 dan 164.9 mg/U. Hasil analisis bobot molekul dengan SDS-PAGE menunjukkan terdapat 4 macam protein enzim yang aktif mendegradasi pati dengan bobot molekul 114.000, 74.000, 55.000, 52.000 Dalton. Kata Kunci : Glukoamilase, Fermentasi padat, Membran Ultrafiltrasi, elektroforesis.
Pendahuluan Peranan enzim sebagai biokatalisator dalam industri semakin meningkat peranannya. Dewasa ini enzim-enzim yang diproduksi secara komersial telah banyak digunakan baik oleh industri pangan maupun non pangan. Adanya perkembangan berbagai teknologi proses dalam industri, akan semakin meningkatkan pemanfaatan enzim, dengan jenis enzim yang spesifik sesuai dengan proses yang diinginkan. Mengingat enzim ini cenderung memiliki karakteristik sesuai dengan karakteristik mikroorganisme yang menghasilkannya, maka peluang untuk memproduksi enzim yang sejenis dengan karakteristik yang berbedabeda akan tetap terbuka. Enzim yang digunakan untuk industri pangan merupakan enzim yang menguasai pasar global. Pada saat ini enzim yang sangat banyak digunakan untuk mengkonversi bahan tapioka menjadi maltosa, dekstrin, dan glukosa adalah enzim golongan amilase, seperti α-amilase, β-amilase, dan glukoamilase. Selain dimanfaatkan dalam industri pangan terutama gula cair, amilase juga banyak digunakan dalam industri tekstil dan deterjen. Enzim glukoamilase dewasa ini dapat dgunakan untuk campuran makanan ternak dan pembuatan gula cair. Meskipun potensi prnggunaan glukoamilase cukup besar, namun saat ini enzim ini masih diimpor dengan harga yang cukup mahal. Untuk memproduksi sendiri juga masih menghadapi beberapa kendala, antara lain tidak tersedianya galur unggul penghasil amilase dan kurangnya pengetahuan tentang teknologi enzim. Salah satu faktor yang sangat berperan dalam tahapan proses produksi yang berbasis bioteknologi, khususnya produksi enzim adalah proses hilir. Sekitar 40 – 60% dari total biaya produksi suatu produk bioteknologi, adalah untuk proses hilirnya (Belter et al.,1988). Dengan demikian akan sangat menguntungkan jika suatu industri bioteknologis dapat meningkatkan rendemen pada tahapan proses hilir untuk mendapatkan biaya produksi yang seminimal mungkin. Pemurnian enzim termasuk glukoamilase dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain dengan cara pengendapan dalam garam organik (salting out) atau pelarut organik (aseton), dan melalui membran ultrafiltrasi. Menurut Forgaty (1983) penggunaan amonium sulfat untuk salting out memiliki keuntungan antara lain harga relatif lebih murah, kelarutan tinggi, pH larutan tidak berubah secara ekstrem, dan tidak bersifat toksid. Kerugiannya adalah konsentrasi garam yang tertinggal dalam produk tinggi dan kurang efisien dalam menghilangkan pencemar. Pengendapan dengan pelarut JURUSAN TEKNIK KIMIA FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS DIPONEGORO SEMARANG
F-9-1
organik seperti aseton akan menghasilkan produk dengan aktivitas tinggi, tetapi kondisi reaksi harus dipertahannkan pada suhu yang relatiif rendah untuk mencegah denaturasi protein.Keuntungan lain dari penggunaan aseton adalah harganya lebih murah dan menghasilkan aktivitas enzim yang relatif tinggi, disamping itu aseton juga dapat didaur ulang kembali dengan cara destilasi. Metode pemurnian lain adalah dengan penerapan teknologi membran. Pemisahan dengan teknologi membran khususnya membran ultrafiltrasi sudah banyak digunakan dalam pemisahan produk industri bioteknologi. Keuntungan dari aplikasi teknologi membran adalah tidak ada pelarut ataupun bahan kimia lain yang ditambahkan dalam cairan atau bahan yang akan dipisahkan, disamping itu proses pemisahan ini tidak banyak membutuhkan energi dibandingkan dengan proses pemisahan lainnya. Enzim glukoamilase diharapkan dapat terpisahkan dengan membran ultrafiltrasi yang berukuran pori 10.000 Dalton. Prinsip pemisahan dengan ultrafiltrasi adalah memisahkan komponen berdasarkan bobot molekul melalui suatu membran yang sangat halus dengan menggunakan tekanan tertentu, dengan demikian partikel-partikel yang berukuran lebih besar dari pori-pori membran akan tertinggal dan partikel yang lebih kecil akan lolos (Bollag & Edelstein, 1991). Ultrafiltrasi sebagai salah satu tahap pemisahan α-amilase telah dilakukan oleh Shih & Labbe (1995), untuk produk yang lain juga telah dilakukan seperti teh hijau (Kawatsu et al.,1995) dan protein kedelai (Devereux et al., 1986). Tujuan penelitian ini untuk menentukan kadar pemekatan filtrat enzim glukoamilase yang paling optimum hasil pemisahan dengan membran ultrafiltrasi dan mengetahui bobot molekul proteinnya Metode Penelitian. Produksi Enzim Glukoamilase Substrat yang digunakan dalam penelitian ini komposisinya mengacu pada komposisi yang digunakan oleh Tani et.al (1986) yang dimodifikasi. Komposisinya sebagai berikut ; 29 g tapioka , 29 g dedak , 1,67 g MgSO47H2O, 3,52 g Ca(NO3)2, dan 37 ml air. Semua medium fermentasi dalam toples disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit. Fermentasi dilakukan dalam toples yang bervolume satu liter dengan kondisi aerobik selama 120 jam pada suhu 300C. Isolasi Enzim Glukoamilase. Fermentasi dihentikan setelah 120 Jam dan dilanjutkan dengan memisahkan enzim glukoamilase dengan biomassa dan media padat. Pemisahan dilakukan dengan mengekstraksi padatan media fermentasi dengan bufer asetat pH 4.6. Biomassa dan sisa media fermentasi dipisahkan dengan penyaringan menggunakan kertas saring. Untuk mendapatkan padatan enzim maka dilakukan pengendapan dengan menambahkan aseton sebanyak volume filtrat enzim, dan didinginkan selama 1 jam pada suhu 40C. Endapan enzim dipisahkan dengan freeze drying. Padatan enzim dilarutkan dalam bufer asetat pH 4.6 untuk dimurnikan kembali dengan membran ultrafiltrasi. Pemurnian Enzim Glukoamilase. Supernatan yang diperoleh dimurnikan dengan membran ultrafiltrasi dengan ukuran pori 10.000 Dalton, diharapkan hanya protein yang berukuran bobot molekul lebih kecil dari 10.000 Dalton (termasuk enzim glukoamilase) yang dapat lolos melewati pori membran. Kecepatan alir larutan umpan yang digunakan pada percobaan ini adalah 100 ml/menit, dan jenis membran yang digunakan adalah membran kaset dari polisulfone. Pemurnian enzim glukoamilase melalui membran ultrafiltrasi tersebut dilakukan dengan perlakuan pemekatan sebanyak 0, 5, 10, 15 kali. Hasil pemekatan dianalisis aktivitas enzim, protein, dan rendemennya. Pewarnaan Glukoamilase pada SDS-PAGE Filtrat enzim hasil pemekatan dengan ultrafiltrasi dimigrasikan pada SDS-PAGE. Gel yang telah dielektroforesis direndam dalam coomasie brilliat blue R-250 (0.005% coomasie brilliat blue dalam etanol 10% dan asam asetat glasial 5%) selama semalam, kemudian gel direndam dalam larutan peluntur warna (etanol 10% dan asam asetat glasial 5%) sampai gel bening. Protein standar yang digunakan miosin (BM=212 kDa), α2-makroglobulin (BM=170 kDa), β-galaktosidase (BM=116 kDa), transferin (BM=76 kDa), dan glutamat dehidrogenase (BM=53 kDa). Untuk mengetahui aktivitas glukoamilase setelah dielektroforesis dengan SDS-PAGE, el hasil SDS_PAGE direndam dalam 1% soluble starch yang dilarutkan dalam bufer asetat pH 4.6 dan diinkubasi pada suhu 600C selama 30 menit pada penggoyang. Pita glukoamilase divisualisasi dengan merendam gel dalam larutan iodin dengan komposisi KI 0.5% dan I2 0.05% (Kim et al.1995). JURUSAN TEKNIK KIMIA FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS DIPONEGORO SEMARANG
F-9-2
Hasil dan Pembahasan Penentuan Kondisi Optimum pada Ultrafiltrasi Laju alir umpan yang digunakan pada penelitian ini adalah 100 ml/menit, hal ini mengacu dari penelitian sebelumnya bahwa laju alir yang paling optimum yang menghasilkan aktivitas spesifik paling tinggi dengan rendemen tertinggi adalah pada laju alir 100 ml/menit. Larutan umpan yang akan digunakan merupakan larutan hasil dari pegendapan dengan aseton yang telah dilarutkan kembali dengan bufer asetat. Volume larutan umpan awal adalah sebesar 1000 ml dengan aktivitas glukoamilase 666 U/ml dan aktivitas spesifik 74.2, sehingga setelah dipekatkan dengan perlakuan 5, 10, 15 kali pemekatan, volume menjadi 200, 100, dan 66.6 ml (Tabel.1). Tabel 1. Pengaruh pemekatan dengan ultrafiltasi terhadap aktivitas dan jumlah protein enzim glukoamilase. Umpan VOL Akt. Akt. Kons. protein Akt spesifik Kemurn Rendemen (ml) (U/ml) total Protein total (mg) (gr/U) ian (%) (unit) ((mg)/ml) (kali) Filtrat awal 1000 666 666000 8.97 8970 74.2 1 100% (aceton) 5X 200 2630 526000 18.9 3780 139.2 1.9 79% 10X 100 3786 378600 21.7 2170 174.5 2.3 57% 15X 66.6 3975 264735 24.1 1605.06 164.9 1.2 40% Dari Tabel 1 menunjukkan kadar pemekatan glukoamilase dengan membran ultrafiltrasi berpengaruh terhadap aktivitas total, maupun protein total glukoamilase. Peningkatan kadar pemekatan menyebabkan aktivitas total glukoamilase menurun. Aktivitas total tertinggi pada pemekatan lima kali yaitu 666000 Unit. Kadar pemekatan yang semakin tinggi membutuhkan proses ultrafiltrasi lebih lama sehingga proses gesekan atau kontak dengan permukaan memban menjadi lebih banyak sehingga menyebabkan menurunnya aktivitas glukoamilase karena terjadinya kerusakan pada protein (denaturasi). Hilangnya aktivitas enzim selama tahap pemurnian sudah banyak terbukti (Kawaguci et al.1992, Ivanova et al.1993, Suhartono et al.1994, dan Kawatsu et al.1995). Whitaker (1972) melaporkan bahwa proses pemurnian dapat menyebabkan hilangnya kofaktor yang penting yang dapat menyebabkan hilangnya aktivitas enzim. Selain itu juga dapat pula terjadi denaturasi protein akibat pengaruh suhu dan pH selama pemurnian berlangsung. Semakin tinggi derajat pemekatan ternyata protein total menjadi turun, hal ini terjadi karena protein dengan berat molekul lebih kecil dari 10000 Dalton akan lolos melewati pori dan sebaliknya protein dengan berat molekul di atas 10000 Dalton (termasuk didalamnya enzim glukoamilase) akan tertahan. Namun demikian jika dilihat dari besarnya aktivitas spesifik maka pemekatan 5 dan 10 kali terjadi kenaikan aktivitas spesifik, hal ini disebabkan karena penurunan aktivitas total jauh lebih kecil dibandingkan dengan penurunan protein total, yang artinya bahwa banyak protein yang bukan enzim dapat dipisahkan sehingga pemekatan berkorelasi positif terhadap tingkat kemurnian enzim. Apabila aktivitas spesifik tinggi maka tingkat kemurnian enzim juga tinggi. Pada pemekatan enzim 15 kali aktivitas spesifik menjadi turun., hal ini terjadi karena penurunan protein total juga diimbangi dengan besarnya penurunan aktivitas total, yang berarti bahwa pada pemekatan sampai dengan 15 kali telah terjadi banyak kerusakan protein yang menyebabkan deaktivasi enzim. Dengan demikian kadar pemekatan 10 kali dengan laju alir 100 ml/menit merupakan kondisi yang paling optimum untuk pemurnian enzim glukoamilase dengan membran ultrafiltrasi dengan rendemen 57% dan kemurnian meningkat 2.3 kali dari kondisi awal. Tahap selanjutnya enzim hasil pemekatan diimigrasikan melalui elektroforesis gel (SDS-PAGE). Tujuannya untuk mengetahui banyaknya jenis protein enzim kasar secar kualitatif yaitu yan membentuk pitapita protein pada gel elektroforesis. Teknik ini dapat menganalisis bahaan dalam jumlah yang sangat kecil dengan kepekaan yang tinggi dan waktu pemisahan yang singkat Pemisahan protein dengan elektroforesis dikembangkan atas dasar prinsip bahwa ion atau gugus yang bermuatan akan bergerak sesuai dengan muatannya bila diberikan medan listrik. Karakterisasi protein berdasarkan bobot molekul enzim kasar hasil ultrafiltrasi dilakukan pada SDSPAGE (Gambar 1). Pita yang menunjukkan zona jernih ialah pita protein yang memiliki sifat aktif menghidrolisis pati. Hasil pengujian terhadap filtrat enzim Aspergillus niger BCS, diperoleh informasi bahwa di dalam filtrat tersebut terdapat enam macam protein masing-masing dengan bobot molekul 168.000, 114.000, 102.000, 74.000, 55.000, dan 52.000 Dalton. Pengujian lebih lanjut dengan menggunakan analisis produk hidrolisis soluble starch pada gel hasil elektroforesis menunjukkan dari keenam protein tersebut, ada JURUSAN TEKNIK KIMIA FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS DIPONEGORO SEMARANG
F-9-3
empat macam protein yang mampu menghidrolisis soluble starch, yaitu protein dengan bobot molekul 114.000, 74.000, 55.000, 52.000 Dalton yang menunjukkan zona bening pada elektroforegram. Protein dengan bobot molekul 114.000 Dalton menunjukkan pita yang paling cerah (menunjukkan degradasi soluble starch paling kuat), sedangkan protein dengan bobot molekul 74.000 Dalton menunjukkan degradasi soluble starch paling lemah. Keempat protein yang aktif terhadap hidrolisis soluble starch tersebut diduga merupakan aktivitas glukoamilase.
. A
B
212000 170000
C
168000
116000
114000 102000
76000
74000 55000 52000
53000
Keterangan : Lajur A.Protein marker Lajur B.Protein yang dihasilkan oleh Aspergillus niger BCS Lajur C.Degradasi soluble starch oleh glukoamilase Aspergillus niger BCS yang dideteksi dengan substrat soluble starch dan larutan pewarna I2/KI. Gambar 1. Elektroforegram SDS PAGE filtrat enzim Kesimpulan. Dari hasil penelitian ini disimpulkan bahwa ; •
Pemekatan sampai dengan 10 kali merupakan kondisi optimum proses pemurnian enzim glukoamilase dari senyawa pengotor menggunakan membran ultrafiltrasi. Pada pemekatan ini diperoleh peningkatan kemurnian sampai dengan 2.3 kali dari kondisi awal (setelah pengendapan dengan aseton) dengan rendemen 57%.
•
Bobot molekul protein enzim yang aktif terhadap hidrolisis pati pada filtrat hasil pemekatan dengan ultrafiltrasi ada empat macam protein antara lain 114.000, 74.000, 55.000, 52.000 Dalton.
Daftar Pustaka Belter, P.A., E.L.Cussler., S.H.Wei ., 1988. “Bioseparation; Downstream Processing For Biotechnology”. New York: J Wiley Bollag, D.M., S.J.Edelstein ., 1991. “Protein Methods”. New York: J Wiley. Devereux,N ., M.Hoare ., P.Dunnil ., 1986.” Membrane Separation Of Protein Precipitates: Unstirred Batch Studies”. Biotechnol Bioeng 28:88-96. Forgaty, W.M., 1983. “Microbial Enzymes and Biotechnology”. London: Appl.Sci. JURUSAN TEKNIK KIMIA FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS DIPONEGORO SEMARANG
F-9-4
Kawakatsu,T., T.Kobayashi., Y.Sano ., M.Nakajima., 1995. “Clarification Of Green Tea Extract By Microfiltration An Ultrafiltration. Biosci. Biotechnol. Biochem 59: 1016-1020. Kawaguchi,T ., H.Hagal., S.Murao ., M.Arai., 1992. “Purification and Some Properties Of a HaimSensitive α-Amilase From Newly Isolated Bacillus Sp. No.195”. Biosci.Biotech.Biochem. 56:1792-1796. Ivanova,V.M., E.P. Dobreva ., E.I.Emanuilova., 1993.” Purification and characterization of a thermostable α-amylase from Bacillus licheniformis”. J.Biotechnol 28:277-289. Tani,Y., V.Vongsuvanlert., J.Kumnuanta., 1986. “Raw Cassava Starch-Digestive Glucoamylase Of Aspergillus Sp.N-2 Isolated From Cassava Chips”. J.Ferment.Technol 64:405-410 Whitaker, J.R. 1072. “Principles of Enzymology for The Food Services”. New York: Marcel Dekker.
JURUSAN TEKNIK KIMIA FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS DIPONEGORO SEMARANG
F-9-5
