PRODUKSI GLUKOAMILASE DARI RHIZOPUS ORYZAE SKALA FERMENTASI 2 LITER DAN 4 LITER Unar Z. Udln, Ngadiman dan A.T. Karossl Puslitbang Kimia Terapan • LlPI Jalan Cisitu-Sangkuriang Bandung 40135
INTISARI Produksi glukoamilase oleli Rhlzopus oryzae telahdilakukan dalam skala erlenmeyer dengan menggunakan tepung sagu sebagai sumber karbon dan tepung bungkil kedele sebagai sumber nitrogen. Diketahui bahwa tepung sagu 2 % dan tepung bungkll kedele 0,5% dalam medium fermen/asi dapat memberikan glukoamilase optimum. Pada penelitian ini dicoba mencari kondisi yang paling baik untuk menghasllkan glukoamilase dalam jumlah yang maksimal dan beraktifitas tinggi oleli R. oryzae dalam medium tepung sagu pada skala 2 liter dan 4 liter. Hasil yang diperoleli menunjukkan bahwa untuk percobaan fermentasi dengan skala 600-1500 ml waktu inkubasi yang diperlukan untuk produksi glukoamilase adalah 8 (delapan) hari. Pada kondisi ini aktifitas spesifik enzim dapat mencapai 0,85 Uimg protein - 1,50 Ulmg protein. Pada skala fermentasi 4000 ml dengan kecepatan agitasi 300 rpm, aktifitas spesifik enzim maksimum sebesar 2,58 Ulmg protein diperoleli pada hari ke-S, sedangkan untuk kecepatan agitasi 500 rpm dan 700 rpm, aktiJitas spesiJik enzim makslmum masing-masing sebesar 3,47 Ulmg protein dan 4.71 U/mg protein didapatkan pada hari ke-6 dan ke-5 fermentasi. Pada kondisi makslmum ini penggunaan pati sagu dalam medium mencapai 94-98%. Biomasa yang dlhasilkan pada akhir proses fermentasi berkisar antara 4,80 - 7,90 g keringfl. medium.
ABSTRACT Production of glucoamylase by R. oryzae has been conducted in erlenmeyer flasks using medium containing sago starch as carbon source and soybean meal as nitrogen source. It was known that 2 % of sago starch and 0.5 % of soybean meal in the medium is the best composition for the production of glucoamylase. At the present study, the optimal condition for maximal production of glucoamylase fermentation from R. oryzae was investigated using sago starch medium in the 2L and 4L scale. The results showed that the maximum production of glucoamylase at 600-1500 ml fermentation scale was reached at day-S of incubation time. At this condition, the enzyme specific activity was 0.85 Ulmg protein - 1.50 Ulm g protein. For glucoamylase production within 4000 ml fermentation scale, the maximum enzyme specific activity, 2.58 Ulmg protein, was obtained at day-S of fermentation with 300 rpm agitation, while the maximum activity of 3.47 Ulmg protein and 4.71 Ulmg protein were achieved at day-6 and day-S of fermentation process with 500 rpm and 700 rpm agitation, respectively. At this maximum condition, the use of sago starch reached 94 - 98 %, and biomass production at the end of fermentation process was 4.80 - 7.90 g [dry weight)/L medium.
JKTI, VOL. 4 - No.1, Juni, 1994
PENDAHULUAN Enzim glukoamilase banyak digunakan dalam industri makanan, terutama pada pembuatan sirup. Glukoamilase adalah enzim yang menghidrolisa molckul pati menjadi glukosa dengan cara mcmutuskan ikatan glikosida -1,4 dari ujung rantai non-pereduksi polimer pati. Glukoamilase yang digunakan dalam bidang industri ini dihasilkan oleh mikroorganisme dari golongan bakteri, ragi atau kapang. Jcnis kapang yang secara komersial digunakan untuk produksi glukoamilase umumnya dari genera Aspergillus dan Rhizopus (2). Bcberapa peneliti melaporkan bahwa spesies Rliizopus dan Aspergillus ini dapat menghasilkan beberapa jenis glukoamilase (3, 4). Underkoflcr (5) dan Davies (6), melaporkan bahwa enzim dari kapang Rhizopus oryzae merupakan salah satu enzim kapang yang sangat baik untuk proses sakarifikasi. Produksi glukoamilase dari kapang sangat dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti komposisi medium, suhu, pH medium, tingkat acrasi dan waktu inkubasi. Untuk produksi enzim ini dipcrlukan medium yang mengandung sumber karbon, nitrogen dan mineral (6). Riyanto (1), melaporkan bahwa tcpung sagu atau campuran tepung sagu dengan "soluble starch" dapat digunakan scbagai sumber karbon untuk produksi glukoamilase oleb R. oryzae. Sclain itu juga dilaporkan mengenai penggunaan tepung bungkil kedc1e scbesar 0,5 % (kandungan nitrogen dalam medium 0,05 %) menghasilkan glukoamilase terbaik (1). Pcngaruh pH awal medium tcrhadap produksi glukoamilase R. oryzae tclah dilaporkan o1eb Prahastoeti (7). Diketabui bahwa produksi glukoamilase optimum dipcrolch pada pH awal medium 4,5. Pcnelitian yang dilaporkan disini bertujuan mencari kondisi agitasi yang paling baik untuk mendapatkan glukoamilase dalam jumlah yang maksimal dan beraktifitas tinggi dcngan menggunakan R. oryzae di dalam medium Icrmcntasi yang mcngandung tcpung sagu pada skala fcrmcntor 21itcr dan 4litcr.
BAHAN DAN METODA Rliizopus oryzae L16 dipcrolch dari Laboratorium Mikrobiologi ITB. Pati sagu dari jcnis metroxylon dan bungkil kedclc, kcduanya, dipcroleh dipasaran dilokasi Bandung.
19
Media fmnentasi
yang digunakan untuk produksi
glukoamilase mengandung (gIl) tepung sagu 20; tepung bungkil kedele 7,07; malt ekstrak 3% 30 (ml); KH2P04 1; MgS04. ?H20 0,5; KCI 0,05; FeS04' ?H20 0,01. pH; medium diatur sehingga mencapai 4,5. Media setelah disterilisasi, diinokulasi dengan 2% (v/v) larutan suspensi spora biakan murni R. oryzae yang berumur 7 (tujuh) hari (mengandung 106 spora/ml). Fermentasi dilakukan pada suhu 30 ± 1°C, aerasi 4,5 - 6 L/menit (1 vvm). Agitasi dilakukan dengan menggunakan Corning Hot Plate Stirrer skala-6 (± 300 rpm). Volume fermentasi yang digunakan yaitu: 600 ml, 800 mI dan 1500 mI. Fermentor yang digunakan berkapasitas 2L, dengan diameter 15 em. Percobaan pada skala fermentor 4L dilakukan pada kondisi yang sarna dengan percobaan pada skala 2L, hanya dilakukan variasi agitasi 300 - 700 rpm, dan volume kerja fermentasi 4000 mI. Fermentor yang digunakan (LKB) mempunyai diameter 16 em, dengan lebar pengaduk 1,5 em. Pengamatan dilakukan terbadap perubaban pH medium selama fermentasi berlangsung, aktifitas glukoamilase yang dihasilkan, pati tersisa dalam medium fermentasi dan biomasa pada akhir fermentasi. Aktifitas glukoamilase ditentukan dengan menggunakan metoda Ueda (3) yang telab dimodifikasi. Unit aktifitas ditentukan sete1ab membandingkan dengan glukoamilase standar (SIGMA). Unit aktifitas dinyatakan dalam unit/ml supernatan, yaitu banyaknya enzim yang dapat melepaskan 1 mg glukosa dari substrat pati-larut dalam waktu 10 menit pada pH 4,5 dan suhu 55°C. Kandungan protein enzim ditentukan dengan metoda Lowry (8). Pati tersisa dalam medium ditentukan berdasarkan metoda Nelsen-Somogyi setelab dibidrolisa dengan asam (9). Pengukuran biomasa dilakukan secara gravimetri setelah pencucian dengan air dan pengeringan pada 70°C (10).
kemudian menunjukkan peningkatan terus mula; bari ke-3. Hal ini disebabkan karena basil utama metabo1isme kapang tahap awal pertumbuhannya adalab senyawa-senyawa as am (7). Akumulasi asam-asam ini dalam medium menyebabkan pH medium turun. Selanjutnya asam-asam ini digunakan oleh kapang untuk keperluan pertumbuhannya sehingga pH medium meningkat kembali. Dengan semakin tinggi agitasi, pertumbuban kapang akan semakin cepat Hal ini akan mengakibatkan peningkatan pH medium semakin cepat dicapai. 10r------------------------------------.
8
2
6 WAKTU
FERMENTASI
8
10
12
(HAR I)
Gambar 1. Perubahan pH medium selama proses fermentasi olch R. oryzae L16 pada skala fermentasi 600 ml (0) 800 ml (_).1500
ml(e).
-9.-------------------------------------,
zs w ~ I
0.
5
HASIL DAN DISKUSI Dari hasil pengamatan perubaban pH medium selama proses fermentasi berlangsung, seperti yang diperlibatkan Gambar 1 dan Gambar 2, dapat dilihat babwa pH medium meningkat terus, dimulai bari ke-3 fermentasi. Dari skala fermentasi 600 ml, terlihat bahwa pH medium naik mencapai pH 3,49 setelah hari ke-5 fermentasi, Hal yang sama juga didapatkan untuk skala fennentasi 800 ml dan 1500 ml yang diamati selama 10 bari. Pada keadaan ini dapat dilibat babwa untuk skala fennentasi 800 ml, pH medium naik mencapai pH 5,67 setelah sepuluh hari, bahkan untuk skala fennentasi 1500 mI pH medium dapat meucapai 7,70. Pola yang sama tcrhadap perubahan· pH medium juga tcramati untuk skala 4000 ml, terutama proses fermentasi yang dilakukan dengan kecepatan agitasi 300 rpm dan 500 rpm (Gambar 2). Untuk proses fermentasi dengan kecepatan agitasi 700 rpm, pH medium sckitar 7,0 sudah dicapai pada hari ke-S, Perubahan pH medium ini tergantung pada aktifitas metabolisme kapang. pH medium memperlihatkan penurunan pada hari pcrtama inkubasi,
20
2
4 WAKTU
6 FERMENTASI
8
10
12
(HARI)
Gambar 2. Perubahan pH medium selama proses fermentasi oleh R. oryzae L16 pada skala fermentasi 4000 ml dengan kecepatan agitasi 300 rpm ( _). 500 rpm (e). 700 rpm (0).
Aktifitas glukoamilase yang dihasilkan dapat dilihat dalam Gambar 3 sampai Gambar 6. Terlihat bahwa aktifitas glukoamilase meningkat dengan bertambahnya waktu inkubasi. Untuk skala Iermentasi 600 mI, aktifitas gIukoamiIase pada hari ke-5 baru mencapai 0,4102 U/mI (0,5583 U/mg protein). Tetapi untuk skala 800 mI dan 1500 mI, aktifitas enzim masih terus meningkat, dan mencapai maksimum setclah hari ke-S, yaitu masing-masing sebesar 1,1945 V/mI atau 0,8460 Uzmg protein dan 2, 3927 U/mI atau 1,5014 Uzmg protein (Gambar 3 dan Gambar 5). JKTI, VOL. 4 - No.1, Junl, 1994
enzim yang dihasilkan secara maksimum, berkisar pada nilai pH medium yang sarna seperti pH untuk aktifitas maksimum enzim tersebut.
3
E <,
::> UJ
2
~ ~ ...J
~ d
0-:
~ 0 0
2
4 WAKTU
6 FERMENTASI
8
10
12
(HARI)
Gambar 3. Aktifitas glukoamilase hasil fermentasi R. oryzae L16 pada skala fermentasi 600 ml (D). 800 ml (.). 1500 ml (e). 2
4~----------------------------------~
4 WAKTU
6 FERMENTASI
8
10
12
(HARI)
Gambar 5. Aktifitas spesifik glukoamilase R. oryzae L16 pada skala fermentasi 600 ml (0). 800 ml (.). 1500 ml (e).
E .•..• ::>
5 4
~ 12
N~ ffi .s
..
::.:-
3
-0•.. u,
WAKTU
FERMENTASI
(HARI)
_0-
III
UJ'" o..E
Gambar 4. Aktifitas glukoamilase hasil fermentasi R. oryzae L16 pada skala fermentasi 4000 ml dengan kecepatan agitasi 300 rpm (.).500 rpm (e). 700 rpm (0).
2
Ill'
.::> >- ~
::.:
4:
~ 0
Aktifitas spesifik enzim maksimum basil fennentasi 4000 mI, yaitu 2,58 U/ mg. protein, dicapai setelah bari ke-8 inkubasi dengan kecepatan agitasi 300 rpm (Gambar 4 dan Gambar 6). Dengan menaikkan kecepatan agitasi terlihat bahwa aktifitas spesifik enzim yang dihasilkan meningkat, dan waktu fennentasi untuk mendapatkan aktifitas maksimum semakirr cepat dicapai. Proses fennentasi yang dilakukan dengan kecepatan agitasi 500 rpm dan 700 rpm, memberikan aktifitas spesifik glukoamilase masing-masing sebesar 3,47 dan 4,70 U/mg protein yang diperoleh pada 6 dan 5 hari inkubasi. Hal ini disebabkan karena kontak antara mikroorganisme dengan nutrisi dalam medium semakin baik dengan adanya agitasi yang tinggi. Umumnya mikroorganisme memerlukan aerasi yang baik untuk kecepatan pertumbuhannya. Agitasi yang besar yang dapat memberikan aerasi yang baik akan mempercepat pertumbuhan kapang, yang berarti dapat mempercepat proses metabolisme kapang tersebut, sehingga waktu fermentasi untuk mendapatkan basil maksimum akan semakin cepat dicapai. Aktifitas giukoamiiase maksimum yang dibasilkan dari percobaan ini ada disekitar pH 5,0. Bcrarti babwa
JKTI, VOL 4 - No.1, Junl, 1994
Q
2
4 WAKTU
6 FERMENTASI
8 (HARI
10
12
)
Gambar 6. Aktifitas spesifik glukoamilase R. oryzae L16 pada skala fermentasi 4000 ml dengan kecepatan agitasi 300 rpm (.). 500 rpm (e). 700 rpm (0).
Semakin tinggi kecepatan agitasi, semakin ban yak biomasa kapang yang terjadi. Hal ini dapat terlihat dari jumlah biomasa yang dihasilkan (Tabel 1 dan 2). Untuk proses fermentasi dengan kecepatan agitasi tertinggi (700 rpm) memberikan jumlah biomasa yang paling banyak (7,88g kering/L medium), sedangkan proses fermentasi dengan kecepatan agitasi 300 rpm dan 500 rpm, masing-masing menghasilkan biomasa sebesar 4,85g kering/L medium dan 4,52g kering/L medium. Tetapi agitasi yang terlalu tinggi juga dapat menyebabkan lisisnya sel-sel kapang tersebut. Keadaan ini dapat dilihat dari aktifitas glikoamilase basil fermentasi dengan kecepatan agitasi 700 rpm (Gambar 6), yang sudab mulai menurun di bari ke-8, bahkan diakbir fennentasi aktifitas enzim tersebut hampir tidak ada. 21
Tabel 1. Produksi biomasa oleh R. oryzae pada skala fennentasi 600 - 1500 ml.
~ ~ V>
Biomasa (g kering/L medium)
Volume fennentasi (ml)
L
Vi
60
0:
w I-
600
3,40
;:::
800
3,46
~
1500
3,51
40 20
2
Produksi biomasa oleh R. oryzae pada skala fennentasi 4000 ml dengan kecepatan agitasi 300 - 700 rpm.
Tabel2.
Kecepatan agitasi (rpm)
Biomasa (g kering/L medium)
300
4,52
500
4,85
700
7,88
Gambar8.
8
6 WAKTU
FERMEN1ASI
10
12
(HARI)
Kandungan pati sisa dalam medium selama proses fermentasi berlangsung oleh R. oryzae L16. pada skala fermentasi 4000 ml dengan kecepatanagitasi 300 rpm (e). 500 rpm (.), 700 rpm(G·
KESIMPULAN
Gambar 7 dan Gambar 8 memperlihatkan kandungan pati sisa dalam medium. Kandungan pati sisa ini untuk semua taraf perlakuan fennentasi terlihat semakin menurun dengan semakin lamanya waktu inkubasi. Dari Gambar 7 terlihat bahwa penurunan kandungan pati sisa dalam medium fennentasi skala 600 - 1500 ml berfluktuasi setelah hari ke-6 fennentasi. Hal ini disebabkan karena pada percobaan digunakan magnetic stirrer (sebagai agitator) yang putarannya tidak terlalu kencang sehingga kecepatan putaran tidak merata keseluruh isi fermentor dan gumpalan yang terjadi tidak dapat hancur. Keadaan ini memungkinkan sampe1 yang diambil kurang mewakili keseluruhan isi. Dari Gambar 7 dan 8, juga teramati bahwa dalam keadaan maksimum pati sagu yang terpakai untuk pertimbuhan kapang mencapai 94 - 98 %.
Dari percobaan ini diperoleh hasil sebagai berikut: waktu inkubasi (fennentasi) yang diperlukan untuk mendapatkan glukoamilase yang maksimum dengan skala 6001500 ml adalah 8 hari. Aktifitas spesifik enzim yang dihasilkan berkisar antara 0,85 U/mg protein - 1,50 U/mg protein. Fennentasi dengan skala 4000 ml, memperlihatkan bahwa dengan meningkatnya kecepatan agitasi, aktifitas spesifik enzim meningkat dan waktu fennentasi untuk mendapatkan aktifitas enzim maksimum semakin cepat dicapai. Aktifitas spesifik glukoamilase sebesar 2,58; 3,74 dan 4,71 Uzmg protein, masing-masing diperoleh setelah inkubasi selama 8, 6, 5 hari dengan kecepatan agitasi 300, 500 dan 700 rpm. Dengan meningkatnya kecepatan agitasi, se1ain dapat meningkatkan aktifitas enzim, juga dapat meningkatkan produksi biomasa. Biomasa yang dihasilkan diakhir fennentasi adalah 4,52 - 7,88 g kering/L medium dengan kecepatan agitasi 300 - 700 rpm. Penggunaan pati sagu dalam medium mencapai 94 - 98 %.
100
~ ~ V>
80
PUSTAKA
60
1. S. Riyanto. Skripsi S1. Fakultas Pertanian, Universitas Padjadjaran, Bandung (1986).
Vi 0: w I-
;:::
2. Linar Z. Udin dan A.T. Karossi. Penggunaan Enzim Pemecah Pati di Indonesia. Buletin Limbali Pangan, Vol. V, April: 484-497 (1990).
40
~ 20
2
4 WAKTU
Gambar 7.
22
6 FERMENTASI
8
10
12
(HARI)
Kandungan pati sisa dalam medium selarna proses ferrnentasi berlangsung olch R. oryzae L16. pada skala fermentasi 600 OIl (D). 800 OIl (.). 1500 OIl (e).
3. S. Ueda, Fukuoda, T. Mitsue and B.C. Saba. Glucoamylase Produced by Submerged Culture of A. oryzae. Starke. 31(9) : 307-314 (1979). 4. W.M. Fogarty. Microbial Enzyme and Biotechnology. W.M. Fogarty (Ed). Applied Science Publ., London (1983). JKTI, VOL. 4 - No.1, Junl, 1994
8. S.P. Colowick and H.O. Kaplan. Methods in Enzymology. Vol. 3. Acad Press Inc. New York (1957).
5. L.A. Underkofler. Microbial Enzyme. Industrial Microbiology. Brinton, M and W. Litsky (Ed). Mc.Graw Hill Book Co. New York (1976). 6. R. Davies. Microbial Extracellular Enzymes. Their Role and Some Factors Affecting Their Formation, Biochemistry of Industrial Microorganisms. Rainbow, C. and A.H. Rose (Ed). University of London Press Ltd. London (1963). 7. R.D. Prahastoeti. Skripsi Sl. Fakultas Pertanian, Universitas Padjadjaran, Bandung (1989).
9. N. Nelson. A Photometric Adaption of the Somogyi Method for Determination of Glucose. J. Bioi. Chem. 153 : 375-380 (1944). 10.A.T. Karossi, C. Tjahjadi, R. Dyah and Linar Z. Udin. Food Science and Technology in Industrial Development. Proceedings Food Conference'88. Bangkok, Thailand, 24-26 October 1988 : 396-398.
Proceedings dan maj alah berikut ini dapat dipesan pada Rosidin d/a HKI, Puslitbang Kimia Terapan-LIPI DAFTAR HARGA PROCEEDINGS/MAJALAH
DI UNION SHOP HKI
NAMA
NO.
HARGAJUAL
1. Proceedings of the ASEAN-EC workshop on the scale up, cost evaluation and technology transfer of biotechnological processes.
Rp 12.500,-
2. Proceedings on the first ASEAN workshop on biochemical engineering
Rp 12.500,-
3. Proceedings lokakarya lignosellulosa
Rp 7.500,-
pertama
evaluasi
biologi
kimia dan fisika limbah
4. Proceedings of the first ASEAN workshop on the technology of animal feed production utilising foodwaste materials................................................................ 5.
Rp 7.500,-
Invited papers presented at the first ASEAN workshop on the technology of animal feed production utilising foodwaste materials
Rp 7.500,-
6. Proceedings of the second ASEAN workshop on the technology of animal feed production utilising foodwaste materials................................................................
Rp 12.500,-
7. ASEAN bibliography on fermentation technology
Rp 7.500,-
8.
Rp 5.000,-
Biogasification of various organic residues in the ASEAN region
9. Proceedings of the first ASEAN (+ supplementary information)
seminar
workshop on biogas technology .
Rp 12.500,-
10. Buletin Limbah Pangan
.
Rp
11. Proceedings of the First ASEAN workshop on solid substrate fermentation
.
Rp 7.500,-
12. Proceedings of the second ASEAN workshop on food analytical techniques
.
Rp 7.500,-
13. Jumal Kimia Terapan 1991-1992
.
Rp 3.500,-
14. Warta Kimia Analitik
.
Rp 2.000,-
JKTI, VOL. 4 - No.1, Junl, 1994
1.500,-
23
