Membran Kromatografi untuk Pemisahan Protein Dwi Ananda Gunawan Jurusan Teknik Kimia, Fakultas Teknologi Industri, Institut Teknologi Bandung Jalan Ganesa No. 10, Bandung, Indonesia
[email protected]
Abstrak Permasalahan-permasalahan atau keterbatasan yang dapat ditimbulkan oleh kromatografi menggunakan unggun padat seperti ketergantungannya pada difusi intra-partikel dalam transfer molekul-molekul zat terlarut ke tempat pengikaatan didalam pori dari medianya dapat diatasi dengan menggunakan membran makropri dan mikropori sebagai media kromatografi. Hal ini kemudian disebut sebagai membran kromatografi ataupun kromatografi membran. Membran kromatografi memanfaatkan dominansi sifat konveksi pada transpor zat terlarut sehingga dapat lebih unggul dari unggun pada, selain itu pemisahan berdasarkan afinitas dan pertukaran ion biasanya digunakan untuk kromatografi membran protein. Selanjutnya yang dibahas dalam paper ini adalah tinjauan tentang ilmu kimia yang diterapkan dalam hal pemisahan, penerapan-penerapan dari kromatografi membran, dan tantangan mengenai gaya dorong untuk perkembangan lebih lanjut. Setelah dilakukan pembahasan mengenai masalah kromatografi membran dalam artikel ini didapatkan kesimpulan bahwa jelas kromatografi menggunakan membrane jauh lebih menguntungkan daripada kromatografi menggunakan unggun padat, hal ini dibuktikan dengan semakin banyaknya membran yang telah dikomersialkan atau digunakan dalam industry untuk membantu proses kromatografi. Selanjutnya untuk pengembangan membran kromatografi di masa depan, hal hal yang perlu dilakukan adalah (a) perbaikan proses dan desain peralatan terutama berfokus pada aliran inlet, (b)pengembangan membran baru untuk aplikasi-aplikasi yang lebih luas, (c) penyaringan sifat pengikat membran yang ada , dan (d) sistem seleksi yang tepat. Kata kunci: Membran, kromatografi, protein, unggun padat, mikropori, makropori, konveksi, afinitas, pertukaran ion
1. Pendahuluan Teknologi membran adalah teknologi baru dan telah menjadi sangat penting dalam hidup kita. Terobosan signifikan untuk aplikasi industrial dari membran sintetik berawal pada 1960an, walaupun studi tentang fenomena membran tercatat pada pertengahan abad ke 18. Dengan 50 tahun dari perkembangan cepat, kini, varian proses berbasis membran telah menemukan berbagai aplikasi industrial, termasuk pemurnian air dan susu, desalinasi air laut dan payau, reklamasi air limbah, produksi makanan dan minuman, pemisahan gas dan uap, konversi dan penyimpanan energi, pengendalian polusi udara dan pengelolaan
limbah industri berbahaya, hemodialisis, pemisahan protein dan mikroorganisme, dll. [1]. Kromatografi merupakan teknik yang paling banyak digunakan untuk analisis protein dan pemisahan resolusi tinggi. Proses-prosesnya secara sederhana dilakukan menggunakan unggun padat yang memiliki beberapa keterbatasan. Penurunan tekanan sepanjang unggun umumnya tinggi dan cenderung meningkat selama prosesnya disebabkan efek dari penggabungan unggun (yang disebabkan oleh perubahan bentuk media) dan pengaburan kolom yang disebabkan oleh material koloid yang bertumpuk. Keterbatasan lainnya dengan kromatografi konvensional proses bioseparasi adalah ketergantungannya pada
difusi intra-partikel dalam transfer molekulmolekul zat terlarut ke tempat pengikaatan didalam pori dari medianya (lihat Gambar 1). Hal ini akan menambah waktu dari prosesnya karena transport makromolekul dengan difusi itu berjalan lambat apalagi jika prosesnya terhalang. Akibatnya, volume cairan pemulihan (yang dibutuhkan untuk elusi) juga akan meningkat. Channeling,
yaitu pembentukan bagian aliran karena keretakan pada unggun padat, adalah masalah utama. Hal ini menyebabkan hubungan arus pendek aliran material, menyebabkan pemanfaatan unggun yang buruk. Masalah lain termasuk keterbatasan dispersi aksial dan radial yang timbul dari penggunaan media polydisperse konvensional.
Gambar 1. Transportasi zat terlarut dalam kromatografi unggun padat dan kromatografi membran. (Diadaptasi dari [2]) Beberapa faktor tersebut dan fakta bahwa fenomena transportasi rumit membuat proses kromatografi unggun padat dalam skala besar menjadi sulit. Beberapa keterbatasan dari kromatografi unggun padat tersebut telah diatasi dengan menggunakan media kromatografi baru yang keras, tidak berpori, dan monodisperse. Walaupun demikian, media tersebut umumnya mahal dan kapasitas pengikatan zat terlarut berkurang karena proses pengikatannya hanya dapat terjadi di permukaan luar. Dan juga permasalahan dengan penurunan
tekanan yang tinggi masih ada. Sebuah pendekatan yang berbeda secara radikal untuk mengatasi keterbatasan yang terkait dengan unggun padat adalah dengan menggunakan mikro sintetik atau membran berpori media kromatografi (misal Ref. [37]). Dalam membran kromatografi proses pengangkutan zat terlarut ke tempat pengikatan berlangsung secara dominan oleh konveksi (lihat Gambar. 1), sehingga mengurangi baik waktu proses dan volume cairan pemulihan. Efisiensi pengikatan umumnya tidak bergantung pada laju alir
2
umpan pada rentang yang luas dan karena itu laju alir umpan yang sangat tinggi dapat digunakan. Penurunan tekanan juga secara signifikan lebih rendah dibandingkan pada unggun padat. Keuntungan lainnya dari penyerap membran adalah relatif mudah pada skala yang lebih besar bila dibandingkan dengan unggun padat. Namun, potensi ini belum sepenuhnya dimanfaatkan di industri bioproses. Kromatografi membran sangat cocok untuk protein yang lebih besar (yaitu Mr> 250 000). Protein seperti itu jarang masuk ke dalam pori di media kromatografi-grafis partikulat dan hanya mengikat pada daerah permukaan yang tersedia secara eksternal dari media tersebut. Oleh karena itu, untuk protein yang lebih besar, luas permukaan yang tersedia untuk mengikat secara signifikan lebih besar dengan membran. Kapasitas pengikatan membrane penyerap untuk protein yang lebih kecil umumnya lebih rendah dibandingkan dengan media berbasis gel konvensional, tetapi secara signifikan lebih tinggi daripada dengan monodisperse, tidak berpori, dan media kaku. Perangkat membran kromatografi umumnya lebih mudah dan lebih murah untuk diproduksi secara massal. Hal ini memungkinkan untuk memiliki membrane penyerap sekali pakai. Perangkat ini dapat digunakan sampai sifat yang diinginkan (yaitu permeabilitas hidrolik, kapasitas pengikatan, selektivitas dan kekuatan pemecahan) dipertahankan. Saat mereka berhenti berfungsi dengan baik perangkat ini bisa diganti. Fleksibilitas ini dapat menghilangkan kebutuhan untuk membersihkan dan memvalidasi ulang peralatan. Pemisahan kimiawi berbeda digunakan dalam kromatografi membran protein. Beberapa membran yang sudah digunakan untuk jenis lain dari proses membran (misal mikrofiltrasi) ternyata cocok digunakan
sebagai media kromatografi. Namun, dalam banyak kasus ini membrane yang tersedia telah dimodifikasi untuk membuat mereka lebih cocok untuk digunakan sebagai membran penyerapan. Membran sintetik baru juga telah dikembangkan. Alternatif lain untuk kromatografi unggun padat, yang memiliki kemiripan tertentu dengan membran kromatografi, didasarkan pada penggunaan kolom monolit. Kolom ini disusun dengan menggunakan struktur berbentuk batang berpori melalui dimana aliran fasa gerak konvektif dapat terjadi. Keuntungan utama dari kolom monolit sama dengan yang terjadi pada membran kromatografi. Namun, monolit berbeda dari membran dalam hal bahan konstruksi dan morfologi. Sementara membran menurut definisi adalah penghalang di mana dimensi lateral yang jauh melebihi memanjang dari dimensi longitudinalnya. Monolit mungkin lebih mirip dengan kolom unggun padat daripada membrane kromatografi. 2. Fenomena transpor pada membran kromatografi Menurut Teori Black Box, fenomena transportasi dari molekul atau partikel melintasi membran dari satu fase ke fase lain dapat terjadi karena karena gaya dorong yang diberikan pada molekul atau partikel. Persamaan fenomenologis yang paling menggambarkan transportasi massa melintasi membran didefinisikan oleh, Flux (J) = proportionality factor (A) x driving force (X) [8]. Keuntungan dari kromatografi membran terletak pada dominasi transportasi bahan konvektif. Namun, seperti terlihat dari Gambar 1, transportasi difusi tidak benarbenar ada. Dominasi konveksi sendiri tidak menjamin efisiensi. Aliran konvektif pada jenis yang tidak sesuai dapat menyebabkan kerugian serius. Distribusi aliran merupakan perhatian utama dalam kromatografi dan
3
sebagian besar jenis proses pemisahan. Desain rasional dari proses membran kromatografi dan peralatannya hanya mungkin bila fenomena transportasi yang terlibat dipahami dengan benar. Namun, mungkin layak disebutkan bahwa, dalam banyak proses kromatografi, terutama yang mengandalkan jenis interaksi afinitas, kinetika pengikatan dapat membatasi. Dalam proses yang seperti itu, perbaikan dalam fenomena transport sepertinya tidak akan menghasilkan perbaikan signifikan dalam efisiensi proses. Umumnya terdapat tiga jenis membran penyerap yang digunakan untuk bioseparasi protein: flat sheet, hollow fibre, dan aliran radial. Flat sheet tunggal jarang dipakai, yang lebih sering dipakai adalah tumpukan dari beberapa flat sheet yang ditempatkan dalam modul membran. Sebagai tambahan untuk menyediakan volume adsorbent yang lebih banyak, penggunaan tumpukan membran memiliki keuntungan lain yang akan dibahas dibawah. Membran hollow fibre memiliki geometri turbular dengan ukuran diameter pipa pada rentang 0,25-2,5 mm. Membran penyerap jenis hollow fibre biasanya terdiri dari seikat ratusan fiber yang diletakkan dalam modul di konfigurasi penukar panas jenis shell and tube. Penyerap aliran radial disusun dengan melilitkan flat sheet secara spiral pada pori silinder di bagian tengah. Membran berpori digunakan pada proses mikrofiltrasi dan ultrafiltrasi. Membranmembran tersebut terdiri dari matriks polimer dengan ukuran pori-pori pada rentang 2 nm hingga 10 µ [8]. Ultrafiltrasi (UF) adalah varian dari filtrasi membran dimana tekanan hidrostatik memaksa cairan menembus membran semipermeabel. Padatan tersuspensi dan pelarut dengan berat molekul tinggi tertahan, sedangkan air dan pelarut dengan berat molekul rendah melewati membrane. Proses pemisahan ini digunakan di industri dan penelitian untuk
purifikasi dan pemekatan larutan makromolekul (103-106 Da), terutama larutan protein [9] Sejauh ini, membran flat sheet adalah yang paling banyak digunakan. Hollow fibre, walaupun memiliki keuntungan di berbagai tipe teknologi berbasis membran (misal mikrofiltrasi, ultrafiltrasi, dan dialisis), mungkin tidak terlalu cocok untuk membran kromatografi. Penggunaan peralatan aliran radial juga tidak begitu luas walaupun beberapa penyerap jenis ini tersedia di pasar. Tabel 1 menunjukkan daftar beberapa membran penyerap yang tersedia secara komersial. Fakta mengenai adanya beberapa membrane penyerap pabrikan secara relatif menunjukkan corak baru dalam teknologi. Dalam membran penyerap jenis flat sheet, cairan biasanya dibawa ke permukaan membran secara normal (lihat Gambar 2). Dalam membran hollow fibre , cairan awalnya mengalir sejajar dengan permukaan membran (lihat Gambar. 2). Cairan tersebut kemudian secara bertahap diarahkan menuju dan melalui pori-pori karena perbedaan tekanan hidrostatik. Keuntungan utama menggunakan konfigurasi hollow fibre adalah rasio luas permukaan membran yang tinggi terhadap volume yang disediakan. Keuntungan lain menggunakan hollow fibre adalah pengurangan akumulasi partikel dekat pintu masuk pori karena cross-flow. Pengamatan pola aliran cairan di hollow fibre menunjukkan bahwa jenis absorber ini tidak dapat digunakan untuk mendorong terjadinya kromatografi yang bergantung pada injeksi sampel dalam bentuk getaran, durasi yang dibutuhkan tidak signifikan jika dibandingkan dengan waktu proses keseluruhan. Bahkan dalam cara mengikat dan elusi, terobosan yang diharapkan akan diperluas, mengarah ke pemanfaatan adsorber yang buruk. Pola aliran cairan dalam perangkat aliran radial ditunjukkan pada Gambar 2.
4
Penyerap aliran radial diklaim cocok untuk aplikasi skala besar. Kiranya, distribusi aliran dalam perangkat ini diharapkan akan cukup menantang. Daerah membran juga bertambah dalam arah radial keluar. Hal ini pasti akan menyebabkan kompleksitas yang dihasilkan dari penurunan kecepatan superficial dari aliran cairan selama arus melalui membran. Penyerap aliran radial jelas tidak cocok untuk kromatografi pulsa. Penyerap aliran radial mungkin lebih cocok untuk digunakan dalam mode mengikat dan elusi. Namun, proses mengikat dan elusi mungkin sulit untuk diprediksi dan dimodelkan. Terlepas dari kekurangan tersebut, penyerap aliran radial ternyata populer di kalangan pengguna dalam industri. Beberapa produk yang sukses telah dikomersialkan oleh perusahaan seperti Sartorius dan Pall. Dalam merancang produk-produk ini, upaya yang cukup telah dilakukan untuk meningkatkan distribusi
aliran. Peneliti tertentu berpendapat bahwa keuntungan yang dapat diperoleh dengan menumpuk alat aliran radial tersebut jauh lebih besar dari kelemahan yang dihasilkan dari distribusi aliran yang buruk. Setelah umpan memasuki membran, ia akan mengalir melalui pori-pori, yang umumnya diasumsikan lurus normal dengan permukaan membran. Aliran keseluruhan cairan melalui membran berlangsung dalam arah normal. Meski demikian, karena sifat berliku-liku dari pori-pori di sebagian besar membran berpori, aliran lokal belum tentu selalu begitu. Rezim aliran cairan biasanya laminar. Transportasi aksial molekul protein dalam pori-pori silinder sebagian besar konveksi sedangkan transportasi radial sebagian besar difusi. Transportasi aksial dapat berpotensi dipengaruhi oleh dispersi Taylor. Namun, efek ini diharapkan kecil. Beberapa peneliti telah menyelidiki fenomena transport dari membran kromatografi (misal Ref. [6, 10, 15-21]).
Tabel 1. Penyerap membran yang tersedia secara komersial (diadaptasi dari [2]) Product name
Membrane material / type
Configuration
Manufacturer
Sartobind MA5, MA15 and MA100
Reinforced stabilised cellulose, strong cation exchange (S type), strong anion exchange (Q type), weak cation exchange (C type), weak anion exchange (D type)
Flat sheet, ready to use adsorbers
Sartorius
Sartobind MA120, MA550, MA600X5 and MA5500X10
Reinforced stabilised cellulose, strong cation exchange (S type), strong anion exchange (Q type), weak cation exchange (C type), weak anion exchange (D type)
Flat sheet, discs
Sartorius
Sartobind Factortwo family
Reinforced stabilised cellulose, strong cation exchange (S type), strong anion exchange (Q type), weak cation exchange (C type), weak anion exchange (D type)
Radial flow cartridge
Sartorius
Sartobind C5F, C15X and C100X
Reinforced stabilised cellulose, weak cation exchange
Flat sheet
Sartorius
Vivapure
Strong and weak,
Flat sheet,
Vivascience
5
ditimbulkan oleh variasi porositas membran dan ketebalan juga disorot. Transpor massa yang terlibat dalam model matematis ini diperiksa menggunakan studi percobaan (melibatkan antibody monoclonal) dalam paper berikut [16].
Gambar 2. Aliran di membran penyerap (diadaptasi dari [2])
Gambar 3. Skema proses pemindahan berbasis membran (diadaptasi dari [25])
Kebanyakan dari paper tersebut adalah berdasarkan membran flat sheet sebagai model sistem. Satu dari paper yang pertama membahas fenomena transpor dalam membran kromatografi adalah paper dari Briefs dan Kula [6]. Formulasi matematis untuk membran penyerap ideal berdasarkan pada tumpukan flat sheet disajikan dan dipecahkan untuk memprediksi terobosan dab profil elusi. Kecenderungannya yang prediksi dengan formulasi matematis diuji secara eksperimental dengan adsorpsi dinamis dan elusi menggunakan enzim formate dehydro-genase dan pyruvate decarboxylase. Suen dan Etzel [15] menyajikan model matematis, dimana yang menjadi pertimbangan adalah konveksi, difusi, dan adsorpsi isotermal Lang-muir. Model ini juga didasarkan pada membrane penyerap jenis flat sheet. Dalam paper ini diprediksi bahwa, dengan membran tipis, batas atas dari laju alir dapat dibatasi dengan hubungan kinetic ligan-protein. Penggunaan tumpukan beberapa mempran tipis direkomendasikan untuk mengatasi keterbatasan ini. Keterbatasan yang
Tennikova dan Svec [8] menjelaskan fenomena transport massa dari membrane kromatografi (juga flat sheet) terutama berdasarkan parameter-parameter operasi. Efek-efek yang diamati dari transfor massa mempengaruhi parameter-parameter operasi (misal kecepatan superfisial, diameter pori, ketebalan membrane, dan difusifitas protein) dalam efisiensi proses yang dibahas. Mereka melaporkan bahwa efisiensi proses dari suatu sistem yang diperiksa tidak dibatasi oleh laju alir. Hal ini diduga disebabkan oleh peningkatan transportasi difusi protein karena peningkatan kecepatan aliran (yaitu peningkatan koefisien perpindahan massa). Difusivitas protein dalam pori-pori dilaporkan menjadi hampir empat kali lipat lebih tinggi dari difusifitas masing masing larutan bebas. Liu dan Fried [19] membahas sebuah model sistem berdasarkan adsorpsi lisosom pada sebuah sistem afinitas membran flat sheet. Dampak dari perpindahan massa dibahas secara rinci dan signifikan. Pentingnya difusi radial dan aksial, efek
6
distribusi ukuran pori, dan variasi ketebalan membran dipertimbangkan. Meningkatkan distribusi ukuran pori dan variasi ketebalan membran ditemukan dapat memperluas kurva penerobosan secara signifikan. Disarankan bahwa menggunakan tumpukan
sejumlah besar membran untuk ''menyeimbangkan'' dispersi aliran akan meningkatkan ketajaman kurva terobosan dan karena itu efisiensi pengikatan meningkat.
Tabel 2. Membran kromatografi berdasarkan ligan immunoafinitas (diadaptasi dari [2]) Ligand
Membrane
Target protein / s
Adsorber geometry
Anti IgE antibody Anti BSA antibody Human IgG Monoclonal antibody Monoclonal antibody Anti BSA monoclonal antibody Anti hSAP antibody Anti rINF-a2A monoclonal antibody IgG IgG IgG
Regenerated cellulose Regenerated cellulose GMA–EDMA Hydrazide Hydrazide Regenerated cellulose
IgE BSA Protein G Interleukin-2 receptor Interleukin-2 BSA
Flat sheet Hollow fibre Flat sheet Hollow fibre Hollow fibre Flat sheet
Cellulose Hydrazide
Human serum amyloid P (hSAP) Recombinant interferon-a2A (rINF-a2A) Recombinant protein G Human low-density lipoprotein Human low-density lipoprotein
Flat sheet Hollow fibre
(GMA–EDMA) co-polymer Microporous membrane Microporous membrane
Flat sheet Flat sheet Flat sheet
Tabel 3. Membran kromatografi afinitas berdasarkan protein A dan G (diadaptasi dari [2]) Ligand
Membrane
Target protein / s
Adsorber geometry
Protein A
IgG
Hollow fibre
IgG
Flat sheet
Recombinant protein G Protein A Protein A Protein A Recombinant protein A Recombinant protein A Recombinant protein A Recombinant protein A / G Protein A
Hydroxyethyl cellulose treated blend of polyethersulfone and polyethylene oxide Methyl methacrylate based copolymer Regenerated cellulose Nylon based Poly(ether–urethane–urea) Composite membrane Polyethersulfone Polysulfone Composite cellulosic membrane Poly-caprolactam Epoxy
Flat sheet Flat sheet Flat sheet Hollow fibre Hollow fibre Hollow fibre Radial flow Flat sheet Flat sheet
Protein G Protein A Protein A Recombinant protein G
Nylon based Poly(vinylidene difluoride) Poly(GMA–EDMA) Immobilon AV
IgG Human IgG Human IgG Human IgG Human IgG Human IgG Human IgG Human IgG Mouse monoclonal antibody (IgG) Human IgG Human IgG Human IgG Human IgG sub-classes
Protein A / G
7
Flat sheet Flat sheet Flat sheet Flat sheet
Tabel 4. Membran kromatografi afinitas berdasarkan ligan bermassa molekul rendah (LMM) (diadaptasi dari [2]) Ligand
Membrane
Target protein / s
Adsorber geometry
Cibacron Blue F3-GA Procion Yellow HE-4R Procion Red HE-3R Cibacron Blue 3GA Maltose Phenylalanine Tryptophan Histidine
BSA Pyruvate decarboxylase Formate dehydrogenase Lysozyme Concanavalin A IgG IgG Human IgG
Flat sheet Flat sheet Flat sheet Flat sheet Flat sheet Hollow fibre Hollow fibre Hollow fibre
Adenylate kinase Alkaline phosphatase BSA Bovine catalase
Flat sheet Flat sheet Tubular Flat sheet
Cibacron Blue F3-GA
Nylon based Nylon based Nylon based Cellulose Cellulose Polyethylene based Polyethylene based Polyethylenevinyl alcohol Nylon based Modified cellulose Acrylic copolymer Poly(hydroxyethyl methacrylate) Sartobind Blue 2
Flat sheet
Cibacron Blue F3-GA p-Aminomethylbenzoyl sulphonamide Aspartate p-Aminobenzamidine Cibacron Blue F3-GA Cibacron Blue F3-GA Procion Blue MX-R
Supported chitosan Poly(glycidyl methacrylate) based Regenerated cellulose Chitosan membrane Chitosan membrane Nylon based Modified polyethylene
Yeast glucose-6-phosphate dehydrogenase Human serum albumin Carbonic anhydrase Aspartase Trypsin Human serum albumin Alanine dehydrogenase Creatine phosphokinase
Flat sheet Flat sheet Flat sheet Flat sheet Hollow fibre
Cibacron Blue F3-GA Cibacron Blue F3-GA Cibacron Blue F3-GA Cibacron Blue F3-GA
Flat sheet Flat sheet
Tabel 5. Jenis membrane kromatografi afinitas lainnya (diadaptasi dari [2]) Ligand
Membrane
Target protein / s
Adsorber geometry
Peptide ligand Pentadecapeptide Hexadecapeptide
GMA–EDMA GMA–EDMA
IgG IgG
Flat sheet Flat sheet
Macroporous chitin membrane Epoxy Modified polysulfone Macroporous chitin membrane Modified polyethylene
Lysozyme Annexins Soybean trypsin inhibitor Wheat germ agglutinin Trypsin Monoclonal antibody
Flat sheet Flat sheet Flat sheet Flat sheet Hollow fibre Spiral wound
Immobilised metal ion ligands Cu 21
Sartobind IDA membrane
Flat sheet
Cu 21
Glass membrane
Cu 21
Nylon based
Cytochrome c, lysozyme and chymotrypsinogen Cytochrome c, lysozyme, chymotrypsinogen A and ribonuclease A Lysozyme, ovalbumin and concanavalin A
Other polymeric ligands Chitin based Collagen Trypsin Chitin based Soybean trypsin inhibitor Thiophilic ligand
8
Tubular
Flat sheet
pemisahan protein spesifik dari campuran komples alami (misal pemurnian antibodi monoclonal dari kultur sel supernatan). Pemisahan campuran protein yang terjadi secara alami (misal serum albumin dan immunoglobulin), mungkin juga diklasifikasikan secara umum sebagai aplikasi berbasis penelitian. Namun, pemisahan protein yang tidak berkelanjutan dalam campuran alam [misal bovine serum albumin (BSA) dan lisosom] mungkin tidak termasuk dalam kateegori ini. Campuran tiruan yang telah dipisahkan didasarkan pada karakter yang baik dan ketersediaan protein yang mudah seperti BSA, lisosom, miogloin, ovalbumin, conalbumin, sitokrom c dan krimotripsinogen. Protein-protein ini tersedia dalam bentuk paling murni dan merepresentasikan rentang sifat-sifat kimiafisik (misal titik isoelektrik, massa molekul). Hal-hal ini secara ideal sesuai dengan model protein, yang umumnya digunakan untuk menunjukkan kinerja dan kesesuaian dari membrane baru dan juga untuk studi teoretis.
3. Aplikasi membran kromatografi dalam pemisahan protein Seperti dilihat secara jelas pada Tabel 27, membran kromatografi telah digunakan secara luas dalam pemisahan protein. Kebanyakan literatur setuju dengan pemisahan campuran biner atau multi protein. Juga terdapat beberapa laporan mengenai pengikatan dan berdasarkan protein tunggal. Aplikasinya dapat dikategorikan berdasarkan jenis protein yang dipisahkan. Aplikasi membran kromatografi sebenarnya potensial. Hal ini disebabkan oleh kepentingan peneliti yang beragam dalam cakupan ini, yang dapat dibagi menjadi tiga kategori umum: (a) ahli bioteknologi menggunakan membran kromatografi untuk campuran biologis, (b) peneliti membran cenderung mencari aplikasi-aplikasi membrane baru, dan (c) insinyur proses cenderung memodelkan membran kromatografi. Aplikasi berdasarkan penelitian umumnya berkenaan dengan proses pengembangan untuk
Tabel 6. Membran kromatografi pertukaran ion (diadaptasi dari [1]) Type
Membrane
Target protein / s
Adsorber geometry
Cation exchange Anion exchange
Sartobind S (sulfonic acid type) DEA containing GMA–EDMA copolymer
Radial flow Flat sheet
Cation exchange Cation exchange Cation exchange Cation / anion Anion exchange Cation / anion Cation / anion Cation / anion Cation / anion Cation exchange Cation exchange Anion exchange
Sartobind S (sulfonic acid type) SP polyethylene Sartobind S (sulfonic acid type) Sartobind S and Sartobind Q DEAE MemSep 100 S, DEA and EA presenting membranes S, DEA and EA presenting membranes S and DEA presenting copolymer and cellulose membranes DEAE and SP Zetaprep 100 S-Poly(glycidyl methacrylate) CM MemSep 1010 DEAE MemSep 1000
Hemoglobin, lysozyme Myoglobin, conalbumin, ovalbumin and soyabean trypsin inhibitor Lysozyme, ovalbumin Lysozyme Mouse monoclonal antibody (IgG) Mouse monoclonal antibody (IgG) Ovalbumin and myoglobin BSA BSA Milk proteins
Radial flow Hollow fibre Flat sheet Flat sheet
Anion exchange Cation exchange
DEAE-polymer Sulfonic acid type membrane
Human albumin Lysozyme Immunotoxin, monoclonal antibody Amino terminal domain of formyltetrahydrofolate dehydrogenase BSA Lactoferrin and lactoperoxidase
9
Flat sheet Hollow fibre Flat sheet Flat sheet Flat sheet Hollow fibre Hollow fibre Flat sheet
Hollow fibre Flat sheet
Tabel 7. Membran kromatografi fase terbalik dan interaksi hidrofobik Membrane / ligand
Target protein / s
Styrene–divinylbenzene Phenyl grafted polyethylene Dodecyl methacrylate containing GMA–EDMA Quick Disk C4 Dodecyl methacrylate containing GMA–EDMA Hydrophilised poly(vinylidene difluoride) Decanol supporting poly(vinylidene difluoride) membrane Modified polyethylene
Ovalbumin, human serum albumin BSA Myoglobin, ribonuclease A, lysozyme and chymotrypsinogen A Human tumour necrosis factor Myoglobin, ribonuclease A, lysozyme and chymotrypsinogen A Mouse monoclonal antibody (IgG) Humanised monoclonal antibody (IgG) BSA
Upaya telah dilakukan untuk mewakili aplikasi potensi kromatografi membran untuk pemurnian protein. Hal ini didasarkan pada literatur yang berhubungan dengan pemisahan campuran protein nyata atau campuran simulasi protein alami. Antibodi serum merupakan satu segmen aplikasi terbesar. Enzim, antibodi monoklonal dan serum albumin mengikuti urutan itu. Namun, harus dicatat bahwa kategori enzim terdiri dari entitas molekul berbeda.
Adsorber geometry Flat sheet Hollow fibre Flat sheet Flat sheet Flat sheet Flat sheet Flat sheet Hollow fibre
umumnya lebih rendah. Oleh karena itu membrane kromatografi mungkin lebih cocok untuk proses pemurnian di mana volume besar cairan yang mengandung konsentrasi rendah protein target untuk diproses. Ketika protein target adalah konstituen utama dalam pakan, penggunaan kromatografi membran kemungkinan akan sebagian besar terbatas pada penghapusan sejumlah kecil pengotor tertentu [22].
Analisis kritis dari ulasan literatur tampaknya menunjukkan kesesuaian kromatografi membran untuk pemurnian protein yang bukan merupakan komponen utama dari campurannya yang terjadi secara alami. Misalnya, antibodi terjadi pada konsentrasi yang jauh lebih rendah daripada albumin dalam serum atau plasma. Demikian pula, konsentrasi antibodi monoklonal dalam supernatan kultur sel umumnya jauh lebih rendah dari protein kontaminasi utama, yaitu BSA. Ini menunjuk pada dua hal: pertama, kesesuaian membran penyerap untuk pengolahan volume besar cairan, dan, kedua, kapasitas pengikatan protein
4.
Kesimpulan
Membran kromatografi jelas memiliki keuntungan lebih dari kromatografi unggun padat. Namun, ada tantangan besar yang harus diatasi jika semua keuntungan ini harus dikapitalisasi. Dominasi transportasi zat terlarut konvektif adalah alasan utama untuk keuntungan dari membran kromatografi. Para peneliti telah menyoroti kompleksitas fenomena transportasi di membran berpori. Namun, jauh lebih kompleks bila dibandingkan dengan unggun padat. Oleh karena itu, peningkatan (scaleup) diharapkan menimbulkan lebih sedikit tantangan. Pemisahan berdasarkan afinitas dan pertukaran ion biasanya digunakan untuk kromatografi membran protein. Secara
10
signifikan lebih sedikit pekerjaan telah dilakukan pada pemisahan berdasarkan interaksi fase terbalik dan hidrofobik. antibodi serum merupakan segmen terbesar aplikasi. jenis protein utama lainnya dipisahkan termasuk enzim, antibodi monoklonal dan serum albumin. Pekerjaan di masa depan pada kromatografi membran kemungkinan akan terkonsentrasi di bidang-bidang yaitu pada perbaikan proses dan desain peralatan, pengembangan membrane baru, penyaringan sifat pengikat membran yang ada, dan sistem seleksi yang tepat. Pekerjaan pada bidang perbaikan proses dan desain peralatan kemungkinan akan difokuskan di sekitar pemecahan masalah distribusi aliran inlet. Yuan et al. [23] dan Lightfoot et al. [24] telah membahas pendekatan baru untuk menyelidiki dan memecahkan masalah-masalah ini. Membran baru yang telah diperbaiki sifat pengikatan dan operasionalnya perlu dikembangkan. Banyak perkembangan ini kemungkinan akan ditargetkan pada aplikasi tertentu karena sekarang kelayakan menggunakan kromatografi membran untuk pemurnian protein telah dibuktikan.
Membran berpori mikro berbeda yang digunakan untuk jenis lain dari proses pemisahan bisa berpotensi berguna dalam kromatografi membran. Sifat mengikat membran yang berbeda perlu secara sistematis disaring. Daya tarik utama dari penyaringan membran tersedia secara komersial adalah bahwa membran telah dikembangkan untuk memiliki stabilitas termal dan kimia yang tinggi bersama dengan kekuatan mekanik dan daya tahan. Sifat ini juga diinginkan dalam kromatografi membran. Banyak dari membran yang baru dikembangkan kekurangan sifat ini dan menjadi tidak cocok untuk aplikasi nyata. Penerapan kromatografi membran untuk pemurnian protein cenderung di daerah relung yang sangat spesifik saja. Kromatografi membran mungkin lebih cocok untuk proses pemurnian di mana volume besar cairan yang mengandung konsentrasi rendah protein target harus diproses.
11
Daftar Pustaka References [1] I.G. Wenten, “Industri Membran dan Perkembangannya.” Teknik Kimia Institut Teknologi Bandung, 2015. [2] R. Gosh, Protein separation using membrane chromatography: opportunities and challenges. 952 (2002) 13-27. [3] N. Kubota, et. al, Comparison of two convection-aided protein adsorption methods using porous membranes and perfusion beads. Biotechnol. Prog. (1996) 12, 869. [4] S. Brandt, R. Goffe, S. Kessler, J. O’Connor, S. Zale, Membrane-based affinity technology for commercial scale purifications. Bio/Technology (1988) , 6, 779-782 [5] B. Champluvier, M.-R. Kula, Microfiltration membranes as pseudo-affinity adsorbents: modification and comparison with gel beads. J. Chromatogr.(1991), 539, 315-325. [6] K. Briefs, M.-R. Kula, Fast protein chromatography on analytical and experimental scale using modified microporous membranes. Chem. Eng. Sci. (1992), 47, 141-149. [7] B. Champluvier, M.-R. Kula, Dye-ligand membranes as selective adsorbents for rapid purification of enzymes: a case study. Biotechnol. Bioeng. 40 (1992) 33. [8] I.G. Wenten, Khoiruddin, A.N. Hakim, P.T.P. Aryanti, “Teori Perpindahan dalam Membran.” Teknik Kimia Institut Teknologi Bandung, 2012. [9] I.G. Wenten, P.T.P. Aryanti, “Ultrafiltrasi dan Aplikasinya.” Teknik Kimia Institut Teknologi Bandung, 2014. [10] T.B. Tennikova, F. Svec, High performance membrane chromatography: high efficient separation method for proteins in ion-exchange, hydrophobic interaction and reversedphase modes. J. Chromatogr. (1993), 646, 279-288. [11] E. Klein, Affinity membranes: a 10-year review. Journal of Membrane Science (2000), 179 (1–2) 1–27. [12] C. Charcosset, Purification of proteins by membrane chromatography. J. Chem. Technol. Biotechnol. (1998), 71, 95-110. [13] X. Zeng, E. Ruckenstein, Membrane Chromatography: Preparation and Applications to Protein Separation. Biotechnol. Prog. 15 (1999) 1003. [14] D. Josic, A. Strancar, Application of membranes and compact, porous units for the separation of biopolymers. Ind. Eng. Chem. Res. 38 (1999) 333. [15] S.Y. Suen, M.R. Etzel, A mathematical analysis of affinity membrane bioseparation. Chem. Eng. Sci. (1992), 47, 1355- 1364. [16] S.Y. Suen, M. Caracotsios, M.R. Etzel, Sorption kinetics and axial diffusion in binary solute affinity membrane bioseparations. Chem. Eng. Sci. (1993), 48, 1801-1812. [17] F.T. Sarfert, M.R. Etzel, Mass transfer limitations in protein separations using ion-exchange membranes. J. Chromatogr. (1997), 764, 3-20. [18] H. Yang, M. Bitzer, M.R. Etzel, Analysis of protein purification using ion-exchange membranes. Ind. Eng. Chem. Res. 38 (1999) 4044. [19] H.C. Liu, J.R. Fried, Breakthrough of lysozyme through an affinity membrane of celluloseCibacron Blue 3GA. AIChE J. (1994), 40, 40-49.
[20] A. Tejeda, J. Ortega, I. Magana, R. Guzman, Optimal design of affinity membrane chromatographic columns. J. Chromatogr. (1999), 830, 293-300 [21] D. Roper, E. Lightfoot, Separation of biomolecules using adsorptive membrane. J. Chromatogr. (1995), 702, 3-26. [22] R. van Reis, A. Zydney, Membrane separations in biotechnology. Curr. Opin. Biotechnol. 12 (2001) 208. [23] Q.S. Yuan, A. Rosenfeld, T.W. Root, D.J. Klingenberg, E.N. Lightfoot, Flow distribution in chromatographic columns. J. Chromatogr. A 831 (1999) 149. [24] E.N. Lightfoot, J.L. Coffman, F. Lode, Q.S. Yuan, T.W. Perkins, T.W. Root, Refining the description of protein chromatography. J. Chromatogr. A 760 (1997) 139. [25] I.G. Wenten, “Intensifikasi Proses Berbasis Membran.” Teknik Kimia Institut Teknologi Bandung, 2014.
13
