PEMBAHASAN UMUM Pengendalian hayati merupakan suatu teknik pengendalian populasi hama pengganggu tumbuhan, hewan ataupun vektor penyakit dengan memanfaatkan musuh alami yang ada di alam baik berupa parasit, predator ataupun organisme patogen. Teknik pengendalian ini hanya berfungsi untuk menekan perkembangan hama , mempunyai toksisitas yang sangat rendah terhadap manusia dan bersifat spesifik. Penggunaan teknik pengendalian hayati sudah lama dikenal sebelum manusia menggunakan teknik pengendalian dengan menggunakan pestisida berbahan kimia dan pada tiga dasawarsa terakhir ini sudah banyak ditinggalkan akibat semakin maraknya macam pestisida yang beredar. Dengan menggunakan musuh alami ini diharapkan tidak hanya menghilangkan salah satu mata rantai tetapi akan mampu menekan perkembangan dari siklus kehidupannya. Berdasarkan
penelitian
yang
telah
dilakukan
yaitu
mencari
mikroorganisme khususnya kapang yang dapat digunakan sebagai agen pengendali hayati maka melalui proses isolasi dan identifikasi terhadap kapang yang akan digunakan telah teridentifikasi beberapa kapang yang ditemukan dari berbagai larva nyamuk yang berasal dari daerah persawahan disekitar lingkar Kampus IPB desa Cikarawang, Bogor, Jawa Barat. Kapang yang teridentifikasi dari larva nyamuk Culex, Anopheles dan Aedes teridentifikasi sebagai kapang, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Penicillium sp., Verticillium sp., Mucor sp., Syncephalastrum sp., Gliocladium sp., Beauveria sp. dan L. giganteum. Dari isolat – isolat tersebut sudah dilakukan pengujian lebih lanjut dan digunakan sebagai produk komersial. Beberapa yang
sudah beredar seperti kapang
Verticillium sp. dan Beauveria sp., sedangkan kapang Aspergillus, Mucor,
59
Penicillium, Syncephalastrum dan Gliocladium merupakan kapang-kapang saprofit yang umum ditemukan pada material klinis, sebagai kontaminan laboratorium dan pada kondisi tertentu kapang ini akan menjadi patogen. Kapang Aspergillus dan Penicillium merupakan kapang kontaminan yang umum ditemukan pada bangkai serangga (Humber, 1998). L. giganteum merupakan kapang yang hidup di air tawar dalam hidupnya dapat bersifat saprofitik ataupun parasit ik. Keadaan
perkembangan vegetatif
ditemukan pada tanaman air, tanaman busuk ataupun serangga yang sudah mati. L. giganteum akan bersifat sebagai parasit pada larva nyamuk. Dalam penelitian ini kapang L. giganteum diisolasi dari larva nyamuk yang berasal dari daerah persawahan yang merupakan salah satu dari habitatnya. Dari hasil identifikasi baik secara makroskopis koloni yang tumbuh dan mikroskopis dengan melihat morfologinya. Secara makroskopis ditemukan adanya pertumbuhan dalam media lempengan agar yang mengandung pepton dan glukosa. Pertumbuhan koloni berwarna putih keabuan, berbentuk bulat dengan tekstur globrous dan topografi flat sedang tipe pertumbuhan sedang karena pertumbuhan terjadi setelah 7 hari masa inkubasi. Pada penelitian – penelitian yang dilakukan sebelumnya tidak pernah diungkap gambaran makroskopik dari koloni asal biakan agar, penelitian hanya menggambarkan morfologi secara mikroskopik dari zoospora ataupun oosporanya. Dalam penelitian ini gambaran makroskopik berdasar identifikasi kapang menurut Fisher dan Cook (1998) dengan melihat bentuk, warna, tekstur, topografi dan tipe pertumbuhan. Menurut Kerwin (2000) bahwa koloni kapang L. giganteum pada larva yang mati terinfeksi menunjukkan adanya sekumpulan
60
miselium yang berwarna putih keabuan diseluruh tubuhnya dan sifatnya sangat karakter istik. Secara mikroskopis gambaran morfologi dari kapang Lagenidium dalam penelitian ini adalah adanya hifa yang bersepta dengan terbentuknya sporangium yang berdinding jelas dan miselium yang berinti serta hifa yang bersepta. Tipe spora seksual dan aseksual baru terbentuk setelah dibiakkan didalam media yang khusus dengan morfologi zoospora yang bersifat motil, bentuk bulat dan oval. Oospora
berbentuk bulat dan berdinding jelas. Gambaran mikroskopis ini
menurut
Dwidjoseputro (1978), bahwa L. giganteum mempunyai miselium
soenositik dan hifa bersepta. Miselium menghasilkan sporangium yang berbentuk oval kadang berbentuk sperikal dan mempunyai vesikel. Lagenidium hifanya terbagi atas beberapa sel dan diantara sel selnya akan berubah menjadi gametangium dan sporangium dan bentuk spora bulat sampai oval. Protoplast dari sporangium ini yang akan membagi diri dan menjadi zoospora yang bersifat infektif. Menurut Laddie et al. (1987) dalam Melvin dan Jaronski (1987) bahwa morfologi secara mikroskopis dari Lagenid ium callinectes adalah holokarpik, senositik, berfilamen dan kadang menghasilkan sporangia serta zoospora. Dengan menggunakan pembesaran sampai 2000x ,terlihat adanya 2 flagela dikedua ujung polar zoospora yang berfungsi sebagai alat geraknya. L. giganteum seperti kapang entomopatogen lain dalam pertumbuhannya membutuhkan unsur trehalosa sebagai sumber karbon. Selain unsur trehalosa sumber karbon juga berasal dari gugus glukosa, mannosa, fruktosa, maltosa dan gliserol, selain sumber karbon juga dibutuhkan unsur aspartat, glutamat dan glutamin sebagai sumber nitrogen. Dalam penelitian ini untuk mempertahankan
61
kehidupan kapang digunakan media biakan yang didalamnya mengandung unsur – unsur tersebut baik yang berasal dari pepton, glukosa ataupun nutrisi yang berasal dari kuning telur dan whole milk . Kapang ini mempunyai enzim ekstrasel protease jika ditumbuhkan dalam media yang mengandung PYG yang berfungsi dalam proses pertumbuhan yang lebih cepat. Proses pemeliharaan kapang ini selain menggunakan media biakan sintetis juga dibutuhkan pemeliharaan secara biologis dengan membiakkan kedalam larva nyamuk, hal ini dilakukan untuk menjaga patogenesitas dari kapang tersebut. Dalam siklus hidupnya Lagenidium mempunyai 2 fase pertumbuhan yaitu secara aseksual (zoospora) dan seksual (oospora). Dalam penelitian ini zoospora dapat dihasilkan dengan membiakkan koloni kapang kedalam media cair yang mengandung unsur pepton, yeast ekstrak dan glukosa serta ditambah dengan suplemen minyak jagung. Untuk pembentukkan zoospora dibutuhkan adanya sterol yang berasal dari luar karena kapang tidak mampu mensintesa sterol sendiri, sehingga media biakan yang mengandung minyak seperti minyak kedelai, biji bunga matahari sangat efektif didalam menginduksi pembentukan zoospora melalui proses zoosporogenesis ( Sur et al. 2002). Selain itu Proses zoosporogenesis juga akan terpacu dengan cara mencuci koloni dan membiarkan koloni kapang hasil panenan direndam dalam aquades steril. Dalam penelitian ini komponen lain yang digunakan untuk menginduksi terjadinya zoosporogenesis digunakan air bebas ion. Menurut Kerwin et al. (1986) bahwa untuk memacu terjadinya zoosporogenesis digunakan aquades steril, sedangkan Domnas e t al. (1977) menggunakan air bebas ion sebagai pemacu zoosporogenesis. Peran pepton dan glukosa dalam perkembangan kapang L. giganteum besar, pada saat
62
perkembangan vegetatif unsur tersebut sangat dibutuhkan. Karena pada proses zoosporogenesis kedua unsur tersebut mempunyai sifat menekan maka peran dari sterol yang sangat diperlukan. Karena pentingnya sterol dalam zoosporogenesis ,sehingga minyak jagung yang digunakan sebagai salah satu komponen dalam penelitian ini berperan dalam menghasilkan zoospora. Jumlah zoospora yang dihasilkan dalam penelitian ini adalah 15 x 107 zoospora/ml. Kandungan sterol minyak jagung meliputi sitosterol beta dan gamma, stigmasterol dan kompesergosterol dan menurut Kerwin dan Washino (1983) bahwa sitosterol dan kompesergosterol sangat baik dalam memicu zoosporogenesis. Selain minyak jagung protein asal minyak nabati
lain seperti minyak biji bunga matahari,
minyak kedelai, minyak biji ganja, ataupun minyak menghasilkan zoospora. Penambahan
protein
zaitun juga mampu
tersebut juga akan memicu
produksi enzim protease sehingga proses penetrasi kedalam kutikula lebih mudah disamping aktifitas dari enzim lipase. Jumlah oospora asal isolat L. giganteum yang dihasilkan dalam penelitian ini dengan menggunakan metode Brey (1985) adalah 2,1 x 103 oospora permililiter, dengan menggunakan media tersebut dalam penelitian yang dilakukan oleh Brey (1985) oospora yang dihasilkan sebanyak 5,0 x 103 dan Kerwin dkk (1983) menggunakan medium padat yang berisi PYG dan ditambah suplemen kolesterol dan lesitin mampu menghasilkan oospora sejumlah 4,1x105 /10 cm diameter petri. Hasil pengujian efektifitas zoospora kapang L. giganteum setelah diujikan terhadap larva instar 2 nyamuk Ae. aegypti.
Pengujian efektifitas
masih
dilakukan dalam skala laboratorium. Dengan menggunakan analisa menurut
63
metode Reed dan Muench (1938) diperoleh nilai LD50 zoospora sebesar 2,35x106 zoospora/ml
dan pada konsentrasi 1,35x107 zoospora/ml mampu membunuh
larva nyamuk sampai 95%. Semakin tinggi konsentrasi zoospora maka prosentasi larva yang mati akan semakin tinggi Berdasarkan hasil pengamatan jumlah larva yang mati, ada beberapa kematian pada kelompok kontrol kemungkinan hal ini disebabkan oleh beberapa faktor individual dari larva
seperti daya tahan tubuh, kemampuan mencari
makanan serta stadium larva yang digunakan. Menurut Mian dan Mulla (1983) bahwa faktor ekologis, fisik dan biologis sangat berpengaruh terhadap kehidupan dari larva nyamuk. Apabila dibandingkan dengan perlakuan angka kematian pada larva kontrol diperoleh nilainya sangat kecil. Kematian pada perlakuan selain dipengaruhi oleh konsentrasi zoospora, dipengaruhi juga oleh individual zoospora serta larvanya sendiri. Semakin tua stadium larva maka semakin keras lapisan kutikula larva sehingga zoospora tidak mampu menembus lapisan tersebut, sehingga penetrasi sukar dilakukan. Dalam proses penyerangan terhadap larva nyamuk, zoospora sangat dipengaruhi oleh faktor mekanis ataupun faktor enzimatis. Menurut Zattau dan McInnis (1987) bahwa kemampuan menyerang kapang Leptolegnia chapmanii terhadap larva nyamuk instar 1 dan 2 lebih mudah dibanding dengan yang lebih tua, zoospora lebih mudah dalam mengkista dan melakukan germinasi pada kutikula. Secara mekanis kemampuan menginfeksi secara umum sangat dipengaruhi oleh umur larva, semakin muda umur larva maka kepekaan terhadap infeksi kapang akan semakin tinggi apabila dibanding dengan stadium yang lebih tua ataupun pupa (Federici, 1981; Lord dan Roberts, 1987). Faktor enzimatis sangat berpengaruh terhadap kemampuan zoospora dalam
64
melakukan penetrasi pada tubuh larva, yaitu atas keberadaan pengaruh aktifitas enzim proteolitik dan enzim lipolitik (Domnas et al. 1974). Menurut WHO (1985) bahwa pada seekor larva yang terinfeksi dapat ditemukan sekitar 178.640-250.000 zoospora dan tingkat kematian larva 100% diperoleh dengan pemberian antara 715.000 zoospora/100ml air L. giganteum isolat California. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa zoospora dari kapang L. giganteum mempunyai potensi yang baik dalam menekan perkembangan larva nyamuk Ae. aegypti walaupun dalam mematikan 100% harus menggunakan konsentrasi yang tinggi. Dalam penelitian ini untuk menentukan dosis efektifitas oospora dalam kemampuannya membunuh larva digunakan analisa seperti pada penentuan efektifitas zoospora yaitu menggunakan metode Reed dan Muench (1938). Konsentrasi yang digunakan pada percobaan ini menggunakan pengenceran oospora yang telah dihasilkan dan dilakukan pengenceran dari 0,1 sampai 1 ml setara dengan jumlah oospora per mililiter yaitu mulai dari 4,2 x 10 2 sampai 4,2x103 oospora per milliliter media. Pengamatan dimulai setelah hari ketiga karena oospora diharapkan baru mulai menginfeksi setelah hari ketiga. Hal ini disebabkan karena dalam siklus hidupnya oospora akan menyesuaikan diri terhadap lingkungannya terlebih dahulu, pada kondisi yang sudah cocok barulah oospora bergerminasi dan menghasilkan zoospora yang motil, berflagella dan bersifat infektif. Germinasi oospora ini sangat dipengaruhi oleh lingkungan ataupun nutrisi yang ada pada media biakan. Dari hasil pengamatan pada masing – masing konsentrasi dari 0,1ml ( 420 oospora/ml) sampai 1 ml (4200 oospora/ml ), kematian mulai terjadi pada hari kelima setelah pemaparan. Dalam penelitian ini bentuk pupa sering ditemukan karena akibat terlalu lamanya waktu yang
65
digunakan yaitu sampai 14 hari. Dari data yang dipe roleh pupa sering ditemukan setelah 12 hari. Konsentrasi efektif oospora dalam kemampuannya membunuh 50% (LD50) yang
dapat digunakan untuk mengendalikan larva nyamuk Ae.
aegypti dilaboratorium adalah sebesar 6,7 x 102 , dan semakin tinggi konsentrasi sema kin tinggi prosentase kematian dari larvanya, pada konsentrasi 1,94 x 103 oospora/ml mampu membunuh larva nyamuk sampai 95%. Tahapan mekanisme infeksi kapang L. giganteum sangat berkaitan dengan siklus hidupnya, khususnya siklus reproduksi aseksual yang merupakan stadium infektif dari kapang ini. Kematian akan terjadi pada saat pertumbuhan miselium vegetatif terhenti dan digantikan siklus reproduktifnya. Indikasi paling awal adalah adanya bagian kutikula seperti lubang bor yang merupakan tempat penetrasinya zoospora atas faktor enzimatik dan mekanik. Kadang bagian lubang ini ditemukan zona melanisasi. Didalam tubuh larva akan terjadi percabangan hifa dari mulai bagian kepala dan thorak sampai saluran hemocoel dan pertumbuhan terhenti dilanjutkan siklus repr oduksi baik seksual ataupun aseksual dan kematian larva akan terjadi. Proses oosporogenesis akan terjadi apabila dalam media biakannya selain mengandung sterol, dalam media biakan juga dibutuhkan fosfolipid, selain itu juga dibutuhkan unsur Ca maupun Mg. Untuk menghasilkan oospora optimum maka dalam penelitian ini dihasil jumlah oospora optimum ketika zoospora ditumbuhkan pada media yang mengandung kuning telur plus yaitu media kuning telur yang ditambah dengan minyak jagung 1%, setelah diinkubasi selama 10 hari. Menurut Brey (1985) sterol yang digunakan untuk memicu proses oosporogenesis dapat berasal dari kolesterol, 7 dihidrokolesterol, sitosterol,
66
desmosterol, fukosterol, stigmasterol, kolesterol asetat dan kolesterol palmitat. Dari sekian macam sterol ini, kolesterol merupakan sumber sterol yang paling efektif
untuk
oospora
disamping
kolesterol
lainnya.
Dalam
memicu
oosporogenesis selain sterol media pertumbuhan harus mengandung asam lemak tak jenuh. Selain itu zoospora harus berkontak langsung denga n medium tersebut sehingga dalam penelitian ini media biakan yang berisi zoospora harus dalam posisi digoyang dengan menggunakan shaker waterbath. Kandungan nutrisi yang ada pada kuning telur merupakan sumber nutrisi utama untuk pertumbuhan kapang L. giganteum yang meliputi lemak, karbohidrat, protein dan elemen organik yang meliputi sulfur, potassium, sodium, fosfor, kalsium, magnesium, cobalt, iodine, selenium dan besi (Sauci, 2004). kandungan kolesterol kuning telur kurang lebih 300 mg. Nutrisi yang terkandung dalam kuning telur ini selain berpengaruh pada pertumbuhan miselium juga akan berpengaruh pada saat proses zoosporogenesis. Unsur lain yang perlu ditambahkan dalam memicu proses oosporogenesis adalah unsur – unsur yang mempunyai kemampuan dalam menghasilkan sumber karbon dan sumber nitrogen, juga asam lemak tak jenuh, dan garam – garam mineral non toksik seperti unsur kalsium dan magnesium . Asam lemak tak jenuh dan asam lemah jenuh yang terkandung dalam kuning telur berfungsi sebagai sumber energi melalui sistem oksidasi. Media biakan yang digunakan bisa berupa media padat ataupun media cair. Dari ketiga macam media biakan yang digunakan untuk menghasilkan oospora dari hasil penghitungan statistika bahwa media kuning telur plus menunjukkan hasil yang paling baik apabila dibanding dengan dua media yang lain, hal ini kemungkinan disebabkan oleh kandungan
67
nutrisi yang lengkap dan memenuhi syarat yang berasal dari kuning telur dan minyak jagung. Unsur sterol, fosfolipid dan kalsium serta magnesium terkandung didalam kedua bahan tersebut. Menurut Nakane et al. (2001) media kuning telur merupakan media yang sangat kaya akan nutrisi baik sterol (kolesterol dan allyl sterol) ataupun kandungan lemak yang lebih baik dalam indikator proses zoosporogenesis. Lemak yang terkandung dalam kuning telur terdiri dari unsur trigliserid ataupun fosfolipid yang berupa unsur lesitin dan kolesterol. Menurut Brey (1985) bahwa kolesterol merupakan sumber sterol yang paling efektif untuk oospora disamping kolesterol lainnya. Kandungan nutrisi pada minyak jagung mencukupi dalam memicu produksi oospora dibanding dengan minyak lain dalam hal ini adalah cotton seed oil. Sesuai dengan hasil penelitian bahwa oospora yang dihasilkan pada media yang mengandung cotton seed dan cotton seed oil jumlah oospora yang dihasilkan berbeda nyata dengan media biakan yang ditambah dengan minyak jagung. Kandungan sterol pada minyak jagung berupa stigmasterol, beta sitosterol, gamma sitosterol (kompesterol), asam lemak jenuh dan asam lemak tak jenuh C16 dan C18. Dalam proses induksi dan maturasi stadium seksual dari kapang L. giganteum dipengaruhi juga oleh proses regulasi komplek dari kalsium. Pengaruhnya meliputi gangguan:
metabolisme, induksi anteridia, fusi
gametangia, meiosis, pembentukan dinding oospora dan maturasi oospora. Sehingga unsur kalsium ekstrasel dibutuhkan selama proses oosporogenesis yang secara sinergis bekerja bersama secara normal dengan unsur magnesium dalam memproduksi oospora.
68
Oospora dapat dihasilkan dan dapat bertahan lama dengan memberikan asam lemak dalam media pertumbuhannya khususnya unsur trigliserida. Jumlah oospora yang diproduksi dipengaruhi suhu, pH, nutrisi, salinitas, cahaya ataupun komponen organik. Dalam penelitian ini oospora yang dihasilkan belum mencapai jumlah yang maksimal, hal ini kemungkinan disebabkan oleh faktor sterol yang digunakan ataupun asam lemaknya. Menurut Elliot dalam Kerwin et al. (1986) bahwa dalam produksi oospora hasil akan optimum apabila jumlah sterol yang ditambahkan cukup besar yaitu 60 mg/lt dan diproduksi menggunakan fermentor. Tipe dan konsentrasi asam lemak yang digunakan juga berpengaruh dalam proses oosporogenesis. Asam lemak kemungkinan mempengaruhi proses fisiologi yang berkaitan dengan terjadinya oosporogenesis. Asam lemak tergabung dalam golongan fos folipid yang mungkin berpengaruh dalam aktivitas pengikatan antara membran sel dengan enzim adenil siklase yang diketahui terlibat dalam merangsang terjadinya proses oosporogenesis. Kandungan
fosfolipid juga
berpengaruh dalam fusi antara anteridia dan oogonia, menghambat terjadinya gametangia sehingga menyebabkan terjadinya kegagalan dalam pembentukkan oospora. Dari hasil penelitian ini kendala utama yang dihadapi nantinya adalah didalam memproduksi media dala m skala besar. Dalam penelitian ini media biakan yang digunakan masih dalam skala laboratorium dan jumlah yang digunakan juga masih dalam skala kecil. Apabila dibanding dengan media lain, media kuning telur plus ataupun media kuning telur (EWM) mempunyai peluang yang sama dalam hal menghasilkan sel vegetatif , sedangkan dalam memproduksi
69
oospora kuning telur plus merupakan metode alternatif yang dari segi ekonomis lebih murah serta efektif dalam memproduksi oospora (Tabel 6). Tabel 6. Harga perkiraan 3 macam media biakan per liter No
Media
Komposisi
Harga
Jumlah Rp/Lt
1
Media A
PYG*
Rp. 4.911,-
Cottonseed powder*
Rp.
Cotton seed oil*
Rp. 1.152,-
Mineral organik*
Rp. 1.000,-
Aquades steril
Rp. 2.000,-
371,-
Rp.9.434,2
Media B
Kuning telur
Rp 2.000,-
Aquades steril
Rp 2.000,Rp. 4.000,-
3
Media C
Kuning telur
Rp 2.000,-
Minyak jagung dll
Rp
Aquades steril
Rp 2.000,-
300,-
*produk impor
Rp. 4.300,-
Berdasarkan perhitungan perkiraan harga dari ketiga media biakan tersebut yang tertera pada tabel 6, antara media B dan media C tidak banyak menunjukkan perbedaan. Untuk membuat 1 liter media. Media biakan B membutuhkan biaya Rp. 4.000,- sedangkan media C Rp. 4.300,-, sedangkan media A mebutuhkan biaya sebesar Rp. 9.434,-. Dari biaya yang dikeluarkan media A merupakan media termahal dan oospora yang dihasilkan paling sedikit dibanding media B dan C. Sehingga berdasar Tabel 6 dapat dikatakan bahwa media C merupakan media termurah dan efektif dalam memproduksi oospora.
70
