Přehled základních biotechnologických výrob ve farmacii

Obsah přednášky 1) Dva základní strategické přístupy 2) Produkty klasických výrob 3) Enzymy, antibiotika, steroidy,ostatní 4) Biotransformace 5) Rekombinantní léčiva 6) Hormony, enzymy, cytokiny, protilátky 7) Neproteinové produkty

2

Přehled základních biotechnologických výrob ve farmacii       

Enzymy Polysacharidy Steroidy Antibiotika Antimykotika Vitamíny Alkaloidy

 Hormony  Aminokyseliny  Cytokininy

Dva přístupy  Produkty získané klasickými technikami mikrobiální biotechnologie  Produkty rekombinantních technologií

Nejčastější produkt = ENZYMY Využití enzymů ve farmacii  příprava léčiv - antibiotika, steroidy, aminokyseliny  léčiva - digestiva, léčba leukémie, rozpouštění krevních sraženin atd.  diagnostické účely

Kultivace mikroorganismů Submersním aerobním postupem » suroviny: zdroj uhlíku – sacharidy, polysacharidy » zdroj dusíku – anorganické soli, amoniak; » přirozené substráty – kukuřičné výluhy, rostlinné mouky, kvasničný extrakt » stopové prvky

Exoenzymy, endoenzymy

Produkty klasické biotechnologie mikroorganismů

Příklady enzymů Proteázy    

trypsin, chymotrypsin, pepsin, chymosin papain, ficin, bromelain bakteriální proteázy (Bacillus) proteázy produkované plísněmi (Aspergillus) Glukosidázy

 α-amylázy, β-amylázy  produkují bakterie (Bacillus) a plísně (Aspergillus)

Použití amyláz Medicína  usnadnění trávení škrobu při dyspepsii  omezení meteorismu před chirurgickým výkonem a v pooperačním období

Potravinářství  výroba piva, alkoholických nápojů, lihovin  zpracování škrobu na glukózové a maltózové sirupy a krystalickou glukózu  sirupy s vysokým obsahem fruktózy

Lipázy Katalyzují hydrolýzu triacylglycerolů

Původ  pankreas  pšeničné klíčky  Aspergillus niger, Rhizopus sp., kvasinky

Použití  součást digestiv  potravinářský průmysl – výroba sýrů

Penicilinacyláza Hydrolázy štěpící vazby jiné než C-N

Mechanismus  hydrolýza penicilinu na kyselinu 6-aminopenicilanovou

Původ  Escherichia coli, Neurospora crassa, Torula sp., Rhodotorulla sp.

Použití  výroba polosyntetických penicilinů

POLYSACHARIDY Dextran Původ

bakterie Leuconostoc mesenteroides

Použití

náhražka krevní plazmy

dextransacharáza n x sacharóza

(anhydroglukóza)n + n x fruktóza

ANTIBIOTIKA  Produkty buněk schopné v nízkých koncentracích inhibovat růst jiných buněk  Nejčastější producenti G+ bakterie rodu Streptomyces  Příprava nových ATB modifikací známého ATB, tzv. mutační syntéza Mutace MO produkující ATB + vhodný prekurzor

nové ATB

Penicilin Mikroorganismus Penicillium notatum – inhibice stafylokoků Fleming 1928 – izolace surového penicilinu Florey a Chain 1938 P. chrysogenum – vyšší množství, submerzní kultivace

Mechanismus účinku  baktericidní  inhibice syntézy buněčné stěny vazbou β-laktamu na enzymy vytvářející peptidoglykan

Penicilin G Penicilin G (benzylpenicilin)

jádro penicilinů

Postup výroby penicilinu 1)

Naočkování suspenze spor Penicillium chrysogenum do nutričně bohatého média

2)

Kultivace 1 týden při teplotě 24°C

3)

Převedení do inokulačního fermentoru

4)

Aerobní kultivace 1 až 2 dny  nárůst mycelia

5)

Naočkování inokula do produkčního fermentoru - kultivace 7 dní živiny

prekurzor

zdroj C - roztok glukózy, melasa zdroj N - kukuřičné výluhy kyselina fenyloctová

Růstová křivka – výroba penicilinu Nárůst mycelia

Akumulace penicilinu

primární metabolity

primární i sekundární metabolity

pH = 6 !

Izolace penicilinu 1) Odstranění mikrobiálních buněk pomocí rotační vakuové filtrace 2) Extrakce penicilinu do organického rozpouštědla 3) Re-extrakce do vodné fáze 4) Purifikace opakovanou extrakcí organické rozpouštědlo–voda

5) Přídavek draselných iontů  krystalická draselná sůl penicilinu G 6) Izolace filtrací nebo centrifugací

7) Výsledný produkt se usuší

Deriváty penicilínu G 6-aminopenicilanová kyselina = výchozí produkt kyselina 6-aminopenicilanová

penicilinacylasa z E. coli H N O

O

S

CH3 CH3

N COOH

CH3 CH3

S

H2N

O

+

OH

N

O

COOH

kyselina fenyloctová

penicilin G OMe

HOOC

O

OMe

S

N H O

N

methicilin

CH3 CH3

H2N

O S

N H O

COOH

S

N H O

N

CH3 CH3 COOH

ampicilin

O

N

CH3 CH3 COOH

karbenicilin

Další antibiotika I  Cefalosporiny - Cephalosporium acremonium

 Tetracykliny - Streptomyces  Aminoglykosidy (streptomycin) Streptomyces griceus  Makrolidy (erythromycin) - Streptomyces erythreus (Saccharopolyspora erythreus)  Linkosamidy (linkomycin) - Streptomyces lincolnensis

Další antibiotika II  Amfenikolová antibiotika (chloramfenikol) Streptomyces venezuelae  Polypeptidová a glykopeptidová - polymyxin B, Colistin, Bacitracin, Vancomycin - Bacillus  Ansamycinová (rifampin) - semisyntetické odvozené od rifamycinu B - Streptomyces mediterranei

Postup výroby streptomycinu 1)

Naočkování suspenze spor Streptomyces griseus do počátečního nutričně bohatého média, kultivace při 28°C

2)

Nastartování růstu kultury a nárůst mycelia

3)

Převedení do inokulačního fermentoru

4)

Naočkování inokula do produkčního fermentoru, dokonalá aerace, 10 dní, výtěžek 1g/litr

živiny

zdroj C - roztok glukózy, NaCl zdroj N - sojová mouka

Antimykotika  Griseofulvin – Penicillium  Nystatin – Streptomyces noursei  Amfotericin B – Streptomyces nodosus OH H 3C

HO

OH

O O CH 3

OH OH

OH

OH

OH

O H

H 3C H 3C HO

H 2N

O OH

O

COOH

STEROIDY  fyziologický účinek závisí na přesné poloze substituentů v základním skeletu  chemická syntéza je velmi náročná

Biotransformace steroidů 1)

Kultivace mikroorganismu - nárůst biomasy

2)

Přidání steroidu, následná biotransformace

3)

Izolace do organického rozpouštědla

4)

Purifikace chromatograficky a krystalizací

Příklady biotransformací I 11α-hydroxylace příprava 11-a-progesteronu Rhizopus nigricans, R. arrhizus, Aspergillus ochraceus

11β-hydroxylace příprava kortisolu Curvularia lunata, Cunninghamella blakesleeana

Příklady biotransformací II 16a-hydroxylace příprava 16a-hydroxy-9a-fluoroprednisolonu (triamcinolon) Streptomyces roseochromogenes

dehydrogenace mezi C1-C2 Bacillus lensus, Arthrobacter simplex výroba prednisonu, prednisolonu, triamcinolonu, 6-methylprednisolonu, dexamethasonu…

NÁMELOVÉ ALKALOIDY Zdroje Claviceps purpurea (pěstování na žitě) Claviceps paspali (submerzní kultivace)

Sklerocia paličkovice nachové na žitu

Výtrusnice na sklerociu

VITAMÍNY esenciální živočišné nutriční faktory Výroba

   

chemická syntéza izolace z přírodního materiálu mikrobiální biosyntéza biotransformace

Vitamíny vyráběné biotechnologicky

 riboflavin (B2)  kobalamin (B12)  kyselina askorbová (C)

 ergosterol (D2, D3)  provitamín A  provitamín D

AMINOKYSELINY  Chemická syntéza

 Izolace z přírodních zdrojů  Enzymové přeměny

- kultivace MO obsahujících příslušný enzym - separace buněk

- k buňkám se přidá substrát určený pro enzymovou přeměnu  Biosynteticky - kultivace mikroorganismu izolace AMK z kultury

Producenti aminokyselin Bakterie přirozeně se vyskytující - Corynebacterium - Brevibacterium - Micrococcus

Rekombinantní kmeny - Escherichia coli - Serratia marcescens

Rekombinantní léčiva

Typy rekombinantních léčiv  lídrem jsou USA (Food and Drug Administration)  desítky léčiv, všechny na bázi proteinů

 hormony

     

enzymy hematopoetické růstové a koagulační faktory cytokiny a interferony protilátky a jejich deriváty vakcíny další produkty

Rekombinantní hormony alterace sekvence aminokyselin

změny farmakokinetiky

rozdílné biologické účinky

širší léčebné postupy

Rekombinantní hormony byly první r. 1979 - Goeddel a kol. - produkce inzulínu a somatotropinu pomocí Escherichia coli r. 1982 - inzulín - první klinicky použitý rekombinantní hormon (USA)

r. 1985 - somatotropin

Příprava rekombinantních hormonů • Bakterie (Escherichia coli) • Kvasinky (Saccharomyces cerevisiae) • Savčí buňky

Analoga inzulínu Lispro (HUMALOG)  obrácené pořadí lysinu a prolinu v pozici B28 a B29  produkce v Escherichia coli  krátce působící inzulín

Aspart (NOVORAPID)  substituce prolinu kyselinou asparagovou v pozici B28  Saccharomyces cerevisiae  krátce působící inzulín

Další typy inzulínu Glargin (LANTUS)  adice 2 argininů k C-konci řetězce B a náhrada asparaginu glycinem na A21  Escherichia coli  prodloužený účinek

Detemir  odstranění threoninu na B30 a acylace (kys. myristová) lysinu na pozici B29  prodloužený účinek

Výhody oproti lidským krátkodobě působícím inzulínům  rychlejší a pravidelnější vstřebávání z podkoží  nejlépe napodobují prandiální sekreci  léčba nemocných od 3 let

 kratší biologický účinek – nižší riziko hypoglykémie

Další hormony vyráběné biotechnologicky  Glukagon (E. coli, S. cerevisiae)  Somatotropin (E. coli)

 Folitropin – FSH (ovariální buňky čínského křečka)

Glukagon Polypeptidový hormon (29 AMK) Účinky  glykogenolytické  hyperglykemizující  relaxace hladké svaloviny GIT

Příprava  Escherichia coli  Saccharomyces cerevisiae Indikace  hypoglykémie  radiologická vyšetření – inhibice pohybu GIT

Somatotropin Druhově specifický polypeptid (191 AMK) Účinky  stimulace růstu  zvyšuje proteosyntézu  snižuje proteokatabolismus

Indikace  poruchy růstu Příprava  Escherichia coli (od konce 80. let)

Folitropin folikulostimulační hormon (FSH) Dvě podjednotky – alfa (92 AMK), beta (111 AMK) Produkce  ovariální buňky čínského křečka Indikace  anovulační cykly  amenorea  poruchy spermatogeneze urofollitropin

Rekombinantní enzymy Příprava léčiv  antibiotika, steroidy, aminokyseliny Léčiva

 digestiva (rozpouštění krevních sraženin, léčba leukémie) Diagnostické účely

 Taq polymeráza

Hematopoetické a růstové faktory Epoetin α (165 AK, glykosylovaný) Účinky stimulace tvorby krevních buněk Příprava savčí buňky Indikace léčba anémie

Cytokiny a interferony Interleukin IL-2 Účinky imunomodulační účinky Příprava Escherichia coli

Indikace terapie nádorových onemocnění

Interferony α, β, γ

Protilátky  první příklad v roce 1989 – myší imunoglobulin IgG1 2. linie

1. linie

gen pro těžký řetězec γ

F1

gen pro lehký řetězec κ

oba řetězce v množství až 1,3% celkového proteinu v listech

Příklad úspěšné rostlinné protilátky  sekreční sIgA z Nicotiana tabacum  proti zánětu zubů Streptococcus mutans  rozpoznává adhesin I/II, kterým se S. mutans váže na povrch buněk – prevence kolonizace

4 výchozí transgenní linie, trojí křížení

Rekombinantní vakcíny Hepatitida B Obchodní název: Recombivax Produkuje: Saccharomyces cerevisiae Výrobce: Merck, i další výrobci

Lidský papillomavirus (6, 11, 16, 18) Obchodní název: Gardasil Produkuje: Saccharomyces cerevisiae Výrobce: Merck

První použitelný rostlinný produkt

Květen 2012 Obchodní název: Elelyso

Enzym: taligluceráza alfa Produkuje: GM kultura mrkve Výrobce: Protalix BioTherapeutics, Izrael Pfizer, USA

Schválen FDA pro léčbu Gaucherovy choroby 51

Neproteinové produkty

Fomivirsen Fomivirsen (Vitravene) Obchodní název: Vitravene Produkuje: umělá syntéza Výrobce: Isis Pharmaceuticals, Inc.

 antivirové léčivo určené k léčbě zánětu sítnice vyvolanému infekcí CMV u imunohandicapovaných pacientů (např. pacienti s AIDS), aplikuje se intravitreálně

Fomivirsen  licencován FDA v srpnu 1998  21mer  5´- gCg TTT gCT CTT CTT CTT gCg – 3´  nukleotidy spojené fosforothionátovou vazbou (rezistence k nukleázám)  blokuje translaci virové mRNA

Pegaptanib Pegaptanib (Macugen) Obchodní název: Macugen Produkuje: umělá syntéza Výrobce: EyeTech Pharmaceuticals (OSI Pharmaceuticals), Pfizer (mimo USA)  anti-angiogenetikum pro léčbu vlhké formy věkem podmíněné makulární degenerace (VPMD)  licencován v roce 2000, FDA schválen v roce 2004

Pegaptanib  pegylovaný anti-VEGF aptamer, ssDNA, která se specificky váže k VEGF 165 – protein, který hraje rozhodující úlohu v angiogeneze a zvyšuje permeabilitu krevních vlásečnic (tyto dva patologické procesy jsou zodpovědné za ztrátu zraku při VPMD)  aplikuje se intravitreálně

Podrobnosti najdete na stránkách Evropské lékové agentury www.emea.europa.eu

Budoucnost?  Transgenní rostliny  Transgenní organismy

 DNA vakcíny  Interferující RNAi

 Genová terapie  Problematika GMO

… nebo žhavá současnost?

Shrnutí aktuálních technik 1) Výroba a testování léčiv - bakterie a kvasinky

2) Produkce protilátek a šlechtění rostlin - buněčné a tkáňové kultury, hybridomy 3) Orgány pro transplantace - celé organismy 4) Šlechtění hospodářských zvířat, záchrana ohrožených druhů - celé organismy

5) Genové terapie (nedědičná změna genetického kódu člověka) – viry 6) Léčba dědičných chorob, řešení pro bezdětná manželství – klonování člověka

Shrnutí přednášky 1) Dva základní strategické přístupy 2) Produkty klasických výrob 3) Enzymy, antibiotika, steroidy,ostatní 4) Biotransformace 5) Rekombinantní léčiva 6) Hormony, enzymy, cytokiny, protilátky 7) Neproteinové produkty

59