Přehled přednášek Biotechnologie a technická mikrobiologie I. Čistírenská mikrobiologie Mikroorganismy: Viry a bakteriofágy Bakterie: Vločkotvorné Degradační a transformační Vláknité Biologické pěnění Biologické problémy při separaci kalu Houby Prvoci Eucarya Způsob mikroskopické kontroly kalů Metody zkoumání mikrobiálních procesů v čistírenství (i v jiných prostředích) Mikrobiální odstraňování dusíku Mikrobiální odstraňování fosforu Anaerobní procesy Předčišťování OV s obsahem toxických látek Výskyt parazitů v odpadních vodách a kalech
II. Ostatní environmentální biotechnologie Mikrobiální čištění odpadního vzduchu Bioremediace půd a podzemních vod Fytoremediace Kompostování Biosorpce, biomethylace Desinfekce pitné vody III. Mikrobiální rozklad nejvýznamnějších polutantů Mikrobiální rozložitelnost sloučenin - úvod Uhlovodíky alifatické Uhlovodíky aromatické Chlorované organické látky Plasty IV. Aplikace imobilizovaných buněk
Mikroorganismy aktivovaných kalů 1. VIRY Živočišné viry (rotaviry, enteroviry, viry hepatitidy A, HIV a.j.) Bakteriofágy 2. BAKTERIE - Dominantní skupina mikroorganismů v AK Vločkotvorné Degradační Transformační Vláknité
3. HOUBY 4. PRVOCI
5. EUCARYA
(Zoogloea + mnohé další) (rozklad organických látek na CO2 a vodu) (nitrifikační, denitrifikační, poly-P baktérie aj.)
Tvorba mikrovloček buňkami bakterií
Barveno krystalickou violetí, zvětšení 1000 x
Vločky aktivovaného kalu, zvětšení 100 x
BIOFLOKULACE – proces tvorby vloček Buňky mikroorganismů, nečistoty a nerozpuštěné částice jsou stmeleny hmotou nazývanou matrix Matrix je tvořena zejména - bakteriálními extracelulárními polymery - biopolymery uvolněnými po rozpadu buněk - polymery obsaženými v OV Soudržnost vloček je dána (dle různých teorií): - přitažlivými silami prostřednictvím různě nabitých složek - gelovací schopností bakteriálních alginátů - schopností bivalentních kationtů poutat dvě záporně nabité složky
Vločky rychle „vychytávají“ mikrobiální buňky z přitékající OV, rovněž mohou poutat ionty (těžkých) kovů. Mají význam při ochraně bakteriálních buněk vůči účinkům některých toxických látek.
Zoogloea
Význam vláken pro tvorbu vloček AK, zvětšení 200 x fázový kontrast
PRINCIP FÁZOVÉHO KONTRASTU
Objektiv
Fázová destička
Stolek s preparátem Čočka kondenzoru
Prstenčitá clona
Vláknité mikroorganismy AK 30 – 35 typů (mezinárodní klasifikace dle Eikelbooma)
Rozlišování na základě mikroskopických charakteristik: - délka a průměr vlákna, větvení, tvar vlákna, tvar buněk - viditelnost sept, pouzder a granulí - růst epifytických bakterií, pohyblivost - Gramovo a Neisserovo barvení Nadměrný výskyt vláken: - otvírání struktury vloček - přemosťování vloček
Vláknité bytnění kalu
Vláknité mikroorganismy AK - vláknité bytnění
Vláknité mikroorganismy AK - vláknité bytnění
Vláknité mikroorganismy AK Vlákna otevírající strukturu vloček: Microthrix parvicella, Nostocoida limicola Typ 0041, Typ 0675, Typ 0092, Typ 1701, Typ 1851
Vlákna přemosťující vločky: Sphaerotillus natans, Typ 0041, Typ 021N, Typ 1701 Haliscomenobacter hydrossis, Microthrix parvicella a.j.
Vláknité mikroorganismy AK vlákna otevírající strukturu vloček
Vláknité mikroorganismy AK vlákna přemosťující vločky
Nejvýznamnější vláknité mikroorganismy v ČR
Microthrix parvicella Nostocoida limicola I, II, III Typ 0041, Typ 0675 Typ 0092, Typ 0803 Haliscomenobacter hydrossis Typ 1851, Typ 021N Typ 0961, Typ 1863 Aktinomycéty – NALO, GALO, – PTLO Sphaerotillus natans Thiothrix
Microthrix parvicella
Vlákna 100 – 400 μm dlouhá Šířka 0,5 – 0,8 μm Septa nepozorovatelná (FK) Gram + Neisser granule +
Barvení dle Neissera, zvětšení 1000 x
Nostocoida limicola I
Vlákna 50 – 200 μm dlouhá
Šířka 0,6 – 0,8 μm Tvar vlákna stočený Septa obvykle nepozorovatelná FK Gram + (buňky kokovité) Neisser + Gramovo barvení, 1000 x
Nostocoida limicola II Vlákna 100 – 200 μm, šířka 1,0 – 1,4 μm Tvar vlákna stočený, buňky kulovité, oválné až diskoidní Gram variabilní (spíše -), Neisser variabilní (spíše +), septa často zřetelná FK
Barvení dle Neissera, zvětšení 1000 x
Fázový kontrast
Nostocoida limicola III Vlákna 200 – 300 μm, Šířka 1,6 – 2,0 μm Tvar vlákna stočený Buňky často kulovité, ale i oválné až diskoidní (septa dobře viditelná FK) Gram + Neisser +
Barvení dle Neissera 1200 x
Typ 0041, Typ 0675 (Typ 0041/0675) Mírně prohnutá vlákna, Typ 0041 delší (až 400 μm) a silnější (1,0 – 1,9 μm) Často epifytické nárosty Gram + nebo gramlabilní Neisser -
Fázový kontrast Gramovo barvení, 1000 x
Typ 0092 Vlákna 50 – 100 μm, šířka 0,6 – 1,0 μm, často vyčnívají z vloček Septa téměř nerozpoznatelná Gram – Neisser +
Preparáty dle Neissera, 1000 x
Haliscomenobacter hydrossis Jemná vlákna dlouhá do 100 μm, šířka jen 0,35 – 0,45 μm rovná nebo mírně zahnutá, vyčnívají z vloček Septa obvykle nepozorovatelná FK Gram Neisser -
Barvení dle Grama
1000 x
Typ 021N Přímé světlo, 800 x
Typ 021N Fázový kontrast 1000 x
Typ 0961 Vlákna přímá nebo prohnutá: 50 – 500 μm, šířka 0,8 – 1,5 μm Buňky obdélníkové, septa pozorovatelná fázovým kontrastem Gram Neisser -
Gramovo barvení 1000 x
Typ 1863 Vlákna do 150 μm, někdy stočená, šířka 0,8 – 1,5 μm, volně mezi vločkami Buňky oválné, dobře viditelné Gram - Neisser -
Gramovo barvení 1000 x
Aktinomycéty - NALO, GALO, PTLO Vlákna s pravým větvením, často mycélia nebo chomáčky Gram + Neisser – s granulemi často +
Fázový kontrast 200 x
Fázový kontrast 1000 x
Aktinomycéty - NALO, GALO, PTLO Vlákna s pravým větvením, často mycélia nebo chomáčky Gram + Neisser – s granulemi často +
Gramovo barvení, 1000 x
Gramovo barvení, 1400 x
Aktinomycéty - NALO, GALO, PTLO Vlákna s pravým větvením s ostřejším úhlem, často mycélia nebo chomáčky Gram + Neisser – s granulemi často +
Gram
1200 x
Sphaerotillus natans Vlákna s nepravým větvením, 100 – 1000 μm, rovné nebo mírně prohnuté Buňky tyčkovité se zaoblenými konci Gram - Neisser -
Fázový kontrast, 1000 x
Fázový kontrast, 200 x
Thiothrix Vlákna rovná nebo mírně prohnutá, buňky obdélníkové Septa snadno viditelná Přítomnost sirných granulí (FK), sirný test + Gram – ( + při velkém množství granulí), Neisser -
Potlačení vláknitých organismů
Nespecifické zákroky - desinfekce (chlór, peroxid vodíku, ozon) - instalace selektorů
Specifické zákroky - přídavek nutrientů, snížení koncentrace kalu - změna koncentrace kyslíku - změna stáří kalu (?), sběr flotující biomasy - výměna kalu, přídavek koagulantů
Skupiny morfotypů vláknitých mikroorganismů Mikroorganismy
Společné vlastnosti
Možnosti potlačení
Skupina I: Růst při nízké koncentraci rozp. O2 S. natans, Typ 1701, H. hydrossis
Využívají snadno rozložitelné substráty. Růst při různém stáří kalu.
Selektory s postupným tokem (AE, AN i ANOX). Zvýšení stáří kalu. Zvýšení koncentrace kyslíku nad 1,5 mg/l
Skupina II: Růst v aerobní mixotrofní zóně
Využívají snadno rozložitelné substráty (nižší org. kys.). Tvoří ze sulfidů sirné granule. Růst při deficitu nutrientů.
Selektory s postupným tokem (AE, AN i ANOX). Dodávka nutrientů. Omezení přísunu sulfidů a org. kyselin.
Využívají snadno rozložitelné substráty. Výskyt při středním až vysokém stářím kalu.
Selektory s postupným tokem (AE, AN i ANOX). Snížení stáří kalu.
Rozšířené v systémech s AE, ANOX i AN stupni. Výskyt při vysokém stáří kalu. Možný růst na hydrofobních substrátech.
Možnosti potlačení nejisté. Doporučení: - instalace zařízení pro sběr nerozpuštěných substrátů (tukolapače) - dodržení postupného toku v celém systému - různé stupně (AE, AN, ANOX) dobře definovat - dodržet koncentraci O2 nad 1,5 mg/l - dodržet nízkou koncentraci amonného dusíku (pod 1 mg N / l)
Thiothrix sp. Typ 021 N Skupina III: Růst v jiných aerobních zónách Typ 1851 Nostocoida limicola
Skupina III: Růst v AE, AN i ANOX zónách M. parvicella, Typ 0092, Typ 0041/0675
Zdroj: Martins et al.: Filamentous bulking sludge – a critical review. Water Research, 38, (2004), 793 - 817
PĚNĚNÍ AKTIVOVANÉHO KALU Nejčastější mikroorganismy působící tvorbu biologických pěn: Microthrix parvicella NALO (Nocardia amarae – like organisms) = GALO (Gordona amarae) PTLO (Pine Tree – like organisms), Skermania piniformis Aktinomycéty, rhodokoky Typ 1863 Nostocoida limicola
Separační problémy při čištění odpadních vod ● Vláknité bytnění ● Biologické pěny ● Dispersní růst ● Neusaditelné mikrovločky ● Viskósní bytnění ● Vzplývání kalu
Dispersní růst
Fázový kontrast 200 x
Neusaditelné mikrovločky
Přímé světlo 100 x
HOUBY
PRVOCI - PROTOZOA Základní skupiny: Bezbrví: Bičíkovci Měňavky Obrvení: Nálevníci Rournatky
Bičíkovci - Flagellata
Přímé světlo 100 x
Měňavky Améby
Fázový kontrast 200 x
Nálevníci – Ciliata, Infusoria Nálevníci plovoucí
Přímé světlo
100 x
Přímé světlo 200 x
Nálevníci – Ciliata, Infusoria Nálevníci lezoucí
Fázový kontrast 200 x
Přímé světlo 200 x
Nálevníci – Ciliata, Infusoria Nálevníci přisedlí – r. Vorticella
Nálevníci – Ciliata, Infusoria Nálevníci přisedlí – koloniální
Přímé světlo 100 x
Fázový kontrast 200 x
Rournatky – Suctoria
Význam nálevníků pro kvalitu odtoku Parametr odtoku BSK (mg/l) CHSK (mg/l) Org. dusík (mg/l) Zákal (A 620) Počet bakterií (CFU/ml)
Systém s nálevníky 7 – 24 134 – 142 7 – 10 0,23 – 0,34 103 – 104
Bez nálevníků 53 – 70 198 – 250 14 – 21 0,95 – 1,42 105
EUCARYA: Vířníci – Rotaria, Rotatoria
Přímé světlo 100 x
EUCARYA: Hlístice - Nematoda
EUCARYA: Máloštětinatci - Oligochaeta
EUCARYA: Želvušky - Tardigrada
EUCARYA: Rozsivky - Diatomae
ZÁKLADNÍ CÍLE MIKROSKOPICKÉ KONTROLY AK ● Charakterisace vloček kalu s ohledem na jejich separovatelnost
● Zjištění přítomnosti vláknitých mikroorganismů, jejich kvantifikace, případně identifikace dominantních typů
● Zhodnocení různorodosti a četnosti protozoálního oživení a výskytu mnohobuněčných organismů
● Posouzení možných příčin případné špatné separovatelnosti
● Posouzení výskytu PAO bakterií v systémech s biologickým odstraňováním fosforu (Neisserovo barvení)
MIKROSKOPICKÝ OBRAZ ATIVOVANÉHO KALU
● Omezená přítomnost vláknité populace (do stupně 4 – 5) ● Výskyt pevných, nejlépe sférických vloček střední velikosti ● Absence dispersního růstu, absence částic v tekutině ● Absence nebo nízká četnost plovoucích nálevníků a bičíkovců ● Přítomnost lezoucích a přisedlých nálevníků nad 103 / ml ● Nepřítomnost hlístic a oligochét
BIOLOGICKÉ ODSTRAŇOVÁNÍ DUSÍKU AMONIZACE
– proces uvolňování amoniaku a amonných solí při
rozkladu organických látek (amonizační bakterie)
NITRIFIKACE
– aerobní přeměna amoniaku a amonných solí na dusitany a dusičnany (nitrifikační bakterie)
DENITRIFIKACE – anaerobní redukce dusitanů a dusičnanů na plynné produkty: oxid dusný a dusík (denitrifikační bakterie: Paracoccus, Pseudomonas, Alcaligenes, Bacillus aj.)
ANAMMOX – anaerobní oxidace amoniaku: NH4+ + NO2- → N2 + 2 H2O
ANAMMOX Mikrobiální proces objevený a popsaný v 90-tých letech 20. století, v poloprovozním anaerobním bioreaktoru (publikováno Mulderem a kol.,1995). Obdobné mikroorganismy se vyskytují v mořích, řekách, sedimentech aj. Jde o unikátní skupinu bakterií z kmene Planctomycetes: Brocadia (B. anammoxidans)
Kuenenia Scalindua Jettenia Anammoxoglobus
ANAMMOX – bakterie: Jsou gramnegativní, anaerobní, relativně pomalu rostoucí, s řadou znaků odlišných od ostatních bakterií (buněčná stěna proteinová, cytoplasma rozdělena
na pariphoplasmu a riboplasmu, existence anamoxosomu, výskyt specifických lipidů, laderanů)
Jsou autotrofní, avšak s možností heterotrofního růstu. Dusitany jsou akceptorem elektronů (a jsou využívány i při fixaci
CO2).
Buňka ANAMMOX - baktérií DNA
Buněčná stěna Cytoplasmatická membrána
Anammoxosom Membrána anammoxosomu
Parifoplasma
Vnitřní membrána
Riboplasma
ANAMMOX – využití NH4+ + NO2- → N2 + 2 H2O Je využitelný pro čištění OV s vysokým amoniakálním znečištěním a nízkým organickým znečištěním. Výhody: velmi nízká produkce kalu, menší energetické nároky, jen N2 Nevýhoda: dlouhá doba k získání kalu s ANAMMOX bakteriemi (1. velkoobjemový reaktor v Rotterdamu: doba „náběhu“ 3,5 roku !)
Pro OV s vysokým amoniakálním znečištěním a s určitým organickým znečištěním je ANAMMOX vhodný v kombinaci s částečnou nitrifikací. (dvoukalový systém, tzv. SHARON – ANAMMOX proces) Princip: cca polovina amoniakálního dusíku je v prvním stupni převedena nitritací na dusitany, které pak slouží ve druhém stupni k anaerobní oxidaci amoniaku. Výhody: viz výše + menší prostorové nároky při výstavbě
ANAMMOX – využití NH4+ + NO2- → N2 + 2 H2O SHARON – ANAMMOX proces: Princip: cca polovina amoniakálního dusíku je v prvním stupni převedena nitritací na dusitany, které pak slouží ve druhém stupni k anaerobní oxidaci amoniaku. Nevýhoda: nutnost precizní regulace 1. stupně pro zabezpečení vzniku dusitanů (tj. nitritace).
Zajištění průběhu nitritace: - teplota nad 15°C - koncentrace kyslíku max. 1 mg/l !!! - pH kolem 8 - stáří kalu nižší než v nitrifikačních stupních ČOV Dodržení uvedených parametrů umožňuje vypěstovat kal s obsahem nitritačních bakterií 60 – 70% (zjištěno pomocí FISH).
ANAMMOX – využití NH4+ + NO2- → N2 + 2 H2O CANON proces: Je principiálně identický s procesem SHARON – ANAMMOX, avšak je provozován jako jednokalový systém. AOB se vyskytují na povrchu vloček (nebo v povrchových částech biofilmu) a ANAMMOX – bakterie ve vnitřních částech. Klíčové je dodržení zejména kyslíkového režimu a vstupní koncentrace amoniaku.
ANAMMOX – využití NH4+ + NO2- → N2 + 2 H2O DEAMOX proces: Jde o 2-kalový systém: 1. stupeň (jen polovina objemu OV): klasická nitrifikace 2. stupeň (+ druhá polovina OV): kombinace denitrifikace s ANAMMOXem Výhoda: po technické stránce jednodušší než SHARON – ANAMMOX
Mikrobiální odstraňování fosforu EBPR (Enhanced Biological Phosphorus Removal)
Poly–P baktérie (PAO): aerobní druhy, schopné za určitých podmínek zvýšené akumulace polyfosfátů v buňkách EBPR systém může vést k odstranění 80 – 85 % fosforu a může zajistit výstupní koncentraci fosforu pod 0,1 mg / l. Ani Poly–P baktérie (PAO), ani složitost celého systému však nejsou ještě dokonale poznány !
Poly-P bakterie Neisserovo barvení, 1000 x
Mikrobiální odstraňování fosforu Poly–P baktérie (PAO): aerobní druhy, schopné za určitých podmínek zvýšené akumulace polyfosfátů v buňkách
Význam anaerobní zóny: * umožnit průběh kvasných procesů a tím tvorbu nižších mastných kyselin * krátkodobě znemožnit poly-P bakteriím aerobní respiraci * umožnit poly-P bakteriím tvorbu vnitrobuněčných zásob PHB Význam aerobní nebo denitrifikační zóny: * intenzívní množení poly-P bakterií při využití zásob PHB * akumulace fosforu ve formě polyfosfátů poly-P bakteriemi Význam recyklace kalu: * zajistit přítomnost poly-P bakterií v anaerobní zóně
Mikrobiální odstraňování fosforu OV
ANAEROBNÍ zóna
AEROBNÍ zóna bakterie schopné kvašení Poly-P bakterie (s PHB)
(denitrifikační zóna) ←P ←P ←P
←P ←P
←P ←P
Vratný kal
Přebytečný kal
Mikrobiální odstraňování fosforu Poly–P baktérie (PAO): Acinetobacter sp. (?), Rhodocyclus sp. (?) In situ hybridizace:
α – Proteobacteria - Proteobacteria γ – Proteobacteria Actinobacteria Cytophaga-Flavobacterium
ANAEROBNÍ ZÓNA 11% 24% 5% 24% 9%
AEROBNÍ ZÓNA 9% 26% 10% 19% 8%
V jiných ČOV však byly zjištěny jiné skupiny bakterií coby dominantní PAO organismy !!!
Mikrobiální odstraňování fosforu Poly–P baktérie (PAO): Rhodocyclus Accumulibacter ( - Proteobacteria) Dechloromonas Microlunatus phosphovorus (Actinobacteria) Tetrasphaera
Acinetobacter (γ – Proteobacteria)
Microlunatus phosphovorus: G+ koky, 65-66 mol% G+C, akumuluje fosfor až do množství 23% hmotnosti sušiny buněk
Mikrobiální odstraňování fosforu G bakterie (GAO): gramnegativní koky rostoucí v tetrádách ● konkurují poly-P bakteriím v anaerobní zóně ● neakumulují PHB, ale glykogen ● neakumulují polyfosfáty v aerobní zóně
● lze je mikroskopicky sledovat v preparátech dle Neissera ● mohou dominovat nad PAO při vyšším podílu sacharidických substrátů v surové OV ● nízký poměr P/CHSK v surové OV preferuje GAO vysoký poměr P/CHSK v surové OV preferuje PAO ● (teploty nad 30°C preferují GAO) ● pH 7,2 – 8,0 se jeví jako optimální pro preferenci PAO Competibacter Tetracoccus sp. (Proteobacteria) Amaricoccus sp. (Proteobacteria)
G bakterie (GAO) Neisserovo barvení, zvětšení 1000 x
Mikrobiální odstraňování fosforu Neúplné znalosti o PAO, GAO i celkově o systému EBPR jsou příčinou: - nižší výkonnosti EBPR na některých ČOV
Celý systém EBPR je založen na společenstvech bakterií (konsorciích) Žádná doposud isolovaná čistá kultura nesplňuje všechny vlastnosti PAO bakterií ! Další výzkum by měl zodpovědět tyto otázky: PAO = GAO ??? Jak jiné bakterie ovlivňují PAO a GAO ??? Je střídání AN/AE či AN/DEN opravdu nutné pro akumulaci fosforu ??? Jaké další skupiny bakterií či jaké další faktory ovlivňují PAO ??? Vztah PAO – GAO může být velmi složitý !
Anaerobní procesy s produkcí methanu Využití: ● stabilizace (vyhnívání) čistírenských kalů ● čištění OV z potravinářského nebo papírenského průmyslu ● čištění průmyslových OV s obsahem látek, aerobně obtížně rozložitelných ● zpracování pevných organických odpadů z živočišné a/nebo rostlinné výroby a potravinářství
Mikrobiální procesy při anaerobním rozkladu organické hmoty: 1. Hydrolysa vysokomolekulárních látek (bílkovin, PS, NK) a lipidů 2. Kvasné procesy přeměňující aminokyseliny, organické kyseliny, sacharidy a ostatní nízkomolekulární sloučeniny 3. Anaerobní oxidace vyšších mastných kyselin a alkoholů 4. Anaerobní oxidace nižších mastných kyselin (kromě octové) 5. Přeměna octanů na methan 6. Přeměna vodíku a CO2 na methan
VÝZNAM KVASNÝCH PROCESŮ – ANAEROBNÍ ROZKLAD ORGANICKÉ LÁTKY: BÍLKOVINY POLYSACHARIDY NUKLEOVÉ KYS. LIPIDY A.J.
Depolymerace makromolekul
Kyseliny propionová, mléčná, máselná, valerová, alkoholy
Methanol, methylaminy Kyselina mravenčí
peptidy, aminokyseliny oligo- a monosacharidy organické kyseliny glycerol, dusíkaté báze a další nízkomolekulární látky
CO2 + H2
Kyselina octová
Methanogenese – tvorba methanu
Skupiny anaerobních mikroorganismů v procesech s produkcí methanu ● Hydrolytické bakterie ● Kyselinotvorné bakterie ● Acidogenní ● Acetogenní ● kvasné bakterie produkující kys. octovou, vodík a CO2 (OHPA) ● homoacetogenní bakterie tvořící kys. octovou z vodíku a CO2 ● Methanogenní mikroorganismy (Archaea) ● Hydrogenotrofní druhy (tvoří methan z vodíku a CO2) ● Acetotrofní druhy (tvoří methan z octové kyseliny)
Syntrofní společenstva: OHPA + homoacetogenní bakterie OHPA + methanogenní Archaea
Výskyt parazitů v odpadních vodách a kalech Parazitičtí prvoci Cryptosporidium parvum, Giardia intestinalis, Entamoeba histolytica
Parazitičtí bezobratlí (Helminti) Nematoda (Hlístice): Ascaris lumbricoides – škrkavka dětská Enterobius vermicularis – roup dětský Trichuris trichiura – tenkohlavec bičíkový Cestoda (Tasemnice): Taenia solium – tasemnice dlouhočlenná Taenia saginata – tasemnice bezbranná Hymenolepis nana – tasemnice dětská Trematoda (Motolice) Schistozoma sp.
ASCARIS LUMBRICOIDES – ŠKRKAVKA DĚTSKÁ
Zralé vajíčko (rozměry 45-75 x 35-50 µm)
ENTEROBIUS VERMICULARIS – ROUP DĚTSKÝ
Ascaris lumbricoides škrkavka dětská
TASEMNICE DĚTSKÁ - HYMENOLEPIS NANA
(vajíčko, rozměry 30-50 x 40-60 µm)
TASEMNICE DLOUHOČLENNÁ - TAENIA SOLIUM
(rozměry 30-35 x 35-40 µm)
MIKROBIOLOGICKÁ KRITERIA PRO POUŽITÍ ČISTÍRENSKÝCH KALŮ NA ZEMĚDĚLSKÉ PŮDY Vyhláška MŽP č. 382 / 2001 Sb. I. Kategorie: - termotolerantní koliformní b.: < 103 KTJ / g sušiny - enterokoky: < 103 KTJ / g sušiny - Salmonella sp.: negativní / 50 g sušiny
II. Kategorie: - termotolerantní koliformní b.: 103 – 106 KTJ / g sušiny - enterokoky: 103 – 106 KTJ / g sušiny
MIKROBIÁLNÍ PŘEDČIŠŤOVÁNÍ TOXICKÝCH PRŮMYSLOVÝCH VOD Provádí se v případech výskytu toxických a/nebo špatně biologicky rozložitelných sloučenin v OV. Technické zařízení: mikrobiální kolony Příklad (ČR): Odpadní lázeň z chemické výroby: aceton 1 – 3 g/l acetonitril 100 – 200 mg/l kyanid draselný 50 – 100 mg/l Používaná kultura: Fusarium proliferatum + Rhodococcus equi
METODY ZKOUMÁNÍ MIKROBIÁLNÍCH PROCESŮ V ČISTÍRENSTVÍ KLASICKÉ IZOLAČNÍ TECHNIKY - na živných agarech MIKROMANIPULACE FISH – fluorescenční in situ hybridizace MAR – mikroautoradiografie EXTRAKCE DNA + GEL. ELEKTROFORÉZA (DGGE, TGGE) Kvantitativní PCR
FISH – fluorescenční in situ hybridizace
POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE - PCR
Každý cyklus zmnožení (amplifikace) zahrnuje:
● ● ●
záhřev na 94°C (rozvláknění DNA) snížení teploty na 50 - 60°C (vazba primerů) zvýšení teploty na 72°C (reakční teplota TAQ-polymerasy)
Lze zmnožit úsek o velikosti až dvou tisíc nukleotidů, a to i z jediné molekuly DNA. Během několika hodin lze pomocí thermocyklerů uskutečnit 20 – 40 cyklů, během nichž dojde ke 106 – 108 násobnému zmnožení úseku DNA
Interakce mikroorganismů s (těžkými) kovy 1. Interakce mikrobiálních metabolitů s kovy - produkce silných kyselin vede k rozpouštění minerálních látek (biometalurgie, průsaky z hald)
- produkce slabých kyselin vede k rozpouštění nebo komplexaci minerálních látek - produkce amoniaku vede k vysrážení těžkých kovů na hydroxidy - produkce sulfanu vede k vysrážení těžkých kovů na sulfidy - extracelulární polysacharidy bakterií vedou ke komplexaci (těžkých) kovů (vychytávání TK z vod kontaktorem)
2. Biomethylace - methylace Hg2+ : Hg2+ → → CH3Hg+ → → (CH3)2Hg (dimethylrtuť) - methylace Cd2+, Pb4+, As3+ a dalších kovů - dopad na pohyb těžkých kovů v prostředí - možnost mikrobiálního odstraňování methylovaných forem těžkých kovů
3. Biosorpce
Mikrobiální čištění odpadního vzduchu Použití: 1. Rozklad těkavých organických sloučenin, zejména rozpouštědel (lakovny, barvírny, chemické výroby apod.) 2. Transformace některých anorganických látek (chemické výroby) 3. Záchyt, rozklad a přeměna směsí zapáchajících látek (odstraňování pachů z rozkladných procesů, kafilerií, ČOV apod.) Nejpoužívanější mikroorganismy: Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Rhodococcus sp., Corynebacterium sp., Nocardia sp., Hyphomicrobium sp., Thiobacillus sp., Acidithiobacillus sp.
Bioremediace půd a podzemních vod ● Postupy (mikro)biologické dekontaminace půd a podzemních vod ● Převážně aerobní procesy ● Odstraňování ropných látek, fenolických sloučenin jen ojediněle pesticidů, PCB, chlorovaných rozpouštědel
Bioremediace
●
Stimulace přirozené mikroflory znečištěné lokality - zabezpečení vhodných fysiologických podmínek + přívodu kyslíku - přísun minerálních živin - přísun organických živin
●
Intenzifikace specifickými zásahy
- aplikace degradačních mikroorganismů - aplikace detergentů - využití kometabolického rozkladu
Bioremediace půd a podzemních vod
Lokalizace bioremediací: Bioremediace ex situ - půdní hromady - degradace v bioreaktorech
Bioremediace in situ - bioventing (půdy) - biostripping (podzemní vody) - technologie „pump and treat“
Kompostování Termofilní aerobní způsob zpracování pevných odpadních materiálů - rostlinných zbytků - organických odpadů z domácností, kuchyní, potravinářského průmyslu - odpadů z živočišné výroby
Charakteristickým jevem je vznik humusu coby konečného produktu Významné faktory při kompostování: - surovinová skladba (poměr C:N, množství fosforu) - dostatečné množství strukturního materiálu - vzdušnění (přístup kyslíku) - přítomnost mikroorganizmů - vhodná vlhkost
Desinfekce vody (zejména pitné)
Základní požadavky na desinfekční prostředky: Desinfekční účinek: činidlo musí usmrcovat či inaktivovat širokou škálu patogenních mikroorganismů Zacházení: snadná manipulace a aplikace, činidlo by mělo být bezpečné Kontrola: dostupné analytické metody ke stanovení koncentrací včetně zbytkových Zbytkový (residuální) účinek: činidlo by mělo v nízkých koncentracích přetrvávat ve vodovodním řádu Toxicita: činidlo by nemělo být toxické ani by nemělo produkovat toxické látky při aplikaci
Desinfekce vody (zejména pitné) Činidlo - způsob
Výhoda(y)
Nevýhoda(y)
Residuální úč.
Vedl. produkty
Chlor
několik
tvorba THM
ano
THM, radikály
Chloraminy
několik
dávkování
ano
--
Chlordioxid ClO2
bez THM
dávkování
ano
--
Ozon
účinnost
nestabilní
ne
peroxidy
Peroxidy, oxidanty
kombinace
složitost
ne
radikály kyslíku
Jód + jeho sloučeniny
nekorozivní
slabší účinek
částečně
--
lokálně
nutno kombin.
ano
--
--
reaktivace
ne
radikály kyslíku
Záhřev
účinek
malé objemy
ne
--
Filtrace
účinek
náročné
ne
--
Elektrochemie
účinek
lokální použití
ne
--
Fotokatalýza
účinek
komplikované
ne
--
Kovy UV záření
Mikrobiální rozklad sloučenin Základní pojmy: Xenobiotika Rekalcitrantní (persistentní) látky Degradace Biodegradace Biotransformace Dead-end produkt(y) Mineralizace Mikrobiální rozklad cizorodých látek 1. Využití organických látek jako zdrojů uhlíku a/nebo energie 2. Využití org. i anorg. látek jako zdrojů prvků (dusíku, síry) 3. Kometabolismus 4. Využití látek jako akceptorů elektronů při anaerobní respiraci 5. Náhodný rozklad bez jakéhokoliv zisku
Rozklad cizorodých látek směsnými mikrobiálními populacemi - potřeba růstových faktorů (vitaminů, aminokyselin, koenzymů) - odstraňování toxických meziproduktů - společné (případně sekvenční) působení enzymů
PŘÍKLADY REKALCITRANTNÍCH XENOBIOTIK
• • • •
DDT PCB TARTRAZIN ABS – alkyl benzen sulfonát
PŘÍKLADY XENOBIOTIK
DDT 1,1,1-trichlor-2,2-bis(p-chlorofenyl)ethan
PCB Tartrazin ABS Lineární alkyl benzen sulfonát
PŘÍKLADY XENOBIOTIK II O C
Et O
CH 2
CH
Bu-n
DEHP C O
O
CH 2
CH Et
Bu-n
PŘÍKLADY XENOBIOTIK III
Polyvinylalkohol a polyethylenglykoly
― CH2 ― CH ―
PVA
| OH n
H ― O ― CH2 ― CH2 ― OH n
PEG
Mikrobiální rozklad sloučenin Základní pojmy: Xenobiotika Rekalcitrantní (persistentní) látky Degradace Biodegradace Biotransformace Dead-end produkt(y) Mineralizace Mikrobiální rozklad cizorodých látek 1. Využití organických látek jako zdrojů uhlíku a energie 2. Využití org. i anorg. látek jako zdrojů prvků (dusíku, síry) 3. Kometabolismus 4. Využití látek jako akceptorů elektronů při anaerobní respiraci 5. Náhodný rozklad bez jakéhokoliv zisku
Rozklad cizorodých látek směsnými mikrobiálními populacemi - potřeba růstových faktorů (vitaminů, aminokyselin, koenzymů) - odstraňování toxických meziproduktů - společné (případně sekvenční) působení enzymů
KOMETABOLICKÝ ROZKLAD POLUTANTŮ ● Podléhají mu jen některé látky (TCE, DCE, PCB, chloroform, dichlormethan,
vinylchlorid, některé PAH, MTBE, aj., včetně některých polymerních látek)
● Je založen na účinku inducibilních bakteriálních enzymů (většinou oxygenas)
● Tvorba enzymů v buňkách musí být vyvolána induktorem ● K degradaci polutantů dochází díky širší substrátové specificitě mnohých oxygenas ● Rychlost rozkladu polutantu je obvykle nejvyšší po spotřebování induktoru buňkami (dáno afinitou enzymů)
● U přirozených bakteriálních kultur je schopnost kometabolického rozkladu relativně krátkodobá, často ji však lze obnovit
● Konečné produkty kometabolického rozkladu musí být experimentálně zjištěny případ od případu
BAKTERIÁLNÍ OXYGENASY alkan-monooxygenasa + O2
R-CH2-CH2-CH3
R-CH2-CH2-CH2OH NADPH + H+
NADP+ + H2O
BAKTERIÁLNÍ OXYGENASY – toluen dioxygenasa
TVORBA ATP - ANAEROBNÍ RESPIRACE
+ +
ATP-synthasa
+ +
++ 2H+ + 2e+ NO3¯
- - - H2O NO2¯
FAD
- -
ATP
Periplasmatický prostor
FADH2
NAD
ADP+ Pi
Buněčná stěna
NADH2
Cytoplasmatická membrána
Vnitřní část buňky
DUSIČNANY,DUSITANY,SÍRANY
CHLOROVANÉ SLOUČENINY
ORGANICKÉ LÁTKY, H2
TESTOVÁNÍ BIODEGRADABILITY SLOUČENIN A MATERIÁLŮ a) Směsnými kulturami - půdními - kalů (aerobních, anaerobních) - vod (říční, jezerní, mořské) - kompostů - sedimentů
b) Čistými či definovanými kulturami - bakteriálními, plísňovými, kvasničnými … - složenými
Faktory ovlivňující mikrobiální rozklad sloučenin 1. 2. 3. 4. 5.
Kontakt sloučeniny s enzymy Fyzikální stav, rozpustnost, adsorpce sloučeniny na jiné částice Náboj Toxicita a koncentrace Struktura organických molekul - snadno metabolizovatelné struktury: obsahující esterové, amidové a aminové vazby - obtížně metabolizovatelné struktury: obsahující kvarterní uhlík - nepřirozené či málo obvyklé struktury: uhlík – (poly)halogen, nitroskupina, diazoskupina, aromatické sulfokyseliny - stupeň větvení uhlíkatého řetězce - charakter substituentů, jejich počet a poloha 6. Faktory ovlivňující mikrobiální činnost (teplota, pH, prvky, růst. faktory) 7. Přítomnost nebo absence kyslíku 8. Charakter prostředí
2,4-D
Terminální oxidace alifatických uhlovodíků (Pseudomonas oleovorans) alkan-monooxygenasa + O2
R-CH2-CH2-CH3
R-CH2-CH2-CH2OH NADPH + H+
NADP+ + H2O NAD+ alkohol-dehydrogenasa NADH+H+
aldehyd-dehydrogenasa
R-CH2-CH2-COOH
R-CH2-CH2-CHO NADH+H+
NAD+ + H2O
Utilizace aromatických uhlovodíků benzaldehyd kys. mandlová anthracen fenanthren naftalen o-kresol kys. antranilová
toluen bifenyl
kys. benzoová kys. salicylová
benzen fenol OH
katechol OH ortho-štěpení katechol-1,2-dioxygenasa
kys. jantarová + acetyl-koA
O2
O2
meta-štěpení katechol-2,3-dioxygenasa
kys. mravenčí + kys. pyrohroznová + acetaldehyd
Bakteriální degradace chlorovaných sloučenin Degradace v aerobním prostředí 1. Využití chlorovaných látek jako zdrojů uhlíku a energie a) Hydrolytická dehalogenace Xanthobacter, Rhodococcus, Pseudomonas, Sphingomonas, Agrobacterium, Ralstonia, Nocardia, Mycobacterium aj., rozkládají:
kys. monochloroctovou, 4-chlorbenzoovou, mono- i dichlorpropionovou, 1,2-dichlorethan, vinylchlorid, lindan, chloralkany, degradační produkty rozkladu mono- a dichlorfenolů aj. Klíčové enzymy: různé typy dehalogenas (např. haloalkan dehalogenasa)
b) Thiolytická, dehydrohalogenační nebo reduktivní dehalogenace utilizují dichlormethan Sphingomonas paucimobilis: utilizuje lindan (dehydrohalogenasou a dehalogenasou) Azotobacter chroococcum: utilizuje 2,4-D, odštěpuje Cl reduktivní cestou Methylotrofní bakterie:
c) Oxidativní dehalogenace Rozklad zahajují oxygenasy. Haloalifatické i haloaromatické sloučeniny. Burkholderia sp.: utilizuje 1,2,4,5-tetrachlorobenzen Sphingomonas chlorphenolica, Mycobacterium chlorphenolicus: utilizují PCP (pomalu !) Mycobacterium sp.: utilizuje vinylchlorid (klíčovým enzymem je ethen-monooxygenasa)
2. Kometabolický rozklad – bez užitku nebo s pranepatrným ziskem TCE, PCB
Schéma rozkladu trichlorethylenu bakterií Ralstonia sp.
Cl
H
fenol-2-monooxygenasa
C = C Cl
Cl
kyslík, NADPH Cl
H
TCE-epoxid
C ─ C Cl
Cl O
Trichlorethylen (TCE)
Spontánní hydrolysa
Kyselina glyoxylová
Kyselina mravenčí
CO
Cl‾
Bakteriální degradace bifenylů (včetně chlorovaných) H OH Bifenyldioxygenasa kyslík
OH H
COOH Kyselina benzoová
H2C
CH ― CH
C ― COOH OH
Bakteriální degradace chlorovaných sloučenin Degradace v anaerobním prostředí 1. Využití chlorovaných látek jako zdrojů uhlíku a energie Acetobacterium dehalogenans: utilizuje chloromethan, dichloromethan
Dehalobacterium formicoaceticum: utilizuje dichloromethan
2. Využití chlorovaných látek k anaerobní respiraci (halorespirace) (PCB, trichlorfenoly, trichlorethan, tetrachlormethan, tetrachlorethylen, hexachlorcyklohexan, hexachlorbenzen, 1,2-dichlorpropan, chloroaniliny, chlorofenoly, pesticidy picloram a bromacil, některé PCDD, PCDF…) Dehalococcoides ethenogenes: redukuje PCE až na ethen ! Dehalobacter sp.: redukuje PCE na cis-DCE
3. Kometabolický rozklad při jiných AN respiracích Řada anaerobních bakterií redukuje haloalkany (např. CCl4, PCE na TCE) bez užitku, během jiných AN respirací. Tento proces je však velmi pomalý.
4. Neenzymová dechlorace Tetrachlormethan může být redukován na chloroform, dichlormethan, monochlormethan a methan za katalýzy hemem nebo deriváty kobalaminu.
Degradace (poly)chlorovaných sloučenin v anaerobním prostředí - halorespirace Cl
Cl
NADH2
NAD
Cl
C═C
Cl
H C═C
Cl
Cl
HCl
Cl TCE
PCE
+
NADH2
NAD
H HCl
+
H
NAD
NADH2
H
C═C H
H +
C═C Cl
Cl
Cl DCE
HCl
Faktory ovlivňující mikrobiální rozklad polymerů ● Struktura polymeru: - přítomnost hydrolyzovatelných skupin - přítomnost heteroatomu(ů) - větvení řetězce
● Molekulová hmotnost ● Krystalinita a morfologie, hydrofobita
● Prostředí
Biologicky téměř nedegradabilní plasty polyethylen, polypropylen polystyren polyvinylchlorid polyethylen tereftalát
Biodegradabilní plasty polyhydroxyalkanoáty (PHAs) poly-ε-kaprolakton (PCL) polymléčná kyselina (PLLA) kopolymerní estery s tzv. BTA-strukturou polyvinylalkohol (PVA)
Bakteriální polyestery R O | || ― CH ― (CH2) ― C ― O ―
poly--hydroxyalkanoáty (PHAs) n
CH3 O | || ― CH ― (CH2) ― C ― O ―
poly--hydroxybutyrát (PHB) n
Bakteriální polyestery
poly--hydroxybutyrát-co-poly--hydroxyvalerát
PHB-co-PHV (BIOPOL)
Syntetické alifatické polyestery I O || ― CH2 ― CH2 ― CH2 ― CH2 ― CH2 ― C ― O ―
poly--kaprolakton (PCL)
n
CH3 CH HO
O || C
O C || O
CH CH3
CH3 CH O
n
OH C || O
kys. polymléčná (PL) (PLLA)
Syntetické alifatické polyestery II Kondenzáty diolů s organickými dikarboxylovými org. kyselinami:
― O ― (CH2)4 ― O ― C ― (CH2)4 ― C ― || || O O n
Kopolymery alifatických a aromatických esterů: BTA-struktura (butandiol, tereftalová kyselina, adipová kyselina)
Aromatické polyestery
— C
O
C — O — CH2 — CH2 — O — O
n PET
Polyvinylalkohol a polyethylenglykoly
― CH2 ― CH ―
PVA
| OH n
H ― O ― CH2 ― CH2 ― OH n
PEG
UPŘESNĚNÍ BIOLOGICKY NEDEGRADABILNÍ PLASTY - v běžných podmínkách vnějšího prostředí jsou rozkládány během stovek až tisíců let - tyto polymery však mohou být za určitých, velmi specifických podmínek mikrobiálně degradovány výrazně rychleji (NAPŘ. V LABORATOŘÍCH)
BIODEGRADABILNÍ PLASTY Jsou polymery mikrobiálně rozložitelné za všech běžných podmínek vnějšího prostředí (např. bakteriální polyestery, zvl. BIOPOL) Pokud toto nesplňují, neměly by být jako biodegradabilní označovány nebo by měly být označeny za biodegradabilní jen v konkrétním typu prostředí (např. v kompostech)
