MIKROBIOLOGIE POTRAVIN A KOSMETIKY

PROJEKT OPERAČNÍHO PROGRAMU VZDĚLÁVÁNÍ PRO KONKURENCESCHOPNOST

ZVYŠOVÁNÍ EXKLUZIVITY VÝUKY TECHNOLOGIE TUKŮ, KOSMETIKY A DETERGENTŮ REGISTRAČNÍ ČÍSLO CZ.1.07/2.2.00/28.0132

MIKROBIOLOGIE POTRAVIN A KOSMETIKY doc. RNDr. LEONA BUŇKOVÁ Ph.D.

VÝVOJ TOHOTO UČEBNÍHO TEXTU JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY

O projektu

Učební text byl vyvinut v rámci projektu Operačního programu Vzdělávání pro konkurenceschopnost „Modernizace výuky nově zřízeného Ateliéru designu skla“, registrační číslo CZ.1.07/2.2.00/15.0451, jehož příjemcem je Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně. Cílem projektu je vytvoření inovativní podpory vzdělávání s multimediálními prvky, zaměřené na nové postupy a poznatky v oblasti mikrobiologie potravin a kosmetických přípravků. Realizace projektu vytvoří podmínky pro rozvoj studijního oboru Technologie výroby tuků, kosmetiky a detergentů v rámci bakalářského studia a oboru Technologie a ekonomika výroby tuků, detergentů a kosmetiky v rámci magisterského studia studijního programu Chemie a technologie potravin na Fakultě technologické UTB ve Zlíně. Projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

Cílová skupina

Projekt je zaměřen na vysokoškolské studenty akreditovaných studijních oborů Technologie výroby tuků, kosmetiky a detergentů a Technologie a ekonomika výroby tuků, detergentů a kosmetiky Fakulty technologické. Výstupy projektu ovlivní studenty zmíněných oborů v bakalářském i navazujícím magisterském studiu v prezenční i kombinované formě.

Obsah

1

Identifikace bakterií ................................................................................................................................... 8 1.1

Identifikace bakterií ........................................................................................................................... 8

1.2

Morfologie bakterií při identifikaci ................................................................................................... 9

1.2.1

Selekce kultur ............................................................................................................................ 9

1.2.2

Selektivní živné půdy ................................................................................................................ 9

1.2.3

Diagnostické živné půdy ......................................................................................................... 10

1.3

Biochemická identifikace bakterií ................................................................................................... 10

1.4

Genetická identifikace bakterií metodami PCR .............................................................................. 11

1.4.1 1.5

2

Modifikace PCR ...................................................................................................................... 12

Další metody genetické identifikace bakterií .................................................................................. 14

1.5.1

Metoda PFGE .......................................................................................................................... 14

1.5.2

Ribotypizace ............................................................................................................................ 14

1.6

Identifikace bakterií hmotnostní spektrometrií ................................................................................ 15

1.7

Metody zjišťování počtu mikroorganizmů v potravinách ............................................................... 15

1.7.1

Kvantitativní testy.................................................................................................................... 16

1.7.2

Kvalitativní testy...................................................................................................................... 17

Taxonomie bakterií .................................................................................................................................. 19 2.1

Základní pojmy taxonomie bakterií ................................................................................................. 19

2.2

Taxonomické jednotky a jejich hierarchie ....................................................................................... 21

Označení taxonomických jednotek .......................................................................................................... 21

3

4

2.3

Numerická taxonomie...................................................................................................................... 21

2.4

Chemotaxonomie (chemosystematika) ............................................................................................ 22

2.5

Nomenklatura .................................................................................................................................. 23

Startérové kultury .................................................................................................................................... 25 3.1

Startérové kultury ............................................................................................................................ 25

3.2

Přirozené fermentační procesy v syrových potravinách .................................................................. 25

3.3

Role startérových kultur a jejich vlastnosti ..................................................................................... 26

3.3.1

Bakteriální startérové kultury .................................................................................................. 27

3.3.2

Startérové kultury plísní .......................................................................................................... 27

3.3.3

Kvasinkové startérové kultury ................................................................................................. 28

3.3.4

Smíšené nebo neidentifikované startérové kultury .................................................................. 29

3.3.5

Definované startérové kultury ................................................................................................. 29

3.3.6

Použití startérových kultur....................................................................................................... 30

Bakterie mléčného kvašení ...................................................................................................................... 31 Strana 3 / 136 Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky

4.1

Bakterie mléčného kvašení .............................................................................................................. 31

4.2

Taxonomie bakterií mléčného kvašení ............................................................................................ 32

4.3

Metabolizmus mléčných bakterií..................................................................................................... 34

4.3.1

Homofermentativní kvašení..................................................................................................... 34

4.3.2

Heterofermentativní kvašení.................................................................................................... 35

4.3.3

Metabolické kategorie BMK ................................................................................................... 36

4.3.4

Konverze pyruvátu uskutečňované bakteriemi mléčného kvašení .......................................... 37

4.3.5

Metabolizmus dusíku uskutečňovaný bakteriemi mléčného kvašení ...................................... 38

4.4

5

6

Další metabolická aktivita BMK ..................................................................................................... 38

4.4.1

Metabolizmus citrátu ............................................................................................................... 38

4.4.2

Malolaktická fermentace ......................................................................................................... 39

4.4.3

Metabolizmus lipidů ................................................................................................................ 39

4.5

Antimikrobiální aktivita bakterií mléčného kvašení........................................................................ 39

4.6

Přínos bakterií mléčného kvašení pro zdraví člověka ..................................................................... 41

Charakterizace významných zástupců bakterií mléčného kvašení .......................................................... 43 5.1

Úvod do problematiky potravinářsky významných bakterií mléčného kvašení .............................. 43

5.2

Rod Lactobacillus ............................................................................................................................ 43

5.3

Rod Lactococcus ............................................................................................................................. 45

5.4

Rod Streptococcus ........................................................................................................................... 46

5.5

Rod Enterococcus ............................................................................................................................ 46

5.6

Rody Leuconostoc a Oenococcus .................................................................................................... 47

5.7

Rody Pediococcus a Tetragenococcus ............................................................................................ 48

5.8

Rody Bifidobacterium a Carnobacterium ....................................................................................... 48

5.9

Ostatní důležité grampozitivní bakterie v potravinách .................................................................... 49

Využití probiotik ve výživě lidí ............................................................................................................... 52 6.1

Úvod do problematiky probiotik ..................................................................................................... 52

6.2

Střevní mikroflóra ........................................................................................................................... 52

6.2.1

7

Variabilita střevní mikroflóry .................................................................................................. 53

6.3

Kritéria volby probiotické mikroflóry ............................................................................................. 54

6.4

Funkce probiotik .............................................................................................................................. 54

6.5

Volba probiotik a jejich aplikace v potravinách .............................................................................. 55

6.6

Bifidobacterium jako typicky probiotická kultura ........................................................................... 57

Struktura, fyziologie a ekologie biofilmů ................................................................................................ 60 7.1

Úvod do problematiky biofilmů ...................................................................................................... 60

7.2

Biofilmové versus suspendované buňky – důvod vzniku biofilmů ................................................. 61

7.3

Vznik a vývoj biofilmu .................................................................................................................... 62

7.3.1

Kolonizační chování bakterií na povrchu ................................................................................ 65 Strana 4 / 136 Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky

7.3.2

Růst a diferenciace biofilmu - Transkripce genů a fenotypové změny ................................... 65

7.3.3

Růst a diferenciace biofilmu - Horizontální přenos genů v biofilmu ...................................... 66

7.3.4

Dynamika tvorby biofilmu a jeho maturace ............................................................................ 67

7.4

Extracelulární polymerní matrice .................................................................................................... 68

7.4.1

Specifické polysacharidy ......................................................................................................... 69

7.4.2

Nespecifické polysacharidy ..................................................................................................... 69

7.4.3

Extracelulární polysacharidová substance u klinicky významných mikrobů a její význam.... 70

7.5

Koagregace a koadheze ................................................................................................................... 71

7.6

Regulace tvorby biofilmu ................................................................................................................ 72

7.6.1 7.7

Struktura a fungování biofilmu ........................................................................................................ 74

7.8

Transport látek a difuze v biofilmech .............................................................................................. 75

7.8.1 7.9

8

Difuze do biofilmů................................................................................................................... 76

Charakteristiky biofilmu .................................................................................................................. 79

7.9.1

Tloušťka biofilmu .................................................................................................................... 79

7.9.2

Denzita biofilmu ...................................................................................................................... 79

7.9.3

Prvkové složení biofilmů ......................................................................................................... 80

7.10

Sukcesní vývoj biofilmu .................................................................................................................. 80

7.11

Uvolňování buněk z biofilmu a šíření biofilmu ............................................................................... 81

Toxické produkty mikroorganizmů ......................................................................................................... 84 8.1

Biogenní aminy ............................................................................................................................... 84

8.1.1

Chemická struktura biogenních aminů .................................................................................... 84

8.1.2

Vznik biogenních aminů .......................................................................................................... 85

8.1.3

Producenti biogenních aminů .................................................................................................. 86

8.1.4

Biogenní aminy v potravinách ................................................................................................. 86

8.1.5

Fyziologické účinky biogenních aminů ................................................................................... 88

8.2

9

Quorum sensing a tvorba biofilmu .......................................................................................... 73

Mykotoxiny ..................................................................................................................................... 88

8.2.1

Chemická struktura mykotoxinů.............................................................................................. 89

8.2.2

Výskyt mykotoxinů v potravinách........................................................................................... 91

8.2.3

Fyziologické účinky mykotoxinů na lidské zdraví .................................................................. 91

Procesy prodlužování trvanlivosti potravin ............................................................................................. 94 9.1

Konzervační metody ........................................................................................................................ 94

9.1.1

Působení vysokých nebo nízkých teplot .................................................................................. 95

9.1.2

Zvýšení obsahu sušiny ............................................................................................................. 96

9.1.3

Biochemické postupy .............................................................................................................. 97

9.1.4

Přídavek antimikrobních látek ................................................................................................. 98

9.1.5

Působení modifikované atmosféry .......................................................................................... 98 Strana 5 / 136 Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky

9.1.6

Hydrostatický tlak, záření a ultrazvuk ..................................................................................... 99

Mikrobiologie obalových materiálů .................................................................................................. 101

10 10.1

Úvod do problematiky obalových materiálů ................................................................................. 101

10.1.1

Ochranná funkce obalů .......................................................................................................... 101

10.1.2

Obaly z papíru ....................................................................................................................... 102

10.1.3

Kovové obaly......................................................................................................................... 102

10.1.4

Skleněné obaly....................................................................................................................... 103

10.1.5

Obaly z plastických hmot ...................................................................................................... 103

Pravidla správné hygienické a výrobní praxe – mikrobiologická kritéria ......................................... 105

11 11.1

Úvod do problematiky bezpečnosti potravin ................................................................................. 105

11.2

Základní pojmy .............................................................................................................................. 106

11.3

Náležitosti plánu odběru vzorků a doporučené mikrobiologické limity........................................ 108

11.3.1

Plán odběru vzorků ................................................................................................................ 108

11.3.2

Doporučené mikrobiologické limity ...................................................................................... 109

11.3.3

Interpretace výsledků vzorkování .......................................................................................... 109

11.3.4

Přípustné hodnoty mikrobiologických kritérií ....................................................................... 111

Mikrobiologie tukařského průmyslu ................................................................................................. 116

12 12.1

Úvod do problematiky mikrobioogie tuků .................................................................................... 116

12.2

Mikrobiologie surovin tukařského průmyslu................................................................................. 116

12.3

Mikrobiologie jedlých olejů a tuků ............................................................................................... 117

12.3.1

Mikrobiologie ztužených tuků ............................................................................................... 117

12.3.2

Mikrobiologie margarínu ....................................................................................................... 118

12.3.3

Zdroje mikroorganizmů v margarínu..................................................................................... 118

12.3.4

Vlivy působící na růst mikroorganizmů v margarínu ............................................................ 120

12.3.5

Mikroorganizmy v margarínu a mikrobiální vady margarínu ............................................... 122

12.3.6

Opatření vedoucí k omezení mikrobiálních vad margarínu................................................... 122

Mikrobiologie kosmetických přípravků ............................................................................................ 124

13 13.1

Úvod do problematiky mikrobiologie kosmetických přípravků .................................................... 124

13.1.1

Pleťové krémy a pleťová mléka............................................................................................. 124

13.1.2

Pudry a zásypy ....................................................................................................................... 125

13.1.3

Zubní pasty ............................................................................................................................ 125

13.1.4

Rtěnky.................................................................................................................................... 126

13.1.5

Kolínské vody a parfémy ....................................................................................................... 126

13.2

Zdroje mikrobiální kontaminace v kosmetických přípravcích ...................................................... 126

13.2.1

Obaly ..................................................................................................................................... 126

13.2.2

Voda ...................................................................................................................................... 127

13.2.3

Vzduch ................................................................................................................................... 128 Strana 6 / 136 Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky

Seznam literatury ........................................................................................................................................... 130 Seznam obrázků............................................................................................................................................. 133 Seznam tabulek.............................................................................................................................................. 134 Seznam rovnic ............................................................................................................................................... 135

Strana 7 / 136 Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky

1 Identifikace bakterií Studijní cíle: Seznámit studenta se základy bakteriologie a s problematikou identifikace bakterií, osvětlit metody využívané v rámci identifikace bakterií se zaměřením na metody molekulární biologie Klíčová slova: diagnostika, grampozitivní a gramnegativní bakterie, morfologické znaky, makroskopické a mikroskopické znaky, biochemické znaky, identifikace metodami molekulární biologie Potřebný čas: 2 hodiny

1.1 Identifikace bakterií Potraviny, které konzumujeme, nejsou ani zdaleka sterilní. Obsahují skupiny mikroorganizmů, jejichž složení je závislé na tom, jaké mikroorganizmy získaly přístup, jak rostou, přežívají a interagují s danou potravinou. Některé z nich hrají důležitou roli ve výrobě potravin a jejich aplikace je žádaná např. pro produkci fermentovaných mléčných výrobků. Zatímco jiné mohou způsobovat jejich kažení a vyvolávat onemocnění konzumentů. Přítomná mikrobiální flóra může mít přirozený původ (ze surového materiálu), nebo jejím zdrojem může být proces sklizně/porážky, výroba, skladování či distribuce potraviny. Specifické složení a počet mikroorganizmů pak do značné míry záleží na technologickém procesu, kterým jsou výchozí suroviny zpracovány, na vlastnostech potraviny, skladovacích podmínkách a vlastnostech samotných organizmů. K dalšímu zjišťování působení mikroorganizmů v potravinách a jejich kontrole je nutné izolovat je jako čistou kulturu a studovat jejich morfologické, fyziologické, biochemické a genetické vlastnosti. Při identifikaci bakterií je důležité vědět, za jakých podmínek bakterie roste a množí se. Tyto podmínky jsou důležitým faktorem při určování jednotlivých druhů bakterií, resp. skupin. Je důležité znát, jestli bakterie, které se snažíme identifikovat, rostou při anaerobních nebo aerobních podmínkách, případně zda jsou schopné růst a množit se v obou případech. Příkladem mohou být např. obligátně anaerobní bakterie z rodu Clostridium, nebo rodu Pseudomonas. BakteBakterie z čeledi Enterobacteriaceae jsou zase fakultativně anaerobní a žijí v přítomnosti i nepřítomnosti kyslíku. Dalším faktorem, který pomáhá při identifikaci, je samotná teplota kultivace. Je sice pravdou, že bakterie mají široké spektrum teplot, ve kterých dokážourostou, ale s určitostí nám tento fyzikální faktor přiblíží, o jaké bakterie se může jednat. Ne nadarmo se bakterie rozdělují podle optimální teploty růstu na psychrofilní, mezofilní a termofilní. Jednou z důležitých metod, které se používají v bakteriologii při rozlišování a identifikaci bakterií je Gramovo barvení, což jje mikroskopická metoda založená na odlišném barvení buněčné stěny gramnegativních a grampozitivních bakterií krystalovou violetí a safraninem. Po obarvení se buněčná stěna grampozitivních bakterií zbarví do modra, zatímco buněčná stěnagramnegativních do růžova až červena. Pod imerzním mikroskopem při zvětšení 100x. V nedávné minulosti, dnes už méně, se při identifikaci bakterií používaly jejich mikroskopické znaky. Když používáme termín mikroskopické znaky, hovoříme o tvarech, velikostech, motilitě bakterií, případně přítomnosti či nepřítomnosti spor.

8

1.2 Morfologie bakterií při identifikaci Tvar a velikost jsou jedním z rozlišovacích znaků různých druhů bakterií, které můžeme snadno pozorovat pod mikroskopem. Mnoho bakterií se jeví jako koky, tyčinky, nebo vláknité útvary, nicméně určení morfologických znaků diagnostikovaného mikroorganizmu patří k základní identifikaci. Např. baktebakterie z rodu Enterococcus spp. se pod mikroskopem jeví jako typické koky, rod Lactobacillus spp. jako protáhlé tyčinky a např. rod Bifidobacterium jako tyčinky ve tvaru písmena Y. Co se týká čeledi Enterobacteriaceae, jsou všechny baktebakterie této čeledi tyčinky. Mikroskopie se používá v bakteriologii dodnes, protože bakterie většinou rostou v populacích složených z různých druhů. Pokud chceme tyto druhy od sebe oddělit, lze k izolaci použít čárkování nebo konvečně používaný křížový roztěr. Poté, pro kontrolu dobré izolace, je nutné použít mikroskop pro ověření, zda se v kultuře nevyskytují i jiné bakterie. Pro základní identifikaci anebo rozlišení skupin mikroorganizmů se používají:  

Mikroskopické znaky – tvar, velikost, atd. Makroskopické znaky – vzhled kolonie (velikost, barva, povrch, profil a okraj) případně produkce zápašných látek (proteolytický druh Pseudomonas), Salmonella (síra).

 1.2.1

Selekce kultur

Nejzákladnějším pravidlem při identifikaci bakterií je čistota kultury. To znamená, že by se v identifikovaném vzorku měl vyskytovat jen jeden druh bakterií. Pro získání čisté kultury bakterií existuje mnoho metod a technik. Nejjednodušší metodou je izolace bakterií pomocí bakteriologického očka na příslušném agaru již zmíněným čárkováním. Po každém kroku čárkování je nutné bakteriologické očko vyžíhat nad plamenem. Důvod je prostý. Na bakteriologickém očku se nachází obrovské množství bakterií, které bychom při technice čárkování rozetřeli po celém povrchu agaru, a výsledkem by bylo takové množství kolonií bakterií, že by spolu splývaly v jeden celek namísto samostatných kolonií, které jsou při této technice požadované. Avšak některé bakterie, hlavně z čeledi Enterobacteriaceae, se pomocí této metody rozizolovávají velmi těžko. Tento proces je pak potřeba opakovat až do úplného vyčistění kultur. Když tyto techniky selhávají, je možné čistou kulturu bakterií získat pomocí metody ředění bakteriální suspenze a následným roztěrem. Když bakteriální suspenzi zředíme v roztoku dostatečně, získáme tak samostatné kolonie, které původně vyrostly z jediné bakterie. Tato technika izolace čistých kultur je odvozená od systému desítkového ředění, které se používá při určování počtů bakterií z různých zdrojů.

1.2.2

Selektivní živné půdy

Pro cílenou selekci bakterií můžeme použít selektivní živná média. Selektivní živná média jsou živné půdy, které obsahují látky podporující růst určité skupiny bakterií. Nebo naopak obsahují látky, které potlačují růst ostatních nežádoucích bakterií. Jedním z příkladů selektivní živné půdy je McConkeyho agar, živná půda, která obsahuje žlučové soli. Ty potlačují růst všech ostatních bakterií kromě bakterií z čeledi Enterobacteriaceae. Živnou půdou pro mléčné bakterie z rodu Lactobacillus sp. je například MRS agar. Pro selekci fekálních laktobacilů můžeme použít selektivní agar ROGOSA. Rod Enterococcus sp. můžeme selektovat na živné půdě s názvem Slanetz-Bartley agar. Žampiónový agar pak lze využít na selekci myxobakterií z vody. Pro

9

selektivní kultivaci rodu Bifidobacterium sp. se používají různé agary s přídavky rozličných druhů reagencií, jako např. klíčkový agar s mupirocinem, nnebo TOS Propionate agar s propionátem sodným a suplementem mupirocinu.

1.2.3

Diagnostické živné půdy

Diagnostické půdy jsou média, pomocí kterých je možné na základě barevné změny identifikovat některé bakterie. Zároveň zde dochází k selekci mikroorganizmů, proto se někdy setkáváme s označením selektivně-diagnostické půdy. Je třeba uvést, že ne všechny bakterie je možné identifikovat na jednom médiu. Často je třeba použít vícero diagnostických půd a někdy ani neexistují. Selektivně-diagnostická médiaobsahují určitou chemickou látku (barvu fungující nejčastěji jako pH indikátor), která reaguje s produkty metabolizmu různých bakterií a způsobí tak barevnou změnu. V praxi proto existuje mnoho diagnostických půd, které se liší svým složením, jež závisí na výrobci. Příkladem je Chromogenic coliform agar, který se používá na identifikaci koliformních bakterií z různých zdrojů. Přičemž kolonie během růstu na tomto médiu procházejí barevnou změnou. Např. u Escherichia coli jsou kolonie modře zbarveny. Růžové se jeví naopak kolonie bakterií Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, nebo Salmonella enteritidis. Hnědé kolonie na tomto agaru vytváří Proteus vulgaris. Co se týká bakterií Staphylococcus aureus a Enterococcus faecalis, jejich růst by měl být inhibován. Dalším diagnostickým živným médiem je Chromogenic urine agar IV, anebo URI select IV. Tento agar je podobný předcházejícímu, avšak je selektivní pro bakterie z urinálního traktu. Mezi selektivní půdy zařazujeme rovněž XLD (xylosa-lyzin-dextróza) agar, pomocí kterého dokážeme identifikovat rod Salmonella sp., protože vytváří na agaru kolonie s černým zbarvením, které je způsobeno tvorbou H2S. Mezi diagnostické půdy patří i TSI agar (Triple sugar iron agar), starší překlad Hajnův agar. Tento agar byl vytvořený pro skupinu bakterií z čeledi Enterobacteriaceae. Zároveň je i agarem s biochemickým testováním. Princip TSI agaru je založený nekvašením zkvašování tří různých cukrů, z kterých se fermentací tvoří kyseliny, plyn a H2S. S Hajnovým agarem se pracuje ve zkumavkách na tzv. šikmých agarech. Hajnův agar obsahuje pH indikátor. Vlivem kvašením vznikajících metabolitů dojde k barevné změně. Když bakterie cukry zkvašují, vznikají kyseliny a barva agaru se vlivem nízkého pH nemění. Pokud bakterie cukry nezkvašují, ale místo toho jako zdroj uhlíku využívají pepton, vzniká z peptonu v procesu metabolizmu amoniak, který má za následek změnu pH směrem nahoru. Vzniká tak zásadité prostředí a agar mění své zabarvení ze žluté na červenou. Kvašením cukrů vzniká též CO2, který se projevuje trhlinami v agaru. Další z biochemických reakcí, které mohou probíhat v TSI agaru je tvorba H2S. Ten se projeví na agaru černým zabarvením. Tvorba sirovodíku je základním rozlišovacím znakem při identifikaci např. salmonel nebo bakterií rodu Citrobacter.

1.3 Biochemická identifikace bakterií V minulosti se pro identifikaci bakterií používala řada biochemických zkumavkových testů, kdy každý test probíhal v jedné zkumavce s příslušnou indikační látkou. Např. cukrovou řadu představovala sadu zkumavek obsahující různé sacharidy jako odlišné zdroje uhlíku. Bakterie dokážou využívat různé zdroje uhlíku odlišným způsobem. Některé zkvašují glukózu, jiné např. laktózu. Některé nejsou schopny fermentovat sacharidy vůbec. Podle toho jaký druh cukru dokáže daná bakterie metabolizovat, jsme schopni blíže identifikovat rod nebo dokonce druh zkoušených bakterií. K určení, zda daná bakterie některý ze substrátů zkvašuje, nám pomáhá acidobazický 10

indikátor. Podobně jako při testech na TSI agaru při zkvašování cukrů vznikají kyseliny. Ty mění pH a způsobují barevnou změnu. Pokud bakterie jako zdroj uhlíku využívají pepton, vzniká z peptonu amoniak a k barevné změně nedochází. Dalším biochemickým testem, který lze prokázat barevnou změnou média, je ureázový test. Ureáza je enzym, pomocí kterého bakterie dokážou rozkládat močovinu. Existuje nepřeberné množství dalších biochemických testů, pomocí nichž dokážeme od sebe odlišit jednotlivé bakterie. Např. manitolový test (kdy z manitolu vzniká kyselina), tvorba lyzindekarboxylázy, produkce indolu, utilizace citrátu, tvorba beta-galaktozidázy, produkce lipáz, fenylalanindeamináza, tvorba kyselin z adonitu, celobiózy, ramnózy, sacharózy, sorbitolu, trehalózy, dulcitolu apod. Dnes se pro biochemickou identifikaci bakterií používají kombinace specifických testů, které se aplikovaly již dříve, s tím rozdílem, že jsou umístěné v mikrodestičkách. Mikrometody mají spoustu výhod. Zabírají méně místa v inkubátoru, jejich příprava a pracovní postup je o mnoho méně náročný na čas i spotřebu chemikálií příp. půd. Jsou jednodušší a praktičtější. Příkladem je enterotest24, EN-coccus test, systém Biolog, API (Biomérieux), ebo Anaerotest. Z nejmodernějších biochemických metod můžeme uvést přístroj VITEK 2, který na základě biochemických reakcí v mikrodestičkách sám vyhodnotí barevnou změnu a identifikuje jednotlivé druhy bakterií.

1.4 Genetická identifikace bakterií metodami PCR Bakterie už dnes dokážeme identifikovat i s použitím molekulárních metod, které jsou nejčastěji založené na principu polymerázové řetězové reakce (PCR, Polymerase chain reaction). Tuto metodu objevil biochemik Kary Mullis v roce 1985 a v roce 1993 za ni dostal Nobelovu cenu. Princip je založený na opakovaném zdvojování (amplifikaci) templátové DNA, pžípadně úseku DNA ohraničeného primery (oligonukleotidy) pomocí DNA-polymerázy. Pro účely PCR reakce se používá Taq-polymeráza, která byla izolovaná z baktebakterie Thermus aquaticus, protože má DNA-polymerázu, která je schopna odolat vysokým teplotám, které jsou při PCR reakci nevyhnutelné. Kromě Taq-polymerázy, primerů a templátové DNA musí samotná směs pro PCR reakci obsahovat též dNTP (deoxynukleotidtrifosfát), PCR pufr s MgCl2 a čistou deionizovanou vodu. PCR reakce je rozdělená do kroků, které se opakují cyklicky 30–40 krát za sebou. Při každém cyklu se zdvojnásobí počet kopií DNA anebo úseku, který se snažíme namnožit. Cykly se skládají z následujících fází: 1. denaturace – vlivem vysoké teploty (více než 90 °C) se templátová DNA rozplete (denaturuje), 2. aneeling – poklesem teploty (37-65 °C) nastává navázání primerů k templátové DNA, 3. polymerizace – zvýšením teploty na 72 °C Taq-polymeráza syntetizuje nové komplementární vlákno DNA s dNTP (deoxynukleotidtrifosfát), 4. závěrečná polymerizace – tento krok probíhá jen jednou a to na konci PCR reakce, kdy se „dosyntetizují“ nová vlákna DNA. Pomocí PCR reakce dokážeme identifikovat jakoukoliv bakterii, která má osekvencovaný genom a jsme schopni určit tak pořadí nukleotidů v templátové DNA. Nejdříve totiž musíme znát sekvenci, kterou chceme amplifikovat. Při identifikaci bakterií je nejlépe najít takovou sekvenci v templátové DNA, která je jedinečná pro konkrétní druh. Když takovýto úsek najdeme, můžeme jej ohraničit komplementárními primery a během PCR reakce nám vzniknou kopie tohoto specifického úseku DNA. Když ohraničený úsek během PCR reakce nevzne, je pravděpodobné, že se nejedná o druh 11

bakterie, který jsme hledali a naopak. Když nám daný produkt PCR reakce vznikne, je pravděpodobné, že hledalis jedná o kýžený druh.

1.4.1

Modifikace PCR

RFLP-PCR (Restriction Fragment Length Polymorphism, polymorfizmus velikosti restrikčních fragmentů) je metoda, při které PCR produkt štěpíme restrikční endonukleázou. Restrikční fragmenty jsou separované agarózovou gelovou elektroforézou, přičemž vytvářejí charakteristický RFLP profil. Tento profil prokazuje specificitu získaného PCR produktu např. genu kódujícího enterotoxin E. coli (pro odlišení falešně pozitivních reakcí). Vzhledem k tomu, že je to metoda založená na použití PCR techniky, vyžaduje jen malý počet buněk analyzovaného mikroorganizmu a obchází problém kultivace. Toto je hlavní výhoda všech molekulárních metod vycházejících z PCR. Metoda má nejvyšší schopnost reprodukovatelnosti ze všech DNA otiskových metod založených na použití PCR. ARDRA (Amplified Ribosomal r-DNA Restriction Analysis) je analýza fragmentů ribozomální DNA získaných metodou PCR. Dříve byla označovaná jako RFLP. Tato metoda je rychlá, jednoduchá a nevyžaduje znalost sekvence amplifikovaných 16S r-DNA fragmentů. Molekuly 16S r-RNA jsou hodnotným fylogenetickým markrem pro mikroorganizmy, protože jsou univerzálně rozšířené, mají konstantní funkci a jejich sekvence se mění v různém rozsahu. Tyto vlastnosti dělají 16S r-RNA geny dostupnými pro mnohé metody, např. sekvenční analýzu, ribozomovou typizaci, RLFP, anebo hybridizaci s oligonukleotidovými sondami. Všechny výšeč zmíněné metody jsou používané na identifikaci a typizaci mikroorganizmů. Na amplifikaci se používají primery, které se vážou na označené oblasti na začátku a konci sekvence pro 16S r-DNA- Po PCR amplifikaci jsou získané PCR amplikony štěpené restrikčními endonukleázami a restrikční fragmenty separovány agarózovou gelovou elektoforézou. Bylo mnohokrát dokázano, že metoda ARDRA umožňuje dobré rozlišení bakteriálních druhů. Analýza restrikčního vzoru ribozomálních RNA genů byla použita na identifikaci a klasifikaci bakteriálních druhů v rámci mnohých bakteriálních rodů, např. Campylobacter, Lactococcus, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus. Používání této analýzy se velmi osvědčilo v klasifikaci a doporučuje se jako jedna z metod pro taxonomii bakteriálních druhů. ITS-PCR metoda využívá sekvenci genů ve specifické oblasti. DNA oblast mezi 16S a 23S r-RNA geny se nazývá internal trascribed spacer (ITS). Tato oblast je rozšířená ve všech bakteriích, ale vykazuje velmi nízkou sekvenční konzervovanost, což omezuje její použití jako fylogenetického markeru. ITS oblast může vykazovat signifikantní variabilitu i v rámci stejného bakteriálního druhu. ITSPCR amplifikuje „mezerníkovou“ sekvenci DNA mezi geny kódujícími 16S a 23S r-RNA. Všechny bakterie mají několik kopií ribozomálního operonu, obvykle 2-10 v závislosti na vyšetřovaném druhu. Vzpomínané r-DNA operony mají konzervovanou strukturu a pořadí genů je následovné: 16S–23S–5S r-DNA. 16S a 23S r-DNA. Tyto úseky obsahují konzervované sekvence nacházející se u všech bakterií, proto je možné vyselektovat pozice dvou primerů, které umožňují amplifikaci celé mezerníkové oblasti. Tyto primery se vážou na 3’ oblast 16S r-DNA genů a 5’ oblast 23S r-DNA genů. Amplifikované ITS fragmenty mohou být separovány agarózovou gelovou elektroforézou, anebo elektroforézou na denaturačním polyakrylamidovém gelu. Izoláty patřící ke stejnému bakteriálnímu druhu obyčejně vytváří stejný charakteristický vzor fragmentů DNA, který může být použit přiidentifikaci izolátů. Hlavními výhodami ITS-PCR jsou především jednoduchost, rychlost a finanční nenáročnost. Nevýhodou je, že navzdory rostoucímu počtu informací o ITS sekvencích v databázích stále není možné dopředu předpovědět očekávaný DNA vzor. Biodiverzitu jednotlivých kmenů stejného druhu bakterií využíváme zvláště při hledání zdroje nákazy onemocnění, např. při otravách z potravin. Mezi nejjednodušší, ale i nejméně specifické, 12

patří PCR metody RAPD, ERIC, Rep-PCR a UP-PCR. Na druhé straně, metody jako SSCP, PFGE a ribotypizace jsou specifičtější, ale i přiměřeně složitější. RAPD PCR (randomamplified polymorfic DNA) – Při této technice se obvykle používají krátké nukleotidové primery a méně přísné podmínky amplifikace (teplota annealingu kolem 37–65 °C), přičemž se získá méně komplexní fingerprint (otisk). Na separaci amplifikačních produktů se obvykle používá elektroforéza v agarózovém gelu a detekce ethidium bromidem. ERIC-PCR (enterobakteriální repetitivní intergenetický konsensus) využívá dva primery ERIC 1 (5′–ATG TTA AGC TCC TGG GGA TTC AC–3′) a ERIC 2 (5′–AAG TTA GTG ACT GGG GTG AGC G–3′), které jsou odvozeny z ERIC elementů. Tyto elementy jsou krátké (120 párů bází) a vyskytují se ve vícerých kopiích rozptýlené v genomu enterobakterií. I když přítomnost těchto elementů byla potvrzená jen u enterobakterií, metoda ERIC-PCR se v současné době široce využívá nejen pro fylogenetické analýzy a studium příbuznosti bakteriálních kmenů, ale i u eukaryotických organizmů. Další možností je tzv. REP-PCR (repetitivní element). UP-PCR využívá jeden tzv. univerzální primer např. UPL45 GTA AAA CGA CGG CCA GT, který byl použit pro detekci podobnosti fekálních druhů enterokoků izolovaných ze střev japonských křepelek. SSCP (single strand conformation polymorphism) je metoda, při které se jedno vlákno DNA, které bylo získáno denaturací PCR produktu (např. bakterií) o maximální velikosti 400 bp v nedenaturujícím polyakrylamidovém gelu. Ve vhodných podmínkách (nízká teplota a nedenaturační vlastnosti prostředí) se DNA vlákna skládají do struktur, které migrují v závislosti na jejich tvaru – konformaci (nedělí se na základě molekulové hmotnosti). Vlákna DNA s odlišnými sekvencemi nezískají stejný tvar, proto mají rozdílnou pohyblivost v gelu. Současná zjištěnínaznačují, že tyto rozdíly v pohyblivosti závisí především na terciální struktuře, méně na sekundární struktuře DNA molekul. Citlivost metody je ve všeobecnosti. Proporciálně inverzní velikosti fragmentů resp. rozdíly v jednotlivých párech bází jsou zaznamenávány na 99 % při velikosti fragmentů 100-300 bp a méně než 80 % při 400 bp fragmentech. Ke stanovení složení mikrobiální populace se používají rovněž metody molekulárně-biologické analýzy využívající PCR. Mezi tyto postupy náleží metody DGGE a TGGE. Diverzitu mikrobiální populace lze potvrdit i fluorescenční metodou FISH. Při DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) se PCR produkt (např. střevní anebo půdní mikroflóry) dělí v polyakrylamidovém gelu obsahujícím gradient dvou denaturačních látek (močoviny a formamidu) při teplotě 60 °C. Jeden z použitých primerů musí obsahovat na 5′ konci tzv. GC clamp, což představuje 40 báz GC, např. primer FP341: 5′–CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G CCT ACG GGA GGC AGC AG. DGGE byla popsaná jako metoda pro detekci mutací, nebo analýzu genového polymorfizmu. V současnosti se tato molekulárně-biologická technika ve velké míře využívá v mikrobiální ekologii. Jednotlivé fragmenty představují dominantní skupiny bakterií, např. střevní mikroflóry. Touto metodou je možné bez kultivace stanovit složení mikrobiální populace. TGGE (thermal gradient gel electrophoresis) je vlastně modifikací DGGE, při které je chemický gradient DNA denaturujících látek nahrazen tepelným gradientem. Zpravidla je využíván gradient v rozmezí od 40 °C do 65 °C v jednoduchém polyakrylamidovém gelu. TGGE se provádí ve dvou modifikacích a to se stálým tepelným gradientem během celé doby dělení (např. přístroj od firmy Biometra), nebo s tzv. dočasným tepelným gradientem (např. přístroj od firmy Biorad), při kterém teplota stoupá v průběhu elektroforézy. TGGE metoda byla již mnohokrát použita jako nástroj v bakteriální taxonomii.

13

FISH (fluorescent in situ hybridisation) metoda využívá fluorescenční mikroskop ke stanovení jednotlivých rodů resp. fylogenetických skupin bakterií použitím RNA fluorescenčních sond. Ty specificky hybridizují s danými mikroorganizmy. Vzorky obsahu střeva, půdy, nebo čistých kultur bakterií se fixují např. v paraformaldehydu a po nanesení zpracovaného vzorku na podložní sklíčko se nátěr permeabilizuje, aby sonda při následující hybridizaci mohla proniknout do bakteriální buňky. RNA sondy jsou nejčastěji označené pomocí fluorescein-izothiokyanátu, což se projeví v mikroskopu zeleným fluoreskujícím zabarvením pozitivně hybridizujících bakterií v černém poli. Pro analýzu střevní mikroflóry se používá např. univerzální sonda Eub 338 a skupinově specifická sonda pro enterobakterie Enter 1432. Sonda Erec 482 se aplikuje pro skupinu Clostridium coccoides a sonda Bact 303 pro skupinu Bacteroides - Prevotella. Pro detekci bifidobakterií ve stolici dětí se používá sonda Bif 164 jako součást komerčního kitu.

1.5 Další metody genetické identifikace bakterií Amplifikace genetického materiálu není vždy nutností. V rámci identifikace mikroorganizmů metodami molekulární biologie se můžeme setkat s metodami, které nevyžadují zmnožení DNA (PFGE, ribotypizace).

1.5.1

Metoda PFGE

PFGE (pulzní gelová elektroforéza) je metodou, kdy se neamplifikovaná chromozomální DNA přímo v gelovém bločku nejdříve naštěpí restrikční endonukleázou a potom se dělí periodickou (pulzní) změnou orientace elektrického pole mezi dvěma páry elektrod. Separace DNA probíhá na základě rozdílné molekulové hmotnosti. Kratší fragmenty putují rychleji. Počet fragmentů je relativně nízký (5-50). Fragmenty se získávají štěpením bakteriálního genomu restrikčními enzymy, které rozpoznají na DNA cílové sekvence dlouhé 8 anebo 6 bp. Výskyt těchto štěpných míst v genomu je statisticky řídký. Výsledný profil je charakteristický a vysoce specifický pro analyzovaný mikroorganizmus. Tento otisk DNA představuje kompletní bakteriální genom a umožňuje detekovat specifické změny DNA (delece, inzerce, přeskupování) uvnitř části bakteriální populace určitého kmenu v průběhu času. Tato vlastnost je důvodem, proč se metoda PFGE považuje za jednu z nejcitlivějších, pokud ne přímo za nejcitlivější metodu ve schopnosti rozlišování vnitřně druhových resp. kmenových rozdílů.

1.5.2

Ribotypizace

Při ribotypizaci nepoužíváme amplifikaci DNA. Izolovanou chromozómovou DNA z bakterií rozštěpíme restrikčním enzymem, např. Eco RI a po elektroforetickém dělení na velkém agarózovém gelu (20x20 cm, 16 hod., 50 V) se rozdělené fragmenty přenesou na nylonovou membránu. Potom následuje hybridizace fragmentů na membráně s označenou rrs sondou (rrs je gen kódující 16S ribozomální DNA). Pozitivní úseky se vyhodnotí podle počtu a vzdáleností od startu a připraví se tzv. dendrogram (fylogenetický strom). Každý kmen může mít jiný počet a velikost fragmentů.

14

1.6 Identifikace bakterií hmotnostní spektrometrií Identifikace bakterií metodou hmotnostní spektrometrie je záležitostí moderních postupů. Jedná se o metodu velmi rychlou a vy a vysoce spolehlivou. Samotná identifikace, bez času přípravy vzorku, trvá jen 10 sekund. Čas potřebný k provedení biochemických testů je nesrovnatelně delší -(kolem 24 hodin). Pokud využijeme metod molekulární genetiky, celkový čas k provedení metody činí 5 hodin (izolace DNA 2 hodiny, PCR reakce 2 hodiny a následná vizualizace asi 1 hodina). Jedinou podmínkou je potřeba čisté kultury bakterií, abychom dosáhli kvalitního výsledku a správné identifikace. Hmotnostně spektrometrická metodase nazývá MALDI-TOF MS Biotyper. Zkratku tvoří slova: matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight mass spectrometry. Slovo biotyper je odvozeno od toho, že dokáže identifikovat mikroorganizmus porovnáním v databázi. Samotné identifikaci pomocí MALDI-TOF MS předchází příprava vzorku z čisté kultury bakterií. Využíváme 24 hodinové kultury bakterií, které jsou konzervovány v 70-75 % etanolu. Vzorky v mikrozkumavkách s etanolem se centrifugují při maximálních otáčkách. Etanol se odstraní a zbytkový etanol se nechá odpařit při pokojové teplotě. V eppendorfce nám zůstane pelet (centrifugovaná kultura bakterií). K tomuto peletu se přidá kyselina mravenčí a acetonitril v poměru 1:1. Suspenze se důkladně promíchá. Suspenzi dáme centrifugovat a pomocí pipety odebereme potřebné množství (1-1,5 µl) z vrchní vrstvy centrifugované suspenze, ve které se nacházejí bílkoviny. Roztok se přenese na mikrodestičku a nechá usušit při pokojové teplotě. Po usušení se překryje matrixem (maticí), kterou tvoří kyselina skořicová. Nechá se usušit při pokojové teplotě. Takto připravený vzorek je analyzován přístrojem. Principem je, že dusíkový pulzní laser o vlnové délce 337 nm nastřeluje vzorek s matrixem ve vakuu a odštěpuje jej mimo mikrodestičku. Matrix (kyselina skořicová) se pomocí laseru ionizuje a odevzdává proton bílkovinám, které jsou takto nabité kladně a putují k detektoru, který je nabitý záporně. Různé bílkoviny putují k detektoru odlišnou rychlostí, proto se v názvu uplatňuje pojem Time-of-Flight. Detektor potom zaznamenává různé časy „přeletu“ bílkovin a porovnává je s databází. V databázi jsou uloženy i informace o specifických bílkovinách bakterí. Porovnáním s databází je potom možné identifikovat bakterie za několik sekund, protože tento proces je počítačově automatizovaný a software zabezpečí rychlou a spolehlivou identifikaci.

1.7 Metody zjišťování počtu mikroorganizmů v potravinách Průmyslové systémy kontroly kvality se změnily z kontroly jakosti potravin na systémy zajištění kvality prostřednictvím konceptu HACCP (Hazard Analysis Critical Control Point = Analýza nebezpečí v kritických kontrolních bodech). Systém HACCP je nemyslitelný bez provedení mikrobiologických analýz. V rámci monitoringu kritických kontrolních bodů (CCP) je nejdůležitější získat výsledky v reálném čase tak, aby bylo možné udělat, pokud to bude nutné, nápravné opatření. Tento požadavek stimuluje výzkum k vývoji rychlých mikrobiologických testů. Cílem takového výzkumu je vytvořit mikrobiologické analytické postupy, které jsou daleko rychlejší než tradiční standardní metody a které mohou najít široké uplatnění v systémech HACCP. I.

Tradiční mikrobiologie

Mikrobiologické metody se během posledních padesáti let změnily jen velmi málo. Vyžadují jen jednoduché, ne příliš drahé vybavení i chemikálie a jsou schopné poskytnout výborné výsledky. Mají však jednu nevýhodu, a tou je dlouhá doba, potřebná k získání výsledků. Velmi jednoduché metody, jako jsou například stanovení celkového počtu mikroorganizmů v potravinách anebo 15

v nápojích vyžadují 2-3 dny, zatímco detekce patogenních mikroorganizmů, jako jsou salmonely anebo listerie, může trvat 5-7 dní. II.

Rychlá mikrobiologie

V průběhu posledních dvaceti let se vyvinulo množství „rychlých testovacích metod“, z nichž některé jsou dnes k dispozici ve formě komerčních sad. Mikrobiologické metody jsou obvykle rozdělené do dvou skupin, a to na kvantitativní testy pro početní vyjádření mikroorganizmů přítomných ve vzorku, např. stanovení celkového počtu mikroorganizmů, stanovení počtu Staphylococcus aureus, stanovení počtu koliformních bakterií, a na testy důkazu přítomnosti (prezence/absence testy) specifických obvykle patogenních mikroorganizmů např. salmonel, listerií, E coli O157:H7.

1.7.1

Kvantitativní testy

Rychlé kvantitativní testy mohou být všeobecně rozdělené na tři typy: 1. testy na bázi mikroskopie, 2. testy na bázi ATP (adenozin trifosfát) bioluminiscence a 3. testy na bázi měření elektrické vodivosti. 1.

Testy na bázi mikroskopie

Je to jednoduchá mikroskopie používaná mnoho let. Kromě světelného mikroskopu bylo v poslední době do oblasti analýzy potravin zavedeno množství složitějších mikroskopických technik za účelem velmi rychlého a přesného stanovení požadovaných kvantitativních parametrů. V mlékárenském, masném a nápojovém průmyslu se ve velkém rozsahu využívají techniky založené na fluorescenční mikroskopii, při které jsou mikroorganizmy barvené fluorescenční látkou a sledované epifluorescenčním mikroskopem. Při těchto technikách se vyskytují dva hlavní nedostatky:



některá barviva přijímají živé i mrtvé buňky mikroorganizmů (v mikrobiologii obvykle chceme počítat jen živé buňky)



počítání buněk je pracné a časově náročné

První problém byl vyřešený zavedením techniky DEFT (Direct epifluorescent filter technique). Tato metoda umožňuje počítání živých buněk v syrových potravinách. Druhý problém se může vyřešit jen automatizací. Vyvinulo se množství automatizovaných mikroskopických počítacích systémů, vrcholem je plně automatizovaný filtrační počítací systém COBRA. Dalším pokrokem v oblasti vývoje rychlých mikroskopických systémů bylo použití průtokové cytometrie (flow cytometry). Při této technice se mikrobiální buňky fluorescenčně barví a potom se přenášejí proudem přes automatický fluorescenční mikroskop. Při průchodu mikroskopem buňka vyvolá impuls fluorescenčního světla, které je zachycené detekčním systémem. V potravinářském průmyslu se používá Chemflow. Vrcholem detekce počtu mikroorganizmů založeném na fluorescenční technice je známý i systém Chemscan. Byl vytvořený pro rychlé stanovení mikroorganizmů v čirých tekutých vzorcích. Vzorek je na začátku zfiltrován a mikroorganizmy se zachytí na povrchu filtru. Ten se zabarví tak, aby bakterie fluoreskovaly. Filtr se umístí v zařízení, které může rychle snímat jeho celý povrch laserem. Laser vyvolá fluorescenci zabarvených mikroorganizmů, které se detekují.

16

2.

Testy na úrovni ATP bioluminiscence

ATP je primárním zdrojem energie v živých buňkách. V bakteriálních buňkách je ATP přítomné vždy přibližně ve stejné hladině, proto měřením hladiny ATP v bakteriálních kulturách je možné zjistit počet přítomných buněk. Měření se provádí s použitím enzymu luciferázy. ATP reaguje s enzymem za uvolnění světla, které se zachytí citlivým zařízením-luminometrem a je proveden přepočet množství přítomného ATP. Zásadním problémem této techniky je přirozená přítomnost ATP v potravinách. Proto před měřením hladiny bakteriální ATP musí být ATP potraviny rozložená. Pravděpodobně nejširší uplatnění využití ATP bioluminiscence v potravinářském průmyslu je v oblasti monitoringu stavu hygieny. V tomto případě analýza zachytává obě hladiny ATP, bakteriální i potravinovou, protože jakékoliv zbytky surovin nebo potravin zanechané v produkčních linkách po čištění jsou indikátorem špatné hygieny a mohou být ohniskem bakteriálního růstu a kontaminace. 3.

Testy na bázi měření elektrické vodivosti

V 90. letech minulého století se zjistilo, že bakteriální rozklad krve způsobuje změny elektrické vodivosti. Elektrické změny jsou vyvolány bakteriálním metabolizmem, který mění elektricky nenabité látky v růstovém médiu na jednodušší sloučeniny s elektrickým nábojem. Na tomto principu funguje mnoho zařízení, jako jsou např. Bactometr, Malthus, Analyser, Rabit, Bactrac. Metody jsou založené na bázi měření změn elektrické vodivosti, jsou vysoce automatizované, schopné zpracovat najednou stovky vzorků a podstatně ušetřit čas potřebný na přípravu vzorků (není nutné žádné ředění, výpočet je prováděn automaticky). Největší uplatnění našla tato technika mikrobiální analýzy při testování sterility např. UHT mlék anebo ovocných šťáv. Nevýhoda techniky je, že neposkytuje výsledky ihned. Tato data jsou k dispozici v průběhu 15-20 hodin. Pokud jsou výsledky požadované dříve, je nutné použít jiné metody analýzy.

1.7.2

Kvalitativní testy

Kvalitativní testy slouží většinou k rychlému důkazu původců alimentárních onemocnění v potravinách. Rozlišujeme metody založené na imunologických postupech anebo na základě detekce nukleových kyselin. 1.

Imunologické metody

Jsou založené na využívání protilátek reagujících se specifickými mikroorganizmy (antigeny). Velké rozšíření zaznamenala metoda známá pod označením ELISA. Jde o nekompetitivní analýzu, při které protilátky pokrývají pevnou matrici. Po inkubaci s testovaným vzorkem je detekováno množství navázaného antigenu pomocí protilátek s označeným enzymem. Enzymatická aktivita je přímo úměrná koncentraci antigenu. V případě této techniky musí být na antigenu přítomna minimálně dvě místa na vázání pro protilátku (existuje i metoda kompetetivní, kdy antigen v testovaném vzorku soutěží s antigenem označeným enzymem o místa na vázání na specifickou protilátku vázanou na pevnou matrici. Vazba označeného antigenu je nepřímo úměrná koncentraci produktu vznikajícího enzymatickou reakcí).

17

2.

Metody založenéna detekci nukleových kyselin

Metody založené na dektekci specifických genů přítomných ve sledovaných mikroorganizmech (podkapitoly 1.4.-1.5). Shrnutí Pro identifikaci bakterií lze využít různé metody, které souvisí s vlastnostmi stanovovaného mikroorganizmu. Předmětem zájmu jsou odlišné morfologické (makro- a mikroskopické) znaky, biochemické vlastnosti (metabolizmus) a specifické geny. Metody identifikace lze tedy zjednodušeně rozdělit na kultivační (média selektivní a selektivně-diagnostická), biochemické (schopnost hydrolyzovat, utilizovat, fermentovat specifické substráty) a metody molekulární genetiky povětšinou zahrnující využití PCR. Další možností je potom využití moderní metody chemické analýzy MALDI-TOF MS. Kontrolní otázky 1. Jaké metody využíváme při identifikaci bakteriálních populací? 2. Jaké selektivně-diagnostické půdy znáte a v čem spočívá jejich schopnost identifikovat určitou skupinu mikroorganizmů? 3. Na jakém principu funguje metoda PCR a kde všude se využívá? 4. Čeho využívá metoda MALDI-TOF MS a jaké má výhody?

18

2 Taxonomie bakterií Studijní cíle: Seznámit studenta se základními pojmy taxonomického řazení, s taxonomií bakteriální populace. Osvětlit pojmy: numerická taxonomie, chemotaxonomie Klíčová slova: diagnostika, grampozitivní a gramnegativní bakterie, morfologické znaky, makroskopické a mikroskopické znaky, biochemické znaky, identifikace metodami molekulární biologie Potřebný čas: 1 hodina

2.1 Základní pojmy taxonomie bakterií Taxonomie je nauka o třídění, pojmenování a určování organizmů. Součástí taxonomie jsou tedy tři samostatné, ale navzájem propojené oblasti: klasifikace, nomenklatura a identifikace. Klasifikace se zaobírá tříděním organizmů do taxonomických (systematických) skupin (taxonů). Taxon (z řeckého slova taxis – uspořádání) je všeobecný název pro jakoukoli systematickou jednotku. Základními taxony v bakteriologii jsou rod, druh a nižší než druh je kmen anebo varieta resp. typ. Při klasifikaci organizmů do taxonů se uplatňují jednak systémy přirozené, tzn. založené na genetické a fylogenetické příbuznosti a umělé, opírající se o fenotypovou podobnost (velikost, barva, užitečnost anebo jakýkoliv libovolný znak). Fenotyp je soubor charakteristických viditelných znaků a vlastností. Je výsledkem interakce genotypu a prostředí. Přirozené systémy využívají existující příbuznost, nezávislou na vůli člověka. Jde tedy o klasifikaci fenetickou (podobnostní), anebo fyletickou tvořenou podle fylogenetické příbuznosti. Klasifikace monothetická je běžná u rostlin a živočichů. Každému znaku se přisuzuje jiná váha a vytváří se hierarchie znaků. Třídí se postupně a začíná se nejvýznamnějším znakem, kterým je fylogenetický nejstarší znak. Polythetická klasifikace připisuje všem znakům stejnou hodnotu a jedince rozděluje do skupin podle celkové podobnosti, popsané hodnotami co největšího počtu znaků. Pro bakterie je jedinou možností pro rekonstrukci jejich přirozené fyletické taxonomie. Klasifikační systém bakterií je výsledkem komplexních analýz, které zohledňují celkový stupeň podobnosti a rozdílnosti jak fenotypových, tak i genotypových charakteristik organizmu. Mezinárodně uznávaným systémem třídění bakterií je „Bergyho systém“, publikovaný v příručce „Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology“ (Bergyho příručka determinativní bakteriologie). První vydání vyšlo v roku 1923. Od té doby se neustále systém zdokonaluje a doplňuje. V roce 1974 bylo publikováno 8. vydání této příručky. V roce 1984 získala příručka novou podobu a začala vycházet v samostatných čtyřech dílech a název se změnil na „Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology“(Bergyho příručka systematické bakteriologie). Při klasifikaci bakterií se využívají zejména tyto fenotypové znaky:  

tvar buňky velikost buňky

19

             

Gramovo barvení pohyblivost tvorba spor počet a umístění bičíků přítomnost a vlastnosti pouzder tvar a barva kolonie produkce pigmentů typ metabolizmu vztah k O2 produkce určitých metabolitů schopnost utilizovat určité substráty typ výživy přítomnost některých enzymových aktivit typický biotop, atd.

Fenotypové znaky jsou velmi proměnlivé v čase a závislé na složení prostředí, které způsobuje indukci a represi genové exprese, alosterickou aktivaci, nebo inhibici enzymů. Z genotypových znaků jsou to zejména:    

molární % GC (guanin–cytozin) párů v DNA procentuelní shoda primární struktury DNA stupeň podobnosti genetické mapy stupeň podobnosti primární struktury homologického proteinu, resp. příslušného genu, aj.

Na taxonomické členění organizmů s prokaryotickou buňkou neexistuje jednotný názor. Souvisí to se specifickými biologickými vlastnostmi bakterií. Pro bakterie není ontogeneze opakující fylogenezi, nejsou zkameněliny, bakterie nemají pletiva a orgány, jsou málo tvarově pestré a celkově je k dispozici malý počet charakteristik pro popis jedince. Největším problémem je nemožnost aplikovat na bakterie obvyklou definici druhu. Podle současné definice biologického druhu je to soubor jedinců schopných vzájemného plodného křížení se vznikem potomků. Mezi jedinci stejného druhu existuje volná kombinovatelnost genetického materiálu. V rámci druhu existuje tok genů, příslušníci stejného druhu mají společný genofond. Mezi druhy naopak existuje genetická a reprodukční bariéra. Druh je jediná přirozená a objektivně existující taxonomická jednotka. Vyšší taxonomické jednotky (rod, čeleď atd.) jsou umělé a subjektivní. Definice druhu je tedy rozhodujícím způsobem vázaná na existenci sexuality, tj. na takový způsob reprodukce, kdy nový jedinec vzniká splynutím dvou haploidních pohlavních buněk. Pro bakterie, které se rozmnožují nepohlavně příčným dělením, je charakteristická „genetická promiskuita“, tj. poměrně vysoká frekvence horizontální výměny části genetického materiálu i mezi dvěmi značně nepodobnými jedinci. Pro bakterie není biologický druh přesně vymezený, zřejmě též existuje, jen pro jeho vymezení a definici není doposud vhodné kriterium. Extrémním názorem je, že bakterie tvoří z hlediska toku genů jedinou komunitu, a že je tolik bakteriálních druhů, kolik je statisticky možných kombinací genů navzájem, resp. jimi determinovaných vlastností. U haploidní buňky se každá mutace projeví, protože není zakrytá normální funkcí druhé nemutované alely. Druhou příčinou genetické proměnlivosti je už vzpomínaný častý horizontální přenos genetického materiálu mezi buňkami různých druhů a rodů.

20

2.2 Taxonomické jednotky a jejich hierarchie Bakteriální druh je definovaný jako soubor kmenů, které mají společné znaky, kterými se liší od kmenů jiných druhů. Z vyšších taxonů se přikládá značný význam rodu, protože mezi rody je výrazný rozdíl. Taxonomické jednotky na úrovni čeledi, řady a třídy se v bakteriologii málo využívají. Bakteriologický druh se někdy dělí na poddruhy na základě menších, ale stabilních fenotypových odlišností uvnitř druhu, anebo na základě geneticky determinovaných shluků uvnitř druhu. Označení taxonomických jednotek A. Všeobecné Kmen

Potomstvo jednorázové (jedné) izolace z nějakého konkrétního zdroje (např. z půdy, z infikované rostliny) v čisté kultuře.

Typový kmen

Živá čistá kultura odvozená od kmene, podle kterého byl příslušným autorem stanovený nomenklaturní typ. Kultura tohoto kmene, tzv. typová kultura, musí být uložena v oficiální sbírce kultur s příslušným popisem.

Klon

Populace bakterií odvozená z jedné mateřské buňky.

Kultura

Populace bakterií na daném místě a v daném čase, může mít delší trvanlivost, např. jako lyofilyzát.

Čistá kultura

Populace bakterií z jednoho kmene, není přesné, nebo nejde zároveň o klon.

Smíšená kultura

Populace bakteriálních buněk tvořená z několika kmenů bakterií.

Jedinec

V bakteriologii nemá místo, mohl by se vztahovat jak na jednu bakteriální buňku, tak i na kmen

B. Termíny vztahující se na kmeny bakterií Biotyp (Biovar)

– kmen se vyznačuje specifickými fyziologickými vlastnostmi

Serotyp (Serovar)

– kmen se vyznačuje charakteristickými antigenními vlastnostmi

Patotyp (Pathovar)

– kmen se vyznačuje patogenními vlastnostmi pro určitého hostitele

Fagotyp (Fagovar)

– kmen se vyznačuje schopností být hostitelem určitého bakteriofágu

Morfotyp (Morfovar) – kmen má specifické morfologické vlastnosti Při klasifikaci bakterií se využívají metody mikroskopické, kultivační, fyziologické, biochemické, chemické, ekologické, molekulární biologie, genetické, sérologické a metody numerické taxonomie.

2.3 Numerická taxonomie Numerická taxonomie je numerické vyhodnocení podobnosti mezi klasifikovanými jednotkami a uspořádání těchto jednotek do taxonů na základě velikosti podobnosti. Je tedy založená na kvantifikaci podobnosti a rozdílů mezi bakteriemi. Spočívá na třech základních pravidlech: 1. Všechny znaky mají stejnou hodnotu (váhu). 2. Zjišťují se hodnoty co možná největšího počtu znaků. 21

3. Vztah mezi porovnávanými jednotkami je funkcí číselné hodnoty velikosti jejich podobnosti (S). Postup při numerické taxonomii je tvořen třemi kroky: A. U t taxonomických jednotek, zpravidla bakteriologických kmenů, se zjišťuje hodnota n znaků a sestavená tabulka t versus n. B. Porovnáváním každé klasifikované jednotky s každou další je vypočítána jejich vzájemná podobnost S. Při porovnávané dvojici jsou nejdříve stanovena tato čtyři čísla: a=počet znaků, u kterých hodnota + je pro oba

++

b=počet znaků, u kterých hodnota – je pro oba

––

c=počet znaků, u kterých hodnota je pro prvý – a pro druhý +

–+

d= počet znaků, u kterých hodnota je pro prvý + a pro druhý –

+–

přičemž: a+b+c+d=n Nejjednodušší koeficient podobnosti je:

SS 

ab n

Rov. 1

Je to poměr počtu znaků, ve kterých se dvojice shoduje k celkovému počtu znaků. Koeficient podobnosti:

SJ 

a acd

Rov. 2

nepovažuje nepřítomnost znaku pro obě jednotky za podobnost. Hodnoty koeficientů jsou 0,1. S rostoucí podobností se koeficient blíží k 1, a pokud S=1 znamená to identitu obou jednotek. Nalezené indexy se seřadí do tx t tabulek, ve kterých je každé dvojici přiřazený vzájemný stupeň podobnosti. C. Na základě předcházejících zjištění se udělá klasifikace, tj. hodnocené taxonomické jednotky jsou řazeny do shluků se vzájemnou podobností větší, jako je zvolená hranicenapř. všechny jednotky vykazující vzájemnou podobnost S0,80 atd. Hodnota znaku pro bakteriální taxon je veličina pravděpodobnostní, proto si vyžaduje statistický a pravděpodobnostní přístup nejen k taxonomii, ale i k identifikaci bakterií.

2.4 Chemotaxonomie (chemosystematika) Chemotaxonomie je autonomní odvětví taxonomie, které je definováno obyčejně jako odbor, který využívá ke klasifikaci organizmů a jejich zpětnou identifikaci chemické znaky. Oblast chemotaxonomie se omezuje jen na stanovení kvalitativního výskytu a kvantitativního zastoupení chemických komponentů bakteriální kultury. Může se analyzovat pevná, kapalná, resp. polotuhá fáze kultury. Pevná fáze představuje sediment bakteriální biomasy, anebo stěr z povrchu polotuhé

22

živné půdy. Kapalná fáze je supernatant stráveného kultivačního média, anebo polotuhá agarová živná půda pod vyrostenými koloniemi. V pevné fázi jsou taxonomicky významné všechny složky živé hmoty: nukleové kyseliny, proteiny, polysacharidy, lipidy, ale i speciální složky jako jsou cytochromy, chinony, enzymy. Mohou se charakterizovat celé polymery, anebo jejich stavební složky. V kapalné fázi jsou významné odpadové produkty metabolizmu, složení plynů a produktů, úbytek některých komponentů živného média.

2.5 Nomenklatura Nomenklatura přiřazuje každému taxonu jednoznačný latinský název, zpravidla dvojslovný. Vědecká nomenklatura v bakteriologii je binomická, stejná jako v botanice nebo v zoologii (např. Escherichia coli) a řídí se mezinárodně dohodnutými pravidly („International Code of Nomenclature of Bacteria“). Mezinárodní komise vydává „Approved Lists of Bacteria Names“, který obsahuje všechna platná vědecká jména bakterií. Na rozdíl od klasifikace bakterií, která může být u různých autorů rozdílná, je nomenklatura bakterií oficiální a jediná. Každý taxon má jen jedno platné jméno. Identifikace je proces, kterým zařazujeme nově izolovanou bakterii do určitého pojmenovaného taxonu. Pokud je taxon dobře popsaný, potom zařazení neznámé bakterie do něho znamená bohatou informaci o jeho vlastnostech morfologických, fyziologických, biochemických a dalších, které jsou danému taxonu vlastní. Nejnovější nomenklaturní změny jsou založené na:nejmodernějších metodách (chemotaxonomie, studium nukleových kyselin a proteinů). Spolu s fenotypovými, genetickými a fylogenetickými charakteristikami odhalily nové poznatky. 

projevují se nejdřív v klasifikaci a potom také ve změnách a v nomenklatuře.

Taxonomická databáze prokaryot je pravidelně aktualizována na stránce J.P. Euzéby – List of Prokaryotic Names with Standing in Nomenclature: http://www.bacterio.cict.frbacterio.fr// (LPSN). Dnes známe 24 kmenů bakterií: Proteobacteria Chlamydiae Spirochaetes Fibrobacteres Bacteroidetes Fusobacteria Verrucomicrobia Chrysiogenetes Defferibacteres Dictyoglomi Acidobacteria Cyanobacteria Planctomycetes

Chlorobi Nitrospira Deinococcus – Thermus Chloroflexi Gemmatimonadetes Thermodesulfobacteria Thermotogae Lentisphaerae Aquificae Actinobacteria Firmicutes

Vedle bakterií zařazených do uvedených kmenů existuje rozsáhlé množství nezařazených kultur a též množství nekultivovatelných bakterií.

23

Shrnutí Taxonomie bakterií je věda, která dělí prokaryotické mikroorganizmy na základě fenotypových znaků a podle fylogenetického původu do příbuzných skupin. Nomenklaturou je pak těmto skupinám přiřazen oficiální latinský název, který je všeobecně platný. Vlivem zjišťování nových poznatků vlastností mikroorganizmů se názvosloví v průběhu historického vývoje identifikačních metod měnilo. Mění se i samotné řazení mikroorganizmů v rámci taxonů. Docházelo a ještě stále dochází k přeskupování mikroorganizmů mezi jednotlivými taxony. Pro správné používání názvů a klasifikaci bakterií je tedy třeba zjišťovat výše uvedené změny. Ty jsou zaznamenány v aktualizovaných Bergeyho příručkách a v on-line databázi LPSN. Kontrolní otázky 1. K čemu taxonomie slouží a čeho tento vědní obor využívá? 2. Jaký formát názvů využívá nomenklatura v bakteriologii? 3. Co je to chemotaxonomie a numerická taxonomie a v čem spočívá jejich význam?

24

3 Startérové kultury Studijní cíle: Seznámit studenta s využitím mikroorganizmů v potravinářství. Poukázat na možnosti cílené aplikace určitých skupin mikroorganizmů v technologických procesech. Popsat mikroorganizmy aplikované jako startérové kultury. Klíčová slova: startérové kultury, bakterie, kvasinky, plísně, řízené fermentační procesy Potřebný čas: 3 hodiny

3.1 Startérové kultury Většina fermentovaných výrobků byla vynalezena ještě předtím, než měli lidé znalosti o mikrobiologii a aktivitě mikroorganizmů jako takové. Jednalo se pouze o aplikaci empirických pozorování toho, že určité způsoby skladování způsobují v potravinách žádoucí změny. Po většinu doby byly fermentované potraviny připravovány využitím endogenní přirozeně přítomné mikroflóry. Postupem času však v souvislosti s prvními izolacemi čistých kmenů pivních kvasinek Emilem Christianem Hansem (1983) se do fermentačních procesů potravin začaly zapojovat cíleně přidávané čisté kultury (startéry). Takto použité mikroorganizmy musí splňovat požadavky na bezpečnost označované zkratkou GRAS (Generally Recognized as Safe). Aplikované kultury jsou vybírány podle jejich výhodných vlastností, které mají dopad na fermentační proces a konečnou kvalitu výrobků. Obecně by se dalo říct, že jako startéry přidáváme tři skupiny mikroorganizmů bakterie, kvasinky a plísně. Úspěšná technologie výroby kvašených výrobků zjednodušeně spočívá v přítomnosti, růstu a metabolizmu mikroorganizmů, které jsou zodpovědné za produkci látek a za modifikaci texturních vlastností.

3.2 Přirozené fermentační procesy v syrových potravinách Syrové potraviny rostlinného a živočišného původu přirozeně obsahují mikroorganizmy, které se na nich náhodně usídlily, nebo jsou ekologicky spjaty s kultivačními podmínkami před sklizní příp. podmínkami před porážkou. Pokud jsou potraviny připravovány fermentací bez tepelného opracování, většina mikroorganizmů se bez problému pomnožuje. Avšak možnosti jejich rozvoje jsou omezeny schopností růst v daných podmínkách, které potravina skýtá. To v konečném důsledku vede k ustálení mikroorganizmů, které ve výsledném fermentovaném produktu převáží počtem nad ostatními díky tomu, že se dokážou vzniklým fyzikálně-chemickým podmínkám přizpůsobit. Tento způsob přirozeného kvašení je ilustrován např. u kvašeného krouhaného zelí, které je fermentováno bakteriemi mléčného kvašení. Nevýhodou zmíněného procesu je hlavně dlouhá doba fermentace a nestandardní výsledek. Další výskyt mikroorganizmů v potravinách je způsoben jejich záměrným přídavkem z technologických důvodů.

25

3.3 Role startérových kultur a jejich vlastnosti Použití vybraných laboratorně předkultivovaných startovacích kultur se v dnešní době stává přímo nutností. Cílem potravinářských podniků je vyrobit fermentovaný výrobek, který bude splňovat požadované vlastnosti a bude mít konstantní kvalitu. Startovací kultury můžeme jednoduše definovat jako mikroorganizmy, které jsou očkovány do výrobku, aby způsobily kýžené změny surovin. Tyto změny mohou zahrnovat novou funkcionalitu, delší trvanlivost, snížení rizik v oblasti bezpečnosti potravin, lepší nutriční a senzorické vlastnosti, a v neposlední řadě vyšší ekonomickou hodnotu. Startovací kultury jsou považovány za základní součást téměř všech komerčně vyráběných fermentovaných potravin. Jen velmi malý počet výrobků je fermentován non-startérovou mikroflórou. V době, kdy byla startovací kultura vyvinuta a ještě mnoho let po té, složení mikroorganizmů aplikovaných jako startovací kultury nebylo stabilní. Nebyly známy druhy nebo dokonce vůbec identita aplikovaných mikroorganizmů. Kultura byla používána jen z důvodů již ověřené funkčnosti, kdy byl vytvořen produkt požadovaných vlastností. Také tyto nedefinované kultury jsou v současnosti mnohem méně používány. Místo toho jsou přidávány do surovin organizmy moderních komerčních startovacích kultur, které jsou jasně definované dokonce na úrovni kmene. A co je důležité, jsou také pečlivě vybrány na základě přesných fenotypových kritérií pro určitý produkt. Žádoucí vlastnosti startérových kultur vhodných pro mléčné výrobky jsou: • řízené výnosy kyseliny mléčné, • krátká doba lag-fáze, • fágová rezistence, • stabilita a konstantnost kvality výstupního produktu, • schopnost vytvářet požadovanou chuť a texturu, • tolerance k okyselenému prostředí, • omezení tvorby off-flavor. Žádoucí vlastnosti startérových kultur vhodných pro fermentaci masa jsou: • rychlá acidifikace, • produkce požadovaných chuťových a jinak senzoricky aktivních látek, • antimikrobiální aktivita. Žádoucí vlastnosti startérových kultur vhodných pro výrobu piva jsou: • rychlé kvašení, • produkce požadované chuti, • zachování tolerance ke kultivačnímu prostředí • stabilita, • flokulace, • neschopnost tvořit off-flavor, • správné utlumení růstu v daných fázích výroby, • růst v širokém rozmezí teplot, • osmotolerance, termotolerance a odolnost k mechanickému namáhání. Žádoucí vlastnosti vinných startovacích kultur jsou: • osmotolerance, 26

• tolerance k etanolu, • flokulace, sedimentace, • růst při nízké teplotě, • tvorba konzistentní chuti, • schopnost jablečno-mléčné fermentace. Žádoucí vlastnosti startovacích kultur vhodných pro výrobu chleba jsou: • tolerance k nízkým teplotám, • tvorba požadované chuti, • produkce kypřícího plynu. 3.3.1

Bakteriální startérové kultury

Jako nejvýznamnější skupinu startovacích organizmů můžeme jednoznačně označit bakterie mléčného kvašení. Pouze několik bakteriálních startérových kultur, které nejsou tvořeny bakteriemi mléčného kvašení, je komerčně dostupných. Startérové kultury bakterií mléčného kvašení (BMK) reprezentují nejčastěji rody Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc a Lactobacillus. Zákysové kultury používané pro mléčné výrobky jsou obecně charakterizovány jako mezofilní nebo termofilní v závislosti na optimální teplotě růstu. Mléčné kultury mají tři základní funkce:   

fermentují mléčný cukr, laktózu a produkty metabolizmu následně okyselují mléko nebo sýr, vytvářejí prekurzory chuťových látek, nebo chuťové látky samotné, modifikují texturní vlastnosti výrobků.

BMK, které jsou užívány jako startérové kultury pro ostatní fermentované potraviny disponují podobnými schopnostmi, přičemž z technologického hlediska nejdůležitější je acidifikace. Např. Pediococcus acidilactici je používán při výrobě fermentovaných klobás, produkuje kyselinu mléčnou a významně snižuje pH, které se pak stává nevyhovujícím pro ostatní mikroorganizmy (včetně patogenních). BMK jsou nejdůležitější a nejčastěji užívanou skupinou bakteriálních kultur, které se aplikují jako startéry. Do startérových kultur však mohou být zahrnuty i ostatní mikroorganizmy. Při průmyslové výrobě sýrů švýcarského typu (ementál) je používána kultura Propionibacterium freundenreichii ssp. shermanii. Brevibacterium linens je zase aplikována při výrobě sýrů zrajících pod mazem. V Evropě a příležitostně i v USA výrobci fermentovaných klobás záměrně přidávají bakterii Micrococcus spp. do masové směsi. Tento mikroorganizmus produkuje enzym nitrát reduktázu, která redukuje dusičnanové soli (dusičnany sodné a draselné) na dusitany a podporuje vývoj chuťových látek a barvy masných výrobků. Výroba octa pak zahrnuje aerobní odbourávání etanolu bakteriemi Acetobacter acetti a ostatními příbuznými druhy acetobakterií. 3.3.2

Startérové kultury plísní

Navzdory tomu, že relativně málo výrobků vyžaduje použití mikroskopických hub, výrobci těchto produktů preferují užití plísňových startérových kulturTab. 2 před propagací vlastních kultur. Proto jsou dostupné plísňové startéry pro různé typy sýrů, které zahrnují sýry s modrou plísní v těstě (např. Roquefort a Gorgonzola), stejně jako sýry s bílou plísní na povrchu (např. Brie a Camembert) (Tab. 2). Sýry s modrou plísní využívají aplikaci suspenze spór Penicillium roqueforti a sýry s bílou plísní pak obsahují kulturu Penicillium camemberti. Plísňové kultury jsou také často používány při výrobě asijských fermentovaných sojových produktů. Hlavními příklady těchto výrobků jsou

27

Tempeh, který je vyrobený aplikací Rhizopus microspores, a výrobek Miso a sojová omáčka, které jsou vyráběny pomocí startérových kultur Aspergillus soyae a Aspergillus oryzae. Také můžeme zmínit plísňové kultury určené k výrobě klobás a šunek evropského typu. Tab. 1 Mikroorganizmy užívané jako startérové kultury Organizmy Bakterie mléčného kvašení Lactococcus lactis ssp. lactis Lactococcus lactis ssp. cremoris Lactococcus lactis ssp. lactis biovar diacetylactis Lactobacillus helveticus Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus Lactobacillus sanfranciscensis Lactobacillus casei Lactobacillus sakei Lactobacillus plantarum Lactobacillus curvatus Streptococcus thermophilus Pediococcus acidilactici Pediococcus pentosaceus Tetragenococcus halophilus Oenococcus oeni Leuconostoc lactis Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris

Aplikace Sýr, mléčné výrobky s kulturou Sýr, mléčné výrobky s kulturou Sýr, mléčné výrobky s kulturou Sýr, mléčné výrobky s kulturou Sýr, jogurt Kváskový chleba Sýr, mléčné výrobky s kulturou Klobásy Klobásy, fermentovaná zelenina Klobásy Sýr, jogurt Klobásy, fermentovaná zelenina Klobásy Sojová omáčka Víno Sýr, mléčné výrobky s kulturou Sýr, mléčné výrobky s kulturou, fermentovaná zelenina

Ostatní bakterie Brevibacterium linens Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii Staphylococcus carnosus ssp. carnosus Plísně Penicillium camemberti Penicillium roqueforti Penicillium chrysogenum Aspergillus oryzae Rhizopus microsporus Kvasinky Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces pastorianus Saccharomyces cerevisiae

3.3.3

Sýry: pigment, povrch sýrů Sýry: oka v sýru švýcarského typu Maso: kyselost, chuť, barva Sýr: bílá ušlechtilá plíseň na povrchu Sýr: modrá plíseň v těstě, proteázy, lipázy Klobásy Sojová omáčka, Miso Tempeh Chleba: produkce CO2 Pivo Pivo Víno

Kvasinkové startérové kultury

Výroba pekárenských produktů je nejrozsáhlejší průmyslovou výrobou používající kvasinky jako startérové kultury. Kvasinkové kultury jsou dostupné v nejrůznějších formách od lisovaného droždíaž po sušené droždí prodávané k užití spotřebitelům. Kvasinky pro fermentaci těst na výrobu chleba, běžného a jemného pečiva (pekařské kvasnice) jsou klasifikovány jako Saccharomyces cerevisae a jsou vybrány na základě jejich schopnosti produkovat velké množství oxidu uhličitého, který má kypřicí efekt (Tab. 2).

28

Víno, pivo, destiláty a jiné alkoholické nápoje jsou také vyráběny působením kvasinkových kultur (Tab. 2). Mnoho těchto etanol produkujících kvasinek je také klasifikováno jako S. cerevisae, avšak se významně liší od kmenů používaných v pekárenském průmyslu. Jak bylo zmíněno výše, mnoho vín produkovaných v rámci Evropy je vyráběno pomocí přirozené spontánní fermentace, která spoléhá na přirozenou přítomnost kvasinek na povrchu bobulí hroznového vína a vinařském vybavení. Stejně jako u vína výběr kvasinek probíhá na základě vlastností relevantních pro charakteristické potřeby určitých pivovarů, které zahrnují faktory jako je žádoucí flokulace, vývoj chuti a produkce určitých množství etanolu.

3.3.4

Smíšené nebo neidentifikované startérové kultury

Smíšené nebo neidentifikované startérové kultury obsahují směs různých mikroorganizmů lišících se rody, druhy nebo dokonce kmeny. Ve směsných kulturách je identita organizmů často neznámá a jednotlivé druhy mohou a nemusí být mikrobiologicky a biochemicky charakterizovány. Poměr různých mikroorganizmů v těchto kulturách nebývá nutně konstantní a může se lišit výrobek od výrobku. Nicméně nedefinované kultury jsou stále používány při mnoha výrobách, protože se ukázaly být během dlouhých let používání spolehlivými. Navíc v závislosti na výrobku mohou mít smíšené kultury určité výhody. Tyto kultury jsou např. užívány pro výrobu dlouhozrajících sýrů. Fermentační část výroby sýra může být dlouhá a během ní může vzniknout riziko infikace startérové kultury bakteriofágy. Ty se mohou vyskytovat v sýřenině nebo mohou být zaneseny do sýra společně s kulturou. V souvislosti s odlišností bakterií směsné kultury jsou přítomny spíše kmeny rezistentní k bakteriofágům a mohou tak bez problémů dokončit fermentaci. Je prokázáno, že časté vystavení opakovaně propagovaných směsných kultur různým bakteriofágům zajistí přirozeně a efektivně fágovou odolnost. Navzdory jejich jasným pozitivním vlastnostem ani směsné kultury nejsou bez problému. Kvalita výsledných výrobků může značně kolísat a doba pro fermentaci také. U výrob v menším rozsahu, kde je na produkci více času tato skutečnost nemusí znamenat závažnou komplikaci. Zatímco u velkoobjemových výrob, kde je očekáváno dodržení výrobní doby a konzistentní kvality výrobku je použití směsných kultur z těchto důvodů méně obvyklé.

3.3.5

Definované startérové kultury

Kultury, které jsou velmi dobře mikrobiologicky a biochemicky definovány, nyní v užívání pro výrobu fermentovaných potravin převažují. Definované kultury mohou být tvořeny jen jedním určitým druhem, nebo jsou kombinací více druhů nebo kmenů. Původ daných kmenů, které jsou komerčně používány, se liší. Některé pochází z tradičně používaných směsných kultur a jiné byly izolovány z přírodních zdrojů. V případě zákysových kultur pro mléčné výrobky jsou dobrým zdrojem zástupci mikroorganizmů osidlující prostředí související s produkcí mléka a sýrů. V případě výroby vína je vhodným zdrojem pro izolaci kvasinek mikroflóra bobulí hroznů a případně i vybavení pro výrobu fermentovaného nápoje. Vybrané kmeny pak musí být identifikovány a charakterizovány na základě relevantních metabolických a fyziologických vlastností, fágové rezistence a ostatních kladených požadavků. Pro plísňové startéry je důležitá bezpečnost. Esenciálním požadavkem je neschopnost vybraných mikromycet produkovat toxiny. Kromě toho, pokud budeme sestavovat směsnou kulturu, všechny kombinované mikroorganizmy musí být kompatibilní. To znamená, že žádný kmen by neměl produkovat metabolity, které by negativně ovlivňovaly růst ostatních kultur nebo které by inhibovaly další přítomné organizmy a způsobovaly dominanci jen jedné kultury. 29

Kombinací kultur je používáno pro výrobu jogurtových startérů, které vyžadují přítomnost dvou odlišných mikroorganizmů Streptococcus salivarius ssp. thermophilus a Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Mnoho klobásových startérů obsahuje bakteriální druhy Lactobacillus a Pediococcus. Kompatibilní kmeny kultur jsou dávány do směsí, které se liší citlivostí k fágům. Každý kmen je senzitivní/rezistentní k určitým typům fágů, čímž je zajištěno, že v případě infikace jednoho kmene, ostatní kmeny dokončí fermentaci.

3.3.6

Použití startérových kultur

Jsou zde dva základní způsoby, jakými jsou startérové kultury používány. Buď jsou aplikovány do potravin přímo, nebo jsou připravovány postupným pomnožováním (vedením kvasných předstupňů, vedení velkoobjemových tekutých kultur). Zmražené nebo lyofilizované kultury mohou být inokulovány přímo do potravinové matrice (přímé inokulace, „direct-to-vat“ – přímo do tanku). Tento způsob v běžné praxi představuje zavádění pekařských kvasnic, startérových kultur pro výrobu fermentovaných masných nebo fermentovaných mléčných výrobků. V případě zmrazených kultur, jsou kultury v nádobkách bezprostředně před použitím většinou rozmraženy ve studené (a obvykle chlorované) vodě, ale mohou být v některých případech aplikovány přímo. Lyofilizovanými kulturami také můžeme inokulovat přímo. Pro usnadnění hydratace je však někdy vyžadováno roztírání a míchání kultury v nádrži. Některé fermentované potraviny mohou být inokulovány velkoobjemovými tekutými kulturami. Tyto kultury jsou připravovány postupným zvětšováním objemu a celkového počtu buněk startérové kultury o několik řádů (průměrné velikosti tanků se pohybují od 2000 do 4000 litrů). Pro přípravu této kultury mohou být používána speciální média, která vytváří vhodné růstové podmínky pro rozvoj mikroorganizmů. Toto médium obsahuje i fosforečnanové pufry a ostatní činidla, která chrání buňky proti poškození, které může kyselé prostředí napáchat a také proti infekcím způsobeným lytickými bakteriofágy. Shrnutí Mikroorganizmy se v potravinách vyskytují přirozeně jako epifytní mikroflóra surovin, nebo se do nich dostávají v rámci technologického procesu výroby jako kontaminanty. Třetí možností je záměrné přidávání čistých startérových kultur, které má pozitivní vliv např. na chuť, texturu a údržnost výsledného výrobku. Startéry mohou představovat kultury bakterií (bakterie mléčného, propionového, octového kvašení), kvasinek (pivní, vinařské, pekárenské) i plísní (sýry s plísní na povrchu či uvnitř těsta, ušlechtilou plísní porostlé trvanlivé salámy). Pro dosažení požadovaných vlastností fermentovaných potravin jsou většinou startérové kultury kombinovány. Výhoda použití směsných kultur také spočívá ve fágové rezistenci. Dříve nebylo výjimkou užívání nedefinované kultury, nyní, v době velkoobjemových výrob, jsou aplikovány hlavně kultury s jasně definovaným složením a biochemickými vlastnostmi. Důvodem je hlavně požadavek na standardnost výroby a konstantní jakost výrobků. Kontrolní otázky 1. V čem spočívá výhoda používání startérových kultur v procesu výroby potravin? 2. Jaké druhy startérových kultur znáte a kde se využívají?

30

4 Bakterie mléčného kvašení Studijní cíle: Definovat bakterie mléčného kvašení a jejich užití jako startérových kultur ve výrobě potravin. Popsat biochemické znaky a metabolizmus bakterií mléčného kvašení. Klíčová slova: bakterie mléčného kvašení, homo- a heterofermentativní mléčné kvašení, Potřebný čas: 4 hodiny

4.1 Bakterie mléčného kvašení Bakterie mléčného kvašení (BMK) jsou souhrnným označením pro heterogenní skupinu grampozitivních bakterií, které mají společné některé morfologické, metabolické a fyziologické znaky. Název „bakterie mléčného kvašení“ není jako takový oficiálně zahrnut v taxonomii a je pouze nadřazeným pojmem k popsání funkčně a geneticky spřízněných bakterií. Obecnou charakteristikou této taxonomicky nesourodé skupiny je, že se jedná o nesporulující, nepohyblivé, fakultativně anaerobní/aerotolerantní tyčinky a koky, které produkují kyselinu mléčnou jako hlavní produkt fermentace sacharidů. Obecné charakteristiky BMK jsou: grampozitivita; fermentatorní typ metabolizmu; kataláza negativní; oxidáza negativní; netvoří spóry; nízký obsah G+C v genomu; nepohyblivost; tolerance ke kyselému pH. Z hlediska jejich požadavků na dostupnost uhlíku a energie jsou klasifikovány jako heterotrofní chemoorganotrofové, což znamená, že pro stavbu vlastních struktur získávají uhlík z organických zdrojů a vyžadují ho i jako zdroj energie. BMK jsou popisovány jako skupina bakterií poměrně náročných na kultivační podmínky. Mnoho druhů roste jen na nutričně bohatých, hojně fortifikovaných mediích za optimálních podmínek. Existují mezi nimi ale i výjimky, které dokážou růst i za méně příznivých podmínek, které se mohou nacházet ve fermentovaných potravinách (zvláště velmi nízké pH). To se odráží v odlišnosti zastoupení BMK v rostlinném materiálu, mléce, mase, ale také solných lácích/nálevech a alkoholizovaném prostředí. BMK lze rozdělit podle způsobu fermentace sacharidů do dvou skupin na: 

Homofermentativní, které využívají výhradně Embden-Meyerhof-Parnasovu (EMP) dráhu tedy glykolýzu a přeměnu pyruvátu na laktát, který je hlavní produkt za standardních podmínek.



Heterofermentativní, u nichž jsou sacharidické substráty odbourávány přes6fosfoglukonátovou/fosfoketolázovou dráhu (6-PG/PK) za vzniku dalších produktů (etanol, acetát a CO2) nejen kyseliny mléčné.

Různé růstové podmínky pak mohou u některých BMK významně ovlivnit konečný produkt fermentace. Tyto změny mohou být přisuzovány variabilitě metabolizmu pyruvátu a/nebo mohou být dány využitím externích elektronových akceptorů jako je např. kyslík v obou aerobních i anaerobních modech, či jiných (anorganických) složek. Konkrétněji lze vliv přítomnosti kyslíku na

31

metabolizmus fakultativně anaerobních mikroorganizmů označit jako Pasteurův efekt nebo nadřazeným pojmem kyslíkový efekt.

4.2 Taxonomie bakterií mléčného kvašení Rody Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus a Stretococcus tvořily historické jádro BMK. Taxonomické revize těchto rodů založené na metodách molekulární biologie a charakterizace nových rodů zapříčinily, že v rámci širší fyziologické definice by skupina BMK mohla zahrnovat více než 20 rodů. Avšak z hlediska technologické praxe můžeme do této skupiny zařadit následující rody: Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, a Weissella. Došlo k diverzifikaci mnoha rodů, kdy byly nové rody vyčleněny z již existujících a zahrnují pak dokonce jeden či více druhů. Například Lactococcus a Enterococcus byly klasifikovány jako Streptococcus skupiny N a skupiny D. Weissella a Oenococcus byly zase vyselektovány z rodu Leuconostoc. Rod Bifidobacterium, často považovaný za BMK, sice disponuje některými typickými znaky, avšak není fylogeneticky příbuzný a disponuje originálním způsobem fermentace sacharidů. Všechny BMK můžeme zařadit do kmene Firmicutes, řádu Lactobacillales. Z hlediska 16S r-RNA sekvencování a jiných technik molekulární genetiky, mohou být BMK seskupeny pod fylogenetický klastr, který je blízký ostatním grampozitivním bakteriím s nízkým obsahem G+C v genomu (Obr. 1).

Obr. 1 Fylogenetický strom vybraných zástupců BMK získaný na základě podobnosti ribozomálních proteinů 16s rRNA. (Hutkins, 2006)

32

BMK můžeme rozdělit z hlediska morfologie na tyčinky (Lactobacillus, Carnobacterium) a koky (všechny ostatní rody). Výjimkou je rod bakterií Weissella, který je prvním rodem ze skupiny BMK, jež zahrnuje obojí tedy jak tyčinky, tak i koky. Klíčovou charakteristikou, která se používá v diferenciaci koků, je dělení ve dvou na sebe kolmých rovinách, což vede k tvorbě tetrád. Velmi důležitou charakteristikou, dle které můžeme rody BMK dělit, je již zmíněný způsob fermentace glukózy za standardních podmínek, podle růstových faktorů (aminokyseliny, vitamíny a prekurzory nukleových kyselin) a limitované dostupnosti kyslíku. Na základě těchto podmínek můžeme BMK soustředit do dvou skupin: na homofermentativní, které přeměňují glukózu na kyselinu mléčnou a na heterofermentativní, které zkvašují glukózu na kyselinu mléčnou, etanol/kyselinu octovou a na CO2. Leukonostoky, oenokoky, weisselly a podskupiny laktobacilů jsou heterofermentativní. Ostatní skupiny BMK jsou homofermentativní. Růst při různých teplotách a toleranci k přítomnosti NaCl (6,5 %) můžeme chápat také jako nástroj k rozlišení mezi některými koky. Tolerance ke kyselému a alkalickému prostředí může být také rozlišovací znak. Tvorba odlišných izomerů kyseliny mléčné pak může sloužit k odlišení leukonostoků od heterofermentativních laktobacilů. Souhrn všech rozlišovacích znaků na základě fenotypových testů je obsažen v tabulce Tab. 2. Sedm rodů BMK je užíváno přímo pro fermentaci potravin: Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, a Tetragenococcus. Enterococcus sp. se také často vyskytuje ve fermentovaných potravinách (sýr, fermentované salámy, fermentovaná zelenina), kromě pár výjimek není přidáván záměrně. Tab. 2 Rozdílné vlastnosti BMK (upraveno podle Salmien et al., 2004 a Hutkins, 2006) Lbc.

Lac.

Leuc.

Oen.

Tvar buňky

tyčky

koky

koky

koky

Fermentace

homo/heter o ± ± ± ± D, L, DL** Weis.

homo

hetero

hetero

Ped. koky (tetrády) homo

+ ± L Aer. koky (tetrády) homo + + + L

+ ± ± D Carn.

+ + ± ± D Ent.

± ± ± D, L, DL Vag.

tyčky

koky

koky

hetero + L

homo + + + ± + L

homo + ± L

Růst při 10 °C* Růst při 45 °C* Tolerance k 6,5% NaCl* Tolerance k 18% NaCl* Růst při pH 4,4* Růst při pH 9,6* Izomer kys. mléčné Tvar buňky

koloidní

Fermentace Růst při 10 °C* Růst při 45 °C* Tolerance k 6,5% NaCl* Tolerance k 18% NaCl* Růst při pH 4,4* Růst při pH 9,6* Izomer kys. mléčné

homo + ± ± D, L, DL

Str. koky homo + L Tetr. koky (tetrády) homo + + + + L

Lbc.–Lactobacillus, Lac.-Lactococcus, Leuc.-Leuconostoc, Oen.-Oenococcus, Ped.-Pediococcus, Str.-Streptococcus, Weis.-Weisella, Aer.-Aerococcus, Carn.-Carnobacterium, Ent.-Enterococcus, Vag.-Vagococcus, Tetr.-Tetragenococcus. * + pozitivní; - negativní; ± mezidruhová odlišnost **Produkce D-, L-, nebo DL-izomeru kyseliny mléčné lišící se mezi druhy

33

4.3 Metabolizmus mléčných bakterií BMK jsou obligátně fermentatorní a nedokážou získávat energii oxidativním způsobem či respirací. Podstatou metabolizmu BMK je efektivní fermentace sacharidů spojená s fosforylací substrátu. Setkáváme se s dvěma základními mechanizmy odbourávání hexóz (glukózy) – s homo- a heterofermentativním kvašením. To jestli dávají bakterie přednost homo- či heterofermentaci lze rychle rozlišit v médiu obsahujícím glukózu za laboratorních podmínek. Tato detekce souvisí se schopností heterofermentativních mikroorganizmů produkovat oxid uhličitý. V rámci mléčného kvašení je pyruvát generován glykolýzou a jako elektronový akceptor dává vzniknout kyselině mléčné. ATP, které v rámci glykolýzy vzniká, je pak použito pro procesy biosyntézy. BMK obecně disponují velkou kapacitou degradovat různé karbohydráty a s nimi spojené složky. Hlavním produktem odbourávání sacharidů bývá kyselina mléčná (více než 50 % uhlíku pocházejícího ze sacharidu). BMK se adaptují nastaveným podmínkám a mění podle nich metabolizmus. Tento proces pak vede ke vzniku různých produktů. Monosacharidy, disacharidy, aminokyseliny a krátké peptidy jsou transportovány přes membránu různými aktivními systémy, jako jsou primární transporty, sekundární transporty a systém fosfoenolpyruvát-fosfotransferázový systém (PEP-PTS). Systém může být specifický pro jeden typ nebo skupinu podobných molekul a může docházet k transportu proti koncentračnímu spádu, kdy transporty vyžadují energii. Pentózy a hexózy jsou metabolizovány různými cestami. Sukróza, maltóza, laktóza jsou nejdříve hydrolyzovány vevnitř buňky enzymy sukrázou, maltázou, laktázou (β-galaktozidáza) na hexózy. Laktóza fosfát (galaktóza-6-fosfát-glukóza) je hydrolyzována fosfo-β-galaktozidázou za výnosu glukózy a galaktózy-6-fosfátu.

4.3.1

Homofermentativní kvašení

Pro homofermentativní mléčné bakterie jsou hexózy metabolizovány pomocí enzymů EMP dráh (Obr. 3A). Teoreticky, jedna molekula hexózy představuje vznik dvou molekul laktátu. Jeden z klíčových enzymů je aldoláza, která zajišťuje rozdělení fruktóza-1,6-bisfosfátu na dva triózafosfáty, které pak slouží jako substráty pro generování ATP. Výnosnost EMP dráhy jsou 2 molekuly ATP na mol hexózy. Pyruvát podléhá redukci na L- či D-láktát. Více než 90 % substrátu je pak přeměněno na kyselinu mléčnou. Schopnost produkovat specifické izomery kyseliny mléčné (D-; L-; D,L-) je determinována typem laktátdehydrogenázy. Za účelem regenarce NAD+ je pyruvát redukován na laktát za účasti NADH. Hexózy jiné než glukóza, jako je např. galaktóza, fruktóza jsou fermentovány mnohými BMK. Tyto hexózy však podstupují další úpravy, než jsou odbourávány v EMP dráze. Galaktóza nejdříve přechází na galaktóza-1-fosfát, pak na glukóza-1-fosfát. Z glukóza-1-fosfátu pak konečně přechází na glukóza-6-fosfát pomocí Leloirovy dráhy (Obr. 2). Leloirova dráha představuje následující proces: Galaktóza-6-fosfát je první přeměněn na tagatózu-6-fosfát, pak na tagatózu-1,6-difosfát, který je následně hydrolyzován na dva známé triózafosfáty EMP dráhy – glyceraldehyd-3-fosfát a dihydroxyacetonfosfát. Tagatóza je stereoizomer fruktózy, ale i tak jsou vyžadovány pro její metabolizmus odlišné enzymy.

34

Obr. 2 Metabolizmus galaktózy u BMK (Adams a Moss, 2008)

4.3.2

Heterofermentativní kvašení

Heterofermentativní BMK metabolizují hexózy pomocí 6-fosfoglukonát/fosfoketolázové dráhy (6PG/PK) (Obr. 3 B) nebo taky hexóza monofosfátové dráhy. Heterofermentativní BMK produkují ekvimolární množství laktátu, etanolu/acetátu, CO2 s energetickým výnosem jednoho molu ATP za hexózu. Postrádají aldolázu a místo toho disponují fosfoketolázou. Tyto mikroorganizmy přeměňují hexózu (glukózu) na pentózu pomocí procesu zahrnujícího oxidaci a dekarboxylaci. Vzniklá pentóza je pak štěpena na glyceraldehydfosfát a acetylfosfát pomocí enzymu fosfoketolázy. Triozafosfát je pak přeměněn na laktát stejným postupem jako u glykolýzy. Oxidace NADH a udržení rovnováhy NADH/NAD+ je uskutečňováno pomocí dvou redukčních reakcí katalyzovaných acetaldehyd dehydrogenázou a alkohol dehydrogenázou. Konečný produkt je pak uvolněn do prostředí. Některé BMK (druhy rodu Leuconostoc a skupina III Lactobacillus může fermentovat různé pentózy pentózafosfátovou dráhou za účelem produkce ATP, laktátu, acetátu, protože disponují fosfoketolázou. Ve skupině II Lactobacillus je produkce enzymu indukována jen tehdy, když je v prostředí pentóza. Pentózy jsou fosforylovány a přeměny na ribulóza-5-fosfát nebo xylulóza-5fosfát pomocí epimeráz nebo izomeráz. Tyto složky mohou být pak metabolizovány z menší části 6-PG/PK dráhou. Obecně produkty, které vznikají během tohoto procesu dvou odlišných cest a jejich výtěžek, se může lišit v závislosti na typu a koncentraci substrátů, teploty růstu, atmosférických podmínkách a růstové fáze buněk. Nějaká část uhlíku z uhlovodanů je inkorporována do buněčné hmoty. Bylo ale také sledováno, že homofermentativní laktokoky za určitých podmínek, jako jsou limitace sacharidických substrátů nebo aerobióza, se mohou odklonit od konečného produktu laktátu k jiným vzniklým substancím jako je např. acetát, CO2. Tato tzv. heterofermentativní mléčné kvašení může poskytovat buňkám dodatečné ATP nebo sloužit jako způsob vzniku pyruvátu (Obr. 3B).

35

4.3.3

Metabolické kategorie BMK

Na základě typických schémat fermentace sacharidů výše zmíněných BMK je možné je rozdělit povšechně do tří metabolických kategorií viz.Tab. 2Tab. 3. První kategorie zahrnuje laktobacily a specifické druhy rodů, které jsou obligátně homofermentativní. Tedy těch, kteří sacharidy fermentují přes glykolýzu. Druhou kategorií jsou leukonostoky a třetí kategorií laktobacily, oenokoky, weisselly, které jsou obligátě heterofermentativní, což v konečném důsledku znamená, že jedinou dostupnou cestou fermentace je 6-PG/PK dráha. Třetí kategorie zbývajících BMK (např. skupina II laktobacilů a většina druhů enterokoků, laktokoků, pediokoků, streptokoků a tetragenokoků, či vagokoků) jsou takovou „meziskupinou“. Tyto BMK jsou homofermentativní s ohledem na hexózy a heterofermentativní v souvislosti s pentózami a ostatními substráty. Můžeme se proto u nich setkat s označením fakultativně heterofermentativní. Tab. 3 Fermentace monosacharidů některými startérovými kulturami rod Lactococcus Streptococcus Pediococcus Leuconostoc

sacharidy hexózy hexózy hexózy hexózy pentózy

mléčné kvašení homofermentativní homofermentativní homofermentativní heterofermentativní heterofermentativní

dráha EMP EMP EMP 6-PG/PK PP

Lactobacillus skupina I Lactobacillus skupina II

hexózy

homofermentativní

EMP

hexózy pentózy

heterofermentativní heterofermentativní

EMP PP

Lactobacillus skupina III

hexózy pentózy

heterofermentativní heterofermenetativní

6-PG/PK PP

hlavní produkt laktát laktát laktát laktát, CO2, acetát/etanol (1:1:1) laktát laktát laktát, acetát/etanol (1:1) laktát, CO2, acetát/etanol (1:1:1)

dráhy: EMP = Embden-Meyerhof-Parnass; 6-PG/PK = 6-fosfoglukonát/fosfoketolázová dráha; PP = pentóza fosfátová dráha

36

A

B B

Obr. 3 Heterofermentativní mléčné kvašení, fosfoketolázová dráha

4.3.4

Konverze pyruvátu uskutečňované bakteriemi mléčného kvašení

Pyruvát si drží klíčovou pozici v mnoha fermentačních procesech, kde působí jako elektronový nebo vodíkový akceptor. Jako důsledek BMK užívají alternativní cesty pro utilizaci pyruvátu, než je jen redukce na laktát. Přičemž ne všechny kroky jsou užívány v rámci jednoho kmene, ale představují reakce využívané obecně skupinou BMK. Odlišné druhy používají různé metabolické cesty v závislosti na podmínkách a enzymové kapacitě. Některé z těchto reakcí mohou být funkční i v rámci normální glukózové fermentace, ale mohou sloužit jako anabolické děje. Například tvorba acetyl-CoA může být žádána pro biosyntézu lipidů. Cesty vedoucí k diacetylu (aroma másla) a acetoin/2, 3-butandiolu jsou u BMK běžné a velmi technologicky významné. Avšak k tomuto metabolizmu významněji dochází jen tehdy, pokud je v buňce přebytek pyruvátu vzhledem k regeneraci NAD+. Přebytek pyruvátu pak může vzniknout dvojím způsobem: a) jako zdroj pyruvátu slouží růstové médium (jiného, než přítomného v podobě zkvasitelných cukrů), b) jiná složka působí jako elektronový akceptor, tak šetří pyruvát tvořený v rámci fermentace sacharidů. Jinou kategorií pyruvátového metabolizmu je pyruvát-formiát lyázový systém. Pyruvát-formiát lyáza katalyzuje reakci pyruvátu a koenzymu A na formiát a acetyl-CoA. Vzniklý acetyl-CoA pak může být uplatněn jako akceptor elektronů při produkci etanolu. Systém je operativní u různých druhů BMK, avšak tento lyázový systém je aktivní jen anaerobně, protože využívá enzymy extrémně citlivé na přítomnost kyslíku.

37

4.3.5

Metabolizmus dusíku uskutečňovaný bakteriemi mléčného kvašení

Jako mnoho bakterií i BMK jsou neschopné asimilovat anorganický dusík. Z těchto důvodů jsou závislé na aminokyselinách přítomných v kultivačním médiu. Požadavky na přítomnost aminokyselin se liší mezi druhy a i mezi kmeny jednoho druhu. Tím, že potraviny jako takové obsahují primárně málo volných aminokyselin, BMK musí být schopné degradovat proteiny a dlouhé peptidy, aby pak mohly uvolněné aminokyseliny případně malé peptidy uvolněné během proteolýzy transportovat a utilizovat. Mnoho BMK užívá během fermentace potravin aktivní transportní systémy (transport aminokyselin a malých peptidů do 8-10 aminokyselinových zbytků). Velké peptidy a metabolizovatelné proteiny jsou nejdříve hydrolyzovány pomocí proteináz a peptidáz, které jsou většinou lokalizovány v buněčné stěně. Pak dochází povětšinou k aktivnímu transportu připravených substrátů dovnitř buňky. Uvnitř buňky jsou pak peptidy rozloženy na příslušné aminokyseliny a aminokyseliny jsou dále různými cestami metabolizovány na odpovídající produkty. Ty jsou následně uvolněny do prostředí. Všechny mléčné laktokoky, které jsou užívány pro okyselení mléka (např. v mléčné výrobě), disponují proteolytickou aktivitou. Systém pro utilizaci kaseinu v BMK zahrnuje tedy tři hlavní kroky. Prvním krokem je, že je kasein hydrolyzován proteinázami na peptidy. Dalším krokem je transport peptidů do buňky pomocí peptidových transportních systémů. A konečným krokem je hydrolýza peptidů intracelulárními peptidázami za uvolnění aminokyselin. Mléčný kasein je hydrolyzován proteinázami vázanými na buněčnou stěnu za vzniku oligopeptidů. Tyto oligopeptidy jsou transportovány skrze membránu pomocí oligopeptidového transportního systému. Intracelulární oligopeptidy jsou pak hydrolyzovány cytoplazmatickými peptidázami za tvorby aminokyselin. Některé z metabolických procesů aminokyselin zahrnují dekarboxylaci (produkci biogenních aminů, které mohou být biologicky aktivní), deaminaci, oxidativní redukci a anaerobní redukci. Výsledkem aminokyselinového metabolizmu u BMK a bakterií s nimi spřízněnými během fermentace mohou být různé produkty. Některé z nich představují např. amoniak, sulfan, aminy, merkaptany, disulfidy. Mnoho z těchto látek (v malých koncentracích) přispívá k žádoucí chuti fermentovaných potravin. Řádná hydrolýza proteinů z potravin proteolytickými enzymy startérové mikroflóry je důležitý pro kýženou texturu mnoha fermentovaných potravin (jako je např. sýr). Rychlá hydrolýza proteinů ale může vyústit v produkci specifických hydrofobních peptidů, které se podílejí na hořké chuti výrobku.

4.4 Další metabolická aktivita BMK Přestože metabolizmus sacharidů a mléčná fermentace zejména jsou stěžejní ve výrobě většiny mléčně kvašených potravin i ostatní metabolické procesy jsou důležité. 4.4.1

Metabolizmus citrátu

Některé druhy BMK mohou fermentovat i citrát. Citrát není používán přímo jako elektronový akceptor, ale funguje jako prekurzor. Zpočátku je citrát transportován pH-dependentními protnmotivními silami, které jsou zprostředkovány citrát permeázami. Základním krokem je štěpení citrátu na acetát a oxalacetát. Acetát je uvolněn přímo do média, zatím co oxalacetát je dekarboxylován za vzniku pyruvátu a CO2. Koncentrace pyruvátu však může způsobit kromě redukce kapacity laktát dehydrogenázy 38

glykolytickou překážku díky nedostatku NADH. Proto je přebytek pyruvátu odstraněn dekarboxylací. Produkt acetaldehyd thiamin pyrofosfát kondenzuje s jinou molekulou pyruvátu za vzniku α-acetolaktátu, který je přeměněn na diacetyl s uvolněním CO2. Diacetyl je důležitou senzoricky aktivní látkou v mnoha fermentovaných mléčných výrobcích, která dodává máslu jeho typické aroma. Za redukčních podmínek může být diacetyl přeměněn na acetoin, což způsobí ztrátu žádané chuti mléčného výrobku.

4.4.2

Malolaktická fermentace

BMK mohou dekarboxylovat kyselinu L-jablečnou za vzniku L-laktátu v reakci známé jako malolaktická fermentace známá též jako jablečno-mléčné kvašení. D forma se této dráhy neúčastní. Malolaktická fermentace je uskutečňována specifickými druhy a kmeny BMK. Komerční startérové kultury, které jsou schopné tohoto metabolizmu, spočívají hlavně v Oenococcus oeni. Tento proces je spojen s vínem, kde jablečná kyselina může představovat až polovinu celkového obsahu kyselin a podporovat nežádoucím způsobem kyselost vína. Dříve se předpokládalo, že malolaktická fermentace zahrnuje dvě oddělené reakce, které představují dekarboxylaci malátu NADdependentní dekarboxylázou za výnosu pyruvátu a redukovaného NADH. V druhé reakci pak pyruvát slouží jako elektronový akceptor za vzniku kyseliny mléčné. Jednoznačný vliv malolaktické fermentace je ten, že kyselina jablečná (dikarboxylová kyselina) je přeměněna na kyselinu mléčnou (monokarboxylovou), čímž logicky dochází ke snížení kyselosti vína (k tzv. odkyselení). Některé BMK jako např. Enterococcus faecalis and Lactobacillus casei umí využívat malát jako jediný zdroj energie. NAD dependentní enzym katalyzuje dekarboxylaci malátu na pyruvát a CO 2. Pyruvát je následně přeměněn na acetát, etanol a CO2 za uvolnění ATP.

4.4.3

Metabolizmus lipidů

Mnoho startérových bakteriálních kultur nedokáže dostatečně metabolizovat lipidy. Triglyceridy a fosfolipidy jsou hydrolyzovány mimo buňku extracelulárními lipázami. Rozkladem triglyceridů a fosfolipidů vznikají glyceridy (mono- a diglyceridy) a glycerol. Mastné kyseliny mohou difundovat přes membránu do buňky a jsou následně metabolizovány. Přičemž některé mastné kyseliny jsou inkorporovány do membrány samotné. Hydrolýzou glyceridů, zvláště těch s nízkouhlíkatými mastnými kyselinami jako je např. kyselina máselná, která může způsobovat hydrolytické žluknutí výrobků.

4.5 Antimikrobiální aktivita bakterií mléčného kvašení Schopnost BMK produkovat antimikrobní látky byla využívána již po staletí, jako metoda k prodloužení údržnosti potravin. Fermentací dochází k redukci dostupných karbohydrátů a vznikajíorganické molekuly o nízké molární hmotnosti, které prokazují antimikrobní účinek. Nejčastěji se jedná o kyselinu mléčnou, octovou a propionovou. Kromě produkce těchto primárních inhibičních metabolitů mohou vznikat i další antimikrobiální látky závislé na druhu BMK. Tento jev může být chápán jako forma amenzálizmu, což znamená, že se jedná o získání konkurenční výhody nad jinými přítomnými mikroorganizmy.

39

Hlavní faktory, které mohou přispět k inhibici a vytvořit tak konkurenční výhodu mikroorganizmu, jsou: organické kyseliny, nízkomolekulární antimikrobní látky, bakteriociny, hydrogen peroxid, etanol, diacetyl, vyčerpání živin, nízký redoxpotenciál. Slabé kyseliny mají větší antimikrobní aktivitu při nižším pH.Velmi podstatná je produkce kyseliny mléčné a octové, které významně snižují pH. Z těchto dvou kyselin je silnějším inhibitorem kyselina octová, která inhibuje jak mikromycety (kvasinky, plísně), tak i bakterie. Tato silná antimikrobiální aktivita může být vysvětlena vyšší disociační konstantou (v porovnání s kyselinou mléčnou). Antimikrobní účinek nedisociovaných molekul spočívá v disociaci molekul až v cytoplazmě po vstupu přes membránu. Ve studiích se však můžeme dočíst, že se jedná o spolupůsobení disociovaných a nedosociovaných molekul. Kyseliny indukují subletální poškození buněk a zvyšují tak jejich šanci ke ztrátám životaschopnosti. Některé kmeny Lactobacillus reuteri, které se vyskytují v gastrointestinálním traktu člověka a lidí, produkují nízkomolekulární látku zvanou reuterin (3-hyroxypropanal). Pomocí dehydratace glycerolu, Lb. reuteri produkuje 3-hydroxypropanal. Reuterin je však tvořen jen tehdy, když je v prostředí dostatek glycerolu, jehož přídavek do potravin je legislativně limitován. Reuterin působí zvláště proti grampozitivním a gramnegativním bakteriím, kdy účinkuje hlavně proti sulfhydryl enzymům. Ostatní nízkomolekulární antimikrobní substance jsou reutericyklin, který je produkovaný některými kmeny Lbc. reuteri a pyroglutamová kyselina produkovaná Lactobacillus casei ssp. casei a Lactobacillus casei ssp. pseudoplantarum. Další formou bakteriálního antagonizmu je produkce bakteriocinů. Bakteriociny jsou baktericidní peptidy nebo proteiny, které jsou úzce spřízněny s produkujícím organizmem. Tyto složky jsou ribozomálně syntetizovány. Bakteriociny mohou být považovány za antibiotika, ale v mnohém se od antibiotik liší. Na rozdíl od antibiotik jsou: a) bakteriociny jsou ribozomálně syntetizovány b) hostitelské buňky jsou vůči nim imunní c) jejich systém aktivity je odlišný od antibiotik d) nejsou širokospektré, dokážou inhibovat jen určitou skupinu mikroorganizmů. Z hlediska chemického jsou bakteriociny kationické, amfipatické, mají strukturu α-helixu nebo β-hřebene (případně obojí). Jsou to thioétery s dvojnými disulfidovými můstky nebo volnými thiolovými skupinami. Zatím není dokázáno, že by bakteriociny produkované grampozitivními bakteriemi měly nějaký účinek na gramnegativní mikroflóru bez přídavku membránově aktivní látky, která antimikrobní účinek podpoří. Bakteriociny mohou být ale aplikovány jako cílové léky proti specifickým patogenům, aniž by byla narušena žádoucí mikroflóra. V rámci BMK bylo zjištěno mnoho bakteriocinprodukujících kmenů. Schopné produkovat bakteriociny jsou např. některé kmeny druhů: Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Lactobacilllus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus sakei, Lactobacillus curvatus, Leuconostoc mesensteroides, Leuconostoc carnosum, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus parvulus, Tetragenococcus halophilus, Carnobacterium pisciocola, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium. Bakteriociny produkované BMK mohou být pak rozděleny do čtyř základních skupin:    

I, lantabiotika; II, malé tepelně stabilní peptidy; III, velké tepelně labilní proteiny a IV, bakteriociny s komplexní strukturou.

Nisin je v současnosti jediný bakteriocin prakticky užívaný v potravinářském průmyslu. Nisin je amfifilní polypeptid obsahující 34 aminokyselinových zbytků a je značně tepelně stabilní. Odolává také nízkému pH. Náleží do skupiny lantibiotik a je produkován některými kmeny rodu Lactococcus lactis. Poprvé byl objeven při komplikacích ve výrobě sýra, kdy Lactococcus lactis bránil rozvoji ostatní startérové mikroflóry. Na rozdíl od jiných bakteriocinů, které jsou produkovány BMK, je nisin širokospektrální, alespoň co se týče boje proti grampozitivním

40

bakteriím. Ve vegetativních buňkách působí tak, že v buněčné membráně vytvoří póry a způsobí tak únik komponent cytoplazmy, čímž oslabí transmembránový potenciál. Některé BMK produkují za aerobních podmínek peroxid vodíku. Nedisponují totiž katalázou (neprodukují ji, pokud nemají v prostředí hem), pseudokatalázou nebo peroxidázou a nejsou tedy schopné vzniklý peroxid odbourat. Uvolňují ho následně do prostředí. Baktericidní účinek peroxidu spočívá ve vysokém oxidačním účinku na bakteriální buňku, kdy jsou oxidovány surfhydrylové skupiny buněčných proteinů a membránové lipidy. Některé kmeny dokážou produkovat za příznačných podmínek dostatečné množství peroxidu, aby zajistily bakteriostatický nebo spíše baktericidní účinek. Za anaerobních podmínek však je množství peroxidu produkované těmito bakteriemi velmi malé. Antibakteriální účinek peroxidu může být posílen díky přítomnosti laktoperoxidázy a thiokyanátu. Syrové mléko právě tyto substance obsahuje. V přítomnosti peroxidu vodíku laktoperoxidáza vytvoří hypothiokyanátový aniont, který při pH mléka dává vzniknout hypothiokyanátové kyselině, která působí jakosilné oxidační činidlo. Tento systém je však inaktivován pasterací mléka. Heterofermentativní BMK jsou schopné produkce etanolu, což může působit opět jako inhibitor ostatních bakterií. V mléčných výrobcích jako takových je ale množství vzniklého etanolu bezvýznamné. Diacetyl je produkován několika kmeny BMK ve větším množství odbouráváním citrátu. Diacetyl je produkován zástupci rodů Lactobacillus, Leuconostoc, Pediooccus a Streptococcus stejně jako jinými organizmy. Jestliže dochází k degradaci hexóz, je přítomen i diacetyl. Přičemž bylo pozorováno, že diacetyl byl produkován efektivněji při pH<7. Jeho antibakteriální aktivita je však omezována přítomností glukózy, acetátu a tweenu 80. Několik studií prokázalo, že je diacetyl účinnější proti gramnegativním bakteriím, kvasinkám a plísním, než proti grampozitivní mikroflóře, kdy BMK byly nejméně senzitivní. Také spolupůsobení tepla a diacetylu vede k podpoření jeho antimikrobní aktivity. Za redukčních podmínek je však diacetyl přeměněn na acetoin a dochází k poklesu antibakteriálního účinku.

4.6

Přínos bakterií mléčného kvašení pro zdraví člověka

Fermentované potraviny jsou považovány již po dlouhý čas jako za zdraví prospěšné. Metchnikoff v roce 1907 poukázal na skutečnost, že metabolity BMK z jogurtu mají blahodárný účinek na gastrointestinální trakt (GIT) a podporují lidské zdraví. Tyto bakterie (zvláště některé kmeny rodu Lactobacillus a Bifidobacterium) jsou méně citlivé ke kyselině v žaludku a žluči, dokonce proti lyzozymu a jiným pankreatickým enzymům přítomným v GIT (konkrétněji v tenkém střevě). Za běžných podmínek tyto bakterie napomáhají udržet rovnováhu osídlení GIT tím, že regulují úroveň růstu nežádoucí mikroflóry. Tento účinek spočívá v tvorbě relativně velkého množství kyseliny mléčné a octové. Kromě toho, dokážou produkovat specifické substance, z nichž některé jsou rozpoznány (viz podkapitola 4.5). Studie prokázaly, že mají tyto bakterie pozitivní dieteticko-léčebný účinek hlavně tehdy, když jsou přítomny ve střevě v relativně vysokém počtu (106-7/g střevního obsahu). Živé kultury BMK (a Bifidobacterium) jsou často označovány za probiotika (viz kapitola 6). Shrnutí BMK jsou taxonomicky heterogenní skupinou, která má ve svých řadách zástupce probiotických mikroorganizmů. Do potravin jsou aplikovány jako startérové kultury zvláště kvůli svým 41

pozitivním účinkům vyplývajícím z jejich metabolické aktivity. Do potravinářských výrobků se tedy aplikují z technologických důvodů (kyselé srážení mléka, okyselení prostředí a prodloužení údržnosti potravin). Dále Pozitivně ovlivňují senzorickou a nutriční hodnotu potravin. Mnohé z nich navíc disponují dieteticko-léčebnými účinky. BMK jsou schopné produkovat řadu antimikrobních látek (slabé kyseliny, bakteriociny, diacetyl, peroxid vodíku, reuterin) a dokážou tak regulovat ostatní přítomnou mikroflóru, ať už se jedná o mikroflóru potravinové matrice, nebo GIT člověka. Kontrolní otázky 1. Které rody můžeme zařadit do BMK? 2. Proč a do jakých skupin dle způsobu fermentace sacharidických substrátů dělíme BMK? 3. Z jakých důvodů jsou BMK aplikovány jako startéry? Vysvětlete jejich technologický význam. 4. Při jakých metabolických procesech vznikají technologicky významné látky? Vyjmenujte konkrétní dráhy. 5. Jaký je rozdíl mezi metabolizmem homo- a heterofermentativních BMK?

42

5 Charakterizace významných zástupců bakterií mléčného kvašení Studijní cíle: Popsat morfologické, metabolické a fyziologické znaky vybraných rodů bakterií mléčného kvašení, které se podílejí na výrobě potravinářských výrobků jako startéry, non-startéry nebo jsou přítomny jako původní mikroflóra. Klíčová slova: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Enterococcus, Oenococcus, Carnobacterium, Micrococcus, Bifidobacterium, Tetragenococcus, Propionibacterium, Pediococcus Potřebný čas: 2 hodiny

5.1 Úvod do problematiky potravinářsky významných bakterií mléčného kvašení Jak již bylo zmíněno v kapitole 4, BMK představují nesourodou skupinu bakterií, které mají společné některé:   

morfologické, metabolické a fyziologické znaky.

BMK zahrnují velkou spoustu bakteriálních rodů, které se v rámci výroby potravin aplikují jako startérové kultury, nebo jsou součástí non-startérové mikroflóry, která se však při výrobě potravin také nemalou měrou uplatňuje. V následujících podkapitolách budou popsány potravinářsky nejvýznamnější rody BMK.

5.2 Rod Lactobacillus Rod Lactobacillus je druhově nejpočetnějším rodem BMK. Skládá se z více než osmdesáti druhů. Zahrnuje druhy s různými fenotypovými, biochemickými a fyziologickými vlastnostmi. Heterogenita se projevuje širokou variabilitou obsahu guaninu a cytozinu v genomu. Tento rozsah je 32-55 %. Laktobacily jsou grampozitivní tyčinkovité bakterie, nepohyblivé, nesporulující, fakultativně anaerobní. Liší se morfologicky, v růstových a metabolických charakteristikách. Buňky mohou mít tvar od kratších tyčinek (kokotyčky) po protáhlé dlouhé, štíhlé, středně silné, rovné nebo zahnuté tyčinky. Morfologie kolonií při růstu na agarových plotnách se také mnohdy liší. Některé druhy vytvářejí rozsáhlé okrouhlé kolonie, zatímco jiné naopak malé a nepravidelné. Jak již bylo zmíněno v předešlé kapitole (viz kapitola 4), jsou laktobacily klasifikovány podle různých ukazatelů. Nejčastěji jsou děleny podle způsobu fermentace sacharidů, konfigurace produkované kyseliny mléčné, hydrolýzy argininu, nebo podle růstových požadavků (růst při různých teplotách; mezofilní/termofilní kultury). Tyto charakteristiky jsou stále užitečné. Avšak detailnější klasifikace vyžaduje analýzu peptidoglykanu, stanovení zastoupení GC v molekule DNA a DNA-DNA homologiické studie. Odlišné PCR metody a přímé sekvencování PCR fragmentů

43

(např. r-RNA genů) také nabízejí možnosti rychlé obecné identifikace a klasifikace laktobacilů a BMK (viz kapitola). Laktobacily jsou ubikvitně rozšířené v přírodě a mnoho druhů má uplatnění v průmyslu. Kromě opravdu extrémních podmínek prostředí, najdeme jen pár míst, kde laktobacily nejsou schopny růst. Některé druhy osidlují rostliny, rostlinné materiály a jsou často přítomny v mléku a mase, v džusech, fermentovaných nápojích, v zrninách a cereálních výrobcích. Jejich přítomnost v GIT zvířat a lidí vedla k tomu, že je jim přisuzována probiotická aktivita (viz kapitola 6). V potravinách jsou laktobacily zapojeny do mnoha technologicky důležitých fermentací. Bohužel stejně tak mohou být tyto bakterie spojovány s kažením potravin (fermentovaných i nefermentovaných). Schopnost laktobacilů růst a odolávat různým podmínkám poukazuje na odlišnou fyziologickou diverzitu. Můžeme zde najít mnoho mezofilních druhů, ale často jsou v rámci jednoho rodu i druhy psychrofilní nebo termofilní. Laktobacily mají tedy velký rozptyl teplot, za kterých jsou schopné růst (1-50 °C) a optimální teploty nejčastěji dosahují 30-45 °C. Některé druhy ukazují vysokou toleranci k NaCl, osmotickému tlaku a nízké vodní aktivitě. Při jejich růstu v souvislosti s jejich metabolity je pH redukováno na 3,5 až 5,0. Tolerance k nízkému pH je typickým rysem pro laktobacily (mnoho druhů preferuje kyselé prostředí), některé jsou také etanol tolerantní nebo dokážou odolávat žlučovým kyselinám. Pro některé druhy laktobacilů jsou důležité striktně anaerobní podmínky. Jako všechny BMK, mají laktobacily fermentatorní metabolizmus. Jejich metabolity se však mohou značně lišit. Na základě obecného vzorce odbourávání odbourávání hexóz a pentóz mohou být druhy laktobacilů rozděleny do tří skupin (viz Tab. 4). Tab. 4 Rozdělení rodu Lactobacillus podle způsobu fermentace Charakteristika mechanizmus fermentace sacharidů*

Skupina 1 obligátně homofermentativní

konečný produkt fermentace sacharidů

laktát

fermentace pentóz přítomnost FDP aldolázy** přítomnost fosfoketolázy předchozí označení zástupci rodu (druhy)

+ Thermobacterium Lb. acidophilus Lb. delbrueckii Lb. helveticus Lb. salivarius Lb. jensenii Lb. crispatus Lb. amylovorus

Skupina 2 fakultativně heterofermentativní jen laktát nebo laktát, acetát, CO2, ethanol, formiát + + +*** Streptobacterium Lb. casei Lb. paracasei Lb. curvatus Lb. plantarum Lb. sakei Lb. alimentarius Lb. bavaricus

Skupina 3 obligátně heterofermentativní laktát, acetát, etanol, CO2 + + Betabacterium Lb. brevis Lb. buchneri Lb. fermnetum Lb. divergens Lb. reuteri Lb. kefiri Lb. sanfranciscensis

* viz podkapitola 4.3; ** fruktóza-1,6-difosfát aldoláza; *** indukovatelná pentózami

Podle výše uvedené tabulky (Chyba! Nenalezen zdroj odkazů.), skupina laktobacilů 1 fermentuje hexózy (ale také disacharidy laktózu a sukrózu) převážně za vzniku kyseliny mléčné. Zástupci této 44

skupiny nejsou schopni metabolizovat pentózy (např. ribózu, xylózu, arabinózu). Ve skupině fakultativně heterofermentativních druhů (skupina 2) výsledné produkty odbourávání závisí na sacharidech a dostupných množství sacharidů. Skupina 3 zkvašuje sacharidy na směs laktátu, acetátu, etanolu a CO2. Výše uvedené skupiny mohou být dále děleny podle dalších biochemických vlastností. Navzdory metabolické diverzitě jsou všechny laktobacily obecně náročné na kultivační prostředí a mnoho z nich vyžaduje nutričně bohatá média. Laktobacily nejsou nijak zvlášť proteo- a lipolytické. Přítomnost aminokyselin, peptidů, mastných kyselin je obvykle kvitována pro jejich rychlejší růst. Některé kmeny jsou zvláště náročné a vyžadují dodávku vitamínů, nukleotidů a jiných nutrientů. Laktobacily vyžadují v prostředí i zkvasitelné sacharidy. Jsou schopny metabolizovat poměrně široké spektrum sacharidů a nejen těch „obvyklých“ (glukóza, fruktóza, laktóza), ale i rostlinami generované deriváty sacharidů jako celobiózu, amygdalin, trehalózu aj. Některé druhy dokonce fermentují škrob. Když rostou v přítomnosti glukózy (v závislosti na druhu), produkují jen izomery kyseliny mléčné (L(+), D(-)/DL) nebo směs kyseliny mléčné, etanolu, octové kyseliny a CO2. Některé uvolňují do růstového prostředí diacetyl. Velký počet druhů laktobacilů má význam pro fermnetované potraviny. Některé jsou přidávány záměrně jako zákysové kultury, ale mohou být i přirozeně přítomné (endogenní) v surovém materiálu nebo na povrchu přístrojového vybavení a mohou tak přispívat k výrobě a konečnému výsledku fermentovaných potravin. Zákysové kultury laktobacilů jsou primárně užívány při výrobě mléčných výrobků a fermentovaných masných produktů. Jako typické zákysové kultury (pro jogurty a sýry) jsou aplikovány: Lb. helveticus, Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus. Ostatní běžné kultury užívané v mléčných výrobcích zahrnují Lb. casei a Lb. acidophilus (oba druhy jsou často aplikovány jako probiotikum). Starterové kultury pro fermentaci klobás a suchých salámů představují hlavně druhy Lb. plantarum a Lb. sakei ssp. sakei.

5.3 Rod Lactococcus Rod Lactococcus zahrnuje sedm fylogeneticky odlišných druhů: Lactococcus lactis, Lc. garviae, Lc. piscium, Lc. plantarum, Lc. raffinolactis, Lc. fujiensis, Lc. chungagensis. Jen jeden druh (Lc. lactis) je často používaný při výrobě fermentovaných mléčných výrobků. Náleží mezi nejdůležitější BMK, které jsou zapojeny ve fermentaci potravin. Je nejběžněji používanou kulturou pro výrobu většiny tvrdých sýrů a pro mnoho jiných mléčných výrobků prodávaných na celém světě. Lc. lactis má čtyři poddruhy (ssp.): ssp. lactis, ssp. cremoris, ssp. hordinae, ssp. tructae. Však jen ssp. lactis a cremoris jsou aplikovány v potravinářství jako startéry. Lc. lactis ssp. lactis biovar diacetylactis je také aplikován při fermentaci mléka. Laktokoky mají typickou morfologii koků, vyskytují se v párech a v krátkých řetízcích. Jsou nepohyblivé, nesporulující, obligátně homofermentativní, fakultativně anaerobní až mikroaerofilní, s optimální teplotou růstu při cca 30 °C. Obecně rostou nejlépe v rozsahu teplot 20-30 °C. Nejsou však schopny růst v prostředí s 6,5 % NaCl nebo při pH 9,6. Za vhodných podmínek dokážou vyprodukovat v růstovém médiu 1 % L(+) izomeru kyseliny mléčné a výrazně snížit pH na zhruba 4,5. Biovar diacetylactis, v porovnání s ostatními, produkuje poměrně velké množství CO2 a diacetylu z citrátu. Obecně jsou laktokoky schopné hydrolýzy laktózy a kaseinu. Jsou schopny zkvasit galaktózu, sukrózu a maltózu. Obvyklý výskyt laktokoků je na rostlinách, v silážích, v mléčných výrobcích i v syrovém mléce. Lc. lactis ssp. cremoris se odlišuje od Lc. lactis ssp. lactis následujícími charakteristikami: 

růst při 40 °C, 45

  

růst v přítomnosti 4 % (w/v) NaCl, hydrolýza argininu, fermentace ribózy.

Poddruhy lactis a cremoris mohou být samozřejmě rozlišeny i na základě DNA-DNA homologie. Některé plazmidy laktokoků jsou snadno vyměnitelné mezi kmeny pomocí konjugačního transferu a v ostatních případech může být plazmidová DNA integrována do chromozomu za vzniku stabilních a vysoce adaptabilních kmenů. Tyto plazmidy jsou však přítomny hlavně u kmenů laktokoků izolovaných z nemléčných zdrojů.

5.4 Rod Streptococcus Rod Streptococcus obsahuje mnoho odlišných druhů s širokou škálou stanovišť. Zahrnuje také zvířecí a lidské patogeny, komenzály přítomné v ústech a střevech. Jen jeden druh je úspěšně aplikován při výrobě fermentovaných potravin – Streptococcus thermophilus. Obecně jsou streptokoky nepohyblivé, fakultativně anaerobní a mají obligátně homofermentativní metabolizmus. Str. thermophilus je užíván hlavně pro výrobu jogurtů a sýrů. Tím, že je geneticky vysoce příbuzný Str. salivarius (na základě hodnot homologie DNA-DNA, 70 %) někteří autoři navrhovali Str. thermophilus jako poddruh Str. salivarius. Nějaký čas byl dokonce Str. thermophilus označován jako Str. salivarius ssp. thermophilus. Tento návrh byl ale později zamítnut. Nicméně je možné se ještě teď v literatuře setkat s tímto označením. Stejně jako laktokoky je Str. thermophilus vysoce adaptabilní na mléčné prostředí, rychle fermentuje laktózu na L(+) kyselinu mléčnou. V bujónu s glukózou dokáže snížit pH na 4,0. Streptococcus thermophilus má vyšší optimální teplotu růstu (40-42 °C). Maximální tolerovatelná teplota je pak o poznání vyšší 52 °C. Buňky jsou schopné přežít dokonce teplotu 60 °C, avšak jen po dobu 30 min. Požadavky na růstové prostředí jsou vyšší než u laktokoků. Zvláště díky tomu, že je Streptococcus slabě proteolytický a proto potřebuje v růstovém prostředí volné aminokyseliny. Fermentuje fruktózu, manózu, ale obecně není schopen zkvasit galaktózu a sukrózu.

5.5 Rod Enterococcus Enterokoky jsou bakterie, které mají význam jak v prostředí, v potravinách, tak v klinické mikrobiologii. Jedná se opět o ubikvitní mikroorganizmy, které se ovšem nejvíce vyskytují v GIT teplokrevných živočichů – zvířat a lidí. Jsou to přirozené kontaminanty masa, které se do něj dostávají z GIT v době porážky. Enterokoky jsou také technologicky významné a záměrně přidávané kultury pro výrobu různých fermentovaných potravin, jako jsou např. sýry. Schopnosti těchto bakterií růst při nízkém pH a vysokých koncentracích soli je činí technologicky významnými při výrobě nejen sýrů, ale i masných výrobků. Některé druhy, konkrétně Enterococcus faecalis (dříve Streptococcus faecalis), může být považován za oportunisticky patogenní a tudíž nežádoucí v potravinách. Důvodem může být i náchylnost fekálních enterokoků přenášet rezistenci na antibiotika, možný výskyt virulentních faktorů a jejich role v onemocněních člověka. Enterococcus faecium (dříve Streptococcus faecium) a Enterococcus faecalis jsou naopak používány jako probiotika a jako inokuláty pro siláže. Tento dvojí význam enterokoků je činí současně žádoucími i nežádoucími. Zástupci rodu Enterococcus, stejně jako Streptococcus a Lactococcus, jsou kataláza negativní, grampozitivní koky, které vytvářejí páry a krátké řetízky. Endospóry se v tomto rodě nevyskytují.

46

Bakterie rodu Enterococcus jsou nepohyblivé s výjimkou Ent. gallinarum a Ent. casseliflavus. Některé kmeny mají žlutý pigment. Všichni enterokokové jsou fakultativně anaerobní chemoorganotrofové s fermentatorním metabolizmem. Jsou schopni homofermentativní mléčné fermentace za vzniku L(+) kyseliny mléčné jako hlavního produktu odbourávání glukózy. Mnoho druhů enterokoků (Ent. durans, Ent. faecalis, Ent. faecium, Ent. gallinarum, Ent. hirae, Ent. mudtii) může být snadno rozlišeno od ostatních grampozitivních, kataláza negativních, homofermentativních koků díky jejich schopnosti růst při teplotách 10-45 °C, při pH 9,6, v přítomnosti 6,5 % (w/v) NaCl nebo 4,0 % žluči. Některé izoláty enterokoků dokážou produkovat bakteriociny. Bakteriociny enterokoků jsou obvykle označovány jako enterociny a obecně prokazují antagonistický účinek proti listeriím. Poměrně velký počet enterokoků (včetně těch řazených k BMK) má potenciál tvořit během fermentace biogenní aminy (BA). Jako výsledek metabolické aktivity dekarboxyláza pozitivních kmenů dokážou vyprodukovat vysoké koncentrace BA, zvláště pokud jsou v prostředí bohatém na proteiny, jako je např. maso nebo mléko. Požití vysokých koncentrací histaminu a tyraminu pak může vést k alergickým reakcím nebo způsobit intoxikaci organizmu konzumenta. V rámci BMK jsou enterokoky poměrně často spojovány s produkcí tyraminu (viz kapitola 8).

5.6 Rody Leuconostoc a Oenococcus Rod Leuconostoc náleží do čeledi Leuconostocaceae, která obsahuje blízce příbuzné rody Weissella a Oenococcus. Grampozitivní buňky leukonostoků mají kokoidní tvar někdy připomínající tyčinky v závislosti na složení a formě kultivačního média (tekuté/pevné médium) a vytvářející páry nebo řetízky. Leukonostoky jsou nepohyblivé, nesporulující, katláza negativní fakultativní anaeroby. Rostou optimálně v rozsahu teplot 18-25 °C. Jsou ale schopny růst od 1 do 37 °C. Některé druhy dokonce přežívají při 60 °C avšak jen 30 minut. Leukonostoky jsou obligátně heterofermentativní, což ve výsledku znamená, že odbouráváním sacharidů vzniká heterogenní směs produktů zahrnující D(-) kyselinu mléčnou, kyselinu octovou, etanol, CO2 a redukují pH prostředí na 4,5-5,0. Přítomnost CO2 může být použita i v diagnostice rodu v rámci odlišení leukonostoků od streptokoků, laktokoků a pediokoků. I výše zmíněná schopnost snižovat nepříliš výrazně pH lze použít pro odlišení leukonostoků od homofermentativních laktobacilů a ostatních BMK. Zástupci tohoto rodu osidlují rostliny a rostlinný materiálu (siláže). Najít je můžeme v mléce a syrovém nebo i zpracovaném mase. Některé druhy jsou zapojeny v kažení potravin (např. Ln. gasicomitatum) a jiné se používají záměrně z technologických důvodů (např. Ln. mesensteroides). Leukonostoky rostou v mléce, ale nesrážejí ho. Pokud rostou v prostředí se sukrózou, produkují dextran. Zvláště kmeny, které tvoří polysacharidy, mohou způsobovat kažení některých potravin (nápojů). Leuconostoc produkuje mimo jiné poměrně velké množství diacetylu z citrátu přítomného v mléce. Např. právě zmíněný Ln. mesensteroides ssp. cremoris je právě díky této schopnosti používán při výrobě mléčných výrobků. Leuconostoc hraje poměrně důležitou roli ve spontánním kvašení rostlinných materiálů (výroba kvašeného zelí). Rod Oenococcus byl založen r. 1995 a obsahoval pouze jeden druh Oenococcus oeni. Tato bakterie byla a je i v současnosti spojována s vínem a využívá se v procesu malolaktické fermentace. I když O. oeni sdílí mnoho fenotypových vlastností s leukonostokem (např. heterofermentativní metabolizmus, mezofilní bakterie), některé důležité fyziologické odlišnosti mezi nimi můžeme

47

najít. Buňky O. oeni jsou více acidotolerenantí než bakterie rodu Leuconostoc a jsou schopny zahájit růst v médiu při pH nižším než 5,0. Kromě toho je O. oeni ze všech BMK nejvíce tolerantní vůči etanolu (toleruje v růstovém prostředí až 10 % (v/v) etanolu). Tato schopnost podmiňuje využití oenokoků při fermentaci vína. Nevýhodou může však být pomalý růst a limitovaný rozsah fermentovaných sacharidů.

5.7 Rody Pediococcus a Tetragenococcus Pediokoky jsou podobné ostatním kokoidním, obligátně homofermentativním BMK s jednou výjimkou. Dělení u nich probíhá na dvou k sobě kolmých rovinách a vznikají tetrády. Buňky vytvářejí páry sféricky tvarované. Jednotlivě nebo v řetízcích se nevyskytují. Jsou grampozitivní, nepohyblivé, nesporulující, faktultativní anaerobové s komplexními požadavky na růstové prostředí, jako mají ostatní BMK. Optimální teplota růstu se pohybuje od 25 do 40 °C, ale některé druhy rostou i při teplotě mnohem vyšší (50 °C). Mnoho pediokoků je rozlišováno od ostatních BMK na základě schopnosti tolerovat opravdu nízké pH (pH 4,2) a růst při vysoké koncentraci soli (6,5 %). Pediokoky zkvašují glukózu na L(+) nebo DL kyselinu mléčnou a některé druhy jsou schopny snižovat pH až na 3,6. V závislosti na druhu fermentují i jiné sacharidy např. sukrózu, arabinózu, ribózu a xylózu. Laktózu primárně nezkvašují, ale pokud je v médiu jediným zdrojem uhlíku, mohou některé kmeny tento disacharid hydrolyzovat a využít k zisku energie. Pediokoky můžeme najít na různých stanovištích, které zahrnují rostlinné materiály, mléko, maso, ryby, syrovátku, moč zvířat a pivo. Pediokoky jsou důležité pro výrobu potravin jak v tom pozitivním, tak v negativním slova smyslu. P. damnosus je hlavním původcem kažení piva. Produkuje diacetyl/acetoin, což vyústí v nežádoucí máselnou chuť pivního moku. P. acidilactici a P. pentosaceus jsou aplikovány při výrobě fermentovaných masných výrobků jako startérové kultury, anebo jsou inokulovány do sena při výrobě siláží. Stejné druhy pak bývají přítomny v syrovém rostlinném materiálu, takže hrají roli i při výrobě kvašeného zelí. Pediokoky je možné označit jako non-startérové kultury, nebo jako sekundární kultury při zrání sýra. Jako pediokoky i tetragenokoky jsou homofermentativní, tvoří tetrády a jsou fakultativně anaerobní. Jsou mezofilní a neutrafilní s optimální teplotou růstu mezi 25-30 °C. Optimální pH se pak pohybuje mezi hodnotou 6,5 a 8,0. Všechny druhy jsou charakteristické díky jejich významné toleranci k soli. Nerostou jen v médiu s koncentrací soli nad 25 %. Stejně tak se tetragenokokům špatně roste v médiích bez přídavku soli. Maximální růstové rychlosti dosahují v přítomnosti 3-10 % NaCl. Také se vyznačují dobrým růstem při nízké aktivitě vody, pravděpodobně díky kumulaci betainu, karnitinu a jiných kompatibilních rozpuštěných látekTechnologické uplatnění bakterie rodu Tetragenococcus nacházejí při výrobě fermentovaných potravin s vysokým obsahem soli, jako je např. sojová omáčka.

5.8 Rody Bifidobacterium a Carnobacterium Morfologicky jsou bifidobakterie podobné některým laktobacilům a dříve byly právě zahrnovány do rodu Lactobacillus (Lbc. bifidus). Jsou hlavně přítomny v GIT teplokrevných živočichů a jejich zvýšený obsah v GIT člověka koreluje se zvýšenou odolností organizmu ke střevním infekcím. Bifidobakterie jsou nyní často používány jako probatika a jsou součástí funkčních potravin.

48

Rod Bifidobacterium reprezentují grampozitivní, nepohyblivé a nesporulující tyčinky. Tyto tyčky jsou pleomorfní – různých tvarů (V-, Y-, X-tvary), velikostí a vyskytují se jak samostatně, tak v řetízcích. Bifidobakterie jsou kataláza negativní, většinou striktně anaerobní mikroorganizmy. Avšak stupeň tolerance ke kyslíku se různí „druh od druhu“ a také závisí na kultivačním médiu. Některé tolerují O2 v přítomnosti CO2. Optimální teplota pro rozvoj bifidobakterií izolovaných z GIT člověka je 3638 °C, na rozdíl od zvířecích druhů, které mají o něco vyšší optimální teplotu růstu kolem 41-43 °C. Nerostou při teplotě nižší 20 °C a nejsou termorezistentní, neodolávají běžně teplotě nad 46 °C až na výjimky. B. bifidum zmírá až při 60 °C. Optimální pH růstového prostředí se pohybuje mezi 6,57,0. Při pH pod 5,0 nebo nad 8,0 inhibuje růst bifidobakterií. Co se týče nutričních požadavků bifidobakterií na růstové prostředí, jsou velmi náročné. Fermentují glukózu za produkce kyseliny mléčné a octové v molárním poměru 2:3 bez toho aniž by byl uvolňován CO2. Zkvašují mimo jiné laktózu, galaktózu, některé pentózy a jiné sacharidy včetně nestravitelných oligosacharidů. Druhy rodu Carnobacterium byly původně, stejně jako bifidobakerie, klasifikovány také jako laktobacily (skupina III) pod označením Lb. divergens, Lb. carnis a Lb. piscicola. Pozdější studie ukázaly, že jsou tyto bakterie jodlišné do takové míry, aby vytvořily samostatný rod. Carnobacterium homofermentativně odbourává glukózua roste při relativně vysokém pH (např. pH 9), zatím co laktobacily toho schopné nejsou. Karnobakterie jsou charakteristicky přítomné v mase a masných výrobcích, kde se množí i při nízkých teplotách.

5.9 Ostatní důležité grampozitivní bakterie v potravinách Rod Staphylococcus Stafylokoky jsou grampozitivní sférické bakterie, které vytváří hrozénkovité útvary. Bylo popsáno více než 40 druhů stafylokoků, avšak jen Staphylococcus aureus a Staphylococcus epidermidis vykazuje významné interakce s člověkem. Běžným prostředím stafylokoků je kůže, kožní žlázy a membrány sliznic teplokrevných živočichů. Mnoho druhů je spojeno přímo s hostiteli např. St. hyicus s vepři nebo St. gallinarum s kuřaty. St. aureus je široce rozšířený a vyskytuje se nejčastěji na kůži vyšších primátů. Stafylokoky jsou kataláza pozitivní, oxidáza negativní fakultativní anaeroby. Jejich schopnost fermentovat glukózu za vzniku převážně kyseliny mléčné může být použita pro diagnostiku a odlišení od striktně aerobních mikrokoků. Avšak v obou skupinách mikroorganizmů se vyskytují druhy, pro které toto rozlišení není zcela jasné, jelikož v obou skupinách můžeme zástupce, kteří tvoří jen velmi malá množství kyseliny mléčné. Negativní vlastností některých druhů stafylokoků je produkce enterotoxinů. St. aureus je typická mezofilní bakterie, která je schopna růstu od 7 do 48 °C, přičemž optimální teplotou růstu je 37 °C. Hranice teplot, ve které jsou produkovány enterotoxiny, je podstatně užší. Optimální teplota pro toxikogenezi je 35-40 °C. Vhodné pH pro růst a množení stafylokoků se pohybuje v rozmezí pH 67. Minimální hodnota, ve které dokážou stafylokoky existovat, je pH 4 a maximální pH 9,8-10. Pro S. aureus, který se vyskytuje i v potravinách, je typickou vlastností tolerance k NaCl a nízké vodní aktivitě. Snadno roste v médiu s 5-7 % NaCl a některé kmeny dokonce v prostředí s více než 20 % NaCl.

49

Nízký počet bakterií St. aureus se běžně vyskytuje v mase drůbeže a je přirozenou komponentou kožní mikroflóry živočichů. Stejně tak může být izolován ze syrového mléka, kde ve vyšším počtu signalizuje mastitidu vemene. Jen několik málo druhů se záměrně používá při výrobě potravin (fermentované klobásy). Jedná se hlavně o St. xylosus a St. carnosus. Ve fermentovaných masných výrobcích se však tyto bakterie nepoužívají kvůli mléčnému kvašení, ale kvůli vývoji požadovaného aroma a barvy. Aromatické látky, které se při metabolické aktivitě stafylokoků uvolňují, vznikají hydrolýzou lipidů, proteinů a redukcí dusičnanů na dusitany. Rod Micrococcus Mikrokoky jsou aerobní, grampozitivní bakterie. Koky tohoto rodu bakterií se vyskytují jak v párech, tetrádách, tak ve skupinách, nikoliv však v řetízcích. Jsou kataláza- a často oxidázapozitivní (reakce může být slabá). Na agaru tvoří červeně nebo žlutě pigmentované kolonie a optimální teplota jejich růstu se pohybuje od 25 do 37 °C. Mikrokoky jsou halotolerantní a rostou v přítomnosti 5 % NaCl. Dokážou tolerovat i 10 % NaCl. Můžeme je nalézt v podzemních vodách, v čerstvé vodě a často na pokožce lidí a zvířat. Mikrokoky jsou zapojeny ve zrání sýrů díky jejich proteolytické a lipolytické aktivitě. Ve zvýšené míře se Micrococcus se vyskytuje, zvláště díky jeho schopnosti existovat při nízké vodní aktivitě, v masných výrobcích jako je např. sušená šunka nebo fermentované klobásy. Podílí se zde na vzhledu výsledného produktu, podobně jako tomu bylo u stafylokoků. Redukuje dusičnany na dusitany za vzniku typicky růžového zabavení fermentovaných masných výrobků. Přispívají také k celkové chuti, kdy v rámci proteolytické aktivity vznikají senzoricky aktivní chuťové látky. Rod Brevibacterium Bakterie rodu Brevibacterium (kmen Actinobacteria) jsou popisovány obecně jako nepohyblivé, nesportující a nekyselinotvorné. Náleží do skupiny koryneformních. Jako jiné koryneformní bakterie, jsou brevibakterie grampozitivní tyčinky, ale jejich tvar se může lišit v závislosti na stáří buněk a podmínkách kultivačního prostředí. Jejich genom obsahuje poměrně velké množství bazí GC (60-67 %). Brevibacterium je striktně aerobní, kataláza pozitivní a mezofilní rod s optimální teplotou růstu mezi 20-35 °C. Mnoho druhů je tolerantních vůči přítomnosti NaCl (>10 %) a jsou schopné růst v poměrně širokém rozmezí pH. Některé rody mohou být označovány za oportunitní patogeny a mají tudíž význam spíše v medicíně. Jen jeden druh brevibakterií, Brevibacterium linens, má využití v potravinářském průmyslu, konkrétně při výrobě sýrů. V těchto produktech Brevibacterium vytváří žluto-oranžovo-červený pigment, který dává sýrům zrajícím pod mazem typické zabarvení. Schopnost této kultury hydrolyzovat proteiny a metabolizovat aminokyseliny rovněž přispívá k procesu zrání a vývoji chuti sýrů. Rod Propionibacterium Propionibakterie náleží také do kmene Actinobacteria. Stejně jako brevibakterie, buňky Propionibacterium obsahují v genomu poměrně vysoké koncentrace GC (53-68 %). Jsou nesporulující, grampozitivní a nepohyblivé. Mají tvar tyčinek, které jsou často zahnutého tvaru. Mohou být mimo jiné kokoidní nebo dokonce větvené. Propionibakterie jsou kataláza pozitivní, anaerobní (příp. aerotolerantní) mezofylové. Jsou neutrofilní a rostou pomalu při pH 5-5,2 (hodnota pH, která je nastavena v sýrech švýcarského typu, kde jsou aplikovány).

50

Obecně bývají propionibakterie spojovány se dvěma stanovišti – lidská kůže a mléčné výrobky. Kožní druhy jsou: Pr. acnes a Pr. avidum (způsobující akné) a mléčné bakterie: Pr. freundericherii ssp. freundericherii, Pr. freundericherii ssp. shermanii, Pr. acidopropionici, Pr. jensenii. Výše zmíněné mikroorganizmy mají obsah GC v genomu od 66-68 % a jsou rozlišovány hlavně na základě morfologických a biochemických charakteristik. Schopností zkvašovat laktózu se liší od druhu. Mléčné kmeny jsou navíc za jistých podmínek schopny laktát využívat jako zdroj uhlíku. Konečné produkty metabolizmu jsou pak kyselina propionová, kyselina octová, oxid uhličitý a dokonce malá množství vitamínu B12. Během růstu v médiu bohatém na peptidy, jako jsou sýry, propionibakterie uvolňují prolin z bílkovin. Také jsou lipolytické a odštěpují mastné kyseliny z triacylglycerolů. Navzdory jejich tendencím tvořit oka v sýrech švýcarského typu, nejsou propisovány jako typičtí producenti CO2. Nicméně právě díky této schopnosti, jsou nedílnou součástí těchto delikátně nasládlých sýrů s typickými oky.

Shrnutí V rámci širší fyziologické definice skupina BMK zahrnuje více než 20 bakteriálních rodů. Avšak z hlediska technologické praxe můžeme do této skupiny zařadit hlavně rody Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus a Tetragenococcus. Někdy milně je k BMK řazeno Bifidobacterium, které disponuje probiotickými kmeny. Dále je v průmyslu výroby mléčně kvašených potravin (sýry, trvanlivé salámy) využíváno i jiných rodů, které nejsou fylogeneticky s BMK spřízněny, ale jsou schopné zkvašovat laktózu a jiné sacharidy za produkce kyselin, plynů, nebo jiných senzoricky aktivních látek. Jedná se např. o kmeny některých druhů rodu Propionibacterium, Brevibacterium, Micrococcus, Staphylococcus.

Kontrolní otázky 1. Jaké jsou základní biochemické a morfologické charakteristiky bakterií rodu Lactobacillus? 2. Jaké termofilní a mezofilní kultury se využívají při výrobě jogurtu a zakysané smetany? 3. Které kultury produkují diacetyl? A jaký význam má diacetyl v mléčných výrobcích? 4. Čím se odlišuje rod Bifidobacterium od BMK?

51

6 Využití probiotik ve výživě lidí Studijní cíle: Seznámit studenta s možností využití některých mikrobiálních kultur jako probiotik. Zaměřit se na požadavky na kultury jejich aplikaci ve funkčních potravinách. Vysvětlit působení probiotik v lidském organizmu. Klíčová slova: probiotická medicína, probiotika, prebiotika, střevní mikroflóra Potřebný čas: 1 hodina

6.1 Úvod do problematiky probiotik Zdravotně prospěšné účinky kyselého mléka se vzpomínají už ve Starém zákoně a od časů Mečnikova se v průběhu minulého století shromáždilo množství empirických poznatků, dokumentujících kladné působení jogurtu a jiných mléčně kvašených produktů na lidské zdraví. V posledním desetiletí problematika probiotik nabyla novou dimenzi, která se odrazila v jejich nebývalém rozvoji. Podmínilo to několik skutečností: 1. Cílenými a kontrolovanými klinickými studiemi se nejen potvrdil zdravotně prospěšný účinek probiotik, ale získaly se i první experimentální poznatky o mechanizmu jejich účinků na molekulové a buněčné úrovni. 2. Stále více převládá poznání, že chemoterapie není schopná vyléčit všechny choroby. 3. Antibiotika nejsou univerzálními a ideálními prostředky na léčbu infekčních chorob (likvidují i potřebnou symbiotickou jinak prospěšnou mikroflóru, mnoho z antibiotik disponuje imunosupresivními účinkya podporují šíření rezistence). 4. Probiotika by mohla působit i proti některým patogenům rezistentním na antibiotika a v některých případech by mohla představovat alternativu a ekologicky výhodnější formu terapie. Tyto skutečnosti zavdaly impuls na vznik nového vědního oboru na rozhraní mikrobiologie, imunologie, molekulární biologie a vícerých klinických disciplin. Tento obor se začíná označovat jako probiotická medicína. Má dva základní cíle: A. Přesně charakterizovat mechanizmy, kterými složení střevní mikroflóry může ovlivňovat nejen sliznicový imunitní systém, ale i celkový zdravotní stav každého jedince. B. Využít tyto poznatky v prevenci a terapii různých chorob, včetně alergií. C.

6.2 Střevní mikroflóra Střevní mikroflóra může mít na svého hostitele prospěšné nebo naopak škodlivé účinky. Záleží na jejím mikrobiálním složení. Mezi prospěšné účinky patří zejména příznivý vliv na zdravotní stav. Uplatňuje se na základě bezprostředního kontaktu střevních bakterií s místním imunitním systémem, který představuje lymfoidní tkanivo sdružené se střevem označovaným v cizojazyčné 52

literatuře jako GALT (gut-associated lymphoid tissue). Střevní epitel pak představuje přirozenou překážku, která reguluje prostup mikroorganizmů do dalších vrstev tkaniva. Střevní bakterie, střevní epitel a GALT se vzájemně ovlivňují. Vzájemné působení těchto tří složek se uskutečňuje na velmi rozsáhlé ploše, neboť povrch gastrointestinálního traktu (GIT) u dospělého člověka činí 250 až 350 m2. Funkční porucha v kterékoli z těchto částí má za následek nedostatečnou obranu proti patogenním anebo podmíněně patogenním střevním či případně jiným mikroorganizmům a nedostatečnou imunologickou toleranci na potravinové antigeny včetně antigenů prospěšných mikroorganizmů. To situace následně vyústí do nadměrné imunitní přecitlivělosti projevující se zejména alergickými reakcemi, jako jsou např. potravinové alergie, atopický ekzém, alergická rinitida, bronchiální astma a další. Zmíněnou poruchu imunitního systému mohou navodit zmíněné patogenní mikroorganizmy, perorálně podávané širokospektrální antibiotika, imunosupresivní a cytostatické preparáty, toxické látky nacházející se v potravě a v neposlední řadě různé stresové situace. Z nich významné místo zaujímají psychické stresory, protože mezi neuroendokrinním a imunitním systémem existuje velmi účinné obousměrné propojení. V trávicím ústrojí zdravého člověka se hlavní podíl mikroorganizmů nachází v tlustém střevě, zatímco žaludek a horní část tenkého střeva je obvykle téměř neosídlená. Odhaduje se, že střevo dospělého člověka obsahuje 1,0 až 1,5 kg mikroorganizmů. Zejména se jedná o bakterie, které jsou příslušníky asi 500 různých druhů. Kromě aerobních bakterií je tu mnohonásobně víc anaerobních druhů. Tyto mikroorganizmy nejsou jen pasivními kolonizátory GIT, ale plní mnohé významné funkce při zpracování potravy. Mikroflóra se mimo jiné podílí nai udržování fyziologické homeostáze organizmu.

6.2.1

Variabilita střevní mikroflóry

Složení intestinální mikroflóry se v průběhu života dramaticky mění. Mikroflóra GIT je poměrně složitá, stejně jako její funkce. Po narození je GIT prakticky sterilní a s první přijatou stravou dochází k jeho osidlování. Již v prvních dnech a měsících života je GIT rychle kolonizován za vzniku relativně stabilní mikroflóry. Její druhové složení závisí nejen na věku, ale i na potravě, stresorech, ekologických a hygienických poměrech. Nejprve se ve střevech kojenců usazují fakultativní anaerobi, jako jsou Escherichia coli, Streptococcus sp., Lactobacillus sp., Bacteroides sp., Bifidobacterium sp. a Enterococcus faecium. U starších osob se počet bakterií rodu Bifidobacterium snižuje, nebo zcela vymizí, vzrůstá naopak mikroflóra Enterococcus, Enterobacterium a Clostridium. Enormní aktivita těchto bakterií pak může vést až ke vzniku nádorů a poruchám jaterních funkcí. Ze zdravotního hlediska jsou prokazatelně nejprospěšnější bakterie mléčného kvašení, jako např. laktobacily, streptokoky, bifidobakterie a enterokoky. Zmíněné bakterie mají schopnost zkvašovat laktózu a jiné cukry na krátkořetězcové karboxylové kyseliny (mléčnou, octovou, propionovou, máslovou), produkují vitamíny skupiny B, K a další vitamíny potřebné pro hostitele. Jsou schopné dehydroxylovat a dekonjugovat žlučové kyseliny, tím brání jejich přeměně na fekální sekundární žlučové kyseliny. O sekundárních žlučových kyselinách je známo, že se zúčastňují na patogenezi a vzniku rakoviny tlustého střeva. Jsou schopny přeměňovat bilirubin na urobilinogen a cholesterol na koprostanol, čímž zmenšují možnost jeho resorpce z trávicího traktu. BMK utvářejí ve střevě mikroprostředí, které brání pomnožení nejen různých patogenních druhů, ale i různých hnilobných a méně prospěšných bakterií. Mnoho z nich produkuje oxidační enzymy schopné přeměňovat prokarcinogeny z potravy na účinné karcinogeny. Takové enzymy se v BMK nenacházejí a díky tomu je jim přisuzováno preventivní působení proti různým nádorům GIT.

53

Během ontogenetického vývinu se prospěšné bakterie ze střeva ztrácejí a u starších osob je jich už velmi málo. Nahrazují je jiné, pro zdraví jedince méně výhodné druhy. Proto se předpokládá, že jednou z nejvážnějších komplikací doprovázených stárnutí je akumulace chronických infekcí a latentních toxikóz, navozených zejména nevhodným složením střevní mikroflory. Vrámci historického vývoje se složení potravy a způsob života lidí výrazně změnil. Největší rozdíly můžeme pozorovat zejména v průmyslově rozvinutých krajinách. To přineslo s sebou i nepříznivé změny ve složení naší střevní mikroflóry. Je pravděpodobné, že tyto změny mohou být jednou ze základních příčin zvýšeného výskytu alergických a jiných nemocí souvisejících s abnormální aktivitou imunitního systému.

6.3 Kritéria volby probiotické mikroflóry Na zlepšení skladby a tím pádem i účinnosti střevní mikroflóry se využívají probiotika. Ta se buď přidávají do potravin (funkční potraviny), nebo jsou jako koncentráty podávány v želatinových kapslích výživových doplňků. Podobně jako mikroorganizmy střevní mikroflóry, i probiotika jsou živé mikroorganizmy. Do střev přicházejí s potravou a je známé, že mají příznivý vliv na žádané osídlení střev. Tento efekt lze považovat za zásadní kriterium, pokud chceme určitý druh mikroorganizmu nazvat probiotikem. Mikroorganizmy s probiotickým účinkem mají splňovat více než dvacet kriterií. Vědecká komunita dnes souhlasí hlavně s pěti z nich:     

mikroorganizmy označované jako probatika musí mít lidský původ, nesmí být patogenní, musí tolerovat kyseliny a žluč (důležité je, aby si zachovaly životaschopnost během zpracování potravy a přechodu trávicím traktem), musí být schopné přežít během technologických procesů a skladování potravin, musí být dokázány jejich příznivé zdravotní účinky.

Z laického pohledu by se přínos probiotik dal charakterizovat následujícím způsobem:  nutriční vylepšení potravin,  účinek proti střevním patogenům,  poskytování enzymů pro trávení některých složek potravy, jako je např. laktáza k hydrolýze laktózy na glukózu a galaktózu (velmi důležité pro jedince trpící laktózovou intolerancí),  protirakovinný účinek,  detoxikace některých škodlivých látek a metabolitů ve střevě,  vylepšení peristaltické aktivity střeva,  léčba průjmových onemocnění či zácpy aj.

6.4 Funkce probiotik Přívlastek „probiotický“ byl původně vymezen na fenomén, kdy každý ze dvou spolu kultivovaných organizmů produkoval látky, které stimulovaly růst druhého. Postupně se však význam termínu probiotikum zúžil jen na živé mikroorganizmy, které po podání živočichům, včetně člověka, působí blahodárně na zdraví. Impuls pro tuto koncepci pochází od Mečnikova, který už začátkem našeho století publikoval několik prací, ze kterých vyplynulo, že stárnutí organizmu je důsledkem jeho postupné otravy toxickými produkty střevních bakterií. Mečnikov 54

kromě různých drastických opatření (např. navrhoval odstranit tlusté střevo jako semeniště hnilobných bakterií, produkujících toxické látky) doporučoval konzumaci kysaných mléčných produktů, které antagonizují množení hnilobných bakterií. V současnosti probiotickými nazýváme produkty obsahující jeden, nebo více živých mikrobiálních druhů, které po konzumaci působí na spotřebitele (zvíře, člověk) pozitivně tím, že vylepšují složení střevní mikroflóry. Po zjištění, že střevní mikroflóra může výrazně ovlivňovat zdraví člověka, se začal zvyšovat zájem o úpravu jejího složení, aby ve střevě převládaly jen užitečné druhy. Pro tento účel mohou posloužit probiotika, tedy živé bakterie, které jako součást různých tzv. funkčních potravin pomáhají optimalizovat bakteriální společenství ve střevech. Na rozdíl od probiotik, jsou prebiotika většinou v tenkém střevě neresorbovatelné oligosacharidy, které stimulují množení užitečných bakterií (zejména bifidobakterií) v tlustém střevě. Po krátkodobém podávání probiotik v kombinaci s prebiotiky, dochází k rozmnožení příznivé mikroflóry, která se může stát ve střevě dominantní. Probiotické bakterie se nacházejí v různých mléčně fermentovaných produktech (jogurty, acidofilní mléko, kefír, žinčice aj.). Další možností je aplikace čisté lyofilizované kultury ve formě kapslí, tablet anebo sirupů. Málokdo ví, že jogurtová kultura složená z Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus a Streptococcus thermophilus je citlivá na kyseliny a žluč, a proto nepřekoná velmi kyselé žaludeční prostředí ani žlučovou bariéru ve dvanácterníku a tenkém střevě. Existují však jiné, skutečně probiotické bakterie, které řadíme do skupiny bifidobakterií, laktobacilů, enterokoků a některých kvasinek. Ty jsou schopny odolávat nepříznivým podmínkám GIT člověka, živé procházejí přes žaludek a až ve střevě se začnou množit a kolonizovat jej. Nejčastějšími probiotickými mikroorganizmy jsou některé bakterie mléčného kvašení, v praxi často nazývané BMK (viz kapitola 4). Je třeba opět zdůraznit, že jsou i mimořádné případy, kdy BMK podporovaly vnik infekce střev. Jednalo se však o negativní projevy jinak pozitivních kultur u pacientů postižených vážným onemocněním (např. leukémií) způsobujícím vážné oslabení imunitního systému, v důsledku kterého byli náchylní k infekcím. Ve všech ostatních „normálních“ případech se ukázalo, že dnes používané probiotické mikroorganizmy jsou bezpečné. Z hlediska infekce způsobené BMK tedy není v žádném případě rizikovým faktorem věk nebo těhotenství.

6.5 Volba probiotik a jejich aplikace v potravinách Vliv probiotik se může měnit podle jejich formy a způsobu, jakým byly přidány do potraviny a i podle formy, v jaké jsou konzumovány. Je několik způsobů, jakým podávat probiotika:    

samotné monokultury, neebo v kombinaci s jinými mikroorganizmy, v potravě, v léku, v potravinářské přídatné látce, nebo ve výživovém doplňku.

Když uvážíme, že každý z nás má vlastní charakteristickou intestinální mikroflóru, je zřejmé, že probiotika nebudou působit na každého stejně. Projevují se především věkové rozdíly. Některé bakterie vykazují příznivý vliv jen na kojence a malé děti. To je případ bakterií působících na trvání průjmu. Zvláštní cílovou skupinou probiotik jsou i starší lidé, protože jejich tělesné funkce jsou všeobecně oslabeny. V současnosti probíhá evropský výzkumný program zaměřený na zkoumání

55

příznivého působení probiotik na zdraví seniorů, formou obnovy a posílení aktivity jejich střevní mikroflóry. Tabulka 5 ukazuje příklady konkrétních druhů, jejíž kmeny jsou používány jako probiotika, která prokazatelně disponují dieteticko-léčebnými účinky. Jak bylo zmíněno výše, kromě fermentovaných mléčných výrobků s probiotiky se na trhu objevují různé probiotické preparáty ve formě kapslí a tablet. Tyto komerční přípravky mají většinou omezenou životnost, navzdory doporučenému udržování při nízkých teplotách (4 °C). Při analýze takovýchto tablet s probiotickou kulturou se obvykle najde značně redukovaný počet živých bakterií v porovnání s hodnotami deklarovanými výrobcem. Z tohoto hlediska jsou zvlášť citlivé bifidobakterie, jejichž schopnost přežívání v tabletách se rychle snižuje. Při kontrole třinácti probiotických preparátů, které jsou na trhu ve Velké Británii, jen ve dvou případech kvantitativní a kvalitativní ukazatele korespondovaly s údaji uvedenými výrobcem na obalu. V těchto produktech byly nejčastějšími složkami kmeny Lactobacillus acidophilus příp. jiné laktobacily, bifidobakterie a v pěti případech i Enterococcus faecium. Je nutné si uvědomit, že životaschopnost bifidobakterií v probiotických jogurtech se velmi rychle snižuje, navzdory doporučení výrobce spotřebovat tuto funkční potravinudo 30 dní. Po 7 dnech uskladnění při teplotě 4 °C se počet živých bifidobakterií snižuje asi o 2 řády. Po 14 dnech skladování i při nízkých teplotách se ve výrobku živé bakterie vyskytují už jen v zanedbatelném počtu. Je třeba zdůraznit, že z hlediska pozitivního efektu se účinnost probiotických bakterií projeví, jen pokud aplikujeme opakovaně dávky vysokého počtu buněk mikroorganizmů. V Dánsku se již několik roků vyrábí zakysaný nápoj jogurtového typu, který kromě charakteristické jogurtové kultury obsahuje i druh Enterococcus faecium. Podle informací siprobiotické enterokoky konkrétně kmen Enterococcus faecium M-74 nacházející se ve výrobku zachovává plnou životaschopnost během celého doporučeného konzumačního období. Účinky tohoto kmene na udržení zdravotně prospěšné mikrobiologické rovnováhy v trávicím traktu člověka byly už mnohokrát potvrzeny. Biologická účinnost tohoto kmene byla navíc zvýšena obohacením buněk o organický selen. Přidáním kmene Enterococcus faecium M-74 např. do brynzy způsobíme její fortifikaci o živý bakteriový druh, který i v klinických zkouškách prokázal pozitivní vlastnosti. Divoké, přirozeně v brynze přítomné enterokoky se zde vyskytují v koncentracích 105–106 CFU/g. Tab. 5 Příklady konkrétních probiotických druhů bakterií Bakterie mléčného kvašení vykazující probiotické účinky Druhy Lactobacillus L. acidophillus, L. amylovorus L. casei, L. crispatus,L. delbrueckii subs. bulgaricus L. plantarum, L. rhamnosus Druhy Bifidobacterium B. longum, B. adolescentis B. infantis, B. bifidum B.animalis Jiné druhy Enterococcus faecium E. faecalis Streptococcus salivarius subs.thermophilus Leuconostoc mesenteroides Jiné bakterie Escherichia coli Bacillus cereus Propionibacterium freundenreichii

56

6.6 Bifidobacterium jako typicky probiotická kultura Bifidobakterie hrají významnou roli v udržování zdraví GIT. Nicméně i přes tento všeobecně přijímaný prospěšný vliv bifidobakterií základní molekulární mechanizmy těchto komenzálů, kteří vykonávají zdraví prospěšné probiotické aktivity, zdaleka nejsou známy. Bifidobakterie byly poprvé izolovány Tissierem 1899 z kojeneckých exkrementů. Bakterie byla nazvána Bacillus bifidus. Později byla překlasifikována Orla Jensenem na Bifidobacterium bifidum. Kvůli morfologickým a fyziologickým vlastnostem a kvůli tomu, že jsou bifidobakterie do značné míry podobné laktobacilům, byly řazeny k rodu Lactobacillus po převážnou část dvacátého století. Nyní tento rod obsahuje velký počet nových druhů (Tab. 5 Příklady konkrétních probiotických druhů bakterií). Základní morfologické a biochemické vlastnosti byly již uvedeny v předešlé kapitole. Nicméně pro doplnění mohou mít tyto pleomorfní mikroorganizmy různý tvar, který je ovlivněn přítomností N-acetylglukózaminu, alaninu, kyseliny asparagové, kyseliny glutamové, serinu a Ca 2+ iontů v kultivačním médiu. Bifidobakterie vykazují v mléce pouze slabý nárůst, jelikož nedisponují proteolytickou aktivitou. Jsou poměrně náročné na kultivační prostředí a ve funkčních potravinách jejich životaschopnost nemá dlouhé trvání. Potřebují přídavek růstových faktorů, aby dosáhly požadovaného počtu. Růst bifidobakterií podporuje například κ-kasein, α-laktalbumin, β-laktoglobulin, kvasničný extrakt, treonin, cystein, pepton, dextrin, maltóza a hydrolyzáty kaseinu, D-glukózamin, α-etyl-N-acetyl-Dglukózamin, N-karboetoxy-D-glukózamin, N-acetylglukózamin, N-acetyl-laktoamin, N-Ndiacetylchitobióza a N-acetylneuraminová kyselina. Někdy jsou tyto zvýšené požadavky na růstové prostředí označovány souhrnně jako bifidus faktor. Zástupci rodu Bifidobacterium (Tab. 5 Příklady konkrétních probiotických druhů bakterií) fermentují hexózy unikátní fruktóza-6-fosfátovou drahou, kdy jsou konečnými produkty metabolizmu kyselina mléčná a octová. Potom mohou být generovány další kyseliny na úkor uvedených (kys. mravenčí, kys. jantarová) a etanol. Z 2 molů glukózy vzniknou 3 moly acetátu + 2 moly laktátu + 5 molů ATP. Kromě glukózy mohou jako substráty pro bifidobakterie posloužit i jiné sacharidy např. galaktóza, nebo disacharidy rafinóza, sacharóza či laktóza. Jen některé druhy bifidobakterií pak dokážou degradovat i cukerné alkoholy manitol a sorbitol nebo disponují extracelulárními enzymy, kterými jsou schopny hydrolyzovat polysacharidy jako je např. amylopektin a amylóza škrobu, inulin nebo xylan. Fruktooligosacharidy a inulin jsou bifidobakteriemi metabolizovány přednostně v porovnání s jinými oligosacharidy. Bifidobakterie navíc produkují velké množství vitaminů, zahrnující např. thiamin (B1), pyridoxin (B6), kyselinu listovou (B9) a kyselinu nikotinovou. Naproti tomu většina druhů izolovaných z lidských zdrojů požaduje k růstu riboflavin (B2) a kyselinu pantotenovou.

57

Tab. 5 Druhy bifidobakterií a zdroje, ze kterých mohou být izolovány Původ Hmyz Lidský GIT

Druh Bifidobacterium Bif. actinocoloniiforme Bif. adolescentis Bif. animalis Bif. animalis subsp. animalis Bif. animalis subsp. lactis Bif. angulatum Bif. asteroides Bif. bifidum Bif. bohemicum Bif. bombi Bif. boum Bif. breve Bif. catenulatum Bif. coryneforme Bif. choerinum Bif. cuniculi Bif. denticolens Bif. dentinum Bif. gallicum Bif. gallinarum Bif. indicum Bif. inopinatum Bif. longum Bif. longum subsp. longum Bif. longum subsp. infantis Bif. longum subsp. suis Bif. magnum Bif. mericium Bif. minimum Bif. mongoliense Bif. pseudocatenulatum Bif. pseudolongum Bif. pseudolongum subsp. globosum Bif. pseudolongum subsp. pseudolongum Bif. psychroaerophilum Bif. pullorum Bif. ruminantium Bif. saeculare Bif. scardovii Bif. stercoris Bif. subtile Bif. suis Bif. thermoacidophilum Bif. thermoacidophilum subsp. porcinum Bif. thermoacidophilum subsp. thermoacidophilum Bif. thermophilum Bif. tsurumiense

Zvířecí GIT Potraviny Lidský GIT Hmyz Lidský GIT Hmyz Hmyz Zvířecí GIT Lidský GIT Hmyz, odpadní vody Hmyz Zvířecí GIT Zvířecí GIT Liská dutina ústní Lidská dutina ústní Lidský GIT Zvířecí GIT Hmyz Lidská dutina ústní Lidský GIT Lidský GIT Zvířecí GIT Zvířecí GIT Zvířecí GIT Odpadní vody Kvašené kobylí mléko Lidský GIT Zvířecí GIT Zvířecí GIT Zvířecí GIT Zvířecí GIT Zvířecí GIT Zvířecí GIT Lidská krev Lidský GIT Lidská dutina ústní Zvířecí GIT Zvířecí GIT Odpadní voda Zvířata GIT Lidská dutina ústní

58

Shrnutí Střevní mikroflóra nemá stabilní složení. Je ovlivňována mnohými faktory, které se pak v konečném důsledku promítnou i na imunitním systému a zdraví jedince. V poslední době společnost soustřeďuje svůj zájem na pozitivní vliv probiotik v rámci tzv. probiotické medicíny. Uvedené poznatky nasvědčují, že v dostatečném počtu podávaná probiotika mají mnohé prospěšné účinky na lidské zdraví a stávají se významnými nejen v péči o zdraví každého jedince, ale i cílené prevence a terapie mnoha závažných chorob. Mezi probiotiky můžeme najít hlavně bakterie, ale i kvasinky. Nejčastěji jsou v odborné literatuře jako probatika jmenováni zástupci BMK, zvláště pak zástupci rodu Bifidobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc a Enterococcus. Kromě hledání dalších zdraví prospěšných bakterií je však třeba prozkoumat i mechanizmy jejich působení a formy nejefektivnější aplikace při konkrétních chorobných stavech. Doposud získané poznatky jsou jasně předurčeny pro další, intenzivní experimentální i klinické studie. Kontrolní otázky 1. V čem spočívá dieteticko-léčebný účinek bakterií? 1. Jaké druhy bakterií osidlují GIT? Popište dynamické změny, které ve skladbě střevní mikroflóry nastávají (od narození až po stáří člověka). 2.

Jakou formou se probiotika dostávají do lidské výživy?

3. Jaké požadavky musí kultura splňovat, aby mohla být označena jako probiotikum?

59

7 Struktura, fyziologie a ekologie biofilmů Studijní cíle: Seznámit studenta s pojmy souvisejícími s tvorbou biofilmů. Objasnit tvorbu mikrobiálních biofilmů – pozitivní a negativní přínos tvorby biofilmů, složení biofilmů a transport látek v biofilmech. Klíčová slova: biofilm, transport, adsorbce, kolonizace povrchů, transkripce genů a fenotypové změny, metody diagnostiky biofilmu Potřebný čas: 4 hodiny

7.1 Úvod do problematiky biofilmů Bakterie v přírodních populacích jeví zřetelnou tendenci přisedat k nejrůznějším povrchům. Existence v biofilmu je pro bakterie z mnoha důvodů výhodnější a ve většině prostředí je také základním způsobem jejich přirozeného výskytu. Mnozí vědci považují mikrobiální biofilmy za jeden z typů mikrobiální agregace a domnívají se, že ostatní skupiny agregátů vykazují ve srovnání s biofilmem spíše více podobností než rozdílů. Kromě přírodního prostředí se biofilmy vyskytují ale i v mnoha humánních prostředích, kde způsobují četné problémy, neboť znečišťují povrchy, na nichž se tvoří, případně je poškozují korozí, ale mohou být rovněž zdrojem některých patogenních infekcí. Tvorba patogenních biofilmů byla prokázána u celé řady bakteriálních rodů, jako Pseudomonas, Vibrio, Escherichia, Salmonella, Listeria, Streptococcus, Staphylococcus a Mycobacterium. Biofilm zvětšuje například odpor lodního trupu při plavbě a poskytuje základ pro další usazování řas a larev bezobratlých. V potrubí rozvinutý biofilm způsobuje turbulenci protékající kapaliny a zmenšuje prosvit, v průmyslových výměnících tepla tvoří tepelnou izolační vrstvu a snižuje jejich účinnost. V mnoha odvětvích průmyslu, jako je biotechnologie, čištění odpadních vod nebo bioremediace, je naopak přítomnost biofilmů nezbytná (Tab. 6). Zcela samostatnou, ale nesmírně důležitou a v současnosti nejvíce studovanou otázkou je výskyt biofilmů v medicíně, především na cizích tělesech v lidském těle, jako jsou kanyly, katétry či plastové protetické implantáty. Biofilmové nárosty se vyskytují prakticky všude, kde jsou přítomné mikroorganizmy. Z tohoto důvodu je studiu biofilmů věnována pozornost v nejrůznějších odvětvích (biokoroze, zdravotnictví, vodárenství, limnologie). Protože se liší zaměření i pole působnosti jednotlivých výzkumů biofilmů, je někdy velmi obtížné porovnat výsledky z rozdílných studií. Tento fakt se částečně promítá i do odborného pojmosloví a nejrůznějších definic biofilmu. V jedné z prvních definic, používané mezi biology, kteří pracují s přírodními biofilmy, je jako biofilm zpravidla označována „…aktivní biologická vrstva, složená z mikroorganizmů (bakterií, řas, hub, prvoků, mnohobuněčných) a jejich extracelulárních polymerních produktů, která je přichycena na povrchu nejrůznějších podkladů, které jsou v kontaktu s vodou …“ Definice biofilmů se však neustále vyvíjí; jedna z nejaktuálnějších definic, která zahrnuje rovněž fyziologické vlastnosti organizmů biofilmu a schopnost transkripce genů, říká, že biofilm je „… přisedlé společenstvo mikroorganizmů, charakterizované tím, že buňky, které jsou ireverzibilně přichycené k podkladu nebo jedna k druhé, jsou zapuštěné v matrici extracelulárních polymerních

60

látek těmito buňkami produkovaných, které dále vykazují odlišný fenotyp s ohledem na rychlost růstu a transkripci genů…“ Tab. 6 Vlivy biofilmů (podle CharacklishMarshall, 1990) Proces Akumulace biofilmů v potrubí teplotních výměníků A v chladicích zařízeních Akumulace biofilmů ve vodovodních potrubích a v kanalizacích, v porézním prostředí (např. podzemní voda), na trupu lodí Urychlená koroze v důsledku mikrobiálních procesů na rozhraní biofilm-substrát Tvorba biofilmů na senzorech, periskopech ponorek, dalekohledech Akumulace biofilmu v distribučních sítích pitné vody Uvolňování mikroorganizmů z biofilmů v chladicích zařízeních (např. Legionella) Akumulace biofilmu na zubech, dásních, močové trubici a střevu Tvorba biofilmu na povrchu materiálů vkládaných do lidského těla (katétry, stenty, chlopně, protézy, atp.) Extrakce a oxidace organických a anorganických kontaminantů z vody a odpadní vody (např. rotační biodisky, adsorpce aktivním uhlím) Aktivita bentického biofilmu v řekách Extrakce minerálů z ložisek prováděná biofilmy (biometalurgie) Imobilizované mikroorganizmy v biotechnologických odvětvích průmyslu

Vlivy Zvýšení odporu přenosu tepla, ztráty energie, snížený výkon Zvýšení třecího odporu kapaliny, ztráta energie, snížený výkon Poškození materiálu, snížená trvanlivost zařízení Snížený výkon Snížení kvality vody a zvýšení zdravotního rizika Zdravotní riziko Zdravotní riziko Infekce spojené s materiály vkládanými do lidského těla Redukce zatížení polutanty pro recipienty Ovlivnění kvality vody v toku Zvýšení výtěžnosti produktu Zlepšená produkce a stabilita procesů

Velkou výzvou ve výzkumu mikrobiálních biofilmů je mimo jiné skutečnost, že biofilmy představují předmět interdisciplinárního výzkumu, protože jsou významným fenoménem v přírodě, průmyslu a medicíně. Studium biofilmových společenstev tak těží z poznatků, spolupráce a společného úsilí výzkumníků z velmi rozdílných disciplín, zahrnujících odborníky od environmentálních a medicínských biologů přes chemiky až po inženýry a matematiky zabývajících se modelováním biofilmů. S rostoucím počtem publikací a poznatků o biofilmech rovněž vzrůstá potřeba zvýšené mezioborové spolupráce a kontaktů odborníků zabývajících se biofilmy. Stejně jako mezi různými profesemi existují rozmanité pohledy a přístupy ke studiu biofilmů, tak existují rozmanité pohledy na „škodlivost“ a „užitečnost“ biofilmů. Asi jen málokterý lékař bude mít radost z výskytu bakteriálních biofilmů na operačních nástrojích či implantátech, naopak technolog na čistírně odpadních vod si svoji činnost bez jejich přítomnosti umí stěží představit.

7.2

Biofilmové versus suspendované buňky – důvod vzniku biofilmů

Růst ve formě biofilmu je pro mikroorganizmy výhodný. Oproti bakteriím rostoucím v planktonické formě biofilm poskytuje bakteriálním buňkám ochranu, udržuje určitý stupeň homeostázy a vytvořená biofilmová vrstva obklopující buňky představuje bariéru, která izoluje 61

bakterie od okolí. Buňky v biofilmu tak mají například vyšší odolnost vůči toxickým látkám, UV záření, mechanickému poškození, bakteriofágům či predátorům. V těle člověka nebo zvířete lépe odolávají působení imunitního systému nebo antibiotikům. Biofilmové bakterie vykazují rovněž vyšší metabolickou aktivitu ve srovnání se svými planktonními, čehož lze úspěšně využít v různých průmyslových aplikacích. Jako planktonní bakterie (planktonic bacteria) budou nadále v textu označovány bakterie suspendované či rostoucí v tekutém médiu, jako protiklad k bakteriím přisedlým či rostoucím na povrchu. Ačkoliv v současnosti existují stovky publikovaných prací o biofilmech, stále jednou z dosud ne zcela vyřešených otázek zůstává, jaké důvody vedou bakterie k tomu, že „přepínají“ z volně plovoucí fáze do biofilmové fáze růstu. Protože přichycení se k povrchu je účinnějším prostředkem, jak zůstat nadále ve vhodném prostředí, než nechat se strhnout proudem, dala by se v extrémním případě planktonní či volně plovoucí mikrobiální fáze chápat primárně jako mechanizmus pro přemísťování z jednoho povrchu na druhý. Někteří naopak považují biofilmy za stabilní fázi biologického cyklu, která zahrnuje vývoj, zrání, udržování a rozpouštění. Vývoj biofilmu pak podle autorů začíná jako odpověď na specifické environmentální podněty, jako je např. dostupnost živin. V současnosti se uvažuje o čtyřech potenciálních důvodech, proč bakterie vytvářejí biofilmy:    

ochrana před nepříznivými podmínkami hostitele (obranná strategie); usazení se do živinami bohatého prostředí (kolonizace); využití kooperativních výhod (společenstvo) a biofilmy normálně rostou jako biofilmy a planktonní kultury jsou pouze in vitro artefakty (biofilmy jako „default mode of growth“).

Genetické studie jednodruhových biofilmů ukázaly, že biofilmy se vytvářejí v několika krocích, které vyžadují mezibuněčnou signalizaci a vykazují celou řadu genetických transkripcí zcela odlišných od planktonních buněk. Cílem genetických studií je porozumět přechodu mezi planktonní a biofilmovou fází růstu a naopak. Klíčem k tomu je nalezení externích podnětů („cues“), které vedou ke vzniku a „rozpuštění“ biofilmů a identifikace genetických složek zahrnutých v těchto přechodech.

7.3 Vznik a vývoj biofilmu Vznik, vývoj a stabilizace biofilmů probíhá v několika následujících krocích, které se zjednodušeně dají popsat jako:     

transport a adsorpce organických molekul substrátu na povrchu nosiče („conditioning“); transport mikrobiálních buněk k povrchu nosiče, transformace těchto buněk z reverzibilních na ireverzibilní adsorpci; desorpce reverzibilně adsorbovaných buněk; růst ireverzibilně adsorbovaných buněk a eroze/odtrhávání buněk; zachycení mikroorganizmů (v první fázi především bakteriálních) na povrchu, replikace sesilních buněk a produkce extracelulární matrice a dalších metabolitů; vývoj biofilmu na povrchu nosiče (odumírání některých buněk, kontinuální replikace dalších částí biofilmu); odtrhávání a disperze buněk biofilmu zpět do kapaliny.

První fáze vývoje biofilmu, nazývaná „initial events“, není doposud zcela jednoznačně prozkoumaná, ačkoliv procesy zahrnuté v této prvotní fázi tvorby biofilmů jsou relativně dobře známé a zahrnují přisednutí organických molekul na povrch („conditioning“); transport buněk k povrchu; transformace těchto buněk z reverzibilních na ireverzibilní adsorpci; desorpce 62

reverzibilně adsorbovaných buněk; růst ireverzibilně adsorbovaných buněk eroze/odtrhávání buněk. Zachycování molekul substrátu na povrchu nosiče se řídí zákony adsorpce a jedná se o rychlý proces. Rozhodujícími mechanizmy při transportu mikrobiálních buněk k povrchu nosiče jsou molekulární a turbulentní difúze, chemotaxe, termoforéza, sedimentace. Vlastní zachycení buněk na povrchu (adheze) je poměrně složitý proces, který je ale z hlediska vzniku biofilmu klíčovým krokem. Zachycení probíhá ve dvou fázích. První je reverzibilní adsorpce a druhou fází pak permanentní (ireverzibilní) zachycení, které jsou zprostředkovány třemi typy interakcí bakterií vůči okolí: fyzikálními silami (van der Waalsovy síly, hydrofobní interakce, elektrostatické interakce), nespecifickými chemickými vazbami (kovalentní polární vazby, vodíkové vazby) a specifickými interakcemi mezi bakteriálními receptory a receptory hostitele. Bakterie k adhezi používají specifické, povrchově aktivní molekuly, zvané adheziny, což mohou být látky různé povahy. Z hlediska chemického se jedná o bílkoviny, glykopeptidya polysacharidy. Vazba povrchových adhezinů mikrobiálních buněk na hostitelské receptorové molekuly je kritický počáteční krok mikrobiální infekce a patogeneze. Adheze je zprostředkována interakcí mezi specifickými adheziny na mikrobiálním povrchu a receptory na hostitelské tkáni (Tab. 7). Interakce jsou nejčastěji podobné lektinu s vazbou proteinových adhezinů na sacharidové receptory hostitelských tkání, ačkoliv adheze interakcí proterin-protein a vazba sacharidových skupin mikrobiálního povrchu byla rovněž popsána. Např. v případě grampozitivní bakterie Streptococcus mutans, která je významným orálním patogenem, je adheze na zubní povrch zprostředkována povrchovým adhezinem zvaným streptokokální antigen I/II (SA I/II), který se váže na sacharidové skupiny glykoproteinů slin adsorbovaných na povrchu zubů. Tab. 7 Složky hostitelského filmu ovlivňující bakteriální přichycení k biomateriálům (upraveno dle Mittelman 1996) Prostředí biomateriálu Močová trubice

Suspendované kapaliny

Hlavní složky conditioning filmu

Moč, prostatické tekutiny, semeno

Mukopolysacharidy, Tamm Horsfall proteiny, glykoproteiny

Kardiovaskulární Oční Ústní dutina

Krev Slzy Sliny

Žlučovody Podkoží Peritoneální dutina Dýchací trubice Kostní lůžko, kloub

Žluč Extracelulární tekutina Peritoneální tekutina Respirační sekrety Kloubní výpotek, krev

Serum, albuminy, fibrinogen, fibronektin Proteiny (lysozymy), fibrin Mukopolysacharidy, glykoproteiny, serumalbuminy Steroidy, žlučové soli, mukopolysacharidy Fibrin Fibrin, sérum albuminy, dialyzáty Mukopolysacharidy Sérové proteiny, krevní elementy

Iniciální adheze bakteriálních buněk na „kondiciovaný“ povrch je považována za náhodný proces. Po přichycení se buňky začnou dělit a akumulovat a produkují „primární biofilm“, na který se mohou přichytávat (akumulovat) další buňky tzv. sekundárního biofilmu. Během vývoje polymikrobiálních populací, jako je např. zubní povlak, představuje každý nový organizmus, který se naváže na existující biofilm, nový povrch a tvoří tak základ pro akreci definované skupiny organizmů. Buňky primárního biofilmu vykazují během svého růstu určitou prodlevu (lag), která je pravděpodobně spojená s adaptací na podmínky přisedlého růstu či s fenotypickými změnami přisedlých buněk. Toto zpoždění v růstu primárních buněk je nazýváno jako „surface associated lag 63

time“. Planktonní buňky a buňky sekundárního biofilmu rostou rychleji než primární biofilm. Těsně před přilnutím se u bakterií spouští řada genů, ve fázi dotyku s vhodným povrchem se aktivuje především tvorba bičíků, v biofilmu se pak jejich tvorba snižuje nebo úplně ustává. Při adhezi pomáhají bakteriím i další buněčné struktury, jako např. fimbrie, které na rozdíl od bičíků vypadají spíše jako třásně či chloupky a na povrchu buňky tvoří husté kartáčky. Při dotyku s vhodným povrchem jich vzniká velké množství. Ačkoliv se zdá pravděpodobné, že bakterie mají schopnost zjistit dotek s podložkou, dosud ne zcela vyřešenou otázkou zůstává, jak bakterie vědí, že jsou již na povrchu. Nicméně bezprostředně po doteku následuje celá řada nových syntéz, včetně syntézy polysacharidové matrice. Počáteční tvorba biofilmu také velmi úzce souvisí s hydrofobitou povrchu. Pro úvodní iniciální fázi adheze se zdá výhodnější hydrofobní povrch materiálů, přestože povrch většiny bakteriálních buněk je hydrofobní. Hydrofobní povrch obyčejně napomáhá buňkám překonat počáteční elektrostatický odpor nosiče a adherovat tak rychleji. Přítomnost fimbrií, které jsou obsahově bohaté na hydrofobní aminokyseliny, také zvyšuje žádoucím způsobem hydrofobitu buněčného povrchu. Také přítomnost bičíků a schopnost pohybu umožňuje mikroorganizmům překonávat odpudivé síly v blízkosti nosiče. Obvykle je patrná zvyšující se tendence k adhezi v případě vyšší hydrofobity povrchů nosičů; byla prokázána mnohem rychlejší tvorba biofilmu např. na teflonu než na materiálech hydrofilní povahy typu sklo či kov. Na vývoj biofilmů působí dále celá řada faktorů, z nichž nejdůležitější jsou povrch nosiče a podmínky okolního prostředí. Drsné povrchy obvykle pozitivně ovlivňují utváření biofilmu. Střižné síly jsou totiž v blízkosti drsného povrchu nižší a tím se zvětšuje oblast, kam mohou buňky adherovat. Stejně tak velmi dobře slouží jako materiály vhodné pro adhezi ty, které mají porézní strukturu s póry, jejichž velikost je vhodná pro formování biofilmu. Střižné síly uvnitř pórů jsou velmi nízké, a to i za vysokých rychlostí v okolí proudící kapaliny. Póry tak poskytují buňkám vítanou ochranu potřebnou k nerušené adhezi a růstu. Dalším faktorem, který přímo souvisí s rychlostí tvorby biofilmu, je množství nutrientů přítomných v médiu. Biofilmy se rychleji formují v nutričně bohatém prostředí a naopak hladovění je jedním ze spouštěcích signálů pro odpoutávání buněk z povrchů. Poměr uhlíku, dusíku a fosforu ovlivňuje tvorbu jednodruhového a smíšeného biofilmu bakterií Enterobacter claocae a Citrobacter freundii, poměr živin je pro vývoj biofilmu mnohem důležitější než jejich pouhé složení. Dále je možné nalézt souvislost mezi zvyšováním teploty (v rozmezí vhodném pro reprodukční aktivitu mikrobiálních populací) a zrychlením tvorby biofilmu včetně zvyšující se produkce extracelulárních polymerních látek. Způsob adheze je také ovlivněn druhovou příslušností bakterií. Například u Pseudomonas aeruginosa je adheze do značné míry závislá na motilitě a tvorbě funkčních bičíků a podobný znak ovlivňuje rovněž fázi shlukování buněk. Zatím není rovněž zcela jasné, jaký význam mají v iniciální fázi tvorby biofilmů bakteriální signální molekuly, tzv. quorum sensing. Fyziologie, metabolizmus a organizace biofilmů jsou silně závislé na typu povrchu, který kolonizují a na převládajících fyzikálně-chemických podmínkách prostředí. Proto se biofilmy přisedlé uvnitř potrubí, chladících věží, implantátech v lidském těle, měkkých rostlinách a živočišných tkáních, půdních agregátech a říčních a mořských sedimentech zásadně liší navzájem z hlediska jejich fyziologických vlastností, organizace a metabolizmu buněk. Biofilmy se v zásadě mohou vytvářet na třech typech povrchů: 1. Rozhraní pevné a vzdušné fáze (Solid/air interfaces) – plicní infekce, mokré povrchy; živiny a vlhkost získává biofilm z pevné fáze a kyslík ze vzduchu. Výsledek je vznik opačných gradientů živin a kyslíku v biofilmu. 2. Rozhraní interní pevné a tekuté fáze (Inert solid/liquid interfaces) – např. potrubí, kloubní implantáty; kyslík a dostupné živiny jsou získávány z tekutého prostředí, gradient klesá s rostoucí hloubkou biofilmu.

64

3. Rozhraní pevné živné a tekuté fáze (Solid nutrient/liquid interfaces) – např. infekce měkkých tkání, půdní prostředí; živiny a kyslík mohou být získávány z pevné či tekuté fáze, výsledkem je vznik rozmanitých fyzikálně-chemických gradientů v populaci biofilmu.

7.3.1

Kolonizační chování bakterií na povrchu

Po adhezi na vhodný substrát byla u různých druhů bakterií zjištěna široká škála kolonizačního chování. Mezi pozorované typy patří: 1. „a mother-daughter (shedding) strategy“ – strategie „matka-dcera“, kdy mateřské buňky adherují k povrchu a regulérně produkují dceřiné buňky; 2. „a packing strategy“ – strategie „mikrokolonií“ – dělící se buňky přisedají jedna k druhé, což vede k tvorbě mikrokolonií a jednovrstvé vrstvě buněk; 3. „a slow migratory (spreading) strategy“ – strategie „pomalé migrace“; buňky po dělení pomalu (0,15 µm·min.-1) náhodně migrují po povrchu, dokud se opět nerozdělí a nemigrují dále; 4. „a reversibly adhering (rolling) strategy“ – strategie „rolování“; kdy buňky nejsou pevně přichyceny na povrch; 5. „a filament (chain-forming) strategy“ – „řetězová“ strategie vývoje vláknitého biofilmu.

7.3.2

Růst a diferenciace biofilmu - Transkripce genů a fenotypové změny

Když se bakterie přichytí na povrch, mění své vlastnosti, zprvu jen na úrovni regulace genů. Aktivují se geny, které produkují polysacharidy a polymery rozhodující pro vznik biofilmu. Analýzou bílkovin bylo zjištěno, že mikroorganizmy rostoucí ve formě biofilmu se od svých planktonických forem odlišují transkripcí odlišných genů, a tudíž i svými fyziologickými vlastnostmi a vzniká tak jakýsi „biofilmový fenotyp“. Ačkoliv je genová exprese různá u planktonních buněk i biofilmových buněk, doposud byly rovněž identifikovány některé geny, které jsou specifické pouze pro biofilmy. Největší rozdíly v expresi genů mezi biofilmem E. coli a suspendovanými buňkami byly zjištěny u mladého biofilmu ve 4 a v 7 hodin. Genová exprese se týká relativně malého počtu genů. Největší změny v genové expresi závisejí mimo jiné na fázi vývoje biofilmu – u osmi hodinového, mladého biofilmu exprese proběhla cca u 14 % genomu, zatímco u vyvinutého biofilmu proběhla exprese u méně než 1 % genomu. Obecně lze rozdělit geny potřebné pro tvorbu biofilmů do dvou základních skupin. Do první patří geny odpovědné za tvorbu bičíků, fimbrií, různých proteinových adhezinů a exopolysacharidů, které umožňují pohyb a iniciální přichycení bakterií na vhodný povrch, resp. konstruktivní vztah mezi buňkou a povrchem. Do druhé skupiny pak patří geny, jejichž exprese je ovlivněna vnějšími vlivy či bakteriálními signálními molekulami a které ovlivňují zásadně tvorbu strukturního třídimenzionálního biofilmu. Ne všechny bakterie vyžadují uvedené složky a cesty. V různých podmínkách jednotlivé bakteriální druhy mohou při vzniku biofilmu využít různé genetické cesty, jak prokázali na příkladu tvorby iniciálního biofilmu Pseudomonas fluorescens. Hlavní roli v přepnutí mezi planktonním a biofilmovým způsobem života hraje pravděpodobně protein s doménou GGDEF. Spouštěcími podněty pro změnu regulace činnosti genů jsou zevní podmínky v tvořícím se biofilmu – zvýšený osmotický tlak, snížený obsah kyslíku a rostoucí hustota populace. Ačkoliv ve srovnání se studiem fyzikálních vlastností biofilmů má výzkum vlivu genové exprese na tvorbu biofilmů určité zpoždění, genetické základy jednotlivých kroků v tvorbě

65

biofilmu byly studovány u celé řady bakteriálních druhů, včetně Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa a Vibrio cholerae. Dnes již poměrně dobře víme, že prostorová organizace biofilmu je závislá na aktivitě specifických genů. Např. u bakterie Vibrio cholerae je gen mbaA potřebný pro vytvoření charakteristických sloupků a kanálků v biofilmu. Produkce rhamnolipidů je nezbytná nejen pro vytvoření typické morfologie biofilmu u Pseudomonas aeruginosa, ale tyto glykolipidy fungují také jako ochrana biofilmu před jeho kolonizací bakteriemi z vnějšího prostředí. Gen pro sporulaci spo0A je významný pro tvorbu biofilmu u Bacillus subtilis. Těsně před přilnutím na vhodný povrch se aktivuje řada genů odpovědných především za zvýšenou pohyblivost buněk. Ve fázi dotyku se uplatňují bičíky, jejichž tvorba se dramaticky zvyšuje. V pohybu a přichycení bakteriálních buněk pomáhají i další proteinové povrchové struktury, například fimbrie a curli (kudrlinky), nedávno popsaný nový druh Pro iniciální adhezi E. coli není nutný pohyb bičíků a přítomnost exopolysacharidu (kyselina kolanová), naopak pro primární adhezi na inertní povrchy a vývoj vícevrstvých buněčných shluků je vyžadována syntéza kudrlinek. Doposud byla popsána celá řada extracelulárních struktur složených z proteinů nebo polysacharidů, které jsou považovány za nezbytné pro interakci s inertními povrchy. Povrchové složky bakteriálních buněk, jako jsou bičíky, fimbrie nebo exopolysacharidy, pomáhají překonat elektrostatické odpuzovací síly mezi povrchem substrátu a bakteriální buňkou. Pohyb vyvolaný bičíky (flagellar-mediated motility) je významný při vytvoření kontaktů mezi buňkou a povrchem a byl popsán zejména u Pseudomonas sp., naopak pohyb pomocí pil čtvrtého typu (type IV pili), tzv. twitching motility, hraje důležitou roli při vytváření prvotní struktury biofilmu, speciálně při tvorbě mikrokolonií. Není však dosud jisté, zda bičíky hrají přímou roli jako adheziny či jsou vyžadovány pro přiblížení buňky do těsné blízkosti povrchu. Různé genetické studie prokázaly, že pro stabilní přichycení a tvorbu biofilmu jsou kromě bičíků a fimbrií vyžadovány specifické adheziny vnější membrány, jako je např. manosenzitivní hemaglutinin (MSHA) u Vibrio cholerae E1 Tor nebo autolysin AtlE u Staphylococcus epidermidis. Tvorba biofilmu je dynamický proces a v různých stadiích jsou produkovány různé geny. Např. „flagellar geny“ jsou zapojené do tvorby raného biofilmu, ale nejsou potřebné ve zralém biofilmu. Při genetických studiích je proto potřeba být opatrný při interpretacích získaných výsledků. Některé geny mohou být exprimovány jako odpověď na specifický povrch, který se bakterie rozhodla kolonizovat. Např. chitin, polymer N-acetylglukosaminu, je složkou exoskeletu korýšů a hmyzu. Přisednutí a degradace chitinu jako zdroje živin je významnou částí přežití pro celou řadu druhů mořských bakterií rodu Vibrio. Strukturní geny, které jsou významné pro přichycení na chitin, se liší od těch, které jsou vyžadovány pro přichycení na abiotický, živinami chudý povrch, jakým je např. plast či sklo. I když je okolní médium bohaté na živiny, bakterie přesto přisedaly na chitin. U některých mořských bakterií bylo prokázáno, že chitináza a „chitin-binding“ geny jsou selektivně exprimovány v přítomnosti chitinu. To znamená, že když je okolní médium bohaté na živiny, bakterie přisedá na jakýkoliv povrch, zatímco když je prostředí živinami chudé, bakterie se preferenčně přichytí na povrch nutričně bohatší. Tato adaptace zajišťuje bakteriím maximální přístup k živinám jak v prostředí chudém, tak v prostředí bohatém na živiny.

7.3.3

Růst a diferenciace biofilmu - Horizontální přenos genů v biofilmu

Buňky v biofilmu spolu metabolicky spolupracují a dochází u nich k vyššímu stupni genetické výměny. Kromě toho zde dochází díky poměrně úzkému kontaktu mezi jednotlivými buňkami k intenzivní výměně genetické informace, zvl. jde o konjugaci a přenos plazmidů. Tímto způsobem se mohou mezi jednotlivými populacemi v biofilmu poměrně rychle šířit např. plazmidy nesoucí geny, které kódují rezistenci k antibiotikům aj.

66

Transdukce je zprostředkována přenosem DNA mezi buňkami prostřednictvím bakteriofágů. Je poměrně specifická, protože bakteriofágové mají omezený rozsah hostitelů, a proto je genetický přenos možný pouze mezi dvěma úzce příbuznými druhy. Doposud není zcela jasné, jestli se bakteriofágové biofilmových bakterií vyskytují běžně v prostředí. Mimoto se pronikání fágů do biofilmů jeví jako poměrně náročné. Konjugace vyžaduje, aby živý a aktivní dárce a příjemce byl v době přenosu genů ve vzájemném kontaktu. Obecně se soudí, že konjugace je nejvýznamnějším mechanizmem přenosu genů v přírodě. U biofilmů byla studována např. v biofilmových reaktorech, aktivovaném kalu či v laboratorních modelech biofilmů. Přírodní genetická transformace je definována jako příjem volné DNA, uvolněné do prostředí lyzí nebo exkrecí, bakteriálními kmeny kompetentními pro transformaci. Transformaci v biofilmu Acinetobacter sp. byla prokázána v roce 2003. Dosavadní výsledky naznačují, že architektura biofilmu představuje kritický faktor v určení výsledku konjugace a transformace v biofilmech. Např. v případě konjugace otevřené kanálky a póry umožňují hlubší proniknutí donorových buněk biofilmem a četnější kolizi s dalšími buňkami; výsledkem je rychlejší šíření genů v biofilmu horizontálním přenosem. Zvýšená pozornost je v poslední době věnována roli mimobuněčné volné DNA v tvorbě biofilmů. U volnění DNA a transformace se zdá být částí biofilmového cyklu, uvolnění DNA stabilizuje strukturu biofilmu. 7.3.4

Dynamika tvorby biofilmu a jeho maturace

Po úspěšném přichycení bakterií k povrchu biomateriálu následuje fáze růstu (akumulace) a diferenciace zrání (maturace) biofilmu. Je stimulována exprese genů podílejících se na tvorbě složité struktury biofilmu, zvláště na tvorbě extracelulární polymerní matrice a mění se fyziologie bakteriálních buněk. V této fázi je bakteriemi produkováno poměrně velké množství extracelulární polymerní substance (EXPS), tzv. slizu, různého chemického složení. EXPS je společně s bakteriálními buňkami v mikrokoloniích základní stavební složkou biofilmu a výrazně ovlivňuje jeho vlastnosti. Jejím hromaděním v okolí mikrokolonií se postupně vytváří vyzrálá vrstva biofilmu. Iniciální kolonizátoři povrchu substrátu vykazují relativně vysokou rychlost růstu; buňky na okraji mikrokolonií proto v důsledku formují na povrchu své replikáty rychleji než buňky v centru kolonie. Po určité době se rychlost růstu biofilmu zpomalí a tloušťka biofilmu dosahuje určité ustálené hodnoty. Zpomalení růstu je dáno omezením transportu substrátu do hlubších vrstev biofilmu a zvýšení m vlivu odumírání a rozkladu buněk ve stárnoucím biofilmu. Výsledná tloušťka biofilmu a jeho povrchová morfologie jsou výsledkem působení následujících vlivů: (i) zachycování dalších bakterií z okolní proudící vody; (ii) vlastní růst a množení mikroorganizmů a produkce EXPS; (iii) odumírání a rozklad buněk; (iv) strhávání části biofilmu zpět do okolní proudící vody. Strhávání biofilmu se děje buď mechanickým otěrem proudící kapalinou (shear stress), nebo spontánním samovolným strháváním. Jednotlivé kroky tvorby biofilmů u různých bakterií se mohou navzájem lišit. Např. Staphylococcus eidermidis produkuje slizu podobnou exopolysacharidovou matrici, Pseudomonas aeruginosa vytváří exopolysacharidovou matrici podobnou kyselině algové.

67

7.4 Extracelulární polymerní matrice Jednou z nejvíce odlišných charakteristik biofilmů ve srovnání s planktonními populacemi je, že buňky jsou zanořeny do extracelulární polymerické matrice (Extracellular polymeric matrix – EPM), o které zatím víme velmi málo. EPM jsou produkovány bakteriemi, případně eukaryoty v biofilmu a vytvářejí extracelulární matrici, ve které jsou bakterie fixovány. V současnosti se ukazuje, že strukturální integrita biofilmů velmi závisí na EPM produkované buňkami biofilmu. Biofilmová matrice je velice dynamický systém, ve kterém mikrobiální buňky dosahují homeostáze a jsou optimálně organizovány tak, aby využily dostupných živin. Jinými slovy, extracelulární matrice přispívá podstatně k organizaci biofilmového společenstva a nejčastěji je to matrice, která působí většinu ekonomických problémů spojovaných s tvorbou biofilmů. Složení matrice vychází z kombinace z vnitřních faktorů, jako jsou genotyp přisedlých buněk a vnějších faktorů, které zahrnují okolní fyzikálně-chemické prostředí a povahu kolonizovaného substrátu. Proto složení matrice a její fyzikální podmínky mohou značně kolísat, ačkoli tato je produkována identickými organizmy. Matrice se skládá především z vody a dále z látek anorganických a organických, přičemž významnou roli ve struktuře mají (exo)polysacharidy. Voda může být v biofilmu vázaná v kapsulích mikrobiálních buněk, nebo existuje jako rozpouštědlo, jehož fyzikální vlastnosti, jako je např. viskozita, jsou determinovány roztoky v něm rozpuštěnými. Z ostatních látek se v matrici kromě vody a mikrobiálních buněk nachází komplex vyloučených polymerů, absorbovaných živin a metabolitů, produktů buněčné lýze a někdy i partikulovaného materiálu a detritu z okolního prostředí. Kromě hlavních skupin makromolekul – proteinů, polysacharidů, DNA a RNA – jsou zde přítomné rovněž peptidoglykany, lipidy, fosfolipidy a další složky buněk (Tab. 8). V matrici některých půdních a vodních biofilmů byly detekovány i stopové koncentrace huminových kyselin. Tab. 8 Složení biofilmové matrice (ex Sutherland 2001b) Složka Voda Mikrobiální buňky Polysacharidy (homo- a heterosacharidy) Proteiny (extracelulární a výsledek lýze) DNA a RNA Ionty

% matrice až 97 % 2–5 % 1–2 % (neutrální a polyanionická)  1–2 % (včetně enzymů)  1–2 % (z lyzovaných buněk) ? (vázané a volné)

Kromě fixace buněk slouží EPM jako vysoce selektivní síto limitující pohyb plynů, rozpuštěných solí a makromolekul do a z jednotlivých mikrokolonií biofilmu. Jinou významnou vlastností biofilmů je vychytávání a koncentrace nutrientů a organických látek z okolní vody, což umožňuje bakteriím růst v extrémně oligotrofních podmínkách. Biofilmy mohou rovněž skladovat organické složky, které zadržují v přítomnosti extracelulárních enzymů produkovaných bakteriemi biofilmu. To umožňuje bakteriím rozkládat refraktorní složky, jako je např. lignin, které jsou jinak jako potravní zdroj pro volně žijící buňky nedostupné. EPM dále slouží jako velmi účinná ochrana před nepříznivými účinky vnějšího prostředí (antibiotika, toxicita apod). Buňky Pseudomonas aeruginosa chráněné v biofilmu vrstvou alginátu byly jen nepatrně ovlivněny ve srovnání s planktonními buňkami. Biofilm s vrstvou alginátu propouštěl pouze malé množství UV záření, což naznačuje, že biofilmové exopolymery mohou být přírodní ochranný mechanizmus používaný k zeslabení vlivu UV v přírodních podmínkách. Tato

68

atenuace UV se odrazila ve vyšším procentu přežívání u alginátem obalených buněk, zatímco u planktonních kultur vystavených stejné expozici UV záření byla pozorována úmrtnost daleko větší. Ačkoliv exopolysacharidy netvoří hlavní složku matrice (obvykle 1-2 %), jsou považovány za hlavní strukturní složku, která poskytuje kostru pro komplexní biofilm. Stručně řečeno, exopolymery poskytují skelet, do kterého jsou mikrobiální buňky a jejich bioaktivní produkty zapuštěny. Podle jejich chemického složení, antigenní specifity a typu biosyntézy se polysacharidy rozdělují do dvou skupin: specifické a nespecifické polysacharidy.

7.4.1

Specifické polysacharidy

Speciální polysacharidy, nazývané někdy polysacharidové antigeny, jsou specifické pro individuální bakteriální kmeny. Typickými složkami specifických polysacharidů jsou běžné cukry jako glukóza, galaktóza, manóza, ramnóza, N-acetylglukozamin, kyselina glukuronová a galakturonová. Typické specifické polysacharidy jsou složeny z opakujících se jednotek lineárních či rozvětvených oligosacharidů, seřazených do polymeru prostřednictvím lipidového meziproduktu. Opakující se oligosacharidové jednotky mohou obsahovat 2–9 monosacharidů a další organické substituenty jako jsou např. běžně zjišťované pyruvát a acetát. Anorganické substituenty jako sulfát jsou v bakteriálních polysacharidech méně běžné než v polysacharidech řas. Navzdory zjevně pravidelnému strukturnímu vzorci polysacharidů, složených z opakujících se oligosacharidových jednotek, je běžně zjišťována značná strukturní variace ve vlastnostech EPM. V závislosti na bakteriálním kmenu, růstových podmínkách a fyzikálně-chemických metodách zpracování vzorku mohou kolísat jak délka řetězce, tak i vzorce (pattern) substituentů. Specifické polysacharidy jsou nazývány polysacharidovými antigeny, protože vykazují specifické imunologické vlastnosti. Lipopolysacharidy a teikoové kyseliny, které jsou složkami buněčné stěny, ale nejsou klasifikovány jako extracelulární polysacharidy, jsou také antigenní. Antigenní specifita těchto polymerů spočívá nejen v individuálních monosacharidech, ale také v pozici a konfiguraci glykozidických vazeb. Proto i omezený počet rozdílných monosacharidů může dát vzniknout velkému počtu antigenů, tj. velkého počtu polymerů s chemicky i fyzikálně rozdílnými vlastnostmi. 7.4.2

Nespecifické polysacharidy

Nespecifické polysacharidy jsou nacházeny u mnoha bakteriálních kmenů a jsou strukturálně odlišné a všeobecně jednodušší než specifické polysacharidy. Většina z nich jsou homopolysacharidy, obsahující pouze jediný monomer. Např. extracelulární celulóza produkovaná několika druhy rodu Acetobacter je chemicky podobná celulóze vyšších rostlin, tj. -1,4-spojených nevětvených glukanů. Dextrany jsou polysacharidy s -1,6-spojenou glukanovou kostrou, obsahujících obvykle větve glukanu. Dextrany a podobné -1,3-spojené glukany jsou produkovány několika bakteriálními kmeny, přičemž významné jsou zejména polysacharidy produkované ústními streptokoky, protože tyto organizmy mohou tvořit biofilmy v ústní dutině včetně zubů. Organizmy mohou produkovat i dva rozdílné polysacharidy. Např. v kultuře produkoval marinní kmen Pseudomonas sp. NCMB 20021 typický heteropolysacharid (PS-A) během exponenciální fáze růstu, zatímco jiný polysacharid (PS-B) během zpomalení růstu a ve stacionární fázi.

69

7.4.3

Extracelulární polysacharidová substance u klinicky významných mikrobů a její význam

Extracelulární polysacharidové substance (EXPS), někdy též zvaná sliz, je klíčovou stavební složkou biofilmů a je zodpovědná za většinu jejich fyzikálních, chemických i biologických vlastností. V první fázi tvorby biofilmu se obvykle podílí na primární adhezi buněk k pevnému podkladu, později pak na vzájemné agregaci bakteriálních buněk a na tvorbě mikrokolonií. EXPS má také zásadní vliv na schopnost biofilmu odolávat nepříznivým vlivům zevního prostředí. V těle hostitele jde především o omezení účinku antibakteriálních látek používaných při terapii a o imunitní systém. Chrání bakteriální buňky před opsonizací, účinky komplementového systému a před fagocytózou. Znalost struktury EXPS obklopující mikrobiální buňky v biofilmu má význam jak pro pochopení mechanizmů tvorby biofilmu, tak pro vysvětlení její schopnosti chránit bakteriální buňky před působením imunitního systému i před účinky některých antibiotik. Jednou z nejznámějších EXPS je tzv. alginát, který byl poprvé izolován z bakterií (P. aeruginosa) v roce 1966. Později byla jeho tvorba zjištěna i u dalších pseudomonád (P. syringae, P. viridiflava, P. corrugata, P. fluorescens, P. putida, aj.), později také např. u rodu Azotobacter. Alginát hraje u těchto bakterií významnou roli jako faktor virulence. Stává se důležitým stavebním prvkem biofilmu a chrání bakterie v něm obsažené. Mukózní alginát produkující kmeny P. aeruginosa jsou původci těžkých chronických pneumonií u pacientů s cystickou fibrózou. Díky tvorbě alginátu se v plicích tvoří pseudomonádový biofilm chránící bakterie před účinky antibiotik, což výrazně komplikuje léčbu. Dále bývají mukózní kmeny pseudomonád izolovány i z dalších chronických infekcí, např. infekcí středního ucha a močových cest. Tvorba alginátu je však široce rozšířena i mezi kmeny ze zevního prostředí. Rostlinným patogenům usnadňuje kolonizaci a infekci rostlin. Podobně jako kmenův v těle hostitele poskytuje i těmto kmenům ochranu před nepříznivými podmínkami zevního prostředí, jako je vyschnutí, UV záření aj. Alginát je polymer složený z podjednotek: -D-mannuronové kyseliny a jejího C-5-epimeru, -Lglukuronové kyseliny. Jednotlivé podjednotky tvoří homopolymerní struktury (poly-mannuronát či poly-glukuronát) či heteropolymery. Tyto polymery jsou obvykle ve 2. či 3. pozici jednotlivých podjednotek O-acetylovány. Chemické složení, míra acetylace, přítomnost negativního náboje a velikost molekuly určují vlastnosti a míru viskozity polymeru. Alginát P. aeruginosa neobsahuje větší bloky poly-glukuronátu, takže vytváří poměrně flexibilní, tekuté gely. Vysoké procento Oacetylace tohoto polymeru zároveň zvyšuje jeho schopnost vázat vodu. Syntéza alginátu vychází z meziproduktů metabolizmu uhlohydrátů. Za syntézu alginátu z těchto látek je zodpovědná celá řada genů, nejméně 24 genů, které jsou lokalizovány na bakteriálním chromozomu. Celá metabolická dráha syntézy alginátu a její regulace je poměrně složitý proces, jehož některé části ještě nejsou zcela objasněny buněk k pevným povrchům, kdy dochází k aktivaci těchto genů a zvýšená tvorba alginátu se podílí na vytvoření stabilního zralého biofilmu. Kmeny, u kterých je syntéza této substance či regulace její syntézy narušena, obvykle nejsou schopny pevné adheze k povrchům a netvoří biofilm. Další typický příklad extracelulárního polysacharidu, který hraje klíčovou roli v tvorbě bakteriálního biofilmu a podílí se na virulenci bakterie, je stafylokoková extracelulární polysacharidová matrice (EPM). Její hlavní součástí je poly-N-acetyl-glukosamin (PNAG). Poprvé byla tato látka popsána jako tzv. kapsulární polysacharid/adhesin (PS/A), zodpovědný za adhezi buněk S. epidermidis. Ukázalo se také, že chemická struktura PS/A odpovídá struktuře polysacharidového intercelulárního adhesinu (PIA). PIA byl identifikován jako klíčová složka, která umožňuje agregaci stafylokokových buněk a touto cestou i jejich akumulaci v biofilmu.

70

PIA, SAA a PS/A jsou tedy prakticky stejné chemické entity a jejich syntéza je kódována stejnými geny, geny ica operonu. Za jejich základní strukturu je v současné době považován lineární homopolymer N-acetylglukosaminu vázaný beta-1-6-glykosidickou vazbou, jehož podjednotky bývají náhodně deacetylovány (16,40 %) a volné aminoskupiny dávají tomuto polysacharidu kladný náboj. PNAG může být v malé míře esterifikován O-sukcinátem či acetátem. Podobného složení je i EPS produkovaný kmeny S. aureus a zřejmě i ostatními stafylokoky. Deacetylace v molekule EPS vytváří pozitivní náboje díky vzniku volných aminoskupin, které jsou nezbytné pro správnou funkci EPS. Pozitivní náboj EPS umožňuje pevnou adhezi této substance k negativně nabitému povrchu bakterie. Je jednak nezbytný pro lokalizaci této substance na povrchu bakteriální buňky, jednak je zodpovědný za agregaci bakterií. Částečná deacetylace EPS je také nezbytnou podmínkou pro její rozpustnost ve vodě, na rozdíl od kompletně acetylované EPS, která se ve vodním prostředí sráží. Bylo prokázáno, že ztráta kationického charakteru nedeacetylované EPS u izogenického icaB-delečního mutanta S. epidermidis vede ke snížení schopnosti přilnout na povrchy, vytvářet biofilm, odolávat antibakteriálním peptidům (humánní beta-defensin 3) a perzistovat na katétrech podkožně zavedených pokusným zvířatům. Z toho vyplývá, že právě enzymatická modifikace EPS deacetylací je rozhodujícím momentem v syntéze EPS určující její správnou funkci. EPS má antigenní charakter a protilátky proti jejím antigenním strukturám mají protektivní efekt, brání kolonizaci povrchů a tvorbě biofilmu. Pokusy na zvířatech ukázaly, že vakcinace purifikovanou PNAG vede ke zvýšení rezistence vůči stafylokokovým infekcím, jako jsou infekce katétrové či infekční endokarditida. Syntéza EPM je uskutečňována enzymy, které jsou kódovány geny icaC a opačně transkribovaný gen icaR s funkcí represoru, zodpovědného za regulaci transkripce ica operonu. Produkt genu icaA, membránový protein IcaA s UPD-N-acetyl-glukosamintransferázovou aktivitou, syntetizuje Nacetylglukosaminové oligomery o délce 15-20 zbytků. Jeho aktivita je potencována membránovým proteinem IcaD, který zřejmě zprostředkovává vazbu mezi IcaA a IcaC. Další z membránových proteinů IcaC se pravděpodobně podílí na tvorbě delších řetězců PNAG z oligomerů a transportuje je skrze cytoplazmatickou membránu extracelulárně.

7.5

Koagregace a koadheze

Vývoj mnohodruhového biofilmu je spojen s koadhezí a koagregací geneticky odlišných druhů bakterií. Mechanizmy obou interakcí jsou identické. Pokud se fyzikální interakce vyskytují mezi suspendovanými buňkami, je proces nazýván koagregací. Pokud se vyskytuje mezi suspendovanými a již přisedlými buňkami v biofilmu, hovoříme o koadhezi. První organizmus, který přisedne na povrch, se nazývá primární (primary, early) kolonizátor a primární kolonizace je zprostředkována specifickými nebo nespecifickými fyzikálně-chemickými interakcemi se složkami adsorbovaného, organického filmu. Primární kolonizátor se pak na povrchu substrátu množí a vytváří mikrokolonie. S vývojem mladého biofilmu dochází ke změně podmínek prostředí a substrát se pokrývá bakteriemi. Sekundární kolonizátoři jsou pak schopni se přichytit na kolonizátory primární a biofilm se začíná vyvíjet v multidruhový biofilm. Koagregace přispívá k vývoji biofilmu dvěma způsoby: (i) jednotlivá buňka v suspenzi specificky rozezná a přisedne na geneticky odlišnou buňku vyvíjejícího se biofilmu, (ii) ke koagregaci dojde již v suspenzi sekundárního kolonizátora a tento koagregát pak následně přisedá na vyvíjející se biofilm. V obou případech bakteriální buňky v suspenzi (planktonické buňky) specificky přisedají na buňky v biofilmu v procesu známém jako koadheze. Přisedlé buňky se poté stávají součástí biofilmového společenstva. Koagregace mezi bakteriemi je zprostředkována nejčastěji interakcemi lektin-

71

sacharid. Kromě zubního plaku, kde byly studovány nejčastěji, byly koagregace popsány i u sladkovodních bakterií.

7.6 Regulace tvorby biofilmu Některé buňky se z kolonií odlučují, přecházejí zpět do planktonního stavu a mohou kolonizovat další části povrchu. Pravděpodobnou příčinou tohoto chování je zvyšující se konkurence buněk v biofilmu. Chemické signály vycházející z buněk umožňují buňkám zjišťovat existenci okolních buněk, resp. upozorňují okolní buňky na svou přítomnost a zabraňují tak dalšímu přehušťování populace. Produkce signálních látek (tzv. autoinducers) stoupá se zvyšující se hustotou populace a tyto látky se ve vysokých koncentracích hromadí v buňkách i v jejich okolí. Lze je prokázat také na místě, odkud byl biofilm již odstraněn, resp. detekce signálních látek může indikovat výskyt biofilmu v určitých místech. Tento způsob vnitrobiofilmové komunikace je označován pojmem „quorum sensing“ (vnímání množství) a v současnosti existuje celá řada informací o tomto zajímavém fenoménu. Existence jakékoliv mezibuněčné bakteriální komunikace byla dlouhou dobu skepticky přehlížena a bakteriální buňka byla vnímána jako „soběstačné individum neschopné tvorby skupin či vzájemné komunikace“. Quorum sensing byl poprvé rozpoznán v sedmdesátých letech u mořské bakterie Vibrio fischeri, kde kontroluje luminiscenci. Tyto bakterie se vyskytují často jako mutualistický světelný orgán (fotofory) v symbióze s určitými mořskými organizmy a jsou schopné luminiscence pouze tehdy, když dosáhnou dostatečné buněčné denzity. Bakteriální extracelulární signál, který spouští luminiscenci, byl později určen jako acyl-homoserin lakton. Dosud bylo popsáno několik rozdílných typů signálů. Gramnegativní bakterie využívají jako signální molekulu v systému quorum sensing, zahrnující dva klíčové proteiny LuXl a LuxR, více různých chemických látek, nejčastěji N-acyl-homoserin laktony, složené z mastné kyseliny a aminokyseliny serinu (N-acyl-homoserine lactons, Acyl-HSLs). U grampozitivních mikrobů jsou to obvykle krátké oligopeptidy, které lze přirovnat k feromonům či hormonům a u stafylokoků cyklické peptidy s thionolaktonovým kruhem. Třetí intenzivně studovanou skupinou, která se nachází jak u gramnegativních, tak grampozitivních baktetií, je skupina signálních látek, označovaná jako autoinducer-2 (AI-2). V případě grampozitivních bakterií to obvykle bývají krátké oligopeptidy. Signální látky řídí dělení buněk, a tím hustotu populace v biofilmu a tvorbu hlenové polysacharidové matrice. Kromě laboratorního prostředí byly acylhomoserinové laktony zjištěny rovněž v klinickém prostředí močových katétrů a rovněž v přírodním biofilmu a v prostředí agregátů tzv. „mořského sněhu“. Acyl-HSL systém je pravděpodobně nejstudovanějším signálním systémem. Jedná se o malé signílní molekuly, které nemají žádnou jinou funkci. Tyto signály jsou produkovány specifickými enzymy a detekovány specifickými receptory. U jedné z nejstudovanějších baktetií, Pseudomonas aeruginosa, byly jako quorum sensing signální molekuly identifikovány N-butanoyl-L-homoserinlakton (C4-HSL) a N-(3-oxododecanoyl)-Lhomoserinlakton (3-oxo-C12-HSL), produkované expresí enzymů lasI a rhlI. Signály mohou difundovat do okolního prostředí, avšak buněčná koncentrace je definována koncentrací v prostředí. A koncentrace v prostředí může vzrůstat pouze tehdy, pokud je dostatečná populace signál produkujících bakterií. Regulace pomocí systému quorum sensing je zpravidla třífázový proces). V první fázi bakterie produkují specifické signální molekuly. Signální molekuly quorum sensing systému vznikají zpravidla intracelulárně a do zevního prostředí jsou transportovány aktivně, příp. volně difundují. Jiné však mohou být původně součástí bakteriálního povrchu, nebo se mohou vyskytovat v zevním prostředí bakterie a jsou aktivovány až působením příslušného, bakterií produkovaného, enzymu. Ve druhé fázi dochází ke kumulaci signálních molekul v zevním prostředí okolo bakteriální buňky, především díky rostoucí populační hustotě bakterií, které je produkují. Ke kumulaci může také dojít 72

díky přítomnosti struktur, které jsou pro tyto molekuly neprostupné (např. extracelulární matrice hostitelské tkáně nebo EPS v biofilmu). Ke třetí fázi dochází až při překročení prahové koncentrace signální molekuly. Signální molekula se pak naváže na membránový receptor n povrchu bakteriální buňky a poté se aktivuje intracelulární regulátorový protein, který spustí fosforylační kaskádu vedoucí k expresi celé řady genů. Tímto způsobem pak mezibuněčná komunikace zprostředkovaná systémem quorum sensing ovlivňuje regulaci exprese faktorů virulence u celé řady patogenních bakterií. Jiné typy signálních molekul, např. cyklické dipeptidy či diketo-piperaziny, pronikají do buňky a přímo se vážou na regulátorový protein. Intenzivní komunikace mezi jednotlivými bakteriemi i celými mikrokoloniemi v biofilmu prostřednictvím signálních molekul se podílí na regulaci procesu tvorby biofilmu. Vliv systému quorum sensing na tvorbu biofilmu byl studován u celé řady bakterií, např. u Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Aeromonas hydrophila, Strptococcus mutans, Strptococcus gordonii, Bacillus subtilis a dalších. Jedním z nejdůležitějších poznatků výzkumu různých signálních systémů je zjištění, že quorum sensing představuje významný mechanizmus regulace genů spojených s virulencí a že u mnoha G- a G+ bakterií absence jedné či několika složek quorum sensing (QS) systému může způsobit významnou redukci virulence. Častou otázkou je, jaký má pro bakterie vlastně význam kontrola virulence pomocí QS. Zdá se, že je ekonomické produkovat extracelulární faktory až poté, co bylo dosaženo kritické populační hustoty. QS totiž umožňuje bakteriálnímu patogenovi koordinovat syntézu extracelulárních virulentních faktorů tak, že se neuplatní v ranéfázi infekce, kdy je bakteriální populace slabá. Naopak načasování uvolnění virulentních faktorů může vést k tomu, že patogen se může postupně hromadit bez uvolňování virulentních faktorů a pak překvapí útokem, ve kterém je arzenál virulentních faktorů vypuštěn v koordinované a ohromující podobě. U oportunního bakteriálního patogenu Pseudomonas aeruginosa bylo zjištěno, že quorum sensing kontroluje  4 % ze zhruba 6 000 genů.

7.6.1

Quorum sensing a tvorba biofilmu

Zajímavé výsledky přinesly studie zabývající se vztahem mezi quorum sensing a tvorbou zralého biofilmu. Např. u Pseudomonas aeruginosa bylo zjištěno, že mutace enzymu lasI má značný dopad na tvorbu zralého biofilmu. LasI mutanti totiž nejsou schopni syntézy signálu 3OC12-HSL a vývoj biofilmu je tak zastaven po vytvoření mikrokolonií, ale před zráním mikrokolonií do silně strukturovaného uskupení. Biofilm mutanta LasI je proto plochý a nediferencovaný. Architektura normálního biofilmu může být obnovena přidáním quorum sensing signálu 3OC12-HSL, generovaného LasI. Velmi zajímavé bylo zjištění, že biofilm LasI mutantů byl mnohem náchylnější na ošetření detergentem SDS, zatímco přírodní typ biofilmu (nemutantní) byl rezistentní. Tato pozorování podporují myšlenku, že antimikrobiální terapie cílené na mechanizmus quorum sensing P. aeruginosa mohou vést ke vzniku abnormálních biofilmů, které jsou více náchylné na ošetření. Ačkoliv každý bakteriální druh produkuje a odpovídá na vlastní specifický signál, není vyloučeno, že by tyto signály mohly být potenciálně přijímány nejen „vlastními“ druhy, které je produkují, ale i dalšími, nepříbuznými druhy. Někteří vědci soudí, že jako „univerzální signál“ pro mezidruhovou komunikaci by mohl fungovat signální „autoinducer“ AI-2, závislý na LuxS proteinu. Některé výzkumy z poslední doby však naznačují, že acyl-homoserinové molekuly nemusí fungovat pouze mezi bakteriemi, ale že by mohly být významné i v „komunikaci“ mezi bakteriemi a eukariotickými buňkami.

73

Velmi zajímavé poznatky z oblasti quorum sensing a tvorby biofilmu byly získány v poslední době studiem symbiotického vztahu mezi malou olihní sepiolou kropenatou (Euprymna scolopes) z vod Tichého oceánu a gramnegativními bakteriemi Vibrio fischeri. Tito hlavonožci žijí v symbióze se světélkujícími bakteriemi – sepioly bakteriím poskytují domov ve svých světelných orgánech a bakterie na oplátku produkují záblesky bioluminiscence, kterými sepioly odrazují nepřátele. Zajímavé je, že v této symbióze žijí jen některé kmeny bakterií Vibrio fischeri, jiné dávají přednost rybám a olihním se vyhýbají. Tento rozdíl spočívá v jediném regulačním genu (rscS), který se vyskytuje u bakterií žijících v sepiolách, ale chybí těm kmenům, které žijí v symbióze s rybami. Díky tomuto genu dokážou bakterie ve světelných orgánech sepiol vytvořit biofilm, který je nezbytnou podmínkou k tomu, aby bakterie dokázaly kolonizovat světelné orgány čerstvě vylíhlých sepiol. Hostiteli pak biofilm signalizuje, že se do jeho orgánů dostal správný druh bakterie, se kterým je možné žít v symbióze. Čerstvě vylíhlé mladé sepioly jsou aposymbiotické, tj postrádají dosud své symbioty, které potřebují získat z okolní mořské vody. V okolí svého světelného orgánu na spodní straně těla proto začnou vylučovat sliz, který přitahuje bakterie, žijící volně v moři. Buňky světelného orgánu pečují o bakterie Vibrio fischeri a zároveň ničí všechny jejich bakteriální konkurenty. Vibrio fischeri se hostiteli za jeho péči odvděčí produkcí světla. Jakmile se bakterie namnoží do potřebného počtu, začnou svítit. Sepiola se osvětlenou spodní stranou těla maskuje. Když pluje v noci volně mořem, byla by její silueta při pohledu ode dna dobře vidět proti měsícem ozářené hladině. Zajímavé je, že ráno sepiola 90-95 % bakterií ze světelného orgánu vypudí a tím jej vypne. Orgán se rozsvítí opět až večer, když se bakterie namnoží na potřebné množství. Vibrio fischeri a Vibrio harveyi jsou dva druhy lumineskujících bakterií, které byly dosud intenzivně studovány. V. fischeri je symbiotická bakterie žijící ve světelných orgánech některých ryb (čeleď Monocentridae) a hlavonožců rodů Sepiola a Euprymna. V. harveyi je volně žijící bakterie, která je příležitostně nalézaná na povrchu mořských organizmů či v jejich trávicím traktu. Bakteriální luminiscence u V. fischeri i V. harveyi je regulována několika geny, kódujícími enzym luciferázu (geny luxA a luxB). U obou druhů jsou tyto geny organizovány v operonu společně s dalšími geny, které se podílejí na bioluminiscenci. Exprese těchto genů je regulována mechanizmem quorum sensing – výsledkem tohoto mechanizmu je, že účinnost světelné emise závisí na koncentraci buněk v prostředí. Luminiscence je produkována bakteriální luciferázou, která využívá FMNH2, O2 a aldehydy s dlouhým řetězcem jako substrát. Při nízkých buněčných abundancích, které jsou dosahovány v mořském prostředí, jsou lux geny syntetizující luciferázu vypnuté a bakteriální buňky nesvětélkují. Avšak poté, co bakterie kolonizují světelný orgán hostitele (ryby nebo hlavonožce), kde se pomnoží a dosáhne vysokých abundancí, dojde k indukci lux genů syntéze luciferázy. Jinými slovy, bakteriální luminiscence je účinná tehdy, pokud se buňky vyskytují při vysoké hustotě, zatímco emise světla je nepatrná v naředěných kulturách.

7.7 Struktura a fungování biofilmu Doposud bylo v literatuře prezentováno několik různých strukturálních modelů biofilmu (např. model splývavého růstu – confluent growth model, model heterogenní mozaiky – heterogenous mosaic model či model houbovitých strutur – mushroom structure model, jejichž objektivita a opodstatněnost byla potvrzena použitím nejrůznějších technik, včetně kyslíkových mikrosenzorů a konfokálního laserového mikroskopu. Struktura biofilmu závisí na fyzikálních (např. transport substrátu) a biologických faktorech (např. výtěžnost růstu a rychlost konverze substrátu). Tvorba biofilmu pak primárně závisí na interakci mezi transportem látek a procesy konverze. Pokud je biofilm silně limitován difuzí, jeví tendenci mít heterogenní a porézní strukturu. Pokud je limitujícím krokem tvorby biofilmu konverze 74

substrátu, pak má biofilm tendenci být homogenní a kompaktní. Na vrcholu těchto dvou procesů hrají velmi důležitou roli procesy odtrhávání. V systémech se silným odtrháváním má stržená část formu eroze a biofilm je hladší; naopak v systémech s malým odtrháváním je biofilm více porézní a odtrhávání se děje zejména odlupováním po částech (sloughing). Struktury biofilmu je proto výsledkem projevů mezi těmito interakcemi (transfer látek, rychlost konverze, odtrhávací síly) a je velmi obtížné studovat systém a brát v potaz pouze jeden z těchto faktorů. Je dobře známo, že biofilmy rostoucí při vyšších rychlostech proudu jsou hustší než biofilmy, které rostou při nižších rychlostech. Je rovněž známo, že hustší biofilmy jsou pravděpodobně odolnější ke zvýšenému smykovému tření, které je důsledkem vyšší rychlosti proudění. V návaznosti na tyto poznatky a na základě svých pozorování a experimentů byla formulována hypotéza, že v závislosti na rychlosti proudu okolní kapaliny, ve které roste, biofilmy vytvářejí svoji vnitřní architekturu za účelem kontroly rychlosti transportu živin a mechanické ohebnosti potřebné k odolnosti proti smykovému tření okolní vody. Zdá se, že biofilmy se pokoušejí uspokojit nejdříve druhý cíl, tj na úkor rychlosti transportu živin do hlubších vrstev zvýšit jejich mechanickou pevnost. Toto zvýšení pevnosti je spojeno se vzrůstem denzity biofilmu, která zpomaluje rychlost interního transportu látek. Zvýšení biofilmové hustoty považují autoři za fyziologickou odpověď biofilmu na zvyšující se smykové tření. Biofilmy rostoucí při nízkých rychlostech vykazují nízkou hustotu a vysokou efektivní difuzivitu, ale nemohou odolávat vyššímu smykovému tření. Naopak biofilmy rostoucí při vysokých rychlostech jsou hustší a mohou odolávat vyššímu smykovému tření, ale mají nižší efektivní difuzivitu. Plně vyzrálý biofilm není homogenní, ale jedná se o heterogenní strukturu: buňky a kupy buněk rozptýlených v matrici, s mezerami a kanálky naplněných vodou, které jsou propojené s okolní tekutou fází. Z různých pozorování a měření, především za použití laserového konfokálního mikroskopu, byl vytvořen trojrozměrný model architektury biofilmu. Bakterie jsou v něm rozloženy nerovnoměrně, rostou v tzv. mikrokoloniích, shlucích kuželovitého nebo houbovitého tvaru. Mikrokolonie jsou navzájem spojeny spletitými kanálky, které mohou většími mikrokoloniemi procházet; tyto kanálky jsou však tenčí a představují jakési póry. Vývoj „zón bez buněk“ (kanálků) může podporovat transport živin a odpadních produktů směrem do hlubších částí a naopak ven z biofilmu. Pomocí mikroelektrod bylo prokázáno, že ve stejné hloubce biofilmu je koncentrace kyslíku v kanálcích mnohem vyšší než v přilehlých shlucích biomasy. Tvorba mikrokolonií je také považována za adaptivní odpověď, která umožňuje přežívání během nepříznivých podmínek, jako je např. predační tlak prvoků či působení antibiotik nebo se jedná o součást „naprogramovaného“ životního cyklu. Myšlenka naprogramovaného vývoje je v současnosti podporována zjištěními, že signální komunikace mezi buňkami může zprostředkovávat formaci mikrokolonií.

7.8 Transport látek a difuze v biofilmech Okolní kapalina obklopující biofilm (bulk liquid phase) obsahující molekuly živin a dalších nezbytných organických a anorganických látek omývá povrch biofilmu a prostřednictvím kanálků a pórů v mikrokoloniích do něj vstupuje. Naopak odnáší z okolí biofilmu metabolické produkty. Z kanálků proudí kapalina póry do nitra větších mikrokolonií a dále se již dostává pouze difuzí, avšak pouze do omezené hloubky biofilmu. S rostoucí hloubkou biofilmu dochází proto ke zřetelnému úbytku koncentrací kyslíku i dalších životně důležitých látek. Transport látek v biofilmech může být rozdělen do dvou zón: externí (z okolní kapaliny do biofilmu) a interní (uvnitř biofilmu). Efektivní difuze (effective diffusivity) v biofilmech kolísá

75

místo od místa, pravděpodobně v důsledku heterogenní struktury biofilmu: husté shluky biofilmových mikrokolonií jsou obklopeny prázdným intersticiálním prostorem. Nejednotná struktura biofilmu pravděpodobně vykazuje nejednotnou distribuci efektivní distribuce. Difuzi v biofilmech lze charakterizovat následovně:   

difuze je hlavním transportním procesem mezi shluky buněk; ve většině biofilmových systémů je časové měřítko pro dosažení difuzního ekvilibria nereaktivních roztoků ve zlomcích sekund až desítek minut; limitace difuze vede rychle ke vzniku koncentračních gradientů reaktivních roztoků a (iv) vodní kanálky přinášejí roztoky do a z hloubky biofilmu, ale nezajišťují přísun do vnitřku buněčných shluků.

V biofilmu je rychlost transportu částic a roztoků ovlivňována vlastní biofilmovou matricí. Ve srovnání s holým podkladem bylo vypočteno, že biofilmy mohou zvyšovat konvektivní transport látek v blízkosti povrchu, protože jejich poddajný charakter zvyšuje hydraulickou drsnost. Drsnost povrchu biofilmu v některých případech zvyšuje vířivou difuzi a externí transfer látek do biofilmu. Viskoelasticita biofilmů byla prokázána experimentálně změnou hydrodynamických podmínek (smykový stres a rychlost proudu) a měřením strukturálních deformací biofilmů způsobených těmito změnami. Biofilmy byly velmi poddajné a rychle se deformovaly změnou smykového napětí. Pokles tloušťky biofilmu o 25 % byl naměřen, když smykové napětí vzrostlo z 0 na 10 Nm-2. Tato deformace byla do určité míry reverzibilní – biofilmy se vrátily do své původní podoby, pokud aplikované změny ve smykovém napětí byly menší než smykové napětí, ve kterém původně rostly. Biofilmy rovněž poskytují ochranu před smykovým napětím a zvyšují povrchovou plochu pro přichycení.

7.8.1

Difuze do biofilmů

Relativní efektivní difuzivita vzrůstá se vzrůstající koncentrací rozpuštěných organických látek (DOM) a s klesající rychlostí proudu. To znamená, že denzita biofilmů rostoucích při nízkých koncentracích živin a vysokých proudových rychlostech (např. v potocích a řekách), je pravděpodobně vyšší, než denzita biofilmů v eutrofních jezerech nebo v čistírnách odpadních vod. Jak růst biofilmu mění hydrodynamické prostředí v toku, simultánně rovněž zvyšuje rychlost depozice suspendovaných organických látek. Biofilmová teorie předpokládá, že retence roztoků nebo příjem organických substrátů jako zdroje uhlíku a energie jsou limitovány difuzí. Před asimilací musí roztoky nejprve projít z okolní kapaliny do povrchové vrstvy biofilmu (external mass transfer) a poté skrz biofilmovou matrici do buněk (internal mass transport). V důsledku toho, jak biofilm roste, se přenos látek stává primárním limitujícím krokem, protože spotřeba substrátu a struktura biofilmu zvyšují odpor k přenosu. Vývoj biofilmu ovlivňuje přenos látek, který má dále vliv na příjem substrátů, lišících se svojí biodostupností. Když začne transport roztoků z vodního sloupce do biofilmu být limitující, dostupnost molekul pro metabolizmus se posune od jejich vlastní biologické lability ke schopnosti difundovat do biofilmu. Hlavní úlohu v procesech přenosu látek a kinetiky příjmu má fyzikální struktura biofilmu. Současné poznatky vyvrátily tradiční pohled na biofilmy jako homogenní struktury podléhající limitaci difuze externího a interního přenosu látek. Naopak zdůrazňují jejich heterogenní strukturu se soustavou kanálků, protubrancemi houbovitých tvarů a kmitajícími vláknitými útvary. Taková heterogenní struktura naznačuje, že alespoň část interních transportních procesů může být advektivních. Zvýšená porozita s větším systémem kanálků pak favorizuje advektivní transport látek, zatímco vysoce fragmentované biofilmové shluky s velkým poměrem plochy k objemu mohou snižovat 76

průměrnou difuzní dráhu molekul substrátu z okolní kapaliny do buněk uvnitř shluků biofilmu. Tyto koncentrační gradienty ovlivňují i složení bakteriálního společenstva biofilmů: při bázi biofilmu (tzv. vnitřní biofilm) se nacházejí pouze anaerobní bakterie, zatímco v povrchové vrstvě (tzv. periferní biofilm) převládají druhy aerobní. Jednodruhové biofilmy striktně aerobních bakterií, např. Pseudomonas aeruginosa, jsou proto podstatně tenčí ve srovnání s biofilmy druhů fakultativně aerobních, resp. vícedruhovými biofilmy. Někdy je stratifikace biofilmu vyvolána kompeticí mezi přítomnými druhy, jako např. mezi heterotrofními a nitrifikačními bakteriemi u aerobního nitrifikujícího biofilmu. Heterotrofní bakterie v důsledku vysoké koncentrace substrátu a vyšší růstové rychlosti dominují v povrchové vrstvě biofilmu a kompetičně vytlačují pomaleji rostoucí autotrofní nitrifikační bakterie do vnitřního biofilmu, kde ovšem strádají nedostatkem kyslíku. Výsledkem je pak zpomalení nitrifikačního procesu, který je však žádoucí z hlediska odstraňování nadbytečného dusíku v odpadních vodách. Pomocí mikroelektrod, které umožňují měřit koncentraci kyslíku, pH, sulfidu, amoniaku, dusitanů, dusičnanů nebo oxidu dusného a studovat mikrozonaci bakteriálních substrátů a produktů v měřítku menším než 100 µm, bylo zjištěno, že v rámci jednoho a téhož biofilmu existuje mozaika navzájem propojených metabolických drah. Protože matrice izoluje mikrokolonie od okolní proudící vody, biofilmy umožňují metabolické aktivity, které jsou zcela odlišné od aktivit v tekoucí vodě. Proto je možné, aby se např. anaerobní aktivity vyskytovaly v aerobních habitatech a také aby se aerobní a anaerobní procesy, jako např. oxidace sulfidů a redukce sulfátů, mohly vyskytovat v odlišných vrstvách téhož biofilmu. Protože matrice udržuje úzkou propojenost mezi mikrokoloniemi rozdílných bakteriálních typů, mohou vznikat místa specificky limitovaných nik. Bakteriální typy, které vyžadují specifické substráty, jako např. metanogenní bakterie vyžadující H2, jsou schopné růstu, protože jsou v těsném prostorovém uspořádání s jinými bakteriálními typy, které tyto substráty produkují. Jinou významnou vlastností biofilmů je vychytávání a koncentrace nutrientů a organických látek z okolní vody, což umožňuje bakteriím růst v extrémně oligotrofních podmínkách. Jako sorpční místa biofilmu slouží EXPS, buněčné stěny, buněčné membrány a buněčná cytoplazma. Tato místa vykazují různé sorpční preference, schopnosti a vlastnosti. Sorpční podmínky se však mohou plynule měnit, protože biofilmy reagují fyziologicky na přítomnost sorbovaných látek. Např. příjem toluenu biofilmem vede k tvorbě uronových kyselin v EXPS, které zvyšují sorpční kapacitu pro kationty. Z hlediska sorpčních schopností se rozlišuje pět oblastí biofilmu: 

EXP s  kationtovými skupinami v aminocukrech a proteinech;  aniotovými skupinami v uronových kyselinách a proteinech;  nepolárními skupinami z proteinů (jako jsou aromatické aminokyseliny);  skupiny s vysokým potenciálem vodíkové vazby, jako jsou polysacharidy.



Vnější membrána a lipopolysacharidy gramnegativních bakterií s jejich lipidovou membránou a lipoteikoové kyseliny u grampozitivních bakterií.



Buněčná stěna složená z N-acetylglukosaminu a N-acetylmuranové kyseliny, poskytující kationtová a aniontová místa.



Cytoplazmatická membrána s lipofilní oblastí.



Cytoplazma – vodní fáze oddělená od okolní vody.

77

Biofilmy mohou rovněž skladovat organické složky, které zadržují v přítomnosti extracelulárních enzymů produkovaných bakteriemi biofilmu. To umožňuje bakteriím rozkládat refraktorní složky, jako je např. lignin, které jsou jinak jako potravní zdroj pro volně žijící buňky nedostupné. Struktura biofilmu a koncentrační gradienty se odrážejí rovněž v distribuci metabolicky aktivních a neaktivních buněk. Rozdílná buněčná aktivita uvnitř biofilmu byla prokázána např. pomocí barvení nukleových kyselin, které odlišuje DNA od RNA, hybridizací 16S rRNA s fluorescenčně značenými sondami či sledováním exprese GFP (green fluorescent protein). Pomocí vitálního barvení a konfokálního laserového mikroskopu byla prokázána v orálním biofilmu přítomnost aktivních buněk v periferním biofilmu, zatímco v bazálním biofilmu převládaly buňky neživé. Podobně pomocí GFP reportérů bylo zjištěno, že aktivní syntéza proteinů u biofilmů Pseudomonas aeruginosa je omezená na úzký pás v části biofilmu přilehlé ke zdroji kyslíku. Tato zóna aktivní exprese GFP proteinů byla široká 30-60 µm. Rovněž prodlužování buněk bylo lokalizováno na rozhraní mezi vzduchem a biofilmem. Autoři se domnívají, že pozorované heterogenní anabolické procesy zjištěné v biofilmu jsou výsledkem limitace biofilmu kyslíkem. Zatímco dospělý biofilm P. aeruginosa obsahuje aktivní rostoucí buňky, může obsahovat rovněž velké množství buněk, které jsou neaktivní a nerostou. Možné vysvětlení nižší proporce živých bakterií v biofilmu je takové, že bakterie jsou časově dislokované od jejich optimálních růstových podmínek. Jak se biofilm během času vyvíjí, primární kolonizátoři – aerobní bakterie, které byly původně v kontaktu s okolní kapalinou, jsou přerostlé vyvíjejícím se biofilmem. Koncentrace sekundárních metabolitů rovněž zhoršuje tuto situaci. Tyto postupné změny v nejbližším prostředí mohou eventuálně vést k usmrcení buněk. Paradigma ochranné biofilmové fáze bakteriálního života je v tom, že usnadňuje vývojový životní cyklus, který kulminuje disperzí fyziologicky odlišných volně žijících buněk, které mohou kolonizovat nové povrchy. Několik současných publikací poukázalo na zvýšenou aktivitu a buněčnou diferenciaci lokalizovanou v centru zralého biofilmu, které vedou k disperzi buněk zevnitř biofilmových struktur a zanechávají po sobě velké průhledné dutiny tvořené nepohyblivými buňkami. Velmi zajímavá kooperace různých typů buněk byla popsána při tvorbě houbovitých struktur biofilmu Pseudomonas aeruginosa. Nohy hřibovitých struktur byly tvořeny klonálním růstem nemotilních buněk, zatímco „klobouky“ byly tvořeny motilními buňkami, které vymigrovaly z noh hřibovitých struktur. V současnosti byly publikovány výsledky pozorování o odumírání určitých subpopulací buněk jak uvnitř jednodruhového biofilmu Pseudomonas aeruginosa, tak v přirozeném multidruhovém biofilmu ústní dutiny. V souladu s tzv. naprogramovanou buněčnou smrtí (Programmed cell deth, PCD) se někteří autoři domnívají, že přežívající buňky v biofilmu profitují ze smrti svých „kolegů“, což jim umožňuje pokračovat v diferenciaci na buňky pohyblivého disperzního fenotypu. Zjištění, že podobně jako u mnohobuněčných organizmů může PCD hrát významnou roli v buněčné diferenciaci a pokračujícím vývoji bakteriálních mikrokolonií, naznačuje možné propojení mezi jednobuněčnými organizmy a kooperací buněk mnohobuněčných organizmů. Studium biofilmů z tohoto hlediska proto představuje nový pohled na vztahy mezi mnohobuněčným vývojem a procesy stárnutí. V centru pozornosti při výzkumu životního cyklu biofilmu jsou nyní dva procesy chování bakterií v biofilmech, které značně zvyšují schopnost přežití a šíření bakterií v prostředí: fenotypová variace a disperze buněk. Buňka dispergující z biofilmu totiž často vykazují vysoký stupeň fenotypové a genotypové variace, která zvyšuje přežití vůči měnícím se podmínkám prostředí. Tato funkční diverzita bakterií uvnitř biofilmu zvyšuje schopnost biofilmu odolávat environmentálnímu stresu, a lze ji proto považovat za indikátor tzv. „insurance hypothesis“. Tento fenomém vysvětluje často pozorovanou skutečnost, že stabilita většiny společenstev je zvyšována její. Buňky biofilmu mohou čas od času dispergovat z biofilmu a kolonizovat nové povrchy. Disperzní procesy mohou být 78

kontrolovány systémem komunikací mezi buňkami, který usnadňuje koordinované skupinové chování bakterií v biofilmu. Vývoj biofilmu je proto dynamický proces, ve kterém fenotypické variace a disperze jsou klíčovým faktorem, který ovlivňuje funkci biofilmu v prostředí. Recentní studie se zabývají otázkou, jakou roli v mechanizmu buněčné apoptózy hrají bakteriofágové a jejich uvolňování z biofilmu. Zdá se totiž, že indukce fágů může hrát významnou roli jako strategie přežití v biofilmu. Konstantní uvolňování fágů je známo již delší dobu u planktonních kultur např. Escherichia coli a Pseudomonas aeruginosa. Současné poznatky však naznačují, že uvolňování fágů se rovněž vyskytuje v biofilmech a je poměrně časté. Geny bakteriofágů patří mezi nejvíce regulované skupiny genů během vývoje biofilmu u gramnegativních i grampozitivních bakterií. U P. aeruginosa vykazovaly geny Pf1-vláknům podobných bakteriofágů (značených jako Pf4), které existují jako profágy v genomu P. aeruginosa, až 83,5násobnou aktivaci během vývoje biofilmu ve srovnání s expresí u planktonních buňek. Další studie prokázaly, že aktivace fágových genů je u P. aeruginosa regulována systémem guorum sensing a že aktivita Pf4 je spojena s usmrcením a lyzí subpopulace buněk P. aeruginosa uvnitř biofilmu. Indukce Pf4 může proto představovat významnou fyziologickou a vývojovou událost během vývoje biofilmu P. aeruginosa. Autoři se domnívají, že uvolňování fágů je významným mechanizmem diferenciace buněk uvnitř mikrokolonií biofilmu, který usnadňuje disperzi subpopulace přeživších buněk. Aktivita Pf4 fágů v biofilmech P. aeruginosa je spojena s objevením se subpopulace buněk s fenotypem tvorby malých kolonií v odtoku z biofilmu. Tyto buňky mají vysokou hustotu vláknitých fágů na povrchu buňky, vykazují zvýšenou adhezi a vývoj mikrokolonií a vyskytují se ve vysokém počtu v odtoku z biofilmu. Pf4 sehrávají významnou roli jednak ve vývoji biofilmu, jednak v kolonizaci nových povrchů během disperze biofilmu.

7.9 Charakteristiky biofilmu 7.9.1

Tloušťka biofilmu

Tloušťka biofilmu je často velmi významná charakteristika při analýze biofilmových procesů, protože určuje difuzní délku (diffusional length) a je nezbytná pro výpočet fluidního třecího odporu a odporu přenosového tepla (heat transfer resistance). Avšak přesné měření hloubky biofilmu je obtížné. Navíc tloušťka biofilmu může značně kolísat v závislosti na morfologických rysech biofilmu a dále je také funkci stáří biofilmu. V pomalu tekoucích, živinami bohatých vodách může tloušťka biofilmu přesáhnout 30 mm (např. foto/heterotrofní nárosty). Tloušťka biofilmu může být rovněž ovlivněna diverzitou mikrobiálních druhů. Např. biofilm s čistou kulturou Pseudomonas aeruginosa v několika laboratorních studiích vzácně přesáhl tloušťku 50 µm, zatímco smíšená biofilmová kultura v těch samých experimentálních podmínkách často dosahovala tloušťky větší než 120 µm. Biofilmový systém je všeobecně charakterizován několika délkovými hodnotami, které kolísají podle typu prostředí a taxonomického složení a které určují jeho charakter:  buněčná délka = 1–10 µm,  mezní vrstva pro přenos hmoty (mass transfer boundary layer = 10–100 µm;  difuzní hloubka = 10–1 000 µm;  tloušťka biofilmu = 10–1 000 µm.

7.9.2

Denzita biofilmu

Přesné měření biofilmové hustoty je přímo úměrné měření tloušťky. Proto musí být uváděné hustoty biofilmu ve vztahu k technikám měření tloušťky biofilmu. Prakticky se hustota biofilmu

79

určuje měřením sušiny biofilmu ze známé plochy substrátu dělené tloušťkou biofilmu. Nejvyšší hustota biofilmu bývá uváděna jako 105 kg·m-3 a nejnižší 10 kg·m-3. Hustota biofilmu může kolísat s hloubkou biofilmu (Tab. 9). Hustota biofilmu může být ovlivněná rovněž růstem určitého mikrobiálního druhu. Např. dominance vláknitých organizmů v biofilmu způsobovala nízkou hustotu biofilmu ( 40 kg·m-3). Vláknitá morfologie buňky může být důsledkem mikrobiální metabolické odpovědi na environmentální stres. V biofilmu vystaveném turbulentnímu proudu byly např. pozorovány zvláštní vláknité pseudomonády a kompletně vláknité buňky Pseudomonas putida byly zjištěny v pozdní fázi vsádkového růstu při limitaci kyslíkem. V biofilmu mohou být buňky v nejnižší vrstvě často limitované kyslíkem, jehož absence může spustit vláknitý růst.

Tab. 9 Kolísání denzity biofilmu s hloubkou biofilmu (podle Christensen&Characklis 1990)

Povrchový film Prostřední Základní film

7.9.3

Tloušťka sekce biofilmu (µm) 400 200 130

Hloubka od rozhraní voda–biofilm (µm) 0–400 400–600 600–730

Denzita (kg·m-3) 37 98 102

Prvkové složení biofilmů

Podíl organických a anorganických složek může být determinován spálením sušiny (105°C/1–3 h) biofilmu při 550 °C. Těkavá (volatilní) frakce biofilmu může být značně nižší než tato frakce u populace suspendovaných mikrobiálních buněk (>90 % volatilních látek), a to primárně z důvodu adsorbovaných anorganických složek, zachycených či vysrážených uvnitř biofilmové matrice. Podíl anorganické frakce je vysoký zejména u biofilmů akumulovaných v přírodních akvatických ekosystémech, kde jsou do matrice zachycené jílovité, prachové a další částice sedimentu. Poměr uhlík/dusík (C/N) je v některých biofilmech značně vyšší než v mikrobiálních buňkách (5x). Vysoký poměr C/N může odrážet velký podíl EXPS (která má všeobecně nižší obsah N) nebo převahu uhličitanových solí. Anorganické složení biofilmu je nepochybně ovlivněno fyzikálními vlastnostmi biofilmu. Např. vápník a hořčík zvyšují mezimolekulární vazbu mezi EXPS; produkty koroze mohou být zachyceny v biofilmu a ovlivnit tak jeho makroskopické vlastnosti, jakými jsou hustota a hydraulická drsnost. V biofilmech vystavených časté chloraci byly ve srovnání s okolní vodou zjištěny vysoké koncentrace manganu a železa.

7.10 Sukcesní vývoj biofilmu Tvorba mikrobiálního biofilmu může být vnímána jako sukcesní proces z hlediska struktury i složení. Tento proces začíná stochastickým přichycením primárních kolonizátorů – druhů pocházejících z okolní vody, které vytvoří na povrchu základní vrstvu biofilmu. Protože primární kolonizátoři jsou prostorově separovaní a vykazují nízký selekční tlak pro uchycení, má tento primární biofilm pravděpodobně vysokou druhovou diverzitu. Tato iniciální kolonizace je poté následována sekundární kolonizací bakteriemi, které profitují z ochranného prostředí již existujícího primárního biofilmu či se živí zbytky jiných bakterií. V tomto sekundárním společenstvu lepší konkurenti o zdroje nebo prostor mohou vyloučit méně konkurenčně zdatné organizmy. V biofilmu proto dochází k poklesu diverzity a jeden nebo několik konkurenčně nejsilnějších taxonů začíná ve společenstvu dominovat. Jak postupně biofilm stárne, vlivem gradientů a interní recyklace zdrojů se 80

vytváří více nik. V této fázi taxonomická bohatost a vyrovnanost opět vzrůstají a vytvářejí unimodální vztah mezi stářím a diverzitou. Finální nárůst druhové bohatosti reflektuje komplexní prostorovou strukturu s mnoha funkčními skupinami bakterií. Výše popsaný model byl později ještě revidován a rozšířen o „nové druhy“, tj. taxony, které se objevují v průběhu či v pozdních fázích sukcese. Pomocí denaturační gradientové gelové elektroforézy bylo zjištěno, že v pozdních fázích sukcese dochází ke vzrůstu druhové bohatosti, což indikuje, že dochází rovněž ke vzrůstu bohatosti prostorových nik. Nárůst druhové bohatosti je s největší pravděpodobností způsoben spíše objevením se nových druhů, než pouhým nahrazením jedné populace za druhou. Pokud během sukcese biofilmu vzrůstá počet nových nik lineárně, pak se zpravidla počet nových druhů stabilizuje. Pokud však prostorové niky přibývají exponenciálně, pak vzrůstá i počet nových taxonů ve společenstvu. Smíšené bakteriální biofilmy vykazují různé vzájemné interakce, včetně konkurence. Avšak na rozdíl od planktonních společenstev, kde je při vzájemné konkurenci vždy jeden kmen konkurenčně vyloučen, v biofilmech oba dva kmeny koexistují.

7.11 Uvolňování buněk z biofilmu a šíření biofilmu Akumulace biofilmu na určitém povrchu je určována rovnováhou mezi procesy přichycení, růstu a odtrhávání. Z těchto tří procesů je zatím nejméně známo o odtrhávání. Odtrháváním (detachment) rozumíme uvolňování jednotlivých mikrobiálních buněk i jejich shluků obalených v EXPS z biofilmu do okolní kapaliny a jejich další šíření (disperzi). K disperzi dochází zpravidla po dosažení kritického množství buněk i masy biofilmu. Jako faktory významné z hlediska odtrhávání buněk biofilmu byly navrhovány enzymy degradující matrici (matrix-degrading enzymes), bubliny plynů vznikající činností biofilmu, koncentrace živin a stav mikrobiálního růstu, dostupnost zesíťovaných polyvalentních kationtů, smykové tření okolní kapaliny, kontaktní mechanický otěr, signály quorum sensing, aktivace lytických bakteriofágů a oxid dusnatý (NO). Některé z těchto „odtrhávacích mechanizmů“ jsou čistě fyzikální, ale jiné mohou být přednostně biologické. Z hlediska fyzikálního je nejčastějším faktorem odtrhávání působení hydraulických střižných sil (shear stress) či kontaktní otěr částic navzájem. Tyto „odtrhávací síly“ (detachment forces) jsou významné zejména v prostředí tekoucích vod a v technologických procesech, jakými jsou např. biofilmové reaktory pro čištění odpadních vod. Zásadně ovlivňují strukturu, přenos látek, produkci exopolysacharidů, metabolické a genetické vlastnosti biofilmu. Vysoký stupeň odtrhávání by měl vést k tvorbě silnějšího biofilmu, zatímco v podmínkách nízkého odtrhávání jsou biofilmy heterogenní, porézní a mají měkčí strukturu. Obecně je však nutné konstatovat, že o vlivu těchto odtrhávacích sil zatím neexistuje dostatek informací. Vlivu odtrhávacích sil na strukturu a metabolizmus lze shrnout takto:  Vyšší odtrhávací síly vedou k tvorbě tenčího a hustšího biofilmu, přičemž rovnováhu mezi hustotou a tloušťkou biofilmu lze zjistit pro danou hodnotu odtrhávací síly. Hustota biofilmu vzrůstá lineárně s rostoucí střižnou silou okolní kapaliny, zatímco tloušťka klesá. Tloušťka biofilmu ovlivňuje negativně difuzi substrátu, silnější biofilmy jsou také více náchylné k odtrhávání (sloughing) a přispívají tak k vyšší nestabilitě kvality vody na odtoku např. z čistíren odpadních vod. V technické praxi je proto důležité optimalizovat hydrodynamické podmínky ve vztahu k odtrhávání.

81

 Odtrhávání v důsledku hydrodynamiky okolní kapaliny vykazuje dvojí vliv na přenos látek v biofilmu; vyšší turbulence by měla zvyšovat difuzi substrátu do biofilmu, na druhé straně denzita biofilmu vyvolaná odtrháváním redukuje difuzivitu biofilmu.  Zvyšující se odtrhávací síly vedou ke zvyšování poměru polysacharidy/proteiny v biofilmu, což indikuje, že vyšší specifická rychlost okolní kapaliny indukuje v biofilmech zvýšenou sekreci exopolysacharidů. Hustota biofilmu lineárně vzrůstá s obsahem exopolysacharidů v biofilmu. Tyto vzájemné vztahy naznačují, že vysoké hustoty biofilmu pozorované při vysokých odtrhávacích silách by mohly být výsledkem produkce polysacharidů indukované odtrhávacími silami.  Výsledkem vyšších odtrhávacích sil byl nižší výtěžek růstu a stimulace spotřeby rozpuštěného kyslíku. Toto zjištění naznačuje, že při vysokých odtrhávacích silách by mnohem více rozpuštěného organického uhlíku mělo být konvertováno spíše na CO2, než použito pro biosyntézu. Jinými slovy, vysoké odtrhávací síly stimulují katabolické procesy biofilmu. S ohledem na biologickou povahu odtrhávání je zajímavé a nezbytné vědět, jaké jsou možné spouštěče odtrhávání, resp. které environmentální příčiny spouštějí vývoj vedoucí eventuálně k uvolnění buněk. Mezi výše zmíněnými faktory lze nalézt minimálně dva možné spouštěče, které mají potenciál vysvětlit pozorované odtrhávání shluků buněk jedním z nich je akumulace metabolických produktů a druhým pak vyčerpání metabolických substrátů. Jedna z hypotéz předpokládá, že roli spouštěče v rozpouštění biofilmu a uvolňování bakterií hrají quorum sensing signální molekuly, které se v biofilmu naakumulují nad prahovou koncentraci. Tato představa vedla k předpokladu, že přírodní signální molekuly nebo jejich analogy by mohly být použity k disperzi biofilmů a vyčištění ploch s nárosty. Tento mechanizmus odtrhávání biofilmu byl originálně navržen na základě pozorování, kde zastavení proudění média do systému biofilmu vedlo ke spontánnímu odtrhávání biofilmu během několika dní. Zastavení proudění pravděpodobně umožnilo akumulaci odtrhávací signální molekuly, eventuálně dosáhlo koncentrace dostatečné ke spuštění disperze biofilmu. Tento quorum sensing mechanizmus odtrhávání byl teoreticky zkoumán pomocí počítačového modelu a výsledky indikovaly, že vysoké koncentrace signální molekuly se vyskytují v centru buněčných shluků, kde je nejvíce omezena difuze. Tato lokalizace je ale ve stejné oblasti biofilmu, která je pravděpodobně vystavena deficitu živin. Tradičně bylo odtrhávání části biofilmu považováno za pasivní chování, závislé na rychlosti proudění (fluid stress) nebo hladovění, avšak odtrhávání může být chápáno jako strategie, kterou bakterie aktivně kolonizují nové niky ještě dříve, než se prostor a živiny stanou limitujícími. Určité druhy bakterií mohou aktivně opouštět biofilm během procesu, který se nazývá rozptyl (dispersion) či rozpuštění, zánik (dissolution). Tohoto procesu je pravděpodobně dosahováno koordinací dvou kroků: štěpením extracelulární matrice produkcí polysacharidových lyáz či ektoenzymů a aktivací mobilních funkcí bakteriálních buněk. Předpokládá se, že tato aktivita představuje závěrečný krok ve vývoji biofilmu, ve kterém se buňky biofilmu vracejí do planktonní fáze. U biofilmových bakterií lze rozlišit tři rozdílné strategie disperze: disperze vyrojením (swarming dispersal); disperze shluků (clumping dispersal) a povrchová disperze (surface dispersal). Kromě těchto strategií se rozlišují bakterie podle způsobu uvolňování na druhy pohyblivé (motile) a neschopné pohybu (non-motile). Prvně jmenované by se měly z biofilmu odlučovat po jednotlivých buňkách či jakýchsi mikrokoloniích, které se „pohybují“ samostatně kolem substrátu (jako příklad motilních druhů uvádějí Pseudomonas aeruginosa). Ve starším, zralém biofilmu P. aeruginosa se uvnitř jednotlivých kolonií objeví centrální dutina, která je posléze zaplněna pohyblivými bakteriemi. Disperze začíná ve chvíli, kdy se dutina protrhne a pohyblivé bakterie jsou vypuzené do okolního prostředí. Nemotilní druhy (například Staphylococcus aureus) závisejí více na podmínkách okolí, přičemž se šíří ve formě větších multicelulárních konglomerátů. Disperzní mechanizmus nemotilního, gramnegativního orálního patogena Actinobacillus actinomycetemcomitans zahrnuje např. ejekci jednotlivých buněk či malých shluků buněk z vnitřku biofilmu do okolní kapaliny. Všechny tyto strategie umožňují bakteriím šíření na nové povrchy či 82

náchylného hostitele. Pro Vibrio cholerae by to mohla být strategie, která umožňuje bakterii perzistovat v různých mořských a sladkovodních prostředích, kde pak dochází k přenosu do lidského střeva.

Shrnutí Biofilm představuje společenství mikroorganizmů, které se nachází na povrchu různých předmětů, ve vodním prostředí či na povrchu půd, rostlin a živočichů. Biofilmy mají složitou strukturu, kterou připomínají tkáně vyšších organizmů. Představují systém kanálků, ve kterém jsou efektivně dopravovány a vylučovány všechny potřebné látky. V některých případech mohou být biofilmy žádané (využití v biotechnologiích, výroba potravin), jindy se jim snažíme zabránit (viz obrana proti patogenům, hygiena provozu a onemocnění – zvýšená rezistence bakterií v biofilmu). Tvorba biofilmu má své specifické fáze. Skládá se z:    

adheze buněk, akumulace a maturace buněk, aktivace genů a růst a diferenciace buněk, disperze.

Po přilnutí mikroorganizmy schopné tvorby biofilmu začnou produkovat extracelulární polymery, vznikají mikrokolonie se slizem, který se pak dělí v biofilm. Faktory vnějšího prostředí pak mohou fungovat jako signály a spouštět expresi genů zodpovědných za tvorbu těchto odolných společenství. Kontrolní otázky 1. Jak byste definovali biofilm? Jaké jsou jeho výhody a nevýhody pro zůčasněné mikroorganizmy? 2. Které konkrétní mikroorganizmy mají tendence tvořit biofilm? 3. Jaké geny jsou zodpovědné za tvorbu biofilmu? 4. Jakými způsoby je tvorba filmu regulována? 5. Jaké praktické uplatnění nacházejí biofilmy v průmyslu?

83

8 Toxické produkty mikroorganizmů Studijní cíle: Seznámit studenty s problematikou produkce toxických látek mikroorganizmy. Zaměřit se na dekarboxylázovou aktivitu bakterií a toxikogenezi plísní. Upozornit na zdravotní rizika spojená s příjmem potravin obsahující tyto substance. Klíčová slova: biogenní aminy, mykotoxiny, bakterie, plísně, tyramin, hystamin, aflatoxiny, ochratoxin A Potřebný čas: 3 hodiny

8.1 Biogenní aminy Biogenní aminy jsou nízkomolekulární dusíkaté organické báze, které vznikají převážně dekarboxylací volných aminokyselin, nebo případně aminací či transaminací aldehydů a ketonů. Na tvorbě těchto ve vyšších koncentracích toxických substancí se podílejí hlavně enzymy mikrobiálního původu. Biogenní aminy jsou ale rovněž produkovány během metabolizmu zvířat a rostlin (nejen mikroorganizmů). Vyskytují se tedy všude, avšak v různých koncentracích.

8.1.1

Chemická struktura biogenních aminů

Aminy jsou formálně odvozeny od amoniaku náhradou jednoho (primární amin), dvou (sekundární amin) nebo tří (terciární amin) vodíků za alkyl- nebo aryl-skupinu. Řadí se mezi dusíkaté deriváty uhlovodíků. Dle chemické struktury se klasicky biogenní aminy člení na aromatické, heterocyklické, alifatické a polyaminy. Aromatické aminy zahrnují tyramin a β-fenylethylamin, heterocyklické skýtají histamin a tryptamin viz Chyba! Nenalezen zdroj odkazů.. Mezi alifatické biogenní aminy můžeme zařadit putrescin a kadaverin (Chyba! Nenalezen zdroj odkazů.). Polyaminy pak reprezentují hlavně spermin, spermidin a případně agmatin (Chyba! Nenalezen zdroj odkazů.). Někdy se mezi polyaminy řadí i diaminy (např. putrescin), podobně jako se heterocyklické aminy občas řadí do skupiny aromatických aminů.

84

Obr. 4 Chemická struktura vybraných biogenních aminů (Velíšek, 2009; Anli a Bayram, 2009)

8.1.2

Vznik biogenních aminů

Biogenní aminy jsou tvořeny v potravinách bohatých na proteiny. Přítomné bílkoviny jsou proteolyticky rozštěpeny exo- a endo-peptidázami na aminokyseliny, které představují prekurzory pro vznik biogenních aminů. Tři základní podmínky, které jsou pro tvorbu biogenních aminů nezbytné, můžeme formulovat následujícím způsobem:   

dostupnost volných aminokyselin, přítomnost dekarboxyláza-pozitivní mikroflóry a zajištění příznivých podmínek pro růst a produkci enzymů.

V rámci dekarboxylačního procesu aminokyselin vznikají reakcí aminoskupiny α-aminokyseliny s karbonylovou skupinou prostetické skupiny katalyzujícího enzymu přechodné iminosloučeniny, které jsou obecně nazývány jako Schiffovy báze. Tyto sloučeniny jsou během reakce stabilizovány příslušnými kofaktory pyruvoylovým zbytkem nebo pyridoxalfosfátem. Vytvořená nová Schiffova báze je dekarboxylována a eliminací vody vzniká odpovídající biogenní amin. Dekarboxylace aminokyselin se tedy zjednodušeně uskutečňuje odštěpením α-karboxylové skupiny za vzniku příslušného aminu a uvolnění oxidu uhličitého (Chyba! Nenalezen zdroj odkazů.., Chyba! Nenalezen zdroj odkazů.). R-CHNH2-COOH →

R-CH2-NH2 + CO2

E: příslušná dekarboxyláza Obr. 5 Obecná rovnice vzniku biogenních aminů dekarboxylací (Velíšek, 2009)

85

Obr. 6 Vznik biogenních aminů (upraveno podle Ancín-Azpilicueta et al., 2008)

Optimální pH pro dekarboxylační enzymy se pohybuje okolo pH 5,0 (v rozmezí pH 4,0-5,5). Optimum působení dekarboxyláz nastává v rozsahu teplot 20-37 °C. Pyridoxalfosfát je důležitým kofaktorem enzymů dekarboxyláz. Pokud je v kultivačním prostředí přítomen, je logicky podpořena produkce BA.

8.1.3

Producenti biogenních aminů

Mezi producenty hojných množství těchto substancí náleží zástupci čeledi Enterobacteriaceae (např. rodu Citrobacter, Hafnia, Escherichia, Morganella, Salmonella, Serratia, Shigela, Yersinia), představitelé typicky proteolytických bakterií rodu Pseudomonas a grampozitivní bakterie rodu Staphylococcus. Původcem zvýšené koncentrace těchto substancí v potravinách může být nejen kontaminující mikroflóra, ale také zákysové (startérové) kultury bakterií mléčného kvašení (BMK). Schopnost dekarboxylovat aminokyseliny byla pozorována u mnoha zástupců BMK pocházejících z rodů Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus a Oenococcus. Řada kmenů výše jmenovaných rodů bakterií je využívána jako zákysová kultura v mlékárenském, případně masném průmyslu nebo při výrobě vína. Produkce biogenních aminů není však typické pro určitý rod a druh, ale je kmenovou záležitostí. 8.1.4

Biogenní aminy v potravinách

Biogenní aminy jsou přirozenou složkou řady fermentovaných i nefermentovaných potravin ať už rostlinného nebo živočišného původu. Vyšší koncentrace biogenních aminů lze očekávat v potravinách obsahujících bílkoviny nebo přímo volné aminokyseliny, zvláště pokud navíc poskytují vhodné podmínky pro biochemickou aktivitu přítomných mikroorganizmů. Biogenní aminy mohou jednak sloužit jako indikátory procesu fermentace potravin nebo jejich kažení. Sledování výskytu aminů může být tedy zdrojem cenných informací pro producenty potravinářských výrobků, při jejichž výrobě hraje stěžejní roli činnost mikroorganizmů (výroba piva, vína, kysaného zelí, sýrů, 86

fermentovaných masných výrobků). V případě potravin je důležité, zda se jedná o produkty fermentačních procesů či nikoli. Evropská legislativa přímo udává (Nařízení komise (ES) č. 2073/2005), že potraviny nesmějí obsahovat mikroorganizmy, jejich toxiny či metabolity v množstvích, která představují nepřijatelné riziko pro lidské zdraví. Obsah biogenních aminů není bohužel legislativně stanoven (s výjimkou histaminu v rybách 200 mg.kg-1). Vzniká zde tak problém s určením tohoto množství, neboť je značně individuální, závislé na detoxikačním systému jedince. Mezi důležité biogenní aminy obsažené v potravinách patří histamin, β-fenyletylamin, tyramin, tryptamin, kadaverin a z polyaminů putrescin, spermidin a spermin. Biogenní aminy a polyaminy se vyskytují v potravinách rostlinného i živočišného původu. Samotné stanovení obsahu biogenních aminů v potravinách může sloužit k posouzení míry rozkladu sledovaného materiálu, může být ukazatelem jakosti vstupní suroviny a úrovně hygieny během výrobního procesu, nebo optimálních podmínek skladování. Nefermentované potraviny (např. maso, mořské ryby) vykazují významnější nárůst obsahu aminů hlavně v souvislosti s nežádoucími rozkladnými procesy bílkovinné matrice. Ryby skýtají vhodné prostředí pro rozvoj dekarboxyláza pozitivní mikroflóry produkující převážně histamin, kadaverin, tyramin, putrescin, agmatin, spermin a spermidin. Tyto mikroorganizmy mohou být reprezentovány např. bakteriemi: Hafnia alvei, Proteus vulgaris, Clostridium perfringens, Enterobacter aerogenes, Bacillus sp. a Staphylococcus xylosus. V mase převažují následující biogenní aminy: tyramin, kadaverin, putrescin a histamin. Spermin a spermidin můžeme najít také jako přirozenou součást čerstvého masa. Maso a logicky tedy i masné výrobky mohou obsahovat histamin, kadaverin, putrescin, tyramin, fenyletylamin, tryptamin a mezi jejich producenty lze zařadit kmeny Pediococcus sp., Lactobacillus sp., Pseudomonas sp., Enterococcus sp., Micrococcus sp., a představitele čeledi Enterobacteriaceae (Velíšek, 2002) Ovoce a zelenina mohou být překvapivě také zdrojem biogenních aminů, přičemž obsah těchto látek se v nich zvyšuje se stupněm zralosti a během nevhodného skladování. Nejčastějším biogenním aminem vyskytující se v ovoci a zelenině je tryptamin a potom také tyramin, z polyaminů je to především putrescin. Další skupinou potravin, která je podstatně významnější z hlediska obsahu biogenních aminů, jsou již jednou zmíněné fermentované výrobky. Sýry patří mezi potraviny s vyšším rizikem tvorby biogenních aminů a polyaminů. Koncentrace biogenních aminů je závislá na druhu použité startovací kultury při výrobě daného sýra a zvyšuje se často dekarboxylázovou aktivitou kontaminující mikroflóry, přičemž množství přítomných biogenních aminů roste během zrání a skladování. Sýry nejčastěji obsahují histamin, kadaverin, tyramin, putrescin a tryptamin, mezi jejichž původce náleží např. Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium, Propionibacterium sp. Fermentovaná zelenina může být zdrojem histaminu, kadaverinu, putrescinu, tyraminu a fenyletylaminu, které v tomto prostředí generují např. Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus sp. Fermentované alkoholické nápoje, jako jsou pivo a víno, mohou také disponovat biogenními aminy. Vyšší koncentrace aminů u alkoholických nápojů lze považovat za velmi nežádoucí jev z důvodu přítomnosti etanolu, který v konečném důsledku může podpořit intoxikaci spotřebitele. Ze surovin pro výrobu piva je za hlavní zdroj těchto substancí považován slad (zdroj putrescinu, sperminu, spermidinu a agmatinu). Při hlavním kvašení piva pak dochází k nárůstu obsahu tyraminu a histaminu. Ve víně není neobvyklý výskyt putrescinu, histaminu a spermidinu. Tyto látky do vína přechází z hroznů při lisování. Biogenní aminy mohou být tvořeny převážně během jablečnomléčného kvašení.

87

8.1.5

Fyziologické účinky biogenních aminů

Biogenní aminy vykazují biologickou aktivitu. Běžně se podílejí na metabolických procesech v živých tkáních, přičemž vykazují různé biologické účinky. Biogenní aminy jsou pro lidský organizmus nepostradatelné. Mají mimo jiné vliv na růst a proliferaci buněk (regulace nukleových kyselin, stabilizace membrán, syntéza bílkovin), slouží jako zdroj dusíku v biochemických reakcích, jako prekurzory některých hormonů, nebo plní funkci neurotransmiterů v centrálním nervovém systému. Některé biogenní aminy jsou schopny přímo plnit funkci hormonů (histamin) nebo mohou být např. stavební látkou pro biosyntézu hormonů (např. β-fenylethylamin), alkaloidů, fytohormonů a dalších sekundárních metabolitů rostlin. V nízkých koncentracích jsou biogenní aminy přirozenou složkou řady potravin. Mnohé vznikají i vlivem procesů zpracování potravin (např. hlavně během fermentačních procesů, působením enzymů a vysokých teplot). BA, pokud jsou v nadbytku, disponují nežádoucími vazoaktivními a psychoaktivními účinky. Psychoaktivní biogenní aminy ovlivňují centrální nervový systém působením na neurotransmitery, zatímco vazoaktivní biogenní aminy mají vliv na vaskulární systém. Vazoaktivní aminy se pak podle účinku dělí na vazokonstrikční (např. tyramin) a vazodilatační (např. histamin). Konzumace potravin obsahujících biogenní aminy vede k různým alimentárním onemocněním, nejčastěji zahrnujícím otravu histaminem a intoxikaci tyraminem. Zvýšené množství biogenních aminů v organizmu se projevuje např. bolestí hlavy, potížemi s dýcháním, bronchiálním astmatem, průjmem, hypotenzí či ekzémem. Polyaminům je přisuzován regenerační podpůrný účinek, kdy napomáhají růstu a poliferaci buněk. Tento efekt však musí být regulován zvláště u jedinců s onkologickým onemocněním, kdy polyaminy mohou být přijímány nádorovými buňkami. Jejich toxikologický účinek je založen na jejich schopnosti vytvářet karcinogenní N-nitrososloučeniny. Menší množství BA přijatá v potravě jsou metabolizována zpravidla bez negativních následků. Podílí se na tom přirozeně přítomný detoxikační systém tvořený pomoci monoaminooxidáz, diaminooxidáz a histidinmetyltransferáz. Detoxikační systém však může ovlivnit mnoho faktorů jako je např. zdravotní stav a věk jedince, nebo konzumace alkoholu nebo psychofarmak, které mohou inhibovat účinky detoxikačních enzymů. Množství do 100 mg.kg-1 (mg.l-1) potraviny jsou považována pro zdravé osoby za bezpečná. Avšak vyšší koncentrace BA mohou mít poměrně vážný dopad na zdravotní stav spotřebitele a způsobovat mu značné zdravotní komplikace.

8.2 Mykotoxiny Mykotoxiny řadíme mezi toxiny přírodního původu (tzv."biotoxiny"). Jsou to toxické sekundární metabolity některých vláknitých mikroskopických hub. Můžeme je charakterizovat jako strukturně nesourodé a komplexní organické sloučeniny o nízké molekulové hmotnosti. Je známých kolem 300 metabolitů mikromycet s toxickým potenciálem. Odhad FAO/WHO uvádí, že cca 25 % potravin a surovin je kontaminováno mykotoxiny. Většina mykotoxinů proniká do potravin a zůstane v ní i po odstranění mycelia. Takto do potravin uvolňované mykotoxiny označujeme jako exomykotoxiny. Některé však také zůstávají v samotné plísni či jejich spórách (endomykotoxiny). Kontaminacím potravin mykotoxiny nelze zabránit a ani je zcela odstranit. Lze je jen snížit dodržováním správných zemědělských a technologických postupů tím, že dojde ke snížení obsahu mykotoxinů již během vegetačního růstu plodin, sklizně a skladování. Tkáně zvířat však obsahují nižší koncentrace mykotoxinů než rostlinné tkáně. Primární kontaminace znamená, že k výrobě potravin se již používají suroviny kontaminované mykotoxiny. Sekundární kontaminace vychází z růstu toxinogenních mikromycet na potravině, která je nevhodně uložená s následkem následné produkce mykotoxinů. V lidském okolí se ve významných množstvích vyskytuje asi 20 88

mykotoxinů, např.: aflatoxiny: B1, B2, G1, G2, M1, ochratoxin A, patulin, fumoniziny B1, B2, B3, citrinin, trichotheceny, jako deoxynivalenol, případně T-2 toxin, aj., dále např. zearalenon. Mezi mykotoxiny, na které je soustřeďována pozornost kvůli jejich toxikologickému významu, jsou aflatoxiny, patulinové a fusariové mykotoxiny a ochratoxin A. Známé jsou teratogenní, karcinogenní (játra, ledviny), estrogenní a imunosupresivní účinek mykotoxinů zvláště v souvislosti s plísněmi rodu Aspergillus, Penicillium, Fusarium a Alternaria.

8.2.1

Chemická struktura mykotoxinů

Mykotoxiny lze rozdělit dle chemické struktury do následujících kategorií: cyklické dipeptidy (např. brevianamidy, fumitremorgen, gliotoxin, roquefortin, sporidezminy, verukulogeny atd.); epoxytrichoteceny (deoxynivalenol, diacetoxyscirpenol, fusarenony, nivalenol, uridiny, satratoxiny atd.); griseofulviny (griseofulvin); nenasycené laktony (alternariol, kyselina mykofenolová a penicilová, ochratoxiny, patulin atd.); polycyklické substituované indolové deriváty (kyselina cyklopiazonová, paspaliny, penitremy atd.); substituované chinony (luteoskyrin, rubratoxin, viridikatumtoxin, xantomegnin atd.).; substituované pyreny a hydroxypyreny(kyselina kojová, sekalonová kyselina atd.) a ostatní mykotoxiny s jinou chemickou strukturou (citrinin, curvularin, moniliformin, zearalenon atd.). Aflatoxiny Aflatoxiny jsou extrémně toxické a současně nejvíce sledované mykotoxiny. K jejich rozvoji může za příznivých podmínek docházet prakticky na každém substrátu, což předurčuje jejich snadné šíření. Z hlediska chemické struktury jsou to polycyklické, nesaturované, vysoce substituované kumariny. Dosud bylo identifikováno asi 20 druhů aflatoxinů. Aflatoxiny jsou rezistentní, avšak je lze částečně tepelně inaktivovat pražením nebo sterilizací (100-120 °C). Jsou citlivé k silnějším kyselinám a zásadám. Zodpovědné za produkci aflatoxinů jsou zvláště toxikogenní kmeny Aspergillus flavus a Aspergillus parasiticus. V organizmu živočichů mohou vznikat různé deriváty aflatoxinů, např. mykotoxin v mléce M, demetylovaný derivát v moči P, aflatoxin Q z jaterní tkáně a dalších deset metabolitů B1, B2, G1, G2 přičemž jejich označení souvisí s barvou fluorescence (B – blue, G – green). Produkce aflatoxinů může být do jisté míry ovlivněna faktory vnějšího prostředí – složení atmosféry, teplota, vlhkost substrátu, vzdušná vlhkost, přítomnost stopových prvků, nenasycených mastných kyselin nebo represe glukózou. Teplota pro toxikogenezi se pohybuje od 12 do 42 °C. Pro produkci kmeny Aspergillus flavus a A. parasiticus se optimální teplota pro tvorbu aflatoxinů pohybuje mezi 25 a 30 °C. Vlhkost ideální pro produkci aflatoxinů je pak poměrně vysoká nad 84 %. Prostředí, ve kterém se produkci aflatoxinů přímo daří, vytváří podzemnice olejná, ale také se mohou vyskytovat v ostatních druzích ořechů, kakau, koření, rýže nebo kukuřici. Plísně Aspergillus flavus a A. parasiticus se vyskytují v půdě, prachu a na rostlinách a jejich plodech. Aflatoxin B1 má na člověka karcinogenní účinek, nejznámější je jako hepatokarcinogen. Výskyt druhů A. flavus a A. parasiticus je obzvlášť typický pro plodiny, jako jsou oříšky a olejnatá semena. Burské oříšky, kukuřice a bavlníkové semeno jsou tři nejdůležitější komodity, ve kterých se uvedené druhy vyskytují. Obilniny jsou též běžným substrátem pro růst A. flavus, avšak na rozdíl od burských oříšků a olejnatých semen, znehodnocení obilnin touto mikroskopickou houbou je obvykle výsledkem špatné manipulace se zrnem. Hladina aflatoxinů v zrnech obilovin je zřídkakdy signifikantní. Kořeniny někdy obsahují A. flavus a úroveň kontaminace aflatoxinem může být vysoká. K jejímu rozvoji může dojít za příznivých podmínek (obzvlášť při dostatečně vysoké teplotě) prakticky v každém substrátu, avšak nejvyšší hladiny mykotoxinů byly zaznamenány u 89

kukuřice, burských oříšků, pistácií, paraořechů, bavlníkových semen. Nižší hladiny mohou být zjištěny i v mandlích, pekanových i vlašských ořeších, rozinkách, fících a v různých druzích koření. Ochratoxin A Ochratoxin A je produkován plísněmi Aspergillus ochraceus, A. niger, A. melleus, A. elegant, A. alliaceus a Penicillium viridicatum, P. expansum, P. chrysogenum, P. variabile, P. palitans. Ochratoxin se vyskytuje především na obilovinách jako ječmen, žito, oves, pšenice, rýže, proso a kukuřice. Dalším zdrojem jsou masné výrobky, díky reziduálnímu ochratoxinu, který se váže na albumin a v játrech se následovně koncentruje. Ochratoxin A je silný nefrotoxin a vyvolává nefrotické syndromy u prasat a i u lidí. Kromě nefrotických účinků jsou uváděny i účinky karcinogenní, teratogenní a imunotoxické. U člověka je vliv ochratoxinu A spojovaný zejména s balkánskou endemickou nefropatií a nádorovými nemocemi ledvin. Patulin Nejznámějším producentem patulinu je Penicillium expansum. Producenti patulinu jsou běžnými kontaminanty mnohých druhů ovoce a zeleniny, především jablek, hroznů ale i pomerančů. Patulin se poměrně často vyskytuje v koncentrátech a džusech z tohoto ovoce, zejména pokud bylo ovoce ve vysokém stupni zralosti, přezrálé a poškozené (většinou je však koncentrace tohoto toxinu menší jak 0,1 mg·kg-1 – limit 0,05 mg v 1 kg a pro kojence 0,001 mg v 1 kg). Patulin se určité období využíval jako účinné antibiotikum proti G+ a G- bakteriím, byly dokázané jeho antifungální a antivirové účinky. Později byla dokázána jeho karcinogenita a mutagenita. Trichoteceny Jsou nejpočetnější skupinou mykotoxinů a zahrnují více než 140 popsaných látek. Jsou metabolity plísní rodů Fusarium, Trichthecium, Myrothecium, Trichoderma a Stachybotrys. Z hlediska chemické struktury je můžeme charakterizovat jako estery seskviterpenických alkoholů, které obsahujících trichotecenový bicyklický systém. Důležitými představiteli trichotecenů jsou např. deoxynivalenol (DON), T-2 toxin, diacetoxyscirpenol a nivalenol. Trichoteceny můžeme nalézt opět v zrninách (v pšenici, kukuřici, prosu, ječmeni) a také v sójových bobech, v semenech olejnin, v banánech, mangu a v pivu. V nejvyšších koncentracích bývá často přítomný DON, který je proto běžně považovaný za indikátor možné kontaminace dalšími trichotecenovými mykotoxiny. Přechod trichotecenů do masa, mléka či vajec je zanedbatelný. DON způsobuje zvracení, bolesti břicha a bolesti hlavy. T-2 toxin vyvolává onemocnění alimentární toxická aleukia (ATA). Postihuje trávicí ústrojí, způsobuje zápaly sliznice, zvracení, průjmy a bolesti hlavy. Druhé stadium je charakterizováno snížením počtu krevních destiček a bílých krvinek. Třetí fáze je pak doprovázena infekcemi způsobenými mikroflórou, která je pro zdravého člověka neškodná. Nejrozsáhlejší epidemie byla ve 40.tých letech v Rusku. Obilí nebylo sklizeno na podzim, ale až na jaře. Obilí bylo pod sněhem kontaminováno chladnomilnými fuzáriemi a jejich toxiny. Na intoxikaci zemřelo více než 17 000 lidí. V 50. a 60.tých letech se hromadná onemocnění vyvolaná tímto toxinem vyskytla ve Francii a Maďarsku. Zearalenon Zearalenon je dalším mykotoxinem běžně produkovaným fuzáriemi. Mezi nejdůležitější producenty se uvádí Fusarium graminearum a F. semitectum. S výskytem zearalenonu v různých obilninách – 90

pšenice, kukuřice, ječmen, oves, se setkáváme prakticky ve všech klimatických pásmech. Příjem zearalenonu může vyvolat hyperestrogenní syndrom. Fumoniziny Tato skupina mykotoxinů byla objevena na konci 80.let. Za hlavní producenty jsou označovány druhy Fusarium moniliforme a F. proliferatum. Fumoniziny se nejčastěji vyskytují v kukuřici a jejich produktech kukuřičná siláž, kukuřičné lupínky, ale i v rýži a prose. Fumoniziny mají na organizmus hepatotoxické a nefrotoxické účinky.

8.2.2

Výskyt mykotoxinů v potravinách

Mezi rizikové potraviny z hlediska možné kontaminace toxinogenními mikroskopickými houbami v domácnostech patří:          

chléb, pečivo (aflatoxiny, ochratoxin A), masné výrobky – trvanlivé salámy (aflatoxiny, ochratoxin A), tvrdé a tavené sýry (aflatoxiny, ochratoxin A), plísňové sýry (kyselina cyklopiazonová), ovoce a zelenina (patulin, fuzáriové mykotoxiny), konzervované ovocné a zeleninové potraviny (kompoty, džemy, marmelády), (aflatoxiny, ochratoxin A, patulin), sušené plody (aflatoxiny, ochratoxin A), rýže (aflatoxiny, citrinin), kojenecká mléčná výživa (aflatoxiny), plněné těstoviny, pizza (časté plesnivění).

Prevence výskytu mykotoxinů je následující: Omezení infekce zemědělských plodin mikroskopickými houbami v období růstu. Rychlé a účinné vysušení plodin a jejich správné skladovaní. Použití účinných chemických přípravků proti rozvoji mikroskopických hub v obou předcházejících bodech.

8.2.3

Fyziologické účinky mykotoxinů na lidské zdraví

Rizika kontaminace člověka představují:   

kontaminované potraviny (prvořadé) riziko vdechnutí kontaminovaných spor a prachových částí obsahujících mykotoxiny (manipulace s kontaminovanou surovinou) kontaminace farmaceutických preparátů, při výrobě kterých se využívají mikroskopické houby.

Základním preventivním opatřením na zamezení jejich výskytu v potravinách je dodržování hygienických požadavků na skladování komponentů na výrobu potravin, jako i samotných potravin. Správným skladováním se minimalizuje možnost rozmnožování mikroskopických hub, které jsou přirozenou složkou fylosférové mikroflóry a taktéž se zamezuje jejich další kontaminaci. Z pohledu konzumenta platí základní pravidlo, nic plesnivého nepatří do výživy člověka ani zvířat.

91

Mykotoxiny se zpravidla vyznačují velkou odolností vůči vlivu prostředí. Ve větší míře se vlastně provádí jen dekontaminace aflatoxinů a to i jen z krmiv ne z potravin. Na dekontaminaci se využívají fyzikální, chemické a biologické metody. Mykotoxiny jsou vysoce nebezpečné chemické látky obecně známé svými toxickými účinky např. genotoxické, mutagenní, karcinogenní, teratogenní, estrogenové, imunotoxické, hemoragické, neurotoxické, cytotoxické, neurotoxické či hepatotoxické. Skupina, která je nejvíce ohrožena negativním působením mykotoxinů jsou děti a kojenci díky poměrně vysokému přívodu kontaminovaného mléka a mléčných produktů, svému specifickému metabolizmu, nedostatečně vyvinutému imunitnímu systému, nízké hmotnosti a vysoké buněčné aktivitě. Obsah mykotoxinů by měl být regulován nejen v dětské výživě, ale i ve stravě dospělých jedinců a zvířat. Konkrétně vyhláška Ministerstva zemědělství 305/2004 Sb. stanovuje v souladu s právem ES přípustná množství a druhy kontaminujících látek, toxikologicky významných látek a látek vznikajících činností mikroorganizmů, které smějí potraviny a suroviny obsahovat. Ve vyhlášce 305/ 2004 Sb. jsou dále uvedeny nařízení Komise ES, které jsou pro ČR z hlediska obsahu mykotoxinů v současné době zásadní, kterých je zatím 7. V ES jsou regulovány aflatoxiny (B1, B2, G1, G2 , M1), ochratoxin A a patulin. Pro výše jmenované mykotoxiny existují v Evropské unii tzv. expoziční limity, které jsou stanoveny Společným výborem expertů pro aditiva a kontaminanty JECFA FAO/WHO a Vědeckým výborem pro potraviny EU SCF. U ochratoxinu A byly potvrzeny imunotoxické, teratogenní a karcinogenní účinky. Při ochratoxikóze dochází k výraznému podráždění sliznice trávicího ústrojí, což vede až k rozvoji akutní gastroenteritidy. Ochratoxiny poškozují ledviny, způsobují nechutenství, deprese, průjmy, horečky, žíznivost a časté vydatné močení a postupnou dehydrataci organizmu. Přítomnost trichothecenů je spojována s výskytem různých onemocnění u zvířat a člověka. Mezi projevy intoxikace patří odmítání potravy, zvracení, krvácení zažívacího traktu, horečka, destrukce kostní dřeně, deformace plodů. Na základě experimentů se zvířaty se některé z nich, zvláště T-2 toxin, považují za potenciálně karcinogenní a mutagenní a při podávání T-2 toxinu myším se zjistily negativní účinky na plodnost a jeho teratogenní účinek. Aflatoxiny vykazují především toxický účinek na játra a ledviny. Nejčastějšími příznaky intoxikace alflatoxiny jsou nechutenství, gastroenteritidy, podkožní krvácení, krvácení z tělních otvorů a úhyny. Nutnost sledovat mykotoxiny je stále aktuální, protože ve vztahu k lidské populaci představují stále vážný problém. Neustále jsou objevovány nové mykotoxiny (fuzáriové: YM-47524, YM-47525, visoltricin, roridin L a M, izo-chlamydosporol). Dosud však neznáme mechanizmy jejich toxických účinků. V podmínkách ČR je považováno za významné zejména riziko jejich pozdních toxických účinků (např. karcinogenita). Celkově jsou stále nejasné souvislosti mezi chronickými intoxikacemi mykotoxiny a chorobami, zejména po dlouhodobém působení mykotoxinů na člověka.

Shrnutí Některé mikroorganizmy jsou schopny za jistých podmínek produkovat a do růstového prostředí uvolňovat pro člověka toxické látky. Potraviny, které zmíněnou mikroflóru obsahují, pak mohou být zdrojem alimentárních intoxikací a mohou vážně ohrozit zdravotní stav spotřebitele. Mezi takové látky náleží BA a mykotoxiny. BA jsou produkovány zvláště ve fermentovaných potravinách bakteriálním metabolizmem, zatímco mykotoxiny, jak už sám název napovídá, jsou produkovány plísněmi.

92

V potravinách se můžeme setkat nejčastěji s následujícími osmi BA: histamin, tyramin, kadaverin, putrescin, agmatin, fenyletylamin, spermin a spermidin. Zmíněné BA se liší jak strukturou, tak fyziologickými účinky. Lidé disponují detoxikačním systémem. Malá množství BA jsou bez problému odbourána. Vyšší koncentrace pak mohou způsobovat různé zdravotní komplikace. Činost detoxikačního systému bývá ovlivněn mnoha faktory, což komplikuje stanovení maximálních povolených množství těchto látek v potravinách, které by pak zahrnovala příslušná legislativní norma. Nejvíce sledovanými mykotoxiny v potravinách jsou: ochratoxin A, aflatoxin, patulin, trichoteceny, zearalenon a fumoniziny. Opět se liší jak strukturou, tak účinkem na lidské zdraví. Potraviny napadené plísní představují potencionální výskyt těchto látek, které mohou v konečném důsledku působit cytotoxicky, hepatotoxicky, teratogenně nebo karcinogenně. Kontrolní otázky 1. Jakou mikroflórou jsou produkovány BA? Uveďte konkrétní charakteristiku mikroorganizmů disponujících dekarboxylázovou aktivitou. 2. Jaké podmínky musí být splněny, abychom prostředí mohli označit jako příhodné pro dekarboxylázovou aktivitu bakterií? 3. Které mykotoxiny představují největší riziko pro spotřebitele a jaké jsou preventivní kroky vedoucí k minimalizaci rizik spojenými s konzumací potravin obsahující tyto substance? 4. Které konkrértní plísně produkují ochratoxin A, aflatoxin a patulin? A kde můžeme očekávat jejich přítomnost?

93

9 Procesy prodlužování trvanlivosti potravin Studijní cíle: Seznámit studenta s konzervačními metodami, které jsou nástroji prodlužování údržnosti a zajištění zdravotní nezávadnosti potravin. Vysvětlit principy základních konzervačních metod a jejich vliv na mikrobiální populaci (přímé/nepřímé konzervační metody). Využití antagonistické metabolické aktivity mikroorganizmů. Klíčová slova: konzervace, inaktivace, inhibice, pasterace, sterilace, psychroanabióza, kryoanabióza, chemoanabióza, osmoanabióza, fyzikální faktory, biologická konzervace Potřebný čas: 2 hodiny

9.1 Konzervační metody Procesy prodlužování trvanlivosti mají zabránit mikroorganizmům a přirozeně přítomným enzymům v rozmnožování, resp. v jejich aktivitě, anebo je částečně ničit, resp. inaktivovat. Tab. 10 Antimikrobiální techniky využívané na ochranu potravin a dosažení požadované doby skladování Cíl Omezení anebo inhibice růstu

Ochranné faktory nízká teplota nízká aktivita vody (aw) snížení přístupu k živinám nižší obsah kyslíku zvýšený obsah oxidu uhličitého okyselení etanolové kvašení použití konzervačních látek

Inaktivace mikroorganizmů

vysoká teplota ozáření tlak lýza buněk

94

Použité metody chlazení a mrazení sušení, zahušťování, uzení, solení uchovávání potravin ve vodněolejových emulzích balení ve vakuu a dusíku balení v modifikované atmosféře přídavek kyselin, kvašení kvašení při výrobě vína, etanolu anorganické konzervační látky: sulfidy, dusitany organické konzervační látky: propionát, sorbit, benzoát antibiotika: nizin, natamycin pasterizace a sterilizace ionizující záření působení vysokého hydrostatického tlaku přídavek bakteriolytických enzymů (lyzozym)

9.1.1

Působení vysokých nebo nízkých teplot

Při použití dostatečně vysoké teploty a času působení této teploty všechny druhy mikroorganizmů zahynou, včetně termorezistentních bakteriálních spór. Hlavní příčinou letálního účinku vysokých teplot je pravděpodobně nevratná denaturace bílkovin a s ní související inaktivace enzymů. Probíhají tu však pravděpodobně i jiné procesy jako např. poškození cytoplazmické membrány, které vede k lýze buněk, může též dojít ke změně permeability buňkové stěny a ke změně koncentrace solí v cytoplazmě a k dalšímu poškození buněk. Současně se aktivují i enzymy nacházející se v poživatinách z rostlinných anebo živočišných surovin. Avšak použití jakékoli vysoké teploty a délky času je limitováno tím, že při určité teplotě dochází k organoleptickým i nutričním změnám, případně k úplnému znehodnocení poživatiny. Smrtící účinky vysokých teplot se kvantitativně vyjadřují tzv. smrtící (letální) teplotou, což je nejnižší teplota, při které je organizmus usmrcen během určité doby (nejčastěji 10 minut) za přísně definovaných venkovních podmínek. Smrtící účinky vysokých teplot závisí na druhu mikroorganizmu, jeho fyziologického stavu a koncentraci jeho buněk v prostředí, na složení prostředí a pH. Většina mezofilních mikroorganizmů je usmrcena ve vlhkém prostředí při zahřívání na 60 až 65 °C během 10 až 15 minut, ale spóry rodů Bacillus, Clostridium a Desulfotomaculum jsou usmrceny za tuto dobu až při teplotách 120 °C anebo ještě vyšších. Poměrně termorezistentní jsou i vegetativní buňky některých druhů rodu Micrococcus, Streptococcus a Lactobacillus. Mezi nejčastější způsoby prodlužování trvanlivosti poživatin zvýšenou teplotou patří pasterizace a sterilizace. Pasterizace Pasterizací se nazývají všechny tepelné postupy, při kterých krátkodobě působí na materiál teploty pod 100 °C a usmrcují vegetativní formy mikroorganizmů na 90 až 99 %. Přitom dochází k inaktivaci i mnohých enzymů. Pro pasterizaci přicházejí do úvahy jen potraviny, které se buď stabilizují pro následující zpracovatelský proces, anebo jako konečné výrobky mají získat měřitelné prodloužení trvanlivosti. V potravinářství se pasterizují: konzumní a standardizované mléko před dalšími pracovními operacemi, ovocné šťávy, limonády, pivo, potraviny, ve kterých by vyšší teploty poškodily chuť anebo nutriční hodnotu. Při pasterizaci mléka používáme takový stupeň pasterizace, při kterém ještě přežívají bakterie mléčného kvašení, které brání rozvoji hnilobných bakterií. Sterilizace Sterilizace znamená devitalizaci prakticky všech mikroorganizmů včetně spór, které odolávají pasterizaci a krátkému varu. Při sterilizaci se používají teploty nad 100 °C, které se dosahují pod tlakem v autoklávech. Všechny sterilizační postupy směřují k tomu, aby ničily nejnebezpečnějšího původce otrav potravinami – Clostridium botulinum, s vícenásobným bezpečnostním faktorem. Clostridium botulinum produkuje nebezpečný neurotoxin, který se inaktivuje jednoduchým zahříváním. Specifickým způsobem sterilizace kapalin je vysokoteplotní krátkodobé (UHT) zahřátí. Mikroorganizmy se devitalizují krátkodobým přímým působením páry, zatímco esenciální a aromatické látky se nemění a nevzniká typická chuť po zahřátí. Tento způsob se používá při zpracování mléka, nápojů a krémů. Do sterilizovaných potravin se nepřidávají konzervační činidla.

95

Chlazení Teploty nižší jako je minimální teplota přežívá většina mikroorganizmů poměrně dlouhou dobu. Pro nepříznivé životní podmínky však nemohou rozvíjet žádnou aktivitu v předpokládaném intervalu prodloužení trvanlivosti. Chlazením prodlužujeme trvanlivost masa, mléka, vajec, ovoce a zeleniny. Když intenzivně rozmnožující se buňky (tj. buňky v exponenciální fázi růstu) některých druhů bakterií přeneseme z optimální teploty do teploty blízké 0 °C, dochází k tzv. chladovému šoku, který se projevuje ztrátou životnosti velké části populace. Chladový šok byl pozorován u gramnegativních, grampozitivních sporulujících bakterií i u psychrofilů. Citlivost různých druhů bakterií k chladovému šoku je odlišná. Když přeneseme mezofilní druh Clostridium perfringens z prostředí s 37 °C do prostředí 4°C odumírá ihned 95 % buněk a zbytek odumírá ve velmi krátkém čase. Naproti tomu Staphylococus aureus je k chladovému šoku poměrně rezistentní. Mrazení Rozeznáváme: a) pomalé mrazení na teploty pod 0°C – z nitrobuňkové i mimobuňkové vody se tvoří velké krystaly ledu, které buňku poškozují a usmrcují. Velmi citlivé k pomalému mrazení jsou druhy rodu Pseudomonas, ale endospory bakterií a koky jsou odolné. V žádném případě však nejsou usmrceny všechny přítomné mikroorganizmy, b) rychlé mrazení na teploty -30 až -190 °C – usmrtí se jen malá část populace, neboť se tvoří mikrokrystalky ledu, které nemají tak škodlivý vliv. Ve zmrazených potravinách, které se skladují při teplotách -15 až -18 °C, přežívá většina bakterií po dobu delší než rok. Zmrazením potravin dochází jen k zastavení činnosti mikroorganizmů, ne k jejich usmrcení. Po rozmrazení se potraviny začnou velmi rychle mikrobiálně rozkládat, protože tkaniva masa i rostlin jsou poškozeny mikrokrystaly ledu při zmrazování.

9.1.2

Zvýšení obsahu sušiny

Zvýšení obsahu sušiny je účinná metoda na omezení rozmnožování všech druhů mikroorganizmů, protože se odstraní jejich prostředí. Můžeme ho dosáhnout:  

odstraněním vody sušením nebo odpařením zvýšením koncentrace rozpuštěných látek v prostředí přídavkem vhodných chemikálií.

Oba dva způsoby se využívají od pradávna při konzervaci některých potravin, přičemž jsou oba dva způsoby mnohokrát kombinované. 1. Odstranění vody a) Sušení – při sušení zahyne většina mikroorganizmů, přece se však zachová velký počet životaschopných mikroorganizmů – především endospor bakterií, některých grampozitivních koků a spor hub, které v sušeném stavu přežívají velmi dlouhou dobu, takže sušenou potravinu nemůžeme považovat za sterilní. Tyto mikroorganizmy se velmi rychle rozmnoží, když se dostanou do styku s vodou. Mezi substráty vhodné na sušení řadíme: mléko, maso, ovoce, zeleninu, obilné produkty, brambory. b) Odpaření – částečné odstranění vody, které se provádí tak dlouho, dokud se nezíská konečný produkt v husté nebo kašovité formě. Ve vysoce koncentrovaných roztocích je

96

vyšší osmotický tlak, který zabraňuje rozmnožování mikroorganizmů anebo je zabíjí. Zastaví se aktivita enzymů anebo se velmi zpomalí. Substráty vhodné na zahušťování mléko hydrolyzáty škrobu ovocné šťávy droždí

Výrobek kondenzované mléko glukózový sirup ovocné koncentráty kvasnicový extrakt

2. Zvýšení koncentrace rozpustných látek v prostředí přídavkem vhodných chemikálií Zvýšení koncentrace rozpustných látek v roztoku způsobuje zvýšení osmotického tlaku v roztoku. Pokud jsou mikrobiální buňky v hypertonickém prostředí, vyrovná se rozdíl mezi osmotickým tlakem uvnitř a v prostředí tak, že molekuly vody difundují z buňky do prostředí. Když dosáhne vnitrobuněčná aw hodnotu nižší než je minimální hodnota pro metabolizmus buňky, metabolizmus buňky se zastaví. U gramnegativních mikroorganizmů se ztráta vnitrobuněčné vody může projevit zřetelným odtrhnutím cytoplazmové membrány od buňkové stěny a zmenšením celkového objemu protoplazmy, to u grampozitivních mikroorganizmů nepozorujeme. Zpětná rehydratace při jejich přenosu do izotonického prostředí většinou vede k obnovení životaschopnosti buňky. Většina hnilobných bakterií je velmi citlivá na zvýšení osmotického tlaku. Bakterie sice nezahynou, ale přestanou se rozmnožovat. Z chemikálií se nejčastěji na snížení vodní aktivity používá: 

sacharóza v koncentraci 50 až 70 %, sacharózu využíváme při výrobě kandovaného ovoce a ovocných sirupů, marmelád. U těchto výrobků se kombinuje přídavek sacharózy s částečným odstraněním vody,



chlorid sodný v koncentraci 10 až 15 %, který využíváme při přípravě soleného masa, ryb, zeleniny apod.

Chlorid sodný se používá buď solením – tj. natíráním solí, anebo lákováním tj. vložením masa do láku připraveného ze soli (NaCl), kyseliny dusičné a dusitanů.

9.1.3

Biochemické postupy

Okyselení Okyselení potravin činností mikroorganizmů znali již Egypťané a Římané, kteří měli k dispozici rozvinuté metody kvašení a vyráběli velké množství kvašených potravin. Celkové vědecké základy kvašení stanovil na začátku 19. století Pasteur. Nejznámějšími produkty, při jejichž výrobě se tento biochemický způsob využívá, jsou kvašené zelí a kvašené okurky. Mléčné kvašení Před samotným procesem kvašení se zelí osolí (2-5 %), tím se vytvoří prostředí, které je příznivé pro rozmnožování mikroorganizmů vyvolávajících kvašení, ale současně brzdí činnost jiných nežádoucích mikroorganizmů. V takovémto slaném prostředí se velmi rychle rozmnoží halotolerantní bakterie mléčného kvašení, které využívají pro svůj metabolizmus přítomné sacharidy.

97

Etanolové kvašení Využívá se při výrobě hroznových anebo ovocných vín. Přítomné sacharidy se mění působením kvasinkových mikroorganizmů na etanol, který v koncentraci nad 10 % v hotovém výrobku dokáže zabránit bez přístupu vzduchu rozmnožování mikroorganizmů.

9.1.4

Přídavek antimikrobních látek

Látky nepříznivě působící svým chemickým složením na mikroorganizmy se nazývají antimikrobiální. Tyto látky:    

zastavují růst a rozmnožování mikroorganizmů a nazývají se mikrobiostatické, mikroorganizmy usmrcují a nazývají se mikrobicidní, pokud působí jen na bakterie, nazýváme je bakteriostatické, baktericidní, pokud působí jen na kvasinky a vláknité mikroskopické houby nazýváme je fungistatické, fungicidní. Některé antimikrobiální látky působí v nižších koncentracích mikrobiostaticky a ve vyšších koncentracích mikrobicidně. Většina antimikrobiálních látek má ve velmi nízkých koncentracích stimulační účinek, zrychlují metabolizmus mikroorganizmů a zvyšují rychlost rozmnožování mikroorganizmů, proto je potřebné dodržovat jejich dávkování. Nejčastější používané antimikrobiální ochranné prostředky v potravinářství:   

propionáty: sodné a vápenaté soli kyseliny propionové mají fungistatický efekt benzoát sodný: má fungistatický, ale i bakteriostatický účinek, ale jen při nízkém pH; při hodnotě pH vyšší než 4,5 takřka ztrácí účinek (džemy, ovocné náplně apod.) kyselina sorbová a její soli (sorbity): nejvíc používaná fungistatika, s nejvyšším konzervačním účinkem, mají i bakteriostatické účinky. Používají se při výrobě tukových výrobků (margaríny, máslo, majonéza), mléčných výrobků (sušené i kondenzované mléko a sýry), při ochraně ovoce, ovocných šťáv a nápojů, zeleniny a zeleninových salátů.

9.1.5

Působení modifikované atmosféry

CO2 Když se CO2 přidá do balení potraviny, je rozptýlený rovnoměrně v potravině. Tady tvoří bikarbonátový anion a další chemické látky v závislosti na parciálním tlaku plynu, na jeho relativním objemu, pH a tlumivé kapacitě potraviny. Eliminací kyslíku se změní mikroflóra, která může způsobovat kažení potraviny, nerostou striktně aerobní mikroorganizmy. Citlivost různých mikroorganizmů na přítomnost vyššího množství CO2 je individuální. Mnohé G- bakterie jako druhy rodu Pseudomonas jsou citlivé už na nízkou koncentraci CO2 (5 %), bakterie mléčného kvašení a mnohé kvasinky jsou schopné růst v prostředí se 100 % obsahem CO2, dokonce i když je CO2 pod tlakem. Atmosféra obohacená o CO2 se využívá při balení potravin jako čerstvé maso, protože všeobecně způsobuje potlačení rychlerostoucích G- bakterií ve prospěch pomaleji rostoucích G+ bakterií. V upravené atmosféře čerstvých ryb se selekcí může stát dominantní Gbakterie Photobacterium phosphoreum, která je velmi tolerantní ke zvýšené koncentraci CO2.

98

Pro efektivní využití modifikované atmosféry při balení potravin je důležitá i teplota skladování, protože antimikrobiální účinnost CO2 je významně zvýšená při nízké teplotě. Kromě samotného CO2 se využívá při tvoření modifikované atmosféry i kombinace vícero plynů (CO2, N2, O2 resp. N2 a O2). Například u potravin citlivých na enzymatické hnědnutí a znehodnocení kvasinkami se využívá balení potravin v atmosféře obsahující více než 70 % O2.

9.1.6

Hydrostatický tlak, záření a ultrazvuk

Mikroorganizmy se většinou rozmnožují za normálního atmosférického tlaku. Zvýšením tlaku na 10 až 20 MPa se obyčejně rozmnožování mikroorganizmů zpomaluje a při tlaku 30 až 40 MPa se rozmnožování většiny mikroorganizmů úplně zastaví. Avšak na usmrcení mikroorganizmů je potřebný velmi vysoký tlak (kolem 600 až 700 MPa), přičemž se doba jeho působení uvádí v rozmezí od několika minut až hodin. Spory rodu Bacillus však nejsou usmrceny ani při hodinovém působení tlaku 1 700 MPa. Tlak několik desítek MPa indukuje klíčení spor, které potom usmrtí už teplota 60 až 65 °C. Ultrafialové záření má silné mutagenní a letální účinky na mikroorganizmy. Pronikání UV záření je však velmi malé a proto se toto záření používá jen pro sterilizaci vzduchu, povrchu předmětů, pracovních ploch provozních zařízení. Mikroorganizmy se navzájem značně liší odolností k účinkům UV světla. Poměrně odolné jsou spory rodů Bacillus, Clostridium, Desulfotomaculum, odolnější jsou i bakterie a kvasinky obsahující karotenoidní barviva a též černě zbarvené spory hub. Vyšší odolnost těchto barevných mikroorganizmů k UV záření způsobuje, že se nacházejí jako častá vzdušná kontaminace. V praxi se využívají UV lampy s vlnovou délkou 210-310 nm. Zvukové vlny o frekvenci vyšší než 20 kHz (tzv. ultrazvuk) působí na mikroorganizmy letálně tehdy, když má poměrně velkou intenzitu (kolem 10 W·cm2) a nízký kmitočet (kolem 20 kHz). Nejvýraznější vliv má ultrazvuk na dlouhé tyčinkové a vláknité mikroskopické houby, ale koky a kvasinky jsou poměrně odolné. V žádném případě však ultrazvuk nemá 100 % letální účinek.

Shrnutí Potraviny představují dynamický systém, který se neustále vyvíjí. Výroba potravin není sterilním procesem. Během výroby, zpracování a skladování v potravinách dochází vlivem nativních a mikrobiálních enzymů k mnoha biochemickým změnám. Tím že potraviny představují bohatý zdroj nutrientů a substrátů pro mikrobiální aktivitu, jsou velmi náchylné k nežádoucím změnám, kažení. Stejně tak se při zpracování surovin mohou do potravin dostat patogenní mikroorganizmy, které ohrožují zdravotní nezávadnost a spotřebitele samotného (Clostridium, Staphylococcus, Salmonella, Listeria aj.). Cílem výrobců potravin je zajistit bezpečnost potravin a zároveň prodloužit jejich údržnost (trvanlivost). K tomuto účelu jsou využívány různé konzervační postupy, které jsou založeny na přímém nebo nepřímém působení na přítomné enzymy a mikroflóru. Jejich aplikací mimo jiné dochází k inaktivaci, inhibici nebo snížení počtu mikroorganizmů, což v konečném důsledku zajistí dosažení obou výše zmíněného cíle. Většina principů spočívá v působení fyzikálních (např. teplota, záření, osmotický tlak) a chemických (konzervační činidla, biochemická konzervace) faktorů na mikroflóru.

99

Kontrolní otázky 1. Popište rozdíl mezi pasterací a sterilací? Jaké mikroorganizmy teploty užívané v rámci těchto režimů budou inaktivovány? 2. Jaké biochemické pochody vedou ke snižování nežádoucí mikrobiální populace v potravinách? 3. Jaké konzervační metody využívají principu osmoanabiózy, kryo- a psychroanabiózy?

100

10 Mikrobiologie obalových materiálů Studijní cíle: Seznámit studenty s funkcí obalových materiálů v souvislosti s minimalizací rizik kontaminace potravin a kosmetických výrobků. Odůvodnit volbu vhodných materiálů a vysvětlit bariérový princip jejich působení (výhody i nevýhody jejich aplikace). Klíčová slova: obal, ochranná funkce, papír, karton, lepenka, kovové obaly, skleněné obaly, plasty, koliformní bakterie, mikromycety Potřebný čas: 1 hodina

10.1 Úvod do problematiky obalových materiálů Pod pojmem obal rozumíme prostředek, kterého účelem je chránit zboží před poškozením. Je přímo nevyhnutelnou podmínkou skladovatelnosti výrobku, např. hermetický obal sterilizovaných potravin. Na druhé straně u některých potravin dává použití obalu předpoklady jen ke krátkému prodloužení skladovatelnosti, jako je tomu u balení čerstvých vodnatých potravin, ovoce, zeleniny, masa. Dokonce mohou nastat případy, kdy se použitím nevhodného obalu skladovatelnost potraviny zkrátí v porovnání s produktem nebaleným. K tomu může dojít např. při použití nepropustného obalu potravin, u kterých probíhají ještě některé funkce živého tkaniva, především výměna plynů s okolím a vylučování vodní páry (ovoce, zelenina).

10.1.1 Ochranná funkce obalů Bariérový ochranný účinek obalu se uplatňuje tam, kde se mikroflóra potraviny inaktivuje, především teplotou, takže se limitujícím faktorem údržnosti stávají hlavně chemické oxidační změny, kterým je možné obalem předejít. Tradiční konzervárenské plechové a skleněné obaly vykazují pro sterilované výrobky nejvyšší koeficient ochranné účinnosti. Ochranná funkce obalů spočívá v ochraně potravin před: a) b) c) d) e) f) g) h) i) j)

mechanickým poškozením, změnami vlhkosti, oxidačně-redukčními změnami, nežádoucími změnami aromatických vlastností, působením záření, změnami teploty, kontaminací cizorodými látkami, mikrobiálním znehodnocením, hmyzem, hlodavci.

Jak je z uvedeného vidět, ochrana potravin obalem může být funkčně různorodá. Není však potřeba, aby obal vyhovoval všem ochranným funkcím.

101

Současný sortiment obalových materiálů je velmi bohatý a neustále se doplňuje o nové modifikace. V zásadě jsou však nejpoužívanější následující:    

papír, karton, lepenka, kovové obaly, skleněné obaly, plasty.

10.1.2 Obaly z papíru Za papír se považují výrobky do plošné hmotnosti 150 g·m-2. Karton je tuhý papír nad 150 g·m-2 vyrobený ze zplstnatělé papíroviny na požadovanou tloušťku anebo na požadovaný počet vrstev. Lepenka je materiál vyrobený slisováním anebo slepením dvou anebo více vrstev kartonu na požadovanou tloušťku anebo na požadovaný počet vrstev o konečné plošné hmotnosti nad 230 g·m-2. Při výrobě papíru ze dřeva je počet mikroorganizmů na 1 cm2 ojediněle až nulový. Na 1 cm2 se vyžaduje jen ojedinělý výskyt vzdušných koků, sporulujících bakterií anebo vláknitých mikroskopických hub. Horší situace je u kartonů a lepenek, u kterých se na výrobu používá sběrový papír, který je silně mikrobiálně znečištěný. U těchto druhů obalů se počet bakterií pohybuje ve stovkách až tisících na 1 cm2. Obsah koliformních bakterií je velmi kolísavý a počty vláknitých mikroskopických hub se zjišťují v hodnotách okolo 100 na1 cm2. Papír jako obalový materiál má tu nevýhodu, že mikroorganizmy, hlavně vláknité mikroskopické houby jsou schopné prorůstat přes papír. Svými enzymy rozrušují strukturu papíru a využívají polysacharidy jako živiny, zvláště u těch druhů papíru, kde se technologickým procesem rozložila celulóza na nižší sacharidy. Částečné zlepšení poskytují papíry dodatečně upravované, např. papíry voskované anebo papíry použité spolu s plasty při výrobě laminátů. Ve formě fólií se při balení potravin uplatňuje hlavně skupina tzv. nepromastitelných papírů – pergamen, pergamín a pergamenová náhrada. Vynikající vlastnosti má pergamenový papír, který je nepropustný pro tuky a nerozmáčí se ani ve vřící vodě. Je to vlastně chemicky upravený papír z kvalitní sulfitové buničiny. Vzhledem ke svým vlastnostem se používá na balení mastných a vlhkých potravin.

10.1.3 Kovové obaly Kovy jsou významným obalovým materiálem pro výrobu rozmanitých spotřebitelských a přepravních obalů různé velikosti. Mohou se využívat ve formě fólií, tub, konví, sudů, kontejnerů, plechovek. Z velkého počtu kovů přichází pro výrobu potravinářských obalů do úvahy hlavně ocel (technické železo s obsahem uhlíku do 1,7 %) a hliník v obou případech s povrchovou úpravou. Cín se už jako samostatný obalový materiál používá jen velmi málo, je však nepostradatelný při povrchové ochraně ocelových plechů na výrobu konzervových plechovek. Pro část potravinářských výrobků postačuje cínovaný plech bez další povrchové úpravy. Pro korozivnější náplně (např. kyselá zelenina) a pro náplně způsobující mapování (černění) tvorbu sirníků, je potřebné cínový plech ještě lakovat. Plech ihned po výrobě je skoro sterilní. Při další manipulaci dochází ke zvyšování kontaminující mikroflóry v plechovkách. Počet bakterií v málo kontaminovaných plechovkách je několik desítek

102

na 1 cm2. Počet hub není větší než 10 a i ostatní mikroflóra, např. koliformní bakterie anebo kvasinky se vyskytují jen ojediněle. Kovové konve, které jsou vratným obalem, vyžadují důsledné čištění a dezinfekci. Nedostatečně odstraněné zbytky poživatin se stávají silným zdrojem kontaminace. Ke kovovým obalům patří i hliníkové fólie, které jsou často používány na balení různých druhů poživatin. Protože fólie jsou přepravovány ve svitcích, možnost mikrobiální kontaminace je malá.

10.1.4 Skleněné obaly Sklo je osvědčeným obalovým materiálem. Jeho předností je velká chemická odolnost, dobrá čistitelnost, možnost vícenásobného použití a lehká dostupnost surovin pro výrobu. Skleněné obaly jsou určeny na výrobky tekuté, kašovité, práškové, kusové v nálevu aj. Potravinářské skleněné obaly se rozdělují obyčejně do dvou hlavních skupin: 1. obalové sklo nápojové, 2. obalové sklo konzervové. Do skupiny nápojového skla zahrnujeme všechny sklenice s malým průměrem hrdla (do 30 mm) a s obsahem od 0,1 do 1, 25 l. Obalové sklo konzervové má velmi široký sortiment tvarů a objemů. Konzervové sklenice se vyrábějí většinou z bezbarvého skla, u kterého jsou dovoleny slabé odstíny modré, zelené, žluté, šedé nebo růžové barvy. Pro sklenice určené k pasterizaci anebo sterilizaci se vyžaduje i určitá odolnost proti tepelnému nárazu zchlazením z teploty 65 °C na 20°C a též odolnost proti vnitřnímu přetlaku 0,3 MPa. Skleněné obaly ihned po výrobě jsou sterilní, protože se vyrábějí při teplotách 1 500°C. Avšak při balení skleněných obalů ve výrobním závodě, při přepravě, jako i při skladování ve zpracovatelském závodě, kde se často tyto obaly skladují na volném prostranství, tu dochází k mikrobiální kontaminaci, zejména málo náročnou mikroflórou, např. bakteriemi Pseudomonas aeruginosa. Proto je třeba i nepoužité sklo před upotřebením čistit a dezinfikovat. Na nedostatečném čištění a dezinfekci sklenic má podíl nedostatek vody na mytí, nízká teplota a tlak vody, zanášení trysek vodním kamenem, případně nesprávná příprava čistících a dezinfekčních roztoků.

10.1.5 Obaly z plastických hmot Současné trendy v balení potravin směřují k: 

většímu využívání plastových materiálů jako náhrady obalů ze skla a kovů,



menší tloušťce plastových obalů a zvyšování jejich bariérových vlastností,



snižování hmotnosti obalů, čímž se zároveň snižují množství obalových odpadů,



postupnému přechodu na transparentní obalové materiály, nahrazující dražší, těžší a méně skladné obaly, umožňující pohled na zabalený produkt.

Plasty používané v obalové technice jsou jednak deriváty přírodních makromolekulárních látek (např. celulóza, kaučuk), jednak jsou to syntetické makromolekulární látky z nízkomolekulárních surovin. Velký výběr obalových materiálů s termoplastickými vlastnostmi dává možnost mnohých aplikací v balení potravin. Uplatňují se tu prakticky všechny plasty – PVC, kopolymery, vysoko a 103

nízkotlaký polyetylén, polypropylén, polystyrén, silikony a jejich kombinace s klasickými materiály. Ne každý druh plastické hmoty je vhodný pro každý typ potraviny a při volbě potřeba zohlednit mnohá závažná kriteria. Obaly z plastů musí vyhovovat těmto základním technologickým a hygienickým požadavkům: 

neškodnost obalu z hlediska toxicity včetně všech jeho přísad, které se používají při jejich výrobě. Vyloučení možnosti migrace cizorodých látek z obalu do potravin, resp. udržení minimální migrace na zdravotně přijatelné hranici,



obal nesmí negativně ovlivnit senzorické vlastnosti a biologickou hodnotu zabalených potravin (změnu vůně, chuti, barvy, konzistence, ztrátu aromatických látek, oxidaci tuků apod.),



neškodnost obalů z hlediska výskytu mikroorganizmů (kontaminace potravin patogenními, resp. podmíněně patogenními mikroorganizmy – včetně mikroskopických hub z obalu, resp. vytváření vhodných podmínek pro jejich růst apod.),



propustnost plynů a vodních par, zejména propustnost aromatických látek.

Po vyrobení jsou plastické hmoty prakticky sterilní, a pokud nedošlo v průběhu balení, transportu, uskladňování anebo rozbalování k silné mikrobiální kontaminaci, není třeba plastické hmoty před použitím zvlášť čistit anebo dezinfikovat. Nejméně odolné proti mikroorganizmům jsou plasty na bázi celulózy, např. celofán. Jde o fólii z regenerované celulózy vyráběné z nerecyklované celulózy ze dřeva anebo bavlny. Odolnější jsou fólie polyvinylchloridu, velmi odolný je polyetylén, a močovino-formaldehydové živice. Výhodnější jsou obaly z laminátů, u kterých je možné použít vnitřní vrstvu z antimikrobiálního materiálu. Shrnutí Obaly potravinářských i kosmetických produktů plní nejen funkci estetickou (komerční), ale hlavně ochrannou. Představují bariéru, která je kladena mikroorganizmům při vstupu do výrobku a zabraňují tak jeho kontaminaci, čímž mimo jiné přispívají k prodloužení jeho trvanlivosti. Brání potenciálnímu prostupu patogenů a rizika alimentárních onemocnění. Volba vhodného materiálu se řídí mnoha faktory, protože obal samotný nesmí potravinu negativně ovlivnit, ale musí zároveň plnit svoji funkci. Obalové materiály těsně po jejich výrobě obsahují na svém povrchu mikroorganizmy a jejich použití musí předcházet dezinfekce, aby mohlo dojít ke kontaktu s baleným materiálem. Plastové hmoty jsou v tomto ohledu nejméně rizikové. Kontrolní otázky 1. Jaké funkce plní obalové materiály a v čem spočívají? 2. Jaké druhy obalových materiálu znáte? Který z nich klade nejmenší odpor při prostupu nežádoucích mikroorganizmů? 3. Jaké vlastnosti musí mít skleněné obaly, aby plnily svoji funkci? 4. Který obalový materiál může být považován za nejůčinnější a které naopak samy o sobě mohou představovat riziko kontaminace?

104

11 Pravidla správné hygienické a výrobní praxe – mikrobiologická kritéria Studijní cíle: Seznámit studenty se správnou hygienickou praxí a s mikrobiologickými kritérii pro potraviny. Zaměřit se na základní pojmy správné hygienické praxe a postupy při zjišťování mikrobiologických kritérií. Klíčová slova: HACCP, Codex Alimentarius, ČSN 56 9609, mikrobiologická kritéria, metody, limity, rizika Potřebný čas: 3 hodiny

11.1 Úvod do problematiky bezpečnosti potravin Obecným a nadřazeným zájmem společnosti je nepochybně bezpečnost potravin. Potraviny nesmějí obsahovat mikroorganizmy, jejich toxiny či metabolity v množstvích, která představují nepřijatelné riziko pro lidské zdraví. Obecně platnou zásadou je, že není-li potravina považována za bezpečnou nebo existuje-li reálné riziko, že by mohlo dojít k ohrožení zdraví spotřebitele, nesmí být uvedena na trh. Pokud i tak dojde k uvedení nevyhovující potraviny do oběhu, provozovatelé potravinářských podniků jsou povinni ihned potravinu z trhu stáhnout. Preventivní opatření, která jsou přijímána za účelem minimalizace pravděpodobnosti ohrožení zdraví spotřebitelů, zahrnují zvláště pravidla správné hygienické praxe a dále postupy založené na zásadách analýzy rizik a kritických kontrolních bodů HACCP1. Pro validaci a ověřování postupů HACCP při výrobě potravin je vhodné určit i mikrobiologická kritéria, která vymezují přijatelnost postupů, ale samozřejmě i mikrobiologická kritéria pro samotnou bezpečnost potravin, tedy limity pro již nepřijatelnou kontaminaci mikroorganizmy. Jejich dodržování by mělo zahrnovat vyšetření odebraných vzorků podle hodnot stanovených pro jednotlivá kritéria, provedení vyšetření a přijetí nápravných opatření v souladu s příslušnými legislativními opatřeními v případě nesplnění daného kritéria. Odebírání vzorků ze zpracovatelského prostředí a vhodné zvolení mikrobiologických kritérií může být objektivním prostředkem, který poskytne provozovatelům potravinářských podniků užitečné informace o případné přítomnosti patogenních mikroorganizmů v potravinách a umožní tak docílit mikrobiologické bezpečnosti potravin či monitorovat její úroveň. Na mezinárodní úrovni byly principy pro stanovení a aplikaci mikrobiologických kritérií přijaty a doporučovány Komisí Codex Alimentarius2. V případě legislativních mikrobiologických požadavků, které jsou obsaženy v nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 2073/2005 ze dne 15. listopadu 2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny a v nařízení Komise (ES) č. 1441/2007 ze dne 5. prosince 2007, kterým se nahrazuje příloha I nařízení Komise (ES) č. 2073/2005, je jejich dodržování pro provozovatele závazné. Česká technická norma ČSN 56 9609 je vlastně doporučením pro stanovení a aplikaci mikrobiologických kritérií v rámci celého potravinového řetězce. Uvádí se v ní definice mikrobiologického kritéria, popisují se jeho jednotlivé součásti a stanoveny jsou principy a návod k provádění hodnocení mikrobiologického rizika tak, aby potravina určená pro konzumenta byla zdravotně nezávadná a vhodná ke spotřebě.

105

1

HACCP neboli Hazard Analysis and Critical Control Points, je základním prostředkem jak předcházet ohrožení zdravotní závadnosti potravin. Podle nařízení Evropského parlamentu a Rady č. 852/2004 ze dne 29. dubna 2004 o hygieně potravin ve znění pozdějších předpisů musí mít tento systém zavedeny všechny potravinářské podniky. Věstník Ministerstva zemědělství ČR 2/2010 pak uvádí všeobecné požadavky na tento systém a podmínky pro jeho certifikaci. 2

Codex Alimentarius je soubor mezinárodních obecně uznávaných potravinářských norem, které mají za cíl chránit zdraví spotřebitelů, harmonizovat požadavky na potraviny v globálním měřítku a tím pak také usnadnit mezinárodní obchod za současného zlepšování nezávadnosti potravin. Komise Codex Alimentarius byla založena v roce 1963 organizacemi FAO a WHO. Komise a její pomocné orgány vyvíjí zmíněné standardy tak, aby zohledňovaly doposud zjištěné vědecké a další relevantní informace.

11.2 Základní pojmy Mikrobiologické kritérium pro potravinu chápeme jako přijatelnost výrobku nebo šarže potraviny založenou na ne/přítomnosti mikroorganizmů (včetně parazitů), nebo množství jejich toxinů/metabolitů na jednotku hmotnosti, objemu, plochy, nebo šarži. Obecně se mohou mikrobiologická kritéria používat pro odlišení přijatelných a nepřijatelných surovin, složek potravin, výrobků, anebo šarží potravin samotnými provozovateli potravinářských podniků, pro ověřování nebo validaci účinnosti systémů HACCP, nebo pro hodnocení, zda technologické postupy splňují obecné principy hygieny potravin. Mikrobiologické kritérium je zaměřeno na zájmovou skupinu mikroorganizmů (bakterií, virů, kvasinek, plísní, řas, parazitických prvoků) a jejich toxinů či jiných metabolitů nebo hlístic. Provozovatelé potravinářských podniků by měli dle svých specifických podmínek a s využitím principů popsaných touto normou stanovit pro své výrobky relevantní mikrobiologická kritéria, která mohou zahrnovat omezení pro výskyt nejen patogenních mikroorganizmů, ale také těch, které nepříznivě ovlivňují jakost, údržnost a užitnou hodnotu potravin. Mikroorganizmy, které jsou sledovány v rámci mikrobiologických kritérií, by měly být tedy uznávány pro jednotlivé potraviny a technologické postupy jako patogenní, indikátorové nebo způsobující kažení. Tam, kde mohou být patogeny detekovány přímo a spolehlivě, měla by být jejich detekci dána přednost před stanovením indikátorových mikroorganizmů. Pro mikrobiologická kritéria musí být stanoveny analytické metody detekce a kvantifikace, měl by být určen plán definující počty vzorků, které se mají odebrat, velikosti a počet analytických jednotek, které by měly odpovídat těmto limitům ve specifikovaném stadiu dané potraviny v potravinovém řetězci. Kritérium musí také obsahovat opatření, ke kterému se přistupuje v případě, když není splněno tak, aby se znovu získala kontrola nad výrobním postupem nebo výrobkem dříve než bude nutné výrobek odmítnout. Povinná mikrobiologická kritéria musí být použita u těch výrobků, nebo ve stádiích jejich výroby, kde nejsou k dispozici žádné účinnější nástroje, a kde je žádoucí zvýšení úrovně ochrany spotřebitele. Avšak průběžnému měření fyzikálních a chemických charakteristik se často dává přednost před mikrobiologickým zkoušením, protože výsledky jsou k dispozici ve většině případů před ztrátou kontroly v kritickém kontrolním bodě. Mikrobiologické kritérium by tedy mělo být stanoveno a aplikováno pouze tam, kde je to skutečně nutné, a kde je jeho aplikace praktická. Zároveň by mělo být dané kritérium technicky dosažitelné při uplatňování pravidel správné hygienické a výrobní praxe. Posouzení principů pro stanovení a aplikaci mikrobiologického kritéria by se mělo týkat hlavně důkazu skutečných či potenciálních zdravotních rizik, mikrobiologického stavu surovin a jeho dopadu na mikrobiologický stav výsledné potraviny. Zohledněna by měla být i pravděpodobnost a následky mikrobiologické kontaminace, její nárůst během následného zacházení, skladování a užívání. Posouzení by se mělo týkat také kategorií spotřebitelů a zvážen by měl být i poměr nákladů a prospěchu spojeného s aplikací kritéria. 106

Mikrobiologické metody aplikované v souvislosti s mikrobiologickými kritérii by měly splňovat požadavky na spolehlivost, přesnost, reprodukovatelnost a minimální odchylky v rámci laboratoře příp. mezi laboratořemi. Mimo jiné by měly být voleny s ohledem na vhodnost, komplexnost, dostupnost médií, zařízení, snadnou interpretaci výsledků, požadovaný čas a náklady. Přednostně by měly být použity metody vypracované mezinárodními organizacemi. Metody pro zkoušení výrobků by měly být co nejcitlivější a reprodukovatelné pro daný účel, zatímco u metod používaných ve výrobě se klade důraz spíše na rychlost a jednoduchost. I v tomto případě by však měly poskytnout dostatečný a spolehlivý odhad potřebných informací. Mikrobiologické limity stanovené v rámci mikrobiologických kritérií by pak měly být založeny na mikrobiologických údajích vhodných pro dané potraviny a měly by být aplikovatelné na podobné výrobky v rámci správné hygienické praxe a HACCP. Mikrobiologické limity by měly brát v úvahu jakékoliv změny mikrofĺóry, které mohou nastat během skladování či distribuce. Měly by zohlednit podmínky, za kterých bude s potravinou zacházeno, za kterých bude pravděpodobně konzumována a stejně tak nerovnoměrné rozložení mikroorganizmů a inherentní variabilitu analytického postupu. Jestliže kritérium požaduje nepřítomnost určitého mikroorganizmu, měla by být určena velikost analytické jednotky a jejich počet, stejně jako počet jednotek vzorku. Plán odběru vzorků zahrnuje postup odběru a představuje rozhodovací kritéria aplikovatelná na šarži, která jsou založena na vyšetření předepsaného počtu jednotek vzorku definovanými metodami. Dobře navržený plán odběru vzorků, udává pravděpodobnost detekování mikroorganizmů v šarži, avšak žádný plán odběru vzorků nemůže zajistit nepřítomnost určitého organizmu. Plány odběru vzorků by měly být administrovatelné a ekonomicky průhledné. Výběr plánu by měl vzít v úvahu zejména: ohrožení veřejného zdraví spojené s rizikem, vnímavost cílových skupin spotřebitelů, heterogenitu distribuce mikroorganizmů, kde jsou variabilní plány odběru vzorků aplikovány, přijatelnou úroveň kvality (AQL3) a požadovanou statistickou pravděpodobnost přijatelnosti neshodné šarže. Pro mnoho aplikací se mohou jevit jako užitečné dvoutřídní nebo třítřídní plány. V plánu odběru vzorků by měly být uvedeny statistické informace k odhadu pravděpodobnosti přijatelnosti neodpovídající šarže. Doba mezi odběrem vzorků a analýzou by měla být co nejkratší, a během přepravy do laboratoře by podmínky neměly vést k nárůstu nebo poklesu počtu cílových mikroorganizmů tak, aby výsledky odrážely v rámci omezení daných plánem odběru vzorků mikrobiologický stav šarže. Protokoly o výsledku musí obsahovat informace nezbytné pro přesnou a úplnou identifikaci vzorku, popis plánu odběru vzorků, metody zkoušení a výsledky. V případě je-li to vhodné, mohou protokoly obsahovat i interpretaci získaných výsledků. Analýza mikrobiologického rizika vyžaduje strukturovaný přístup podložený touto normou a dostupné kvantitativní informace pro odhadování nebezpečí. Samotná analýza zahrnuje tři složky: hodnocení rizika, řízení rizika a komunikace o riziku. Hodnocení rizika představuje vědecky založený proces sestávající z následujících kroků: identifikace nebezpečí, charakterizace nebezpečí, hodnocení expozice a charakteristika rizika. Řízení rizika probíhá jako proces zvažování politických alternativ ve světle výsledků hodnocení rizika a pokud je to vyžadováno i výběr a zavedení vhodných možností řízení, včetně regulatorních opatření. Komunikaci o riziku pak chápeme jako hodnocení rizika poskytující jeho číselné vyjádření a stanovení spojené nejistoty. 3

AQL neboli Acceptable Quality Level je procento neshodných vzorkovaných jednotek v celé šarži, pro kterou bude plán vzorků indikovat přijatelnost s předepsanou pravděpodobností obvykle 95 %. Pro účely analýzy mikrobiologického rizika je nutné definovat hodnocení vztahu dávka-odpověď, kdy dávkou rozumíme velikost expozice biologického nebo fyzikálního činitele a odpovědí vážnost nebo frekvenci nepříznivého zdravotního účinku. Nebezpečí lze charakterizovat jako biologického, chemického, fyzikálního činitele v potravině, který za určitých podmínek může nepříznivě ovlivnit zdraví. Riziko pak představuje pravděpodobnost nepříznivého zdravotního účinku a závažnosti 107

vyplývající z nebezpečného agens v potravině. Pro účely analýzy mikrobiologického rizika je potenciální nebezpečí charakterizováno, identifikováno a kvalitativně či kvantitativně vyhodnoceno. Charakterizace nebezpečí není nic jiného než hodnocení povahy nepříznivých zdravotních účinků spojených s nebezpečím, které dává kvalitativní a kvantitativní popis závažnosti a trvání nepříznivých vlivů, které mohou být důsledkem přítomnosti mikroorganizmů nebo jejich toxinů. Kvantitativní hodnocení je číselně vyjádřené s uvedením nejistoty, kvalitativní hodnocení popisuje nebezpečí nebo zařazuje do popisné kategorie založené na odborných znalostech a nejistotách bez číselného vyjádření. Faktory, které je nutné zohlednit při charakterizaci, jsou buď ve vztahu k mikroorganizmům, nebo k lidskému hostiteli. Ve vztahu k mikroorganizmům je nutné zvážit např. jejich schopnost pomnožovat se (dynamika růstu), jejich virulenci, rezistenci a infekčnost v závislosti na interakci s hostitelem a prostředím či potenciál šíření. Identifikace nebezpečí by mělo být založeno na spolehlivých informacích z odpovídajících zdrojů dat, které představují klinické a epidemiologické studie, laboratorní studie na zvířatech, výzkum vlastností mikroorganizmů, vztahy mezi mikroorganizmy a jejich prostředí v rámci potravinového řetězce, od prvovýroby až do doby spotřeby, a studie o podobných mikroorganizmech a situacích. Hodnocení expozice pro mikrobiologické agens vychází z případné úrovně kontaminace nebo z přítomnosti toxinů a z výživových informací vztahujících se k potravinám. Faktory, které je nutné při hodnocení expozice posoudit, zahrnují četnost kontaminace potravin patogenními mikroorganizmy a úroveň kontaminace v potravinách v závislosti na čase. Tyto faktory jsou například ovlivněny vlastnostmi patogenních agens, mikrobiologickým prostředím, prvotní kontaminací surovin včetně posouzení regionálních rozdílů a sezónnosti výroby, úrovní sanitace a kontrolních postupů, postupy zpracování, balení, distribuce a skladování potravin stejně jako přípravnými kroky jako je vaření a uchovávání. Dalším faktorem je chování spotřebitelů, zvyklosti konzumace, což souvisí se socio-ekonomickým a kulturním zázemím, etnickým pozadím, sezónností, demografickou situací, regionálními rozdíly a spotřebitelskými preferencemi. Přítomnost, pomnožení, přežití nebo ničení mikroorganizmů včetně patogenů v potravinách jsou ovlivněny zpracováním a balením, podmínkami skladování včetně teploty skladování, relativní vlhkosti prostředí, a složením plynů v atmosféře. Dalšími významnými faktory jsou pH, vlhkost, vodní aktivita, výživové složení, přítomnost antimikrobiálních látek a konkurenční mikroflóra. Při hodnocení expozice může být užitečným nástrojem prediktivní mikrobiologie. Shrnutím výsledku identifikace nebezpečí, charakterizace nebezpečí a hodnocení expozice vede ke kvalitativnímu odhadu pravděpodobnosti a závažnosti nepříznivých účinků, tedy k charakterizaci rizika za účelem odhadu nebezpečí pro danou populaci. Jako u každého systému je důležité, aby i analýza rizik byla transparentní, rozhodovací proces systematicky zaznamenáván (zdokumentován) a dokumenty byly dostupné pro přehodnocení.

11.3 Náležitosti plánu odběru vzorků a doporučené mikrobiologické limity 11.3.1 Plán odběru vzorků Plán odběru vzorků představuje souhrn požadavků a pravidel, které platí pro odběr vzorků, jejich zkoušení a posouzení šarže nebo její části. Vzorky jsou odebírány náhodným výběrem, kdy se testuje libovolný vzorek kontrolované šarže mající stejnou pravděpodobnost, že bude vybrán, nebo výběrem záměrným v případě, že jsou do výběru zahrnuty vzorky s určitým záměrem, zvláště v souvislosti s epidemiologickými šetřeními. Při aplikaci plánů vzorkování lze uplatnit následující principy:

108

 vzorkovaným celkem by měla být výrobní šarže, její část nebo dodávka (pokud je dodávka složena z více šarží, potom probíhá vzorkování pro každou šarži),  vzorky jsou odebírány v množství umožňující druhou analýzu,  mikrobiologické vyšetření se provádí kontrolou jedním náhodným výběrem (výběrová kontrola) v rozsahu n. Počet vzorků n může být redukován až trojnásobně, když se jedná o posouzení šarže za předpokladu, že dosahované výsledky předchozích šetření byly vyhovující a svědčily o správné funkci HACCP, nebo pro vyšetření, jehož účelem není samotné posouzení šarže.Tento počet je normou definován v hodnotách 3m pro vzorky charakterizované jako ještě vyhovující. Možnost sníženého objemu/hmotnosti vzorku se nevztahuje na zkoušení potravin pro přítomnost bakteriálních původců onemocnění. Pro zkoušení tepelně opracovaných hermeticky uzavřených potravin je plán odběru vzorků nahrazen požadavkem obchodní sterility. Obchodní sterilita představuje nepřítomnost životaschopných mikroorganizmů, které by se mohly za podmínek oběhu množit a nepřítomnost patogenních mikroorganizmů (zvláště přítomnost Clostridium botulinum a jejich toxinů). Ta je zajišťována zvláště dodržováním technologických postupů a uplatněním HACCP. Nepřítomnost životaschopných mikroorganizmů je v tomto případě hodnocena na základě termostatové zkoušky a znamená, že po 7-10denní inkubaci při 35-37 °C nedojde k většímu zvýšení počtu mikroorganizmů než na 102.

11.3.2 Doporučené mikrobiologické limity Doporučené mikrobiologické limity uvedené v plánu vzorkování zahrnují výčet druhů nebo skupin mikroorganizmů předepsaných k vyšetření, u nichž je definován počet vzorků n, tolerovatelné množství mikroorganizmů m a M (hodnoty m a M představují konfidenční interval, do kterého bude hodnota počtu mikroorganizmů spadat s předem zvolenou vysokou pravděpodobností), kdy M je určováno v závislosti na rozhodném čísle c. Rozhodné číslo c představuje počet vzorků z výběru n, u nichž se připouští hodnota M. Pokud se u vzorků připouští pouze hodnota m, je hodnota c v příslušné dokumentaci vyjádřena nulou a hodnota M proškrtnutím. Množství mikroorganizmů (m, M) je v případě plotnových metod uváděno jako kolonie tvořící jednotky (colony forming units, CFU) na gram či mililitr vzorku (KTJ/ml~CFU/ml; KTJ/g~CFU/g) a při aplikaci membránové filtrace pak jako tolerovatelný počet mikroorganizmů na definovaný objem vzorku (např. 20/10 znamená max. 20 mikroorganizmů v 10 ml vzorku). V případě požadavku nepřítomnosti mikroorganizmů se buď 1 ml tekutého vzorku v ředění 100/10-1 zalije agarovou půdou, nebo se stejně ne/ředěné inokulum o objemu 200 µl rozetře po povrchu agarové plotny. Zkoušení se provádí v dvojím opakování. Požadavek na nepřítomnost mikroorganizmů se pak na výstupu vyjadřuje např. 0/25, což představuje nepřítomnost mikroorganizmů v 25 ml/g vzorku. Nepřítomnost se vyjadřuje jako 0 s indexy a až d, kdy jsou v jednotlivých kategoriích definována množství mikroorganizmů, při kterých jsou mikroorganizmy ve vzorcích považovány ještě za nepřítomné.

11.3.3 Interpretace výsledků vzorkování Dávka nebo část dávky je v rámci daného mikrobiologického kritéria označena jako vyhovující/nevyhovující na základě mikrobiologického rozboru stanoveného počtu vzorků. Dávka nebo její část (šarže) je označována za mikrobiologicky nevyhovující, pokud: a) dojde k překročení hodnoty M  u jednoho nebo více vzorků z výběru n byla zjištěna hodnota vyšší než M pro jeden nebo více z předepsaných sledovaných znaků (Příklad 1 109

mikrobiologický limit udán parametry: n=5, c=1, m=102, M=103, pak je vzorek hodnocen jako nevyhovující, když je např. zjištěno, že u jednoho vzorku ve sledovaném znaku byla stanovena přítomnost 5.103 CFU/g, CFU/ml), b) dojde k překročení hodnoty c  u většího počtu vzorků, než je stanoveno hodnotou c, byly zjištěny hodnoty vyšší než m a nižší nebo rovné M, a to pro jeden nebo více z předepsaných znaků (Příklad 2 - mikrobiologický limit udán parametry: n=5, c=2, m=103, M=104, pak je vzorek hodnocen jako nevyhovující, když je např. zjištěno, že u tří vzorků byly stanoveny hodnoty 5.103, 7.103, 1.103 CFU/g, CFU/ml), c) v případech, kdy je u všech vzorků z výběru n stanoven požadavek nepřítomnosti mikroorganizmů (c=0  M proškrtnuto  m=0), byly u jednoho či více vzorků sledované mikroorganizmy prokázány (Příklad 3 - mikrobiologický limit udán parametry: n=5, c=0, m=0/25, M-, pak je vzorek hodnocen jako nevyhovující, když je např. zjištěno, že u jednoho vzorku byla prokázána přítomnost sledovaných mikroorganizmů z navážky 25 g/ v objemu 25 ml). Plán vzorkování rovněž obsahuje tabulky posuzovaných operativních charakteristik a pravděpodobností posouzení kontrolovaných dávek jako vyhovujících v závislosti na skutečném zastoupení nevyhovujících jednotek v daných dávkách. Tyto hodnoty jsou stanoveny, jak již bylo zmíněno výše, na základě charakterizace a analýzy rizika a odvíjejí se od mikrobiologických limitů. Potraviny by měly být z mikrobiologického hlediska hodnoceny jako jiné než bezpečné nebo s nepřijatelně vysokou mírou rizika ohrožení zdraví lidí, popř. jako zkažené, pokud: - byly překročeny nejvyšší mezní hodnoty počtu mikroorganizmů nebo jejich toxických produktů; - byly zjištěny mikroorganizmy a mikrobiální metabolity působící onemocnění jiné než normou uvedené v množství, které by mohlo ohrozit zdravotní stav lidí; - nebyly splněny podmínky obchodní sterility; došlo k nežádoucím změnám vlastností výrobků způsobené bakteriální činností (např. zápach, změna chuti a barvy, osliznutí povrchu, zákaly, produkce plynu). Tato norma stanovuje jak nejvyšší mezní hodnoty mikroorganizmů a jejich toxických produktů, tak tolerovatelné hodnoty pro jednotlivé druhy, skupiny nebo podskupiny potravin. Mezní hodnoty jsou jasně uváděny pro následující původce alimentárních onemocnění: Bacillus cereus, termotolerantní Campylobacter, Clostridium perfringens, pro Escherichia coli jako takovou, pro její enteropatogenní kmen O 157 a E. coli produkující verocytotoxin, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella ssp., Shigella ssp., koaguláza pozitivní stafylokoky (S. aureus), suspektně patogenní kmeny Yersinia enterocolitica nebo Vibrio parahaemolyticus. Nejvyšší mezní hodnoty pro většinu vyjmenovaných mikroorganizmů (vyjma rizikové patogeny, u kterých je požadavek na nepřítomnost) se liší podle toho, zda ne/jsou potraviny určené k přímé spotřebě (nepřímá spotřeba 105, přímá spotřeba 104 CFU/g či ml). Nejpřísnější limity jsou logicky stanoveny pro potraviny určené pro kojeneckou a dětskou výživu, kdy nepřesáhnou hranici 10 2 CFU/g či ml (pro E. coli 100). Mikroorganizmy považované za původce kažení jsou pro účely normy děleny do následujících obecných skupin: aerobní mezofilní mikroorganizmy, mikroorganizmy nenáležející ke kulturní mikroflóře ve fermentovaných potravinách nebo potravinách obsahujících fermentované složky, kvasinky a plísně. Opět jsou pro tyto zájmové skupiny mikroorganizmů stanoveny nejvyšší mezní hodnoty podle způsobu spotřeby anebo účelu, avšak vždy s ohledem na původní kulturní mikroflóru. Přítomnost jakéhokoliv detekovatelného množství bakteriálních toxinů je nežádoucí. Negativní by měly být testy na přítomnost stafylokokových enterotoxinů, enterotoxinů C. perfringens a B. cereus, verocytototxin E. coli, termostabilního hemolytického toxinu V. parahaemolyticus a botulotoxinu C. botulinum). U toxických produktů mikromycet je situace mírně odlišná. Nejvyšší přípustná množství pro

110

mykotoxiny stanovují platné právní předpisy, a to sice nařízení (ES) č. 466/2001, 1425/2003, 123/2005 a 856/2005.

11.3.4 Přípustné hodnoty mikrobiologických kritérií Přípustné hodnoty pro určení mikrobiologických kritérií jsou normou navrženy pro skupiny potravin a potraviny uvedené v

Tab. 11.

Naopak mezi potraviny a skupiny potravin mikrobiologicky nerizikové náleží: - lihoviny (s obsahem etanolu vyšším než 20 % v/v); - pivo, víno, nealkoholické nápoje; - ocet; - potravinářská aromata; - náhradní sladidla; - sůl kuchyňská (bez bylinných přísad nebo sušené zeleniny); - jedlé oleje rafinované; - ztužené pokrmové tuky; - chléb a běžné pečivo (bez náplní nebo polev); - nečokoládové cukrovinky; - káva pražená a kávoviny; - čaj černý; - sušené náhražky mléka do teplých nápojů. Výše vyjmenované potraviny a skupiny potravin jsou pokládány z důvodů svého složení (např. aktivita vody, pH, obsah antimikrobiálních látek apod.), technologií výroby a vlastností jejich ekologie mikroorganizmů za mikrobiologicky nerizikové, a tak pro ně nemusí být stanovena mikrobiologická kritéria.

111

Tab. 11 Potraviny a sledované mikroorganizmy Potraviny nebo skupina potravin

Sledované mikroorganizmy nebo skupiny mikroorganizmů

Maso a masné výrobky Maso porcované, dělené maso balené Masné výrobky, uzená syrová masa, mleté maso Konzervy sterilované

Escherichia coli, Salmonella spp., koagulázapozitivní koky CPM, Escherichia coli, Salmonella spp., koagulázapozitivní stafylokoky

Polokonzervy

musí splňovat podmínku obchodní sterility CPM, Escherichia coli, Salmonella spp., koagulázapozitivní stafylokoky

Živočišný tuk (kromě másla)

Salmonella spp.

Ryby a výrobky z ryb Čerstvé, zmrazené a solené ryby a jejich části, rybí výrobky určené k tepelné úpravě Uzené ryby a jejich části určené k přímé spotřebě Zmražení měkkýši a korýši Výrobky z ryb hermeticky uzavřené, marinované, tepelně neopracované a bez konzervačních přísad Výrobky z ryb hermeticky neuzavřené (marinované, tepelně opracované)

CPM, Escherichia coli CPM, Escherichia coli, Salmonella spp., koagulázapozitivní stafylokoky

Hermeticky balené rybí výrobky

CPM, Escherichia coli, Salmonella spp. koliformní bakterie, Salmonella spp., koagulázapozitivní stafylokoky koliformní bakterie, Salmonella spp., koagulázapozitivní stafylokoky koliformní bakterie, koaguláza pozitivní stafylokoky, Clostridium perfringens

Rybí konzervy

musí splňovat podmínku obchodní sterility

Vaječné výrobky sušené Vaječné výrobky sušené Majonézy a majonézy ochucené, balené, včetně omáček, krémů apod.

CPM, Enterobacteriaceae, Salmonella spp., koaguláza pozivní stafylokoky CPM, Enterobacteriaceae, Salmonella spp., koaguláza pozivní stafylokoky

112

Mléko a mléčné výrobky Tekuté mléčné výrobky pasterované

celkový počet psychrofilních mikroorganizmů, Enterobacteriaceae

Mléčné výrobky zahuštěné Mléčné výrobky sušené včetně výrobků s přísadami a směsi k přípravě zmrzlin a mléčných pudinků

Enterobacteriaceae, koaguláza pozitivní stafylokoky Enterobacteriaceae, Salmonella spp., koaguláza pozitivní stafylokoky

Mléčné výrobky sterilované a ošetřené UHT Výrobky pro kojeneckou výživu a sušené mléčné výrobky

CPM (po inkubaci v 30 °C po dobu 15 dní) CPM, Enterobacteriaceae, Salmonella spp., koaguláza pozitivní stafylokoky, potenciálně toxikogenní plísně koliformní bakterie, Salmonella spp., koaguláza pozitivní stafylokoky, plísně Geotrichum candidum koliformní bakterie, Salmonella spp., koaguláza pozitivní stafylokoky, Bacillus cereus

Smetanové, mléčné, tvarohové krémy čerstvé Mléčné pudinky, krémy, dezerty; Hotové mléčné bpudinky, krémy a dezerty Jogurt, jogurtové nápoje, nápoje z podmáslí, acidofilní mléko, kefír, smetana kysaná apod. Tvaroh včetně výrobků ochucených a s přísadami, čerstvé tvarohové sýry, čerstvé sýry nezrající Tepelně opracované (termizované) mléčné výrobky včertně výrobků ochucených a s přísadami

koliformní bakterie koliformní bakterie CPM, Enterobacteriaceae, koagulázapozitivní stafylokoky Escherichia coli, koagulázapozitivní stafylokoky, Listeria monocytogenes

Sýry ze syrového mléka Tvrdé sýry, zvláště tvrdé sýry a sýry strouhané (včetně vakuově balených) Escherichia coli, koagulázapozitivní stafylokoky, plísně Polotvrdé sýry

Máslo a pomazánky z másla; máslo a máslo čerstvé

Escherichia coli, koagulázapozitivní stafylokoky Sledované mikroorganizmy nebo skupiny mikroorganizmů koliformní bakterie, Escherichia coli, koagulázapozitivní stafylokoky, Listeria monocytogenes CPM, koliformní bakterie, koagulázapozitivní stafylokoky, plísně CPM, Escherichia coli, plísně jiné než Geotrichum candidum

Máslo a pomazánky z másla; pomazánky z másla

CPM, koliformní, plísně jiné než Geotrichum candidum

Potraviny nebo skupina potravin Měkké sýry zrající, plísňové sýry Tavené sýry včetně sýrů ochucených a s přísadami

Tuky a oleje Rostlinné oleje lisované za studena (panenské)

CPM, koliformní bakterie, plísně

Emulgované tuky Zpracované ovoce a zelenina, suché skořápkové plody Krájená nebo strouhaná čerstvá zelenina, balená, čerstvé ovocné a zeleninové šťávy Výrobky obsahující předvářenou (blanšírovanou) zeleninu, ovoce Výrobky obsahující nepředvářenou (neblanšírovanou zeleninu, ovoce Sušená zelenina a ovoce; sušená zelenina a houby, sušené ovoce Ovocné, zeleninové, maso-zeleninové a kombinované výrobky hermeticky uzavřené

koliformní bakterie, plísně

Ovocné a zeleninové výrobky hermeticky neuzavřené

Escherichia coli Escherichia coli, potenciálně toxikogenní plísně Aspergillus flavus

Suché skořápkové plody Mlýnské obilné výrobky, luštěniny a mlýnské výrobky z luštěnin, semena rostlin Mouka, krupice, kroupy, jáhly, moučné směsi pro přípravu těst

CPM, Escherichia coli, Salmonella spp. CPM, koliformní bakterie, Salmonella spp., plísně CPM, koliformní bakterie, Salmonella spp., plísně Escherichia coli, plísně musí splňovat podmínku obchodní sterility

koliformní bakterie, plísně

113

Instantní moučné a krupicové výrobky s výjimkou dětské výživy Dětská výživa určená ke spotřebě po tepelné výrobě Dětská výživa určená ke spotřebě po obnovení v tekutině neuvedené předtím do varu Těstoviny sušené včetně ochucených nebo s náplní Těstoviny nesušené včetně ochucených Těstoviny nesušené s náplní Rýže, luštěniny Dehydratované sojové výrobky texturované (plátky, kostky, drť apod.) určené k tepelné úpravě Sójové výrobky typu tofu pasterované nebo zmrazené

CPM, koliformní bakterie, plísně CPM, koliformní bakterie, Salmonella spp., potenciálně toxikogenní plísně Aspergillus flavus CPM, koliformní bakterie, Salmonella spp., koagulázapozitivní stafylokoky, potenciálně toxikogenní plísně CPM, koliformní bakterie, koagulázapoztivní stafylokoky, plísně CPM, koliformní bakterie, koagulázapozitivní stafylokoky CPM, koliformní bakterie, koagulázapoztivní stafylokoy, Bacillus cereus, Clostridium perfringens Escherichia coli, plísně CPM, koliformní bakterie CPM, koliformní bakterie, koagulázapozitivní stafylokoky CPM, koliformní bakterie, koagulázapozitivní stafylokoky

Sójové nápoje a obdobné výrobky pasterované Drobná semena rostlin k přímé spotřebě (slunečnicová, sezamová, dýňová, lněná, apod.) Escherichia coli, plísně

Potraviny nebo skupina potravin Drobná semena rostlin ke spotřebě po tepelném opracování (mák, pohanka, proso, apod.) Naklíčená semena rostlin Obilné výrobky typu vločky, müsli, corn flakes, extrudované

Sledované mikroorganizmy nebo skupiny mikroorganizmů Escherichia coli, plísně Escherichia coli, plísně, Salmonella spp., Listeria monocytogenes Escherichia coli, Salmonella spp., plísně, plísně pro obilí a šroty k přímé spotřebě

Pekařské a cukrářské výrobky Strouhanka

Escherichia coli, plísně

Trvanlivé pečivo, dětské piškoty Cukrářské a pekařské výrobky neplněné, sněhové pečivo, výrobky s trvanlivými náplněmi

CPM, koliformní bakterie, Salmonella spp., plísně

Cukrářské výrobky s bílkovými krémy a plněné máslovými a tukovými žloutkovými krémy Cukrářské výrobky plněné anebo zdobené šlehačkovou náplní, smetanovými krémy Pekařské a cukrářské výrobky chlazené a zmrazené včetně výrobků s náplněmi Škrobárenské výrobky a výrobky z brambor Škrob, pudinky, krémy a dezerty v prášku, tzv. šlehačka v prášku apod. Sušené bramborové výrobky (bramborák, bramborové knedlíky, placky, apod.) Sušené bramborové výrobky instantní Bramborové výrobky typu chips (neochucené i ochucené, kořeněné, apod.) Přípravky určené ke spotřebě po tepelné úpravě nebo po přidání horké vody

koliformní bakterie, plísně CPM, koliformní bakterie, Salmonella spp., koagulázapozitivní stafylokoky, plísně, Listeria monocytogenes CPM, koliformní bakterie, Salmonella spp., koagulázapozitivní stafylokoky, plísně, Listeria monocytogenes koliformní bakterie, Salmonella spp., koagulázapozitivní stafylokoky, Bacillus cereus, plísně koliformní bakterie, koagulázapozitivní stafylokoky, plísně koliformní bakterie, plísně CPM, koliformní bakrterie, koagulázapozitivní stafylokoky, plísně koliformní bakterie, Salmonella spp., plísně Enterobacteriaceae, koagulázapozitivní stafylokoky

114

Ostatní výrobky Tekuté koření a ochucující přípravky Koření, směsxi koření a suché kořenící přípravky Čaj zelený, bylinné a ovocné čaje, jejich směsi Instantní čaje a nápoje s výjimkou mléčných a kakaových Želatina včetně výrobků ochucených a s přísadami Tekuté přípravky obsahující pektin (z jablečné dřeně nebo citrusové kůry) Droždí nativní a lyofilizované, vinné kvasinky Mlékařské kultury k domácí přípravě kysaných výrobků Doplňky minerální, vitamínové a kombinované (ve formě tablet, dražé, kapslí apod.) Doplňky obsahující rostlinné části (ve formě tablet, dražé, kapslí apod.) Vícesložkové přípravky k posílení organizmu, pro sportovce apod. Potraviny nebo skupina potravin Lahůdkářké výrobky s majonézy, např. saláty, obložené chlebíčky, výroby v aspiku, pomazánky Kečupy, dresinky, kořenové směsi a obdobné výrobky k dochucování pokrmů (nesterilované výrobky) Bezmasé polotovary čerstvé, chlazené nebo zmrazené Masové a kombinované polotovary a pokrmy čerstvé, chlazené nebo zmrazené Zmrzliny a mražené krémy Mlékařské kultury k domácí přípravě kysaných výrobků Přírodní sladidla a med; suché a tekuté výrobky pro drobné spotřebitelské balení, med včelí Kakaový prášek, výrobky k příprapravě kakaových nápojů

Escherichia coli, Salmonella spp., koagulázapozitivní stafylokoky, Clostridium perfringens, potenciálně toxikogenní plísně Escherichia coli, Salmonella spp., koagulázapozitivní stafylokoky, Clostridium perfringens, potenciálně toxikogenní plísně Aspergillus flavus Escherichia coli, Salmonella spp., potenciálně toxikogenní plísně Aspergillus flavus koliformní bakterie Salmonella spp., koagulázapozitivní stafylokoky, Clostridium perfringens koliformní bakterie, plísně Enterobacteriaceae, Salmonella spp., koliformní bakterie, Salmonella spp., koagulázapozitivní stafylokoky CPM, Escherichia coli Escherichia coli, plísně CPM, Escherichia coli, Salmonella spp., koagulázapozitivní stafykoky Sledované mikroorganizmy nebo skupiny mikroorganizmů Escherichia coli, Salmonella spp., koagulázapozitivní stafylokoky, Bacillus cereus, sulfitredukující klostridia koliformní bakterie, koagulázapozitivní stafylokoky, laktobacily Escherichia coli, Salmolla spp., koagulázapozivní stafylokoky Escherichia coli, Salmonella spp., koagulázapozitivní stafylokoky, sulfidredukující klostridia CPM, Enterobacteriaceae, koagulázapozitivní stafylokoky CPM, Escherichia coli, koagulázapozitivní stafylokoky koliformní bakterie Enterobacteriaceae, Salmonella spp. , plísně

Čokoláda, čokoládové cukrovinky, speciality, polevy CPM, Enterobacteriaceae, Salmonella spp., plísně * potenciálně toxikogenní plísně zvláště Aspergillus flavus

Shrnutí Během výroby potravin musí být dodržována správná hygienická praxe. Pro zajištění bezpečnosti a zdravotní nezávadnosti produktů jsou přijímána opatření v podobě systému HACCP. Kontrolní kritické body, ve kterých může dojít ke vzniku rizika ohrožení bezpečnosti potravin, jsou ověřovány. Nedílnou součástí těchto bodů je sledování zvládnutého stavu, který je mimo jiné podmíněn dodržením mikrobiologických kritérií. Směrodatnou českou normou pro určení mikrobiologických kritérií je ČSN 56 9609, která koresponduje s požadavky EU. Tato norma je doporučením pro stanovení a aplikaci mikrobiologických kritérií v rámci celého potravinového 115

řetězce. Uvádí definice mikrobiologického kritéria, popisuje jeho jednotlivé součásti a stanovuje principy a návody k provádění hodnocení mikrobiologického rizika tak, aby potravina určená pro konečného spotřebitele byla zdravotně nezávadná a vhodná ke konzumaci. Pro každou skupinu potravin jsou pak přípustné hodnoty pro určení mikrobiologických kritérií navrženy odlišně. Důvodem je odlišný původ a složení výrobků, který udává přítomnou mikroflóru a potenciální výskyt patogenů.

Kontrolní otázky 1. Jak souvisí HACCP a mikrobiologická kritéria? 2. U jakých mikroorganizmů norma ČSN 56 9609 uvádí nejvyšší mezní hodnoty mikroorganizmů a jejich toxických produktů? Uveďte příklad (potravina, mikroorganizmus). 3. Jak probíhá odběr vzorků definován normou ČSN 56 9609? Popište jednotlivé kroky.

116

12 Mikrobiologie tukařského průmyslu Studijní cíle: Seznámit studenta s problematikou výskytu mikroorganizmů v surovinách tukařského průmyslu. Zaměrit se na výskyt mikroorganizmů v jedlých tucích a olejích a výrobků z nich (margarín) Klíčová slova: tuky, oleje, margarín, plísně, kvasinky, pseudomonády, bakterie mléčného kvašení Potřebný čas: 2 hodiny

12.1 Úvod do problematiky mikrobioogie tuků Porovnává-li se uplatnění mikrobiologie v průmyslu mlékárenském s jejím uplatněním v průmyslu tukařském, je na první pohled zřejmá značná rozdílnost významu mikrobiologie v jednotlivých oborech. V mnohých úsecích mlékárenské technologie je využití biochemické činnosti některých mikroorganizmů základem celé výroby. Tak je tomu např. při výrobě sýrů, výrobě kysaných a zkvašených mlék, výrobě másla ze zakysané smetany. V tukařském průmyslu se s podobným využitím mikroorganizmů až na výrobu mléčného margarínu nesetkáváme. Ať již jde o výrobu olejů, tuků a kosmetických výrobků slouží mikrobiologie v tukařském průmyslu hlavně k účelům mikrobiologické kontroly výrobků. Správně prováděná mikrobiologická kontrola v tukařském průmyslu odhaluje mnohé, často závažné nedostatky, jejichž odstranění nemálo přispívá ke zlepšení jakosti výrobků. Z tohoto hlediska je třeba též chápat uplatnění mikrobiologie v tukařském průmyslu.

12.2 Mikrobiologie surovin tukařského průmyslu Mezi suroviny v našem tukařském průmyslu převážně zpracovávané patří semena a plody některých rostlin. Nejčastěji to bývají řepka, slunečnice, mák, hořčice, len, sója, kopra, podzemnice, palmová jádra a další. Správné skladování zajišťuje dobrou jakost semena a v něm obsaženého oleje. O možnostech skladování rozhoduje druh semena. Při skladování je důležitá správná teplota a vlhkost skladu. Zvýšená teplota a vlhkost vytvářejí příznivé podmínky pro rozvoj plísní, které, zvláště při dlouhotrvajícím skladování, svou lipolytickou činností ohrožují jakost suroviny. Snížením relativní vlhkosti ve skladovacím prostoru na 70 až 75 % se značně zhorší podmínky pro růst plísní. Též sníženou teplotou se omezí činnost lipolytických enzymů. Plísně jsou na snížení teploty různě citlivé. Klesne-li ve skladovacích prostorách teplota pod 10 °C, nastává ještě rozvoj různých druhů plísní rodů Penicillium a Alternaria na povrchu semen, který je tím silnější, čím vyšší je relativní vlhkost ve skladovacích prostorách. Jako škůdci bývají na semenech a plodech nejčastěji zjišťovány různé druhy rodů Mucor, Rhizopus, Aspergillus, Penicillium a Alternaria. Z ostatních mikroorganizmů bývají ve větším množství zjišťovány bakterie a kvasinky. Hlavně plísně a bakterie produkující lipázy jsou škůdci semen a plodů. 117

Ke skladování se používá přízemních skladů, sýpek nebo sil. Přízemní sklady nejméně vyhovují pro dobré skladování a používá se jich proto pouze pro skladování krátkodobé. Odstranit mikrobiální škůdce je zde obtížné, neboť zde není dostatek skladové plochy a vadné semeno se obtížně ošetřuje a odděluje od semen dobré jakosti. Při skladování na sýpkách je možno semeno lépe dosoušet a přesypávat. Boj proti mikroorganizmům je na sýpkách účinnější, neboť semeno lze lépe ošetřovat. Nejlepší podmínky skladování poskytují mechanizovaná, kontrolním zařízením vybavená železobetonová sila. Nevýhodou železných sil je vnitřní opocování stěn a tím plesnivění partií zvlhlých semen. Semeno v silu lze dobře provětrávat, zchlazovat a různým způsobem ošetřovat. Dálkové registrační teploměry a vlhkoměry umožňují dobrý přehled o stavu semen v jednotlivých odděleních sila.

12.3 Mikrobiologie jedlých olejů a tuků Tuky a oleje se získávají lisováním a extrakcí. Lisování olejnatých semen a plodů je z hlediska jakosti tuků a olejů výhodné, avšak v pokrutinách zůstává ještě 5 až 10 % oleje. Tento nedostatek lisování je odstraněn extrakcí pomocí rozpustidla, které lze poměrně za nízkých teplot odstranit z oleje i ze šrotu. Moderní extrakční zařízení znamená nejen úsporu pracovních sil, ale získává se jím i více oleje, který se jakostí vyrovná olejům získaným lisováním. Surové lisované nebo extrahované oleje obsahují kromě tuků též lecitin, bílkoviny, slizy, vodu a další složky. Často se vyznačují nepříjemnou chutí a vůní. Má-li být surového oleje použito přímo pro potravinářské účely, musí být získán ze semen nebo plodů nejlepší jakosti, které nebyly napadeny plísněmi nebo jinými mikroorganizmy produkujícími lipázy. Nejčastěji se v surovém stavu konzumuje olivový olej. Jinak se veškeré rostlinné oleje a tuky určené k výrobě margarínu a jedlých tuků rafinují. V rafinerii se oleje nejdříve předčistí, aby se částečně oddělily netukové látky. Předčištěné oleje se lépe rafinují, dávají lepší výtěžnost a jsou trvanlivější. Po předčištění následuje neutralizace olejů, kterou se odstraňují volné mastné kyseliny, netuky a části barviva. Další etapou při rafinaci je bělení, takže olej dostane požadovanou barvu. Nepříjemné chuti a vůně surových olejů a tuků, ať již typických pro čerstvou surovinu, nebo vzniklých rozkladem tuků, se odstraňují desodorizací. Při desodorizaci se surový olej zbavuje těkavých látek vodní parou, která se za určitých pracovních podmínek prohání olejem. Teplota oleje se při desodorizaci pohybuje v rozmezí 150 až 180 °C. Rafinační proces, při němž se používá vysokých teplot, a chemické složení rafinovaných olejů a tuků nevytvářejí příznivé podmínky pro rozvoj mikroorganizmů v těchto výrobcích. Proto přítomnost jakékoliv mikroflóry je vzácným jevem a svědčí vždy o kontaminaci.

12.3.1 Mikrobiologie ztužených tuků Ztužováním čili hydrogenací se rozumí katalytické vázání vodíku na nenasycené dvojné vazby mastných kyselin v olejích. Po ztužování jsou tuky za normální teploty tuhé, světlejší barvy a bez původního pachu. Pro ztužování se nejprve oleje připraví. Zpravidla jde o předrafinaci, tj. neutralizaci louhem, praní a bělení. Dalším úsekem je výroba a čištění vodíku, výroba katalyzátoru a vlastní ztužování. Ztužené tuky vzhledem k vysokým teplotám (175 až 180 °C) používaným při ztužování jsou prosté mikroorganizmů. Vyskytnou-li se výrobcích mikroorganizmy, jde o rekontaminaci hotového výrobku. Podmínky pro rozvoj bakterií, kvasinek i plísní jsou ve ztužených tucích nepříznivé a výskyt mikrobiálních vad je zde tedy vzácností. Ztužené tuky tvoří též podstatnou část tukové 118

násady při výrobě margarínu a ostatních upravených tuků. Uplatňují se na vláčnosti, konzistenci, chuti i trvanlivosti těchto výrobků. Ztužené tuky jsou surové. Pro výživu se rafinují obdobně jako oleje.

12.3.2 Mikrobiologie margarínu Skupinu tuků emulgovaných s mlékem, syrovátkou nebo vodou zařazujeme do skupiny margarínů. Podle jakosti a upotřebení se rozeznává několik hlavních druhů margarínu. U mléčného margarínu tvoří dispergovanou fázi zakysané mléko nebo syrovátka. U stolního margarínu tvoří dispergovanou fázi voda. U soleného margarínu tvoří dispergovanou fázi voda obohacená 0,5 až 3 % soli. Hlavní součástí margarínu je tuková násada, která tvoří kontinuální fázi. Voda, mléko, popřípadě syrovátka, tvoří fázi dispergovanou. Kromě těchto základních složek obsahuje margarín ještě mnoho dalších přísad, z nichž mnohé mohou být zdrojem mikroorganizmů v margarínu. Proto je třeba věnovat všem surovinám používaným při výrobě margarínu z mikrobiologického hlediska zvýšenou pozornost. Při výrobě mléčného margarínu, kdy se přidává mléko nebo syrovátka, je dobře provedená pasterace těchto mléčných složek spolu se zamezením kontaminace nezbytným požadavkem. Vlastní technologický postup se skládá v zásadě z emulgace všech použitých surovin. Při výrobě margarínu je důležité, aby se vytvořila emulze typu voda v oleji, která je základem trvanlivosti výrobku. Pak se emulze vychladí na teplotu 2 až 5 °C. Účelem mechanického zpracování emulze je vytvořit u margarínu homogenní konzistenci podobnou máslu. Hotový výrobek se automaticky formuje a balí. Při tomto způsobu výroby jsou jednotlivé pracovní úseky odděleny a je tedy velké nebezpečí vzdušné kontaminace výrobků. U moderních strojů (votátor) tvoří emulgace, chlazení emulze a mechanické zpracování emulze uzavřený prostor, což velkou měrou přispívá k zlepšení mikrobiologické jakosti margarínu.

12.3.3 Zdroje mikroorganizmů v margarínu Margarín svým složením není zvlášť příznivým prostředím pro rozvoj mikroorganizmů. Nízký obsah vody a její rozptýlení v podobě nepatrných kapének obklopených tukem zvláště nevyhovuje většině mikroorganizmů. Též tuk, který je hlavní složkou margarínu (asi 82 %), je odolný vůči mikroorganizmům. Ale i přes tyto nepříznivé podmínky může margarín obsahovat značně vysoký počet mikroorganizmů, které se v něm rozmnožují a svojí enzymatickou, hlavně lipolytickou činností bývají původci různých vad margarínu. Pouze při výrobě aromatického margarínu, kdy se přidává zakysané mléko nebo syrovátka očkované smetanovým zákysem, aby se obohatil margarín diacetylem, je přítomnost bakterií Lactococcus lactis nebo Leuconostoc dextranicum žádoucí. Kromě těchto, v tomto případě užitečných mikroorganizmů, jsou četné bakterie, kvasinky a plísně, které mohou vyvolat v margarínu různé chuťové i jiné vady. Tyto mikroorganizmy pocházejí z různých zdrojů, především z násady, vody nebo mléka, zařízení, škrobu, emulgátoru, soli, barvy, vzduchu, obalového materiálu a od lidí, kteří přicházejí s výrobou a výrobky do styku. Každý z uvedených zdrojů, není-li mu věnována náležitá pozornost, může zhoršit mikrobiologickou jakost margarínu. Hlavní zdroje mikroorganizmů jsou: Násada. Správná volba tukové násady má přímý vliv na jakost i trvanlivost margarínu. Násada se volí podle toho, k jakým účelům má být margarínu použito. Z hlediska trvanlivosti margarínu není výhodné používat tuky, které obsahují nižší mastné kyseliny C6 až C12, neboť snadno podléhají ketonickému štěpení a tím vznikají i chuťové vady. Použité oleje a tuky mají být bez chuti a vůně a 119

po mikrobiologické stránce nezávadné. Jacobsen uvádí, že rostlinné oleje bývají někdy bohaté na mikroorganizmy a často se kazí, jsou-li špatně skladovány. Proto je účelné oleje a tuky určené k výrobě margarínu z hlediska mikrobiálního kontrolovat. Při mikrobiologické kontrole tuků a olejů se nejčastěji zjišťují plísně rodů Penicillium, Aspergillus, Cladosporium a Mucor. Bylo potvrzeno, že v olejích se mohou dlouhou dobu udržovat spory plísní; nejsou-li však příznivé podmínky pro jejich další rozmnožování, mikrobiální vady nevznikají. Voda. V temperačních kotlích se násada přihřeje na požadovanou teplotu a přidají se barviva, kyselina benzoová, emulgátor, lecitin a ostatní přísady rozpustné v tuku, potom voda nebo mléko. Do vody se přidávají všechny rozpustné látky, jako sůl, škrob a konzervační látky rozpustné ve vodě. Voda může být zdrojem škodlivých mikroorganizmů, nejčastěji bakterií rodu Pseudomonas, které mají malé nároky na živiny, neboť jde většinou o mikroorganizmy vodní. Různé druhy rodu Pseudomonas mohou v margarínu vyvolat mikrobiální vady. Voda může být též zdrojem kontaminace bakteriemi skupiny coli-aerogenes. Proto se vodě používané k výrobě margarínu musí věnovat i z mikrobiologického hlediska velká pozornost. Musí být zdravotně i technologicky nezávadná. Mléko. Původně se při výrobě margarínu používalo plnotučné pasterované mléko. S mlékem nebo syrovátkou se do margarínu dostává živná půda vhodná pro růst bakterií, kvasinek a plísní. Nedbá-li se při výrobě všech hygienických a sanitačních opatření, získá se výrobek méně trvanlivý. Dobré životní prostředí pro růst mikroorganizmů vytváří přítomná laktóza a bílkoviny mléka. Použije-li se nezakysané mléko, získá margarín jen v malé míře přirozenou chuť a vůni mléka. Někdy se požaduje, aby chuť a vůně margarínu připomínala dobré máslo. Mnozí autoři dokázali, že hlavní složkou aromatu másla je diacetyl, který se tvoří při biologickém zrání smetany zaočkované máslařským zákysem. Při stloukání smetany přichází určitý podíl aromatických látek do másla. Při výrobě margarínu se diacetyl spolu s dalšími aromatickými látkami vytvořenými biologickou cestou přidává ve formě zakysaného odstředěného mléka nebo zakysané syrovátky. Mléko nebo syrovátka dobré jakosti se očkují aromatickým smetanovým zákysem obsahujícím ve správném poměru mikroorganizmy kyselinotvorné (Lactococcus lactis) a aromatvorné (Leuconostoc dextranicum). Uvedené mikroorganizmy vytvářejí v kyselém prostředí z kyseliny citronové diacetyl.. Škrob. Přídavek bramborového, popř. kukuřičného škrobu v dávce 0,2 až 0,3 % je předepsán při výrobě margarínu jako indikátor. Přidávaný škrob vyžaduje důkladnou mikrobiologickou kontrolu, neboť velmi často bývá zdrojem kontaminace margarínu plísněmi, popřípadě různými bakteriemi. Proto se musí škrob pasterovat, aby byla zaručena jeho mikrobiologická nezávadnost. Emulgátory. Nejčastěji se používá lecitinu nebo monoglyceridů a diglyceridů. Emulgátor se v oleji rozpouští při teplotě 75 °C nejméně po dobu 15 minut. Tento záhřev je vlastně dlouhodobou pasterací, při níž se ničí škodlivé mikroorganizmy, které mohou být přítomny v lecitinu. Barva do margarínu. Používá-li se k barvení margarínu orleany, bývá její jakost při expedici po mikrobiologické stránce nezávadná. Není-li však v provozu správně uskladněna, bývá často dodatečně kontaminována, někdy i značným množstvím mikroorganizmů. Nejčastěji to bývají bakterie, kvasinky a plísně. Množství mikroorganizmů se může pohybovat v 1 ml od několika tisíc do několika desítek miliónů. Množství bakterií zpravidla výrazně převyšuje množství kvasinek a plísní. Uvedené nálezy ukazují, že nevhodně skladovaná barva může margarín po mikrobiologické stránce nepříznivě ovlivnit. Sůl. Sůl používaná při výrobě margarínu má být suchá a dobře skladovaná. Vlhká sůl bývá často zdrojem kontaminace nežádoucími mikroorganizmy, zvláště plísněmi, které mohou být původci mikrobiálních vad margarínu.

120

Zařízení. Margarín může být mikrobiologicky znečištěn strojním zařízením, se kterým přichází do styku. Nejčastěji to bývá potrubí, čerpadla, temperační kotle na tuk a vodu, kirna, chladicí buben, hnětač, formovací a balicí zařízení a různé nářadí používané při výrobě margarínu. Aby se zamezilo kontaminaci strojním zařízením, musí se věnovat veliká péče čistotě a dezinfekci všech ploch, se kterými přichází margarín do styku. Vzduch. Největší nebezpečí vzdušné kontaminace představují u margarínu plísně. Vzdušná kontaminace bývá u margarínu častým jevem, neboť při výrobě jí bývá margarín vystaven delší dobu. Podle různých autorů jsou ve vzduchu nejvíce zastoupeny bakterie, dále spory plísní a neméně kvasinky. Technologicky závadná mikroflóra vzduchu může být původcem vážných vad výrobků. Obalový materiál. K mikroorganizmům vyskytujícím se na obalech patří sporulující bacily, různé druhy rodů Proteus, Escherichia, Aerobacter, Pseudomonas a různé druhy plísní, např. Proteus vulgaris, Bacillus megatherium, Bacillus mycoides, různých druhů kvasinek rodů Saccharomyces a Candida. Dále bývají zjišťovány druhy rodů Penicillium, Aspergillus, Oospora, Mucor, Phoma a Cladosporium. Z technologického hlediska jsou nejvíce nebezpečné plísně, které snadno přecházejí z obalů na margarín a pronikají svými hyfami i do jeho hlubších vrstev, kde způsobují různé vady. Zvláště přísně je třeba hodnotit mikroorganizmy s lipolytickou a proteolytickou činností. Člověk. Osoby vyrábějící margarín a přicházející s ním do styku, mohou být původci různé mikrobiální kontaminace. Nejčastěji bývají zdrojem kontaminace ruce a oděv. Zaměstnanci proto musí dodržovat všechny hygienické předpisy. Osoby nemocné infekčními chorobami nebo bacilonosiči nesmějí být při výrobě margarínu zaměstnáni. Personál pracující při výrobě margarínu musí být pod pravidelnou lékařskou kontrolou.

12.3.4 Vlivy působící na růst mikroorganizmů v margarínu Na růst mikroorganizmů v margarínu působí rozdělení kapének, teplota, vzduch, sůl a konzervační prostředky. 

Vliv rozdělení kapének

V margarínu, podobně jako v másle, jsou voda nebo mléko rozděleny do drobných kapének, jejichž počet dosahuje několika miliónů v 1 g. Množství kontaminovaných kapének v margarínu závisí na počtu mikroorganizmů v násadě, vodě, mléce, škrobu apod. Bylo potvrzeno, že mikroorganizmy jsou v margarínu z téže výroby rozptýleny neprasvidelně. Tento poznatek nasvědčuje tomu, že rozvoj mikroorganizmů bývá omezen na určitá ohnisková střediska, která poskytují lepší podmínky pro jejich růst. Obsah živin nejmenších kapének mikroorganizmům brzo nestačí, mikroby přestanou růst a jejich počet se pomalu snižuje. Pohyb bakterií v margarínu není příliš velký. Setkáváme se s ním hlavně pod pergamenovým obalem. Fyzikální podmínky uvnitř margarínu jsou důležité pro růst mikroorganizmů a mají vliv na jeho jakost. Charakter rozptýlení kapének v margarínu je důležitý především z hlediska růstu bakterií; u kvasinek a zvláště plísní již není tak podstatný. Plísně pronikají svými hyfami i do nejmenších kapének, kde využívají živin a vyvolávají popřípadě vady výrobků. Důležité je, zda byla kontaminována násada, může výrobek plesnivět, ať je stupeň vlhkosti prostředí jakýkoliv. Byl-li však kontaminován margarín až po výrobě, lze skladováním v suché, dobře větrané místnosti omezit další rozvoj plísní. Kromě velikosti kapének a jejich rozptýlení je důležité, zda jsou tvořeny pouze vodou nebo mlékem, popřípadě syrovátkou. Použije-li se zakysaného mléka nebo syrovátky, je třeba dbát na to, aby se s mlékem nebo syrovátkou nedostala do margarínu nežádoucí mikroflóra.

121

Tvoří-li dispergovanou fázi mléko, jsou v margarínu příznivější podmínky pro růst mikroorganizmů, než použije-li se syrovátky. Je-li dispergovaná fáze voda, jsou podmínky pro růst mikroorganizmů nejméně vhodné. Mareš sledoval vliv emulze na růst plísní v margarínu. Při dobře provedené emulgaci, kdy je voda nebo mléko stejnoměrně rozptýleno v nejmenších kapénkách, nevyrostly naočkované plísně v margarínu ani po třech měsících. U margarínu špatně emulgovaného, kde byla zjištěna volná voda, byl růst plísní rychlý a za 4 až 6 týdnů margarín žlukl. 

Vliv teploty

Teplota, při které je margarín uložen, má vliv na růst mikroorganizmů. Trvanlivost margarínu uloženého v chladu mohou ohrozit bakterie štěpící tuk, hlavně Pseudomonas fluorescens, E. coli, Enterobacter aerogenes, kvasinky a plísně. Různí autoři potvrdili, že ve skladovacích prostorách má být maximálně teplota 10 až 12 °C. Chlazení je důležité, neboť chlazený margarín se lépe přepravuje a je trvanlivější. Mikrobiální vady margarínu se projeví vždy rychleji, skladuje-li se margarín při teplotě 18 až 20 °C. Poměrně odolné vůči nízkým teplotám jsou plísně, největší škůdci margarínu; to platí hlavně o některých druzích rodů Penicillium a Alternaria, které mohou růst na margarínu i při teplotě 0 °C. Na druhé straně Aspergillus flavus a Aspergillus niger přestávají růst již při 10 °C, Rhizopur niger při 0 °C. Během skladování se celkový počet mikrobů v margarínu snižuje. To však není zárukou jeho dobré jakosti. Též mikrobiální nález nemusí být v souhlase s jakostí margarínu. Příčinou je různý způsob rozdělení mikroorganizmů v malých nebo větších kapénkách. Je jisté, že se zde uplatňuje též druhové zastoupení mikroorganizmů a jejich enzymatická aktivita. 

Vliv vzduchu

V margarínu jsou mikroorganizmy zpravidla blízko povrchu než uvnitř. V povrchových vrstvách bývají proto častěji zjišťovány mikrobiální vady. Tento poznatek lze vysvětlit vlivem vzduchu na růst mikroorganizmů. Většina lipolytických a hnilobných mikroorganizmů se vyznačuje rychlejším růstem na povrchu; teprve později působí uvnitř. Zvláště plísně mají zvýšené nároky na kyslík. Kyslík se dostává do margarínu při výrobě, hlavně při práci na kirně, kdy se emulze našlehává vzduchem. Doporučuje se proto emulgovat v prostředí inertního plynu, např. kysličníku uhličitého, který se přidává ve formě suchého ledu. Sníží-li se obsah kyslíku v margarínu, omezí se rozvoj četných mikroorganizmů a prodlouží doba trvanlivosti.  Vliv soli Přidává-li se při výrobě margarínu chlorid sodný, tvoří dispergovanou fázi voda obohacená 0,5 až 3 % soli. Přídavkem soli se omezí růst některých mikroorganizmů v margarínu a zabrání nebo oddálí se mikrobiální kažení. Důležitá je koncentrace soli ve vodních kapénkách. Sůl musí být z mikrobiologického i chemického hlediska nezávadná. Účinnost soli na růst mikroorganizmů v margarínu závisí na druzích mikroorganizmů, neboť jsou na sůl různě citlivé. Velmi citlivá na sůl je Oospora lactis, odolnější je již rod Rhizopus a Mucor. Velmi odolné jsou plísně rodů Penicillium, Aspergillus a Alternaria, snášející vysokou koncentraci soli. Solené margaríny obsahují vždy méně mikroorganizmů a jsou trvanlivější. 

Vliv konzervačních prostředků

Konzervační prostředky jsou málo rozpustné. Přidávají se do emulze ve stavu krystalickém, jejich účinnost se snižuje. Kyselina benzoová a etylester kyseliny parahydroxybenzoové se rozpouštějí při 50 °C v tucích a jejich sodné soli ve vodě nebo v mléce. Konzervačním prostředkem se trvanlivost margarínu prodlužuje.

122

12.3.5 Mikroorganizmy v margarínu a mikrobiální vady margarínu Studiem mikroflóry margarínu se zabýval Jacobsen, který uvádí v 1 g 100 000 až 18 000 000 mikroorganizmů. Mezi mikroorganizmy převládaly bakterie rodu Micrococcus, kvasinky rodu Torulopsis a plísně. Podle většiny autorů bývá kontaminace margarínu způsobena hlavně vnějšími provozními podmínkami, surovinami používanými při výrobě a obalovým materiálem. Nejvíce byly zastoupeny sporulující bacily a bakterie rodu Micrococcus. Většina izolovaných bakterií (asi 55 %) měla proteolytické vlastnosti, kdežto lipolytické bakterie byly zjištěny pouze asi u 3 %. Plísně i kvasinky byly nalezeny v menším množství než bakterie. Z plísní bývá v margarínu zastoupen hlavně rod Penicillium a Aspergillus, jejichž lipolytické enzymy mohou za příznivých podmínek způsobit rychlé žluknutí. Při kažení margarínu dochází k lojovatění, zvyšování čísla kyselosti, tvorbě ketonů a aldehydů. Jako příčiny těchto závad lze označit fyzikální činitele (světlo, teplo, vzduch), účinek mikroorganizmů a katalytické působení stop těžkých kovů, hlavně mědi, železa, zinku a manganu. Při studiu margarínu vyrobeného z rostlinných olejů dochízí ke žluknutí doprovázeném nepříjemným zápachem. Nepříjemný zápach ve žluklém kokosovém oleji způsobují mikroorganizmy. Již malé množství vody (0,2 až 0,5 %) v oleji umožňovalo jejich růst. Jako hlavní původce žluknutí margarínu bývají označovány druhy rodů Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Phoma a Mucor. Oospora lactis štěpí tuk a je vážným škůdcem másla, není při žluknutí margarínu tak nebezpečná. Protože biochemické působení různých mikroorganizmů může být velmi rozdílné, není důkazem žluknutí pouhá kyselost. Některé tuky mají nízký obsah volných kyselin a jsou silně žluklé, jiné mají vysoký obsah volných kyselin a žluklé nejsou. Kromě zmíněných druhů plísní mohou být původcem žluknutí některé kvasinky a bakterie, např. Pseudomonas fluorescens, Proteus vulgaris, Escherichia coli, Micrococcus luteus a Sarcina lutea. Krvavě rudé až oranžové skvrny na margarínu jsou způsobené bakteriemi Serratia marcescens. Tato vada bývá také často doprovázena žluknutím. Oospora lactis vytváří mramorový vzhled margarínu a proniká do hloubky až 2 cm. Za největší škůdce margarínu lze považovat plísně rodu Penicillium a Aspergillus. Mýdlovitou chuť margarínu způsobují pouze křísovité kvasinky nebo kvasinky spolu s bakteriemi rodu Leuconostoc. Vada vzniká při 20 °C za 3 až 8 dní. Ostrou mýdlovitou chuť margarínu doprovázenou vysokým obsahem volných kyselin způsobují některé kvasinky a bakterie štěpící tuk. Protože pH margarínu se pohybuje v rozmezí 4,5 až 5,0, nenacházejí proteolytické bakterie v tomto prostředí příznivé podmínky pro svůj růst, a vady vyvolané těmito bakteriemi jsou proto dosti vzácné. Rozvoj proteolytických bakterií v margarínu může být ve spojitosti s kvasinkami, které rozkládají kyselinu mléčnou a jiné organické kyseliny. Snižováním kyselosti margarínu vznikají příznivé podmínky pro růst proteolytických bakterií, které pak mohou způsobit různé chuťové vady vyvolané rozkladem bílkovin.

12.3.6 Opatření vedoucí k omezení mikrobiálních vad margarínu Jednou z hlavních zásad při výrobě margarínu musí být výběr dobré, mikrobiologicky nezávadné suroviny. Též se musí zabránit sekundární kontaminaci. Dalším důležitým požadavkem je vytvořit dobrou emulzi, která omezuje rozvoj mikroorganizmů. Stejně jako u másla, bylo i při výrobě margarínu s úspěchem použito mikrobiálních kultur, které zvýšily jeho jakost i trvanlivost, např. směsné kultury obsahující kvasinky bez proteolytické aktivity spolu s bakteriemi mléčného kvašení. Margarín připravený za použití těchto kultur byl dobré jakosti a udržel si čerstvou chuť několik týdnů.

123

K omezení rozvoje mikroorganizmů v margarínu bylo použito i různých chemických látek, např. kyseliny benzoová, salicylová a boritá v množstvích od 0,2 do 1 g na 1 kg margarínu. Po skladovací době 1 až 5 měsíců při 6 °C bylo zjištěno, že při nižších koncentracích se plísně rozmnožovaly již za 1 měsíc, při koncentracích vyšších až po dvou měsících.

Shrnutí Na surovinách pro tukařský průmysl, na semenech olejnin, se vyskytuje různorodá epifytní mikroflóra. Na semenech najdeme zvláště plísně (Mucor, Rhizopus, Aspergillus, Penicillium a Alternaria), bakterie a kvasinky. Hlavně plísně a bakterie produkující lipázy jsou škůdci semen a plodů. Rafinací, ztužováním a dalšími úpravami olejů dochází výraznému snížení počtu přítomné mikroflóry, takže zdroji mikroorganizmů v margarínech, ve kterých ztužené tuky a oleje fungují jako základní suroviny, jsou hlavně voda, zákysové kultury, mléko, škrob, emulgátory, obalové materiály a hygiena provozu. Na růst mikroorganizmů v margarínu pak působí spousta vlivů jako je např. rozdělení kapének, vliv teploty, vliv vzduchu, vliv soli a konzervačních prostředků. V margarínu se pak můžeme hlavně setkat s bakteriemi rodu Micrococcus, kvasinkami rodu Torulopsis a plísněmi Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Phoma a Mucor. Kontrolní otázky 1. Jaké jsou nejčastější zdroje mikroorganizmů v margarínech? 2. Jaké mikrobiální vady margarínu znáte? Popište konkrétní projevy kontaminací. 3. Jakými vlivy mohou být inhibovány bakterie, kvasinky a plísně v margarínech? 4. Jaké konkrétní kultury přidáváme při výrobě margarínů ve vodné fázi?

124

13 Mikrobiologie kosmetických přípravků Studijní cíle: Seznámit studenty s problematikou výskytu mikroorganizmů v kosmetických přípravcích. Odůvodnit příčiny jejich výskytu (zdroje) a poukázat na způsoby minimalizace kontaminací a bránění kažení kosmetických přípravků. Klíčová slova: kosmetické přípravky, emulze, konzervační prostředky, Penicillium, Aspergillus, Pseudomonas Potřebný čas: 2 hodiny

13.1 Úvod do problematiky mikrobiologie kosmetických přípravků Mnohé kosmetické přípravky, zvláště pleťové krémy, pleťová mléka, pudry, zásypy, zubní pasty, rtěnky a pleťové masky vyžadují mikrobiologickou kontrolu, která má včas upozornit na nedostatky výrobků, mnohdy velmi závažného rázu. Snahou výrobce je, aby všechny kosmetické přípravky pokud možno neobsahovaly nežádoucí mikroorganizmy. Množství mikroorganizmů, ať již bakterií, kvasinek nebo plísní spolu s jejich druhovým zastoupením je ukazatelem toho, jaká péče byla z hlediska hygienického věnována výrobě těchto přípravků. Podmínky pro růst mikroorganizmů v kosmetických přípravcích nebývají zvlášť příznivé, ale i tak mohou některé výrobky obsahovat i 10 000 až milióny mikroorganizmů v 1 g. 13.1.1 Pleťové krémy a pleťová mléka Krémem se rozumí polotuhá emulze, která může být typu olej ve vodě nebo voda v oleji. Pleťové krémy se rozdělují na tři skupiny: 1. Suché krémy jsou emulze typu olej ve vodě s vysokým obsahem vody. Pokožka, na kterou se nanesou, nemá mastný vzhled. 2. Mastné krémy mají nízký obsah vody a jsou obvykle emulzí typu voda v oleji. 3. Krémy polomastné mohou být emulze obojího typu. Jako suroviny při výrobě krémů se používá tuků, mastných kyselin, uhlovodíků (vazelína, ceresin, parafín), mýdel, emulgátorů, bílkovin, některých sterolů, esterů vyšších mastných kyselin s jednomocnými alkoholy, glycerinu a dalších přísad. Přídavkem vhodného emulgátoru lze získat dokonalou emulzi tekuté až hustě krémové konzistence. Záhřevem tukové násady používané k výrobě krémů spolu s dalšími složkami na teplotu 70 °C, v některých případech na 90 °C, se přítomná mikroflóra zničí jen částečně. Pleťové krémy a pleťová mléka jsou poměrně vhodným prostředím pro rozvoj mnohých škodlivých bakterií, kvasinek a plísní. Plísně rodů Penicillium a Aspergillus se projevují na povrchu krémů jako různě barevné skvrny, nejčastěji zelenavé, žlutavé až hnědočerné, které prostupují i do hlubších vrstev a krém v krátké době znehodnocují. Aby se omezilo mikrobiální kažení krémů, přidávají se různé konzervační prostředky. Jako nejvýhodnější konzervační látky jsou pravděpodobně estery kyseliny p-hydroxybenzoové, které v použité koncentraci nedráždí pokožku a jsou bez zápachu. Nejčastěji se používá metyl-p-hydroxybenzoátu (Nipaginu) nebo propyl-p- hydroxybenzoátu 125

(Nipasolu) v množství podle obsahu tuku v krému. U krémů s obsahem tuku do 10 % se přidává 0,05 až 0,1 % Nipaginu, při obsahu tuku 10 až 20 % se přidává 0,15 % Nipasolu, jehož dávka se může zvýšit až na 0,2 %, převyšuje-li v krému obsah tuku 20 %. Při konzervování se postupuje tak, že se předepsané množství těchto esterů rozpustí ve vodě nebo tuku a přidá se k celé násadě. Při mikrobiologickém vyšetřování pleťových krémů, stejně tak jako dalších kosmetických přípravků, zjišťuje-li se celkový počet mikrobů, používá se zpravidla masopeptonového agaru; při zjišťování bakterií skupiny coli-aerogenes Endova agaru nebo agaru s trypaflavinem a bromtymolovou modří. Hemolytické mikroby se zjišťují na krevním agaru a kvasinky spolu s plísněmi na sladinkovém agaru. U pleťových krémů a pleťových mlék podřadné jakosti bývá celkový počet mikrobů v 1 g až 10 000, kvasinek 1 000 a plísní 500 i více. V některých případech byla zjištěna i přítomnost Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa a Pseudomonas fluorescens. Výskyt patogenních mikroorganizmů v těchto výrobcích je vzácný, vyskytne-li se však, musí se výrobek pozastavit, popřípadě se zastaví celá výroba.

13.1.2 Pudry a zásypy Pudry lze rozdělit na práškové, pevné a tekuté. Hlavními surovinami práškových pudrů je mastek, kaolin, škrob, uhličitan vápenatý, uhličitan hořečnatý, běloba zinková, stearát hořečnatý a další. K barvení pudrů se používá barviv přírodních (okru, umbry, sieny) nebo umělých, nerozpustných ve vodě a po zdravotní stránce nezávadných. Pudry tekuté obsahují vedle pevných práškových látek (kaolinu, mastku a dalších) ještě vodu, etanol, popřípadě glycerin a malé množství látek tvořících slizy (tragant nebo tylosa), aby pudr lépe držel na pleti. Zásypy obsahují v podstatě stejné suroviny jako pleťové pudry, hlavní složkou je však mastek. Jako antiseptika se používá kyseliny borité v dávce nejvýše 3 %. Suroviny používané k výrobě pudrů nebo zásypů bývají často zdrojem mikroorganizmů. Kromě bakterií jsou v zásypech a pudrech přítomny kvasinky a plísně, které i v nevhodném prostředí mohou být přítomny až v množství několika desítek tisíc v 1 g. U zásypů a pudrů podřadné jakosti dosahuje celkový počet mikrobů přes 10 000 v 1 g. Výskyt kvasinek v množství přes 500 a plísní přes 100 v 1 g je ukazatelem závad ve výrobě. Zvýšenou pozornost je třeba věnovat bakteriím hnilobným, které jsou někdy v zásypech přítomny. Bakterie skupiny coli-aerogenes a mikroorganizmy patogenní se nesmějí v pleťových pudrech a zásypech vyskytovat. Zvláště zásypům je třeba z mikrobiologického hlediska věnovat zvýšenou pozornost.

13.1.3 Zubní pasty Zubní pasty obsahují pevné a tekuté látky s přísadou pojiva, pěnidla, barvy, chuťových a aromatizujících látek a konzervačního prostředku. Z pevných látek bývá přítomen uhličitan vápenatý, koloidní kaolin, fosforečnan vápenatý a další. Z tekutých látek se kromě vody přidává glycerin. Jako pojidla se používá pektinu, tragantu nebo tylózy. Z látek aromatizujících se používá éterických olejů, nejčastěji anýzových, skořicových a mentolu. Z chuťových látek to bývá vanilin, cukr a další. Protože zubní pasty jsou svým složením poměrně příznivé pro růst mikroorganizmů, přidává se konzervační činidlo. Metyl-p-hydroxybenzoát (Nipagin M) se přidává v množství 0,1 až 0,2 %. Větší množství mikroorganizmů v zubní pastě svědčí o závažných nedostatcích ve výrobě. Nejčastěji bývají přítomny bakterie, méně již kvasinky a plísně. V zubních pastách zjistili někteří autoři bakterie skupiny coli-aerogenes, druhy rodů Proteus a Pseudomonas, nejčastěji druh Ps. fluorescens, a ve vzácných případech i -hemolytické bakterie. 126

13.1.4 Rtěnky Suroviny, kterých se používá při výrobě rtěnek, musí být jakostní a bez zápachu. Již malé závady v surovině mohou způsobit podráždění rtů. Základ rtěnky tvoří tuková a vosková směs různých látek spolu se zdravotně nezávadnou barvou. Nejčastěji se používá barev eozínových, rozpustných ve vodě, různých barev rozpustných v tuku nebo speciálních pigmentů. Dnešní kosmetika přešla k výrobě emulgovaných rtěnek; tuková fáze dodává rtěnce tuhost a vodní fáze barvu. Při mikrobiologickém vyšetřování rtěnek nebyly zpravidla zjištěny žádné podstatné závady; to ovšem neznamená, že by se jejich mikrobiologické kontrole měla věnovat menší pozornost. Vyskytne-li se nějaká mikroflóra na rtěnkách, jde převážně o povrchovou kontaminaci plísněmi. 13.1.5 Kolínské vody a parfémy Hlavní surovinou těchto přípravků jsou různé vonné látky v etanolu. Vlivem poměrně vysoké koncentrace etanolu jsou tyto výrobky po mikrobiologické stránce nezávadné. Význam mikrobiologie kosmetických přípravků záleží převážně v kontrole, jíž je třeba věnovat velkou pozornost. I když u většiny kosmetických přípravků bývá přítomna pouze neškodná mikroflóra, mohou se někdy vyskytnout i vážné nedostatky, na které má mikrobiologická kontrola včas upozornit.

13.2 Zdroje mikrobiální kontaminace v kosmetických přípravcích Zdrojem kontaminace může být mikroflóra obalového materiálu, vody a vzduchu.

13.2.1 Obaly V dřevěných obalech se vyskytují často druhy rodů Penicillium, Aspergillus, Trichoderma, Sporotrichum, Torula, Oospora aj. Z bakterií bývají nejčastěji přítomny Enterobacter aerogenes, Pseudomonas fluorescens, Alcaligenes viscosus, Bacillus subtilis. Dřevěné obaly velmi trpí skladováním, hlavně za vlhka, kde se stávají vhodnou půdou pro rozvoj mikrobů. Surovinou k výrobě papírových lepenek je dřevo a sběrový papír. Dřevo je z hlediska mikrobiologického výhodnější než sběrový papír. V lepenkách bývají zjišťovány sporotvorné mikroorganizmy, různé plísně rodů Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, z bakterií Escherichia coli, Escherichia freundii, Enterobacter aerogenes, různé streptokoky, enterokoky, mikrokoky, jakož i kvasinky. Papírové obaly impregnované parafínem mohou též obsahovat mikroorganizmy. Rostou hlavně při vyšším obsahu vody a při teplotě blízké 20 °C. Rozvojem a činností přítomných mikroorganizmů vznikají pachové látky, které mohou ovlivnit jakost potravin. Aby se rozvoj mikroorganizmů na obalovém materiálu omezil, používá se různých dezinfekčních prostředků, např. derivátu benzenu. U nás byly zavedeny baktericidní a fungicidní prostředky. Z uvedeného nástinu je patrno, že je třeba věnovat velkou péči mikrobiologické jakosti obalů, jichž v mlékárenském i tukařském průmyslu používáme. Musíme učinit vše, aby obal nebyl zdrojem kontaminace potravin. Na obalech byla zjištěma přítomnost E. coli, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, častý výskyt bakterií rodu Proteus, dále Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis a Bacillus megatherium. Téměř vždy bývají přítomny plísně rodů Penicillium, Aspergillus a Mucor. Znečištění, zejména různými skupinami mikroorganizmů proteolytických a lipolytických, 127

může vyvolat četné závady výrobků. Za určitých podmínek způsobí mikrobiálně vadný obal plesnivění, hořknutí a zeslizovatění povrchových vrstev tvarohu. Máslo, zejména při delším uchovávání v sudech vyložených vadným pergamenem, může plesnivět, žluknout a hořknout. U měkkých sýrů je vadný pergamenový papír často původcem povrchového plesnivění. Bakteriální druhy se na obalech začnou množit, stoupne-li obsah vlhkosti uchovávaného produktu na 25 %. Některé druhy mikroorganizmů, například bakterie rodů Pseudomonas, Bacillus a některé plísně, mohou při dostatku vlhkosti růst i za nízkých teplot. Velmi přísně je třeba posuzovat v obalovém materiálu výskyt sporulujících mikroorganizmů s význačnou lipolytickou a proteolytickou činností.

13.2.2 Voda Při hodnocení mikrobiologické jakosti vody, které se používá v mlékařství, jsou důležité údaje o celkovém množství přítomných mikroorganizmů, zejména však o jejich druhovém zastoupení. Voda bývá kontaminována hlavně povrchovými vrstvami země a vzduchem. Ačkoli není ideálním prostředím pro růst mikroorganizmů, vyskytují se v ní psychrofilní a mezofilní bakterie a v mnohých případech se v ní též rozmnožují. Voda používaná v mlékařství nesmí obsahovat žádné mikroorganizmy patogenní a pokud možno žádné mikroorganizmy technologicky závadné. Musí vyhovovat všem požadavkům kladeným na pitnou vodu, i když se jí používá jako vody užitkové. Infekce vody patogenními mikroby nejčastěji souvisí se znečištěním vod výkaly nemocných lidí nebo bacilonosičů. Ukazatelem znečištění vody výkaly je Escherichia coli, ve vodě se často vyskytují druhy Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas syncyanea, Serratia marcescens, Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Alcaligenes faecalis, Salmonella enteritidis, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, Bacillus megatherium a Bacillus cereus, někdy také viry, bakteriofágy a další. Mnohé bakterie, kvasinky a plísně přecházejí s vodou do mléka a mléčných výrobků, kde bývají původci různých mikrobiálních vad. Při vyšetřování vody se věnuje zvýšená pozornost výskytu enterobakterií z nichž mnohé druhy svojí lipolytickou aktivitou mohou být též původci žluknutí. Z mléčných výrobků bývá máslo kontaminováno vodou bakteriemi Ps. fluorescens, Ps. putrefaciens, Ps. fragi i jinými druhy, nacházejícími ve vodě ještě příznivé podmínky růstu. Též při výrobě sýrů může být voda zdrojem kontaminace sýrů nežádoucími plynotvornými bakteriemi E. coli, E. freundii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae a dalšími. Vodou mohou být zaneseny do mlékařských výrobků dále druhy rodů Achromobacter, Actinomyses, Alcaligenes, Bacillus, Clostridium, Pseudomonas, Flavobacterium, Proteus, Micrococcus, Sarcina, Serratia, Salmonella, Enterococcus a další. Z uvedeného je patrno, že závadná voda může být velmi vážným zdrojem kontaminace mléka a mléčných výrobků. Mikrobiologické jakosti vody používané v potravinářském průmyslu se musí proto vždy věnovat velká pozornost. Pitná voda Podle jednotných analytických metod je pitná voda voda z přírodního zdroje, která vyhovuje zdravotním i technickým požadavkům, a je určena člověku k přímému požití. Je jí třeba též v potravinářství. Důležitým ukazatelem jakosti pitné vody je stav přítomné mikroflóry. Podle našich norem se v pitné vodě zjišťuje celkový počet psychrofilních zárodků při 20 až 22 °C na masopeptonovém agaru. Použitím mikrobiologicky závadné vody mohou vzniknout různá vážná onemocnění, jako je tyf, paratyf, dyzentérie, dětská obrna, infekční žloutenka apod. Indikátorem přítomnosti střevní mikroflóry ve vodě jsou bakterie rodů Escherichia, Enterobacter nebo enterokoky; jsou důkazem

128

toho, že voda byla kontaminována povrchovými splašky nebo výkaly. V pitné vodě dobré jakosti při vyšetřování enterobakterií je ve 100 ml vody nález negativní.

13.2.3 Vzduch Vzduch je nevhodným prostředím pro rozvoj mikroorganizmů. Mikroorganizmy se dostávají do vzduchu s prachem; jejich životnost však není ve vzduchu dlouhá, neboť hynou účinkem slunečních paprsků. Mikroflóra vzduchu v provozních místnostech závisí na čistotě místnosti a provozním ruchu. Fjodorov uvádí, že v místnosti, kde se hodně chodí, je prach zvířený, a tím se podstatně zvyšuje množství mikroorganizmů ve vzduchu. V 1 m3 vzduchu v místnostech bývá zjišťováno 500 až 300 000 bakterií. Bylo potvrzeno, že na množství mikroorganizmů ve vzduchu má vliv též roční doba, a to jak ve volném prostoru, tak v uzavřených provozních místnostech. Podle Chr. Hansena jsou ve vzduchu přítomny Acetobacter aceti, druhy rodů Aspergillus, Penicillium, Mucor, Cladosporium, Rhizopus a Oospora. V mlékařských závodech bývají zjišťovány ve vzduchu různé druhy plísní, sporulující mikroorganizmy, Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, různé druhy rodů Micrococcus, Sarcina, Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus a Pseudomonas. Ovzduší mlékárenských provozoven obsahuje jednak vlastní mikroflóru, která pochází ze zpracované suroviny (výrobků) a mikroflóru, která pochází z vnějšího vzduchu. Bývá kladen důraz na zjištění, zda kontaminace šířená vzduchem pochází z provozovny nebo z vnějšího ovzduší. Důležitý je poměr počtu mikroorganizmů uvnitř místnosti k počtu mikrobů vně závodu. Rovná-li se tento poměr jedné, je mikrobiologické osídlení vnitřního i vnějšího ovzduší stejné. Při stoupající hodnotě uvedeného poměru je hlavní zdroj mikrobiálního znečištění uvnitř provozovny; v takovém případě se musí provozní místnosti dezinfikovat. Mikroflóře vzduchu věnujeme zvlášť velkou pozornost v provozovnách při výrobě másla, margarínu, kondenzovaného slazeného mléka a při výrobě a zrání sýrů s plísní na povrchu. Ke sterilaci ovzduší se používá ultrafialového záření. Nejúčinnější jsou paprsky v rozsahu spektra 250 až270 nm. Při nepřímém záření, kdy lampy ozařují vrchní vrstvy vzduchu, je účinnost při dobrém proudění vzduchu až 90%. Dobré výsledky se uvádějí v souvislosti s aerosolovou dezinfekcí, při níž se dezinfekční prostředek rozprašuje ve formě kapiček velikosti 2 až 60 µ. Při jemnějším rozprašování na kapénky velikosti 5 až 10 µ jsou výsledky nejpříznivější.

Shrnutí Mikrobiální kontaminace kosmetiky způsobuje nežádoucí změny výrobků a představuje zdravotní riziko pro spotřebitele. V kosmetických přípravcích se můžeme setkat s bakteriemi rodu Pseudomonas, Staphylococcus, Clostridium a zástupci čeledi Enterobacteriaceae. Stejně tak se v těchto produktech vyskytují všudypřítomné kvasinky a plísně. Aby se zamezilo rozvoji výše zmíněné mikroflóry, jsou do kosmetiky přidávány v nezbytně nutném množství konzervační látky. Zdrojem kontaminace v kosmetických výrobcích mohou být obaly, voda a vzduch. Kontrolní otázky 1. Jaké mikroorganizmy kontaminují pleťové krémy a mléka? Jak se do těchto výrobků dostávají? Charakterizujte způsob kontaminace.

129

2. Jaké konzervační látky se používají pro potlačení mikrobiální kontaminace v pleťových krémech a mlécích? 3. Jaká média používáme při diagnostice mikrobiální kontaminace pleťových krémů a mlék? Odůvodněte jejich použití resp. volbu konkrétních médií. 4. Jaké skupiny mikroorganizmů najdeme v pudrech a zásypech? Jaké koncentrace mikroorganizmů poukazují na závadu v technologii výroby? 5. Jaké druhy bakterií jsou schopné růst a množit se v zubních pastách? 6. Které skupiny kosmetických přípravků jsou na mikrobiální kontaminace chudé?

130

Seznam literatury ANCÍN-AZPILICUETA, C., GONZÁLEZ-MARCO, A., JIMÉNEZ-MORENO, N. Current knowledge about the presence of amines in wine. Critical Reviews in Food Scuebce and Nutrition, 2008, vol. 48, no. 3, p. 257-275. ANLI, R.E., BAYRAM, M., Biogenic amines in wines. Food Reviews International., 2009, vol. 25, no.1, p. 86-102. ANONYM. NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 2073/2005 ze dne 15. listopadu 2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny [online]. [cit. 5. července 2012]. Dostupné na: ARENA, M.E., MANCA DE NADRA, M.C., 2001. Biogenic amine production by Lactobacillus, Journal of Applied Microbiology, 90, 158-162. ARENA, M.E., MANCA DE NADRA, M.C., 2001. Biogenic amine production by Lactobacillus, Journal of Applied Microbiology, 90, 158-162. BAIXAS-NOGUERAS, S., BOVER-CID, S., VECIANA-NOGUÉS, M.T., VIDAL-CAROU, M.C., Amino acid-decarboxylase activity in bacteria associated with Mediterranean hake spoilage, European Food Research and Technology, 2003, 217:164-167 BOVER-CID, S., HUGAS, M., IZQUIERDO-PULIDO, M., VIDAL-CAROU, M. C., 2001. BUŇKOVÁ, L., BUŇKA, F., HLOBILOVÁ, M., VAŇÁTKOVÁ, Z., NOVÁKOVÁ, D., DRÁB, V., 2009. Tyramine production of technological important strains of Lactobacillus, Lactococcus and Streptococcus, European Food Research and Technology, 229, 533-538. BURDYCHOVÁ, R., KOMPRDA T., 2007. Biogenic amine-forming microbial communities in cheese, FEMS Microbiology Letters, 276, 149-155. BURDYCHOVÁ, R., KOMPRDA, T., Biogenic amine-forming microbial communities in cheese. FEMS Microbiology Letters, 2007, 276(2):149-155. CWIKOVÁ, O., mikrobiologické aspekty tvorby biogenních aminů ve zrajících sýrech, XXXVI, Lefeldovy a Hoklovy dny, Konference o hygieně a technologii potravin, sborník, 44-47, 2007. FADDA, S., VIGNOLO, G., OLIVER, G., Tyramine degradation and tyramine/histamine production by lactic acid bacteria and Kocuria strains. Biotechnology Letters 23:2015-2019, 2001. FINK-GREMMELS, J., Mycotoxins:their implications for human and animal health, Veterinary Quaterly, 21, 1999:115-120. GARDINI, F., ZACCARELLI, A., BELLETI, N., FAUSTINI, F., CAVAZZA, A., MARTUSCELLI, M., MASTROCOLA, D., SUZZI, G., 2005. Factors influencing biogenic amine production by a strain of Oenococcus oeni in a model system, Food Control, 16, 609 616. HALÁSZ, A., BARÁTH, A., SIMON-SAKARDI, L., HOLZAPFEL, W., 1994. Biogenic amines and their production by microorganizms in food, Trends in Food Science and Technology, 5, 42-49. HASSAÏNE, O., ZADI-KARAM, H., KARAM, N., 2009. Evaluation of biogenic amines HOĎÁK, K., Fyziologie a biochemie bakterií, Univerzita J.E. Purkyně, Brno, 1979, str. 152 HUSSEIN H.S., BRASEL, J.M., Toxicity, metabolism, and impact of mycotoxins on humans and animals. Toxicology, 2001. 101-134 JEŽKOVÁ, A., DOHNAL, V., The development of screening method for monitoring of biogenic amines in decarboxylation medium, ´konference o technologii potravin, Brno, sborník, 2007. JUNEJA, V. K., SOFOS, J. N., 2010. Pathogens and toxins in foods: challenges and interventions, ASM Press, 248-252, ISBN 155581459X.

131

KALAČ, P., KŘÍŽEK, M., A review of biogenic amines and polyamines in beer. Journal of the Institute of Brewing, 2003, 109(2):123-128. KAROVIČOVÁ, J., KOHAJDOVÁ, Z., 2005. Biogenic amines in food, Chemical Papers 59(1), 70-79. KOHAJDOVÁ, Z., KAROVIČOVÁ, J., GREIF, G., 2008. Biogénne amíny v potravinách. Potravinárstvo KOMPRDA, T., BURDYCHOVÁ, R., DOHNAL, O., CWIKOVÁ, O., SLÁDKOVÁ, P, DVOŘÁČKOVÁ, H., Tyramine production in Dutch-type semi-hard cheese from twoo different producers. Food Microbiology, 2008, 25(2):219-227 KŘÍŽEK, M., KALAČ, P., 1998. Biogenní aminy v potravinách a jejich role ve výživě, Czech KŘÍŽEK, M., KALAČ, P., Biogenní aminy v potravinách a jejich role ve výživě, Czech Journal of Food Science, 16(4):151-159, 1998. LANDETE, J.M., DE LAS RIVAS, B., MARCOBAL, B., MUÑOZ, R., 2007. Molecular methods for the detection of biogenic amine-producing bacteria in foods, International Journal of Food Microbiology, 117, 258-269. LINARES, D.M., MARTÍN, M., LADERO, V., AlVAREZ, M. A., FERNÁNDEZ, M., 2011. LORENCOVÁ, E., BUŇKOVÁ, L., MATOULKOVÁ, D., DRÁB, V., PLEVA, P, KUBÁŇ, LORET, S., DELOYER, P., DANDRIFOSSE, G., 2005. Levels of biogenic amines as a measure of the duality of the beer fermentation process Data from Belgian samples, Food Chemistry, 89, 519-525. MALÍŘ F. A OSTRÝ, V. a kolektiv autorů (2003): Vláknité mikromycety (plísně), mykotoxiny a zdraví člověka. 1. vydání. Brno, 349s ISBN 80-7013-395-3 MALÍŘ, F., ROUBAL, T., SEVER, J., ŘIČAŘOVÁ, B., ROLEČKOVÁ, E., MAREŠOVÁ, H. (2005), Některeé toxikologicky významné mykotoxiny a možné zdravotní riziko, sborník přednášek z XVI celostátního semináře o separační chemii a analýze toxických látek, Lázně Bohdaneč, roč. 16, číslo 1 MCSWEENEY, P., 2004. Biochemistry of cheese ripening, International Journal of Dairy Technology, 57, 127-144. MORENO-ARRIBAS, M.V. and LONVAUD-FUNEL, A., 2001. Purification and characterization of tyrosine decarboxylase of Lactobacillus brevis, FEMS Microbiology MURRAY, K.R., GRANNER, K.D., MAYES, A.P., RODWELL, W.V., Harperova biochemie. 23. vydání (4.české vydání) 2002. ISBN 80-7319-013-3 NAILA, A., FLINT, S., FLETCHER, G., BREMER, P., MEERDINK, G., Control of biogenic amines in food-existing and emerging approaches. Journal of food Science, 2010, 75(7):139-150. OSTRÝ, V., Vláknité mikroskopické houby (plísně), mykotoxiny a zdraví člověka. SZÚ, Praha, 1998:20s ÖZOGUL, F., ÖZOGUL, Y., 2007. The ability of biogenic amines and ammonia production by single bacterial cultures, European Food Research and Technology, 225, 385-394. POLSTER, M., Toxigenní plísně a mykotoxiny v potravinách, 1. vydání Brno, 1971, 84s výrobní číslo 671/71 SAAID, M., SAAD, B., HASHIM, N.H., ALI, A.S., SALEH, M.I., Determination of biogenic amines in selected Malysian food, Food Chemistry, 2009, 113:1356-1362. SHALABY, R.A., Significance of biogenic amines to food safety and human health, Food Research International, 1996, 29:675-690. SCHNELLER, R., GOOD, P., JENNY, M., 1997. Influence of pasteurised milk, raw milk and different ripening cultures on biogenic amine concentrations in semi-soft cheeses during ripening, Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A, 204, 265-272. SILLA-SANTOS, S.M.H., 1996. Biogenic amines: their importace in foods. Food Microbiology, 29, 213231.

132

SMĚLÁ, D., PECHOVÁ, P., KOMPRDA, T., KLEJDUS, B., KUBÁŇ, V., Chromatografické stanovení biogenních aminů v trvanlivých salámech během fermentace a skladování, Chemické listy, 98:432-437, 2004. STADLER, R.H., LINENBACK, D.R., 2009. Process-induced food toxicans: occurence, formation, mitigation and health risks, John Wiley and sons, ISBN 978-0-470-07475-6. STANDAROVÁ, E., BORKOVCOVÁ, I., VORLOVÁ, L., Obsah biogenních aminů v sýrech z české obchodní sítě. Veterinářství 58:735-739, 2008. STANDIK, J., DOLATOWSKI, Z.J., Biogenic amines in meat and fermented meat products. Acta Scientiarum Polonorum. Technologia Alimentaria, 2010, 9(3):251-263. SVOBODA, J., Organická chemie I, 1. vydání, VŠCHT v praze, 2005, 292-296 TAKADASHI, H., KIMURA, B., YOSHIKAWA, M., FUJII, T., 2003. Cloning and sequencing of the histidine decarboxylase genes of gram-negative, histamine producing bacteria and their application in detection and identification of these organizms in fish, Applied and Environmental Microbiology, 69, 25682578. TEN BRINK, B., DAMNIK, C., JOOSTEN, H.M.L.J., HUIST IN´T VELD, J.H.J., 1990. Occurrence and formation of biologically active amines in fous, International Journal of Food Microbiology, 11, 73–84 TETI, D., VISALLI, M., MCNAIR, H., Analysis of polyamines as markers of (patho)physiological conditions, journal of chromatography b, 2002, 781:107-149 VELÍŠEK, J., Chemie potravin 3., 2. vydání, Tábor OSSIS, 2002, 124s, ISBN 80-86659-02-3. VON BEUTLING, D., 1993. Studies on the formation of tyramine by microbes with food hygienic relevance, Archiv für Lebensmittel Hygiene, 44, 83-87.

133

Seznam obrázků Obr. 1 Fylogenetický strom vybraných zástupců BMK získaný na základě podobnosti ribozomálních proteinů 16s rRNA. (Hutkins, 2006) 32 Obr. 2 Metabolizmus galaktózy u BMK (Adams a Moss, 2008)

35

Obr. 3 Heterofermentativní mléčné kvašení, fosfoketolázová dráha (x)

37

Obr. 4 Chemická struktura vybraných biogenních aminů (Velíšek, 2009; Anli a Bayram, 2009)

85

Obr. 5 Obecná rovnice vzniku biogenních aminů dekarboxylací (Velíšek, 2009)

85

Obr. 6 Vznik biogenních aminů (upraveno podle Ancín-Azpilicueta et al., 2008)

86

134

Seznam tabulek Tab. 1 Mikroorganizmy užívané jako startérové kultury ................................................................................ 28 Tab. 2 Rozdílné vlastnosti BMK (upraveno podle Salmien et al., 2004 a Hutkins, 2006) ............................. 33 Tab. 3 Fermentace monosacharidů některými startérovými kulturami ........................................................... 36 Tab. 4 Rozdělení rodu Lactobacillus podle způsobu fermentace .................................................................... 44 Tab. 5 Příklady konkrétních probiotických druhů bakterií .............................................................................. 56 Tab. 5 Druhy bifidobakterií a zdroje, ze kterých mohou být izolovány .......................................................... 58 Tab. 6 Vlivy biofilmů (podle CharacklishMarshall, 1990) ......................................................................... 61 Tab. 7 Složky hostitelského filmu ovlivňující bakteriální přichycení k biomateriálům (upraveno dle Mittelman 1996) .............................................................................................................................................. 63 Tab. 8 Složení biofilmové matrice (ex Sutherland 2001b) .............................................................................. 68 Tab. 10 Antimikrobiální techniky využívané na ochranu potravin a dosažení požadované doby skladování (GOULD 1986, 1996) ...................................................................................................................................... 94 Tab. 11 Potraviny a sledované mikroorganizmy ........................................................................................... 112

135

Seznam rovnic Rov. 1 .............................................................................................................................................................. 22 Rov. 2 .............................................................................................................................................................. 22

136