PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM
Biológiai Doktori Iskola Genetika program
Természetes és mesterséges agrobaktérium rezisztencia vizsgálata szőlőben
PhD értekezés
Galambos Anikó Témavezető: Dr. Putnoky Péter egyetemi tanár
Témavezető aláírása
Iskolavezető aláírása
PÉCS, 2013.
2 TARTALOMJEGYZÉK FELHASZNÁLT RÖVIDÍTÉSEK
4
1. BEVEZETÉS
6
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS
7
2.1. Az Agrobacterium, mint kórokozó 2.1.1. A fertőzési folyamat molekuláris biológiája 2.1.2. Ti-plazmid alapú növényi transzformációs vektorok 2.1.3. Növényregeneráció 2.2. A szőlő nemzetség 2.3. Védekezés az Agrobacterium fertőzés ellen 2.4. Természetes rezisztencia nemesítés molekuláris markerekkel 2.4.1. Genetikai térképezés DNS markerekkel 2.4.1.1. RAPD, SCAR és SSR markerek 2.4.1.2. DNS markereken alapuló szelekció és klónozás 2.5. Mesterséges rezisztencia kialakítása biotechnológiai módszerekkel 2.5.1. A géncsendesítés 2.5.2. siRNS alapú géncsendesítés
7 9 12 13 15 15 16 17 18 19 20 21 23
3. CÉLKITŰZÉSEK
25
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
26
4.1. Alkalmazott baktérium törzsek és plazmidok 4.2. A baktériumok növesztése, tárolása 4.3. A baktériumok keresztezése 4.4. Összes DNS izolálás 4.5. Plazmid DNS tisztítás 4.6. Agaróz gélelektroforézis és DNS-fragment izolálás 4.7. In vitro DNS-technikák 4.8. Baktérium transzformáció 4.9. DNS izolálás szőlőből 4.10. RAPD és specifikus PCR reakciók 4.11. DNS-szekvencia meghatározás és elemzés 4.12. Primertervezés 4.13. Southern-hibridizáció 4.14. RNS izolálás szőlőből 4.15. cDNS szintézis 4.16. qPCR reakciók 4.17. A szőlő növények fenntartása 4.18. Dohány transzformáció 4.19. Mesterséges agrobaktérium fertőzési tesztek
26 27 27 28 28 29 29 30 31 31 33 34 34 35 35 36 36 37 38
3 5. EREDMÉNYEK 5.1. EGY TERMÉSZETES AGROBAKTÉRIUM REZISZTENCIA GENETIKAI TÉRKÉPEZÉSE 5.1.1. A térképező populáció jellemzése agrobaktérium fertőzéssel 5.1.2. Agrobaktérium rezisztenciával kapcsolt RAPD markerek jellemzése 5.1.2.1. Az OPU07.1 RAPD fragment jellemzése 5.1.2.2. Az OPX05.1 RAPD fragment jellemzése
39
39 39 40 41 44
5.2. MESTERSÉGES AGROBAKTÉRIUM REZISZTENCIA KIALAKÍTÁSA 47 5.2.1. A pJP17 konstrukció hatásának ellenőrzése transzgenikus dohányokon 47 5.2.2. pJP17 transzgenikus szőlővonalak előállítása és előzetes jellemzése 49 5.2.3. A legtöbb transzgenikus vonal egy példányban hordozza a géncsendesítő konstrukciót 51 5.2.4. A géncsendesítő konstrukciók expressziója a transzgenikus vonalakban 52 5.2.5. Az A. vitis AT1 törzs iaaM gén szekvenciájának meghatározása 53 6. EREDMÉNYEK MEGVITATÁSA
56
6.1. Agrobaktérium rezisztenciához kapcsolt SCAR markerek kialakítása
56
6.2. Mesterséges agrobaktérium rezisztencia kialakítása géncsendesítéssel
58
7. ÖSSZEFOGLALÁS
63
8. SUMMARY
64
9. IRODALMI HIVATKOZÁSOK
65
10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
78
11. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK
79
4 FELHASZNÁLT RÖVIDÍTÉSEK Amp
ampicillin
ampicillin
AFLP
amplified fragment lenght polymorphism
amplifikált fragmenthossz polimorfizmus
bp
base pair
bázispár
Cm
chloramphenicol
kloramfenikol
Cla
claforan
claforán
CFU
colony forming unit
kolóniaképző egység
CTAB
hexadecyltrimethylammonium-bromide
hexadeciltrimetilammóniumbromid
DMSO
dimethyl-sulfoxide
dimetil-szulfoxid
DNS
deoxyribonucleic acid
dezoxi-ribonukleinsav
EDTA
ethylene-diamine-tetraacetic acid
etilén-diamin-tetraecetsav
H+
hormontartalmú
IPTG
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
izopropil β-D-1thiogalaktopiranozid
kb
kilobase pair
kilobázispár
Km
kanamycin
kanamicin
MAS
marker assisted selection
markeren alapuló szelekció
miRNS
microRNA
mikroRNS
Mb
megabase pair
megabázis
MS
Murashige és Skoog
NAA
naftil acetic acid
naftil-ecetsav
PIPES
piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)
piperazin-1,4-bisz(2etánszulfoxid)
PCR
polymerase chain reaction
polimeráz láncreakció
PTGS
posttranscriptional gene silencing
poszttranszkripciós géncsendesítés
RAPD
random amplified polymorphic DNA
véletlenszerűen amplifikált polimorf DNS
RFLP
restriction fragment lenght polymorphism
restrikciós fragmenthossz polimorfizmus
Rif
rifampicin
rifampicin
RISC
RNA induced silencing complex
RNS indukálta csendesítő komplex
RNS
ribonucleic acid
ribonukleinsav
5 SCAR
sequence characterized amplified region
ismert szekvenciájú amplifikált régió
SDS
sodium-dodecyl-sulphate
nátrium-dodecil-szulfát
siRNS
small interfering RNA
kis interferáló RNS
Spc
spectinomycin
spectinomicin
SSR
simple sequence repeat
egyszerű szekvencia ismétlődések
Tc
tetracyclin
tetraciklin
TDZ
thidiazuron
tidiazuron
T-DNS
transzfer DNS
TGS
transcriptional gene silencing
transzkripciós géncsendesítés
Ti
tumor inducing
tumor indukáló
Tris
tris(hydroxymethyl)-aminomethan
tris-(hidroxi-metil)-aminometán
Xgal
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-
5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-d-
β-d-galactopyranoside
galaktopiranozid
6 1. BEVEZETÉS A növények agrobaktériumok okozta tumoros elváltozása, a golyva, régóta ismert betegség. Hamar erőteljesen vizsgált témává vált, mivel a kutatók hasonlóságot véltek felfedezni az emberi rák és a baktérium által létrehozott növényi sejtburjánzás között. Kiderült, hogy a fertőzési folyamat során a baktérium (egy prokarióta) képes saját géneket a
növényi
(eukarióta)
sejtmagba
juttatni
(„interkingdom”
génátvitel),
ezáltal
transzformálni, genetikailag átprogramozni a növényi sejteket. Ennek célja a patogén baktérium
fennmaradásához
szükséges
körülmények
megteremtése.
A folyamat
molekuláris alapjainak megismerése az agrobaktériumok által természetes úton megvalósított génátvitelre alapozott növényi transzformációs rendszer kifejlesztéséhez vezetett, amely alkalmas különböző élőlényekből származó gének magasabbrendű, elsősorban kétszikű, növényi szervezetekbe történő bevitelére, ezáltal bizonyos tulajdonságok javítására, funkcióhiány pótlásra, vagy éppen új funkció kialakítására. Az agrobaktérium fertőzéssel szemben kémiai védekezésre nincs lehetőség. Viszont ma már léteznek különböző biológiai és biotechnológiai megoldások, bár teljeskörű védelmet biztosító módszerek még nincsenek. Ismertek a betegséggel szemben ellenálló, természetes rezisztenciával rendelkező növények, sajnos azonban ezekből sem a természetes rezisztencia gén(ek), sem pedig a rezisztencia növényélettani háttere nem ismert. Ezek megismerésével mind az alapkutatásban, mind pedig a gyakorlati vonatkozásban hasznos ismeretekre tehetünk szert a betegséggel szembeni védekezés terén, mivel a fertőzési folyamatnak és az ezzel szembeni növényi védekező mechanizmusnak a pontosabb megismerése lehetőséget adhat agrobaktérium rezisztens növények létrehozására. A biotechnológia fejlődésének köszönhetően ma már létrehozhatók olyan genetikailag módosított növények is, melyek csak a bevitt idegen gén (pl. csak az adott rezisztencia gén) tekintetében térnek el a kiindulási fajtától. Ez különösen fontos szempont olyan növények esetében, mint a vegetatív módon szaporított szőlő, melyek termesztésében a hagyományőrzésnek igen nagy jelentősége van. A gyakorlatban az agrobaktérium rezisztencia kialakításának egyik módja lehet olyan transzgenikus szőlőnövények létrehozása,
melyekben
célzottan
a
patogén
baktérium
által
bejuttatott
gének
megnyilvánulása gátolt. Ezen a területen végzett kutatómunkából írtam az itt bemutatott doktori dolgozatomat.
7 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. Az Agrobacterium, mint kórokozó Az agrobaktériumos golyvásodás földünkön mindenhol előforduló betegség. Széles gazdanövénykörének következtében világszerte problémát okoz. A fertőzött növények gyengén fejlődnek, a talaj feletti részeken karfiolszerű, egyenetlen felületű tumorok képződnek, melyek gátolják a tápanyagszállítást, ami súlyos terméskieséshez vezethet (Folk and Glits, 2000). Az Agrobacterium nemzetség képviselői a Rhizobiaceae családba tartozó, Gramnegatív, pálcika alakú, 1-4 flagellummal rendelkező talajbaktériumok. A szőlő golyvásodásában feltehetően szerepet játszó baktériumot Fridiano Cavara izolálta először 1897-ben (Bacillus ampelosporae). 10 évvel ennek a baktériumnak a felfedezése után E. Smith és C.O. Townsend írták le először a tumoros növényi megbetegedésért felelős Bacterium tumefaciens baktériumot, mely mai nevét (Agrobacterium tumefaciens) többszöri változtatás után 1942-ben kapta (Allen and Holding, 1974; Burr et al., 1998). Kezdetben az agrobaktériumokat tumorképződést indukáló tulajdonságaik alapján csoportosították. Nem patogén biotípusa az A. radiobacter faj, patogén fajai pedig az A. tumefaciens, az A. vitis, az A. rhizogenes és az A. rubi fajok, melyek rendelkeznek azzal a képességgel, hogy a növényi genomba géneket integráljanak. Az A. rhizogenes főleg almatermésű gyümölcsfajokon okoz szőrös gyökerűséget („hairy root”), az A. rubi a Rubus fajokat betegíti. Az A. tumefaciens számos növényfajon indukál tumorképződést (gyökérgolyva, „crown gall”), (Allen and Holding, 1974), az A. vitis pedig a szőlőn idéz elő vesszőgolyvát (Ophel and Kerr, 1990). A későbbiekben az agrobaktérium törzseket biokémiai és fiziológiai tulajdonságaik alapján 3 biotípusba sorolták. A harmadik biotípusba a specifikus tulajdonságokkal rendelkező A. vitis tartozik, amely plazmid által kódolt tartarát hasznosításra is képes (Kerr and Panagopoulos, 1977; Süle, 1978; Szegedi et al., 1992). Az A. vitis kromoszómálisan kódolt poligalakturonáz termelése következtében nekrotikus reakciót okoz a növényen, elősegítve ezzel a baktérium bejutását a növénybe (McGuire et al., 1991). Egy új csoportba tartozik a fikuszról izolált törzs, az A. larrymoorei (Bouzar and Jones, 2001). A patogén agrobaktérium fajoknak közös jellemzője, hogy a kétszikű
növényeket
sebzési
helyeken
fertőzik,
tumorfejlődést, illetve hajszálgyökeresedést okoznak.
majd
a
fertőzött
növényeken
8 A tumorszövetek in vitro hormonmentes táptalajon növekedésre képesek (Braun, 1978) és opinokat termelnek (Dessaux et al., 1998), szemben az egészséges növényi szövetekkel. A tumorképződésért és az opinszintézisért az Agrobacterium sejtekben található Ti-plazmid felelős (Zaenen et al., 1974). DNS hibridizációval igazolták, hogy a baktériumfertőzés során a Ti-plazmid egy része, az ún. transzfer vagy T-DNS átkerül a növényi sejtekbe, és stabilan integrálódik a sejtmag DNS-állományába. Ezek a kísérleti megfigyelések nagyon fontosak voltak, mert fényt derítettek egy természetes génátviteli mechanizmusra, amelynek során bakteriális gének épülnek be a fertőzött növények sejtmagi örökítőanyagába. A folyamatról számos összefoglaló cikk jelent meg az elmúlt években ( Christie, 2004; Escobar and Dandekar, 2003; Gelvin, 2003; 2009; 2010; Pitzschke and Hirt, 2010; Tzfira and Citovsky, 2006; 2008 ; Zhu et al., 2000) (1. ábra).
1. ábra: Az agrobaktérium okozta transzformáció folyamata (Pitzschke and Hirt, 2010). Sebzés hatására felszabaduló vegyületek (1) aktiválják, a VirA/VirG kétkomponensű rendszeren keresztül (2), a vir gének átírását. Egyszálú T-DNS keletkezik (3), amely a IV. típusú makromolekuláris transzport rendszeren keresztül (virB/VirD4) (4) átjut a növényi sejtbe, ahol beépül (5,6) a növényi sejt kromoszómájába, melynek következménye tumorképződés és opin bioszintézis.
9 2.1.1. A fertőzési folyamat molekuláris biológiája A genetikai transzformáció alapja az agrobaktériumban található nagyméretű (200-500 kb) tumorindukáló Ti-plazmid jelenléte (2. ábra) (Fortin et al., 1993; Unger et al., 1985). A transzformáció során a Ti-plazmidon lévő T-DNS jut át, majd épül be a növényi genomba és okoz élettani változásokat. A legtöbb Ti-plazmidon csak egy T-DNS régió található, de előfordulnak több ismétlődő T-DNS szekvenciát hordozó Ti-plazmidok is (Barker et al., 1983; Suzuki et al., 2000). A T-DNS hozzávetőlegesen 10-30 kilobázis hosszúságú, amelyen a tumoros növekedésért és az opinszintézisért felelős gének lokalizálhatók, és amelyet két rövid, 25 bázispár hosszúságú ismétlődő szekvencia (left border: LB, right border: RB) határol (Gelvin, 2003).
2. ábra: A Ti-plazmid sematikus ábrája. A T-DNS régió feliratai jelzik az egyes vegyületek létrejöttéért felelős géncsoportok helyzetét. RB, LB a jobb-, és baloldali határoló szekvenciák. A tumoros növekedésért felelős gének növényi növekedési hormonok bioszintéziséért felelős fehérjéket kódolnak, melyek túltermelése a testi sejtek dedifferenciálódását és osztódását eredményezi (Britton et al., 2008). Az egyik növekedési hormon az auxin (indol-3-ecetsav, IAA), melynek bioszintéziséért két gén, az iaaM és az iaaH, által kódolt enzim, a triptofán-monooxigenáz és az indol-3-acetamid hidroláz a felelős (Costacurta and Vanderleyden, 1995; Gaudin et al., 1994). A másik hormon a citokinin (zeatin), amelynek képződésében az ipt gén által kódolt AMP-izopentenil transzferáz enzim vesz részt. Az enzim által létrehozott vegyületet (izopentenil-AMP) a növény által kódolt enzimek gyorsan tovább alakítják zeatinná (3. ábra).
10
3. ábra: Az auxin és citokinin bioszintézisének útvonala agrobaktérium transzformálta növényi sejtekben. Escobar és társai (Escobar and Dandekar, 2003) összefoglalójának módosított ábrája. (a) auxin (b) citokinin bioszintézis. Az auxin bioszintézisben az iaaM gén által kódolt triptofán-monooxigenáz enzim, és az iaaH gén által kódolt indol-3acetamid hidroláz enzim, a citokinin (zeatin) bioszintézisben pedig az ipt gén által kódolt AMP-izopentenil-transzferáz enzim vesz részt. Az opinszintézisért felelős gének opinok bioszintéziséért felelős fehérjéket kódolnak. Az opinok különleges aminosav származékok, általában egy aminosav és egy cukor, illetve egy aminosav és egy szerves sav kondenzációjából keletkeznek. Egy adott Agrobacterium törzs általában kétféle opin szintézisét indukálja a növényi sejtben. Az egyik egy viszonylag nagy mennyiségben termelődő katabolitikus opin, amit a baktérium képes egyedüli szén- és nitrogénforrásként hasznosítani. A másik egy jóval kisebb mennyiségben előforduló ún. konjugatív opin, mely indukálja a konjugatív pTi átvitelt olyan agrobaktérium sejtekbe, amelyekben még nincs. Ezen vegyületek kiválasztódnak a tumorsejtekből és átjutnak a szövetekbe, valamint a környezetbe a növény gyökérzetén keresztül (Savka et al., 1996).
11 Adott Agrobacterium törzs csak az általa hasznosítható opint termelteti, ezáltal csak a saját fennmaradását teszi lehetővé. Ez a folyamat a „genetikai gyarmatosítás” (Schell et al., 1979). A képződött tumorszövetben a baktérium számára előnyös élettér, niche alakul ki (Dessaux et al., 1992; Petit and Tempé, 1985). A Ti-plazmidon végzett deléciós analízis igazolta, hogy a két T-DNS határoló-szakasz (LB, RB) között található gének nem befolyásolják a fertőzőképességet, a virulenciát, az átvitelt és az integrációt (Miranda et al., 1992). Az átvitel folyamatában a Ti-plazmidon lévő virulencia (virA - virG) régiónak, valamint a kromoszómális virulencia (chvA, chvB) régiónak van meghatározó szerepe. A chv gének folyamatosan, úgynevezett konstitutív módon nyilvánulnak meg és termékeik a baktérium növényi sejtfalhoz való tapadását segítik elő, ill. szerepet játszanak a megfelelő ozmotikus viszonyok kialakításában is. A vir gének expressziója viszont szigorúan szabályozott, és aktiválódásuk indítja el a T-DNS átviteli mechanizmust. A sérült növényi szövetekből kiszabaduló fenolos vegyületek, mint például az acetosziringon (Stachel et al., 1985), valamint különböző monoszacharidok és aminosavak jelenléte indukálja ezen gének átírását (Ashby et al., 1988; Parke et al., 1987). A sebzés során keletkező cukrokat megkötő ChvE transzportfehérje kölcsönhatásba lép a fenolszármazékokat érzékelő virA által kódolt szenzor fehérjével, mely foszforiláció révén aktiválja a virG génről átíródott VirG fehérjét, ami beindítja a vir régió génjeinek átírását (Jin et al., 1990). Az indukció során keletkező VirD1/VirD2 határszekvencia-specifikus endonukleáz fehérjék hasítják a duplaszálú T-DNS szekvenciát, és a hasítás helyétől („nick”) kezdve a T-DNS-ről egyszálú DNS íródik át, melynek 5’ végéhez a VirD2 fehérje kovalensen kötődik, ezzel meghatározva irányultságát. Ez a létrejött DNS-fehérje komplex a T-szál (Stachel et al., 1987; Tinland et al., 1995; Yanofsky et al., 1986). A T-DNS kivágódási folyamatában még két fehérje, a VirC1 és a VirC2 is részt vesznek, egyes kutatók szerint azonban ezek inkább a T-DNS növényi sejtbe való átjutásában játszanak szerepet (Zhu et al., 2000). A VirB és VirD4 fehérjék a növényi membránon egy speciális konjugációs csatornát, a IV-es típusú szekréciós rendszert alakítják ki (T4SS) (Christie, 2004; Economou et al., 2006; Vergunst et al., 2000). Ezen keresztül jutnak át a növénybe a különböző Vir fehérjék (pl. VirE2, VirF) és a kialakult T-szál. A növényi sejtben a T-szálhoz kapcsolódnak a VirE2 fehérjék is, egyrészt, hogy megvédjék a DNS molekulát a növényi nukleázoktól, másrészt
12 a VirD2 és a VirE2 fehérjék is rendelkeznek nukleáris lokalizációs szignál (NLS) szekvenciákkal, hogy megkönnyítsék a T-komplex növényi sejtmagba jutását. A genomi DNS állományba történő beépülésben szerepet játszik több különböző növényi fehérje is (Gelvin, 2010). A T-DNS nem-homológ („illegitim”) rekombinációval, random
módon
integrálódik
a
növényi
genomba,
nagyobb
valószínűséggel
a
transzkripcionálisan aktív régiókba (Beilmann et al., 1992; Campisi et al., 1999; Sundaresan et al., 1995). A beépülés pontos mechanizmusa még ma sem ismert, a leginkább elfogadott feltételezés a „nonhomologous end-joining model”, mely szerint a Tszálak a növényi sejtmagban válnak kétszálúvá és utólag integrálódnak a genomba (Chilton and Que, 2003; Tzfira et al., 2003). Mivel a T-DNS jobb-, és baloldali határszakaszai közötti szekvenciák a T-DNS integráció szempontjából nem meghatározóak, ezért az Agrobacterium Ti-plazmid T-DNS része alkalmas arra, hogy vektorként felhasználva idegen géneket építsünk bele és juttassunk be általa magasabbrendű növényekbe (Gheysen et al., 1987; Ream, 1989). A növényi genomba épült mesterséges T-DNS a továbbiakban növényi szekvenciaként funkcionál. Ezek az alapvető felismerések vezettek el különböző növényi transzformációs vektorrendszerek kidolgozásához. 2.1.2. Ti-plazmid alapú növényi transzformációs vektorok Az agrobaktérium Ti-plazmidja alkalmas idegen gének bevitelére, de a Ti-plazmid nagy mérete, az egyedi restrikciós enzim hasítóhelyek hiánya a T-DNS régión nem tették könnyűvé a klónozási folyamatot. A kutatók ennek a problémának a megoldására sok stratégiát fejlesztettek ki, melyek tulajdonképpen kétféle módszeren alapultak. Az egyik módszer lényege, hogy a beépítendő gént „cisz” helyzetben a virulencia génekkel azonos plazmidon helyezik el. A másik módszer alapja pedig az a felfedezés volt, hogy a DNS átvitele akkor is sikeres, ha a virulencia gének és a T-DNS két különböző plazmidon helyezkednek el az agrobaktérium sejten belül. Tehát a virulencia gének „transz” helyzetben is képesek a T-DNS mobilizációjához szükséges funkciók ellátására. A két funkció szétválasztása nyomán kifejlesztett növényi vektorrendszerek a kettős, ún. bináris vektorrendszerek (Hoekema et al., 1983; de Frammond et al., 1983). A T-DNS átvitelét segítő plazmid („vir helper plazmid”) általában olyan Ti-plazmid származék, amelyből az LB, RB határszekvenciákkal együtt eltávolítják a teljes T-régiót. Napjainkra számos „helper” plazmidot fejlesztettek ki. Lefegyverzett vagy "disarmed"
13 vektoroknak is nevezik ezeket a nem patogén Ti-plazmidokat, amelyekből részben vagy egészben hiányzik a T-DNS régió (Hood et al., 1993). A bináris vektorrendszerek másik eleme a „klónozó” plazmid („bináris vektor”), egy széles gazdaspecifitású vektor, amely mind E.coli, mind A. tumefaciens sejtekben képes replikálódni és konjugációval könnyen átvihető az egyik baktériumból a másikba. Az ilyen klónozó vektorok tartalmazzák a T-DNS LB és RB határszekvenciáit, ezen belül a növényi szelekciós markergéneket, mint pl. kanamicin, higromicin, vagy herbicid rezisztencia gének (Gasser and Fraley, 1989; Weising et al., 1988), és klónozásra alkalmas helyeket. Ezeken kívül a plazmidnak tartalmaznia kell egy bakteriális szelekciós markert (pl. kanamicin, gentamicin rezisztencia) is (Lee and Gelvin, 2008). Ezek a vektorrendszerek transzformáns növények létrehozását is lehetővé teszik, mivel a transzformált növényi sejtekből, a megfelelő hormonok alkalmazásával, regeneráltatható a teljes, transzgént hordozó növény. 2.1.3. Növényregeneráció A növényi szomatikus sejtek totipotenciájának in vitro bizonyítása az 1900-as évek elején kezdődött. Haberlandt növényregenerációval kapcsolatos első cikke 1902-ben jelent meg, azonban az akkori körülmények között neki még nem sikerült a növények vegetatív sejtjeinek tenyésztése (Haberlandt, 1902). Az első sikeres kísérleteket Hannig végezte 1904-ben retek embriókkal (Hannig, 1904), majd Kotte gyökércsúcsokat tenyésztett sikeresen mesterséges feltételek mellett (Kotte, 1922). A harmincas években az amerikai White, ill. a francia Gautheret és kutatócsoportjaik fektették le azokat az alap módszereket, melyek a későbbi szervtenyészetek kiindulópontjai is lettek. A későbbiekben szintetikusan előállított
auxin
segítségével
sikerült
létrehozni
differenciálódott
sejtekből
differenciálatlan, folyamatosan osztódó növényi sejteket, kalluszt (Van Overbeek et al., 1941). Ezek a kísérletek, valamint egy új növényi hormoncsoport, a citokininek megismerése végül a totipotencia in vitro bizonyításához vezettek. Skoog és Miller az 1950-es évek végén auxin és citokinin hozzáadásával hajtás- és gyökérregenerációt indukáltak az in vitro tenyésztett kalluszból. A hajtástenyészetek mai napig használt leggyakoribb táptalaja a Skoog és Murashige által kikísérletezett MS táptalaj (Murashige and Skoog, 1962). Az 1960-as évektől megkezdődött a növényregenerációs módszerek kidolgozása az organogenezis, és a szomatikus embriogenezis segítségével (Steward et al., 1958).
14 A harmincas években kezdődtek meg a hazai szövettenyésztési kutatások is. A magyar növényi biotechnológia alapjait a Maróti Mihály által vezetett kutatócsoport eredményei szolgáltatták (1955-70). A 70-es években több más magyarországi kutatócsoport (Heszky László, Maliga Pál, Dudits Dénes) munkája is nemzetközileg figyelemre méltó eredményeket hozott a növényregeneráció kutatásban (Dudits and Heszky, 2003). Az első transzgenikus (génmódosított, GM) növényekről (dohány) a transzformációs technikák tökéletesítésével egy időben, az 1980-as évek elején jelentek meg beszámolók (De Block et al., 1984; Fraley et al., 1983; Horsch et al., 1985). Az első hazai, idegen gént hordozó transzgenikus növényről (lucerna) szóló tanulmányt 1986-ban közölték a Szegedi Biológiai Központ munkatársai (Deák et al., 1986). A transzgenikus növényekről szóló kutatási eredmények hasznosíthatóvá váltak egyrészt az alapkutatásban, hiszen általuk lehetőség nyílt a növényi gének alaposabb megismerésére, génszabályozás vizsgálatokra, másrészt pedig hasznosíthatók az alkalmazott kutatásban, a mezőgazdasági, ipari célból létrehozott növények esetében. Az 1986-os és 1987-es években már sikeresen állítottak elő vírus-, rovar- és herbicidrezisztens GM növényeket (Powell-Abel et al., 1986; Shah et al., 1986; Vaeck et al., 1987). Nem sokkal később, 1992-ben már hazai kutatók is eredményesen alkalmazták a technikát vírus rezisztens transzgenikus burgonya előállítására (Fehér et al., 1992). A gazdaságilag jelentős transzgenikus növények három csoportba sorolhatóak. Az első generációs transzgenikus növényekhez tartoznak a mezőgazdasági termelés fokozása érdekében előállított növények, ezeket termesztik a világon a legnagyobb területen. A második generációs növények esetében a cél speciális minőség előállítása az élelmiszeripari, fogyasztói igényeknek megfelelően. A harmadik generációs növények a bioreaktor típusú növények, melyek valamilyen speciális anyagot termelnek, főleg ipari célokra. A növényregeneráció történetéről, felhasználásáról részletes leírás található a Dudits Dénes és Heszky László által írt Növényi biotechnológia és géntechnológia c. könyvben (Dudits and Heszky, 2003). Napjainkig már nagyon sokfajta és féle genetikailag módosított növényt állítottak elő, változatosságuk szinte követhetetlen. A biotechnológia fejlődésének köszönhetően sikerült olyan genetikailag módosított növényeket létrehozni, melyek csak a bevitt idegen gén tekintetében térnek el a kiindulási fajtától (Venetianer, 2010). Ezek a módosított növények képesek
lehetnek
egyszerre
kielégíteni
a
termesztés,
a
környezetvédelem
és
hagyományőrzés igényeit, amelyek igen jelentős szerepet játszanak a szőlőtermesztésben is.
15 2.2. A szőlő (Vitis) nemzetség A szőlő (Vitis) a szőlőfélék (Vitaceae) családjába tartozó nemzetség. A nemzetségbe tartozó növények közös jellemzői: fás száruk, fürtökben elhelyezkedő virágzataik, terméseik és általában tenyeresen összetett levelük van. A szőlő az emberiség egyik legrégibb és legfontosabb, nagy gazdasági jelentőségű termesztett kultúrnövénye. Termesztése a Föld területéből mintegy 75866 km2 területen folyik, és kb. 71%-át borkészítésre, 21%-át gyümölcsfogyasztásra, 2%-át pedig mazsolakészítésre használják fel. A szőlőn a parányi élőlényektől (vírusok, baktériumok, gombák, fonálférgek), nagyobb rovarokon át a gerincesekig igen sok károsító élősködik, melyekkel szemben védekezés szükséges. Hazánk területén több mint kettőezer éve termesztenek szőlőt, és a rezisztens szőlőfajták a filoxéra járvány idején, az 1800-as években kaptak egyre nagyobb figyelmet. A
rezisztencia
gombabetegségek tanulmányozást
jelenségének (peronoszpóra, kívánt.
és
hasznosulásának lisztharmat)
Magyarországon
az
megismerése
terjedésével 1940-es
egyre évektől
a
különféle
mélyrehatóbb kezdődött
a
gombabetegségekkel szemben ellenálló szőlőfajták nemesítése. A nemesítők az abiotikus ill. biotikus stresszhatásokkal szembeni rezisztencia génforrásként a franko-amerikai fajhibrideket (pl. a Seyve Villard 12375, stb.) ill. az amuri szőlőt (Vitis amurensis) használták (Korbuly, 2000; Korbuly, 2002). Ezeket keresztezték az eurázsiai faj (Vitis vinifera) különböző fajtáival (Koleda I., 1975). Azonban eddig még klasszikus keresztezés segítségével nem sikerült elérni, hogy a rezisztencia géneket és a kedvező, jó tulajdonságokat egyesítsék, pedig ezekre a fajtákra nagy kereslet lenne. Ezért is lehetne létjogosultsága a molekuláris biológiai módszerekkel létrehozott szőlőfajtáknak, melyek kiváló tulajdonságaik megtartása mellett akár több különböző kórokozóval, környezeti hatással szembeni rezisztenciával is rendelkeznének. 2.3. Védekezés az Agrobacterium fertőzés ellen Talajvizsgálatok alapján a nem művelt területek talajában csak az A. tumefaciens fordul elő, míg az A. vitis csak közvetlenül szőlőből (gyökér, szőlővessző), vagy a fertőzött növény gyökérzóna környezetében lévő talajból izolálható, ahol azonban akár évekig is képes fennmaradni és így egy újra telepítés során jelentős károkat okozni (Bouzar and Moore, 1987; Bouzar et al., 1993; Burr and Katz, 1983, 1984; Burr et al., 1987, 1995; Pu and Goodman, 1993).
16 Magyarországon az agrobaktérium okozta golyvás megbetegedés dokumentálhatóan az 1960-as évektől kezdve lép fel rendszeresen. A kórokozó ellen a fertőzés szisztematikus jellege miatt (Lehoczky, 1971) a mai napig nincsen hatékony kémiai védekezési lehetőség. Ezért leginkább a betegség kialakulásának megelőzése a cél, elsősorban a talaj és a szaporítóanyag
kórokozó
mentesítésével,
biológiai
védekezéssel,
hagyományos
rezisztencia nemesítéssel és molekuláris biológiai módszerekkel, sajnos azonban még ezek egyike sem biztosít 100 százalékos védettséget. Az agrobaktérium okozta növénybetegséggel szembeni biológiai védekezésben a kártétel csökkentésére igen hatékonynak bizonyult egy, az 1970-es években izolált apatogén, antagonista A. radiobacter K84 törzs, amely az A. tumefaciens nopalin típusú Tiplazmiddal rendelkező törzseivel szemben hatásos agrocin84 nevű antibiotikumot termeli (Kerr, 1980). Ennek a törzsnek a hátránya, hogy az antibiotikum termelést és a vele szembeni rezisztenciát is kódoló nagyméretű konjugatív plazmidja, természetes baktérium populációban, könnyen átjut patogén agrobaktérium sejtekbe. Ezért kereskedelmi forgalomba már egy konjugációra nem képes mutáns változata került K1026 (Jones et al., 1988) néven. Azonban ez az A. radiobacter törzs az A. vitis törzsekkel szemben hatástalan, még a nopalin típusú Ti-plazmidot tartalmazó törzseivel szemben is, így szőlőn nem alkalmazható. A patogén A. vitis törzsekkel szemben, kizárólag szőlőn hatékony apatogén A. vitis F2/5 törzset a Dél-Afrikai Köztársaságban izolálták, mely az előző törzshöz hasonlóan szintén termel agrocint, bár kísérletes eredmények alapján valószínűleg a biológiai védekezésben betöltött szerepének nem ez az alapja, és a folyamat pontos hatásmechanizmusa még nem ismert (Burr and Reid, 1994; Burr et al., 1997). Ígéretes izolátumok az A. vitis E26 és az A. vitis VAR03-1 apatogén törzsek is, melyek szintén hatékonynak bizonyultak az A. vitis fertőzéssel szembeni védekezésben és hatásuk nem csak kizárólag szőlőre korlátozódik (Kawaguchi et al., 2005; Liang et al., 1990). Az ezen a területen elért eddigi eredmények igazán jelentősek és figyelemreméltóak. 2.4. Természetes rezisztencia nemesítés molekuláris markerekkel Az agrobaktériummal szembeni védekezésre az előbb említett biológiai védekezés mellett a hagyományos keresztezéses módszerrel létrehozott genetikailag ellenálló növények előállítása is lehetőséget ad. A nemesítés szempontjából előnyös, hogy a Vitis fajok egymással keresztezhetőek és termékeny utódokat hoznak létre. A módszer hátránya idő- és költségigényessége, és a patogén nagyfokú genetikai diverzitása is korlátozó tényező lehet.
17 Az 1940-50-es években T. Hoerner (1945) és B. Tamm (1954) kísérleteiben az agrobaktérium gazdanövénykörének vizsgálata során a V. labrusca, V. riparia és V. amurensis szőlők ellenállónak bizonyultak egyes Agrobacterium törzsekkel való fertőzéssel szemben. Az 1980-as években végzett hazai kutatásokban több különböző Vitis genotípust teszteltek agrobaktérium fogékonyságra és a tesztelt fajták közül a Szultán fehér csemegeszőlő, a V. amurensis eredetű Kunbarát, valamint a V. riparia cv. portalis alanyfajta is rezisztensnek bizonyult a nopalin típusú A. tumefaciens és A. vitis törzsekkel szemben (Szegedi, 1981; Szegedi et al., 1984). Emellett több V. amurensis eredetű agrobaktérium rezisztens hibridet is izoláltak és teszteltek, valamint igazolták a rezisztencia Mendeli domináns öröklődését (Szegedi and Kozma, 1984). A rezisztens alanyok további szelekciója, valamint a rezisztencia természetének megismerése céljából az 1990-es években további vizsgálatokat végeztek külföldön (Goodman et al., 1993; Heil, 1993; Stover et al., 1997) és itthon is (Süle et al., 1994). A hazai vizsgálatokban az alanyfajták közül a V. riparia cv. „Gloire de Montpellier” és a V. riparia x V. rupestris „3309 C” hibridek voltak a legígéretesebbek. A rezisztens növényeken nem fejlődött tumor, ugyanakkor az agrobaktériumok képesek voltak épp úgy szaporodni, mint a fogékony növényekben, valamint a vizsgált Vitis fajták mindegyike, függetlenül agrobaktérium fogékonyságuktól, termelt vir-indukáló vegyületeket, azonban a T-DNS átvitele kisebb mértékű volt az ellenálló fajtákban. Ezen kísérletek alapján az ellenállóképesség a T-DNS transzfer vagy integráció gátlásán alapul ezekben az esetekben (Süle et al., 1994). A folyamatról pontosabb képet a rezisztenciagén vagy gének megismerésével, izolálásával kaphatnánk, melyre a genetikai térképezésen alapuló génklónozás adhat lehetőséget. 2.4.1. Genetikai térképezés DNS markerekkel A genetikai térkép, vagy más néven kapcsoltsági térkép megadja a gének egymáshoz viszonyított helyzetét a kromoszóma mentén. A gének a meiózis alatt végbemenő kromoszóma rekombináció alatt válnak szét, ezáltal vizsgálhatók az utódokban. A távolabbi gének egymástól függetlenül öröklődnek, azonban azok a gének, melyek elég közel helyezkednek el egymáshoz, kapcsoltak és az osztódás során együtt kerülnek át az utódokba. Rekombinánsoknak nevezzük azokat az utódokat, melyek a szülői génkombinációtól eltérő génkombinációt hordoznak. A rekombinánsok aránya fontos mérőszám, ez a rekombinációs gyakoriság, vagy rekombinációs frekvencia és RF-ként rövidítjük. Ez az RF érték a géntérképezés mérőszáma és térképegységnek, angol elnevezéssel map unitnak (m.u.), ill. centimorgannak (cM) is nevezik.
18 Egy cM érték felel meg két gén között mért 1%-os rekombinációs gyakoriságnak, vagyis, ha 100 meiózisból egynek a terméke rekombináns. A genetikai térképezés alapjául Morgan és Sturtevant munkája szolgált, kísérlteti modelljük az ecetmuslica volt, melynek teljes géntérképe az 1930-as évek végére készült el. Természetesen napjainkig már több más élőlény genetikai térképe is elkészült, köztük jelentős gazdasági növényeinké is, pl. rizs, krumpli, kukorica, szőlő. Ez utóbbinál a kétszeres áltesztkeresztezés (pseudotestcross) térképezési stratégiával dolgoznak (Grattapaglia and Sederoff, 1994). Ezen kísérletekben az egyik szülő heterozigóta, a másik recesszív homozigóta egy-egy tulajdonságra nézve. Kezdetben a genom térképezés alapjául a látható fenotípusos mutációk szolgáltak, melyek azonban legtöbbször befolyásolták az egyed életképességét, és így csak korlátozott számban voltak alkalmazhatóak. Ezek használatát a molekuláris markerek váltották fel, melyek az egyes alléleket fehérje és/vagy DNS szinten különböztetik meg (Tanksley and Orton, 1983). Vizsgálatuk a DNS-DNS molekuláris hibridizáción alapuló Southern technika, az RFLP (restriction fragment length polimorphism, restrikciós fragmentumhossz polimorfizmus) módszer és a PCR technika segítségével lehetséges (Semagn et al., 2006). 2.4.1.1. RAPD, SCAR és SSR markerek A RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) módszert elsőként Williams és munkatársai írták le 1990-ben (Williams et al., 1990). A módszer DNS polimorfizmus kimutatására alkalmas, mely ismeretlen DNS szakaszok tetszőleges primerek segítségével történő felsokszorozásán alapul. A primerek általában 9-10 bp hosszúságú egyszálú oligonukleotidok, melyek a vizsgált genom különböző komplementer helyeire kötődnek. A PCR reakció során felsokszorozásra alkalmas távolságban (kb. 3000 bp, vagy rövidebb) eltérő
helyekre
kötődve,
eltérő
méretű
fragmenteket
eredményeznek,
melyek
gélelektroforézis segítségével elválaszthatók és így a polimorfizmusok, vagy épp az azonosságok kimutathatók. A technika előnye, hogy hatékony, viszonylag olcsó és nem ismert genomok vizsgálatára is alkalmas (Hadrys et al., 1992). Hátránya nagyfokú érzékenysége a reakció körülményekre, így a primer és a DNS templát koncentráció változásaira, a DNS minta, valamint a Taq polimeráz minőségére, a PCR készülék típusára és a szennyezésként bevitt DNS molekula jelenlétére is. Ezért sokszor vitatott a módszer reprodukálhatósága. Megbízhatóságának megerősítésére a SCAR markerek használata ad lehetőséget. A SCAR (Sequenced Characterized Amplified Region) marker a RAPD fragment szekvenciája alapján tervezett specifikus primerek által kimutatható egyedi fragment
19 (Paran and Michelmore, 1992). A RAPD marker szekvencia-analízisét követően 20-25 bp hosszú primereket terveznek, melyek egy jellegzetes polimorfizmus specifikus kimutatását teszik lehetővé. Ezeknek a markereknek előnye, hogy kifejlesztésük viszonylag egyszerű, kevésbé érzékenyek a PCR reakció körülményeinek változásaira, eredményük agaróz gélen értékelhető,
ugyanakkor
hátránya,
hogy
jellegükből
adódóan
a
polimorfizmus
vizsgálatokban nem elég hatékonyak. A SCAR markereket géntérképezésre, marker alapú klónozásra, vagy markeren alapuló szelekcióra (MAS, Marker Assisted Selection), valamint közel rokon fajták azonosítására használják. Az SSR (Simple Sequence Repeat) vagy mikroszatellita szekvenciák minden eukarióta genomban megtalálhatók, rövid, 2-6 nukleotidból álló tandem szekvencia ismétlődések (néhánytól akár száz fölötti ismétlődésig), melyek sokféle variációja lehet, akár populáción belül is. Jelenlétük lehetőséget biztosít a különböző genotípusok megkülönböztetésére. Mivel határoló régióik konzervatívak, így felsokszorozásukra széles körben használható primereket lehet tervezni (Morgante et al., 2002). Alkalmazhatók a genomtérképezésben, valamint a fajta- és klónazonosításban is (Pellerone et al., 2001). 2.4.1.2. DNS markereken alapuló szelekció és klónozás A DNS markerek, mivel egy adott tulajdonsághoz kapcsolhatók, alkalmasak a keresztezés utáni utódpopulációban az adott tulajdonság jelenlétének nyomon követésére. A MAS módszer előnye, hogy a kiértékeléshez nem szükséges a növényeket teljesen felnevelni, még abban az esetben sem, ha a kedvező tulajdonság jelenléte csak kifejlett növényen megfigyelhető, mint pl. gabona, vagy gyümölcs minőség, hím sterilitás, stb., hiszen a keresett kedvező tulajdonság kimutatható a növénynevelés korai fázisában, akár már a magonc növényből. Megkönnyítheti a munkát akkor is, ha adott allél jelenléte nehezen, költségesen, vagy időigényesen meghatározható, pl. valamely környezeti hatásra érzékeny tulajdonság. A MAS alkalmazása kifejezetten előnyt jelentett pl.: a cisztaképző fonalféreggel (Heterodera avenae), ill. a szójabab-cisztaképző fonálféreggel (H. glycines) szembeni rezisztencia nemesítésben búza ill. szója növények esetében (Eagles et al., 2001; Young, 1999). A módszer segítségével a keresztezés az utódok pontos szelekciója révén költséghatékonyabbá tehető, azonban nem helyettesítheti a fenotípusos szelekciót, sokkal inkább alkalmas annak kiegészítésére. Különösen a betegséggel szemben ellenálló fajták esetében, hiszen nemesített vonalainak végső tesztelésére mindig szükség lesz, függetlenül attól, hogy az adott marker milyen szorosan kapcsolt a keresett tulajdonságot meghatározó génhez, vagy kapcsoltsági csoporthoz (Yu et al., 2000).
20 2.5. Mesterséges rezisztencia kialakítása biotechnológiai módszerekkel A molekuláris biológiai módszerek fejlődése lehetőséget teremtett abiotikus és biotikus stressz-rezisztens növények létrehozására is. Így napjainkban léteznek már rovarrezisztens pl.: Bt-toxint termelő növények (de Maagd RA et al., 1999), gombarezisztens pl.: kitináz és glükanáz túltermelő paradicsom (Jongedijk et al., 1995), vírusrezisztens pl.: papaya gyűrűsfoltosság vírussal szemben ellenálló papaya (Gonsalves et al., 2004), és bakteriális fertőzéssel szemben ellenálló transzgenikus növények, pl.: Xanthomonas baktériummal szemben rezisztens rizs (Wang et al., 1996; Collinge et al., 2010). Agrobaktérium rezisztencia kialakítása lehetséges magának a baktériumnak az elpusztításával, vagy a kórfolyamat gátlásával, vagyis a T-DNS átjutásának, beépülésének, hormontermelésének megakadályozásával. Reisch és munkatársai 2006-ban a baktérium szaporodásának gátlása érdekében egy, a baktérium sejtmembránjához kötődve azon pórusokat kialakító antibakteriális peptidet, a magainint kódoló gént építettek be szőlőbe (Vitis vinifera cv. Chardonnay), génbelövéssel. A beépített transzgén megnyilvánulása szignifikánsan (30-50%) csökkentette a tünetek megjelenését szőlőn (Vidal et al., 2006). A T-szál (T-DNS/VirD2 komplex) az agrobaktériumból a T4SS speciális konjugációs csatornán jut át a növénybe, ahol a hozzá kapcsolódó virE2 fehérjék védik meg a növényi nukleázok általi lebontástól. Citovsky eredményeire alapozva (Citovsky et al., 1994), Burr és munkatársai olyan mutáns VirE2 fehérjét termeltettek szőlőben, mely nem volt képes kötődni az egyszálú DNS molekulához és így megóvni a degradációtól (Holden et al., 2003; Krastanova et al., 2010). Baktériumban a VirE1 fehérje a VirE2 fehérjéhez kötődve segíti annak transzportját a növénybe, ugyanakkor jelenléte növényben nem kimutatható. Feltételezések szerint növényben kifejeztetve szintén kötődhet a VirE2 fehérjéhez és így gátolhatja a T-DNS átvitelét. Szegedi és munkatársai virE1 gént építettek be dohányba, mely gátolta a tumorképződést, azonban hatékony csak azzal az oktopin típusú agrobaktériummal szemben volt, amelyből a VirE1 fehérje származott (Szegedi et al., 2001; Humann et al., 2006). Ez alátámasztja azt a feltételezést is, miszerint a patogén genetikai diverzitása korlátozó tényező lehet a vele szembeni védekezésben. A tumorképződést a Ti-plazmidon lévő iaaM (vagy iaaH) és ipt gének inaktivációja is megszünteti (Ream et al., 1983). A talajban előforduló fertőző Agrobacterium törzsekben nem lehet e géneket elrontani, de meg lehet akadályozni működésüket a fertőzött,
21 transzformált növényi sejtekben. Mivel a T-DNS bejutása után, ahogy a fenti fejezetek is bemutatták, ezek a gének növényi génként működnek, így a hormon bioszintézis transzgének működésének megakadályozására a géncsendesítés módszere lehet alkalmas eszköz. 2.5.1. A géncsendesítés A géncsendesítés (posttranscriptional gene silencing - PTGS, RNS interferencia) egy nemrég felfedezett, és napjainkban intenzíven kutatott mechanizmus, amely kb. 21-24 bp hosszúságú kis RNS molekulák segítségével eukarióta szervezetekben gének expresszióját képes módosítani (Baulcombe, 2004; Baykal and Zhang, 2010; Eamens et al., 2008; Meister and Tuschl, 2004; Susi et al., 2004). A folyamatot Napoli és munkatársai fedezték fel transzgenikus növényekben, melyekben a sötétebb virágszín elérése érdekében bevitt transzgén (kalkon-szintáz) a várakozásokkal ellentétben feltűnően gyengén fejeződött ki (Napoli et al., 1990). A jelenség nem csak növényekben, de állatokban (Fire et al., 1998) és gombákban (Nakayashiki, 2005) is lejátszódik. A mechanizmus pontos megértéséért Andrew Fire és Craig Mello kapott Nobel-díjat 2006-ban. Kísérleteikben a Caenorhabditis elegans fonalféreg mex3 génjét szerették volna csendesíteni antiszensz RNS segítségével. Ahogy várható volt, az antiszensz RNS hatására a gén kifejeződése csökkent, ezzel együtt a róla képződő fehérje mennyisége kevesebb lett. Emellett a mex3 gén szekvenciáját tartalmazó duplaszálú RNS molekulákat is injektáltak a sejtekbe, és a hatás jóval erőteljesebbnek bizonyult, ugyanis a mex3 génről a fehérjeképződés teljesen megszűnt, vagyis a duplaszálú RNS molekulák sokkal hatékonyabbak, mint az antiszensz RNS molekulák. A géncsendesítést indukáló kis RNS molekuláknak két fő típusa van, a short interfering RNS (siRNS) és a mikroRNS (miRNS) (Xie et al., 2004). Növényekben a siRNS alapú géncsendesítésnek elsősorban a vírusokkal szemben van védő szerepe, de részt vesz a heterokromatin kialakításában, a genom átrendeződésben, a transzpozonokkal, vagy transzgénekkel szembeni természetes védekezésben, a miRNS alapú géncsendesítés pedig a saját gének működését (fejlődési mintázat) szabályozza, elsősorban csökkentve az átíródásukat. A géncsendesítés alapvetően kétféle módon történhet: transzkripciós (transcriptional gene silencing - TGS) és poszttranszkripciós (posttranscriptional gene silencing - PTGS) szinten. TGS esetében a célgénről nem keletkezik mRNS, vagyis a gén átíródása gátolt, PTGS során pedig az átírás megtörténik, de a célgén eredetű mRNS molekulák lebomlanak (Xie et al., 2004).
22 A siRNS molekulák hasonlóak a miRNS molekulákhoz, és méretük növényekben a 2124 nukleotid hosszú mérettartományban változik (Hamilton et al., 2002; Tang et al., 2003). Hatásukat transzkripciós és poszttranszkripciós szinten is kifejthetik (Finnegan and Matzke, 2003). A siRNS molekulák hosszabb duplaszálú prekurzor RNS molekulákból vágódnak ki, melyek létrejöhetnek például egymással szemben elhelyezkedő ismétlődő régiókról történő átíródás után. A prekurzor RNS molekulák kialakulásában az RNS függő RNS polimerázoknak van szerepük. A siRNS molekulák képződésében a Dicer nevű enzim vesz részt, elsősorban állatokban, növényekben pedig a Dicer-like enzimeknek van szerepük (Bernstein et al., 2001). A rövid siRNS oligonukleotidok kötődnek az RNS indukálta géncsendesítő fehérje komplexhez (RISC- RNA Induced Silencing Complex), ami a dsRNS két szála közül, valamilyen felismerő mechanizmus alapján, kiválasztja az egyiket. Ez lesz a vezető szál, a másik pedig degradálódik. A kiválasztott szál segítségével a komplex szekvencia specifikusan ismeri fel az mRNS komplementer részét, majd azt a komplementer régió közepén hasítja a komplexben található Argonaute (Ago) fehérje segítségével. Ennek következtében az mRNS degradálódik, így nem képződhet róla fehérje (4. ábra) (Song et al., 2004). Az első növényi miRNS molekulákat lúdfűben (Arabidopsis thaliana) fedezték fel (Park et al., 2002; Reinhart et al., 2002). A genomban található, fehérjét nem kódoló MIR génekről prekurzor mikroRNS (miRNS) molekulák íródnak át, melyekből egy vagy több nukleolitikus hasítási lépésen keresztül képződnek a 21-22 nukleotid hosszúságú miRNS molekulák (Lai, 2003). Az egyszálú prekurzor miRNS komplementer részei kettős szálú részleteket képeznek, melyből az érett miRNS pontos kihasítását a sok doménes Dicer vagy Dicer-like (lúdfűben DCL1) enzim végzi (Denli and Hannon, 2003). Lúdfűben 4 DCL enzimet kódoló gén található, ezek közül a DCL1 vesz részt a miRNS képződésben (Xie et al., 2004), melynek pontos működéséhez a Hyponastic leaves 1 (HYL1) és Serrate (SE) fehérjékre is szükség van. Az érett miRNS molekulákat a Hua enhancer 1 (HEN1) metilálja, hogy megvédje a kis RNS lebontó nukleázoktól (SDN1). Ezek a kis duplaszálú miRNS molekulák a ribonukleoprotein komplexhez kötődnek (RISC), melynek feladata a fejlődési eseményekben (mint pl. sejtosztódás, apoptózis, szerv differenciálódás, polarizáció) részt vevő célgének negatívan szabályozása (Ambros, 2003; Carrington and Ambros, 2003). Az eddigi adatok szerint a növényi miRNS molekulák többsége
konzervatív,
vagyis
ugyanaz
a
miRNS
megtalálható
különböző
növénycsaládokban is és a rokon miRNS molekulák közt csak kismértékű eltérés mutatható ki, de mindemellett előfordulnak köztük fajspecifikusak is (Sunkar et al., 2005).
23 A siRNS indukálta géncsendesítés során a célgénről átíródott mRNS degradálódik, miRNS alapú géncsendesítés során pedig vagy transzlációs gátlás történik vagy az mRNS hasítódik (4. ábra).
4. ábra: A siRNS és miRNS alapú géncsendesítési folyamat összefoglaló ábrája. (Matzke and Matzke, 2004 módosítva) A szekvencia specifitást a RISC komplexbe épült siRNS ill. miRNS molekulák határozzák meg, melyek a cél mRNS molekulával teljes, vagy majdnem teljes komplementaritást mutatnak (Tang et al., 2003). A növényi géncsendesítési folyamatok hőmérsékletfüggőek. A siRNS alapú géncsendesítés alacsony hőmérsékleten (15oC alatt) gátlódik, azonban a miRNS alapú géncsendesítés hatékonyságát a hőmérséklet nem befolyásolja (Szittya et al., 2003). Ennek a mezőgazdasági alkalmazásban lehet jelentős szerepe, hiszen a miRNS alapú géncsendesítés még akkor is hatékony maradhat, amikor a siRNS alapú géncsendesítés az alacsony hőmérséklet miatt már nem működik. A molekuláris növénynemesítés szempontjából olykor jelentős hátránnyal járhat az a tény, hogy a csendesítés mechanizmusa nemcsak a mesterségesen átvitt transzgénre hathat, hanem a növény eredeti, endogén homológ génjére is. 2.5.2. siRNS alapú géncsendesítés Lee és munkatársai sikeresen alkalmazták a siRNS alapú géncsendesítési mechanizmust agrobaktérium rezisztens transzgenikus dohánynövények létrehozására (Lee et al., 2003). Egy olyan génkonstrukciót készítettek, melyben az A. tumefaciens A348 törzsből származó iaaM és ipt géneket egymás után építették, majd ezt két, egymással szemben elhelyezkedő,
24 szensz és antiszensz RNS átírását biztosító promoter közé helyezték és növényi transzformációs vektorba juttatták. Ez a pJP17 vektorkonstrukció (5. ábra). A konstrukció különösen az iaaM gén esetében hatásosan működött és sikeresen akadályozta meg a tumorképződést. Walt Ream és munkatársai ugyanezzel a pJP17 konstrukcióval sikeresen állítottak elő agrobaktérium rezisztens transzgenikus alma vonalakat (Viss et al., 2003).
5. ábra: A pJP17 vektorkonstrukció T-DNS része. RB, LB: jobb és baloldali határoló régiók, nptII: neomicin foszfotranszferáz (KmR) gén, pnos: nopalinszintáz promoter, pCMV és pFMV növényi promoterek. A géncsendesítés hatásossága függ a vektorral bejuttatott gén és a patogén agrobaktérium T-DNS részén elhelyezkedő gén közötti szekvencia azonosságtól, hiszen a folyamat alapja a szekvencia specifikusan történő felismerés. Ezért valószínű, hogy egyetlen csendesítő szekvencia nem lehet hatásos minden Agrobacterium törzsre, mert az eddig megismert iaaM szekvenciák között is vannak erősen eltérőek (53% azonosság, lásd később).
25 3. CÉLKITŰZÉSEK Munkánk hosszú távú célja, egyrészt egy V. amurensis eredetű domináns és feltételezhetően egygénes agrobaktérium rezisztencia (Rcg1) lókusz helyzetének meghatározása a V. vinifera genomban, valamint a rezisztencia molekuláris növényélettani alapjainak feltárása. Másrészt vizsgáljuk annak lehetőségét, hogy hogyan lehet mesterséges agrobaktérium rezisztens szőlőt létrehozni géncsendesítés segítségével. Ennek érdekében a következő közvetlen célokat tűztük ki magunk elé: A rezisztens Kunbarát és fogékony Sárfehér fajták keresztezéséből származó nagyszámú utód jellemzése különböző Agrobacterium törzsekkel történő fertőzések segítségével. A talált polimorfizmusok jellemzése DNS szekvencia szinten, majd az agrobaktérium rezisztenciához kapcsolt DNS markerek kifejlesztése. Az iaaM onkogén géncsendesítésén alapuló mesterséges rezisztencia kialakítása és jellemzése transzgenikus dohánynövényekben. Az iaaM onkogén géncsendesítésén alapuló mesterséges rezisztencia kialakítása és jellemzése transzgenikus szőlőnövényekben és a kialakult rezisztencia mértékének jellemzése génexpressziós szinten.
26 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4. 1. Alkalmazott baktérium törzsek és plazmidok A munkánk során használt baktériumok és plazmidok jellemzőit az 1. táblázat tartalmazza. 1. táblázat: A felhasznált baktériumtörzsek és plazmidok ELNEVEZÉS
JELLEMZŐK
REFERENCIA
Escherichia coli törzsek XL1-blue
recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE4
(Bullock et al., 1987)
relA1 lacZ∆M15 klónozó törzs, TcR JF1754
hsdR. del-lac-gal metB leuB hisB
(McNeil and Friesen, 1981)
PP211
helper törzs JF1754 (pRK2013) KmR,
Putnoky Péter
pJP konjugációhoz Agrobacterium tumefaciens törzsek A348
vad típus, oktopin Ti plazmid
(Garfinkel et al., 1981)
C58
vad típus, nopalin Ti plazmid
(Hooykaas et al., 1980)
EHA101
„disarmed”
helper
törzs
T-DNS
(Hood et al., 1986)
transzferhez KmR, NalR Agrobacterium vitis törzsek Tm4
vad típus, oktopin Ti plazmid
(Paulus et al., 1989; Szegedi et al., 1988)
AT1
vad típus, nopalin Ti plazmid
(Paulus et al., 1989; Szegedi et al., 1988)
S4
vad típus, vitopin Ti plazmid
(Szegedi et al., 1988)
27 Plazmidok pBS
pBluescript II SK (+) klónozó vektor, Amp
Stratagene
R
pJET
pJET1.2/blunt klónozó vektor, AmpR
Fermentas
pRK2013
helper plazmid keresztezéshez, KmR
(Ditta et al., 1980)
pJP21
bináris
(Lee et al., 2003)
vektor,
CaMV,
FMV
promoterek, nptII gén pJP17
pJP21::iaaMA348-STOP, ipt-A348
(Lee et al., 2003)
4. 2. A baktériumok növesztése, tárolása Az Agrobacterium törzseket 28°C-on komplett TA (Orosz et al., 1973), az E. coli törzseket pedig 37°C-on LB (Sambrook et al., 1989) szilárd táptalajon (1,5% agar), illetve tápfolyadékban növesztettük. A megfelelő antibiotikumokat a 2. táblázatban megadott végkoncentrációkban alkalmaztuk. A baktérium törzseket -20°C-on lefagyasztva, 15%-os glicerines TA-ban tároljuk. 2. táblázat: Alkalmazott antibiotikumok és koncentrációik (µg/ml) Antibiotikum
Rövidítés
E. coli
Agrobacterium sp.
ampicillin
Amp
100
-
kanamicin
Km
-
30
tetraciklin
Tc
15
-
nalidixic-sav
Nal
-
100
4.3. A baktériumok keresztezése A pJP plazmid származékokat a pRK2013 helper plazmidot tartalmazó baktériumtörzs segítségével, konjugációval juttattuk be E. coli sejtekből a megfelelő Agrobacterium törzsbe. Ez a módszer a „háromszülős keresztezés”, mely magában foglalja a donor és a recipiens törzset, valamint a mobilizáló plazmidot tartalmazó, „helper” törzset.
28 A keresztezni kívánt donor és recipiens baktériumokat, valamint a „helper” törzset felnövesztettük a megfelelő antibiotikumokat tartalmazó komplett táptalajon. A keresztezést 0,9%-os NaCl-oldatban felszuszpendált baktériumokkal végeztük, TA lemezen összecseppentve őket. Éjszakán át, 28°C-on történő inkubálás után a felnőtt baktériumokat 0,9%-os NaCl-oldatban ismét felszuszpendáltuk, majd különböző hígításokban szelektív lemezekre szélesztettünk belőlük 50 µl szuszpenziót. A 48 óra elteltével felnőtt telepek közül a kiválasztottakat legalább két lépésben tisztítottuk tovább szelektív lemezen, mielőtt tovább dolgoztunk velük. 4. 4. Összes DNS izolálás Összes DNS tisztításhoz Meade és társai módosított eljárását alkalmaztuk (Meade et al., 1982). 1,5 ml éjszakán át növesztett baktériumkultúrából a sejteket centrifugálással ülepítettük, és 300 µl TE oldatban (50 mM TrisHCL, 20 mM EDTA, pH 8,0) szuszpendáltuk. 100 µl 5% SDS-t tartalmazó TE oldatot és 100 µl pronáz oldatot (2,5 mg/ml pronáz TE oldatban) adtunk hozzá. 1-3 órás 37°C-os inkubálás után 500 µl TE-vel telített fenollal ráztuk össze, majd centrifugálás után a felülúszót új Eppendorf csőbe pipettáztuk át. 500 µl fenol : kloroform oldattal (25 térfogat fenol : 24 térfogat kloroform : 1 térfogat izoamil-alkohol) ráztuk össze. Centrifugálás után a felülúszóhoz 500 µl kloroform oldatot (24 térfogat kloroform : 1 térfogat izoamil-alkohol) adtunk, összeráztuk és centrifugáltuk. A vizes fázisból a DNS-t 1000 µl etanollal kicsaptuk. A kocsonyás csapadékot új, 500 µl 70%-os etanol tartalmú Eppendorf csőbe tettük át pipettahegy segítségével. Centrifugálás után a felülúszót leöntve, szárítást követően, a DNS csapadékot 100 µl desztillált vízben oldottuk fel. 4.5. Plazmid DNS tisztítás A plazmid DNS-t 3-3 ml LB tápfolyadékban, a megfelelő antibiotikum jelenlétében éjszakán át növesztett E. coli sejtekből Ish-Horowicz és Burke (Ish-Horovicz and Burke, 1981) módszerének módosított változata szerint preparáltuk. 1,5 ml kultúrát Eppendorf csőbe tettünk és a sejteket centrifugálással leülepítettük. A tisztítás során minden centrifugálás 5 percig tartott, 12000 fordulatszámmal, szobahőmérsékleten. A sejteket 100 µl TEG oldatban (25 mM TrisHCl, 10 mM EDTA, 50 mM glükóz, pH 8,0) felszuszpendáltuk. A feltárást 200 µl NS oldat (0,2N NaOH, 1% SDS) hozzáadásával végeztük. A mintákat 5 percig 0°C-on inkubáltuk, majd 160 µl jéghideg Na-acetát oldatot (3M, pH 4,8) adtunk hozzájuk és az oldatot erősen összeráztuk. 5 perc 0°C inkubáció után
29 a csapadékot lecentrifugáltuk, és a felülúszóból 320 µl izopropanollal kicsaptuk a plazmid DNS-t. 20 perc -20°C inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk, szárítottuk, és 100 µl Tris-acetát pufferben (50 mM Tris, 100 mM Na-acetát, pH 8,0) feloldottuk. Ezután 200 µl etanollal a DNS-t ismét kicsaptuk, centrifugáltuk, szárítottuk az előzőekhez hasonló módon, majd 30-50 µl RNáz tartalmú desztillált vízben (100 µg/ml forralt RNázA) oldottuk fel. Restrikciós emésztésekhez 1-10 µl preparátumot használtunk fel, az adott plazmid kópiaszámának függvényében. A DNS-szekvencia meghatározáshoz a preparátumokat további lépésekben tisztítottuk. Az előzőek szerint készített 50 µl plazmid preparátumhoz 0,1 térfogat 10% SDS oldatot és 1 térfogat 0oC-os 7,5 M NH4-acetát oldatot adtunk és 15 percig inkubáltuk jégen. Ezután a csapadékot lecentrifugáltuk, és a felülúszóból 0,6 térfogat izopropanol hozzáadásával kicsaptuk a plazmid DNS-t (-20°C, 20 perc inkubálás). Centrifugálás, etanolos mosás, szárítás után a tisztított DNS-t 40 µl desztillált vízben vettük fel. A preparátumok minőségét agaróz gélelektroforézis segítségével ellenőriztük általában 1 µl minta felhasználásával. 4.6. Agaróz gélelektroforézis és DNS-fragment izolálás A DNS minták elválasztására agaróz gélt használtunk, követve az általános módszertani leírásokat (Sambrook et al., 1989) Az izolálni kívánt fragment elé az agaróz gélbe Whatman DE 81 papírdarabot helyeztünk és 15 perc (60V) elektroforézis után azt a gélből eltávolítottuk. A fragmentet tartalmazó papírt Eppendorf csőbe tettük, és a DNS-t kétszer 50 µl 1 M NaCl oldattal eluáltuk. A DNS kicsapása 0,1 térfogat 3M Na-acetát oldat (pH 7,0) és 2 térfogat 96%-os etil-alkohol hozzáadásával történt. 20 perces -20°C-os inkubálás után lecentrifugáltuk, szárítottuk és 20 µl desztillált vízben oldottuk fel a csapadékot. 4.7. In vitro DNS-technikák (restrikciós emésztések, foszfatáz és T4 polimeráz kezelés, ligálási reakciók) A DNS minták restrikciós emésztését Sambrook és mtsai szerint végeztük (Sambrook et al., 1989) a Fermentas cég termékeit használva. Kettős emésztés esetén, ha az enzimek nem vágtak egy pufferben, az első enzimreakció után a minta DNS tartalmát kicsaptuk 0,1 térfogat 3M Na-acetát (pH 7,0) és 2 térfogat etanol (96%) hozzáadásával. Minimum 20 percig inkubáltuk -20°C-on, majd 5 perc centrifugálás és 70%-os etanolos mosás, szárítás után 30 µl steril desztillált vízbe vettük fel. Ez után végeztük el a második enzimreakciót.
30 A vektor defoszforilálására és így az inszert nélküli, önmagában való ligálás megakadályozására néhány esetben alkalikus foszfatáz kezelést alkalmaztunk (Shrimp Alkaline Phosphatase, Fermentas), a kitben megadottak szerint. Más esetben kihasználtuk azt, hogy a kétféle restrikciós endonukleázzal megvágott, egymással kapcsolódni nem képes túlnyúló egyszálú végekkel rendelkező vektor csak a megfelelő enzimekkel létrehozott DNS-fragment kapcsolódása esetén hoz létre replikálódni képes származékot. A polimeráz kezelést (tompa végek kialakítása) 20 µl végtérfogatban, 50 ng vektor és fragment DNS, 2 µl 10x reakció puffer (Fermentas), 1 µl 2mM dNTP felhasználásával készített elegyben végeztük el, 0,01 U T4 polimeráz enzim (Fermentas) hozzáadásával. Az elegyet 10-15 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd az enzim inaktiválása érdekében 10 percig 75°C-ra melegítettük. Ezután a minta DNS-tartalmát 0,1 térfogat 3M Na-acetát (pH 7,0) és 2 térfogat etilalkohol (96%) hozzáadásával kicsaptuk, és minimum 20 percig inkubáltuk -20°C-on, majd 5 perc centrifugálás és 70%-os etanolos mosás, szárítás után 10 µl desztillált vízbe vettük fel. Ez után végeztük el a ligálási reakciót. A ligálási reakciókat 20-25 µl térfogatban, 50-100 ng vektor és fragment DNS, és 1x T4 DNS ligáz puffer (40 mM TrisHCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, pH 7,8) segítségével végeztük el. A reakciókhoz ragadós végek esetén 0,01 U, tompa végek összekapcsolása esetén 0,5 U T4 DNS ligáz enzimet (Fermentas) használtunk. Az elegyet legalább 2 órán át, szobahőmérsékleten (22°C) inkubáltuk a transzformáció előtt. 4.8. Baktérium transzformáció Egy transzformáláshoz 100 µl kompetens sejtet használtunk fel. A sejteket -80°C-ról jégre tettük, és 15 perc elteltével hozzáadtuk a transzformációhoz használt DNS-t. 30 percig jégen inkubáltuk, majd hősokkot alkalmaztunk (3 perc, 37°C). Ez után 400 µl LB tápfolyadékot adtunk a sejtekhez. Egy óra 37°C-os inkubáció után a sejteket szelektív táptalajra kentük. pBluescript használata esetén 20 ml táptalajba 100 µl ampicillin (25 µg/ml), 40 µl IPTG (100 mM) és 40 µl X-gal oldatot (2%, dimetil-formamidban) tettünk, és a transzformánsok közül a fehér telepeket választottuk ki további ellenőrzésre. A kompetens sejteket általában az XL1-blue törzsből készítettük, szobahőmérsékleten OD600=0,5 denzitásig felnövesztett sejtekből, melyeket többszöri mosás, centrifugálás után tízszeresre koncentráltunk és 400 µl-es adagokban, -80°C-ra fagyasztottuk 7% dimetilszulfoxid jelenlétében (Inoue et al., 1990).
31 4.9. DNS izolálás szőlőből A DNS izoláláshoz 1 g fiatal szőlőlevelet folyékony nitrogénben szétdörzsöltünk és 20 ml CEP (2% CTAB, 100 mM Tris, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl, 0,5% β-Mercaptoethanol) pufferbe tettük, amihez 100 mg polyvinylpyrrolidont (PVP, Sigma P6755) adtunk (1g levél/100mg PVP). Mindezt jól összeráztuk és 1 órán keresztül 65°C vízfürdőbe helyeztük, mialatt többször összekevertük. Az egy óra elteltével 20 ml kloroformot (1:1arányban) adtunk hozzá, óvatosan összeráztuk és 30 percig állni hagytuk, közben sűrűn forgattuk. Ezután 10 percig centrifugáltuk (4400 rmp, IEC Centra rotor No 7231). A felülúszót új csőbe mértük és 0,5 térfogatnyi NaCl oldatot (5M, pH 7.0) és 0,6 térfogatnyi izopropanolt adtunk hozzá. Óvatosan összeráztuk. Következő lépésben 5 percig centrifugáltuk (4400 rmp), majd a felülúszót leöntöttük, alaposan lecsurgattuk és 1 ml TE (50 mM Tris (pH 7.5), 20 mM EDTA) oldatban oldottuk fel, amihez 10 µl 10 mg/ml DNáz mentes RNáz oldatot adtunk és 1-2 óráig, szobahőmérsékleten hagytuk oldódni. Ezután a mintákat három részre osztottuk szét, hogy Eppendorf csövekben folytathassuk a munkát. 300 µl DNS oldathoz 300 µl TES (TE-ben 10 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA, 1% SDS) puffert adtunk és 10 perc jégen való inkubálás után 300 µl NH4Ac (7,5 M, 0°C) oldatot adtunk hozzá. Alapos összekeverés és 10 perces -20°C-os inkubálást követően, a keletkezett csapadékot ülepítettük (5 perc, 12000 rpm). A felülúszót 500 mikroliterenként új csövekbe óvatosan átpipettáztuk és 0,6 térfogat i-propanollal kicsaptuk a benne lévő DNS-t (20 perc -20°C). Ezután 5 percig centrifugáltuk (12000 rmp) a mintákat. A csapadékot 70%-os etanollal mostuk, majd szárítottuk és 250 µl desztillált vízben oldottuk fel (Arnendo-Andrés et al., 2002). A DNS oldatok koncentrációját és szennyezettségét NanoDrop 1000 UV/VIS spektrofotométer segítségével állapítottuk meg. Az OD260/OD280 arány mindig 1,6 és 2,0 között volt. Az RNS, és az enzimreakciókat gátló esetleges más szennyezések kimutatása érdekében a DNS preparátumokból vett mintákat kezelés nélkül, és EcoRI enzimmel (Fermentas) emésztve agaróz gélen is elválasztottuk. Minden DNS mintából egyenlő koncentrációjú oldatokat higítottunk (20 ng/µl) a PCR reakciók összehasonlíthatósága és kiértékelhetősége érdekében. 4.10. RAPD és specifikus PCR reakciók A rezisztenciagénekhez kapcsolt markerek keresésére a RAPD analízisek során Williams és munkatársai által leírt módszert alkalmaztuk (1990) és az Operon cég
32 (http://oligos.qiagen.com/ stock/ rapd_10mer_price.php) dekamer primersorozataival (OPA-tól OPZ-ig) azonos primereket szintetizáltattunk, és végeztük a reakciókat. A reakciók körülményei: 5 ng emésztetlen vagy emésztett templát DNS, F buffer (10X Dream Taq Buffer (750 mM TrisHCl, pH 8.8, 200 mM NH4SO4, 0.1% Tween20), 2,5 mM MgCl2, 2,5 mM dNTP, 3x H2O), 10 µM primer (3. táblázat) és 0.2 U Dream Taq DNS polimeráz (Fermentas). A MJet PTC 200 thermocycler és BioRAD S1000 PCR gépben a RAPD2 programot alkalmaztuk (4. táblázat). A későbbiekben a kapcsolt, meghatározott bázissorrendű régiókra specifikus primer párokat terveztünk (5. táblázat). A reakciók körülményei a következők voltak: 10 ng DNS, 1x Taq buffer, 0,2 mM dNTP, 1,5 mM MgCl2, 10 µM fw/rev primer, 1.25 U Taq polimeráz. Az alkalmazott programot (chr15) a 4. táblázat tartalmazza. 3. táblázat: A rezisztencia lókuszhoz kapcsolt RAPD markerek primerei PRIMER OPU07 OPX05
SZEKVENCIA 5’-3’ Tm CCTGCTCATC 36°C CCTTTCCCTC 36°C
4. táblázat: A munkánk során alkalmazott RAPD2 és chr15 program RAPD2
chr15
1.
2:00 95°C
2:00 95°C
2.
0:30 95°C
0:30 95°C
3.
0:30 36°C
0:30 58°C
4.
1:00 72°C
1:00 72°C
5.
35x go to 2
32x go to 2
6.
2:00 72°C
5:00 72°C
7.
End
End
5. táblázat: A 15. kromoszóma szekvenciája alapján tervezett SCAR primerek PRIMER OPU07.1sc OPX05.1sc
FW REV FW REV
SZEKVENCIA 5’-3’ CCTGCTCATCTCATTAACAAAAC CCTGCTCATCCACGTCT GTTTCTTGATTCCATTGTTTGTA TTAGGAACTTCGACAACATTG
Tm 56°C 56°C 56°C 56°C
Az A. vitis AT1 törzs iaaM génjének detektálásához, amplifikálásához és szekvenálásához a 6. táblázatban feltüntetett specifikus primereket (iaM52, iaM31, iaM55, iaM53, iaM351, iaM331) alkalmaztuk.
33 A reakciók körülményei: 20 ng templát DNS, 1x Taq buffer, 0.2 mM dNTP, 1,5 mM MgCl2, 10 µM fw/rev primer, 1.25 U Taq polimeráz (Fermentas). Az alkalmazott programokat (IAM1 és IAM2) a 7. táblázat tartalmazza.
6. táblázat: A munka során felhasznált oligonukleotidok PRIMER pJET-F2 pJET-R2 iaM52 iaM31 iaM55 iaM53 iaM351 iaM331 iaM1F iaM1R iaM3F iaM3R pJPLB nptIIR EF1αFw EF1αRev EF1αRev opx05ssr1F opx05ssr1R
SZEKVENCIA 5’-3’ GAGCAGGTTCCATTCATTGTT CAGCCTGAAAATCTTGAGAGAA GGGGCGATGCGATTTCCTC GCGCCCTCCACCCATCC GCACAGTATTCCCCGATTCTCAAC CACATGTATCGGCAACCCTCGTAG CAAGCGCTGGACATGACTAATGA AGACGCCAAAATAAGGGTGACGAT ATCTGACAATGGTCGATAAG ACTGCTACCTTTCCACCA CCTTGAAATCAGGAGACATTAG CCAGATCCTATTCCCATTAG ATTCAATTGTAAATGGCTTCATG CATAGCCGAATAGCCTCTC GATTGACAGGCGATCTGGCAAG CTTTGCTGCAGACTTGGTGAC GTTTCTTGATTCCATTGTTTGTA TTAGGAACTTCGACAACATTG
7. táblázat: A munkánk során alkalmazott további PCR programok IAM1
IAM2
Sequence
1. 2:00 94°C
2:00 95°C
1:00 96°C
2. 0:30 94°C
0:30 95°C
0:20 96°C
3. 0:30 58°C
0:30 56°C
0:05 50°C
4. 1:20 72°C
1:00 72°C
4:00 60°C
5. 32x go to 2 32x go to 2 25x go to 2 6. End
End
End
4.11. DNS-szekvencia meghatározás és elemzés A munkánk során tisztított plazmid DNS minták és PCR fragmentek nukleotid szekvenciáját a megfelelő oligonukleotidok segítségével az MTA Szegedi Biológiai
34 Központ DNS Szekvenáló Laboratóriumában határozták meg a BigDye terminátor kit alkalmazásával, Applied Biosystems 373A szekvenáló készüléken (Perkin Elmer, Wellesley, MA USA). A reakciót 10 µl végtérfogatban mértük össze: 1 µg DNS, 2 µl BigDye, 3,2 pmol primer, 2 µl BigDye puffer megfelelő mennyiségű vízzel kiegészítve és a szekvenáló PCR reakcióhoz az alkalmazott (Sequence) programot a 7. táblázat tartalmazza. A részszekvenciákat a Chromas Pro (www.technelysium.com.au/ChromasPro.html) program segítségével ellenőriztük, javítottuk és a Lasergene (DNA Star Inc.) program segítségével illesztettük össze. A szekvenciák elemzésére az NCBI és a Genoscope honlapján elérhető V. vinifera genomprojekthez kapcsolt különböző funkciókat alkalmaztuk (BLAST elemzés, szekvencia lekérés): 1. www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/leuks.cgi 2. www.genoscope.cns.fr/cgi-bin/blast_server/projet_ML/blast.pl. 4.12. Primertervezés A specifikus primer párok tervezésénél ügyelnünk kellett arra, hogy közel azonos olvadási hőmérséklettel rendelkezzenek, ne képezzenek másodlagos szerkezeteket és specifikusan, stabilan kötődjenek (GC:AT arány 40-60% biztosítja) a DNS régiókhoz. Ezeket a kritériumokat, a DNASTAR PrimerSelected program és a Sequence Manipulation Suite
(SMS)
honlap
PCR
Primer
Stats
program
(http://www.bioinformatics.org/sms2/pcr_primer_stats.html) segítségével vizsgáltuk meg. Mindkettő elemzi a primerek GC-arányát, olvadási hőmérsékletét (Tm), a lehetséges PCR reakciót zavaró esetleges komplementer szakaszok meglétét. A V. vinifera 15. kromoszómájának szekvenciája és géntérképe az alábbi címeken érhető el:
www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_012021.2,
http://www.genoscope.cns.fr/
externe/Genome Browser/Vitis/. 4.13. Southern-hibridizáció A transzgenikus szőlőnövényekből izolált DNS mintákat (3 µg) a beépült T-DNS számának meghatározása érdekében PvuII vagy PaeI (Fermentas, Vilnius, Lithuania) enzimekkel emésztettük. A mintákat ezután 1%-os agaróz gélen futtattuk, majd kapilláris technika segítségével nylon membránra (Hybond-N+, Amersham) vittük át. A DNS hibridizációt Sambrook és mtsai szerint végeztük el (Sambrook et al., 1989).
35 Próbaként egy 692 bp fragmentet használtunk, mely a pJP17 konstrukció kanamicin rezisztencia génjének egy részét és a T-DNS LB határoló régióját tartalmazta. Felsokszorozásához a pJPLB és nptIIR oligonukleotidokat használtuk (6. táblázat) és az IAM1 PCR programot alkalmaztuk (7. táblázat). A DNS fragmentet (200 ng) a Pharmacia Ready-to-go labeling kit és rádioaktív [α32P] dCTP segítségével jelöltük. 4.14. RNS izolálás szőlőből Az RNS izoláláshoz 0,2 g szőlőlevelet, valamint szőlőszárat folyékony nitrogénben szétdörzsöltünk és 1 ml RNS kivonó puffert (2% CTAB, 2% PVP, 100 mM Tris, 25 mM EDTA, 2 M NaCl, 0,5 g/l spermidin, 2% β-Mercaptoethanol) adtunk hozzá (Hamiduzzaman et al., 2005. - módosítva). Mindezt jól összeráztuk és 5 percen keresztül 65°C-on tartottuk mialatt többször összekevertük. Ezután 10 percig jégen hűtöttük, majd 1 térfogatnyi izoamilalkohol-klorofom oldattal összeráztuk és 5 percig centrifugáltuk (4°C, 13000 rpm). A felülúszót új csőbe mértük és 1 térfogatnyi kloroformmal újból összeráztuk és centrifugáltuk (5 perc, 4°C, 13000 rpm). A felülúszót 1/3 térfogat 8M-os LiCl oldattal kevertük össze és éjszakán át 4°C-on állni hagytuk. Ezt követően a mintákat 20 percig centrifugáltuk (4°C, 13000 rpm), és a felülúszó leöntése után a csapadékot 300 µl 0,5%-os DEPC kezelt SDS oldatban oldottuk, majd azonos térfogatnyi kloroform oldattal ismét extraháltuk. Az elegyet 5 percig centrifugáltuk (4°C, 13000 rpm) és a felülúszóhoz 0,1 térfogatnyi 3M-os DEPC kezelt Na-acetát oldatot (pH 7,0), valamint 2 térfogatnyi 96%-os etanolt adtunk, majd -20°C-on inkubáltuk 2 órán át. Az inkubálást követően a mintákat 20 percig centrifugáltuk (4°C, 13000 rpm), majd 400 µl 70%-os etanollal mostuk. Az RNS pelleteket jégen szárítottuk, majd 40 µl RNáz mentes, DEPC kezelt vízben oldottuk és felhasználásig -80°C-on tároltuk. Az RNS minták minőségét 1,2%-os denaturáló agaróz gélen ellenőriztük (Sambrook et al., 1989). 4.15. cDNS szintézis Az RNS mintákat először DNáz kezeltük 20 µl végtérfogatban: 15 µl RNS-hez 2 µl MgCl2 tartalmú 10x DNáz puffert, 2,5 µl DEPC kezelt vizet és 0,5 µl DNáz enzimet (Deoxyribonuclease I, RNáz mentes, Fermentas) adtunk és a reakciót 1 órán át 37°C-on inkubáltuk, majd a DNáz enzimet 10 percig 75°C-on inaktiváltuk. A DNS mentes RNS oldatok koncentrációját és szennyezettségét NanoDrop 1000 UV/VIS spektrofotométer segítségével állapítottuk meg. A reverz transzkripcióhoz a RevertAid Premium First Strand cDNA Synthesis Kit-et alkalmaztuk (Fermentas).
36 A cDNS szintézist 300 ng totál RNS felhasználásával mértük össze: 12 µl DNázzal kezelt RNS-hez, 0,25 µl random primer oligonukleotidokat, 1 µl 10 mM-os dNTP-t, valamint 1,75 µl desztillált vizet adtunk és 5 percig 65°C-on inkubáltuk, majd pár percre jégre tettük hűteni. Ezután hozzámértünk 4 µl 5x reverz transzkriptáz puffert és 1 µl reverz transzkriptáz enzimet (Thermo Scientific Revertaid Premium, Fermentas), majd pedig 10 percig 25°C-on, 15 percig 50°C-on és 5 percig 85°C-on tartottuk. A cDNS oldatokat 0,2szeres koncentrációra hígítottuk. A reakciók sikerességét PCR reakció segítségével ellenőriztük az amplikonok 1,5%-os agaróz gélen történő gélelektroforézisével. A DNáz kezelés sikerességéről, vagyis hogy nem maradt szennyező genomi DNS a mintáinkban, a DNáz kezelt RNS minták PCR templátként való alkalmazásával győződtünk meg. 4.16. qPCR reakciók A kvantitatív valós idejű PCR vizsgálatokat (qPCR) Step One™ Real-Time PCR System segítségével végeztük (Applied Biosystems). A génexpressziós változások mérésére a Step One™ 2.0 számítógépes programba integrált, relatív kvantifikációt alkalmazó ún. ∆∆CT módszert (Livak és Schmittgen, 2001) alkalmaztuk. Belső kontrollként szőlő génexpressziós méréseknél az elongációs faktor gént (EF-1α) választottuk Szalontai Bálint mérései alapján (Szalontai et al., 2012). Az amplifikáció 20 µl térfogatban történt, amelybe összemértünk 10 µl ROX tartalmú Maxima™ SybrGreen 2xMix-et (Fermentas), 0,6 µl-t mindkét 10 pmol/µl koncentrációjú primerből, 8,5 µl vizet és 2 µl-t a hígított cDNS mintákból, a következő PCR programmal: 10 min elődenaturáció 95°C-on, amelyet 15 s denaturáció követett 95°C-on, 30 s tapadás 60°C-on, és 30 s elongáció 72°C-on, 45 cikluson keresztül. A mérések során 3 technikai replikátumot alkalmaztunk mintánként. Az amplikonok homogenitását minden esetben olvadási görbe felvételével ellenőriztük. Ennek során a reakció elegyet 95°C-ra melegítettük, majd 60°C-ra hűtöttük vissza. Ezt követően fokozatosan ismét denaturációs hőmérsékletre melegítettük, miközben 0,3°C-onként regisztráltuk a fluoreszcencia értékeket. Az alkalmazott primerek (iaM1F, iaM1R, iaM3F, iaM3R, EF1αFw, EF1αRev) szekvenciáit az 6. táblázat tartalmazza. 4. 17. A szőlő növények fenntartása A hibridcsaládot 2008 tavaszán ültettük ki szabadföldi magonctáblába a kecskeméti Szőlészeti és Borászati Kutatóintézet telephelyén. A magoncokat zölddugványozással szaporítottuk és üvegházban, természetes megvilágítás mellett neveltük.
37 In vitro körülmények között is szaporítottunk szőlő növényeket, 2-3 cm hosszúságú szárszegmensekből ½ MS (Murashige and Skoog, Duchefa) szilárd táptalajon (pH 5,8), melyet 10 g/l szacharózzal, 6 g/l agarral és Gamborg B5 vitaminnal egészítettünk ki [fotóperiódus: 12 óra megvilágítás/ 12 óra sötét]. A transzgenikus szőlőket a Budapesti Corvinus Egyetemen készítették, edzették üvegházi körülményekhez és szaporították. 4.18. Dohány transzformáció MS H1+ tápoldat: 4,4 g/l MS, 1% szacharóz, 0,055 mg/l tidiazuron (TDZ) és 0,050 mg/l naftil-ecetsav (NAA), táptalaj készítéséhez 0,6% agar hozzáadásával szilárdítottuk (kokultivációnál a 3% szacharóz az agrobaktérium vektor növekedésére gátló lehet). Először 20 ml MS H1+ tápoldatot mértünk 100 ml-es széles szájú Erlenmeyer lombikba, valamint kb. 40 ml MS tápoldatot külön kiöntöttünk a levelek darabolásához. A dohányleveleket Petri csészében, steril tápoldat alatt kb. 6-8 mm-es korongokra vágtuk, a főér kihagyásával. Kb. 20-24 korongot gyűjtöttünk össze 20 ml tápoldatban (széles szájú, 100 ml-es Erlenmeyer lombik). A 28oC-on 2 nap alatt szelektív táptalajon növesztett agrobaktériumokból (EHA101 pJP21, EHA101 pJP17) készített baktérium szuszpenziót és a fiatal dohánynövény levéldarabokat a kokultiváció során együtt tenyésztettük MS H1+ táptalajon. Fél kémcsövekbe 1 ml MS H1+ oldatot mértünk, ebben készítettük el a baktérium szuszpenziót (kb. 5x108sejt/ml), amiből 0,5 ml-t adtunk a levélkorongokhoz, majd enyhén összeráztuk. Kb. 20-25 perc után a levélkorongokat fonákkal felfelé kiraktuk MS H1+ táptalajra, két napig 25-27oC-on sötétben tartottuk a lemezeket. Ezután a levélkorongokat szelektív táptalajra tettük át. MS H3+ táptalaj: 4,4 g/l MS, 3% szacharóz, 0,055 mg/l tidiazuron (TDZ) és 0,050 mg/l naftil-ecetsav (NAA), 0,6% agar, 200 mg/l claforan + 100 mg/l kanamicin. A szelekciós médium tartalmazza a baktériumok megöléséhez szükséges antibiotikumot (claforán). 100 ml-es Erlenmeyer lombikokba 50-60 ml MS H1+ tápoldatot (TDZ és NAA nélkül) mértünk 200 mg/l claforánnal kiegészítve, ezekben történt a baktérium lemosása a levéldarabkák felületéről. Az alaposan lemosott levéldarabkákat ezután Petri csészékre tettük át, amikbe már az MS H3+ táptalajt kiöntöttük. A táptalajhoz a bakteriosztatikus claforán mellett szelekciós antibiotikumot (kanamicin 100 mg/l) is hozzámértünk, abból a célból, hogy a lemezen csak azok a már transzgenikus sejtek nőjenek, melyekbe a T-DNS integrálódott. A transzformáció gyakorisága alacsony, ezért szelekciós nyomás nélkül a nem transzformált sejtek túlnőnék a transzformáltakat. Fényszobában 23-27oC-on inkubáltuk.
38 Következő lépés a hajtásregeneráció. A korongokról izoláltuk a képződő kalluszokat és átraktuk az MS H3+ táptalajra, de ez már nem tartalmazott NAA hormont. A hajtásregenerációt a növényregeneráció követte, amikor is a képződött hajtásokat gyökereztetés céljából hormonmentes MS H1+ táptalajra helyeztük, de az antibiotikumokat nem hagytuk el. További in vitro szaporításra elég 1% szacharóz hozzáadása. A munkafolyamat utolsó lépése az üvegházra edzés, amikor a regenerálódott növényeket steril kerti talajra ültettük ki (közel semleges pH-jú), és kizárólag steril csapvízzel öntöztük. A páratartalmat egy hét után fokozatosan csökkentettük, további 10 napon keresztül. Amint a növények megedződtek, lehetett tápoldatozni, majd zölddugványozással elszaporítani őket a mesterséges agrobaktérium fertőzési kísérletekhez. 4. 19. Mesterséges agrobaktérium fertőzési tesztek A térképező populáció egyedeinek, valamint a transzgenikus dohány és szőlőnövények Agrobacterium törzsekkel szembeni fogékonyságát mesterséges fertőzéssel határoztuk meg. Az A. tumefaciens A348, C58, A. vitis Tm4, AT1 és S4 törzseket (1. táblázat) TA táptalajon két napig növesztettük 28oC-on, majd 0,9%-os NaCl oldatban szuszpendáltuk fel a kultúrákat (OD590= 0,2-0,5). A növények fiatal szárait két-három helyen szúrtuk át, a baktérium szuszpenzióba mártott lándzsatű segítségével. A térképező populáció esetében törzsenként 1-2 növény fertőzésére volt csak lehetőségünk. A növényeket üvegházi körülmények között neveltük és 6 hét után értékeltük a tumorképződéseket.
39 5. EREDMÉNYEK 5.1. EGY TERMÉSZETES AGROBAKTÉRIUM REZISZTENCIA GENETIKAI TÉRKÉPEZÉSE Az eddig még ismeretlen agrobaktérium rezisztencia lókusz térképezéséhez a Vitis amurensis eredetű rezisztenciát hordozó Kunbarát és a fogékony Sárfehér fajták keresztezésével létrehozott, BC2 (KS-2008) hibridcsalád egyedeit használtuk fel. Ezeket a növényeket Dr. Kozma Pál hozta létre a jelenlegi PTE TTK Szőlészeti és Borászati Intézetben és ő bocsátotta rendelkezésünkre. Első lépésben az utódokat le kellett vizsgálnunk a rezisztencia jelenlétének meghatározása érdekében, hogy ezek után specifikusan a rezisztencia génhez kapcsolt DNS markereket tudjunk keresni. A két munka egymással párhuzamosan haladt, a fenotípusos jellemzés érdekében végzett kísérleteket a teljes utódpopulációnak egyszerre csak egy kisebb részén tudtuk elvégezni, így a feltételezett agrobaktérium rezisztenciához kapcsolt markerek helyzetéről, kapcsoltságuk mértékéről csak több év munkája után kaptunk pontosabb képet. 5.1.1. A térképező populáció jellemzése agrobaktérium fertőzéssel A kísérletekhez összesen 272 magoncot használtunk fel, amiket Dr. Szegedi Ernő gondozott és szaporított a kecskeméti Szőlészeti és Borászati Kutatóintézetben (Budapesti Corvinus Egyetem) (6. ábra). Az ő irányításával végeztük a mesterséges agrobaktérium fertőzéses
kísérleteket
Kuczmog
Anettel
közösen.
A
272
utódnövény
8-9
zölddugványozással egyszerre történő elszaporítására (kb. 2500 növény), fenntartására és fertőzésére sajnos nem volt sem kapacitásunk, sem pedig lehetőségünk, ezért a munkát egy kisebb
csoporttal,
két
szülővel
és
27
magonccal
kezdtük
zölddugványozással szaporítottunk fel (8-9 dugvány növény vonalanként).
6. ábra: A növények nevelése az üvegházban.
meg,
melyeket
40 A további munka során egyszerre mindig hasonló mennyiségű növénnyel dolgozva folyamatosan bővítettük a vizsgált magoncok körét, ami végül elvezetett a teljes utódpopuláció jellemzéséhez. A rezisztencia természetének meghatározása érdekében, vagyis, hogy a rezisztencia jelenléte milyen típusú agrobaktériumokkal szemben nyújt védettséget, a fertőzésekhez az A. tumefaciens C58 (nopalin pTi), A. vitis Tm4 (oktopin/cucumopin pTi), AT1 (nopalin pTi) vagy S4 (vitopin pTi) különböző típusú Tiplazmiddal rendelkező baktériumokat használtuk. A fiatal növények szárait 2-3 helyen, a baktérium szuszpenzióba mártott lándzsatűvel megszúrtuk, majd 6 hét után kiértékeltük a tumorképződést (7. ábra).
7. ábra: Szenzitív (A, B, C) és rezisztens (D, E, F) növények: tumorképződés Ezt követően, mivel az eredmények egységes képet mutattak, vagyis ugyanazon növények klónjai voltak ellenállók vagy fogékonyak mindegyik baktériumtörzzsel szemben, a többi utódnövényt már csak az A. vitis AT1 és az A. vitis Tm4 törzsekkel fertőztük kétszeres ismétlésben, két egymást követő évben. Ezek között a növények között sem tapasztaltunk különbséget a két patogén törzzsel szembeni fogékonyságot illetően. A vizsgálatok során 43 növény esetében volt szükséges a fertőzések megismétlése, mivel a rezisztencia jelenléte vagy hiánya nem volt egyértelműen megállapítható. A későbbiekben ismétléseket végeztünk akkor is, amikor ellentmondást találtunk a térképezéshez használt egyes markerek jelenléte és a rezisztencia fenotípusa között. Végül a teljes utódpopuláció kiértékelését követően (3. év) 153 ellenálló és 119 fogékony utódot azonosítottunk. 5.1.2. Agrobaktérium rezisztenciával kapcsolt RAPD markerek jellemzése A Kunbarát és a Sárfehér fajták közötti DNS polimorfizmus meghatározása érdekében kutatócsoportunkban 3118 féle RAPD vizsgálatot végeztek el a szülői DNS mintákon.
41 Ebből 688 esetben kaptak polimorfizmust a rezisztens Kunbarát és 428 esetben a szenzitív Sárfehér fajtában. E markereket felhasználva kezdődhetett el a rezisztencia lókuszhoz kapcsolt RAPD markerek keresése az agrobaktérium rezisztenciára idő közben már jellemzett utódpopuláció segítségével (elsősorban Kuczmog Anett munkája). Ha valamelyik vizsgált marker kapcsoltságot mutatott a rezisztencia jelenlétével, akkor meghatároztuk a különbséget adó fragment szekvenciáját. A szekvencia meghatározáshoz az izolált fragmenteket a pJET1 vektorba klónoztuk és párhuzamosan több klón szekvenciáját is meghatároztuk. Ehhez a szekvenálásra javasolt eredeti pJET primerek helyett, amik túl közel voltak a klónozó helyhez és ezért félő volt, hogy az ismeretlen szekvencia eleje nem lesz pontosan olvasható, a munka során két távolabbi, a teljes nukleotid sorrend meghatározásra alkalmas szekvenáló primert terveztünk (pJET-F2 és pJET-R2, Anyagok és módszerek, 4.10. fejezet, 6. táblázat). A meghatározott szekvenciákat összehasonlítottuk az NCBI honlapján elérhető összesített nukleotidszekvencia adatbázissal (GenBank), később a V. vinifera genomprojekt adatbázisával (Genoscope), hogy adatokat nyerjünk az adott marker genomban elfoglalt helyzetéről (Anyagok és módszerek, 4.11. fejezet). Másrészt, a meghatározott nukleotid sorrend alapján primereket terveztünk a szekvencia két végére remélve, hogy velük valóban specifikusan egyetlen fragmentet tudunk felsokszorozni. Ha ez sikerült, az így előállított SCAR marker jelenlétét rezisztens és szenzitív utódok DNS mintáin teszteltük. Ha a létrehozott SCAR marker valóban kapcsoltságot
mutatott
a
rezisztencia
jelenlétével,
akkor
segítségével
a
teljes
utódpopulációt megvizsgáltuk, hogy megállapíthassuk a kapcsoltság pontos mértékét. A munka elején az OPU07 és az OPX05 dekamer primerekkel a rezisztenciával kapcsoltságot mutató, Kunbarát specifikus RAPD fragmenteket találtunk. Ezek vizsgálatába kapcsolódtam be. 5.1.2.1. Az OPU07.1 RAPD fragment jellemzése Az OPU07 primerrel elvégzett RAPD PCR reakció során a Kunbarát fajtában egy kb. 800 bp hosszúságú fragment is megjelent (OPU07.1), amely az előzetesen vizsgált 5 rezisztens utód DNS mintáiban megtalálható volt, az 5 szenzitív mintában viszont nem (8. ábra).
42
8. ábra: A polimorfizmust eredményező OPU07 primerrel kapott DNS fragment mintázat egyedszintű vizsgálata. L: 100 bp DNS Ladder Plus kontroll, R: rezisztens egyedek, Sz: szenzitív egyedek, K: Kunbarát, S: Sárfehér. A piros nyíl a rezisztensekben megjelenő polimorf fragmentet jelzi.
A fragment izolálását nehezítette, hogy hozzá közel egy másik 800 bp körüli fragment is keletkezett a reakcióban. Ennek megfelelően két független DNS-szekvenciát is kaptunk. Ezek közül az egyik 100%-os homológiát mutatott a Pinot noir 15. kromoszómájához (9. és 10. ábra), a másik viszont a genom ismeretlen részével mutatott hasonlóságot. cctgctcatcTCATTAACAAAACAAAAATTATTGTATTTCTCCCAGAGATGCAAAAG AAACAATTATAGAAGAGGAAATCCATAGAGAATATGGGTAGATCAAGTTCCCCATGA ATGGTTTCTGCTCTTTAGTCAAACGTATAATATTTGACATGCTAGAGTACCAAGTGA GATTCATATTCCTGACTCGAGTAATTTGAGTCAGTTCTATTAATTAATTGAAAATTT GATGCATATATAATTTAATAAACAAAAGATATAAAGATGAGCAAGGAACACGAACAA TGAAGGATTCATTAGCACCATAACCCAATGGCCTTAAGCAGAGTCACCAGACCCAAA CCAGAAATTGAGCCATTCTAGAAGCTGGATCATGGATCACCAGTCCAATAGTTATGA TGCAGCGTGTAGTGTTATTTTTTTTTTACCATTGGAGTTTACTTCATATTAGAACAT GTCTAGGGCAATGTGACTTATCCATTAGATGATTCATATCTCTTAGGTGTGTCAAGA TTTATGGTGACTCTTTTACGGTTTACACACATTTTCAATAGCCACAATTGAAGGTCA CTTCATGCATAGCTCAGGATGGAAAGAGTCTAGGTTTGGTCATGCTGCACTTTCATC TTTCATCATGTGCATAGATACCAACTCAAGTGTTCAGTTTGAGGGTAACTGGTTGAG CATCAAGTCCATGGTCATGCTTCTTCAAGTGTGCTGTTTATTAACTGGGCACCAGTA TGTGGGAATTTTTGGAGACGTGgatgagcagg 9. ábra: Az OPU07.1 RAPD fragment szekvenciája. A kisbetűk a szekvencia két végén az OPU07 dekamer RAPD primereket jelölik.
43 Query
3
Sbjct
9807
Query
63
Sbjct
9867
Query
123
Sbjct
9927
Query
183
Sbjct
9987
Query
243
Sbjct
10047
Query
303
Sbjct
10107
Query
362
Sbjct
10167
Query
422
Sbjct
10227
Query
482
Sbjct
10287
Query
542
Sbjct
10347
Query
602
Sbjct
10407
Query
662
Sbjct
10467
Query
722
Sbjct
10527
TGCTCATCTCATTAACAAAACAAAAATTATTGTATTTCTCCCAGAGATGCAAAAGAAACA ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||| TGCTCATCTCATTAACAAAACAAAAATTATTGTATTTCTCCTAGAGATGCAAAAGAAACA
62
ATTATAGAAGAGGAAATCCATAGAGAATATGGGTAGATCAAGTTCCCCATGAATGGTTTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||| ATTATAGAAGAGGAAATCCATAGAGAATATGGGTAGATCAAGTTCCTAATGAATGGTTTC
122
TGCTCTTTAGTCAAACGTATAATATTTGACATGCTAGAGTACCAAGTGAGATTCATATTC |||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGCTCTTTAGTCAAACATATAATATTTGACATGCTAGAGTACCAAGTGAGATTCATATTC
182
CTGACTCGAGTAATTTGAGTCAGTTCTATTAATTAATTGAAAATTTGATGCATATATAAT ||||||| ||||||||||||||| ||||| |||||||||||||| ||||||||||||||| CTGACTCAAGTAATTTGAGTCAGATCTATKAATTAATTGAAAATYTGATGCATATATAAT
242
TTAATAAACAAAAGATATAAAGATGAGCAAGGAACACGAACAATGAAGGATTCATTAGCA |||| ||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTAAYAAACAAAAGATATAAAGRTGAGCAAGGAACACGAACAATGAAGGATTCATTAGCT
302
CCATAACCCAATGGCCTTAAGC-AGAGTCACCAGACCCAAACCAGAAATTGAGCCATTCT |||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCATAACCCAATGGCCTTAAGCAAGAGTCACCAGACCCAAACCAGAAATTGAGCCATTCT
361
AGAAGCTGGATCATGGATCACCAGTCCAATAGTTATGATGCAGCGTGTAGTGTTAttttt |||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||| AGAAGCTGGATCATGGATCACCAGTCCAATRGTTATGATGCAGCGTGTAGTGTTATTTTT
421
tttttACCATTGGAGTTTACTTCATATTAGAACATGTCTAGGGCAATGTGACTTATCCAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTTTTACCATTGGAGTTTACTTCATATTAGAACATGTCTAGGGCAATGTGACTTATCCAT
481
TAGATGATTCATATCTCTTAGGTGTGTCAAGATTTATGGTGACTCTTTTACGGTTTACAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TAGATGATTCATATCTCTTAGGTGTGTCAAGATTTATGGTGACTCTTTTACGGTTTACAC
541
9866
9926
9986
10046
10106
10166
10226
10286
10346
ACATTTTCAATAGCCACAATTGAAGGTCACTTCATGCATAGCTCAGGATGGAAAGAGTCT |||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACATTTTCAATAGCYACAATTGAAGGTCACTTCATGCATAGCTCAGGATGGAAAGAGTCT
601
AGGTTTGGTCATGCTGCACTTTCATCTTTCATCATGTGCATAGATACCAACTCAAGTGTT ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||| AGGTTTGGTCATGCTGCACTTTCATCTTTCATCATGTGCATAGATACCAACTCAAATGTT
661
CAGTTTGAGGGTAACTGGTTGAGCATCAAGTCCATGGTCATGCTTCTTCAAGTGTGCTGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAGTTTGAGGGTAACTGGTTGAGCATCAAGTCCATGGTCATGCTTCTTCAAGTGTGCTGT
721
TTATTAACTGGGCACCAGTATGTGGGAATTTTTGGAGACGTGGATGAGCAGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||| || |||||||||||| TTATTAACTGGGCACCAGTATGTGGGAATTTTTGGATACATGGATGAGCAGG
10406
10466
10526
773 10578
10. ábra: A 15. kromoszómához talált homológia (AM476364, 17165 bp DNA).
Az első meghatározott szekvencia (9. ábra) két végére primereket terveztünk, hogy megvizsgáljuk, fel lehet-e velük specifikusan, csak a rezisztenciához kapcsolt régiót sokszorozni. Bár erre nem láttunk sok esélyt, mert a teljes régió homológ volt a Pinot noir szekvenciával, így nem valószínű, hogy az ide tervezett primerekkel polimorfizmust tudnánk kimutatni. A tervezett primerek (OPU07.1sc FW, OPU07.1sc REV, 5. táblázat) mindkét szülőben felsokszoroztak egy kb. 800 bp hosszúságú szakaszt, valamint a rezisztens Kunbarát szülőben egy kb. 1250 bp nagyságú extra fragmentet is.
44 Ezután 5 ellenálló és 5 fogékony utódon is teszteltük a primereket, amikor is mindegyik utódban megjelent a kb. 800 bp hosszúságú fragment, a nagyobb, kb. 1250 bp hosszúságú fragment pedig nem mutatott kapcsoltságot a rezisztencia jelenlétével, mivel voltak olyan rezisztens utódok, melyekben nem volt jelen és voltak olyan szenzitív utódok is, melyekben keletkezett a fragment, vagyis a tervezett primerek nem működtek SCAR markerként. Az, hogy az OPU07 RAPD primerrel kaptunk egy rezisztencia-specifikus fragmentet is, arra utalt, hogy a cctgctcatc szekvencia egymással szemben 800 bp távolságra csak a Kunbarát fajta rezisztenciát hordozó kromoszómáján található meg. (Vagy két nagyon hasonló szekvenciának kell a megfelelő helyeken lennie.) Úgy gondoltuk, hogy a polimorfizmus pontos természete megállapítható, ha a meghatározott szekvenciától 5’ és 3’ irányban kb. 100-200 bp távolságban további primereket tervezünk a Pinot noir szekvencia alapján. Az új primerekkel (OPU07.1Fw, OPU07.1Rev, 5. táblázat) mind a Kunbarát, mind a Sárfehér szülői mintákból fel tudtunk sokszorozni egy DNS-szakaszt, ezeket a PCR fragmenteket szintén pJET1 vektorba klónoztuk. Ezek után összesen 5 - 5 független klón szekvenciáját határoztuk meg, azonban a keresett polimorfizmust, ami magyarázná, hogy miért keletkezik a rezisztens szülőben ez a különbséget adó OPU07.1 RAPD fragment, nem sikerült megtalálni. Idő közben Kuczmog Anett térképező munkájának eredményei alapján kiderült, hogy ez a marker a rezisztencia lókusztól viszonylag távolabb helyezkedik el, ezért a további munkánkban a közelebbi markerek vizsgálatára fókuszáltunk, így az OPX05 markerre. 5.1.2.2. Az OPX05.1 RAPD fragment jellemzése A Kunbarát fajtában az OPX05 RAPD primerrel egy 700 bp nagyságú fragment is keletkezett (OPX05.1), mely az előzetes vizsgálatok során az 5 rezisztens utód mintáiban is felsokszorozódott, az 5 szenzitívben viszont nem volt jelen. A rezisztens szülői mintában keletkezett fragmentet klónoztuk, majd meghatároztuk több klón szekvenciáját is (11. ábra). >opx05-1 tccccaAATAAGTTTTTTTTTGTGTTTTTTGTTTTTAAGAACAGAAAATAGTTCTTGAAAACA AAACCAAGTAGACCCTTAGATTCATAATTTAAGAATTATTTCATCAATTCTAACCAAATATTT TTTATATTTATTGCTTTATGTCTTGATTTTATTCATTTATATCTAATCTTAATATTTTGTTTC TTGATTCCATTGTTTGTACATTCATTCAAATGTTTATAATTTTCATAAGTTTTCAACGTAGAG ATTAAAAGTTGATTCCATGTGTATTTTATTACCTTATTTTTTTTTTTTTTATACTTATATTAA TACTTATATTCTTGTATGCATATTTTCACTTTAAAATTATACGGAAACATCCATGATTCAAAT TGAATCACACAATGTTGTCGAAGTTCCTAAATCCTAATACCCTCTGATTTCATAATCCAAAAA TGGAAACGTGGCCAAGGAAGTTAAATAtgggga
11. ábra: Az OPX05.1 RAPD fragment szekvenciája és a tervezett primerek helyzete.
45 A BLASTN elemzés segítségével megállapítottuk, hogy az OPX05.1 RAPD fragment részleges homológiát mutat a Pinot noir 15. kromoszóma egy részletével (12. ábra). Az összehasonlításból kiderült (12. ábra), hogy a Pinot noir szekvenciában ez a régió egy hosszú AT dinukleotid ismétlődést tartalmaz, tehát mikroszatellita régió. Ennek a régiónak a két oldalára primereket terveztünk (opx05ssr1F, opx05ssr1R; 12. ábra és 6. táblázat) remélve, hogy SCAR vagy miroszatellita (SSR) markert tudunk így létrehozni. Score = 542 bits (600), Expect = 2e-152 Identities = 395/467 (84%), Gaps = 47/467 (10%) Strand=Plus/Plus Query
4
Sbjct
583186
Query
63
Sbjct
583244
Query
123
Sbjct
583304
Query
183
Sbjct
583364
Query
243
Sbjct
583424
Query
291
Sbjct
583484
Query
319
Sbjct
583544
Query
379
Sbjct
583604
CAAATAAGtttttttttgtgttttttgtttttAAGAACAGAAAATAGTTCTTGAAAACA|||| |||||||||| ||| ||||||||| || ||||||||||| |||||||||| | CAAACAAGTTTTTTTATGT--TTTTTGTTTACAATAACAGAAAATAATTCTTGAAAATAG
62 583243
AAACCAAGTAGACCCTTAGATTCATAATTTAAGAATTATTTCATCAATTCTAACCAAata |||| || ||||||||||||||| ||||| ||||||||||||||||||||||||||||| AAACTAAACAGACCCTTAGATTCACAATTTGAGAATTATTTCATCAATTCTAACCAAATA
122
ttttttatatttattgctttatgtcttgattttattcatttatatctaatcttaatattt |||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||| ||| ||| TTTTTTATATTTATTGCTTTATATCTTGATTTTATTCATTTATATCTAATCTCAATCTTT
182
tgtttCTTGATTCCATTGTTTGTACATTCATTCAAATGTTTATAATTTTCATAAGTTTTC ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||| TGTTTCTTGATTCCATTGTTTGTACATTCATTCAAATATTTATAATTTTCATAAGTTTTC
242
AA-CGTAGAGATTAAAAGTTGATTCCATGTGTATTTTATTACCTTAttt----------|| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AATGGTAGAGATTAAAAGTTGATTCCATGTGTATTTTATTACCTTATTTATATATATATA
290
583303
583363
583423
583483
--------------------------------tttttttttttATACTTATATTAATACT | | | | | |||||||||||| ||||| TATATATATATATATATATATATATATATATATATATGTATGTATACTTATATTTATACT
318
TATATTCTTGTATGCATATTTTCACTTTAAAATTATACGGAAACATCCATGATTCAAATT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TATATTCTTGTATGCATATTTTCACTTTAAAATTATACGGAAACATCCATGATTCAAATT
378
GAATCACACAATGTTGTCGAAGTTCCTAAATCCTAATACCCTCTGAT ||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||| GAATCGCACAATGTTGTCGAAGTTCCTAAATCCTAATACCCTTTGAT
583543
583603
425 583650
12. ábra: Az OPX05.1 szekvencia illesztése a megfelelő Pinot noir szekvenciához.
A további kísérletek bizonyították, hogy a primertervezés sikeres volt, mivel a kiválasztott 3 rezisztens utód mintáiban specifikusan a rezisztenciához kapcsolt fragment (268 bp) sokszorozódott fel, a 3 szenzitív egyedből származó mintákban pedig ez a termék nem keletkezett (13. ábra).
46
13. ábra: Az OPX05.1 szekvencia segítségével kifejlesztett marker. R: rezisztens utódok, Sz: szenzitív utódok, K: Kunbarát, S: Sárfehér, L: 100 bp DNS Ladder Plus kontroll. A piros nyíl a polimorfizmust mutató fragmentet jelzi.
Ezek után az OPX05sc markert az összes utód DNS mintáin teszteltük (Kuczmog Anett munkája) melynek segítségével megállapítható volt, hogy erősen kapcsolt a természetes rezisztenciát biztosító Rcg1 lókuszhoz, így ez a DNS marker az általunk megszerkesztett genetikai térkép egyik eleme lett. Meghatároztuk a Kunbarát fajtából származó, a rezisztenciával nem kapcsolt OPX05.98 névvel jelzett nagyobb DNS-fragment szekvenciáját is. A 14. ábra mutatja, hogy a rezisztenciához kapcsolt fragmenttel ellentétben, ez tartalmazza a Pinot noir genomban is meglévő dinukleotid ismétlődés egy rövidebb változatát. opx05_98 vvchr15 opx05_1
GTTTCTTGATTCCATTGTTTGTACATTCATTCAAATATTTATAATTTTCATAAGTTTTCA 60 GTTTCTTGATTCCATTGTTTGTACATTCATTCAAATATTTATAATTTTCATAAGTTTTCA 60 GTTTCTTGATTCCATTGTTTGTACATTCATTCAAATGTTTATAATTTTCATAAGTTTTCA 60
opx05_98 vvchr15 opx05_1
ATGGTAGAGATTAAAAGTTGATTCCATGTGTATTTTATTACCT--TTTatatatatatat 118 ATGGTAGAGATTAAAAGTTGATTCCATGTGTATTTTATTACCTTATTTatatatatatat 120 ACG-TAGAGATTAAAAGTTGATTCCATGTGTATTTTATTACCT------------tat-t 107
opx05_98 vvchr15 opx05_1
atatatatat------------------------------GTATACTTATATTTATACTT 148 atatatatatatatatatatatatatatatatatatGTATGTATACTTATATTTATACTT 180 -t-t-t-t-t-t-t-t-t-t-t-------------------TATACTTATATTAATACTT 136
opx05_98 vvchr15 opx05_1
ATATTCTTGTATGCATATTTTCACTTTAAAATTATACGGAAACATCCATGATTCAAATTG 208 ATATTCTTGTATGCATATTTTCACTTTAAAATTATACGGAAACATCCATGATTCAAATTG 240 ATATTCTTGTATGCATATTTTCACTTTAAAATTATACGGAAACATCCATGATTCAAATTG 196
opx05_98 vvchr15 opx05_1
AATCGCACAATGTTGTCGAAGTTCCTAA 236 AATCGCACAATGTTGTCGAAGTTCCTAA 268 AATCACACAATGTTGTCGAAGTTCCTAA 224
14. ábra: A Kunbarát fajtából izolált OPX05.1 és OPX05.98 szekvenciák összehasonlítása a Pinot noir szekvenciával (vvchr15) - többszörös illesztés ClustalW program segítségével. A Pinot noir szekvenciától eltérő részeket szürke háttérrel, a mikroszatellita szekvenciát kis betűkkel, a PCR reakcióban használt primer szekvenciákat aláhúzással jelöltük.
47 Ezzel a Kunbarát fajta mindkét allélját jellemeztük, melyek közül az egyik (OPX05.1) a rezisztenciát hordozó, V. amurensis eredetű kromoszóma része, míg a másik (OPX05.98) a Kunbarát fajta másik felmenőjéből, az Italia fajtából származó, rezisztenciát nem hordozó kromoszóma jellegzetes allélja.
5.2 MESTERSÉGES AGROBAKTÉRIUM REZISZTENCIA KIALAKÍTÁSA Kísérleteinkben egy géncsendesítésre tervezett vektor konstrukcióval dolgoztunk (pJP17, Lee et al., 2003), amely az iaaM és ipt onkogének gátlására alkalmas, szensz és antiszensz RNS molekulák képződését biztosítja (2.5.2. fejezet, 5. ábra). A konstrukcióval sikerült agrobaktérium fertőzéssel szemben ellenálló transzgenikus szőlőket létrehoznunk. 5.2.1. A pJP17 konstrukció hatásának ellenőrzése transzgenikus dohányokon A transzgenikus szőlő létrehozása hosszadalmas és munkaigényes folyamat, amely kooperációs partnerünk, Dr. Oláh Róbert laboratóriumában (Budapesti Corvinus Egyetemen) valósult meg. E munka előtt szerettünk volna meggyőződni arról, hogy a rendelkezésünkre bocsájtott pJP17 géncsendesítő konstrukció (2.5.2. fejezet, 5. ábra) valóban alkalmas agrobaktérium rezisztens transzgenikus növények létrehozására. Azt is meg kívántuk vizsgálni, hogy az így elkészített növények milyen agrobaktérium rezisztencia spektrummal rendelkeznek. Munkánk során ezért először az általunk kevésbé időigényesnek és viszonylag könnyebben kivitelezhetőnek gondolt transzgenikus dohányok létrehozását határoztuk el, amihez Dr. Fehér Attila és Dr. Szegedi Ernő nyújtottak elméleti és gyakorlati segítséget. A 4.18. fejezetben leírtak szerint, úgy 6-9 hónap alatt, 16 transzgenikus dohány vonalat sikerült
regeneráltatnunk
levélkorong
transzformáció
segítségével. Az
üvegházi
körülményekhez hozzáedzett fiatal növények szárait 2-3 helyen előzetesen a baktérium szuszpenzióba mártott lándzsatűvel megszúrtuk és a tumorfejlődést 6 hét elteltével értékeltük ki. Minden baktériummal vonalanként 2-2 növényt fertőztünk. A rezisztencia spektrum megállapításához az A. tumefaciens A348, C58, A. vitis Tm4, AT1 és S4 baktériumokat alkalmaztuk. A 16 egyedi transzgenikus dohányvonal közül 7 dohány vonalat sikerült levizsgálnunk minden baktériummal, a többi növény a kiültetés után, még a kísérletek elvégzése, illetve kiértékelése előtt elpusztult.
48 A létrehozott pJP17 transzgenikus dohányok között voltak olyan vonalak, amiken az A. tumefaciens A348 és C58 baktériumok nem tudtak tumort létrehozni, a másik három A. vitis törzs minden esetben tumorképződést indukált a növényeken (8. táblázat, 15. ábra). Eredményeink szerint a pJP17 vektor valóban alkalmas mesterséges agrobaktérium rezisztencia kialakítására, azonban ez a rezisztencia erősen Agrobacterium törzs függő lehet. Azokban a vonalakban, ahol egyáltalán nem alakult ki rezisztencia feltételezzük, hogy a géncsendesítő konstrukció sérült vagy a kromoszómális környezet befolyásolta a csendesítő szekvencia expresszióját. Ezt a továbbiakban nem vizsgáltuk. 8. táblázat: Transzgenikus dohányvonalak
A transzgenikus dohányvonalak jellemzése A fertőzéshez használt Agrobacterium törzsek1 A.t.A348
A.t.C58 A.v.Tm4
A.v.AT1
N1 R R sz sz N3 sz sz sz sz N4 R R sz sz N7 sz sz sz sz N11 sz sz sz sz N12 R R sz sz N13 sz sz sz sz 1 ( ) A.t.: A. tumefaciens; A.v.: A. vitis, R: rezisztens, sz: szenzitív
A
B
C
A.v.S4 sz sz sz sz sz sz sz
D
15. ábra: Agrobacterium törzsek tumorképzése dohánynövényeken. A: A. tumefaciens A348 által létrehozott tumor nem transzgenikus dohányon, B: A. tumefaciens C58 által létrehozott tumor nem transzgenikus dohányon, C: A. tumefaciens A348 által fertőzött N4 transzgenikus ellenálló dohányvonal, D: A. tumefaciens C58 által fertőzött N4 transzgenikus ellenálló dohányvonal
49 5.2.2. pJP17 transzgenikus szőlővonalak előállítása és előzetes jellemzése A Vitis berlandieri x V. rupestris Richter 110 oltásra előkészített alany szomatikus embrió sejtjeinek Agrobacterium tumefaciens EHA101 (pJP17) baktériummal történő transzformációja után másodlagos embriógenezis útján másfél év alatt kaptunk transzformált növényeket (Oláh et al., 2003). A sikeresen regenerált 21 pJP17 transzgenikus szőlővonalat Dr. Oláh Róbert és Dr. Zok Anikó nevelték a Budapesti Corvinus Egyetemen és bocsátották rendelkezésünkre a további vizsgálatok elvégzéséhez, miután üvegházi körülményekhez edzették a növényeket. A transzgenikus növényeket kanamicin rezisztencia alapján szelektálták, majd DNS izolálás után PCR analízis segítségével igazolták a bevitt gének jelenlétét (nptII szelekciós marker gén, iaaM szekvencia) és egy, a T-DNS szekvencián kívül elhelyezkedő virulencia régió felsokszorozásának hiányával bizonyították a növényi minták agrobaktérium mentességét. A rezisztencia jelenlétének és spektrumának megállapítása céljából a vegetatívan felszaporított transzgenikus növényeken mesterséges agrobaktérium fertőzést végeztünk. Mind a 21 transzgenikus szőlővonalat teszteltük A. tumefaciens A348, C58, A. vitis Tm4, AT1 és S4 baktériumokkal. A fiatal növények szárait a nóduszokhoz közel 2-3 helyen előzetesen a baktérium szuszpenzióba mártott lándzsatűvel megszúrtuk, majd 6 hét elteltével kiértékeltük a tumorképződést (16. ábra).
16. ábra: Tumorteszt eredménye transzgenikus szőlőn. Fogékony és ellenálló növények, a fekete nyilak a sebzési helyeket, illetve a tumorokat mutatják. A vizsgálatok eredményei alapján 8 növény mutatott rezisztenciát az A. tumefaciens A348 törzzsel szemben, amely azt a Ti plazmidot hordozza, amelynek szekvenciája alapján a géncsendesítésre alkalmas vektorkonstrukció készült, és ezek között találtunk 3 olyan vonalat is, amelyek ezen felül az A. vitis AT1 baktériummal szemben is rezisztensek lettek.
50 Az A. tumefaciens C58, A. vitis Tm4 és S4 baktériumokkal szemben kivétel nélkül mind a 21 tesztelt vonal fogékonynak bizonyult. A 9. táblázat a részletesebben jellemzett vonalak tulajdonságait foglalja össze. 9. táblázat: A transzgenikus szőlővonalak jellemzése A tumortesztben felhasznált növények Transzgenikus vonalak
RNS szint (1)
qPCR eredmények A tumefaciens
A. vitis
T-DNS beépülés
RQ
RQmin/RQ max (CI:95%)
A348
AT1
N°3
R
R
1
119,2
107,0/132,8
N°5
sz
sz
1
2,2
1,9/2,6
N°19
R
sz
1
51,5
47,8/55,5
N°23
R
R
1
78,9
69,7/89,4
N°35
sz
sz
1
2,9
2,7/3,0
N°38(2)
sz
sz
2
1
0,4/1,8
N°43
R? (1/3)
R ?(2/3)
1
18,8
17,5/20,3
N°57
R
sz
1
93,7
83,5/105,3
N°58
R
R
1
61,4
57,2/65,9
N°61
sz
sz
1
9
7,9/10,3
R110(3)
sz
sz
0
0
0
(R) rezisztens, (sz) szenzitív, RQ: „relative quantification”, relatív génexpresszió mértéke, RQmin/RQmax: a mért RQ értékek tartománya (1) A pJP17 plazmidból beépült T-DNS konstrukcióról átíródó szensz és antiszensz iaaM szekvencia relatív expressziós szintje. (2) Erre a transzgenikus vonalra normalizáltuk a többi növény expressziós szintjét. (3) Nem transzformált szülői vonal.
51 5.2.3. A legtöbb transzgenikus vonal egy példányban hordozza a géncsendesítő konstrukciót A vizsgálatokhoz 5 ellenálló és 5 fogékony szőlőből származó DNS mintát használtunk fel. Először meghatároztuk a pJP17 plazmid LB oldali szekvenciáját, hogy tudjuk, pontosan milyen restrikciós hasítóhelyek találhatók ezen az adott szakaszon és, hogy a próbának szánt DNS-szakaszt PCR reakcióval fel tudjuk sokszorozni (17. ábra a szekvenciával). Az eredmények alapján a mintákat PvuII és PaeI enzimekkel emésztettük meg. caatggaaattatctgcctaaccggctcagttctgcgtagaaaccaacatgcaagctccaccgggtgcaaagcggcagc GGCGGCAGGATATATTCAATTGTAAatggcttcatgtccgggaaatctacatggatcagcaatgagtatgatggtcaat atggagaaaaagaaagagtaattaccaattttttttcaattcaaaaatgtagatgtccgcagcgttattataaaatgaa agtacattttgataaaacgacaaattacgatccgtcgtatttataggcgaaagcaataaacaaattattctaattcgga aatctttatttcgacgtgtctacattcacgtccaaatgggggcttagatgagaaacttcacgatcgcctcgagacgaca atctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttgg aactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactgagccgcgggtttctggagtttaatgagctaagcacatacgtcaga aaccattattgcgcgttcaaaagtcgcctaaggtcactatcagctagcaaatatttcttgtcaaaaatgctccactgac gttccataaattcccctcggtatccaattagagtctcatattcactctcaatccaaataatctgcagaattccccggat cgtttcgcatgatgaacaagatggATGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGG CACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGAC CGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGC GCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGT CATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTAC CTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGAT GATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGG
17. ábra: A pJP17 vektoron lévő T-DNS szekvenciájának részlete. Szürke kiemelés: T-DNS left border (LB) szekvencia; nagybetűs rész: az nptII kódoló régiója; sárga kiemelés: PvuII hasítóhely; kék kiemelés: PaeI hasítóhely. Az aláhúzott részek a szekvencia részleges meghatározására és a hibridizációs próba készítéséhez használt pJPLB-1 és nptII-R primerek helyzetét jelölik.
A DNS alapú Southern analízis során megállapítottuk, hogy a 10 vizsgált transzgenikus szőlővonal közül csak egy szenzitív vonal tartalmazott kétszeres T-DNS beépülést, a többi 9 vonal esetében egyszeres T-DNS kópiaszámot azonosítottunk (18. ábra, 9. táblázat), vagyis a T-DNS beépülésének mennyisége és a rezisztencia megjelenése között nem találtunk összefüggést.
52
18. ábra: A pJP17 T-DNS beépülésének ellenőrzése (autoradiogram). +K: pJP17 plazmid emésztve PaeI enzimmel, R110: nem transzformált szőlő DNS minta PaeI és PvuII enzimekkel emésztve, 3: No3 transzgenikus szőlő DNS minta PaeI és PvuII enzimekkel emésztve, 5: No5 transzgenikus szőlő DNS minta PaeI és PvuII enzimekkel emésztve, 19: No19 transzgenikus szőlő DNS minta PaeI és PvuII enzimekkel emésztve
5.2.4. A géncsendesítő konstrukciók expressziója a transzgenikus vonalakban Az agrobaktérium fertőzések alapján nyolc növény mutatott rezisztenciát az A. tumefaciens A348 törzzsel szemben. Ezek közül három vonal az A. vitis AT1 baktériummal szemben is rezisztens lett (9. táblázat az eredményekkel). Annak érdekében, hogy kiderítsük, van-e összefüggés a szélesebb rezisztencia megjelenése és a géncsendesítést kiváltó iaaM szekvencia kifejeződési szintje között real-time PCR kísérleteket végeztünk. A vizsgálatokhoz 5 ellenálló és 5 fogékony transzgenikus szőlőből származó RNS mintát használtunk fel és valós idejű PCR kísérleteket végeztünk, amiben megvizsgáltuk az iaaM szekvencia kódoló és nem kódoló szálának (sense és antisense, iaM1F, iaM1R, 6. táblázat, 19. ábra) átírási szintjét. E szekvencia tekintetében a rezisztens növényekben (No3, No19, No23, No57, No58) 50-120-szor magasabb kifejeződési szintet mértünk (RQ: relative quantification, relatív génexpresszió mértéke) a szenzitív növények kifejeződési szintjéhez képest (9. táblázat). Az A348 mellett megjelenő további AT1 rezisztencia és a vizsgált expressziós szint között nem tapasztaltunk összefüggést, mivel találtunk olyan ellenálló növényt (No. 57) ami csak az A348 törzzsel szemben volt rezisztens és az expressziós szintje magasabb volt (RQ=93,7) egy másik A348 és AT1 törzsekkel szemben rezisztens növény (No. 58) expressziós szintjéhez képest (RQ=61,4).
53
19. ábra: A qPCR során használt primerek és a hibridizáció során felhasznált próba helyzete. Az első nyilak az iaM1F-iaM1R, a második nyíl páros az iaM3F-iaM3R primerek helyzetét jelöli, a fekete csík pedig a hibridizációs kísérletben használt próba.
A géncsendesítést kiváltó duplaszálú RNS a két egymással szemben elhelyezkedő promoterről (CaMV és FMV) átíródó szensz és antiszensz szálak összekapcsolódásával jön létre. Kísérleteink során ezeknek a szensz és antiszensz szálaknak a keletkezését is vizsgáltuk a szálakra külön-külön specifikus (iaM3F, iaM3R, 6. táblázat, 19. ábra) primerekkel, azonban kifejeződési szintjük között szignifikáns különbséget nem találtunk. Néhány korábbi tanulmányból ismert, hogy a szőlőt fertőző különböző típusú agrobaktériumok, mint pl. a nopalin, oktopin típusú A. tumefaciens, vagy a nopalin, oktopin, vitopin típusú A. vitis törzsek magas genetikai diverzitást mutatnak, ezért elképzelhető, hogy az iaaM szekvenciák különbözősége magyarázza az eltérő rezisztencia spektrumot. A továbbiakban a kísérleteinkben felhasznált agrobaktériumokból származó iaaM szekvenciákat szerettük volna összehasonlítani számítógépes elemzés segítségével, ehhez azonban először az A. vitis AT1 törzs iaaM szekvenciáját meg kellett határoznunk, mert ez a szekvencia az adatbázisban nem volt megtalálható. 5.2.5. Az A. vitis AT1 törzs iaaM gén szekvenciájának meghatározása A GeneBank nukleotid szekvencia adatbázisban megtalálható Agrobacterium törzsek ismert iaaM szekvenciáit a ClustalW program segítségével illesztettük és ez alapján a konzerválódott részeket figyelembe véve, a kódoló szekvencián belül terveztünk primereket (iaM52, iaM31, 20. ábra) az A. vitis AT1 iaaM szekvencia felsokszorozására. Egy 1277 bp hosszúságú fragmentet sikerült felsokszoroznunk, amit agaróz gélből izoláltunk, majd pBS klónozó vektor EcoRV helyére építettünk. A pozitív klónok kiválogatása során különböző restrikciós enzimekkel való emésztésekből kiderült, hogy körülbelül a szekvencia közepén van egy EcoRV hasítóhely. Ennek felhasználásával a szekvencia biztonságos átolvasásához deléciós származékokat készítettünk, melyek segítségével a teljes szekvenciát, mindkét szálon meg tudtuk határozni.
54 Ez a megismert szekvencia az A. vitis Tm4 iaaM génnel mutatta a legnagyobb (97%) azonosságot, ezért a továbbiakban ezt vettük alapul a primerek tervezésénél, hogy az AT1 törzs iaaM gén teljes kódoló régiójának szekvenciáját felsokszorozzuk és meghatározzuk. Így a Tm4 törzsből ismert, a kódoló régió előtti és utáni szakaszokra és az újonnan megismert AT1 iaaM középső szekvencia 5’ és 3’ végeire terveztünk újabb primereket (iaM55, iaM53, iaM351, iaM331, 20. ábra) bízva benne, hogy a génen belüli erősebb homológia folytatódik ezekben a régiókban is (4.10. fejezet, 6. táblázat).
20. ábra: Az iaaM gén szekvenálásához használt primerek.
Ezekkel a primerekkel sikerült meghatároznunk a gén 5’ és 3’ kódoló végeit is, végül a három részletben megismert szekvenciát egy teljes kódoló régióvá illesztettük össze (21. ábra). Az általunk meghatározott DNS szekvencia elérhető az NCBI nukleotid szekvencia adatbázisban (FN669137).
21. ábra: Az iaaM gén szekvencia illesztése. A leolvasott szekvenciák illesztési stratégiája, az 5’, középső és 3’ végi átfedő szekvenciák összeillesztése.
Sokszoros illesztéssel (Clustal W) vizsgálva az iaaM kódoló szekvenciákat az A. tumefaciens A348 és C58 törzsek szekvenciái között 94%-os azonosságot, míg az A. tumefaciens A348 és az A. vitis AT1, valamint az A. tumefaciens A348 és A. vitis Tm4 iaaM szekvenciák között 89%-os homológiát találtunk.
55 Az RNS indukálta géncsendesítő komplex (RISC) egy 21 bp hosszúságú komplementer szakasz segítségével ismeri fel a megfelelő mRNS szekvenciákat, ezért megvizsgáltuk azt is, hogy a C58 és az AT1 iaaM szekvenciákban hány olyan részlet található, amely az A348 iaaM szekvenciával, legalább 21 bp hosszan azonos. Az A348 és C58 iaaM szekvenciák között 44 db 21-41 bp hosszan 100%-ban homológ szekvenciát találtunk, az A348 és az AT1 iaaM szekvenciái között pedig csak 25 ilyen régió volt. Az összehasonlítások egy részletét mutatja a 22. ábra. Ez az eredmény nem függ össze a géncsendesítés törzs specifikus megnyilvánulásával és nem magyarázza, hogy miért az AT1 törzzsel szemben jelenik meg rezisztencia, és nem pedig a C58 törzzsel szemben, mikor ez utóbbinak magasabb az iaaM szekvencia azonossága.
22. ábra: Azonos szekvencia részletek az iaaM gének között (részlet). Az A. tumefaciens C58 és az A. vitis AT1 iaaM szekvenciákat hasonlítottuk össze az A. tumefaciens A348 szekvenciával. Az első esetben 14, a második esetben csak 5 konzerválódott, 21 bp hosszú régió található az első 700 bázispáron belül. A konzerválódott régiókat a kódoló régiók elejétől számoztuk (részletesebben lásd a szövegben).
56 6. AZ EREDMÉNYEK MEGVITATÁSA 6.1. Agrobaktérium rezisztenciához kapcsolt SCAR markerek kialakítása A RAPD markerek kimutathatósága nehezen reprodukálható, ezért az erősebben kapcsolható RAPD markereket érdemes a PCR reakció körülményeire kevésbé érzékeny és megbízhatóbb SCAR markerekké átalakítani. Tapasztalataink alapján a RAPD reakcióban keletkező polimorf fragment legtöbbször több különböző szekvenciát is tartalmaz, és ezekről csak úgy dönthető el, hogy melyik rendelhető a polimorfizmushoz, ha sikerül valamelyik meghatározott szekvencia alapján a rezisztenciával kapcsolt SCAR markert kifejleszteni. Ha egy meghatározott szekvencia felhasználásával tervezünk primert és ezek segítségével sikerül csak a rezisztens utódokban megjelenő specifikus fragmentet felsokszorozni, akkor az a szekvencia kapcsolt a rezisztenciával. Az OPU07 primerrel végzett RAPD reakcióban keletkezett rezisztencia specifikus fragmentet klónoztuk és több klón szekvenciáját is meghatároztuk. Két különböző szekvenciát is azonosítottunk ezen az úton. Az OPU07.1 szekvencia esetében erős hasonlóságot találtunk a szekvencia teljes hosszában a Pinot noir genom 15. kromoszómájának egy részével (5.1.2.1. fejezet, 10. ábra). Ennek két végére tervezett specifikus primerekkel a RAPD reakcióban kapott polimorfizmust nem sikerült kimutatni, mivel azonos méretű fragmentet kaptunk mindkét szülőben és az utódokban is (5.1.2.1. fejezet). Ha az adott marker minden utódban megjelenik, akkor feltételezhetően mindkét homológ kromoszómán is jelen van, ahogy eredményeink is mutatják. Elképzelhető, hogy a RAPD reakcióban megfigyelt polimorfizmus pont a RAPD primer kötődési helyén (helyein) található. Ezek szekvenciáját nem ismerjük, mivel a RAPD primerek épültek be a helyére a PCR során. Hogy a primer helyen található feltételezett polimorfizmust meghatározzuk, a megismert szekvencián kívülre, két oldalt, a Pinot noir szekvencia alapján tervezett primerekkel felsokszoroztuk a kérdéses részletet. A Kunbarátból és a Sárfehérből is több klónozott PCR fragment szekvenciáját határoztuk meg, feltételezve, hogy a PCR termékekben két allél is jelen lehet. Azonban nem találtunk olyan polimorfizmust, amely a RAPD primerek kötődési helyén lenne. Éppen ezért ezekből az eredményekből nem lehet arra következtetni, hogy a rezisztenciagén a 15. kromoszómán helyezkedik el.
57 (Később, a RAPD reakcióban az OPU07 polimorfizmus kapcsoltnak bizonyult több olyan markerrel is, amelyeket egyértelműen a 15. kromoszómához tudtunk rendelni. Ilyen például az általam is vizsgált OPX05.) Abban az esetben, ha a RAPD fragmentben több szekvencia is detektálható, és a feltételezett szekvenciáról nem dönthető el, hogy kapcsolt a rezisztenciával, akkor ugyanúgy meg kell vizsgálni a többi kapott szekvenciát is, hogy azok esetleg kapcsoltak-e a keresett tulajdonsággal. A talált másik szekvenciát azonban nem vizsgáltuk, mert idő közben Kuczmog Anett munkája alapján kiderült, hogy ez egy viszonylag távoli marker, és a térképezéshez a közelebbi markerek jellemzésére koncentráltunk. Ilyen volt az OPX05 marker is. Az OPX05 RAPD primerrel kapott polimorf fragment az OPX05.1 szekvenciát tartalmazta, melynek egy része illeszkedik a Pinot noir 15. kromoszóma szekvenciájához. Az összehasonlításból kiderült, hogy a Pinot noirban ez egy mikroszatellita vagy SSR régió (AT dinukleotid ismétlődésekkel), ami eltűnt a Kunbarát (OPX05.1) szekvenciából (5.1.2.2. fejezet, 12. ábra). Az SSR régió két oldalára tervezett primerekkel sikerült egy rezisztenciához kapcsolt 224 bp nagyságú specifikus fragmentet felsokszorozni (mellette megjelent egy nem kapcsolt 236 bp nagyságú fragment is). Tehát nem is SCAR, hanem rezisztenciához kapcsolt SSR markert találtunk. A Kunbarát fajtában talált, a rezisztens kromoszómához nem kapcsolt másik allél (236 bp) szekvenciáját is meghatároztuk, amely az Italia fajtából származó, rezisztenciát nem hordozó homológ kromoszóma markere. Ebben az esetben a Pinot noir szekvenciában talált AT ismétlődés jelen volt, de eltérő hosszal (14. ábra). A teljes utódpopuláció vizsgálatát követően a 153 ellenálló utód közül csak hétben nem volt kimutatható a marker, a 119 fogékony utód között pedig nyolcban volt megtalálható. Tehát a 272 utód között 15 rekombinánst találtunk, ezek alapján a marker a rezisztencia géntől 5,5 cM távolságra helyezkedik el (Kuczmog Anett munkája).
23. ábra: Az Rcg1 lókusz genetikai térképe, jelölve rajta az OPX05sc marker helyzete.
58 A további munka során célunk a rezisztenciagén izolálása is. Ennek kivitelezésére a legtöbb esetben heterozigóta növényből készítenek géntárat (Deng et al., 2001), mint pl. a lisztharmat rezisztenciagén pozícionális klónozása során is (Barker et al., 2005). A rezisztenciagént hordozó klón megtalálása sok nehézséggel jár, hiszen sok esetben nem lehet eldönteni, hogy az átfedő klónok összegyűjtésekor az adott klón melyik homológ kromoszómáról származik. A klónok kiválogatására a DNS markerek mellett, mint például amiket mi is azonosítunk, a DNS-DNS hibridizáció is alkalmas, aminek alkalmazását a mi esetünkben is nehezíti a sok ismétlődő (repeat) régió jelenléte. Ezért megpróbálunk a rezisztencia génre nézve homozigóta növényt előállítani és a későbbiekben ebből géntárat készíteni. Ilyen a rezisztenciára nézve homozigóta növényeket a Kunbarát fajta, vagy valamely rezisztens utód önbeporzásával állíthatunk elő. Az előállított utódok közül a homozigóta rezisztens növények kiválogatásában olyan markerek segíthetnek, melyekkel mindegyik homológ kromoszóma megkülönböztethető. Ilyen azonosításra alkalmas marker az OPX05 rezisztencia kapcsolt SSR marker is. Segítségével a heterozigóta növényekben két fragment, a rezisztenciához kapcsolt 224 bp nagyságú, és a másik homológ kromoszómát jelző 236 bp nagyságú allél mutatható ki. A homozigóta rezisztens növényben viszont csak a rezisztenciához kapcsolt kisebb fragment, a homozigóta fogékony növényekben pedig csak a nagyobb fragment keletkezik. Ennek a markernek a segítségével meg tudjuk mondani, hogy az utódok közül melyik lehet homozigóta rezisztens növény, de ezen kívül több más markerrel is vizsgálni kell az utódokat, és a homozigótáknál a rezisztencia jelenlétét növényi tesztben igazolni kell. A géntár készítésre alkalmas növények kiválogatását már elkezdtük csoportunkban.
6.2. Mesterséges agrobaktérium rezisztencia kialakítása géncsendesítéssel A pJP17 vektorkonstrukció az A. tumefaciens A348 törzsből származó iaaM és ipt géneket tartalmazza két egymással szemben elhelyezkedő promoter között, ezáltal biztosítva a szensz és antiszensz szálak keletkezését, hogy így duplaszálú RNS képződhessen,
ami
a
géncsendesítési
folyamat
beindítója.
Ezzel
a
pJP17
vektorkonstrukcióval sikeresen hoztunk létre agrobaktérium rezisztens szőlőt, amiben a rezisztencia megnyilvánulása törzs specifikusnak bizonyult. A transzformált 21 transzgenikus vonal közül 8 növény rezisztens lett az A. tumefaciens A348 törzzsel szemben, amelyből a géncsendesítő konstrukcióban lévő agrobaktérium onkogén szekvencia származik.
59 A növényeket fertőztük még A. tumefaciens C58, A. vitis Tm4, AT1 és S4 törzsekkel is, hogy megnézzük a rezisztencia spektrumot. Vizsgálatainkban az A348 törzsön kívül 3 növény még az A. vitis AT1 törzzsel szemben is ellenállónak bizonyult. Magyarázatot kerestünk rá, hogy mi okozza a különbséget a növények között, ezért vizsgáltuk a beépült transzgén kópiaszámát, a kópiákról keletkező RNS mennyiségét, hogy vajon van-e összefüggés a transzkripciós szint és a kópiaszám, illetve a transzkripciós szint és a rezisztencia spektrum között. Ezek azonban nem adtak magyarázatot arra nézve, hogy miért az A. vitis AT1 törzzsel szemben alakult ki további rezisztencia. Ezzel a pJP17 konstrukcióval Lee és munkatársai sikeresen hoztak létre A. tumefaciens A348 törzzsel szemben rezisztens transzgenikus dohányokat (Lee et al., 2003), Viss és munkatársai pedig az A. tumefaciens A348 törzzsel szemben rezisztens transzgenikus almát állítottak elő, azt azonban, hogy más agrobaktériummal szemben hatékony védelmet biztosít-e a konstrukció, egyik kutatócsoport sem vizsgálta (Viss et al., 2003). A mi eredményeinkből kiderült, hogy ez a fajta megközelítés nem lehet hatásos minden Agrobacterium törzsre. Várható, hogy a nagy mértékben eltérő iaaM kódoló szekvenciákkal rendelkező törzsekkel szemben nem lesz ellenálló a létrehozott transzgenikus növény. A konstrukcióról átíródó, hosszú duplaszálú siRNS molekula darabolódik fel a géncsendesítés során rövidebb 21-23 bp hosszúságú szekvenciákra, és ha ezek a képződő rövidebb oligonukleotidok nem lesznek tökéletesen komplementerek a célzott mRNS szekvenciával, akkor a géncsendesítés hatékonysága kérdéses. Amikor összehasonlítottuk a különböző Agrobacterium törzsekből származó iaaM szekvenciákat, 50%-nál kisebb azonosságot is találtunk (A. vitis S4). Ez gyakorlatilag azt jelenti, hogy minden második bázis eltérő. Az A. tumefaciens A348 és A. vitis AG162 iaaM szekvenciák között már 66% az azonosság, de amikor illesztettük őket, csak egyetlen 21 bázispárnál hosszabb azonos szakaszt találtunk, amely így célpont lehet géncsendesítésnél. Ha nagyobb hasonlóság van a csendesítő és a cél szekvencia között, az sem biztos, hogy hatékony védelmet biztosít. Ahogy azt az 5.2.5. fejezetben megvizsgáltuk, az A. tumefaciens C58 szekvencia 94%-ban azonos az általunk használt csendesítő szekvenciával (A348), míg az A. vitis AT1 esetében ez az érték 89%. Ez a kis eltérés (5%) már azt eredményezi, hogy a 21-41 bp azonosságot mutató szakaszok száma 44-ről 25-re csökken. Azaz majdnem fele azoknak a régióknak a száma, melyek alkalmasak lehetnek géncsendesítésre.
60 A fentiek alapján azt várnánk, hogy a géncsendesítés annál hatékonyabb, minél inkább hasonlít két szekvencia egymásra. A vizsgálatban felhasznált Agrobacterium törzsek iaaM szekvenciáit összehasonlítva (10. táblázat), ehhez képest két ellentmondást is találtunk. 10. táblázat: A géncsendesítés hatásossága az iaaM szekvenciák hasonlóságával összevetve iaaM szekvenciák
A.t. A348
A.t. C58
A.v. AT1
A.v. Tm4
A.v. S4
csendesítő (A.t. A348)
100%
94%
89%
89%
53%
No3
R
Sz
R
Sz
Sz
A.t.: Agrobacterium tumefaciens, A.v.: Agrobacterium vitis, No3: transzgenikus szőlővonal, R: rezisztens, Sz: szenzitív Eredményeink szerint, nincs mindig szoros összefüggés a csendesítés hatásossága és a szekvenciák hasonlósága között. A csendesítő (A348) konstrukciót tartalmazó No3 szőlő vonal (és még két másik vonal, 9. táblázat) esetében a csendesítés 89% azonosság mellett az AT1 törzzsel szemben hatásosan működött, ugyanakkor a Tm4 törzzsel szemben nem. Ennél is váratlanabb, hogy a C58 törzzsel szemben sem bizonyult hatásosnak a csendesítő szekvencia, bár ebben az esetben 94% az azonosság. Úgy tűnik, hogy a DNS hasonlóságon kívül más faktorok is szerepet játszanak a géncsendesítés sikerességében. A megemelkedett növényi növekedési hormonszint gátolhatja a géncsendesítés folyamatát. Néhány Agrobacterium törzs képes lehet olyan gyorsan túltermeltetni ezeket a hormonokat, hogy az onkogén csendesítés hatását elnyomja. Az is lehetséges, hogy néhány Agrobacterium törzs képes kivédeni a géncsendesítést a vírusokban már ismert szuppresszor fehérjék segítségével (Dunoyer et al., 2006). Érdekes továbbá, hogy a pJP17 konstrukcióval transzformált dohányokon a C58 törzzsel szemben is működött a csendesítés, viszont nem találtunk AT1 rezisztens transzgenikus vonalat, így feltételezhető, hogy ebben a folyamatban gazdanövény specifikus hatások is lehetnek. Escobar és munkatársai hasonlóan a pJP17 konstrukcióhoz, hosszú siRNS képződésével alakítottak ki géncsendesítést. Ők egy olyan vektorkonstrukciót hoztak létre, melyben az A. tumefaciens 20W-5A törzsből származó iaaM és ipt géneket külön-külön fordított ismétlődésben építették be és így átíródás után hajtűszerűen képesek önmagukkal duplaszálú RNS molekula kialakítására és ezáltal a géncsendesítés aktiválására (Escobar et al., 2001).
61 A
konstrukció
segítségével
sikeresen
hoztak
létre
több
különböző
típusú
agrobaktériummal szemben rezisztens transzgenikus Arabidopsis, paradicsom (Escobar et al., 2001) és dió (Escobar et al., 2002) növényeket. A transzgenikus Arabidopsis növényeket az A. tumefaciens 20W-5A és A208 törzsekkel, a transzgenikus paradicsomokat az A. tumefaciens 20W-5A, 15955, C58, 127A és CG49 törzsekkel, a transzgenikus dióvonalakat pedig az A. tumefaciens 20W-5A, K12 és 53-1B törzsekkel tesztelték, és a transzgenikus növények mindegyik baktériummal szemben rezisztensnek bizonyultak. Ez a konstrukció valószínűleg azért működhet hatékonyabban, a pJP17 konstrukcióhoz képest, mert erről biztosan keletkezik duplaszálú RNS, a szensz és antiszensz szálak aránya biztosan 1:1, köszönhetően a hajtű szerkezetnek, szemben a pJP17 konstrukcióval, ahol mindkét promoterről kell, hogy átíródjon RNS. Bár kísérleteink során megvizsgáltuk a szensz és antiszensz szálak arányát is, és nem találtunk szignifikáns különbséget a keletkező két szál mennyisége között, de az valószínű, hogy nem pont azonos mennyiségben vannak jelen. Ez is ronthatja a csendesítés hatásosságát. Escobar és munkatársai egy transzgenikus paradicsomvonallal további vizsgálatokat is végeztek, és megállapították, hogy ez a transzgenikus paradicsom 35 különböző tesztelt A. tumefaciens törzzsel szemben is rezisztens (Escobar et al., 2003). A cikk szerint a különböző agrobaktérium iaaM szekvenciák elég hasonlóak ahhoz, hogy a géncsendesítés hatékonyan működjön ezekkel a szekvenciákkal szemben. Ez elképzelhető, azonban az általuk vizsgált legtöbb törzs iaaM szekvenciája nem található meg az adatbázisban, így nem tudni pontosan, mennyire különbözőek, vagy hasonlóak ezek a szekvenciák. A mesterséges agrobaktérium fertőzéseket a kecskeméti üvegházban tartott növényeken, míg az expressziós vizsgálatokat a pécsi üvegházunkban tartott növényekkel végeztük el. Annak érdekében, hogy csak a transzgén jelenlétét tudjuk detektálni, a qPCR kísérletekhez a mintákat a nem a fertőzött növényekről gyűjtöttük be. Elképzelhető, hogy a valamelyest eltérő külső körülmények, mint pl. a hőmérsékletváltozás is befolyásolhatta a mért értékeket. Ismert, hogy a siRNS alapú géncsendesítés hatékonyságát az alacsony hőmérséklet gátolja (Sos-Hegedus et al., 2005; Szittya et al., 2003). A mikroRNS (miRNS) alapú géncsendesítésben csak a miRNS egy 21 bp hosszúságú szakasza vesz részt és aktiválja a folyamatot (Lai, 2003), így a különböző iaaM szekvenciák között elég, ha találunk egy 21 bp hosszan konzerválódott régiót, amit felhasználhatunk egy géncsendesítő konstrukció készítéséhez. Ennek a miRNS alapú géncsendesítésnek a másik előnye a siRNS alapú géncsendesítéssel szemben, hogy hatása nem függ a hőmérséklettől.
62 Niu és munkatársai miRNS alapú géncsendesítés segítségével hoztak létre vírus rezisztens transzgenikus Arabidopsis növényeket. Módosítottak egy, a géncsendesítés folyamatában részt vevő miRNS gént (miRNA159). Kétféle mesterséges miRNS gént hoztak létre, melyek virális mRNS szekvenciák felismerését kódolták. Az egyik esetben a tarlórépa mozaik vírussal (TuMV, turnip mosaic virus) a másik esetben pedig a tarlórépa sárga mozaik vírussal (TYMV, turnip yellow mosaic virus) szemben sikerült ellenálló transzgenikus Arabidopsis növényt létrehozniuk. Ha a két konstrukcióval együtt transzformálták a növényeket, akkor mindkét vírussal szemben rezisztensek lettek (Niu et al., 2006). Ugyanezen elv alapján több kutatócsoportnak is sikerült miRNS alapú géncsendesítéssel növényi kórokozóval szembeni rezisztenciát kialakítania (Ai et al., 2011; Duan et al., 2008; Qu et al., 2007). Ezeknek az eredményeknek az ismeretében a jövőben mi is létrehozunk miRNS alapú, az iaaM gének csendesítésére szolgáló konstrukciókat azt remélve, hogy a legtöbb Agrobacterium törzzsel szemben ez a módszer hatékony védelmet jelent.
63 7. ÖSSZEFOGLALÁS A különböző Agrobacterium törzsek a legtöbb kétszikű növényt képesek fertőzni, és rajtuk tumorképződést indukálni. Fontos mezőgazdasági növények esetében, mint a szőlő, ez jelentős terméskieséshez is vezethet. Megoldást a fertőzéssel szemben ellenálló szőlőfajták létrehozása jelentene, egyrészt természetes rezisztenciagének megismerésével, másrészt
mesterséges
rezisztencia
kialakításával.
Mindkét
irányban
végeztünk
vizsgálatokat. A termesztett szőlő (Vitis vinifera) rokona a V. amurensis, melynek néhány változata ellenálló az agrobaktérium fertőzéssel szemben. Egy V. amurensis eredetű, domináns agrobaktérium rezisztenciát hordozó V. vinifera Kunbarát, és egy fogékony Sárfehér fajta keresztezéséből létrehozott utódpopuláció segítségével elkezdtük a rezisztenciagén (Rcg1) genetikai térképezését. 272 magoncot fertőzve megállapítottuk, hogy közülük 153 utód ellenálló és 119 fogékony a betegséggel szemben. A fenotípusok ismeretében elkezdtük a rezisztenciához kapcsolt DNS markerek azonosítását. A munka elején, RAPD kísérletek segítségével két rezisztenciához kapcsolt polimorfizmus jellemzése volt a feladatom. Ezek közül az OPX05.1 esetében sikeresen azonosítottuk DNS szekvencia szinten a polimorfizmust, melyről kiderült, hogy egy mikroszatellita régió, a 15. kromoszómán. Jellemzésével
a
rezisztenciagén
térképezéséhez
fontos
DNS-markert
sikerült
kifejlesztenünk, melyet a gén izolálása során is használhatunk. A mesterséges rezisztencia kialakítására az A. tumefaciens A348 tözs iaaM onkogén szekvenciáját használtuk fel (pJP17). Az előállított 21 transzgenikus szőlővonalat agrobaktérium fertőzéssel teszteltük a kialakult rezisztencia jellemzésére. Nyolc vonal rezisztensnek bizonyult az A. tumefaciens A348, és közülük három vonal az A. vitis AT1 törzzsel szemben is. A többi vizsgált törzzsel (A. tumefaciens C58, A. vitis Tm4, S4) szemben minden vonal fogékony volt. Megvizsgáltuk a beépült transzgén kópiaszámát és expressziós szintjét, hogy megértsük az eltérések okát. A legtöbb esetben egy T-DNS kópia volt jelen a transzgenikus növényekben. A rezisztens növényekben lényegesen magasabb volt az iaaM szekvencia átíródási szintje, azonban a több törzsre kiterjedő rezisztencia ezzel nem magyarázható. A törzsek eltérő iaaM szekvenciái sem magyarázzák az eredményeket, hiszen az A348 iaaM génhez kevésbé homológ szekvenciát tartalmazó AT1 törzzsel szemben néhány esetben kialakult rezisztencia, míg az erősebben homológ szekvenciát hordozó C58 törzzsel szemben nem. Ezért valószínű, hogy az agrobaktériumok genetikai háttere is befolyásolja a géncsendesítő hatást.
64 8. SUMMARY Pathogen Agrobacterium strains induce uncontrolled cell division (crown gall) on higher plants. Crown gall causes serious economical losses in agriculturally important plants, like grapevine. Some wild Vitis species, including V. amurensis, are resistant to crown gall disease, but the resistance gene and the physiology background of the resistance is still unknown. The breeding of new, resistant grapevine varieties by classical crossings would provide a solution to reduce the damage caused by agrobacteria. On the other hand, modern molecular biological methods are suitable to generate crown gall resistant grapevine, as well. In our study we investigated both the natural resistance gene and the gene silencing technology to develop resistant plants in the future. By crossing the agrobacterium resistant Vitis sp. „Kunbarát” and the susceptible V. vinifera cv. „Sárfehér” a mapping population was established including 272 progeny. We showed in crown gall tests that 153 progeny were resistant and 119 were susceptible to crown gall formation. In RAPD experiments several resistance coupled DNA polymorphism were detected. I have characterized two of them further at DNA sequence level. By the help of the DNA sequence a SCAR marker was developed for the OPX05.1 polymorphism that enhances the genetic mapping. In addition, it was shown that this region is a microsatellite (SSR) region belonging to chromosome 15. Thus we identified and characterized an important DNA marker, which is useful in mapping and isolating the resistant gene. In order to develop artificial resistance, we used an oncogene (iaaM) silencing construct based on A. tumefaciens A348 sequences (pJP17). We investigated 21 transgenic grapevine lines by agrobacterium infections. Eight lines were resistant to A. tumefaciens A348 of which the silencing construct derived from. Three of these lines also carried additional resistance to A. vitis AT1. All examined lines were susceptible to other tested Agrobacterium strains (A. tumefaciens C58, A. vitis Tm4, S4). To answer what is the reason of the different resistance spectra, we examined the copy number of transgene and the expression levels of the iaaM sequences in ten transgenic lines. In most cases the plants carried a single T-DNA insert. In resistant plants the expression level of iaaM sequence was higher than in susceptible lines, but there was no correlation with the resistance spectrum. Interestingly, the additional resistance appeared against A. vitis AT1 strain, although its iaaM gene shows less similarity to the iaaM sequence of A348 than to the gene in strain C58. Beside DNA homology, other bacterial factors may influence the success of silencing.
65 9. IRODALMI HIVATKOZÁSOK Ai, T., Zhang, L. and Gao, Z. (2011). Highly efficient virus resistance mediated by artificial microRNAs that target the suppressor of PVX and PVY in plants. Plant Biol, 13, 304-316. Allen, O. N., Holding, A. J. (1974). Genus II. Agrobacterium. In: Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8th Edition, pp.: 264-267, eds.: Buchanan, R. E., and Gibbons, N. E. , Williams and Wilkins Co., Baltimore Ambros, V.. (2003). MicroRNA pathways in flies and worms: growth, death, fat, stress and timing. Cell, 113, 673-676. Arnendo-Andrés, M.S., Gil-Ortega, R., Luis-Arteaga, M. and Hormaza, J.I. (2002). Develpoment of RAPD and SCAR markers linked to the Pvr4 locus for resistance PVY in pepper (Capsicum annuum L.). Theor Appl Genet, 105, 1067-1074. Ashby, A.M., Watson, M.D., Loake, G.J. and Shaw, C.H. (1988). Ti plasmid-specified chemotaxis of Agrobacterium tumefaciens C58C1 toward vir-inducing phenolic compounds and soluble factors from monocotyledonous and dicotyledonous plants. J Bacteriol, 170, 4181-4187. Barker, C.L., Donald, T., Pauquet, J., Ratnaparkhe, M.B., Bouquet, A., Adam-Blondon, A., Thomas, M.R. and Dry, I. (2005). Genetic and physical mapping of the grapevine powdery mildew resistance gene, Run1, using a bacterial artificial chromosome library. Theor Appl Genet, 111, 370-377. Barker, R.F., Idler, K.B., Thompson, D.V. and Kemp, J.D. (1983). Nucleotide sequence of the T-DNA region from the Agrobacterium tumefaciens octopine Ti plasmid pTi15955. Plant Mol Biol, 2, 335-350. Baulcombe, D. (2004). RNA silencing in plants. Nature, 431, 356-363. Baykal, U. and Zhang, Z. (2010). Chapter XI: Small RNA-mediated Gene Silencing for Plant Biotechnology. In: Gene Silencing: Theory, Techniques and Applications, Catalano, A. J. ed., Nova Science Publishers, p255-269. Beilmann, A., Albrecht, K., Shultze, S., Wanner, G. and Pfitzner, U.M. (1992). Activation of a truncated PR-1 promoter by endogenous enhancers in transgenic plants. Plant Mol Biol, 18, 65-78. Bernstein, E., Caudy, A., Hammond, S. and Hannon, G. (2001). Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature, 409, 363-366. Bouzar, H. and Jones, J.B. (2001). Agrobacterium larrymoorei sp. nov., a pathogen isolated from aerial tumours of Ficus benjamina. Int J Syst Evol Microbiol, 51, 1023-1026. Bouzar, H. and Moore, L.W. (1987). Isolation of different agrobacterium biovars from a natural oak savanna and tallgrass prairie. Appl Environ Microbiol, 53, 717-721.
66 Bouzar, H., Ouadah, D., Krimi, Z., Jones, J.B., Trovato, M., Petit, A. and Dessaux, Y. (1993). Correlative Association between Resident Plasmids and the Host Chromosome in a Diverse Agrobacterium Soil Population. Appl Environ Microbiol, 59, 1310-1317. Braun, A.C. (1978). Plant tumors. Biochim Biophys Acta, 516, 167-191. Britton, M.T., Escobar, M.A. and Dandekar, A.M. (2008). The oncogenes of Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes. In: Tzfira T and Citovsky, eds., Agrobacterium: From Biology to Biotechnology. Springer, New York, pp. 523-563. Bullock, W.O., Fernandez, J.M. and Short, J.M. (1987). XL1-Blue: a high efficiency plasmid transforming recA Escherichia coli strain with beta-galactosidase selection. Biotechniques, 5, 376-379. Burr, T.J. and Katz, B.H. (1983). Isolation of Agrobacterium tumefaciens biovar 3 from grapevine galls and sap and from vineyard soil. Phytopathology, 73, 163-165. Burr, T.J. and Katz, B.H. (1984). Grapevine cuttings as potential sites of survival and means of disemmination of Agrobacterium tumefaciens. Plant Dis, 68, 976-978. Burr, T.J. and Reid, C.L. (1994). Biological control of grape crown gall with nontumorigenic Agrobacterium vitis strain F2/5. Am J Enol Vitic, 45, 213-219. Burr, T.J., Bazzi, C., Süle, S. and Otten, L. (1998). Crown gall of grape: Biology of Agrobacterium vitis and the development of disease control strategies. Plant Dis, 82, 1288-1297. Burr, T.J., Katz, B.H. and Bishop, A.L. (1987). Populations of Agrobacterium in vineyard soils and grape roots in vineyards and nurseries. Plant Dis, 71, 617-620. Burr, T.J., Reid, C.I., Tagliati, E., Bazzi, C. and Süle, S. (1997). Biological control of grape crown gall by strain F2/5 is not associated with agrocin production or competition for attachment sites on grape cells. Phytopathology, 87, 706-711. Burr, T.J., Reid, C.L., Yoshimura, M., Momol, E.A. and Bazzi, C. (1995). Survival and tumorigenicity of Agrobacterium vitis in living and decaying grape roots and canes in soil. Plant Dis, 79, 677-682. Campisi, L., Yang, Y., Yi, Y., Heilig, E., Herman, B., Cassista, A.J., Allen, D.W., Xiang, H. and Jack, T. (1999). Generation of enhancer trap lines in Arabidopsis and characterization of expression patterns in the inflorescence. Plant J, 17, 699-707. Carrington, J.C. and Ambros, V. (2003). Role of microRNAs in plant and animal development. Science, 301, 336-338. Chilton, M.M. and Que, Q. (2003). Targeted integration of T-DNA into the tobacco genome at double-stranded breaks: new insights on the mechanism of T-DNA integration. Plant Physiol, 133, 956-965.
67 Christie, P.J. (2004). Type IV secretion: the Agrobacterium VirB/D4 and related conjugation systems. Biochim Biophys Acta, 1694, 219-234. Citovsky, V., Warnick, D. and Zambryski, P. (1994). Nuclear import of Agrobacterium VirD2 and VirE2 proteins in maize and tobacco. Proc Natl Acad Sci USA, 91, 32103214. Collinge, D.B., Jørgensen, H.J.L., Lund, O.S. and Lyngkjær, M.F. (2010). Engineering pathogen resistance in crop plants ‐ currenttrends and future prospects. Ann Rev Phytopathol, 48, 269-291. Costacurta, A. and Vanderleyden, J. (1995). Synthesis of phytohormones by plantassociated bacteria. Crit Rev Microbiol, 21, 1-18. De Block, M., Herrera-Estrella, L., Van Montagu, M., Schell, J. and Zambryski, P. (1984). Expression of foreign genes in regenerated plants and in their progeny. EMBO J, 3, 1681-1689. De Frammond, A.J., Barton, K.A. and Chilton, M.D. (1983). Mini-Ti: a new vector strategy for plant genetic engineering. Biotechnology, 5, 262-269. De Maagd RA., Bosch, D. and Stiekema, W. (1999). Bacillus thuringiensis toxin mediated insect resistance in plants. Trends Plant Sci, 4, 9-13. Deák, M., Kiss, Gy.B., Koncz, Cs., Dudits, D. (1986). Transformation of Medicago by Agrobacterium mediated gene transfer. Plant Cell Rep, 5, 97-100. Deng, Z., Huang, S., Ling, P., Yu, C., Tao, Q., Chen, C., Wendell, M.K., Zhang, H.B. and Gmitter, F.G.J. (2001). Fine genetic mapping and BAC contig development for the citrus tristeza virus resistance gene locus in Poncirus trifoliata (Raf.). Mol Genet Genomics, 265, 739-747. Denli, A.M. and Hannon, G.J. (2003). RNAi: an ever-growing puzzle. Trends Biochem Sci, 28, 196-201. Dessaux, Y., Petit, A. and Tempé, J. (1992). Opines in Agrobacterium biology. In: D.P.S. Verma (Ed.): Molecular Signals in Plant-Microbe Communications, CRC Press, Boca Raton, 109-136. Dessaux, Y., Petit, A., Farrand, S.K. and Murphy, P.J. (1998). Opines and opine-like molecules involved in Plant-Rhizobiaceae interactions. In H.P. Spaink, A. Kondorosi and P.J.J. Hooykaas (ed.), The Rhizobiaceae: Molecular Biology of Model PlantAssociated Bacteria. Kluwer Academic Publisher, Dordrecht-Boston-London, Vol. Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D. and Helinski, D.R. (1980). Broad host- range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proc Natl Acad Sci USA, 77, 7347-7351. Duan, C.G., Wang, C.H., Fang, R.X. and Guo, H.S. (2008). Artificial microRNAs highly accessible to targets confer efficient virus resistance in plants. J Virol, 82, 11084-11095.
68 Dudits, D. and Heszky, L. (2003). Növényi biotechnológia és géntechnológia. Agroinform Kiadó, Budapest Dunoyer P, Himber C, Voinnet O (2006) Induction, suppression and requirement of RNA silencing pathways in virulent Agrobacterium tumefaciens infections. Nat Genet, 38, 258–263. Eagles, H.A., Bariana, H.S., Ogbonnaya, F.C., Rebetzke, G.J., Hollamby, G.J., Henry, R.J., Henschke, P.H. and Carter, M. (2001). Implementation of markers in Australian wheat breeding. Aust J Agric Res, 52, 1349-1356. Eamens, A., Wang, M., Smith, N.A. and Waterhouse, P.M. (2008). RNA silencing in plants: yesterday, today, and tomorrow. Plant Physiol, 147, 456-468. Economou, A., Christie, P.J., Fernandez, R.C., Palmer, T., Plano, G.V. and Pugsley, A.P. (2006). Secretion by numbers: Protein traffic in prokaryotes. Mol Microbiol, 62, 308319. Escobar, M., Leslie, C., McGranahan, G. and Dandekar, A. (2002). Silencing crown gall disease in walnut (Juglans regia L.). Plant Sci, 163, 591-597. Escobar, M.A. and Dandekar, A.M. (2003). Agrobacterium tumefaciens as an agent of disease. Trends Plant Sci, 8, 380-386. Escobar, M.A., Civerolo, E.L., Polito, V.S., Pinney, K.A. and Dandekar, A.M. (2003). Characterization of oncogene-silenced transgenic plants: implications for Agrobacterium biology and post-transcriptional gene silencing. Mol Plant Pathol, 4, 5765. Escobar, M.A., Civerolo, E.L., Summerfelt, K.R. and Dandekar, A.M. (2001). RNAimediated oncogene silencing confers resistance to crown gall tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci USA, 98, 13437-13442. Fehér, A., Skryabin, K.G., Balázs, E., Preiszner, J., Shulga, O.A., Zakharyev, V.M. and Dudits, D. (1992). Expression of PVX coat protein gene under the control of extesingene promoter confers virus resistance on transgenic potato plants. Plant Cell Rep, 11, 48-52. Finnegan, E.J. and Matzke, M.A. (2003). The small RNA world. J Cell Sci, 116, 46894693. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M.K., Kostas, S.A., Driver, S.E. and Mello, C.C. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 391, 806-811. Folk, G. and Glits, M. (2000). Kertészeti növénykórtan. Mezőgazda Kiadó, Budapest. Fortin, C., Marquis, C., Nester, E.W. and Dion, P. (1993). Dynamic structure of Agrobacterium tumefaciens Ti plasmids. J Bacteriol, 175, 4790-4799.
69 Fraley, R.T., Rogers, S.G., Horsch, R.B., Sanders, P.R., Flick, J.S., Adams, S.P., Bittner, M.L., Brand, L.A., Fink, C.L., Fry, J.S., Galluppi, G.R., Goldberg, S.B., Hoffmann, N.L. and Woo, S.C. (1983). Expression of bacterial genes in plant cells. Proc Natl Acad Sci USA, 80, 4803-4807. Garfinkel, D.J., Simpson, R.B., Ream, W., White, F.F., Gordon, M.P. and Nester, E.W. (1981). Genetic analysis of crown gall: fine structure map of the T-DNA by site-directed mutagenesis. Cell, 27, 143-153. Gasser, C.S. and Fraley, R.T. (1989). Genetically engineering plants for crop improvement. Science, 244, 1293-1299. Gaudin, V., Vrain, T. and Jouanin, L. (1994). Bacterial genes modifying hormonal balances in plants. Plant Physiol Biochem, 32, 11-29. Gelvin, S.B. (2003). Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol Mol Biol Rev, 67, 16-37. Gelvin, S.B. (2009). Agrobacterium in the genomics age. Plant Physiol, 150, 1665-1676. Gelvin, S.B. (2010). Plant proteins involved in Agrobacterium-mediated genetic transformation. Annu Rev Phytopathol, 48, 45-68. Gheysen, G., Montagu, M.V. and Zambryski, P. (1987). Integration of Agrobacterium tumefaciens transfer DNA (T-DNA) involves rearrangements of target plant DNA sequences. Proc Natl Acad Sci USA, 84, 6169-6173. Gonsalves, C., Lee, D.R. and Gonsalves, D. (2004). Transgenic virus-resistant papaya: The Hawaiian 'Rainbow' was rapidly adopted by farmers and is of major importance in Hawaii today. APSnet feature Goodman, R.N., Grimm, R. and Frank, M. (1993). The influence of grape rootstocks on the crown gall infection process and on tumor development. Am J Enol Vitic, 44, 22-26. Grattapaglia, D. and Sederoff, R. (1994). Genetic linkage maps of Eucalyptus grandis and Eucalyptus urophylla using a pseudo-testcross: mapping strategy and RAPD markers. Genetics, 137, 1121-1137. Haberlandt, G. (1902). Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber Akad Wiss Wien Math-Naturwiss Kl, Abt J, 111, 69-92. Hadrys, H., Balick, M. and Schierwater, B. (1992). Applications of random amplified polymorphic DNA (RAPD) in molecular ecology. Mol Ecol, 1, 55-63. Hamiduzzaman, M.M., Jakab, G., Barnavon, L., Neuhaus, J. and Mauch-Mani, B. (2005). beta-Aminobutyric acid-induced resistance against downy mildew in grapevine acts through the potentiation of callose formation and jasmonic acid signaling. Mol Plant Microbe Interact, 18, 819-829.
70 Hamilton, A., Voinnet, O., Chappell, L. and Baulcombe, D. (2002). Two classes of short interfering RNA in RNA silencing. EMBO J, 21, 4671-4679. Hannig, E. (1904). Zur Physiologie pflanzlicher Embryonen. I. Über die Kultur von Cruciferen-embryonen ausserhalb des Embryosacks. Bot Ztg, 62, 45-80. Heil, M. (1993). Untersuchungen zur Resistenz von Vitis gegen Agrobacterium tumefaciens. Dissertation, Universität Hohenheim, Stuttgart Hoekema, A., Hirsh, P.R., Hooykaas, P.J.J. and Schilperoort, R.A. (1983). A binary plant vector strategy based on separation of vir- and T-regions of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid. Nature, 303, 179-181. Holden, M., Krastanova, S., Xue, B., Pang, S., Sekiya, M., Momol, E.A., Gonzalves, D. and Burr, T.J. (2003). Genetic engineering of grape for resistance to crown gall. Acta Hort, 603, 481-484. Hood, E.E., Gelvin, S.B., Melchers, L.S. and Hoekema, A. (1993). New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants. Transgen Res, 2, 208-218. Hood, E.E., Helmer, G.L., Fraley, R.T. and Chilton, M.D. (1986). The Hypervirulence of Agrobacterium tumefaciens A281 Is Encoded in a Region of pTiBo542 Outside of TDNA. J Bacteriol, 168, 1291-1301. Hooykaas, P.J., den Dulk-Ras, H., Ooms, G. and Schilperoort, R.A. (1980). Interactions between octopine and nopaline plasmids in Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol, 143, 1295-1306. Horsch, R.B., Fry, J.E., Hoffmann, N.L., Eichholtz, D., Rogers, S.G. and Fraley, R.T. (1985). A simple and general method for transferring genes into plants. Sci, 227, 12291231. Humann, J., Andrews, S., Ream, W. (2006). VirE1-Mediated resistance to crown gall in transgenic Arabidopsis thaliana. Phytopathology, 96, 105-110. Inoue, H., Nojima, H. and Okayama, H. (1990). High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Genetics, 96, 23-28. Ish-Horovicz, D. and Burke, J.F. (1981). Rapid and efficient cosmid cloning. Nucl Acids Res, 9, 2989-2998. Jin, S.G., Prusti, R.K., Roitsch, T., Ankenbauer, R.G. and Nester, E.W. (1990). Phosphorylation of the VirG protein of Agrobacterium tumefaciens by the autophosphorylated VirA protein: essential role in biological activity of VirG. J Bacteriol, 172, 4945-4950. Jones, D.A., Ryder, M.H., Clare, B.G., Farrand, S.K. and Kerr, A. (1988). Construction of a Tra− deletion mutant of pAgK84 to safeguard the biological control of crown gall. Mol Gen Genet, 212, 207-214.
71 Jongedijk, E., Tigelaar, H., van Roekel, J.S.C., Bres-Vloemans, S.A., Dekker, I., van den Elzen, P.J.M., Cornelissen, B.J.C. and Melchers, L.S. (1995). Synergistic activity of chitinases and β-1, 3 -glucanases enhances fungal resistance in transgenic tomato plants. Euphytica, 85, 173-180. Kawaguchi, A., Inoue, K. and Nasu, H. (2005). Inhibition of crown gall formation by Agrobacterium radiobacter biovar 3 strains isolated from grapevine. J Gen Plant Pathol, 71, 422-430. Kerr, A. (1980). Biological control of crown gall through production of agrocin 84. Plant Dis, 64, 25-30. Kerr, A. and Panagopoulos, C.G. (1977). Biotypes of Agrobacterium radiobacter var. tumefaciens and their biological control. Phytopathol Z, 90, 172-179. Koleda I. (1975). Ergebnisse von Kreuzungen zwischen Vitis amurensis und Vitis vinifera in der Züchtung frostwiderstandsfähiger Reben. Vitis, 14, 1-5. Korbuly, J. (2000). Results of breeding for resistance to winter frosts and different pathogens using Vitis amurensis. 7th Int. Symp.Grape Gen Breed Acta Horticult, 258, 551-558. Korbuly, J. (2002). A Vitis amurensis (Rupr.) értékei a szőlő rezisztencianemesítés számára. Int J Horticult Sci, 8, 53-58. Kotte, W. (1922). Kulturversuch isolierten Wurzelespitzen. Beitr Allg Bot, 2, 413–434. Krastanova, S.V., Balaji, V., Holden, M.R., Sekiya, M., Xue B., Momol, E.A., Burr, T.J., (2010). Resistance to crown gall disease in transgenic grapevine rootstocks containing truncated virE2 of Agrobacterium. Transgenic Res, 19(6), 949-958 Lai, E.C. (2003). MicroRNAs: runts of the genome assert themselves. Curr Biol, 13, 925936. Lee, H., Humann, J.L., Pitrak, J.S., Cuperus, J.T., Parks, T.D., Whistler, C.A., Mok, M.C. and Ream, L.W. (2003). Translation start sequences affect the efficiency of silencing of Agrobacterium tumefaciens T-DNA oncogenes. Plant Physiol, 133, 966-977. Lee, L. and Gelvin, S.B. (2008). T-DNA Binary Vectors and Systems. Plant Physiol, 146, 325-332. Lehoczky, J. (1971). Further evidences concerning the systemic spreading of Agrobacterium tumefaciens in the vascular system of grapevines. Vitis, 10, 215-221. Liang, Y.J., Zhao, J.Y., Ma, D.Q. and Di, Y.B. (1990). A biotype 3 strain of Agrobacterium radiobacter inhibits crown gall formation on grapevine. Acta Microbiol Sin, 30, 165171. Matzke, M.A., Matzke, A.J. (2004). Planting the seeds of a new paradigm. Plos Biol, 2, E133.
72 McGuire, R.G., Rodriguez-Palenzuela, P., Collmer, A. and Burr, T.J. (1991). Polygalacturonase Production by Agrobacterium tumefaciens Biovar 3. Appl Environ Microbiol, 57, 660-664. McNeil, J.B. and Friesen, J.D. (1981). Expression of the Herpes simplex virus thymidine kinase gene in Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet, 184, 386-393. Meade, H.M., Long, S.K., Ruvkun, G.B., Brown, S.E. and Ausubel, F.M. (1982). Physical and genetic characterization of symbiotic and auxotrophic mutants of Rhizobium meliloti induced by transposon Tn5 mutagenesis. J Bacteriol, 149, 114-122. Meister, G. and Tuschl, T. (2004). Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature, 431, 343-349. Miranda, A., Janssen, G., Hodges, L., Peralta, E.G. and Ream, W. (1992). Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism. J Bacteriol, 174, 2288-2297. Morgante, M., Hanafey, M. and Powell, W. (2002). Microsatellites are preferentially associated with nonrepetitive DNA in plant genomes. Nat Genet, 30, 194-200. Murashige, T. and Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant, 15, 473-497. Nakayashiki, H. (2005). RNA silencing in fungi: mechanisms and applications. FEBS Lett, 579, 5950-5957. Napoli, C., Lemieux, C. and Jorgensen, R. (1990). lntroduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes Ín trans. The Plant Cell, 2, 279-289. Niu, Q., Lin, S., Reyes, J.L., Chen, K., Wu, H., Yeh, S. and Chua, N. (2006). Expression of artificial microRNAs in transgenic Arabidopsis thaliana confers virus resistance. Nat Biotechnol, 24, 1420-1428. Oláh, R., Szegedi, E., Ruthner, S. and Korbuly, J. (2003). Thidiazuron-induced regeneration and genetic transformation of grapevine rootstock varieties. Vitis, 42, 133136. Ophel, K. and Kerr, A. (1990). Agrobacterium vitis sp. nov. for strains of Agrobacterium biovar 3 from grapevines. Int J System Bacteriol, 40, 236-241. Orosz, L., Svab, Z., Kondorosi, A. and Sik, T. (1973). Genetic studies on Rhizobio- phage 16-3. Genes and functions on the chromosome. Mol Gen Genet, 125, 341- 350. Paran, I. and Michelmore, R. (1992). Sequence characterized amplified regions (SCARs) as a codominant genetic marker in Lactuca spp. Theor Appl Genet, 85, 985-993.
73 Park, W., Li, J., Song, R., Messing, J. and Chen, X. (2002). Carpel factory, a Dicer homolog, and HEN1, a novel protein, act in microRNA metabolism in Arabidopsis thaliana. Curr Biol, 12, 1484-1495. Parke, D., Ornston, L.N. and Nester, E.W. (1987). Chemotaxis to plant phenolic inducers of virulence genes is constitutively expressed in the absence of the Ti plasmid in Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol, 169, 5336-5338. Paulus, F., Huss, B., Bonnard, G., Ride, M., Szegedi, E., Tempe, J., Petit, A. and Otten, L. (1989). Molecular systematics of biotype III Ti plasmids of Agrobacterium tumefaciens. Mol Plant-Microbe Interact, 2, 64-74. Pellerone, F.I., Edwards, K.J. and Thomas, M.R. (2001). Grapevine microsatellite repeats: isolation, characterisation and use for genotyping of grape germplasm from Southern Italy. Vitis, 40, 179-186. Petit, A. and Tempé, J. (1985). The function of T-DNA in nature. van Vloten-Doting, L;Groot, G S P;Hall, T C, Plenum Press, New York and London. Pitzschke, A. and Hirt, H. (2010). New insights into an old story: Agrobacterium-induced tumour formation in plants by plant transformation. EMBO J, 29, 1021-1032. Powell-Abel, P., Nelson, R.S., De, B, Hoffmann, N., Rogers, S.G., Fraley, R.T. and Beachy, R.N. (1986). Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene. Science, 232, 738-743. Pu, X.A. and Goodman, R.N. (1993). Attachment of agrobacteria to grape cells. Appl Environ Microbiol, 59, 2572-2577. Qu, J., Ye, J. and Fang, R. (2007). Artificial microRNA-mediated virus resistance in plants. J Virol, 81, 6690-6699. Ream, L.W., Gordon, M.P. and Nester, E.W. (1983). Multiple mutations in the T-region of the Agrobacterium tumefaciens tumor-inducing plasmid. Proc Natl Acad Sci USA, 80, 1660-1664. Ream, L.W. (1989). Agrobacterium tumefaciens and interkingdom genetic exchange. Annu Rev Phytopathol, 27, 583-618. Reinhart, B.J., Weinstein, E.G., Rhoades, M.W., Bartel, B. and Bartel, D.P. (2002). MicroRNAs in plants. Genes Dev, 16, 1616-1626. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual - 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Savka, M.A., Black, R.C., Binns, A.N. and Farrand, S.K. (1996). Translocation and exudation of tumor metabolites in crown galled plants. Mol Plant Microbe Interact, 9, 310-313.
74 Schell, J., Van Montagu, M., De Beuckeleer, M., De Block, M., Depicker, A., De Wilde, M., Engler, G., Genetello, C., Hernalsteens, J.P., Holsters, M., Seurinck, J., Silva, B., Van Vliet, F. and Villarroel, R. (1979). Interactions and DNA transfer between Agrobacterium tumefaciens, the Ti-plasmid and the plant host. Proc R Soc Lond B Biol Sci, 204, 251-266. Semagn, K., Bjornstad, Å. and Ndjiondjop, M.N. (2006). An overview of molecular marker methods for plants. Afr J Biotechnol, 5, 2540-2568. Shah, D.M., Horsch, R.B., Klee, H.J., Kishore, G.M., Winter, J.A., Tumer, N.E., Hironaka, C.M., Sanders, P.R., Gasser, C.S., Aykent, S., Siegel, N.R., Rogers, S.G. and Fraley, R.T. (1986). Engineering herbicide tolerance in transgenic plants. Science, 233, 478-481. Song, J., Smith, S.K., Hannon, G.J. and Joshua-Tor, L. (2004). Crystal Structure of Argonaute and Its Implications for RISC Slicer Activity. Science, 305, 1434-1437. Sos-Hegedus, A., Lovas, A., Kondrak, M., Kovacs, G. and Banfalvi, Z. (2005). Active RNA silencing at low temperature indicates distinct pathways for antisense-mediated gene-silencing in potato. Plant Mol Biol, 59, 595-602. Stachel, S.E., An, G., Flores, C. and Nester, E.W. (1985). A Tn3 lacZ transposon for the random generation of beta-galactosidase gene fusions: application to the analysis of gene expression in Agrobacterium. EMBO J, 4, 891-898. Stachel, S.E., Timmerman, B. and Zambryski, P. (1987). Activation of Agrobacterium tumefaciens vir gene expression generates multiple single-stranded T-strand molecules from the pTiA6 T-region: requirement for 5' virD gene products. EMBO J, 6, 857-863. Steward, F.C., Pollard, J.K., Patchett, A.A. and Witkop, B. (1958). The effects of selected nitrogen compounds on the growth of plant tissue cultures. Biochim Biophys Acta, 28, 308-317. Stover, E.W., Swartz, H.J. and Burr, T.J. (1997). Crown gall formation in a diverse collection of Vitis genotypes inoculated with Agrobacterium vitis. Vitis, 35, 29-33. Sundaresan, V., Springer, P., Volpe, T., Haward, S., Jones, J.D., Dean, C., Ma, H. and Martienssen, R. (1995). Patterns of gene action in plant development revealed by enhancer trap and gene trap transposable elements. Genes Dev, 9, 1797-1810. Sunkar, R., Girke, T., Jain, P.K. and Zhu, J. (2005). Cloning and characterization of microRNAs from rice. Plant Cell, 17, 1397-1411. Susi, P., Hohkuri, M., Wahlroos, T. and Kilby, N.J. (2004). Characteristics of RNA silencing in plants: similarities and differences across kingdoms. Plant Mol Biol, 54, 157-174. Suzuki, K., Hattori, Y., Uraji, M., Ohta, N., Iwata, K., Murata, K., Kato, A. and Yoshida, K. (2000). Complete nucleotide sequence of a plant tumor-inducing Ti plasmid. Gene, 242, 331-336.
75 Szalontai, B., Stranczinger, S., Palfalvi, G., Mauch-Mani, B. and Jakab, G. (2012). The taxon-specific paralogs of grapevine PRLIP genes are highly induced upon powdery mildew infection. J Plant Physiol, 169, 1767-1775. Szegedi, E. (1981). Szőlőfajták Agrobacterium tumefaciens (Smith et Townsend)Conn-el szembeni fogékonysága. Növényvédelem, 17, 442-450. Szegedi, E. and Kozma, P. (1984). Studies on the inheritance of resistance to crown gall disease of grapevine. Vitis, 23, 121-126. Szegedi, E., Czakó, M., Otten, L. and Koncz, C. (1988). Opines in crown gall tumors induced by biotype 3 isolates of Agrobacterium tumefaciens. Physiol Mol Plant Pathol, 32, 237- 247. Szegedi, E., Oberschall, A., Bottka, S., Oláh, R. and Tinland, B. (2001). Transformation of tobacco plants with virE1 gene derived from Agrobacterium tumefaciens pTiA6 and its effect on crown gall tumor formation. Internat J Hortic Sci, 7, 54-57. Szegedi, E., Otten, L. and Czakó, M. (1992). Diverse types of tartrate plasmids in Agrobacterium tumefaciens biotype III strains. Mol Plant-Microbe Interact, 5, 435-438. Szittya, G., Silhavy, D., Molnár, A., Havelda, Z., Lovas, A., Lakatos, L., Bánfalvi, Z. and Burgyán, J. (2003). Low temperature inhibits RNA silencing-mediated defence by the control of siRNA generation. EMBO J, 22, 633-640. Süle, S. (1978). Biotypes of Agrobacterium tumefaciens in Hungary. J Appl Bacteriol, 44, 207-213. Süle, S. Mozsár, J. and Burr, T.J. (1994). Crown gall resistance of Vitis spp. and grapevine rootstocks. Phytopathology, 84, 607-611. Tang, G., Reinhart, B.J., Bartel, D.P. and Zamore, P.D. (2003). A biochemical framework for RNA silencing in plants. Genes Dev, 17, 49-63. Tanksley, S.D. and Orton, T.J. (1983). Isozymes in plant genetics and breeding. Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York. Tinland, B., Schoumacher, F., Gloeckler, V., Bravo-Angel, A.M. and Hohn, B. (1995). The Agrobacterium tumefaciens virulence D2 protein is responsible for precise integration of T-DNA into the plant genome. EMBO J, 14, 3585-3595. Tzfira, T. and Citovsky, V. (2006). Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology. Curr Opin Biotechnol, 17, 147-154. Tzfira, T. and Citovsky, V., eds. (2008). Agrobacterium: from biology to biotechnology, Springer. Tzfira, T., Frankman, L.R., Vaidya, M. and Citovsky, V. (2003). Site-specific integration of Agrobacterium tumefaciens T-DNA via double-stranded intermediates. Plant Physiol, 133, 1011-1023.
76 Unger, L., Ziegler, S.F., Huffman, G.A., Knauf, V.C., Peet, R., Moore, L.W., Gordon, M.P. and Nester, E.W. (1985). New class of limited-host-range Agrobacterium mega-tumorinducing plasmids lacking homology to the transferred DNA of a wide-host-range, tumor-inducing plasmid. J Bacteriol, 164, 723-730. Van Overbeek, J., Conklin, M.E. and Blakeslee, A.F. (1941). Factors in coconut milk essential for growth and development of very young datura embryos. Science, 94, 350351. Vaeck, M., Reynaerts, A., Hoftey, H., Jansens, S., DeBeuckleer, M., Dean, C., Zabeau, M., Van Montagu, M. and Leemans, J. (1987). Transgenic plants protected from insect attack. Nature, 327, 33-37. Venetianer, P. (2010). Génmódosított növények. Mire jók? Typotex Kiadó, Budapest Vergunst, A.C., Schrammeijer, B., den Dulk-Ras, A., de Vlaam, C.M., Regensburg-Tuïnk, T.J. and Hooykaas, P.J. (2000). VirB/D4-dependent protein translocation from Agrobacterium into plant cells. Science, 290, 979-982. Vidal, J.R., Kikkert, J.R., Malnoy, M.A., Wallace, P.G., Barnard, J. and Reisch, B.I. (2006). Evaluation of transgenic ‘Chardonnay’ (Vitis vinifera) containing magainin genes for resistance to crown gall and powdery mildew. Transgenic Res, 15, 69-82. Viss, W.J., Pitrak, J., Humann, J., Cook, M., Driver, J. and Ream, W. (2003). Crown-gallresistant transgenic apple trees that silence Agrobacterium tumefaciens oncogenes. Mol Breed, 12, 283-295. Wang, G., Song, W., Ruan, D., Sideris, S. and Ronald, P.C. (1996). The cloned gene, Xa21, confers resistance to multiple Xanthomonas oryzae pv. oryzae isolates in transgenic plants. Mol Plant Microbe Interact, 9, 850-855. Weising, K., Schell, J. and Kahl, G. (1988). Foreign genes in plants: transfer, structure, expression, and applications. Annu Rev Genet, 22, 421-477. Williams, H.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J., Rafalski, J.A. and Tingey, S.V. (1990). DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res, 18, 6531-6535. Xie, Z., Johansen, L.K., Gustafson, A.M., Kasschau, K.D., Lellis, A.D., Zilberman, D., Jacobsen, S.E. and Carrington, J.C. (2004). Genetic and functional diversification of small RNA pathways in plants. PLoS Biol, 2, 642-652. Yanofsky, M.F., Porter, S.G., Young, C., Albright, L.M., Gordon, M.P. and Nester, E.W. (1986). The virD operon of Agrobacterium tumefaciens encodes a site-specific endonuclease. Cell, 47, 471-477. Young, L.D. (1999). Soybeans resistant to Heterodera glycines populations attacking Hartwig soybean. J Nematot, 31, 583 (abstract).
77 Yu, K., Park, S.J. and Poysa, V. (2000). Marker-assisted selection of common beans for resistance to common bacterial blight: efficacy and economics. Plant Breed, 119, 411415. Zaenen, I., Van Larebeke, N., Van Montagu, M. and Schell, J. (1974). Supercoiled circular DNA in crown-gall inducing Agrobacterium strains. J Mol Biol, 86, 109-127. Zhu, J., Oger, P.M., Schrammeijer, B., Hooykaas, P.J.J., Farrand, S.K. and Winans, S.C. (2000). Minireview: The Bases of Crown Gall Tumorigenesis. J Bacteriol, 182, 38853895.
78 10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Doktori disszertációmat a PTE, TTK, Biológiai Intézet, Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszéken végzett kutatómunkám eredményeiből írtam. Köszönettel tartozom elsősorban témavezetőmnek, Dr. Putnoky Péternek, munkám irányításáért, a problémák megoldásában nyújtott elméleti és gyakorlati segítségéért. Köszönettel tartozunk Dr. Szegedi Ernőnek (FVM Szőlészeti és Borászati Kutatóintézet, Kecskemét), a megvalósításban nyújtott segítségéért, és Dr. Kozma Pálnak (PTE TTK, Szőlészeti és Borászati Intézet, Pécs) a munka ötletének felvetéséért, és hogy Dr. Szegedi Ernővel közös keresztezési munkájukkal előkészítették a rezisztencia gén térképezését és szakmai tanácsaikkal támogattak. Köszönjük Dr. Oláh Róbertnek és Dr. Zok Anikónak, hogy rendelkezésünkre bocsájtották a kísérleteinkben felhasznált transzgenikus szőlőket és Dr. Walt Ream professzornak a pJP17 konstrukciót. Köszönet illeti Dr. Gábriel Róbertet, tanulmányaim és munkám során nyújtott támogatásáért, valamint Dr. Endre Gabriellát, Dr. Fehér Attilát és Dr. Fekete Csabát a kísérletekkel kapcsolatos technikai tanácsokért. A szorosan kapcsolódó témánkból adódóan köszönöm Dr. Kuczmog Anettnek és Horváth Szabinának a laboratóriumi munkában és a részeredmények kiértékelésében nyújtott segítségüket, fáradhatatlan munkájukat. Köszönöm a Tanszék összes munkatársának a támogatását, valamint laboránsainknak, Keidl Zoltánné Juditnak és Garai Krisztinának a segítséget, az önálló munkára nevelést. Köszönöm Dr. Szabadfi Krisztina, Dr. Szalontai Bálint, Dr. Stranczinger Szilvia önzetlen szakmai segítségét, baráti tanácsait, valamint kollégáim és barátaim kitartó bíztatását. Végül pedig, de nem utolsó sorban, hálásan köszönöm Családomnak, Szüleimnek és Testvéreimnek, hogy a hat év során, nem csak anyagilag, de lelkileg is sokszor erőn felül támogattak, és hogy mindvégig töretlenül hittek bennem és ennek a doktori dolgozatnak az elkészülésében.
79 11. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK A disszertáció alapjául szolgáló tudományos közlemények: 1. Galambos, A., Zok, A., Kuczmog, A., Oláh, R., Putnoky, P., Ream, W., Szegedi, E. (2013) Silencing Agrobacterium oncogenes in transgenic grapevine results in strainspecific crown gall resistance. Plant Cell Rep, 32:1751-1757 (IF:2,509) 2. Kuczmog, A., Galambos, A., Horváth, Sz., Mátai, A., Kozma, P., Szegedi, E., Putnoky, P. (2012) Mapping of crown gall resistance locus Rcg1 in grapevine. Theor Appl Genet, 125:1565–1574 (IF:3,658) Összesített impakt faktor: 6,167. A disszertáció témakörében készült konferencia előadások és poszterek: Kuczmog Anett, Galambos Anikó, Kozma Pál, Szegedi Ernő, Putnoky Péter (2009) Agrobaktérium rezisztencia térképezése szőlőben. VIII. Magyar Genetikai Kongresszus, XV. Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok, Nyíregyháza, Magyarország. PG28, poszter absztrakt. Galambos Anikó, Zok Anikó, Kuczmog Anett, Putnoky Péter, Oláh Róbert, Szegedi Ernő (2011) Mesterséges Agrobacterium rezisztencia kialakítása szőlőben. IX. Magyar Genetikai Kongresszus, XVI. Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok, Siófok, Magyarország. P064, poszter absztrakt. Kuczmog Anett, Galambos Anikó, Kozma Pál, Szegedi Ernő, Putnoky Péter (2011) Az Agr1 Agrobacterium rezisztencia lokusz térképezése szőlőben. IX. Magyar Genetikai Kongresszus, XVI. Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok, Siófok, Magyarország. P093, poszter absztrakt. Kuczmog Anett, Galambos Anikó, Horváth Szabina, Kozma Pál, Szegedi Ernő, Putnoky Péter (2011): Az Agr1 Agrobacterium rezisztencia lokusz térképezése szőlőben. XVII. Növénynemesítési Tudományos Napok. Program összefoglalók 45. old., (Budapest, 2011. április 27.) előadás absztrakt Horváth Szabina, Kuczmog Anett, Galambos Anikó, Kozma Pál, Szegedi Ernő, Putnoky Péter (2013) Agrobacterium rezisztencia lokusz genetikai térképének pontosítása szőlőben. II. Interdiszciplináris Doktorandusz Konferencia, Pécs, Magyarország. P4.5, poszter absztrakt.
80 Egyéb konferencia előadások és poszterek jegyzéke: Galambos Anikó, Stranczinger Szilvia, Borhidi Attila (2009) Génusz- és fajszintű molekuláris filogenetikai vizsgálatok a Rubiaceae család Hamelieae szekciójában., VIII. Magyar Genetikai Kongresszus, XV. Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok, Nyíregyháza, Magyarország. PG21, poszter absztrakt. Stranczinger Szilvia, Galambos Anikó, Borhidi Attila (2010) Phylogenic study on genus and species level of the Deppea complex (Hamelieae Section) The Fifth International Rubiaceae and Gentianales Conference, Biodiversity in the light of historical information, Stockholm, Sweden. P58, poszter absztrakt. Stranczinger Szilvia, Szalontai Bálint, Galambos Anikó, Borhidi, Attila (2012) A Deppeakomplex (Rubiaceae, Hamelieae) szövedékének integratív filogenetikai felfejtése., „ Egy új korszak kezdetén...” Molekuláris biológiai módszerek az ökológiai és taxonómiai kutatás
