Oxidatie tijdens in vitro vertering van nitrietgepekelde vleesproducten

FACULTEIT BIO-INGENIEURSWETENSCHAPPEN Academiejaar 2012-2013

Oxidatie tijdens in vitro vertering van nitrietgepekelde vleesproducten

Charlotte BOTERDAELE

Promotor: Prof. dr. ir. Stefaan De Smet Tutor: Els Vossen

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van MASTER IN DE BIO-INGENIEURSWETENSCHAPPEN: LANDBOUWKUNDE

De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.

The author and the promotor give the permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more specific the source must be extensively specified when using results from this thesis.

Gent, Juni 2013 Ghent, June 2013

De promotor,

De auteur,

The promotor,

The author,

Prof. Dr. Ir. Stefaan De Smet

Charlotte Boterdaele

Woord vooraf Het realiseren van een eindwerk vergt niet alleen veel tijd en energie van jezelf maar ook van de mensen om je heen. Dankzij hen kan ik u trots mijn eindwerk voorstellen en daarom zou ik hen graag via deze weg bedanken. In de eerste plaats gaat mijn dankwoord naar mijn promotor, Professor De Smet. Enerzijds heeft u mij altijd geboeid tijdens uw lessen, waardoor ik enthousiast werd om een eindwerk te schrijven in uw onderzoeksgebeid. Anderzijds wil ik u ook bedanken voor de kans die ik kreeg om dit onderzoek in uw labo uit te voeren. Els, door jouw hulp en ervaring werd mijn zoektocht al een pak minder zwaar. Bedankt voor je eindeloze geduld en het moeiteloos antwoorden op al mijn vragen. Ik was een bofkont met jou als begeleidster! Thomas, de lange incubatiedagen waren een stuk aangenamer met jou erbij. Dankjewel voor de begeleiding tijdens mijn eerste stappen in het labowerk en voor het delen van je kennis. Verder zou ik graag mijn ouders willen bedanken voor het vertrouwen en de kans die ze mij hebben gegeven om mijn eindwerk en mijn opleiding tot een goed einde te brengen. Nicolas, jouw enthousiasme en cynische opmerkingen hielpen mij doorheen de soms moeilijke dagen. Anne-Sophie, dankjewel voor het aanhoren van al mijn geklaag en dankjewel voor je onvoorwaardelijke steun in de periodes waarin ik ze het meeste nodig had. Tot slot gaat mijn oprechte dank naar alle mensen van het labo in Melle waar ik met mijn vragen terecht kon. In het bijzonder Daisy, bedankt voor het klaarzetten van mijn stalen en voor het gezelschap in de vroege uurtjes. Eric en Sabine, jullie wil ik bedanken voor de vele handige tips. Het was een leerrijke tijd om met jullie allen samen te werken!

i

Lijst van afkortingen

ATNCs

Apparent Total N-Nitroso Compounds

BSA

Bovine serum albumin

DNA

Desoxyribonucleïnezuur

2,4-DNPH

2,4-dinitrophenylhydrazine

DTNB

5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoëzuur)

GSTs

Glutathion S-transferases

HCAs

Heterocyclic Amines

4-HNE

4-Hydroxynonenal

LMWA

Low Molecular Weight Antioxidants

Mb

Myoglobine

MDA

Malondialdehyde

MCO

Metal Catalysed Oxidation

MUFA

Mono Unsaturated Fatty Acids

NOCs

N-Nitroso Compounds

PUFA

Poly Unsaturated Fatty Acids

ROS

Reactive Oxygen Species

SDS

Sodium Dodecyl Sulphate

SFA

Saturated Fatty Acids

SHIME

Simulator of Human Intestinal Microbial Ecosystem

TBA

2-thiobarbituurzuur

TCA

Trichloroacetic acid ii

TMP

1,1,3,3-tetramethoxypropaan

TRIS

Tris(hydroxymethyl)aminomethaan

WCRF

World Cancer Research Fund

iii

Samenvatting Er zijn aanwijzingen dat de consumptie van rood vlees en bereide vleesproducten een hoger risico op colorectale kanker met zich meebrengt. Dit zou te wijten zijn aan de vorming van carcinogene componenten door o.a. de oxidatie van eiwitten en vetten in het vlees. Het doel van deze studie was dan ook om de vorming van oxidatieproducten te onderzoeken na in vitro vertering van vlees. In deze thesis werden drie experimenten uitgevoerd. In een eerste experiment werden drie vleessoorten, verschillend in heemgehalte, in vitro verteerd: kip, varken en rund. Het tweede experiment had als doel het effect van het vetgehalte van het vlees op de vorming van oxidatieproducten te achterhalen. Hiervoor werd aan varkensvlees 0, 5 of 20% subcutaan varkensvet toegevoegd. Tot slot werd een derde experiment opgesteld om de oxidatiegevoeligheid van rauw en verhit vlees (65°C en 95°C) na te gaan. Bij de drie experimenten werd ook de invloed van nitriet onderzocht, dit door zowel vers als nitriet gepekeld vlees (120 ppm nitriet) te onderzoeken. Aan de verschillende vleesstalen werden verteringssappen toegediend voor het simuleren van de maag- en dunne darmvertering, elk experiment werd driemaal herhaald met verschillende microbiota voor het simuleren van de colonvertering. Na de duodenum fase en na de colon fase werden stalen genomen. Zowel op het onverteerd vlees als op deze stalen werden analyses uitgevoerd van vetoxidatie (MDA) en eiwitoxidatie (carbonyls en thiolgroepen). De resultaten toonden aan dat meer oxidatieproducten aanwezig waren in vlees dat een in vitro verteringsproces onderging dan in onverteerd vlees. Experiment 1 toonde voor de vetoxidatie resultaten zoals deze al eerder in de literatuur verschenen: het vlees met het hoogste heemgehalte (rundvlees) gaf aanleiding tot meer vetoxidatie, het vlees met het laagste heemgehalte (kippenvlees) tot minder vetoxidatie. Deze uitkomst gold zowel voor de onverteerde stalen als voor de duodenum en colon stalen. Nitriet was hierbij een duidelijke antioxidant. In experiment 2 werd in de onverteerde, duodenum en colon stalen meer MDA gedetecteerd naarmate het vetgehalte van het vlees toenam. Ook hier zorgde nitriet voor minder vetoxidatie. In het derde experiment kon in het algemeen besloten worden dat het vlees verhit bij 95°C hogere MDA gehaltes had in vergelijking met het rauw en verhit vlees bij 65°C. Bij de verhitte stalen was nitriet opnieuw verantwoordelijk voor minder MDA. De eiwitten waren gedurende de in vitro vertering gevoelig voor oxidatie, aangezien verhoogde carbonylcomponenten en een daling in thiolgroepen gevonden werden. Er is echter meer onderzoek nodig om de verschillen tussen de behandelingen éénduidig te kunnen verklaren. iv

Summary There are indications that the consumption of red meat and processed meats is associated with a higher risk of colorectal cancer. This could be due to the formation of carcinogenic compounds from, amongst others, the oxidation of fats and proteins present in the meat. The aim of this study was to investigate the formation of oxidation products after in vitro digestion of meat. In this study, three experiments were conducted. In the first experiment three kinds of meat, differing in their amount of heme iron, were digested in vitro: poultry, pork and beef. The second experiment aimed at investigating the effect of the fat content of the meat on the formation of oxidation products. For this experiment pork meat was used with the addition of 0, 5 or 20% subcutaneous fat. Finally, there was also a third experiment to discover the susceptibility of raw and cooked (65 and 95°C) meat to oxidation. In the three experiments the influence of nitrite was also investigated by examining uncured as well as nitrite cured (120 ppm) meat. Digestive juices were added to the samples of meat to simulate the digestion in the stomach and small intestine, each experiment was repeated three times with different microbiota to simulate the colon digestion. After the digestion in the duodenum and in the colon samples were collected. These samples as well as the fresh meat were analysed for fat oxidation (MDA) and protein oxidation (carbonyls and thiolgroups). The results of this study showed that more oxidation products were present in in vitro digested meat than undigested meat. The results of experiment 1 were consistent with previously discribed literature: meat with the highest amount of heme iron (beef) gave rise to more fat oxidation, meat with the lowest amount of heme iron (poultry) to less fat oxidation. This was the case for the undigested samples, samples from the duodenum and from the colon. Nitrite had a significant role as an antioxidant. In the second experiment, more MDA was detected in the undigested, duodenum and colon samples of meat with the highest fat content. Also here nitrite was responsible for less fat oxidation. From the third experiment it could be concluded that meat cooked to a temperature of 95°C contained more MDA compared to raw meat and meat cooked to 65°C. In the cooked samples, nitrite was again responsible for less oxidation of fat. Proteins in the meat were sensitive to oxidation during in vitro digestion, since an increased content of carbonyls and a decreased content of thiolgroups were observed. However, more research is needed to elucidate the differences between treatments of meat unambiguously.

v

Inhoudstafel Woord vooraf .............................................................................................................................. i Lijst van afkortingen .................................................................................................................. ii Samenvatting ............................................................................................................................. iv Summary .................................................................................................................................... v 1.

Inleiding ............................................................................................................................. 1

2.

Literatuurstudie .................................................................................................................. 2 2.1 Inleiding ........................................................................................................................... 2 2.2 Oxidatie ............................................................................................................................ 2 2.2.1 Algemeen .................................................................................................................. 2 2.2.2 Reactieve zuurstofmoleculen .................................................................................... 3 2.2.3 Oxidatieve stress ....................................................................................................... 6 2.3 Vlees en colorectale kanker .............................................................................................. 8 2.3.1 Algemeen .................................................................................................................. 8 2.3.2 Oxidatie en kanker .................................................................................................... 9 2.3.3 De rol van onze darmbacteriën in het ontstaan van colorectale kanker .................. 11 2.4 Factoren die de oxidatie in vleeswaren beïnvloeden ...................................................... 12 2.4.1 Algemeen ................................................................................................................ 12 2.4.2 Heemijzer ................................................................................................................ 12 2.4.2.1 Algemeenheden ................................................................................................ 12 2.4.2.2 Mechanisme ..................................................................................................... 13 2.4.3 Vet en vetoxidatie.................................................................................................... 15 2.4.3.1 Algemeenheden ................................................................................................ 15 2.4.3.2 Mechanisme en gevolgen ................................................................................. 15 2.4.3.3 Beïnvloedende factoren .................................................................................... 17 2.4.4 Eiwitoxidatie ........................................................................................................... 18 2.4.4.1 Algemeenheden ................................................................................................ 18 2.4.4.2 Mechanisme en gevolgen ................................................................................. 19 2.4.5 Nitriet en de vorming van N-nitroso componenten ................................................. 21 2.4.5.1 Algemeenheden nitriet en nitraat ..................................................................... 21 2.4.5.2 Nitriet in vlees .................................................................................................. 21 2.4.5.3 Voor- en nadelen van nitriet ............................................................................. 22 2.5 Oxidatieprocessen tijdens de vertering .......................................................................... 23

2.5.1 Algemeen ................................................................................................................ 23 2.5.2 Speeksel ................................................................................................................... 23 2.5.3 Maagsap .................................................................................................................. 24 2.5.4 Darm ........................................................................................................................ 25 2.5.4.1 Duodenum ........................................................................................................ 26 2.5.4.2 Colon en microbiota ......................................................................................... 27 3.

Doelstellingen ................................................................................................................... 28

4.

Materiaal en methoden ..................................................................................................... 29 4.1 Proefopzet....................................................................................................................... 29 4.2 Voorbereidingen vlees.................................................................................................... 29 4.3 In vitro incubaties ........................................................................................................... 31 4.4 Chemische analyses ........................................................................................................ 35 4.4.1 Droge stof, ruw veten ruw eiwitgehalte ................................................................ 35 4.4.2 Vetzurenprofiel ........................................................................................................ 35 4.4.3 Bepaling van het totaal ijzergehalte ........................................................................ 35 4.4.4 Bepaling van het totaal aan heempigmenten ........................................................... 35 4.4.5 Nitrietbepaling ......................................................................................................... 36 4.5 Malondialdehyde ............................................................................................................ 37 4.6 Carbonylgroepen ............................................................................................................ 37 4.7 Thiolgroepen .................................................................................................................. 38 4.7.1 Optimalisatie van de methode ................................................................................. 38 4.7.2 Definitieve methode ................................................................................................ 39 4.8 Statistische analyse ......................................................................................................... 40

5.

Resultaten en discussie ..................................................................................................... 41 5.1 Experiment heemgehalte ................................................................................................ 41 5.1.1 Samenstelling vlees ................................................................................................. 41 5.1.2 Oxidatieparameters .................................................................................................. 44 5.1.2.1 MDA................................................................................................................. 44 5.1.2.2 Carbonyls ......................................................................................................... 49 5.1.2.3 Thiolgroepen .................................................................................................... 51 5.2 Experiment vetgehalte .................................................................................................... 54 5.2.1 Samenstelling stalen ................................................................................................ 54 5.2.2 Oxidatieparameters .................................................................................................. 56

5.2.2.1 MDA................................................................................................................. 56 5.2.2.2 Carbonyls ......................................................................................................... 58 5.2.2.3 Thiolgroepen .................................................................................................... 59 5.3 Experiment verhittingsproces ......................................................................................... 62 5.3.1 Samenstelling stalen ................................................................................................ 62 5.3.2 Oxidatieparameters .................................................................................................. 65 5.3.2.1 MDA................................................................................................................. 65 5.3.2.2 Carbonyls ......................................................................................................... 68 5.3.2.3 Thiolgroepen .................................................................................................... 69 5.

Algemene discussie .......................................................................................................... 72

6.

Besluit............................................................................................................................... 75

Referenties ................................................................................................................................ 76

1. Inleiding “Dagelijkse steak of worst verhoogt risico op darmkanker” of “Rood vlees eten verkort leven”. Krantenkoppen die meer en meer verschijnen. Er zijn aanwijzingen dat de consumptie van rood vlees een belangrijke factor zou zijn in het ontstaan van colorectale kanker bij de mens. De onderliggende processen zijn nog niet helemaal duidelijk. Vlees heeft al sinds het ontstaan van de mens een belangrijk aandeel in het dieet. Dit komt door zijn aantrekkelijke smaak en geur, maar vooral door de hoge nutritionele waarde die vlees aan de mens biedt. Ondanks onze basisbehoefte aan vlees, heeft de vleesindustrie de laatste jaren enorm onder vuur gelegen. Zeer recent zijn ook de bedenkingen rond dierenwelzijn en milieuproblematiek. Jarenlange vooruitgang in de wetenschap zorgde voor meer inzicht in ziektes die met vleesconsumptie geassocieerd worden, zoals hart- en vaatziekten, maar ook kankers. Colorectale kanker is een belangrijke doodsoorzaak in welvarende landen. Er zijn aanwijzingen dat deze kanker veroorzaakt wordt door de consumptie van rood vlees en bereide vleesproducten zoals beenham, salami, paté, … Kunnen we het risico op colorectale kanker verminderen als we bewust kiezen om het aandeel van rood vlees in ons dieet te beperken? Om hierop een antwoord te bieden, moet eerst duidelijk zijn hoe het vlees in ons dieet kan zorgen voor kanker. De aanwezige vetten en eiwitten in vlees zijn gevoelig voor oxidatie waardoor vrije radicalen ontstaan die schade kunnen berokkenen aan ons darmepitheel. Tijdens de oxidatiereacties worden ook stoffen gevormd die mogelijks carcinogeen zijn, zoals MDA tijdens de vetoxidatie. Het doel van deze thesis was om een beter inzicht te krijgen in de invloed van vleescomponenten op oxidatieprocessen tijdens de vertering. Hiervoor werden verschillende vleestypes onderworpen aan in vitro vertering. Verschillende factoren werden onderzocht: wat is de invloed van het heemgehalte van het vlees op het ontstaan van oxidatieproducten, welke rol spelen het veten nitrietgehalte van het vlees en wat is het effect van het verhittingsproces dat vlees onderging. Er werd een onderscheid gemaakt tussen het duodenum en het colon, om te kunnen zien waar en hoeveel oxidatieproducten worden gevormd. Hierdoor kan een mogelijke link gelegd worden met het ontstaan van colorectale kanker.

1

2. Literatuurstudie 2.1 Inleiding In deze literatuurstudie wordt nagegaan hoe ver de wetenschappelijke wereld al staat in het onderzoek over het verband tussen rood vlees en colorectale kanker. Meer specifiek zal er een overzicht gegeven worden over wat er tot op heden al bekend is over de impact van verschillende oxidatieproducten. Hoe ontstaan ze en wat is hun bijdrage tot colorectale kanker wordt meer in detail besproken. Eerst wordt toegelicht wat oxidatie is, wat er bedoeld wordt met oxidatieproducten om zo te komen tot hun bijdrage in het ontstaan van oxidatieve stress. Vervolgens wordt nagegaan wat er in de literatuur al gekend is over het verband tussen oxidatie en kanker. Een apart hoofdstuk wordt gewijd aan de verschillende karakteristieken (zoals het ijzer- en nitrietgehalte) van bereid vlees, omdat vooral dit vlees een groter risico voor colorectale kanker zou kunnen inhouden. In verband hiermee worden specifiek de veten eiwitoxidatie besproken. In een laatste hoofdstuk wordt oxidatie tijdens het verteringsproces behandeld waarbij specifiek aandacht gaat naar de rol van microbiota.

2.2 Oxidatie 2.2.1 Algemeen Om de begrippen oxidatie en oxidatieve stress duidelijk te kunnen toelichten, is het nodig eerst een aantal algemene termen te verduidelijken. Atomen met een ongelijk aantal elektronen zijn onstabiele atomen die men ook vrije radicalen (R•) of oxidanten noemt. Een vrij radicaal is in staat om onafhankelijk te bestaan en meestal zijn ze veel reactiever dan hun overeenkomstig niet-vrij radicaal (Halliwell, 1994; Halliwell en Gutteridge, 2007). Aangezien een radicaal onstabiel is, zal het alles doen om weer stabiel te worden door een elektron te grijpen van een ander molecule, of anders gezegd er ontstaat oxidatie. Oxidatie is het proces waarbij twee vrije radicalen elkaar ontmoeten en hun ongepaarde elektronen een covalente binding vormen. Wanneer een vrij radicaal reageert met een niet-vrij radicaal ontstaat een kettingreactie met als resultaat de vorming van nieuwe vrije radicalen, die op hun beurt kunnen reageren met andere vrije of niet-vrije radicalen (Halliwell en Gutteridge, 2007). 2

Zuurstof is de belangrijkste en levensnoodzakelijke oxidant in het menselijk lichaam om energie te halen uit de oxidatie van organische moleculen via de elektronentransportketen. Het moleculair zuurstof dat hiervoor gebruikt wordt, bevat echter twee ongepaarde elektronen. Hierdoor kan zuurstof opeenvolgende niet-enzymatische reducties ondergaan met de vorming van verschillende reactieve intermediairen, ook reactieve zuurstofmoleculen of ROS (Reactive Oxygen Species) genoemd (zie verder, Figuur 2) (Davies, 1995). Deze reactieve zuurstofmoleculen kunnen leiden tot oxidatieve schade. Zuurstof is dus noodzakelijk maar tegelijkertijd ook gevaarlijk voor het bestaan van aerobe organismen. Dit wordt “the paradox of aerobic life” genoemd (Davies, 1995; Nyska en Kohen, 2002; Halliwell en Gutteridge, 2007). ROS worden niet enkel gevormd door metabolische processen, maar ook door andere endogene bronnen zoals immuuncellen (ROS worden geproduceerd om pathogenen te doden), en exogene bronnen zoals blootstelling aan UV-straling, luchtverontreinigende stoffen, … (Figuur 1) (Davies, 1995; Nyska en Kohen, 2002).

Figuur 1. Exogene en endogene bronnen van ROS (Nyska en Kohen, 2002)

2.2.2 Reactieve zuurstofmoleculen ROS is een verzamelnaam voor zuurstofradicalen en voor niet-radicalen afgeleid van zuurstof zoals waterstofperoxide (H2O2), hypochloorzuur (HOCl) en ozon (O3) (Halliwell en Gutteridge, 2007). In dit deel worden de verschillende ROS a.d.h.v. Figuur 2 meer in detail besproken. 3

Figuur 2. Reductie van moleculair zuurstof (Davies, 1995)

Vrije reactieve zuurstofradicalen 

Superoxide radicaal (O2•-)

Zoals blijkt uit Figuur 2 leidt de eerste niet-enzymatische reductie van zuurstof tot het ontstaan van een superoxide radicaal, of kortweg superoxide (O2•-). Bij lage pH en in waterig milieu kan O2•- voorkomen als hydroperoxyl (HO2•). Deze laatste vorm kan veel makkelijker doorheen membranen dringen dan superoxide, waardoor verondersteld wordt dat het in staat is schade te berokkenen (Davies, 1995; Nyska en Kohen, 2002). Superoxide is veel minder reactief dan bv. het hydroxylradicaal (OH•) en gaat vooral snel reageren met o.a. NO• en Fe-S clusters in sommige enzymen. De belangrijkste reactie van het superoxide radicaal is dismutatie: O2•- + O2•- + 2H+ → H2O2 + O2 De snelheid van deze spontane reactie is meestal laag maar in zure milieus wordt de snelheid snel opgedreven (Halliwell en Gutteridge, 2007). 

Hydroxylradicaal (OH•)

Het hydroxylradicaal wordt gevormd door een derde elektron toe te voegen aan superoxide, met de vrijstelling van een hydroxide ion (OH-) (Figuur 2). OH• kan nog op veel andere manieren gevormd worden bv. door de reactie van hypochloorzuur met O2•-: HOCl + O2•- → O2 + Cl- + OH•

4

OH• is het meest reactieve radicaal dat reageert met alle moleculen (DNA, eiwitten, lipiden, aminozuren, suikers en metalen) in zijn onmiddellijke omgeving. Het radicaal heeft een korte levensduur, maar kan heel wat oxidatieve schade berokkenen door drie reacties, namelijk het verwijderen of toevoegen van een waterstofatoom en elektronentransfer (Halliwell en Gutteridge, 2007). 

Stikstofoxide (NO•)

Stikstofoxide wordt o.a. gevormd door de oxidatie van één van de guanidine-stikstofatomen van L-arginine, deze reactie is gekatalyseerd door enzymen, namelijk stikstofoxide synthasen. Het heeft een lage reactiviteit maar kan aanleiding geven tot de vorming van peroxynitriet (zie verder) (Halliwell en Gutteridge, 2007): NO• + O2•- → ONOONitriet in de voeding kan ook aanleiding geven tot de vorming van stikstofoxide (zie verder “2.4.5.2 Nitriet in vlees” en “2.5.3 Maagsap”). Niet-radicale reactieve species 

Waterstofperoxide (H2O2)

Waterstofperoxide wordt gevormd door aan superoxide een elektron en twee protonen toe te voegen (Figuur 2), zoals ook gebeurt in de dismutatiereactie (zie eerder) gekatalyseerd door het enzym superoxide dismutase (McCord en Fridovich, 1969). Ook bepaalde enzymen kunnen H2O2 vormen, zoals bv. xanthine. H2O2 is geen radicaal (de elektronen zijn gepaard) maar kan wel schadelijk zijn voor de cel bij een lage concentratie. Waterstofperoxide penetreert makkelijk membranen en zorgt voor de afbraak van heemeiwitten, de vrijstelling van ijzer, inactivatie van enzymen en oxidatie van DNA, lipiden, thiol (SH)-groepen (bv. in de aminozuren methionine en cysteïne) en ketozuren (Nyska en Kohen, 2002). In de aanwezigheid van transitiemetalen zorgt H2O2 voor de vorming van OH• (Halliwell en Gutteridge, 2007). 

Peroxynitriet (ONOO-)

Deze molecule ontstaat door de reactie van NO• met O2•- (zie eerder). Vooral de geprotoneerde vorm van peroxynitriet (ONOOH) is reactief. Het zorgt voor oxidatieve schade 5

aan veel moleculen en kan oxidatie van SH-groepen veroorzaken waardoor S-S bruggen worden gevormd (Halliwell en Gutteridge, 2007). 

Transitiemetalen

Transitiemetalen (Fe, Cu, …) zijn geen reactieve zuurstofradicalen, maar horen hier wel thuis aangezien ze ook kunnen zorgen voor oxidatie. De transitiemetalen bevinden zich in de eerste rij van het D-blok in het periodiek systeem der elementen en worden gekenmerkt door ongepaarde elektronen (behalve Zn). Ze zijn dus in staat om elektronen af te staan of op te nemen. Hierdoor bestaat het gevaar dat ze zich gedragen als katalysatoren in vrije radicaal reacties zoals de vorming van het zeer reactieve hydroxylradicaal (Halliwell en Gutteridge, 2007). Via de Fenton reactie kunnen gereduceerde transitiemetalen (zoals Fe2+) aanleiding geven tot het reactieve hydroxylradicaal (Nyska en Kohen, 2002): Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH- + OH• 2.2.3 Oxidatieve stress Om tot de definitie van oxidatieve stress te komen, worden eerst de begrippen pro- en antioxidant uitgelegd. Chemisch gezien is een oxidant elke component die elektronen kan accepteren, een reductant is een component die elektronen afstaat. In een biologisch systeem spreekt men van een pro- en antioxidant respectievelijk. Een pro-oxidant is synoniem voor reactieve species, zoals de ROS hierboven beschreven (Prior en Cao, 1999). Een antioxidant is “elke stof die oxidatieve schade aan een doelwitmolecule vertraagt, voorkomt of verwijdert” (Halliwell, 2007). Een antioxidant kan dus de werking van de pro-oxidant aanzienlijk verminderen, waarbij producten ontstaan die niet of minder toxisch zijn (Prior en Cao, 1999). Voorbeelden van antioxidanten zijn ascorbinezuur en tocoferol. Elk aeroob organisme, waaronder ook de mens, heeft een eigen oxidatieve status. Deze status zegt iets over de balans tussen pro- en antioxidanten in het lichaam. Het is voor een aeroob organisme noodzakelijk om deze balans, die specifiek is voor elk organel, in evenwicht te houden. Elke verstoring/verschuiving in deze balans kan schadelijk zijn voor het organisme. Bijvoorbeeld, door de meestal korte levensduur van de radicalen reageren ze zeer snel met andere moleculen en dit op een niet specifieke manier. Hierdoor kan de balans gaan overhellen naar de pro-oxidatieve kant, waardoor oxidatieve stress kan ontstaan. Oxidatieve stress is het proces waarbij de balans verandert in de richting van meer pro-oxidanten, waarbij 6

de capaciteit van de antioxidanten wordt overschreden. Hierdoor kunnen lipiden, proteïnen, koolhydraten en nucleïnezuren ernstige schade oplopen (Nyska en Kohen, 2002), met de vorming van verschillende aandoeningen tot mogelijk gevolg. Tengevolge van de stijgende zuurstofconcentratie hebben aerobe organismen een aantal verdedigingsmechanismen ontwikkeld om zich tegen het toxische zuurstof te beschermen. Deze mechanismen worden ook gebruikt als bescherming tegen oxidatieve stress en worden hierna opgesomd. Ten eerste kan het organisme ervoor zorgen dat de interne productie van ROS wordt beperkt. Dit kan door de activiteit te veranderen van enzymen die deze ROS produceren (bv. xanthine oxidase) (Kohen, 1999). Daarnaast beschikt het organisme ook over een herstelsysteem dat bestaat uit enzymen en kleine moleculen die beschadigde macromoleculen kunnen herstellen. Zo zijn er bv. DNA-herstelenzymen (DNA-glycosylasen) die in staat zijn een geoxideerde DNA-molecule te herstellen door de beschadigde base te vervangen door een onbeschadigde base (Krokan et al., 1997). Een derde en belangrijkste manier om om te gaan met oxidatieve stress is fysieke afweer a.d.h.v. een antioxidantsysteem. Dit systeem kan ingedeeld worden in twee groepen: de enzymatische groep en de groep van de laag moleculair gewicht antioxidanten (LMWA of Low Molecular Weight Antioxidants). De eerste groep bestaat uit o.a. superoxide dismutase, catalase en peroxidase. Deze enzymen zorgen ervoor dat de reactieve radicalen geïnactiveerd worden. De LMWA groep bevat componenten die de vrije radicalen kunnen vangen waardoor deze onschadelijk worden. Zo kunnen deze kleine moleculen meer stabiliteit geven aan membranen waardoor ze beter beschermd zijn tegen oxidatieve stress. Voorbeelden van deze componenten zijn tocoferolen, ascorbinezuur, β-caroteen en glutathion. Ze worden aangemaakt door de cel zelf of opgenomen via de voeding (Halliwell en Gutteridge, 2007). In voedingsmiddelen zijn heel wat verschillende antioxidanten aanwezig zoals ascorbinezuur, polyfenolen en α-tocoferol, maar dit wordt hier niet verder besproken. Desondanks deze verdedigingsmechanismen tegen oxidatieve stress, zijn er in de literatuur heel wat ziektes, waaronder kanker, beschreven die gelinkt worden aan oxidatieve schade.

7

2.3 Vlees en colorectale kanker 2.3.1 Algemeen Colorectale kanker is kanker die ontstaat in het colon (de dikke darm) en het rectum (de endeldarm of het einde van de dikke darm). Ferlay et al. (2007) voerden in 2006 een onderzoek uit in Europa om een overzicht te krijgen van de meest voorkomende kankers en hun respectieve sterftecijfers. Hieruit blijkt dat colorectale kanker de tweede meest voorkomende kanker is bij vrouwen, na borstkanker. Bij mannen komt colorectale kanker op de derde plaats, na long- en prostaatkanker. In 2006 was het sterftecijfer voor longkanker het hoogst (20% van de totale kankers), gevolgd door colorectale kanker met 12,2%. De preventie van colorectale kanker is reeds een belangrijk doel voor de volksgezondheid en het onderwerp van vele studies. Darmkanker zou tot 80% gereduceerd kunnen worden door een aangepast dieet. Door onderzoek kwam men tot de vaststelling dat fruit en groenten in het algemeen een beschermend effect hebben en dat roken, overgewicht en overmatig alcoholgebruik moeten vermeden worden. Vezels in het dieet reduceren waarschijnlijk specifiek het risico op colorectale kanker. Dit zou te wijten zijn aan het feit dat vezels in de dikke darm worden gefermenteerd met de productie van korte keten vetzuren. Deze vetzuren, en in het bijzonder butyraat, zouden beschermend werken door o.a. celdifferentiatie te bevorderen en cellen met beschadigd DNA te selecteren voor apoptose (Cummings en Bingham, 1998). Veel mensen worstelen met de vraag of rood vlees al dan niet het risico op colorectale kanker verhoogt. Om hierop een antwoord te kunnen geven, verzamelden Norat et al. (2002) en Larsson en Wolk (2006) de resultaten van verschillende epidemiologische studies in hun meta-analyse. In een meta-analyse worden de resultaten van eerdere onderzoeken samen geanalyseerd om zo met een grotere betrouwbaarheid conclusies te kunnen trekken. Uit deze twee meta-analyses bleek dat de totale consumptie van alle vleestypes niet geassocieerd is met een risico op colorectale kanker, net zoals de consumptie van wit vlees dat niet was. De inname van rood vlees en bewerkt vlees daarentegen werd wel gerelateerd aan colorectale kanker. Daarom adviseerde het WCRF (World Cancer Research Fund)-panel in hun rapport in 2007 om de consumptie van rood vlees te beperken en vleeswaren te vermijden (World Cancer Research Fund & American Institute for Cancer Research, 2007). Met rood vlees wordt vooral rund-, varkens-, geiten- en schapenvlees bedoeld. Studies hebben aangetoond dat er een hoger risico op colorectale kanker wordt vastgesteld in landen met een hoge consumptie van rundvlees. In India, een land waar praktisch geen rundvlees wordt 8

gegeten, is de incidentie van colorectale kanker lager (zur Hausen, 2012). Met bewerkt vlees of vleeswaren, bedoelt men vooral varkens- en kippenvlees die een bepaalde behandeling zijn ondergaan. Bewerkt vlees wordt later in een apart hoofdstuk uitgebreid besproken. Demeyer et al. (2008) merken op dat er met de resultaten van studies i.v.m. vlees en colorectale kanker altijd met voorzichtigheid moet omgegaan worden. Vaak zijn de termen “rood vlees” en “vleeswaren” niet voldoende gedefinieerd of houdt men niet voldoende rekening met de grote variatie in samenstelling van het vlees. Hierna wordt verder ingegaan op de bijdrage van ROS in het proces carcinogenese of het ontstaan van kanker. 2.3.2 Oxidatie en kanker Zoals eerder vermeld kunnen ROS op verschillende manieren in het lichaam ontstaan. Deze ROS zijn in staat om DNA-basen aan te vallen waardoor beschadigde basen en DNA crosslinks ontstaan of waardoor de DNA-helix kan breken (Marnett, 2000). Hierdoor ontstaan verschillende DNA-adducten zoals 8-hydroxyguanine, 7-methylguanine en 4-aminobifenyl (Hemminki, 1993). Het lichaam beschikt echter over mechanismen om DNA-schade te herstellen, zoals het uitsnijden van beschadigde basen (BER of Base Excision Repair) en beschadigde nucleotiden (NER of Nucleotide Excision Repair) (Cooke et al., 2003). Maar als de celreplicatie plaats vindt voor het herstel, dan ontstaan er mutaties in het DNA (Klaunig, 2004). Deze mutaties zijn een cruciale stap in de carcinogenese. Ook lipiden en eiwitten kunnen geoxideerd worden door de ROS met de vorming van oxidatieproducten. Deze oxidatieproducten kunnen op hun beurt weer schade berokkenen aan DNA-basen (Esterbauer et al., 1990). De veten eiwitoxidatie worden later meer in detail besproken. Uit onderzoek blijkt dat vooral het hydroxylradicaal (OH•) zorgt voor geoxideerd DNA. Door zijn grote reactiviteit bindt het aan de basen of kan het waterstofatomen onttrekken aan moleculen (Dizdaroglu et al., 2002). Tot hiertoe is er enkel nog maar schade aan het DNA, maar hoe ontstaat nu kanker? Zoals blijkt uit Figuur 3 bestaat het proces carcinogenese uit drie stappen: de initiatie, de promotie en de progressie. ROS zijn in staat om tussen te komen in alle drie de stadia. Tijdens de initiatie ontstaan er niet-letale mutaties in het DNA waardoor de cel gewijzigd wordt. Hierop volgt de promotiefase waarbij de aangetaste cel zogezegd gekloneerd wordt en snel uitbreidt. Dit kan door celproliferatie (snelle vermenigvuldiging van de cel) en/of door de remming van de apoptose (geprogrammeerde celdood). De promotie is een reversibel proces 9

aangezien het pas kan doorgaan als de lesievormende prikkel aanwezig is. Na de promotie is dus een focale laesie gevormd. Als laatste stap volgt de irreversibele progressie waarbij de laesie cellulaire en moleculaire veranderingen ondergaat. Tijdens de progressiefase stapelt de genetische schade zich verder op met als eindpunt de tumorvorming. De initiële cel is nu overgegaan in een kwaadaardig gezwel (Klaunig en Kamendulis, 2004; Valko, et al., 2006). In Figuur 3 is ook te zien dat veel oxidatieve stress nefast is voor de cel door het induceren van de apoptose van gezonde cellen, maar ook weinig oxidatieve stress kan al schadelijk zijn, doordat de celdeling en dus ook de tumorgroei worden gestimuleerd.

Figuur 3. De drie fases in het proces carcinogenese en het effect van het niveau van oxidatieve stress op carcinogenese (Valko et al., 2006) De bijdrage van de reactieve zuurstofmoleculen in het ontstaan van kanker beperkt zich niet enkel tot het induceren van mutaties in DNA. Verschillende studies hebben aangetoond dat ROS ook hun stempel kunnen drukken door te interageren met de signaaltransductie pathway van de cel. Via deze pathway is de cel in staat om informatie van buitenaf naar binnen te brengen en zo te vertalen in de gewenste acties bv. genexpressie en celgroei. De overdracht van deze informatie gebeurt via een groep eiwitten, namelijk transcriptiefactoren. De belangrijkste bijdrage van de ROS tot deze signaaltransductie is ten eerste verandering in de intracellulaire redoxstatus van de cel, en ten tweede verandering aan belangrijke eiwitten in deze pathway. Teveel reactieve zuurstofmoleculen leidt dus tot een verstoring van de informatieoverdracht in de cel, met alle gevolgen van dien (Palmer en Paulson, 1997; Thannickal en Fanburg, 2000). Toyokuni et al. (1995) vermelden in hun studie dat de aanwezigheid van veel ROS leidt tot bv. een continue activatie van de transcriptiefactoren, 10

genetische instabiliteit (afwijkende chromosomen) en de activatie van specifieke antioxidantsystemen waardoor kankercellen resistent worden tegen chemotherapie (Toyokuni et al., 1995). 2.3.3 De rol van onze darmbacteriën in het ontstaan van colorectale kanker Een belangrijke functie van onze darmbacteriën is de fermentatie van koolhydraten en eiwitten die ontsnapt zijn aan de vertering in het duodenum (zie verder “2.5.4.1 Duodenum”). De meeste micro-organismen verkiezen koolhydraten als energiebron en zullen deze dus eerst fermenteren. Als de koolhydraten uitgeput zijn schakelen ze over op eiwitfermentatie (Ouwehand et al., 2005). De eindproducten van de koolhydraatfermentatie zijn korte keten vetzuren (acetaat, propionaat en butyraat) en lactaat, die positief beschouwd worden voor de gezondheid (Scheppach, 1994), terwijl de eiwitfermentatie ook leidt tot toxische metabolieten zoals ammoniak. De koolhydraatafbraak vindt vooral plaats in het proximaal colongedeelte, afbraak van eiwitten in het distaal gedeelte (Figuur 4) (Guarner en Malagelada, 2003). Dit kan een verklaring zijn voor het feit dat kanker vooral optreedt in het distaal colongedeelte (Van Nuenen et al., 2004).

Figuur 4. Fermentatie in het colon (Guarner en Malagelada, 2003) Verschillende studies hebben aangetoond dat onze microbiota reacties kunnen teweeg brengen met de activatie of productie van mutagene en carcinogene stoffen tot gevolg. Er wordt dan ook gesuggereerd dat de darmbacteriën functioneren als een soort tussenpersoon in darmkanker. Vantassell et al. (1990) geeft een overzicht van deze reacties die mogelijks een rol kunnen spelen in het ontstaan van kanker, zoals de reductiereacties van nitriet waardoor Nnitroso componenten kunnen ontstaan (zie verder “2.5.4.2 Colon en microbiota”). Onderzoek heeft aangetoond dat 15 bacteriespecies significant geassocieerd zijn met een hoog risico op colonkanker, hiertoe behoren Bacteroides species en zeer verrassend ook 11

Bifidobacterium species (Moore en Moore, 1995). Een verklaring voor de rol van de Bacteroides species is de volgende: de groei van Bacteroides species wordt gestimuleerd door galsap waarvan de secretie toeneemt naarmate er meer vet in het dieet aanwezig is en een vetrijk dieet is geassocieerd met kanker (zie “2.4.3 Vet en vetoxidatie”). Verschillende stammen van deze bacteriën kunnen gal omzetten tot fecapentaenen en metabolieten die beschouwd worden als co-carcinogeen (Kingston et al., 1990). Uit hetzelfde onderzoek blijkt dat vijf species significant geassocieerd zijn met een laag risico op colonkanker, zoals sommige Lactobacillus species en Eubacterium aerofaciens. Dit wil niet zeggen dat deze species bescherming bieden tegen colonkanker maar dat hun aanwezigheid gekoppeld is met weinig oxidatieve stress.

2.4 Factoren die de oxidatie in vleeswaren beïnvloeden 2.4.1 Algemeen Zoals eerder vermeld is vleeswaren de verzamelnaam voor vlees dat een bepaalde behandeling heeft ondergaan. Voorbeelden van deze behandelingen zijn: zout, suiker en nitriet of nitraat aan het vlees toevoegen, met als doel de smaak en houdbaarheid te verbeteren, vlees roken (dit is het vlees blootstellen aan de rook van houtpyrolyse) om het vlees een gewenste kleur te geven en het langer te kunnen bewaren. Vleeswaren zijn bijvoorbeeld ham, salami, hotdogs, hamburgers, bloedworst enz. (Santarelli et al., 2008). Consumptie van vleeswaren zou een belangrijke bijdrage leveren als het gaat over de relatie tussen vlees en colorectale kanker. Het aandeel van dit vlees in onze totale vleesconsumptie kan oplopen tot 50% (Santarelli et al., 2008). Dit komt vooral door onze drukke agenda waardoor er een stijgende trend is naar voorverpakt en voorbereid vlees. De verschillende hypotheses die verklaren waarom vleeswaren in het bijzonder een hoger risico op colorectale kanker inhoudt, worden hier toegelicht. 2.4.2 Heemijzer 2.4.2.1 Algemeenheden Heem bestaat uit een heterocyclische organische ring, een porfyrine, met centraal een ijzeratoom (Figuur 5). De heemgroep bevindt zich in heemeiwitten zoals hemoglobine, myoglobine en cytochromen. De eerste twee spelen een belangrijke rol bij het zuurstoftransport in het lichaam, de laatste zijn betrokken bij het elektronentransport. 12

Myoglobine komt voornamelijk voor in de spieren en is verantwoordelijk voor de rode kleur van vlees. Rood vlees kan tot tien keer meer myoglobine/heem bevatten dan wit vlees. Het heemijzer in nitriet-behandeld vlees is gebonden met een NO-groep (genitrosyleerd), wat de specifieke roze kleur aan deze vleeswaren geeft (Figuur 5) (Bastide et al., 2011).

Figuur 5. Structuur van heem en genitrosyleerd heem (Bastide et al., 2011) Bastide et al. (2011) toonden in hun meta-analyse aan dat er een significante, consistente, maar beperkte stijging is in het risico op colonkanker (niet colorectale kanker, rectale kanker werd niet in rekening gebracht door een gebrek aan data) door een hoge inname van heemijzer. 2.4.2.2 Mechanisme Hoe bevordert heemijzer nu het ontstaan van colorectale kanker? Het antwoord op deze vraag wordt gegeven a.d.h.v. Figuur 6. Op deze figuur worden twee mogelijke verklaringen geschetst. Ten eerste stimuleert heemijzer de vorming van ATNCs (Apparent Total N-nitroso Compounds; dit zijn nitrosamines, nitrosamiden, nitrosyl-ijzer en S-nitrosothiols), en ten tweede is heemijzer een belangrijke motor achter de vetoxidatie.

13

Figuur 6. De katalytische werking van heemijzer op de vorming van ATNCs en vetoxidatie (Bastide et al., 2011) 

ATNCs

Cross et al. (2003) hebben in hun studie aangetoond dat na de consumptie van vers rood vlees, vooral het heemijzer, en niet de eiwitten of het anorganisch ijzer, de NOC (N-Nitroso Compounds) productie bevordert. De carcinogeniteit of de mate waarin deze stoffen kanker veroorzaken is nog niet helemaal duidelijk (zie verder: “2.4.5 Nitriet en de vorming van Nnitroso componenten“). Wel is aangetoond dat de meeste NOCs DNA-schade kunnen berokkenen waardoor mutaties ontstaan (Bastide et al., 2011). 

Vetoxidatie

Onverzadigde vetzuren zijn gevoelig voor oxidatie. Ze kunnen aangevallen worden door een radicaal waardoor een kettingreactie op gang komt die gekatalyseerd wordt door heemijzer via de Fenton reactie (zie eerder) (zie ook verder “2.4.3 Vet en vetoxidatie”) (Bastide et al., 2011).

14

De belangrijkste producten die bij vetoxidatie ontstaan zijn malondialdehyde (MDA) en 4hydroxynonenal (4-HNE), die DNA-adducten kunnen vormen of mutaties veroorzaken, zoals blijkt uit Figuur 6.

Calciumzouten en chlorofyl vormen een belangrijke bescherming aangezien ze in staat zijn de heemmoleculen neer te slaan (Sesink et al., 2001; Balder et al., 2006). Op Figuur 6 is ook te zien dat bepaalde componenten het carcinogeen effect van heemijzer kunnen reduceren. Tocoferolen en ascorbinezuur zouden de endogene vorming van ATNCs kunnen verhinderen (Mirvish, 1986), polyfenolen (aanwezig in bv. rode wijn) kunnen verhinderen dat vetoxidatie producten geabsorbeerd worden (Gorelik et al., 2008). 2.4.3 Vet en vetoxidatie 2.4.3.1 Algemeenheden Achteruitgang van de vleeskwaliteit wordt voornamelijk toegeschreven aan vetoxidatie. Oxidatie van vetten zorgt namelijk voor een bedorven smaak en geur, verkleuring van het vlees en de productie van componenten die toxisch kunnen zijn (Morrissey et al., 1994a; Gray et al., 1996). Bewerkt vlees wordt gekarakteriseerd door een hoger vetgehalte vergeleken met onbewerkt vers vlees. Verschillende studies en dierenproeven hebben aangetoond dat een vetrijk dieet het ontstaan van colorectale kanker bevordert. Dit zou vooral te wijten zijn aan de hogere secretie van galzuren, zoals deoxycholinezuur, in het duodenum. Hoe meer vet, hoe meer galzuren gesecreteerd worden en ook des te meer vrije vetzuren die vrijkomen. Zowel de galzuren als de vetzuren kunnen schade berokkenen aan de epitheelcellen in het colon (Bruce, 1987; Santarelli et al., 2008). Andere epidemiologische studies hebben echter ook aangetoond dat er geen effect was van gal- en vetzuren op colorectale carcinogenese (Willett, 2001; Santarelli et al., 2008). 2.4.3.2 Mechanisme en gevolgen Vetoxidatie in spieren (vlees) vindt vooral plaats ter hoogte van de celmembranen, in de fosfolipidenfractie. De vetoxidatie start vanaf het moment dat het dier geslacht wordt en gaat door gedurende de bewaring en bereiding van het vlees (Gray et al., 1996). Na het slachten vinden

biochemische

veranderingen

plaats

in

het

spierweefsel

waardoor

het

verdedigingsmechanisme van de cel stil valt en oxidatie wordt bevorderd. Een aantal van deze

15

post mortem veranderingen zijn bv. een pH daling tot 5,5 en een verminderde functie van antioxidant enzymen (Morrissey et al., 1994a). Er zijn verschillende manieren waarop onverzadigde vetzuren kunnen geoxideerd worden. Eén hiervan is “photosensitized oxidation” of lichtgevoelige oxidatie. Hierbij is het onverzadigd vetzuur blootgesteld aan licht en een sensibilisator (Sens) zoals chlorofyl. Door de sensibilisator wordt zuurstof geactiveerd tot het reactieve singlet zuurstof (reactie 2) dat het vetzuur (LH) zal oxideren tot een hydroperoxide (LOOH) (reactie 3) (Frankel, 1984). Sens → Sens* (excited)

[1]

Sens* + 3O2 → 1O2 + Sens

[2]

1

[3]

O2 + LH → LOOH

Een andere en meest voorkomende manier van vetoxidatie is de autoxidatie. Dit proces verloopt in drie stappen: de initiatie, propagatie en terminatie (Frankel, 1980). Tijdens de initiatie wordt een vetzuur aangevallen door reactieve species (bijvoorbeeld OH•) waardoor een waterstofatoom onttrokken wordt (reactie 4). Meervoudig onverzadigde vetzuren (PUFA of Poly Unsaturated Fatty Acids) zijn gevoeliger dan mono-onverzadigde vetzuren (MUFA) voor oxidatie, aangezien het verwijderen van een waterstofatoom makkelijker gaat naarmate het aantal dubbele bindingen in het vetzuur toeneemt (Halliwell en Chirico, 1993). LH + OH• → L• + H2O

[4]

Uit de initiatie ontstaan acylradicalen (L•) die snel reageren met zuurstof tijdens de propagatie (reacties 5 en 6). L• + O2 → LOO•

[5]

LOO• + LH → LOOH + L•

[6]

Hierbij ontstaan onstabiele peroxideradicalen LOO• die op hun beurt een waterstofatoom kunnen onttrekken van naburige vetzuren met de vorming van hydroperoxides (LOOH), de primaire producten van vetoxidatie. Hierdoor wordt de kettingreactie van radicalen in stand gehouden (Morrissey et al., 1998). De hydroperoxides zijn smaak-, kleur- en geurloos en kunnen zelf nog verdere reacties ondergaan met Fe2+ en Cu+ dat aanleiding geeft tot LOO• en alkoxylradicalen (LO•) (reacties 7 en 8) (Morrissey et al., 1994b).

16

Fe2+ + LOOH → Fe3+ + LO• + OH-

[7]

Fe3+ + LOOH → LOO• + Fe2+ + H+

[8]

De terminatie van de kettingreactie ontstaat wanneer bijvoorbeeld twee peroxideradicalen met elkaar reageren. Hierdoor wordt een onstabiel intermediair gevormd dat snel uiteen valt in niet radicale producten en zuurstof (reactie 9). Een andere mogelijke manier van terminatie is reactie 10. LOO• + LOO• → [LOOOOL] → niet radicaal producten + O2 L• + L• → LL

[9] [10]

Zowel LOO• als LO• kunnen verdere reacties ondergaan (zoals reactie 11) en LO• kan βsplitsing ondergaan waardoor het wordt omgevormd tot alkylradicalen (L’CH•2) en verschillende aldehydes (L”CHO) (reactie 12) zoals hexanal, malondialdehyde (MDA) en 4hydroxynonenal (4-HNE) (Morrissey et al., 1994b). Dit zijn de secundaire oxidatieproducten (Raharjo en Sofos, 1993; zie ook Figuur 6). LO• + LH → LOH + L•

[11]

LO• → L’CH•2 + L”CHO

[12]

Er bestaat ook nog enzymgeïnduceerde vetoxidatie waarbij o.a. lipoxygenase de vorming van hydroperoxides in vlees katalyseert. Dierlijk weefsel bevat ook nog peroxidasen en cyclooxygenasen die vooral in staat zijn vetoxidatie te initiëren en deze oxidatie verder te zetten in post mortem weefsel (Kubow, 1992).

De belangrijkste gevolgen van vetoxidatie zijn uiteraard het ontstaan van de secundaire componenten die mogelijks carcinogeen zijn (Figuur 6), maar ook het vernietigen van essentiële celmembranen en de interactie van de oxidatieproducten met andere moleculen (eiwitten, enzymen, DNA) (Kubow, 1992). 2.4.3.3 Beïnvloedende factoren Processen zoals het snijden, malen en koken van vlees zorgen ervoor dat celmembranen worden vernietigd, waardoor vetoxidatie sneller plaats vindt en de primaire oxidatieproducten sneller worden afgebroken tot secundaire producten. Deze laatste worden dan ook gebruikt als merker voor vetoxidatie (Raharjo en Sofos, 1993). Vooral aldehydes worden beschouwd als 17

belangrijke afbraakproducten omdat ze snel gevormd worden tijdens oxidatie en omwille van hun bijdrage tot een ranzige vleessmaak (Gray et al., 1996).

Zoals eerder vermeld, speelt de verzadiging van de vetzuren een grote rol. Hoe hoger de graad van verzadiging, hoe sneller en makkelijker de vetzuren geoxideerd worden. Verder hangt de stabiliteit van vetten ook af van het spiertype, hoeveelheid en type vet in het dieet van het dier, aanwezigheid van ziektes of infecties en het proces dat bereid vlees onderging (Morrissey et al., 1998). Tijdens deze processen komt Fe vrij uit o.a. hemoglobine en myoglobine en kan het chelaten vormen met laag moleculair gewicht componenten zoals aminozuren, fosfaten en nucleïnezuren. Deze chelaten kunnen nog steeds de Fenton reactie katalyseren, waardoor OH• gevormd wordt en de vetoxidatie kan plaats vinden (Halliwell en Gutteridge, 1986). 2.4.4 Eiwitoxidatie 2.4.4.1 Algemeenheden In tegenstelling tot vetoxidatie, is er nog maar weinig geweten over de oxidatie van eiwitten in vlees. Dit komt vooral doordat er de laatste decennia nog geen optimale methoden waren om de mate van eiwitoxidatie te bepalen en ook ging men ervan uit dat vooral de vetoxidatie en microbieel bederf zorgen voor een mindere vleeskwaliteit (Lund et al., 2011). Echter, de complexe chemie die gepaard gaat met eiwitoxidatie zorgt ervoor dat nog veel onderzoek nodig is om een beter en volledig inzicht te krijgen in de oxidatieproducten en hun verschillende pathways (Estevez, 2011). Het werd nog niet onderzocht in welke mate eiwitoxidatie afkomstig van vleesproducten bijdraagt tot colonkanker, maar al veel studies hebben een invloed van geoxideerde eiwitten (in het lichaam door oxidatieve stress) op leeftijdsgebonden ziekten (zoals Alzheimer) gevonden (Berlett en Stadtman, 1997). In een Chinese populatie heeft onderzoek van Chang et al. (2008) aangetoond dat het gehalte aan eiwitoxidatie producten in plasma significant hoger is bij mensen met colorectale kanker in vergelijking met gezonde mensen. Yeh et al. (2010) hebben gekeken naar de interactie tussen oxidatieve stress en een genetische factor (polymorfismen van GSTs, glutathion S-transferases) en hun invloed op colorectale kanker. Hieruit bleek dat het gemiddeld carbonylgehalte in plasma significant hoger was bij kankerpatiënten. Eiwitoxidatie producten worden gebruikt als merker voor oxidatie maar zijn deze producten zelf schadelijk? Kunnen ze ter hoogte van de darm schade berokkenen of 18

moeten ze eerst opgenomen worden in het lichaam? Het antwoord op deze vragen is nog niet duidelijk. Het zou dan ook interessant zijn om deze aspecten van eiwitoxidatie te onderzoeken. 2.4.4.2 Mechanisme en gevolgen Bij vetten start de oxidatie aan de dubbele bindingen van PUFA. Een eiwitmolecule daarentegen bevat verschillende plaatsen die gevoelig zijn voor oxidatie, zowel de eiwitruggengraat als de aminozuurzijketens kunnen aangevallen worden door ROS. Men spreekt dan van “ROS-mediated protein oxidation”. ROS zijn in staat eiwitoxidatie te initiëren waardoor de eiwitten modificaties ondergaan. Voorbeelden van deze wijzigingen zijn: splitsing van peptidebindingen, de vorming van intra- en intermoleculaire bindingen (crosslinks) en omvorming van de aminozuurzijketens (Stadtman en Levine, 2003). Verschillende studies hebben aangetoond dat oxidatie een invloed heeft op de functionaliteit van eiwitten (Carlin et al., 2006) en op de vleeskwaliteit door een daling van de malsheid van het vlees (Lonergan et al., 2010). Het is nog niet duidelijk welke processen juist aan de basis liggen van deze ongewenste veranderingen (Estevez, 2011). Figuur 7 is een weergave van de meest voorkomende eiwitmodificaties. Wijzigingen van aminozuren geven algemeen aanleiding tot carbonylgroepen en eiwit hydroperoxiden. Crosslinks zijn vooral disulfide- en dityrosinevorming door het verlies van cysteïne- en tyrosineresiduen. De carbonyls bestaan uit aldehyden en ketonen (Estevez, 2011), het zijn koolstofmonoxide (CO)-groepen die gevormd worden waarbij de eiwitmoleculen irreversibel gewijzigd worden ten gevolge van oxidatieve stress. De CO-groepen worden vooral gevormd via de directe oxidatie van de zijketens van lysine, arginine, proline en threonine (Stadtman en Levine, 2003). Deze manier van carbonylvorming is een voorbeeld van “metal catalyzed protein oxidation” of MCO (zie verder). Een ander belangrijk gevolg van eiwitoxidatie is de vorming van polymeren door inter- en intramoleculaire crosslinks. Meer bepaald gaat het over de vorming van disulfide bindingen en dityrosine door de oxidatie van thiolgroepen (S-H). Vooral de thiolgroep in het aminozuur cysteïne (RSH) is zeer gevoelig voor oxidatie. Dit aminozuur is belangrijk in veel enzymen zoals het enzym glutathion dat zorgt voor bescherming tegen oxidatieve schade (Shan et al., 1990). Door oxidatieve stress verdwijnen dus heel wat thiolgroepen. Samengevat zijn eiwitten in het vlees gevoelig voor oxidatie waardoor carbonylgroepen ontstaan en thiolgroepen verdwijnen. De carbonylgroepen worden vroeg gevormd en zijn 19

redelijk stabiel met als gevolg dat ze gebruikt worden als merker voor eiwitoxidatie en oxidatieve stress (Dalle-Donne et al., 2003; Estevez, 2011). Ook de thiols kunnen gebruikt worden als een merker voor oxidatieve stress: hoe minder thiolgroepen hoe meer oxidatie is opgetreden.

Figuur 7. Meest voorkomende eiwitmodificaties na oxidatie (Lund et al., 2011) Algemeen verloopt de eiwitoxidatie net zoals de vetoxidatie via een kettingreactie van radicalen: een radicaal onttrekt een waterstofatoom van het eiwit (PH), waardoor een carboncentered eiwitradicaal (P•) ontstaat (reactie 14). In de aanwezigheid van zuurstof wordt het radicaal P• omgevormd tot een peroxylradicaal (POO•) (reactie 15) en verder tot een alkylradicaal (POOH) door weer een waterstofatoom te onttrekken van een andere molecule (reactie 16) met de vorming van een nieuw radicaal (Stadtman en Levine, 2003). PH + HO• → P• + H2O

[14]

P• +O2 → POO•

[15]

POO• +PH → POOH + P•

[16]

Cysteïne en methionine zijn twee aminozuren die het meest gevoelig zijn voor oxidatie aangezien ze zwavel bevatten. Vooral aan methionine wordt de interessante eigenschap van antioxidant toegekend, waardoor andere aminozuren beschermd worden tegen oxidatie (Levine et al., 1999). MCO is de oxidatie van eiwitten waarbij de tussenkomst van gereduceerde transitiemetalen (Mn+) aanleiding geeft tot het reactieve hydroxylradicaal (OH•) via de Fenton reactie (zie eerder). OH• kan dan de kettingreactie op gang zetten. In principe is hier dus geen zuurstof voor nodig. 20

Zoals eerder aangehaald hebben verschillende onderzoeken bewezen dat colorectale kanker positief gecorreleerd is met producten van eiwitoxidatie. De kettingreactie van deze oxidatie zorgt namelijk voor radicalen die in staat zijn schade te berokkenen aan het DNA van de coloncellen. 2.4.5 Nitriet en de vorming van N-nitroso componenten 2.4.5.1 Algemeenheden nitriet en nitraat Zowel nitriet (NO2-) als nitraat (NO3-) worden toegevoegd aan vlees om het de gewenste smaak, kleur en een goede bewaarbaarheid te geven. Beide stoffen worden gewoonlijk onder de vorm van natrium- en kaliumzouten toegevoegd en hun hoeveelheid is wettelijk bepaald (Honikel, 2008). De werkzame stof is nitriet die in eerste instantie werd toegevoegd om bacteriegroei (in het bijzonder van Clostridium botulinum) te remmen, dus om microbieel bederf van het vlees te voorkomen (Santarelli et al., 2008). 2.4.5.2 Nitriet in vlees Zouten zijn zeer goed wateroplosbaar en eens toegevoegd aan het vlees komt het nitriet snel vrij. Nitriet is zeer reactief en als het gemengd wordt met vlees, ondergaat het onmiddellijk heel wat processen. Zo zal een deel van het nitriet geoxideerd worden tot nitraat, waarbij nitriet dienst doet als antioxidant aangezien zuurstof nodig is. Een ander deel zal binden met eiwitten in het vlees en nog een ander deel zal binden met myoglobine (Honikel, 2008). Door dit laatste proces ontstaat nitrosylmyoglobine die het rauwe vlees een rode kleur geeft. Door het vlees te koken, komt myoglobine los van de heemgroep en ontstaat er een roos complex, mono-nitrosylheem, die verantwoordelijk is voor de roze kleur van gekookte vleeswaren zoals bv. ham. In Figuur 8 staan de mogelijke reacties die optreden als nitraat onder de vorm van salpeterzuur (KNO3) wordt toegevoegd aan vlees. Stikstofoxide (NO) reageert niet alleen met myoglobine maar ook met aminozuren. NO kan ook terug geoxideerd worden tot NO2 met tussenkomst van O2, waaruit weer de antioxidant capaciteit van nitriet blijkt (Honikel, 2008).

21

Figuur 8. Reacties van nitraat in behandeld vlees (Honikel, 2008) Door al deze reacties verdwijnen nitriet en nitraat dus snel uit het vlees en worden ze niet meer als dusdanig gedetecteerd. 2.4.5.3 Voor- en nadelen van nitriet Een positieve eigenschap van nitriet is, zoals eerder vermeld, de kleur, textuur, smaak en bewaarbaarheid van het vlees bevorderen. Ook de antioxidatieve werking bij de reductie tot nitraat werd toegelicht. Hierbij komt nog het extra voordeel dat de reacties die nitriet ondergaat, zorgen voor het ontstaan van “cured pigments” waardoor Fe in deze pigmenten wordt vastgehouden en gereduceerd wordt tot Fe2+ en dus niet ter beschikking komt als katalyst van de vetoxidatie (samengevat in Sindelar en Houser, 2009). Helaas is er ook een keerzijde aan de medaille. Ten eerste is er het risico op de vorming van peroxynitriet door reactie van NO• met O2•- (zie “2.2.2 Reactieve zuurstofmoleculen”). Ten tweede kan nitriet in het lichaam reageren met amines en amiden, gevormd door bacteriën bij de eiwitafbraak, waardoor N-nitroso componenten (NOCs of N-Nitroso Compounds) ontstaan. De amines en amiden ondergaan dus een nitrosering (dit is het toevoegen van een nitrosogroep R-N=O), met de vorming van nitrosamines en nitrosamides respectievelijk (Mirvish, 1986; Santarelli et al., 2008). NOCs zijn aanwezig in sommige behandelde vleeswaren en kunnen ook nadien nog gevormd worden tijdens de vertering. Ze kunnen reageren met DNA en zijn waarschijnlijk carcinogeen voor de mens. Dit vormt vooral een probleem voor spek. Dit type vlees bevat redelijk wat residueel nitriet, wordt blootgesteld aan hoge temperaturen en bevat secundaire amines (Wolff en Wasserman, 1972). De aanwezigheid van heem bepaalt in grote mate de vorming van NOCs (zie eerder bij “2.4.2 Heemijzer”). Nog meer onderzoek is nodig om aan te tonen of NOCs van rood en behandeld vlees al dan niet kanker veroorzaken in het colon (Santarelli et al., 2008).

22

2.5 Oxidatieprocessen tijdens de vertering 2.5.1 Algemeen Voedsel dat ons lichaam binnenkomt, komt eerst in contact met speeksel. Het speeksel zorgt voor het bevochtigen en “smeren” van het voedsel zodat het makkelijk kan ingeslikt worden en als een gladde bolus naar de maag kan gaan. Er vindt al een eerste enzymatische vertering plaats en het speeksel heeft ook een belangrijke bufferende werking. In de maag zorgt het maagsap voor een verdere afbraak van het voedsel tot kleinere deeltjes en eiwitten worden voorverteerd. Vervolgens komt de voedselbrij in de dunne darm terecht, waarin de pancreas enzymen (protease, amylase, lipase) afscheidt om de voedseldeeltjes (eiwitten, koolhydraten, vetten) verder te splitsen in absorbeerbare stukken. Bij de vetvertering zijn de galzouten van groot belang, zij worden geleverd door de lever. De dunne darm zorgt dus voor de vertering en absorptie van voedseldeeltjes en water. Het laatste stadium is de dikke darm. Deze dient als een reservoir voor de darminhoud en absorbeert ook water en elektrolyten (Silbernagl en Despopoulos, 2005). In dit hoofdstuk worden de verschillende componenten in de verteringssappen besproken, die een invloed kunnen hebben op oxidatie. 2.5.2 Speeksel Ons speeksel bevat een interessant antioxidant systeem, waarbij urinezuur de belangrijkste antioxidant is, gevolgd door ascorbinezuur (Moore et al., 1994). Van de enzymen blijken de peroxidasen de hoogste antioxidantcapaciteit te hebben. In speeksel zijn er twee peroxidase enzymen: speekselperoxidase dat van structuur zeer goed op lactoperoxidase (aanwezig in koemelk) lijkt en myeloperoxidase (Nagler et al., 2002). Speekselperoxidase heeft een dubbele rol: het kan het gehalte aan H2O2, gesecreteerd door bacteriën en leukocyten in de mondholte, onder controle houden en heeft tegelijkertijd een specifieke antibacteriële activiteit: H2O2 oxideert het thiocyanaat ion (SCN-), met de vorming van het bacteriostatische hypothiocyaanzuur (HOSCN). Deze reactie wordt gekatalyseerd door speekselperoxidase, waarbij het dus optreedt als pro-oxidant. Myeloperoxidase wordt gevormd in monocyten en leukocyten en kan ook de oxidatie van het chloride ion (Cl-) tot het bactericidisch hypochloorzuur (HOCl) door H2O2, katalyseren (Thomas et al., 1994). Uit de literatuur blijkt dus dat de peroxidasen zowel pro- als antioxidatief kunnen zijn.

23

Superoxide dismutase katalyseert de dismutatiereactie, het is in kleine hoeveelheden aanwezig in het speeksel en heeft een secundaire antioxidantwerking (Nagler et al., 2002). Andere enzymen met een minder significante antioxidantwerking in speeksel zijn catalase, glutathion peroxidase en glutathion reductase (Pereslegina, 1989). Gorelik et al. (2007) onderzochten de invloed van de verschillende componenten van speeksel op vetoxidatie in spierweefsel (rood kalkoenvlees). Hieruit bleek dat de vetoxidatie stijgt door de werking van enkel lactoperoxidase en daalt door een afzonderlijke werking van SCN- en nitriet. Bovendien werd in dezelfde studie aangetoond dat de antioxidant werking van speeksel stijgt naarmate de nitrietconcentratie in het speeksel stijgt. De antioxidantwerking van nitriet is volgens Gorelik et al. (2007) te wijten aan de omzetting van nitriet tot NO•. Deze laatste kan de vetoxidatie verminderen door o.a. te reageren met heemijzer en het vangen van peroxideradicalen (LOO•) en alkoxylradicalen (LO•). Het belangrijkste antioxidant effect van NO is volgens Gorelik et al. (2007) te wijten aan het feit dat NO• een ligand kan vormen met Fe3+-complexen waarbij ROS moleculen worden omgezet naar minder schadelijke componenten (bijvoorbeeld reactie 17). X-Fe3+-NO• + H2O2 → X-Fe3+ + NO2- + HO-

[17]

Nitriet in het speeksel is afkomstig van nitraat in onze voeding: het nitraat wordt geabsorbeerd door de dunne darm en ongeveer 25% hiervan wordt opgenomen door de speekselklieren die het terug secreteren in de mond. Bacteriën op onze tong reduceren 30% van dit nitraat tot nitriet (samengevat in Iijima et al., 2003). Vervolgens komt het nitriet in de maag terecht waar het heel wat veranderingen ondergaat (zie verder “2.5.3 Maagsap”). 2.5.3 Maagsap In het maagsap zijn zowel pro- als antioxidanten aanwezig. Om verder te gaan op wat hierboven beschreven staat, wordt eerst de rol van ascorbinezuur in het maagsap beschreven. Nitriet uit het speeksel komt in de maag terecht en komt daar in contact met ascorbinezuur. Dit zuur en de zure condities zorgen ervoor dat nitriet wordt gereduceerd tot stikstofoxide (NO•). Hoe zuurder de pH, hoe meer NO• vorming. Iijima et al. (2003) hebben aangetoond dat de vorming van NO• op deze manier binnen enkele seconden plaats vindt. Ook thiocyanaat, dat uit het speeksel in de maag komt, speelt hierbij een belangrijke rol: hoe meer SCN-, hoe meer NO•-vorming en hoe hoger de NO•-piekconcentratie.

24

Nitriet wordt ook geprotoneerd tot salpeterig zuur (HNO2), hierdoor kunnen nitroserende species zoals N2O3, NO+ en NOSCN ontstaan, die reageren met ascorbinezuur. Kort samengevat kan de snelle vorming van NO• veel ascorbinezuur verbruiken (ascorbinezuur wordt geoxideerd) wat aanleiding geeft tot “nitrosative” stress: er worden carcinogene Nnitroso componenten gevormd en SCN- katalyseert de reactie (samengevat in Iijima et al., 2003). Ascorbinezuur speelt dus eigenlijk een dubbele rol: eerst zorgt het voor de vorming van NO• waardoor nitroserende species ontstaan, nadien beschermt het tegen oxidatieve stress door te reageren met deze componenten waardoor er geen N-nitroso componenten kunnen gevormd worden. Maagsap bevat naast ascorbinezuur ook Fe-ionen en H2O2. Door de aanwezigheid van deze laatste twee componenten kunnen hydroxylradicalen gevormd worden volgens de Fenton reactie (zie “2.2.2 Reactieve zuurstofmoleculen”). H2O2 kan ook reageren met HNO2 waardoor reactieve stikstofmoleculen kunnen ontstaan (Takahama en Oniki, 2004). De aanwezigheid van hydroxylradicalen wordt beïnvloed door verschillende componenten: SCN-, NO2- en NO• (gevormd zoals hierboven beschreven) zijn in staat de radicalen te vangen en in aanwezigheid van Fe2+ of Fe3+ kan ascorbinezuur de vorming van OH radicalen stimuleren (Halliwell en Gutteridge, 2007). Het onderzoek van Takahama en Oniki (2004) toonde aan dat SCN- en NO2- in staat zijn samen te werken om de maag te beschermen tegen OH radicalen. Nitriet in de maag is dus een pro- en antioxidant terwijl het in speeksel fungeert als een antioxidant. Glucosamine is een amino monosaccharide dat van nature aanwezig is in o.a. gastrointestinale mucosa. Onderzoek van Xing et al. (2006) heeft aangetoond dat glucosamine-HCl een aanzienlijke antioxidant capaciteit heeft: het is in staat O2•- en OH• radicalen te vangen. 2.5.4 Darm De darm biedt een belangrijke bescherming aan ons lichaam tegen componenten die zich in het darmlumen bevinden. Dit zijn bijvoorbeeld oxidanten afkomstig van het voedsel (zoals hydroperoxiden), kankerverwekkende stoffen of endogeen gevormde ROS (Ames, 1983). Om hieraan te voldoen heeft de darm verdedigingsmechanismen ontwikkeld zoals het vermogen om hoge antioxidantconcentraties (glutathion, tocoferol en ascorbinezuur) en -enzymen te behouden en celdood te induceren om gewonde enterocyten (darmcellen) kwijt te geraken (Aw, 1999). Echter, door een overbelasting van schadelijke componenten kan de darm geen homeostase behouden en kunnen er ziektes ontstaan zoals colorectale kanker. 25

In de verdere bespreking wordt een onderscheid gemaakt tussen dunne en dikke darm aangezien in het onderzoek wordt nagegaan wat het verschil is in de vorming van oxidatieproducten in het duodenum en colon. 2.5.4.1 Duodenum Het duodenum of de twaalfvingerige darm is het begin van de dunne darm en is verantwoordelijk voor pH-neutralisatie (van de zure voedselbrij uit de maag) en vertering. In tegenstelling tot het colon bevat dit deel dan ook bijna geen bacteriën (0-104/ml darminhoud) door de zure pH (Silbernagl en Despopoulos, 2005). De vetvertering vindt voornamelijk plaats in de dunne darm met behulp van het enzym lipase, gesecreteerd door de pancreas, dat triacylglycerolen omzet tot mono-, diacylglycerolen en vrije vetzuren (Mukherjee, 2003). De vrije vetzuren zullen makkelijker oxideren en kunnen schade berokkenen aan de epitheelcellen van de darm. Calcium blijkt hierbij een belangrijke rol te spelen: de vetafbraak kan namelijk geïnhibeerd worden door de accumulatie van lang keten vrije vetzuren aan het oppervlak van de vetdruppeltjes, calcium kan deze vrije vetzuren doen neerslaan waardoor lipase beter zijn werk kan doen en de vetafbraak sneller kan doorgaan (Zangenberg et al., 2001). Bovendien is calcium ook een belangrijke cofactor voor de activiteit van lipase (Mukherjee, 2003). Onderzoek van Hu et al. (2010) heeft aangetoond dat vrije vetzuren sneller gevormd worden naarmate er meer calcium aanwezig is. De eiwitvertering start al in de maag waar het maagzuur de eiwitten denatureert en de pepsinogenen activeert tot pepsinen. Deze laatste zorgen voor een eerste splitsing van de eiwitten tot polypeptiden. In de dunne darm worden de pepsinen gedeactiveerd en levert de pancreas de precursoren van proteasen (trypsine, chymotrypsine en elastase). Deze proteasen breken de eiwitmoleculen af tot kortere peptiden. Uiteindelijk zullen de peptideketens afgebroken worden tot tri- en dipeptiden en afzonderlijke aminozuren die in het duodenum worden geabsorbeerd (Silbernagl en Despopoulos, 2005). Er is nog maar weinig onderzoek gedaan naar eiwitoxidatie tijdens de vertering. Uit een studie van Sante-Lhoutellier et al., (2007) bleek in vitro dat de vertering van myofibrillaire eiwitten negatief beïnvloed werd door oxidatie van de eiwitten: met een laag gehalte H2O2 toegevoegd (weinig oxidatie) zag men een kleine, niet significante stijging in de eiwitafbraak, met veel H2O2 toegevoegd (veel oxidatie) stelde men vast dat de eiwitafbraak enorm daalt. Deze resultaten zijn in overeenstemming met een studie van Liu en Xiong (2000) die aantoonde dat, onder nietreducerende omstandigheden, de verteerbaarheid van geoxideerd myosine daalt. 26

2.5.4.2 Colon en microbiota Het colon of de dikke darm volgt op de dunne darm en zorgt voor een verdere afbraak van de voedseldeeltjes door de aanwezigheid van, voornamelijk anaerobe, bacteriën (1011-1012 bacteriën/ml darminhoud) (Silbernagl en Despopoulos, 2005). In deze paragraaf wordt kort beschreven wat de relatie is tussen microbiota en oxidatieve stress. Deze relatie is complex en wederzijds: oxidatieve stress heeft een invloed op de samenstelling van onze microbiota en omgekeerd kunnen bacteriën een rol spelen in de vorming van oxidatieproducten. Invloed van oxidatieve stress op microbiota Een studie van Qiao et al. (2012) toonde dat het ROS en MDA gehalte in het plasma van muizen hoger werd als ze meer vet in hun dieet hadden. Dit was een indicator voor meer oxidatieve stress en ging gepaard met een daling van lactobacilli en een stijging van E. coli en enterococcus. Het toevoegen van een antioxidant (liponzuur) aan het vetrijke dieet zorgde voor minder oxidatieve stress en een toename in de lactobacilli. Ijzer in het dieet zorgt ook voor een wijziging in de darmbacteriën. Ongeveer 90% van het heemijzer wordt niet geabsorbeerd in de dunne darm en gaat naar de dikke darm waar sommige bacteriën het gebruiken als groeifactor (Young et al., 1989). Uit een studie van Ijssennagger et al. (2012) bleek dat meer heemijzer in het dieet zorgt voor een stijging in de verhouding gram-negatieve (Bacteroidetes) tot gram-positieve (Actinobacteria en Firmicutes, waaronder de lactobacilli) bacteriën. De consumptie van veel rood vlees zorgde voor een stijging in Bacteroides species en een daling in Lactobacillus species bij de mens (Maier et al., 1974) Invloed van microbiota op oxidatieve stress Omgekeerd, de invloed van lactobacilli op oxidatie werd onderzocht door Sun et al. (2009). Uit hun onderzoek bleek dat sommige lactobacilli de redoxstatus in een systeem dat de colonfermentatie nabootst, kunnen beïnvloeden. Dit had te maken met de antioxidatieve eigenschappen van de lactobacilli: sommige lactobacilli kunnen Fe2+ transporteren in de cel waar het gedeeltelijk geoxideerd kan worden tot Fe3+ (Kot et al., 1995). Hierdoor is Fe2+ niet beschikbaar voor de Fenton reactie met dus minder hydroxylradicalen tot gevolg. De stammen met een hogere superoxide dismutase activiteit realiseerden een hogere hydroxylreductie. Bovendien hadden bepaalde lactobacilli een antibacterieel effect, ze waren in staat het aantal 27

Enterococcus faecalis significant te reduceren. Dit zijn bacteriën die een belangrijke bron van oxdiatieve stress in het colon kunnen zijn, aangezien ze superoxide kunnen produceren, dat in aanwezigheid van ijzer omgevormd wordt tot hydroxylradicalen (Huycke en Moore, 2002). Onderzoek van Kaushal en Kansal (2012) heeft bewezen dat een probioticum met daarin Lactobacillus acidophilus en Bifidobacterium bifidum, oxidatieve stress (gerelateerd aan het ouder worden) in muizen kan verminderen. Verschillende studies hebben aangetoond dat bepaalde bacteriën in staat zijn NOCs te produceren in het menselijk lichaam (zie ook “2.4.5.3 Voor- en nadelen van nitriet”). Dit gebeurt vooral in de maag aangezien de zure pH de reacties bevordert (Hawksworth en Hill, 1971). Sander (1968) toonde aan dat vier stammen van nitraatreducerende enterobacteriën nitrosamines kunnen produceren, uitgaand van nitraat en secundaire amines, bij neutrale pH. Hawksworth en Hill (1971) toonden gelijkaardige resultaten met E. coli stammen. Uit hun onderzoek bleek ook dat sommige niet-nitraatreducerende stammen van o.a. lactobacilli, bacteroides en bifidobacteria secundaire amines kunnen nitroseren met nitriet bij neutrale pH. Naast de vorming van N-nitrosamines zijn sommige darmbacteriën (o.a. stammen van E. coli, Bacteroides, Bifidobacterium en Lactobacillus) ook in staat de amines af te breken (Rowland en Grasso, 1975).

3. Doelstellingen Het doel van deze masterproef was om oxidatieprocessen tijdens in vitro vertering van vlees te onderzoeken. Hierbij werd gekeken naar het effect van het gehalte aan heemijzer en vet in het vlees, de temperatuur waaraan het vlees werd blootgesteld en tenslotte ook naar het effect van nitriet. Hiervoor werden drie experimenten opgesteld: het heempexperiment, het vetexperiment en het experiment voor het verhittingsproces. Telkens werd gekeken naar het verschil in oxidatieproducten naargelang de desbetreffende parameter (heemijzer, vet, verhittingsproces), dit zowel bij vlees met als zonder toegevoegd nitriet.

28

4. Materiaal en methoden 4.1 Proefopzet Er werden drie experimenten opgezet om het effect van heemijzer, vet en verhittingsproces na te gaan op de vorming van oxidatieproducten. Telkens werd ook het effect van nitriet onderzocht door het vlees al dan niet met 120 mg/kg nitriet te behandelen. De verschillende vleesstalen werden onderworpen aan een in vitro verteringproces. Staalname gebeurde na de duodenum en de colon fase. Elk experiment werd driemaal herhaald met verschillend fecaal inoculum. Per herhaling werd elke behandeling twee keer uitgevoerd, wat resulteerde in zes waarnemingen per behandeling. In een eerste experiment werd getest wat de invloed is van het vleestype (met verschillend heemijzer gehalte) op de vorming van oxidatieproducten. Hiervoor werden drie vleessoorten (kip, rund en varken) gebruikt, dat 5% vet en 0 of 120 mg/kg nitriet bevatte en gekookt werd. Het doel van het tweede experiment was om de invloed van het vetgehalte te onderzoeken. Hiervoor werd varkensvlees gebruikt waarbij het vetgehalte gevarieerd werd door 0, 5 of 20% subcutaan varkensvet toe te voegen. Ook hier werd al 0 of 120 mg nitriet per kg vlees toegevoegd en werden de stalen gekookt. Het derde experiment werd opgesteld om te achterhalen wat het effect is van het verhittingsproces (rauw vlees, vlees verhit tot 65°C en vlees verhit tot 95°C) dat het vlees onderging. Dit gebeurde a.d.h.v. varkensstalen met 5% vet, 0 of 120 mg nitriet per kg vlees die aan verschillende verhittingsprocessen werden onderworpen. Vlees dat verhit werd tot 65°C zal verder aangeduid worden als “T65” en vlees dat verhit werd tot 95°C als “T95”.

4.2 Voorbereidingen vlees Per experiment worden de bereidingen die het vlees onderging, besproken. In experiment 1 (experiment heemgehalte) werden drie verschillende vleessoorten gebruikt: kip, rund en varken (Tabel 1). Deze drie soorten verschillen in heemijzergehalte: rundvlees bevat het meest heemijzer, vervolgens varkensvlees en dan kippenvlees. Voor rundvlees werd de spier biceps femoris gebruikt, voor varkensvlees de spier longissimus dorsi en voor kippenvlees de spier pectoralis profundus. De drie spieren ondergingen dezelfde behandeling: aan 500 g van de spier werd 25 g subcutaan varkensvet toegevoegd, zodat het staal 5% vet bevat. Van dit staal werd 250 g verhit in een warm waterbad met een temperatuur van 65°C. Aan de andere 250 g werd eerst 5 g nitrietpekelzout toegevoegd wat overeenkomt met 120 mg 29

nitriet per kg vlees en vervolgens ook verhit tot 65°C. Voor deze vleessoorten waren er in experiment 1 dus twee behandelingen: kip/rund/varken met 5% vet, 0 mg nitriet per kg vlees, T65 en kip/rund/varken met 5% vet, 120 mg nitriet per kg vlees, T65. Tabel 1. Experiment 1: effect heemgehalte nitriet (ppm)

0

120

diersoort

kip

varken

rund

kip

varken

rund

vetgehalte (%)

5

5

5

5

5

5

verhittingsproces

T65

T65

T65

T65

T65

T65

In experiment 2 (experiment vetgehalte) werd enkel gewerkt met varkensvlees T65 (Tabel 2). Er werd gebruikt gemaakt van 1200 g van de spier longissimus dorsi die in drie groepen werd verdeeld: aan 400 g werd geen vet toegevoegd, aan 400 g werd 5% subcutaan varkensvet toegevoegd (gelijkaardig aan experiment 1) en aan de overige 400 g 20% varkensvet. Vervolgens werd elk deel opgesplitst in twee groepen: 200 g zonder nitrietzout en 200 g met 120 mg nitriet per kg vlees. Uiteindelijk werden alle vleesstalen verhit tot 65°C. Tabel 2. Experiment 2: effect vetgehalte nitriet (ppm)

0

120

diersoort

varken

varken

varken

varken

varken

varken

toegevoegd vet

0

5

20

0

5

20

T65

T65

T65

T65

T65

T65

(%) verhittingsproces

In experiment 3 (experiment verhittingsproces) werd gebruik gemaakt van het varkensvlees met 5% vet zoals beschreven onder experiment 1. Hier werden rauw varkensvlees, T65 en T95 gebruikt, zowel met als zonder nitriet (Tabel 3).

30

Tabel 3. Experiment 3: effect verhittingsproces nitriet (ppm)

0

120

diersoort

varken

varken

varken

varken

varken

varken

vetgehalte (%)

5

5

5

5

5

5

verhittingsproces

rauw

T65

T95

rauw

T65

T95

Voor alle drie de experimenten werd dezelfde batch varkensvlees gebruikt, zodanig dat over de experimenten heen het varkensvlees T65 met 5% vet kon vergeleken worden als interne standaard. Van de verschillende behandelingen werd de pH gemeten. De gemiddelde pH van het kippenvlees zonder toegevoegd nitriet was 6,24 ± 0,01. Met toegevoegd nitriet was dit gemiddeld 6,04 ± 0,00. Voor rundvlees was de pH gemiddeld 5,65 ± 0,01 (zonder nitriet) en 5,53 ± 0,01 (met nitriet). Voor het varkensvlees zonder toegevoegd vet was de gemiddelde pH 5,60 ± 0,01 (zonder nitriet) en 5,47 ± 0,01 (met nitriet). Het varkensvlees met 5% vet had een gemiddelde pH van 5,61 ± 0,01 (zonder nitriet) en 5,49 ± 0,01 (met nitriet). Met 20% vet had het varkensvlees een gemiddelde pH van 5,64 ± 0,01 (zonder nitriet) en 5,50 ± 0,01 (met nitriet).

4.3 In vitro incubaties Om de vertering van het vlees in het menselijk lichaam na te bootsen, werden de verteringssappen bereid volgens Versantvoort et al. (2005), tenzij anders vermeld. De samenstelling van deze verteringssappen is weergegeven in Tabel 4. Tabel 4: Samenstelling verteringssappen, uitgedrukt in mM tenzij anders vermeld Speeksel

Maagsap

Darmsap

Galsap

(pH 6,8)

(pH 1,3)

(pH 8,1)

(pH 8,2)

Anorganische

12,0 mM KCl

23,5 mM NaCl

60,0 mM NaCl

90,0 mM NaCl

oplossing

2,06 mM KSCN

1,11 mM

20,2 mM

68,9 mM

NaH2PO4

NaHCO3

NaHCO3

0,294 mM

5,05 mM KCl

7,40 mM

5,53 mM KCl

NaH2PO4 4,79 mM NaSO4

KH2PO4 1,36 mM

3,79 mM KCl

1,80 mM HCl 31

CaCl2,2H2O 5,10 mM NaCl

Organische

2,86 mM

0,263 mM

NH4Cl

MgCl2

20,2 mM NaHCO3

39,0 mM HCl

1,08 mM HCl

3,33 mM ureum

1,80 mM

0,083 mM

glucose

ureum

0,099 mM NaNO2

0,052 mM

0,068 mM

1,51 mM

*

glucuronzuur

CaCl2,2H2O

CaCl2,2H2O

0,089 mM

0,765 mM

15,2 mM BSA

27,3 mM BSA

urinezuur

Glucosamine-

oplossing

4,16 mM ureum

HCl 0,025 g

0,708 mM

9g

30 g gal/liter

mucine/liter

ureum

pancreatine/liter

galsap

speeksel

darmsap

0,0025 IU

0,040 mM

1,5 g lipase/liter

lactoperoxidase/ml

FeSO4 ***

darmsap

speeksel ** 0,100 mM ascorbinezuur *** 15,2 mM BSA 1,25 g pepsine/ liter maagsap 3 g mucine/liter maagsap 0,098 mM H2O2 * Takahama et al., 2002 ** Guven et al., 1996 *** Takahama en Oniki, 2004 Er werd van elk vleesstaal viermaal 4,5 gram afgewogen in een glazen potje. Deze potjes werden omhuld met aluminiumfolie om de invloed van licht te beperken. Twee van deze potjes werden later gebruikt als duodenum stalen, de andere twee als colon stalen. Aan alle 32

stalen werd 6 ml speeksel toegevoegd, de eindpH was 6,5. Na 5 minuten wachten werd 12 ml maagsap toegediend met een eindpH van 3,7. Vervolgens gingen alle stalen 2 uur in de incubator bij 39°C. Hierna werd aan alle potjes 12 ml sap van het duodenum toegevoegd, 6 ml galsap en 2 ml bicarbonaatoplossing (als pH buffer), hier was de eindpH 6,5. Vervolgens gingen de stalen opnieuw 2 uur in de incubator. Tot hier hadden alle stalen de vertering tot in het duodenum ondergaan. Aan twee potjes van elk vleesstaal werd 44 ml water toegevoegd om een even groot volume te hebben als de colon stalen. Vervolgens werden ze gemixt met de Ultra turrax, in epjes overgebracht en bewaard in de diepvries bij -20°C. Aan de andere twee potjes van elk vleesstaal (de colon stalen) werd 22 ml SHIME oplossing toegevoegd en 22 ml fecale suspensie. Hierna werden de stalen ongeveer 1 uur geflusht met N2 om zo anaerobe condities te creëren. Een resazurine strip werd gebruikt als indicator voor anaerobe condities (Padilla en Roth, 2001). Na het flushen werden de colon stalen 72 uur in de incubator geplaatst bij 39°C. Na deze 72 uur werden ze ook gemixt, in epjes gebracht en bewaard in de diepvries bij -20°C. Ook werden er onverteerde stalen voorbereid. Dit zijn vleesstalen waaraan geen verteringssappen werden toegevoegd maar wel eenzelfde hoeveelheid water. Deze werden ook gehomogeniseerd met de Ultra turrax, in epjes overgebracht en bewaard in de diepvries bij -20°C. De bedoeling van deze stalen was om te weten te komen hoeveel oxidatieproducten er reeds aanwezig waren in het vlees zelf aan het begin van het experiment. De herhalingen voor de analyses van de onverteerde stalen waren afkomstig van hetzelfde staal. De incubaties werden driemaal herhaald met verschillende microbiota van drie proefpersonen. De microbiota, toegevoegd aan de stalen onder de vorm van fecale suspensie werd geleverd door gezonde proefpersonen. Deze proefpersonen waren allen mannelijk en hadden een leeftijd van 49, 26 en 38 jaar respectievelijk. De proefpersonen hadden geen bekende gastrointestinale aandoeningen en namen geen antibiotica gedurende minimum drie maanden. Verder consumeerden ze vlees zoals dat voorkomt in een Westers dieet. De fecale suspensie die gebruikt werd voor de colon stalen werd als volgt bereid: verse faeces van de proefpersonen werd zo snel mogelijk in PBS buffer (Phosphate buffered saline of een fosfaat gebufferde zoutoplossing) gebracht (20% w/v, pH 7,2). De componenten aanwezig in deze buffer staan in Tabel 5. Natrium thioglycolaat is een algemeen gebruikt reagens om reducerende condities te verkrijgen in een medium (Roth en Lively, 1956). Nadien werd de suspensie gezeefd met een metalen zeef van 1 mm om de vaste deeltjes te verwijderen. 33

Hieraan werd 20% glycerol toegediend als cryoprotectant en de suspensie werd bewaard in een plastic bekertje bij -80°C. Voor de incubaties werd de suspensie verdund met een BHIcysteïne oplossing (1/9 v/v). BHI (Brain Heart Infusion) wordt algemeen gebruikt als medium om bacteriën op te kweken en cysteïne wordt toegevoegd voor zijn reducerende werking. Nadien werd de slurry nog 1 uur geflusht met resazurine als controle en 24 uur geïncubeerd in de incubator (Kiebooms et al., 2012). Tabel 5: PBS buffer NaCl

0,137 M

KCl

2,69 mM

Na2HPO4,12H2O

0,010 M

KH2PO4

1,76 mM

Natrium thioglycolaat

8,76 mM

De SHIME oplossing werd toegevoegd omdat ze helpt bij de groei en ontwikkeling van de microbiota die zich in ons colon bevinden. De samenstelling van deze oplossing wordt weergegeven in Tabel 6. Tabel 6: Samenstelling SHIME medium (Molly et al., 1994) Arabinogalactan

1 g/l

Gist extract

3 g/l

Glucose

2,22 mM

L-cysteïne-HCl-H2O

4,10 mM

Mucine

4 g/l

Pectine

2 g/l

Pepton

1 g/l

Xylaan

1 g/l

Aardappel zetmeel

4 g/l

Na elke incubatie werd per colonstaal ook gekeken naar de overleving van de bacteriën. Hiervoor werd elk staal uitgeplaat op een RCM (Reinforced Clostridial Medium) bodem. De platen werden geïncubeerd en na 24 uur werden de kolonies per staal geteld.

34

In de hierna beschreven methodes wordt met vleesstaal de verschillende behandelingen bedoeld, zoals weergegeven in Tabel 1, 2 en 3. Digesta zijn de vleesstalen na de in vitro vertering.

4.4 Chemische analyses De herhalingen voor deze analyses waren afkomstig van hetzelfde staal. 4.4.1 Droge stof, ruw veten ruw eiwitgehalte Van alle stalen werd het droge stofgehalte, het ruw veten ruw eiwitgehalte bepaald volgens de respectieve ISO 1442-1973, ISO 1444-1973 en ISO 937-1978 methoden. De analyses werden in dubbel uitgevoerd en de resultaten werden uitgedrukt in g/100 g verse stof. 4.4.2 Vetzurenprofiel De vetfractie van de verschillende vleesstalen werd geëxtraheerd door chloroform/methanol (2/1; v/v) (volgens Folch et al., 1957). Vervolgens werden de vetzuren volgens Raes et al. (2001) gemethyleerd en geanalyseerd aan de hand van gas chromatografie op een CP-Sil88 kolom voor vetzuur methylesters (100 m x 0.25 mm x 0,25 mm). De pieken op het chromatogram werden geïdentificeerd volgens hun retentietijd, vergeleken met standaarden. Nonadecaanzuur (C19:0) werd gebruikt als een interne standaard om het individueel en totaal vetzuurgehalte te bepalen. De analyse werd in tweevoud uitgevoerd en de vetzuurprofielen werden uitgedrukt in mg vetzuur/100 g vetzuren. 4.4.3 Bepaling van het totaal ijzergehalte Het totaal ijzergehalte werd bepaald met ICP-AES (Iris Intrepid II XSP, Thermo Electron corporation), nadat de vleesstalen werden gedestrueerd met de bunzen brander, gedurende 4 uur een droge verbranding bij 550°C ondergingen, opgelost werden met 3 ml geconcentreerd HNO3 en verdund werden tot 10 ml HNO3. Het totaal ijzergehalte werd berekend op basis van een standaardcurve en werd uitgedrukt in mg/kg vlees. 4.4.4 Bepaling van het totaal aan heempigmenten Om het totaal aan heempigmenten te bepalen, werd van de gemalen vleesmonsters 10 g afgewogen. Hieraan werd een mengsel aceton/H2O/HCl (40/2/1 ml) toegevoegd dat zorgt voor de extractie van de heempigmenten. Vervolgens bleef het extract anderhalf uur staan, waardoor alle heempigmenten omgezet werden tot zuur hematine. Nadien werd het extract gefilterd door een papierfilter en net voor het meten van de absorbantie werd het filtraat nog 35

eens gefilterd door een cellulosefilter met poriëngrootte 0,20 µm. Uiteindelijk werd met een spectrofotometer de absorbantie van het filtraat gemeten in een 1 cm cuvet bij 512 en 640 nm. De verhouding van de absorbantie bij 512 nm t.o.v. de absorbantie bij 640 nm geeft een aanduiding over de omzetting van nitrosoheempigmenten naar hematine: is de verhouding A512/A640 kleiner dan twee dan heeft er een volledige omzetting plaatsgevonden. Door de absorbantie bij 640 nm te vermenigvuldigen met 680 wordt het gehalte aan totaal pigmenten bekomen, uitgedrukt als mg hematine/kg vlees (Hornsey, 1956). Door gebruik te maken van de formule van Lombardi-Boccia et al. (2002) werden de resultaten uitgedrukt als mg heem-ijzer/kg vlees. 4.4.5 Nitrietbepaling Gemalen vleesmonsters van 4 gram werden afgewogen en in een centrifugeerbuis gebracht. Hieraan werd 40 ml 0,02 M NaOH toegevoegd om een hogere pH te bekomen. De monsters werden gehomogeniseerd met de Ultra turrax en vervolgens 2 uur in een schuddend waterbad van 80°C geplaatst. Aan de bekomen warme oplossing werd langzaam 5 ml zinksulfaat toegevoegd, dit reagens zorgt voor het neerslaan van de aanwezige eiwitten. Nadat de monsters terug afgekoeld waren tot kamertemperatuur werden ze 5 minuten gecentrifugeerd bij 3000 tpm. Het supernatans werd gefiltreerd door een papieren plooifilter, het extract werd opgevangen in kolven van 100 ml en aangelengd met NaOH tot aan de merkstreep. Aan het extract werd vervolgens een eerste kleurreagens toegevoegd (naftylethyleendiamine) en nadien een tweede kleurreagens (sulfanilamide). Het geheel werd gemengd en na 15 minuten wachten (voor de kleurontwikkeling), werd de absorbantie gemeten bij 538 nm. Voor de standaardreeks werd een stockoplossing gemaakt van NaNO2: 1 g NaNO2 werd opgelost in 1 l gedestilleerd water. De werkoplossing werd bekomen door de stockoplossing 100 keer te verdunnen met NaOH. Met deze werkoplossing werd een verdunningsreeks gemaakt met gekende concentraties van NaNO2 (0-3 µg/ml). Aan deze verdunningsreeks werden ook beide kleurreagentia toegevoegd om nadien de absorbantie te meten bij 538 nm. De absorbantie werd uitgezet in een grafiek in functie van de concentratie NaNO2 en aan de hand daarvan kon de concentratie NaNO2 in de stalen bepaald worden. De concentratie NaNO2 in het vleesmonster werd uitgedrukt in mg NaNO2/kg vlees en elk vleesstaal werd in dubbel geanalyseerd. (ISO 2918–1975).

36

4.5 Malondialdehyde Malondialdehyde (MDA) is een secundair oxidatieproduct dat gevormd wordt tijdens de oxidatie van meervoudig onverzadigde vetzuren. MDA kan reageren met 2-thiobarbituurzuur (TBA) waarbij een gekleurd complex ontstaat. Dit complex kan spectrofotometrisch bepaald worden bij 532 nm (Gray en Monahan, 1992). De MDA-bepaling is gebaseerd op de methode beschreven door Grotto et al. (2007). Met deze methode wordt zowel vrij MDA als MDA gebonden aan eiwitten, gemeten. Van de digesta van elk vleesstaal werd 450 µl in een glazen proefbuisje gebracht. Hieraan werd 300 µl NaOH toegevoegd. NaOH zorgt ervoor dat het gebonden MDA vrij komt. Na vortexen werden de proefbuizen 30 minuten in een warmwaterbad van 60°C geplaatst. Nadien werd 750 µl H3PO4 en 750 µl TBA toegevoegd. Hierdoor kan het gekleurd complex gevormd worden. De proefbuizen werden weer gevortexed en 45 minuten in een warm waterbad van 90°C geplaatst. Hierna werd 300 µl SDS-oplossing (sodium dodecyl sulphate of natriumdodecyl sulfaat) en 3 ml n-butanol toegevoegd. De SDS-oplossing zorgt voor het oplossen van de eiwitten (Gudiksen et al., 2006) en butanol voor de extractie van het gekleurd complex (Gabai et al., 2004). Na goed vortexen werden de proefbuizen 30 minuten gecentrifugeerd op 2500 tpm. Vervolgens werd het eiwitvrije supernatans afgenomen en in plastic cuvetten gebracht. De absorbantie hiervan werd gemeten met de spectrofotometer bij 532 nm. Als standaard werd een stockoplossing van 1,1,3,3-tetramethoxypropaan (TMP) gebruikt. TMP wordt door zure hydrolyse omgezet in MDA (Gutteridge, 1975). Deze stockoplossing werd 100 maal verdund met gedestilleerd water en hiervan werden standaardoplossingen gemaakt met een gekende concentratie MDA (0-50 nmol/ml). De standaardoplossingen werden op dezelfde manier en tegelijkertijd geanalyseerd met de vleesstalen. De analyses werden per staal in dubbel uitgevoerd.

4.6 Carbonylgroepen De bepaling van carbonylgroepen is gebaseerd op de methode beschreven door Ganhao et al. (2010). Per vleesstaal werden drie epjes gevuld met de digesta. Eiwitten werden neergeslagen door aan alle drie de epjes een halve ml ijskoud 20% TCA (Trichloroacetic acid of 37

trichloorazijnzuur) toe te voegen. Na vortexen werden de epjes 10 minuten in een ijsbad geplaatst en nadien 15 minuten gecentrifugeerd op 3000 tpm. Het supernatans werd afgenomen en opnieuw werd ijskoud TCA toegevoegd (1 ml 10% TCA). Na vortexen, het ijsbad en het centrifugeren, werd opnieuw de pellet bekomen door het supernatans af te nemen. Vervolgens werd 1 pellet behandeld met HCl (blanco) en de andere 2 met 2,4-DNPH (2,4-dinitrophenylhydrazine). Deze laatste stof zal met de carbonyls reageren waardoor deze meetbaar worden. De epjes werden gevortexed en nadien 1 uur lang bij kamertemperatuur op een schudder geplaatst op 350 tpm. De epjes werden bedekt met aluminiumfolie om ze af te schermen van het licht. Nadien werd een halve ml ijskoud 20% TCA toegevoegd aan alle epjes en werden ze gevortexed en in het ijsbad geplaatst. Na centrifugatie werd het supernatans afgenomen en 1 ml ethanol:ethylacetaat toegevoegd om resten DNPH en vetten weg te wassen. Na vortexen en 15 minuten centrifugeren werd het supernatans afgenomen en het wassen nog tweemaal herhaald. De pellets werden 10 minuten onder de trekkast gezet om eventuele resten van ethanol:ethylacetaat kwijt te geraken. Uiteindelijk werden de eiwitten in de pellet opgelost door 1 ml guanidine-HCl in natrium fosfaatbuffer (pH 6,5) toe te voegen. Hierna werd opnieuw gevortexed en 10 minuten gecentrifugeerd op 13000 tpm om onoplosbare deeltjes te verwijderen zodat deze niet interfereren met de absorbantie gemeten door de spectrofotometer. Het supernatans werd overgebracht in micro UV-cuvetten. De absorbantie van alle stalen werd gemeten bij 370 nm. De carbonylconcentratie werd bepaald aan de hand van de wet van Lambert-Beer, met een extinctiecoëfficiënt van 21,0 mM-1. De resultaten worden uitgedrukt als nmol DNPH/ml digestaat en elk staal werd in dubbel geanalyseerd.

4.7 Thiolgroepen 4.7.1 Optimalisatie van de methode Het protocol voor de bepaling van thiolgroepen is gebaseerd op de methode van Ellman (1959), met een aantal aanpassingen (Batifoulier et al. 2002). Oorspronkelijk

werd

aan

de

digesta

onmiddellijk

TRIS

buffer

(tris(hydroxymethyl)aminomethaan) met SDS en DTNB (5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoëzuur)) toegevoegd. TRIS buffer (pH 8) zorgt voor de gewenste pH, SDS lost de eiwitten op en DTNB is een stof waarmee de thiolgroepen reageren waarbij een geel chromofoor ontstaat dat spectrofotometrisch kan gemeten worden. 38

De resultaten waren niet herhaalbaar en daarom werden de stalen geanalyseerd door eerst TCA toe te voegen om de eiwitten neer te slaan en dan verder te werken met enkel de eiwitten. De herhaalbaarheid was echter nog steeds niet optimaal, en bovendien is de invloed van TCA op DTNB niet echt gekend, waardoor geopteerd werd om TCA niet verder te gebruiken. Blijkbaar moet een staal dat oxiderende stoffen bevat eerst gewassen worden, aangezien deze stoffen kunnen interfereren met DTNB (Morzel et al., 2006). Dit werd gedaan door aan de digesta TRIS buffer toe te voegen, te centrifugeren en enkel met de pellet verder te werken. Dit zorgde voor herhaalbare resultaten en uiteindelijk werd een geoptimaliseerde methode gebruikt zoals hieronder beschreven. 4.7.2 Definitieve methode Per staal werd één epje 15 minuten gecentrifugeerd op 3000 tpm om de eiwitten en andere vaste deeltjes neer te slaan in een pellet. Het supernatans werd afgenomen en één ml TRIS buffer werd toegevoegd (pH 8) om de stalen te wassen. Na vortexen werd er opnieuw gecentrifugeerd en het supernatans werd afgenomen. Hierna werd opnieuw één ml TRIS buffer toegevoegd aan de pellet en het geheel werd overgebracht in glazen proefbuizen. Het epje werd tweemaal nagespoeld met TRIS buffer. Vervolgens werd aan de proefbuizen vier ml 8,75% SDS oplossing toegediend (eindconcentratie: 5% SDS). De proefbuizen werden 10 minuten in een oven bij 50°C geplaatst. Nadien werden ze 10 minuten gecentrifugeerd op 2700 tpm. Met het supernatans hiervan werd verder gewerkt. Per staal waren drie proefbuizen nodig: een blanco staal met 500 µl supernatans en 2,5 ml TRIS buffer en twee proefbuizen (twee dubbels) met 500 µl supernatans, 2 ml TRIS buffer en 500 µl 10 mM DTNB. Hierna werden de proefbuizen één uur op een schudder geplaatst op 350 tpm, afgeschermd van het licht met aluminiumfolie. Vervolgens werden de buisjes 15 minuten gecentrifugeerd bij 2700 tpm. De absorbantie van het supernatans van het blancostaal en de twee dubbels werd gemeten bij 412 nm. Aangezien DTNB zelf ook geabsorbeerd wordt bij 412 nm, werd een blanco reagens meegenomen met 500 µl 10 mM DTNB, 2 ml TRIS buffer en 500 µl 5% SDS oplossing. De analyses werden in dubbel uitgevoerd en de resultaten werden uitgedrukt in hoeveelheid thiols/ml digesta. Ook hier werd de wet van Lambert-Beer gebruikt, met extinctiecoëfficiënt 14 mM-1. Aangezien voor verschillende stalen zeer lage absorbantie waarden werden gemeten die nauwelijks verschilden van het blanco DTNB staal, werd een detectielimiet gebruikt van 23 nmol thiols/ml digesta (dit komt overeen met een absorbantiewaarde van 0,010). Bij stalen met een waarde kleiner dan 23 nmol thiols/ml digesta, werd deze waarde vervangen door 11,5 (de helft van 23). 39

4.8 Statistische analyse De gegevens verkregen tijdens het onderzoek werden eerst verwerkt in Microsoft Excel. De resultaten werden verder statistisch verwerkt met het programma SAS Enterprise guide 5. Voor de resultaten van het droge stof-, vet-, eiwit-, totaal ijzer-, heem- en nitrietgehalte en vetzurenprofiel werd gebruik gemaakt van een univariate ANOVA met als vaste factor “behandeling”. Het model hiervoor werd dan: Y = β0 + β1×behandeling + ε Met Y = de afhankelijke variabele (de resultaten van de verschillende proeven) β0 = het intercept β1 = coëfficiënt van het vast effect “behandeling” ε = de algemene fout op het model Voor de analyses van MDA, carbonyls en thiolgroepen in het duodenum werd een algemeen lineair model gebruikt met “nitriet” en “experiment” (heemgehalte, vetgehalte of verhittingsproces) als vaste factoren. Voor de analyses van het colon werd eveneens een algemeen lineair model gebruikt met “nitriet” en “experiment”” als vaste factoren. Aangezien bij de resultaten uit het colon de factor “microbiota” een grote invloed bleek te hebben op alle parameters, werd gekozen om de dataset op te splitsen per microbiota en de resultaten apart te onderzoeken. Het model werd als volgt: Y = β0 + β1×nitriet + β2×experiment + β3×nitriet×experiment + ε Met Y = de afhankelijke variabele (de resultaten van de verschillende proeven) β0 = het intercept β1 = coëfficiënt van het vast effect “nitriet” β2 = coëfficiënt van het vast effect “experiment” β3 = coëfficiënt van de interactie tussen “nitriet” en “experiment” ε = de algemene fout op het model De gemiddelden per behandeling werden vergeleken m.b.v. Tukey post hoc test. Het effect werd als statistisch significant beschouwd wanneer de p-waarde kleiner was dan 0,05.

40

5. Resultaten en discussie 5.1 Experiment heemgehalte 5.1.1 Samenstelling vlees Er waren in experiment 1 geen significante verschillen tussen de vleesstalen wat betreft het droge stofgehalte en het eiwitgehalte (Tabel 7). De waarden waren respectievelijk gemiddeld 31 ± 0,78 en 22 ± 1,19 g/100 g vlees. Aan de drie vleessoorten werd hetzelfde vet toegevoegd om er voor te zorgen dat er weinig verschil zou zijn in vetgehalte en vetzuursamenstelling. Het vetgehalte was het hoogst voor varkensvlees met 0 ppm nitriet, varkensvlees met 120 ppm nitriet en rundvlees met 0 ppm nitriet. Deze drie waarden waren niet significant verschillend van elkaar, maar wel significant hoger dan voor de andere vleesstalen. Kippenvlees met 120 ppm nitriet had het laagste vetgehalte. Er waren dus statistisch significante verschillen tussen de stalen wat betreft vetgehalte, maar deze lagen nog steeds rond 5%, waardoor dit geen beduidende invloed zal hebben op de proefopzet. In Tabel 7 is te zien dat er geen relevante verschillen zijn in SFA en MUFA gehalte tussen de drie vleessoorten. Bij SFA bleken C16:0 en C18:0 het grootste aandeel te hebben. MUFA bestond vooral uit c9C18:1. Wel zijn er kleine verschillen in het gehalte aan PUFA: kippenvlees blijkt de meeste PUFA te bevatten, gevolgd door rundvlees en vervolgens varkensvlees, zowel met als zonder nitriet. Bij de drie vleessoorten had C18:2ω6 het grootste aandeel in PUFA. De chemische analyse toont dat rundvlees een significant hoger ijzergehalte heeft dan varkens- en kippenvlees. Het varkens- en kippenvlees verschillen niet significant in hun ijzergehalte. Het rundvlees had ook significant hogere heemwaarden vergeleken met het varkens- en kippenvlees, zowel met als zonder nitriet (Tabel 7). Het varkens- en kippenvlees verschilden onderling niet. Dit kan te wijten zijn aan het feit dat er voor kippenvlees maar één meting werd uitgevoerd, want numeriek liggen de waarden wel hoger. Bij de drie vleessoorten heeft nitriet geen invloed op het heemgehalte: de waarden van het vlees met nitriet zijn niet significant verschillend van de waarden zonder nitriet. De resultaten van het kippen- en varkensvlees liggen in dezelfde range als deze van Lombardi-Boccia et al. (2002). Hier bleek ook dat rundvlees een hoger heemgehalte had vergeleken met de twee andere vleessoorten. 41

Hoewel voor het nitrietgehalte, de waarde voor kippenvlees numeriek veel hoger is dan voor varkens- en rundvlees, werden geen significante verschillen tussen de stalen gevonden (Tabel 7). Dit komt waarschijnlijk door de grote standaard afwijking bij kippenvlees. Aan alle vleessoorten werd 120 ppm nitriet toegevoegd en zoals te zien in Tabel 7 is er een groot deel van dit nitriet weggereageerd. Na toevoeging van nitriet aan vlees vinden heel wat reacties plaats, ook verschillende factoren zoals verhitting, malen, bewaring van vlees spelen een rol bij het verdwijnen van nitriet (Honikel, 2008). Bovendien wordt de verdwijning van nitriet vertraagd door een hogere pH (Dordevic´ et al. (1980) in Honikel, 2008). Hoewel hier niet significant verschillend, weten we dat het kippenvlees een hogere pH had dan varkens- en rundvlees, waardoor er meer residueel nitriet kan overblijven.

42

Tabel 7. Experiment 1: Ruwe samenstelling, vetzuur-, ijzer-, heem- en nitrietgehalte (gemiddelde ± standaard afwijking) van het vlees, n=2 nitriet (ppm) diersoort DS (g/100g verse stof) vet (g/100g verse stof) eiwit (g/100g verse stof) SFA (g/100g vetzuren) MUFA (g/100g vetzuren) PUFA (g/100g vetzuren) totaal Fe (mg/kg vlees) heem (mg/kg vlees) nitriet (mg/kg vlees)

kip 30,1 ± 0,47

0 varken 31,2 ± 0,32

rund 30,6 ± 0,21

kip 31,3 ± 0,95

120 varken 31,9 ± 0,35

rund 30,0 ± 0,08

P behandeling 0,046

4,66 ± 0,45bc

5,87 ± 0,17a

5,31 ± 0,01ab

4,06 ± 0,20c

5,71 ± 0,09a

4,65 ± 0,14bc

0,001

23,8 ± 0,55

21,5 ± 1,82

21,4 ± 0,63

22,9 ± 0,65

22,2 ± 0,84

21,3 ± 0,48

0,176

37,8 ± 0,15

38,0 ± 0,28

36,6 ± 1,36

37,1 ± 0,02

38,3 ± 0,05

37,5 ± 2,62

0,754

41,3 ± 0,51ab

42,2 ± 0,29a

39,6 ± 1,27ab

40,3 ± 0,02ab

42,4 ± 0,14a

38,2 ± 1,54b

0,017

17,7 ±0,02a

16,0 ± 0,13d

16,9 ± 0,42bc

17,5 ± 0,02ab

15,9 ± 0,01d

16,3 ± 0,20cd

<0,001

4,32 ± 0,18b

5,47 ± 0,30b

13,8 ± 1,85a

4,07 ± 0,25b

4,87 ± 0,31b

14,4 ± 0,19a

<0,001

1,41b (n=1)

2,51 ± 0,00b

13,3 ± 0,47a

1,46b (n=1)

3,05 ± 0,08b

13,4 ± 0,97a

<0,001

n.a.

n.a.

n.a.

81,5 ± 30,3

36,4 ± 0,33

18,4 ± 1,00

0,075

a,b,c,d

: gemiddelden in dezelfde rij met verschillend superscript zijn significant verschillend van elkaar (p<0,05) DS = droge stof SFA = C12:0 + C14:0 + C15:0 + C16:0 + C17:0 + C18:0 + C20:0 MUFA = C14:1 + C16:1 + C17:1 + c9C18:1 + c11C18:1 + C20:1 PUFA = C18:2ω6 + C18:3ω3 + C18:4ω3 + C20:2ω6 + C20:3ω6 + C20:4ω6 + C20:3ω3 + C20:5ω3 + C22:4ω6 + C22:5ω6 + C22:5ω3 + C22:6ω3 n.a.= niet geanalyseerd

43

5.1.2 Oxidatieparameters De oxidatieparameters zullen steeds in dezelfde volgorde besproken worden: eerst het MDA gehalte van de onverteerde stalen, van de duodenum en colon stalen (waaronder de drie microbiota: M1, M2 en M3), vervolgens de resultaten voor de carbonyls en tenslotte de thiolgroepen. 5.1.2.1 MDA Zoals blijkt uit Tabel 8 was er voor de onverteerde stalen een significante interactie tussen het heem- en nitrietgehalte van het vlees wat betreft de hoeveelheid MDA. Zonder toegevoegd nitriet werd in rundvlees het meest MDA gevonden. In varkens- en kippenvlees was ongeveer één derde van de hoeveelheid MDA in rundvlees aanwezig. Met 120 ppm toegevoegd nitriet had het rundvlees de hoogste MDA waarde, dit was niet significant verschillend van het kippenvlees zonder toegevoegd nitriet. Met 120 ppm nitriet werd in het rundvlees ongeveer maar half zoveel MDA gevormd vergeleken met rundvlees zonder nitriet. De hoeveelheid MDA voor varkens- en kippenvlees met 120 ppm nitriet was significant lager vergeleken met 0 ppm nitriet. Uit dit experiment blijkt dat zowel met als zonder nitriet rundvlees het meeste MDA bevat. Dit is ook het vlees met het hoogste heemgehalte. Het is waarschijnlijk dat het hoger heemgehalte de Fenton reactie stimuleert met meer vorming van hydroxylradicalen tot gevolg. Deze radicalen kunnen dan aanleiding geven tot meer vetoxidatie, waardoor MDA ontstaat (Bastide et al., 2011). Kippenvlees bevat het minst heemijzer waardoor er dus minder vetoxidatie zal plaats vinden. Met toegevoegd nitriet zijn de MDA waarden lager dan zonder nitriet. Dit kan verklaard worden a.d.h.v. de antioxidatieve werking van nitriet: nitriet kan Fe2+ vangen (er wordt een stabiel complex gevormd tussen nitriet en de heempigmenten) waardoor deze laatste de Fenton reactie niet kan katalyseren en er dus minder vetoxidatie zal optreden. Nitriet kan ook onverzadigde vetten aanwezig in membranen stabiliseren en nitriet kan rechtstreeks reageren met het vrijgekomen niet-heemijzer (Fe2+) van gedenatureerde heempigmenten (samengevat in Freybler et al., 1993). Naast het hoger heemgehalte van rundvlees, zou het hoger MDA gehalte ook deels verklaard kunnen worden door het feit dat rundvlees veel PUFA bevat, aangezien het gras dat ze eten een bron is van deze vetzuren (Wood et al., 2004). Er mag echter niet vergeten worden dat veel van de onverzadigde vetzuren die runderen uit het gras halen, in de pens omgezet worden door de bacteriën tot verzadigde vetzuren of onverzadigde vetzuren met minder dubbele 44

bindingen (Wood en Enser, 1997). Hierdoor heeft het vet van runderen een lager PUFA gehalte dan het vet van niet-herkauwers zoals kippen en varkens (French et al., 2000), waardoor minder oxidatie in het vet van runderen kan verwacht worden. Bovendien is in Tabel 7 ook te zien dat kippenvlees het hoogste aandeel PUFA heeft dus op basis hiervan zou men kunnen verwachten dat kippenvlees meer vetoxidatie ondergaat, maar dit is niet het geval (Tabel 8). Er werd getracht om de invloed van een verschillende vetzuursamenstelling weg te werken door aan alle vleessoorten subcutaan varkensvet toe te voegen. Wellicht heeft hier de invloed van heem een groter effect dan het PUFA gehalte en kan voor deze proef (voorzichtig) besloten worden dat heem de meest bepalende factor is. De antioxidant status van het vlees (zoals bijvoorbeeld het vitamine E gehalte), werd niet in rekening gebracht in deze studie, maar wellicht zou dit ook een beïnvloedende factor zijn op het MDA gehalte. Voor de aanwezigheid van MDA in de duodenumstalen was er in experiment 1 een significante interactie tussen het heem- en het nitrietgehalte van het vlees (Tabel 8). Zonder toegevoegd nitriet had het rundvlees het meest MDA per ml digesta. In varkensvlees werd maar half zoveel MDA gevormd als in het rundvlees en in het kippenvlees werd de laagste concentratie gemeten. Met toegevoegd nitriet waren de waarden lager voor varkens- en rundvlees, vergeleken met dezelfde vleessoorten zonder nitriet en bij kippenvlees was er geen significant verschil. Het verschil tussen de drie vleessoorten met toegevoegd nitriet was niet significant. Met 120 ppm toegevoegd nitriet was voor rundvlees het gehalte MDA minder dan de helft van het gehalte bij 0 ppm nitriet. De resultaten van deze proef tonen aan dat tijdens de vertering van rundvlees het meeste MDA aanwezig is in de digesta vergeleken met de andere digesta, wat in overeenstemming is met wat gevonden werd in het onverteerd vlees. Het MDA gehalte van onverteerd kippen- en varkensvlees was niet significant verschillend, echter in de duodenum fase bevatten de digesta met het kippenvlees minder MDA dan die met het varkensvlees. Dit zou kunnen verklaard worden door het feit dat kippenvlees minder heem bevat (Bastide et al., 2011) en dat dit gegeven een cruciale factor is tijdens de vertering. Echter in deze studie bleek er geen significant verschil in heemgehalte tussen het kippen- en varkensvlees. Als gekeken wordt naar het MDA gehalte in de digesta van het duodenum t.o.v. het MDA gehalte in onverteerd vlees, zou verwacht kunnen worden dat rundvlees de grootste toename vertoont, aangezien dit vlees het meest heem bevat. In Tabel 8 is te zien dat dit niet het geval is: voor rundvlees zonder nitriet is de verhouding MDA duodenum/MDA onverteerd gelijk aan 1,9 en voor varkensvlees is dit beduidend hoger, namelijk 2,7. Ook met nitriet is te zien dat rundvlees de 45

kleinste stijging in oxidatie vertoont na vertering. Er moeten dus, naast het heemgehalte, nog andere factoren zijn die de samenstelling van het vlees bepalen en een rol spelen tijdens de oxidatie. Deze samenstelling wordt voor een groot deel bepaald door het voeder van de dieren. Een studie van Neurnberg et al. (2005) maakte een vergelijking tussen de oxidatieve vleesstabiliteit van runderen gevoederd met gras en runderen die binnen gehuisvest werden, gevoederd met maïssilage en krachtvoer. Hieruit bleek dat in het vlees van gras gevoederde dieren minder vetoxidatie optrad dan in het vlees van de tweede groep. Runderen eten in het algemeen meer gras dat een bron is van α-tocoferol (vitamine E), een welgekende antioxidant. Varkens en kippen daarentegen eten graan gebaseerde voeders met minder vitamine E (Wood en Enser, 1997). Door de mogelijks lagere antioxidantcapaciteit van varkens- en kippenvlees, zou het kunnen dat er meer vetoxidatie kan plaatsvinden in dit vlees in vergelijking met rundvlees. In deze resultaten is dat duidelijk het geval voor het varkensvlees. Los daarvan worden vaak supplementen met synthetische antioxidanten toegediend aan het voeder van de dieren. Vitamine E wordt dan vaak toegediend onder de vorm van α-tocoferylacetaat en oefent zijn antioxidanteigenschappen pas uit eens het gedeësterificeerd is in het maagdarmkanaal (Buckley et al., 1995). De omvorming van α-tocoferylacetaat tot α-tocoferol gebeurt door spijverteringsenzymen zoals lipasen van de pancreas (Yang en McClements, 2013). Het verschil in antioxidantcapaciteit van enerzijds varkens- en kippenvlees en anderzijds rundvlees komt waarschijnlijk niet door een verschil in afbraak van αtocoferylacetaat. Maar studies hebben wel aangetoond dat de veresterde vorm (αtocoferylacetaat) minder biobeschikbaar is dan de vrije vorm (α-tocoferol) (Yang en McClements, 2013). Dus ook al krijgen de dieren vitamine E via de voeding, het is waarschijnlijk dat runderen meer vitamine E in hun vlees hebben doordat het in de vrije vorm in gras aanwezig is. Hierbij moet wel opgemerkt worden dat afgemest vee in Vlaanderen vaak op stal gevoederd wordt met maïskuil en krachtvoeders en dus niet dagelijks gras eten. Volk et al. (2009) hebben aangetoond dat nitriet de vetoxidatie inhibeert bij lage pH (pH = 3, zure omgeving zoals in onze maag). Hun bevindingen komen overeen met de resultaten in deze proef, aangezien nitriet tijdens de vertering zorgt voor minder MDA vergeleken met vertering van ongepekeld vlees (Tabel 8). Dit kan door de omzetting van nitriet tot NO• dat zorgt voor het vangen van radicalen en de ontbinding van ROS moleculen (zie “2.5.2 Speeksel”). Nitriet in de maag zal snel geprotoneerd worden tot HNO2, dat verder zal opgesplitst worden in NO• en NO2•. De mate waarin NO• wordt vrijgesteld uit nitriet in de maag is afhankelijk van de pH in de maag. Volk et al. (2009) toonden aan dat bij een pH van 46

3 de vetoxidatie duidelijk geremd werd door de aanwezigheid van NO•. Dit effect was minder bij een pH van 4 en verdween bijna bij een pH van 5. Naast NO•, heeft nitriet zelf ook een remmende werking op de vetoxidatie, maar dit bij hogere concentraties en in aanwezigheid van reducerende componenten zoals ascorbinezuur (aanwezig in maagsap). Uit hetzelfde onderzoek van Volk et al. (2009) zag men dat bij een pH van 3 en in aanwezigheid van ascorbinezuur, NO• gevormd wordt uit nitriet, maar dat deze vorming stopt bij een pH vanaf 4. In het maagsap zitten ook ijzerionen. Volk et al. (2009) toonde aan dat vrije ijzerionen die werden toegevoegd aan het systeem bij een pH van 3 zorgden voor drie keer zoveel NO• productie dan zonder de ijzerionen. Bij een pH lager dan 4 kunnen thiolgroepen in het vlees (afkomstig van bijvoorbeeld het aminozuur cysteïne) reageren met nitriet waardoor Snitrosothiol species ontstaan, deze zijn gekend als NO• donor (Foster et al., 2003). Dus bij de lage pH die heerst in onze maag kunnen veel van deze S-nitrosothiol species ontstaan waardoor er ook veel NO• aanwezig is met een reducerende werking op de vetoxidatie. In Tabel 8 is te zien dat de vertering zorgt voor hogere MDA gehaltes in alle drie de vleessoorten vergeleken met de onverteerde digesta. Bij de vergelijking tussen de oxidatieparameters in onverteerde stalen en in het duodenum moet in het achterhoofd gehouden worden dat de duodenum stalen onderhevig waren aan een gecombineerd effect van zowel de verteringssappen als blootstelling aan lucht (en licht) gedurende vier uur. Er vindt duidelijk oxidatie plaats tijdens de vertering wat kan verklaard worden a.d.h.v. verschillende pro-oxidanten aanwezig in speeksel (zoals peroxidasen), maagsap (o.a. Fe-ionen en H2O2) en darmsap (o.a. Ca dat zorgt voor meer vetzuren, zie “2.5.4.1 Duodenum”). Kortom, het effect van heem tijdens de vertering was niet zoals verwacht, uitgaande van de onverteerde stalen: het is opvallend dat voor de vertering het varkens- en kippenvlees met nitriet een duidelijk lager MDA gehalte hebben dan het rundvlees met nitriet, maar dit is niet meer zo na de vertering. Voor het colon was er in experiment 1 voor de drie microbiota een significante interactie tussen het heem- en nitrietgehalte van het vlees wat betreft de hoeveelheid MDA (Tabel 8). M3 had over de hele lijn hogere MDA waarden dan M1 en M2, maar dezelfde trends waren aanwezig: zonder nitriet had rundvlees de hoogste MDA waarde, gevolgd door varkensvlees en kippenvlees had de laagste waarde. Wanneer het vlees met nitriet was behandeld, werd voor zowel M1 als M2 significant minder MDA teruggevonden in de digesta met kippen- en

47

varkensvlees dan in de digesta met rundvlees, terwijl er geen significante verschillen gevonden werden tussen die drie digesta bij M3. Net als bij het duodenum werden, bij alle drie de microbiota, de hoogste MDA waarden gevonden in de digesta met ongepekeld rundvlees. Dit kan opnieuw verklaard worden door het hoger heemgehalte van dit vlees met meer oxidatie tot gevolg (Bastide et al., 2011). Zoals aangehaald bij de discussie van het duodenum zorgt nitriet voor minder MDA (Volk et al., 2009), wat ook hier zo blijkt te zijn. Bij M1 zijn de MDA waarden van het colon lager dan deze van het duodenum, bij M2 is er bijna geen verschil tussen duodenum en colon en bij M3 werd er veel meer MDA gedetecteerd in het colon dan in het duodenum. Hierbij kan de vraag gesteld worden of dit kan toegeschreven worden aan de variatie in onze darmbacteriën of aan het moment waarop het MDA gedetecteerd werd. De stalen werden wel op hetzelfde tijdstip genomen, maar MDA kan in het colon verder reageren waardoor het niet meer als dusdanig wordt gedeteceerd. In het eerste geval zou het kunnen dat bij proefpersoon 3 de invloed van bacteriën geassocieerd met meer oxidatie groter was dan de invloed van bacteriën geassocieerd met minder oxidatie. Bij proefpersoon 1 zou dit net andersom geweest zijn en bij proefpersoon 2 zou de werking van de bacteriën finaal geen invloed gehad hebben. In het tweede geval zouden de verschillen verklaard kunnen worden doordat bij proefpersoon 2 evenveel MDA in het colon is weggereageerd als dat er werd gevormd, waardoor de hoeveelheid min of meer overeenkomt met de hoeveelheid MDA in het duodenum. Bij proefpersoon 1 zou dan het omgekeerde kunnen opgetreden hebben: om de een of andere reden zou bij deze persoon meer MDA weggereageerd zijn, waardoor lagere waarden werden gedetecteerd in het colon. Dit is dus niet gelijk aan minder vetoxidatie, MDA werd gewoon niet gedetecteerd. Daarom zou het interessant zijn om de oxidatie in het colon op verschillende tijdstippen te meten om zo een beter zicht te hebben op de kinetiek van de oxidatie in het colon. De vergelijking tussen het duodenum en colon is moeilijk, aangezien er sowieso een groot effect is van de toegevoegde microbiota. In het algemeen is het onmogelijk variaties tussen de drie microbiota te vermijden, aangezien deze afkomstig waren van drie verschillende proefpersonen. Deze proefpersonen hadden elk een verschillend dieet en dus ook een verschillend MDA gehalte in hun faeces en microbiota.

48

5.1.2.2 Carbonyls Voor het carbonylgehalte bleek dat de interactie tussen heem- en nitrietgehalte niet significant was in onverteerd vlees (Tabel 8). De drie vleessoorten zonder toegevoegd nitriet hadden een carbonylgehalte dat dubbel zo hoog was dan dat van de drie vleessoorten met toegevoegd nitriet. De hoeveelheid carbonyls in de vleesstalen zonder toegevoegd nitriet waren niet significant verschillend van elkaar, alsook de carbonyls in de vleesstalen met toegevoegd nitriet. Tabel 7 toont dat de drie vleessoorten niet veschillen in hoeveelheid eiwit wat ook weerspiegeld wordt in de oxidatiehoeveelheid. Het verwachtte effect van heem op carbonylvorming (meer heem zou aanleiding geven tot meer eiwitoxidatie) blijkt uit deze resultaten niet zo te zijn. Dit in tegenstelling met Mercier et al. (1998) die in hun studie concludeerden dat de eiwitten in koel bewaard rundvlees (rood vlees, veel heemijzer) meer gevoelig zijn voor carbonylatie dan deze in kalkoenvlees (wit vlees, minder heemijzer). Het zuurstofbindend eiwit myoglobine (dat meer aanwezig is in rood vlees), met als actief centrum een heemgroep, is een promotor voor de eiwitoxidatie, meer specifiek voor carbonylatie (Lund et al, 2011). Rood vlees in dit experiment (rundvlees) heeft wel hogere carbonylwaarden, maar deze zijn niet significant. Er wordt ook vastgesteld dat nitriet zorgt voor minder carbonylvorming. In tegenstelling tot de antioxidatieve rol van nitriet in de vetoxidatie, is deze werking van nitriet tijdens de eiwitoxidatie nog niet beschreven in de literatuur. Wel kan een analoge redenering gevolgd worden als bij de vetoxidatie: aangezien nitriet Fe2+ kan vangen, kan dit Fe2+ de Fenton reactie niet katalyseren met minder hydroxylradicalen en eiwitoxidatie tot gevolg. Wat betreft de carbonyls in de digesta van het duodenum, was er een significante interactie tussen het heem- en nitrietgehalte te zien (Tabel 8). Zonder toegevoegd nitriet werd de hoogste waarde voor carbonyls gevonden bij de digesta van rundvlees, in de digesta van varkens- en kippenvlees werd minder dan de helft van het carbonylgehalte van de digesta van rundvlees teruggevonden. Het carbonylgehalte van varkens- en kippenvlees was niet significant verschillend van elkaar bij 0 ppm nitriet. Met toegevoegd nitriet was het verschil tussen de drie vleessoorten niet significant. Vergeleken met de overeenkomstige stalen zonder toegevoegd nitriet, werd in de digesta met rundvlees ongeveer drie keer minder carbonylcomponenten gevonden, terwijl er bij het varkens- en kippenvlees geen significant verschil was. Ook tijdens de vertering van het vlees is nitriet dus in staat om op te treden als antioxidant.

49

Onze proef wijst uit dat vertering van rundvlees niet alleen resulteert in de hoogste waarden voor MDA, maar ook voor carbonylgroepen. Een aantal onderzoekers hebben gekeken naar het effect van verschillende parameters op de oxidatie van eiwitten in vlees (zoals Batifoulier et al., 2002) maar wat er precies gebeurt tijdens de in vitro vertering van vlees werd naar mijn kennis nog niet gedocumenteerd in de literatuur. In Lund et al. (2011) wordt beschreven dat de combinatie van transitiemetalen met H2O2 een pro-oxidatief effect heeft op eiwitten. Vooral Fe3+ en Cu2+ zijn in staat om carbonyls te vormen. Aangezien in het maagsap transitiemetalen en H2O2 aanwezig zijn, zou kunnen verwacht worden dat, net als het MDA gehalte, het gehalte aan carbonyls in de digesta van het duodenum hoger is dan in onverteerd vlees. Er werd wel een studie gevonden die keek naar het carbonylgehalte van vis na in vitro vertering (Marmon en Undeland, 2013). Hieruit bleek dat een lagere pH zorgde voor meer vetoxidatie maar het carbonylgehalte bleef gelijk. Er zou dus gesteld kunnen worden dat de lage pH in onze maag de oxidatie van eiwitten niet bevordert, in tegenstelling tot de oxidatie van vetten. Dit is tegenstrijdig aan de bovengestelde verwachting. Tijdens de vertering werd de verwachting van de rol van heem wel min of meer vervuld: ongepekeld rundvlees had de meeste carbonylcomponenten. Bij varkens- en kippenvlees werden duidelijk minder carbonylgroepen gedetecteerd in de duodenum stalen in vergelijking met de onverteerde stalen. Bij rundvlees was dit verschil niet zo groot. Hierbij moet men wel weten dat de gemeten carbonylgroepen geen eindproducten waren maar een netto hoeveelheid (= hoeveelheid gevormde carbonyls – hoeveelheid weggereageerde carbonyls). Daarom is een vergelijking tussen de stalen niet altijd eenvoudig. In het colon was er bij M1 en M3 geen significante interactie tussen het heem- en nitrietgehalte wat betreft de aanwezigheid van carbonyls (Tabel 8). Net als bij de vetoxidatie heeft M3 over de hele lijn de hoogste carbonylwaarden. Zowel bij de nitriet behandelde als nitriet onbehandelde stalen zijn de verschillen tussen de drie vleessoorten in hoeveelheid carbonyls niet significant bij M2 en M3. Bij M1 is er bij de ongepekelde stalen enkel een significant verschil tussen de digesta van rund- en varkensvlees. Bij de nitrietgepekelde stalen zijn de digesta van het varkens- en kippenvlees niet verschillend van elkaar maar wel van het rundvlees. De bevinding dat het heemgehalte niet het verwachte effect vertoont, is ook te zien bij de colonvertering bij de drie microbiota: rund- en kippenvlees hebben geen significant verschil in hun carbonylgehalte. Uit de vergelijking in carbonylgehalte tussen duodenum en colon stalen kunnen geen relevante besluiten getrokken worden aangezien er geen gelijklopende 50

resultaten zijn tussen de drie microbiota (Tabel 8). Aangezien bacteriën zelf ook eiwitten bevatten, werden in de digesta de oxidatieproducten daarvan ook mee gemeten, wat ook deels de variatie tussen de drie proefpersonen zou kunnen verklaren. In tegenstelling tot de onverteerde stalen en de stalen afkomstig uit het duodenum blijkt hier dat nitriet niet meer antioxidatief optreedt wat betreft de vorming van carbonyls. Het is zeer waarschijnlijk dat onze darmbacteriën hier verantwoordelijk voor zijn. Zoals eerder aangehaald kan nitriet reageren met amines en amides, die vrijkomen na de eiwitafbraak door bacteriën. Dit zou vooral in de maag gebeuren o.i.v. de zure pH (Hawksworth en Hill, 1971), maar verschillende darmbacteriën kunnen dit ook bij neutrale pH (Sander, 1968; Hawksworth en Hill, 1971). Hierdoor is dus heel wat minder nitriet aanwezig in het colon met een meer pro-oxidatieve omgeving als gevolg en dus meer carbonylvorming. Mogelijks kunnen de bacteriën zorgen voor zulke oxiderende omstandigheden waarbij nitriet de eiwitoxidatie niet meer kan inhiberen, maar wel nog steeds de vetoxidatie. Er is echter verder onderzoek nodig om deze hypothese te kunnen bevestigen. 5.1.2.3 Thiolgroepen Bij de vorming van thiolgroepen was er in het onverteerd vlees een significante interactie tussen heem- en nitrietgehalte van het vlees (Tabel 8). In het rundvlees waren dubbel zoveel thiolgroepen aanwezig als in het varkensvlees, waaruit men zou kunnen afleiden dat er in varkensvlees het meest oxidatie heeft opgetreden, maar het kan ook zijn dat in dit vlees gewoon minder thiolgroepen aanwezig waren. Met toegevoegd nitriet was er geen significant verschil tussen de drie vleessoorten in hoeveelheid thiols. Bovendien geldt voor de drie vleessoorten dat de hoeveelheid thiols bij 0 ppm nitriet niet significant verschillend is van de hoeveelheid thiols bij 120 ppm nitriet. Hieruit kunnen we afleiden dat nitriet niet als antioxidant heeft opgetreden, dit in tegenstelling tot de antioxidatieve werking bij de MDA en carbonyl resultaten. Na vertering in het duodenum was er voor de aanwezigheid van thiolgroepen geen significante interactie tussen het heem- en nitrietgehalte van het vlees. Het verschil tussen de digesta van kippen-, varkens- en rundvlees voor de aanwezige thiolgroepen was niet significant, dit zowel met als zonder toegevoegd nitriet. Na verdere vertering in het colon (Tabel 8) werden geen significante effecten gevonden voor zowel het heem- en nitrietgehalte als hun interactie. Enkel bij M1 zag men een significante invloed van nitriet op de thiolgroepen, waarbij lagere waarden gevonden werden bij de nitrietbehandelde stalen. Alle 51

waarden liggen echter zeer dicht bij de detectielimiet, waardoor het moeilijk is om relevante conclusies te trekken. Zoals ook blijkt uit de andere experimenten (zie verder) tonen de resultaten van de thiols vaak geen significant verschil tussen de digesta. Er waren grote variaties tussen de digesta en ook veel lage absorbantiewaarden. Naar mijn weten was het de eerste keer dat thiolgroepen tijdens in vitro vertering van vlees gemeten werden. Thiolgroepen zijn een van de functionele groepen die het meest gevoelig zijn voor oxidatie (Sethuraman et al., 2004). Uit de vele niet gedetecteerde waarden en de lage thiolwaarden in het duodenum in vergelijking met de onverteerde stalen (Tabel 8), kan besloten worden dat er wel degelijk oxidatie heeft opgetreden (want de thiolgroepen zijn weg), maar het is moeilijk om behandelingseffecten te zien. Waarschijnlijk zal hier net als bij de carbonyls het heem geen significante invloed uitoefenen aangezien in het duodenum de grootste daling te zien is bij rundvlees en vervolgens bij kippenvlees t.o.v. onverteerd vlees (Tabel 8).

52

Tabel 8. Experiment 1: Gehalte aan MDA, carbonyls en thiolgroepen (gemiddelde ± standaard afwijking) in de onverteerde stalen, de digesta van het duodenum en van het colon, uitgedrukt in nmol/ml digesta, n=2 bij onverteerde stalen en colon, n=6 bij duodenum, tenzij anders vermeld nitriet (ppm) diersoort MDA - Onverteerd - Duodenum - Colon M1 M2 M3 Carbonyls - Onverteerd - Duodenum - Colon M1 M2 M3 Thiolgroepen - Onverteerd - Duodenum - Colon M1 M2 M3 a,b,c,d,e

kip

0 varken

kip

120 varken

rund

rund

P heem

P nitriet

P heem*nitriet

5,72 ± 0,18bc 9,81 ± 1,85c

5,40 ± 0,01c 14,8 ± 1,98b

15,0 ± 0,94a 28,1 ± 1,43a

2,78 ± 0,37d 8,73 ± 1,62c

2,01 ± 0,00d 9,22 ± 1,35c

7,37 ± 0,10b 11,0 ± 1,45c

<0,001 <0,001

<0,001 <0,001

<0,001 <0,001

7,94 ± 0,48c 10,7 ± 0,17d 23,2 ± 0,02c

11,0 ± 0,12b 12,4 ± 0,17b 29,7 ±0,68b

19,8 ± 0,19a 19,6 ± 0,11a 39,4 ± 1,40a

5,59 ± 0,18d 9,37 ± 0,00e 23,5 ± 0,10c

6,01 ± 0,03d 9,17 ± 0,03e 24,0 ± 0,47c

8,70 ± 0,56c 11,4 ± 0,18c 25,8 ±0,59c

<0,001 <0,001 <0,001

<0,001 <0,001 <0,001

<0,001 <0,001 <0,001

10,1 ± 1,21a (n=3) 4,79 ± 1,99b

11,8 ± 2,53a (n=3) 4,92 ± 2,59b

13,8 ± 2,66a

4,77 ± 1,05b (n=3) 3,54 ± 0,51b

5,43 ± 1,73b (n=3) 4,12 ± 0,67b

0,068

<0,001

0,465

11,8 ± 1,66a

4,16 ± 0,20b (n=4) 3,57 ± 0,99b

<0,001

<0,001

<0,001

4,32 ±0,33abc 4,80 ± 0,44ab 5,23 ± 0,12ab

3,85 ± 0,09bc 4,18 ±0,10abc 6,20 ± 0,61ab

5,43 ± 0,17a 5,58 ± 0,60a 6,42 ± 0,79a

3,23 ± 0,66c 3,01 ± 0,27c 5,25 ± 0,01ab

3,22 ± 0,14c 3,93 ± 0,36bc 4,59 ± 0,18b

4,76 ± 0,30ab 3,73 ± 0,33bc 5,34 ± 0,26ab

0,001 0,067 0,171

0,007 0,001 0,011

0,583 0,042 0,089

631 ± 27,7ab 24,8 ± 23,0

358 ± 183b 75,0 ± 62,3

727 ± 3,26a 73,3 ± 43,6

425 ± 26,1ab 29,9 ± 26,0

630 ± 6,53ab 55,0 ± 44,4

675 ± 53,8a 50,7 ± 30,9

0,021 0,056

0,923 0,363

0,014 0,658

19,6 ± 11,4b 18,1 ± 9,40 11,5 ± 0,00

26,2 ± 11,8ab 56,8 ± 6,13 11,5 ± 0,00

47,9 ± 4,08a 61,4 ± 38,8 44,4 ± 5,71

11,5 ± 0,00b 20,8 ± 0,82 29,7 ± 25,7

11,5 ± 0,00b 40,7 ± 13,4 19,3 ± 11,0

11,5 ± 0,00b 39,5 ± 39,6 67,8 ± 65,7

0,063 0,197 0,182

0,003 0,421 0,368

0,063 0,756 0,930

: gemiddelden in dezelfde rij met verschillend superscript zijn significant verschillend van elkaar (p<0,05)

53

5.2 Experiment vetgehalte 5.2.1 Samenstelling stalen Uit Tabel 9 blijkt dat toevoeging van vet aan het vlees zorgde voor een verandering in droge stof- en vetgehalte. Zowel voor het droge stof- als het vetgehalte werd het hoogste gehalte gemeten voor varkensvlees met 20% toegevoegd vet en 120 ppm nitriet. Hetzelfde vlees maar zonder nitriet had significant lagere gehaltes. Varkensvlees met 5% toegevoegd vet had droge stof- en vetgehaltes die significant lager waren dan vlees met 20% toegevoegd vet, en significant hoger dan vlees met 0% toegevoegd vet, ongeacht het nitrietgehalte. Er waren significante verschillen in eiwitgehalte tussen de stalen, de waarden varieerden tussen 17,8 en 24,5%. Wat betreft de vetzuren is uit Tabel 9 af te leiden dat er geen opmerkelijke verschillen zijn tussen de drie vetgehaltes. Dit komt doordat de resultaten relatief uitgedrukt werden (g/100g vetzuren). Per gram vlees zou een vetpercentage van 20 wel hogere gehaltes hebben aan SFA, MUFA en PUFA. Voor het totaal ijzergehalte is enkel het varkensvlees met 0% toegevoegd vet en 120 ppm nitriet significant hoger dan het varkensvlees met 20% toegevoegd vet en 0 ppm nitriet en werden verder geen significante verschillen gevonden (Tabel 9). Uit Tabel 9 blijkt dat bij varkensvlees met 0 en 20% toegevoegd vet er geen verschil was in heemgehalte tussen vlees met en zonder nitriet. Enkel bij een vetgehalte van 5% was het heemgehalte met toegevoegd nitriet significant hoger dan het heemgehalte van hetzelfde vlees zonder nitriet. Dit waren de enige twee behandelingen die significant verschilden in hoeveelheid heempigmenten, deze verschillen waren bovendien relatief klein. Uit Tabel 9 blijkt ook dat hoe meer vet aanwezig, hoe lager het teruggevonden nitrietgehalte in het vlees. Zonder toegevoegd vet blijft een goede 40% van de 120 ppm toegevoegd nitriet over. Bij 5% toegevoegd vet is dit maar 30% en bij 20% toegevoegd vet amper 25%. Dit zou kunnen komen door het feit dat nitriet reacties aangaat met de aanwezige vetten in het vlees en nitriet dan niet meer als zodanig wordt gedetecteerd (Freybler et al., 1993).

54

Tabel 9. Experiment 2: Ruwe samenstelling, vetzuur-, ijzer-, heem- en nitrietgehalte (gemiddelde ± standaard afwijking) van het vlees, n=2 nitriet (ppm) toegevoegd vet (%) DS (g/100g verse stof) vet (g/100g verse stof) eiwit (g/100g verse stof) SFA (g/100g vetzuren) MUFA (g/100g vetzuren) PUFA (g/100g vetzuren) Totaal Fe (mg/kg vlees) Heem (mg/kg vlees) Nitriet (mg/kg vlees)

0

0 5

0

120 5

20

20

P behandeling

29,1 ± 0,00d

31,2 ± 0,32c

36,9 ± 0,21b

29,3 ± 0,54d

31,9 ± 0,35c

43,6 ± 0,80a

0,046

1,63 ± 0,01d

5,87 ± 0,17c

16,0 ± 0,16b

1,70 ± 0,08d

5,71 ± 0,09c

20,6 ± 0,91a

0,001

24,5 ± 0,72a

21,5 ± 1,82abc

17,8 ± 1,53c

22,2 ± 0,08ab

22,2 ± 0,84ab

18,4 ± 0,37bc

0,176

32,1 ± 4,12b

38,0 ± 0,28ab

39,6 ± 0,19a

38,3 ± 0,34ab

38,3 ± 0,05ab

39,6 ± 0,04a

0,754

37,9 ± 4,82

42,2 ± 0,29

43,1 ± 0,23

41,5 ± 1,99

42,4 ± 0,14

42,9 ± 0,15

0,017

15,4 ± 1,11

16,0 ± 0,13

16,4 ± 0,24

15,4 ± 0,37

15,9 ± 0,01

16,1 ± 0,21

<0,001

5,42 ± 0,24ab

5,47 ± 0,30ab

6,05 ± 0,62a

4,60 ± 0,03b

4,87 ± 0,31ab

4,87 ± 0,19ab

<0,001

2,63ab (n=1)

2,51 ± 0,00b

2,63 ± 0,17ab

2,90 ± 0,13ab

3,05 ± 0,08a

2,60 ± 0,04b

<0,001

n.a.

n.a.

n.a.

48,8 ± 1,74a

36,4 ± 0,33b

29,8 ± 0,72c

0,075

a,b,c,d


55

5.2.2 Oxidatieparameters 5.2.2.1 MDA In Tabel 10 is te zien dat de interactie tussen het veten nitrietgehalte significant is voor de hoeveelheid MDA in de onverteerde stalen. Zonder toegevoegd nitriet was het MDA gehalte het hoogst voor varkensvlees met 5 en 20% toegevoegd vet. Met toegevoegd nitriet was er geen verschil tussen de verschillende vetgehaltes wat betreft de MDA vorming en bovendien was het MDA gehalte bij alle drie de vetgehaltes significant lager dan dezelfde vleesstalen zonder nitriet. Dat het vlees met 5 en 20% toegevoegd vet de hoogste MDA waarden heeft, lijkt logisch aangezien er meer vetoxidatie kan optreden als er meer vet aanwezig is in het vlees. Deze resultaten zijn in overeenstemming met een onderzoek van Jo et al. (1999). Hierbij zag men dat de vetoxidatie toenam (mg MDA/kg vlees) met toenemend vetgehalte van gekookt varkensvlees. Dit komt waarschijnlijk doordat het PUFA gehalte van het vlees met 5 en 20% toegevoegd vet absoluut gezien wel hoger is dan het PUFA gehalte van vlees zonder toegevoegd vet. Daarom werd ook verwacht dat er meer vetoxidatie zou zijn bij vlees met 20% toegevoegd vet t.o.v. vlees met 5% toegevoegd vet, maar dit was niet het geval. Nitriet zorgt ook hier voor een lager MDA gehalte wat kan verklaard worden zoals beschreven bij experiment 1. Daarnaast hebben Goutefongea et al. (1977) aangetoond dat nitriet kan reageren met onverzadigde vetzuren en hierop verder gaand hebben Freybler et al. (1993) gekeken naar de stabiliteit van deze gevormde componenten t.a.v. vetoxidatie. Men zag dat er minder vetoxidatie optrad in nitrietgepekeld varkensvlees dan in ongepekeld varkensvlees. De vetten in het nitrietgepekeld varkensvlees werden gestabiliseerd door de reactie met nitriet of N2O3 waardoor ze beschermd werden tegen vetoxidatie. Hierdoor kunnen de lagere MDA waarden bij het varkensvlees met nitriet in deze studie verklaard worden. Er bleek een interactie te zijn tussen het veten het nitrietgehalte wat betreft de aanwezigheid van MDA in het duodenum (Tabel 10). Analoog aan wat gezien werd in de onverteerde stalen werd bij vertering van stalen zonder toegevoegd nitriet het minst MDA gevonden in vlees met 0% toegevoegd vet, vergeleken met vlees waaraan 5 en 20% vet werd toegevoegd en de concentratie MDA was niet significant verschillend tussen vlees met 5 en 20% toegevoegd vet. Vlees met 5 en 20% toegevoegd vet waaraan 120 ppm nitriet werd toegevoegd, had een lagere MDA waarde dan vlees zonder toegevoegd nitriet. Bij 0% toegevoegd vet was er geen significant verschil tussen 0 en 120 ppm nitriet. Bij 120 ppm nitriet was de hoeveelheid MDA 56

per ml digesta niet significant verschillend tussen de drie vetgehaltes. Hierbij kan de redenering van de onverteerde stalen verder uitgebreid worden: aan het vlees toegevoegd nitriet kan reageren met de aanwezige vetten waardoor deze beschermd worden tegen oxidatieprocessen tijdens de vertering. Echter, in vergelijking met het MDA gehalte in onverteerd vlees steeg het MDA gehalte na de duodenumfase 2,5 maal bij de stalen zonder nitriet en 4 maal bij de stalen met nitriet. Hieruit blijkt dat nitriet minder antioxidatief werkt eens het vlees verteerd wordt. Zoals in de literatuurstudie beschreven kan nitriet geprotoneerd worden tot HNO2, hieruit kunnen nitroserende species ontstaan die ascorbinezuur verbruiken. Ascorbinezuur, een belangrijke antioxidant, is in staat om H2O2, O2•-, OCl-, OH• en LOO• efficiënt te vangen en zo de vetoxidatie te belemmeren (Sies et al., 1992). Ascorbinezuur kan echter ook Fe3+ reduceren tot Fe2+ en Cu2+ tot Cu+, waardoor H2O2, O2•- en OH• kunnen gevormd worden. Algemeen zal ascorbinezuur bij lage concentraties reageren als pro-oxidant en bij hoge concentraties als antioxidant (Buettner en Jurkiewicz, 1996). De range van wat men bedoelt met hoge en lage concentratie is zeer breed en verschilt van studie tot studie. Zo zagen Girotti et al. (1985a) dat ascorbinezuur bij een concentratie van 0,5 mM de peroxidatie van vetten in erytrocyt membranen deed stijgen, een concentratie van 15 mM inhibeerde de vetoxidatie. Een andere studie van Girotti et al. (1985b) toonde een stijging in vetoxidatie tot een concentratie van 0,25 mM, een hogere concentratie (1, 5 en 20 mM) had het omgekeerde effect. In Tabel 10 is te zien dat er voor M1 en M2, maar niet voor M3, een significante interactie was tussen het veten nitrietgehalte van het vlees voor de aanwezigheid van MDA. Zonder nitriet werd bij M1 en M2 een hoger MDA gehalte gedetecteerd bij de hogere vetpercentages (5 en 20% vet). Dit is analoog aan de resultaten voor de onverteerde en duodenum stalen (Tabel 10). Met toegevoegd nitriet zijn de aandelen MDA niet altijd lager in vergelijking met de aandelen MDA in vlees zonder nitriet. Bovendien zijn er grote verschillen tussen de drie proefpersonen. Bij de derde proefpersoon had het vetgehalte van het vlees geen significante invloed op de hoeveelheid MDA in de digesta, dit zowel met als zonder nitriet. In experiment 2 was het niet zo dat een hoger vetgehalte aanleiding gaf tot meer oxidatie in het colon (M1 en M3). De resultaten komen dus niet overeen met deze van het duodenum. Uit Tabel 10 is ook te zien dat bij de digesta van M3 meer vetoxidatie heeft plaats gevonden (meer nmol MDA/ml digesta) dan bij M1 en M2. Waarschijnlijk was er in de derde

57

proefpersoon initieel meer MDA aanwezig of was het MDA nog niet zoveel weggereageerd als bij proefpersoon 1 en 2. 5.2.2.2 Carbonyls Voor de stalen zonder toegevoegd nitriet bleek dat het vetgehalte geen significante invloed had op de vorming van carbonylcomponenten (Tabel 10). Dit bleek ook zo te zijn met toegevoegd nitriet. Met toegevoegd nitriet had enkel het vlees met 5% toegevoegd vet een carbonylgehalte dat significant lager was dan het carbonylgehalte van hetzelfde vlees zonder nitriet. Het vlees met 0 en 20% toegevoegd vet was niet significant verschillend van elkaar wat betreft de carbonylvorming, met en zonder toegevoegd nitriet. Zoals hierboven beschreven geeft een hoger vetpercentage aanleiding tot meer vetoxidatie. Uit de resultaten blijkt dat carbonylvorming niet toeneemt met toenemend vetgehalte dus de link tussen veten eiwitoxidatie zoals vaak aangehaald in de literatuur (Mercier et al., 1998) kan hier niet bevestigd worden. Nog steeds bestaat heel wat discussie over de mogelijke rol van vetoxidatie producten als initiators van eiwitoxidatie. In vlees gebeurt de oxidatie van vetten sneller dan die van eiwitten (Davies et al., 1999), waardoor het logisch lijkt dat hydroperoxides en andere afgeleide radicalen de eiwitoxidatie promoten en niet andersom. Een ander argument dat pleit voor een koppeling is het feit dat peroxylradicalen die ontstaan tijdens de vetoxidatie gemakkelijk waterstofatomen kunnen onttrekken van eiwitten waardoor een kettingreactie op gang komt, gelijkaardig aan die van de vetoxidatie (Stadtman en Levine, 2003). Sommige studies vermelden een gelijktijdig optreden van veten eiwitoxidatie (zoals Mercier et al., 1998), met mogelijke interactie tot gevolg, terwijl een andere studie aantoont dat eiwitoxidatie maar minimaal beïnvloed wordt door vetoxidatie (Liu en Xiong, 1996). Het duidelijke antioxidatief effect van nitriet op carbonylvorming uit experiment 1 kon hier niet bevestigd worden, met uitzondering van varkensvlees met 5% toegevoegd vet. Voor de aanwezigheid van carbonyls in de digesta van het duodenum was er een significante interactie tussen het veten nitrietgehalte van het vlees (Tabel 10). De hoogste waarden werden gemeten bij de digesta van het vlees met 5 en 20% toegevoegd vet zonder toegevoegd nitriet. Deze waren niet significant verschillend van elkaar. Zonder toegevoegd nitriet werd in het vlees met 0% toegevoegd vet een significant lager carbonylgehalte teruggevonden dan bij 5 en 20% toegevoegd vet. Met 120 ppm toegevoegd nitriet waren de carbonylwaarden significant lager voor de digesta met vlees met een vetgehalte van 5 en 20%, vergeleken met de digesta van hetzelfde vlees zonder nitriet, terwijl geen verschillen gevonden werden voor 58

deze met 0% toegevoegd vet. Net als bij MDA zien we dat het verschil tussen de digesta van vlees met verschillende vetgehaltes qua hoeveelheid aanwezige carbonyls verdwijnt eens nitriet werd toegevoegd aan het vlees. Blijkbaar werkt nitriet hier toch ook antioxidatief. Opvallend is dat het carbonylgehalte van vlees met 0% toegevoegd vet en 0 ppm nitriet niet significant verschillend was van het carbonylgehalte van vlees met 20% toegevoegd vet en 120 ppm nitriet. Hier zou men kunnen stellen dat het consumeren van vlees met vet én nitriet qua carbonylgehalte overeenkomt met het consumeren van vetarm vlees zonder nitriet! In de digesta van vlees zonder nitriet is er in het duodenum zowel een toename in carbonylcomponenten als MDA met toenemend vetgehalte in het vlees. Met andere woorden, hier zien we een positieve correlatie tussen eiwitoxidatie en vetoxidatie. Dit in tegenstelling tot de onverteerde stalen waar de link tussen veten eiwitoxidatie niet werd bekrachtigd. Dit zou kunnen komen door het vrijkomen van veel vetzuren als de vetten verteerd worden en zoals geweten zijn deze vrije vetzuren gevoeliger voor oxidatie (zie “2.5.4.1 Duodenum”), waardoor het zou kunnen dat de omgeving voor de eiwitten meer pro-oxidatief is geworden. Uit dit experiment blijkt dat de carbonylgehaltes niet beïnvloed werden door de hoeveelheid vet, noch door het nitrietgehalte in het verteerd vlees en dit bij alle drie de microbiota (Tabel 10). Wel waren de waarden bij M3 numeriek wat hoger dan bij M1 en M2. Dit was ook het geval voor de MDA waarden, waardoor we hier zouden kunnen zeggen dat proefpersoon 3 gevoeliger is voor oxidatie dan de andere 2 personen, dit zowel voor vet- als eiwitoxidatie. Of veten eiwitoxidatie gekoppeld zijn in het colon zal waarschijnlijk in grote mate afhangen van de oxidatieve status in ons colon, wat op zijn beurt bepaald wordt door de aanwezige bacteriën. Hierbij is ons dieet een cruciale factor. Zo vonden Maier et al. (1974) dat een dieet zonder vlees aanleiding gaf tot een toename in de hoeveelheid lactobacilli en veel rundvlees zorgde voor een daling in de lactobacilli. Zoals eerder aangehaald zorgen deze bacteriën voor minder oxidatie. Het zou dus kunnen dat bij proefpersoon 3 minder lactobacilli aanwezig waren. Molly et al. (1994) halen terecht aan dat de invloed van de microbiële populatie niet kan in beeld gebracht worden door enkel naar de microbiële concentraties of activiteiten te kijken. Er zijn ook interacties mogelijk tussen verschillende groepen van bacteriën. Dit is een onderzoeksgebied waarin de wetenschappers zich nog meer moeten in verdiepen. 5.2.2.3 Thiolgroepen In de onverteerde vleesstalen was zonder toegevoegd nitriet de aanwezigheid van thiolgroepen enkel significant verschillend tussen vlees met 0 en 5% toegevoegd vet (Tabel 59

10). Met 120 ppm nitriet was er geen verschil in hoeveelheid thiols tussen de verschillende vetgehaltes. Voor alle vetgehaltes geldt dat de aanwezigheid van thiolgroepen niet significant verschillend is tussen 0 en 120 ppm nitriet. Ook hier kan de hypothese van een mogelijke link tussen veten eiwitoxidatie niet bevestigd worden aangezien het vlees met 0 en 20% toegevoegd vet niet significant verschillend zijn in hun thiolgehalte. Uit Tabel 10 blijkt dat in het duodenum er geen significante interactie was tussen het veten nitrietgehalte wat betreft de thiolgroepen. Het vetgehalte had een significant effect op de aanwezigheid van thiolgroepen. Post hoc waren deze verschillen echter niet te zien: zowel met als zonder toegevoegd nitriet waren de gehaltes aan thiolgroepen in verteerd vlees met verschillende vetgehaltes niet significant verschillend van elkaar. Net zoals bij experiment 1 zijn de thiolwaarden lager in vergelijking met de onverteerde stalen, wat wil zeggen dat er oxidatie heeft plaatsgevonden (zie bespreking experiment 1). Ook voor de thiolgroepen werd er in dit experiment bij de drie microbiota geen significante interactie waargenomen tussen veten nitrietgehalte in het colon. De verschillende vetgehaltes en toevoeging van nitriet hadden geen significant effect op het aandeel thiolgroepen. Numeriek had proefpersoon 1 de laagste waarden en zou men dus kunnen stellen dat bij deze persoon de meeste oxidatie heeft opgetreden. Dit is tegenstrijdig aan de resultaten van MDA en carbonyls: daar had proefpersoon 1 de laagste waarden wat overeenkomt met minder oxidatie. Om een goed beeld te kunnen krijgen over de mate van oxidatie in het colon, zouden verschillende tijdstippen bestudeerd moeten worden.

60

Tabel 10. Experiment 2: Gehalte aan MDA, carbonyls en thiolgroepen (gemiddelde ± standaard afwijking) in de onverteerde stalen, de digesta van het duodenum en van het colon, uitgedrukt in nmol/ml digesta, n=2 bij onverteerde stalen en colon, n=6 bij duodenum, tenzij anders vermeld nitriet (ppm) vet (%) MDA - Onverteerd - Duodenum - Colon M1 M2 M3 Carbonyls - Onverteerd - Duodenum - Colon M1 M2 M3 Thiolgroepen - Onverteerd - Duodenum - Colon M1 M2 M3

1

0 5

1

120 5

20

20

P vet

P nitriet

P vet*nitriet

4,00 ± 0,36b 9,15 ± 1,89b

5,40 ± 0,01a 13,3 ± 1,85a

5,28 ± 0,16a 12,6 ± 1,42a

1,96 ± 0,03c 8,19 ± 1,66b

2,01 ± 0,00c 8,36 ± 1,23b

1,89 ± 0,06c 8,01 ± 1,74b

0,002 0,009

<0,001 <0,001

0,002 0,010

7,24 ± 0,23c 14,3 ± 0,67b 24,9 ± 0,56

11,4 ± 0,71a 16,3 ± 0,15a 26,3 ± 1,48

9,46 ± 0,25b 15,1 ± 0,24ab 24,8 ± 0,69

5,99 ± 0,47cd 14,3 ± 0,01b 23,8 ± 0,61

5,89 ± 0,04cd 12,7 ± 0,34c 24,3 ± 0,24

5,49 ± 0,45d 12,0 ± 0,21c 22,7 ± 1,31

0,002 0,019 0,131

<0,001 <0,001 0,018

0,001 <0,001 0,717

9,96 ± 2,53ab (n=4) 3,31 ± 0,52c

11,8 ± 2,53a (n=3) 5,49 ± 0,80ab

7,62 ± 2,56abc (n=4) 5,62 ± 1,60a

6,59 ± 0,93bc (n=4) 3,85 ± 0,68bc

4,77 ± 1,05c (n=3) 3,49 ± 0,74c

7,43 ±0,22abc (n=3) 3,30 ± 0,79c

0,707

0,001

0,022

0,036

<0,001

0,001

5,49 ± 0,40 4,36 ± 0,25 7,41 ± 0,01

6,14 ± 1,40 4,42 ± 0,40 6,40 ± 0,71

3,30 ± 2,98 4,24 ± 0,51 6,11 ± 1,54

5,35 ± 0,55 3,92 ± 0,80 7,94 ± 0,39

4,28 ± 0,37 4,64 ± 0,70 6,12 ± 1,31

4,61 ± 1,48 3,24 ± 0,57 7,30 ± 0,12

0,391 0,228 0,150

0,804 0,260 0,384

0,388 0,376 0,541

775 ± 19,6a 33,1 ± 30,5

358 ± 183b 113 ± 92,8

646 ± 16,3ab 56,0 ± 35,6

613 ± 44,1ab 53,6 ± 68,1

630 ± 6,53ab 103 ± 71,2

513 ± 1,63ab 55,4 ± 65,2

0,029 0,045

0,869 0,882

0,013 0,837

11,5 ± 0,00 36,9 ± 35,9 77,9 ± 66,1

11,5 ± 0,00 50,8 ± 55,5 46,2 ± 3,26

26,2 ± 20,8 80,8 ± 49,0 47,3 ± 0,00

11,5 ± 0,00 46,2 ± 1,63 134 ± 32,6

11,5 ± 0,00 90,0 ± 34,3 88,8 ± 32,6

11,5 ± 0,00 124 ± 18,8 22,5 ± 15,5

0,422 0,147 0,064

0,356 0,204 0,251

0,422 0,787 0,265

a,b,c,d


61

5.3 Experiment verhittingsproces 5.3.1 Samenstelling stalen In Tabel 11 is te zien dat het verhittingsproces een significant effect had op het droge stof- en vetgehalte van het vlees. Het grootste droge stofgehalte werd gemeten voor T95 met 120 ppm nitriet, T95 met 0 ppm nitriet en T65 met 120 ppm nitriet. Het droge stofgehalte van de laatste twee was niet significant verschillend van het droge stofgehalte van rauw varkensvlees met 120 ppm nitriet en T65 met 0 ppm nitriet. Het verschil in droge stof tussen rauw varkensvlees met en zonder nitriet en T65 zonder nitriet was niet significant. De hoeveelheid gemeten vet was het hoogst voor T65 met en zonder nitriet en T95 zonder nitriet. Er was geen significant verschil tussen deze stalen, wel was het vetgehalte significant verschillend van de overige stalen, die op hun beurt niet significant verschillend waren van elkaar. Het verhittingsproces dat het vlees onderging had geen significant effect op het ruw eiwitgehalte van de vleesstalen. In Tabel 11 is te zien dat er geen relevante verschillen zijn qua SFA gehalte tussen de drie verhittingsprocessen. Ook bij de hoeveelheid MUFA en PUFA zijn er geen opmerkelijke verschillen. Enkel het ijzergehalte van beide rauwe behandelingen blijkt significant lager te zijn dan het ijzergehalte van T95 zonder nitriet (Tabel 11). Hoewel statistisch verschillen gevonden werden, kunnen we stellen dat er geen relevante verschillen waren in heemgehalte tussen de stalen. Dit is tegenstrijdig aan de resultaten gevonden door Lombardi-Boccia et al. (2002). Bij hen zorgde het verwarmen van vlees voor een daling van het heemijzer, afhankelijk van de kookmethode. Vlees verwarmd in de oven bij 180°C vertoonde een heemverlies van 22 tot 43% in tegenstelling tot de 1 tot 24% bij vlees dat in een open pan werd gekookt. Het heemverlies was volgens hen te wijten aan het vochtverlies tijdens het koken. In dit experiment was er geen verschil tussen T65 en T95 wat te wijten kan zijn aan het kleine temperatuurverschil tussen beide behandelingen in vergelijking met de temperaturen bij Lombardi-Boccia et al. (2002). Zoals blijkt uit Tabel 11, werd het nitrietgehalte significant beïnvloed door het verhittingsproces dat het vlees onderging. In T95 werd minder dan de helft van het nitriet 62

teruggevonden dan dat er in het rauw en T65 vlees werd. Deze laatste twee behandelingen waren niet significant verschillend van elkaar wat betreft de hoeveelheid nitriet. Net zoals in de vorige experimenten is ook hier te zien dat het grootste deel van het toegevoegd nitriet niet meer als nitriet wordt gedetecteerd: 70 tot 87% is verdwenen. Deze resultaten komen redelijk overeen met een onderzoek van Kudryashow (2003) waaruit blijkt dat ongeveer 65% van het toegevoegd nitriet verloren gaat tijdens de bereiding van het vlees (Honikel, 2008). Dordevic´ et al. (1980) hebben aangetoond dat het grootste verlies van nitriet plaats vindt tijdens bewerkingen van vlees, vooral na het koken van vlees, en dat een hogere temperatuur zorgt voor meer verlies. Uit de resultaten van dit experiment blijkt ook dat in het T95 vlees (vlees dat werd blootgesteld aan de hoogste temperatuur) het meest nitriet is verloren gegaan.

63

Tabel 11. Experiment 3: Ruwe samenstelling, vetzuur-, ijzer-, heem- en nitrietgehalte (gemiddelde ± standaard afwijking) van het vlees, n=2 nitriet (ppm) verhittingsproces DS (g/100g verse stof) vet (g/100g verse stof) eiwit (g/100g verse stof) SFA (g/100g vetzuren) MUFA (g/100g vetzuren) PUFA (g/100g vetzuren) Totaal Fe (mg/kg vlees) Heem (mg/kg vlees) Nitriet (mg/kg vlees)

rauw 29,6 ± 0,74c

0 T65 31,2 ± 0,32bc

T95 32,5 ± 0,69ab

rauw 30,3 ± 0,07bc

120 T65 31,9 ± 0,35ab

T95 34,1 ± 0,83a

P behandeling 0,002

4,94 ± 0,30b

5,87 ± 0,17a

5,81 ± 0,21a

4,97 ± 0,08b

5,71 ± 0,09a

4,75 ± 0,00b

0,002

23,3 ± 2,32

21,5 ± 1,82

23,1 ± 0,01

21,3 ± 0,63

22,2 ± 0,84

23,4 ± 1,05

0,523

38,2 ± 0,05

38,0 ± 0,28

37,6 ± 1,07

37,9 ± 0,03

38,3 ± 0,05

37,5 ± 0,27

0,473

42,7 ± 0,44

42,2 ± 0,29

41,2 ± 1,25

42,1 ± 0,05

42,4 ± 0,14

41,2 ± 0,15

0,140

16,2 ± 0,01a

16,0 ± 0,13ab

15,5 ± 0,41b

15,7 ± 0,16ab

15,9 ± 0,01ab

15,7 ± 0,05ab

0,053

4,49 ± 0,21b

5,47 ± 0,30ab

7,70 ± 1,69a

4,15 ± 0,01b

4,87 ± 0,31ab

4,86 ± 0,04ab

0,022

2,57bc (n=1)

2,51 ± 0,00c

2,21c (n=1)

2,63abc (n=1)

3,05 ± 0,08ab

3,29a (n=1)

0,019

n.a.

n.a.

n.a.

38,2 ± 4,67a

36,4 ± 0,33a

15,7 ± 0,33b

0,006

a,b,c


64

5.3.2 Oxidatieparameters 5.3.2.1 MDA De interactie tussen het verhittingsproces dat het vlees onderging en het nitrietgehalte van het vlees was significant voor de vorming van MDA in de onverteerde stalen (Tabel 12). In het onverteerd vlees hadden T65 en T95 waaraan geen nitriet werd toegevoegd de hoogste MDA waarden (Tabel 12). Deze stalen hadden ook het hoogst gedetecteerde vetgehalte (Tabel 11). Uit Tabel 11 blijkt dat T65 met 120 ppm nitriet ook een hoog vetgehalte had maar het MDA gehalte is significant lager dan dat van T65 en T95 zonder nitriet (Tabel 12). Hieruit blijkt opnieuw het antioxidatief vermogen van nitriet. In rauw vlees zonder toegevoegd nitriet was het MDA gehalte minder dan de helft dan in T65 en T95 zonder nitriet. Met 120 ppm nitriet toegevoegd was er geen significant verschil tussen de drie processen (rauw, T65 en T95). Met toegevoegd nitriet was het gehalte aan MDA in T65 en T95 minder dan de helft van het MDA gehalte in hetzelfde vlees zonder nitriet. Dit is opnieuw te wijten aan de antioxidatieve werking van nitriet. Voor rauw vlees was er echter geen significant verschil tussen 0 en 120 ppm nitriet. Het koken van vlees zorgt voor het vernietigen van de celmembranen waardoor vetcomponenten worden blootgesteld aan zuurstof en er dus meer oxidatie kan optreden (Ladikos en Lougovois, 1990). Bovendien kan tijdens het koken ijzer worden vrijgesteld uit heem en niet-heemeiwitten waardoor het kan zorgen voor de productie van vrije radicalen (Garcia et al., 1996). De resultaten van dit experiment zijn in overeenstemming met de resultaten van Broncano et al. (2009). Zij toonden dat rauw vlees de laagste MDA waarden had en dat het koken van vlees aanleiding gaf tot meer vetoxidatie (hogere MDA waarden). Er werden verschillende kookmethodes vergeleken waarbij het roosteren (hoge temperatuur en lange tijd) van vlees het grootste MDA gehalte had. Hierbij moet wel opgemerkt worden dat in de studie van Broncano et al. (2009) vlees van Iberische varkens werd gebruikt, die gekenmerkt worden door een hoog gehalte aan PUFA in hun vlees (dus mogelijks meer vetoxidatie). Ook Hernandez et al. (1999) bewezen dat verschillende kookmethodes (frituren, ondiep braden, roosteren en koken) de oorzaak waren van meer vetoxidatie in varkensvlees. Brown et al. (1995) zagen in hun onderzoek hogere MDA gehaltes in vlees verhit bij 100°C dan in vlees verhit bij 250°C. Volgens hen werd het MDA gehalte in vlees bepaald door enerzijds de vorming van MDA en anderzijds de vervluchtiging van MDA in het vlees. Bij lage temperatuur (100°C) zou het kunnen dat de vetoxidatie bevorderd werd en dat de 65

verliezen minimaal waren. Bij hoge temperatuur (250°C) zouden de lagere MDA waarden kunnen toegeschreven worden aan meer vervluchtiging. In ons experiment is het verschil in MDA gehalte tussen vlees verhit bij 65 en 95°C niet significant, dit zou kunnen zijn door het kleine temperatuurverschil. Opmerkelijk is dat uit Tabel 11 blijkt dat het nitrietgehalte van T95 het laagst is en van rauw vlees het hoogst (doordat nitriet verloren gaat tijdens verhitting van vlees), terwijl uit Tabel 12 blijkt dat nitriet zorgt voor de grootste daling van MDA in T95 (van 5,70 naar 1,99 nmol) en niet in rauw vlees (geen significant verschil). Uit de resultaten zou men kunnen stellen dat qua vetstabiliteit het niet uitmaakt of nitriet wordt toegevoegd aan rauw vlees of niet. Voor de MDA gehaltes in het duodenum was er een significante interactie tussen het verhittingsproces dat het vlees onderging en het nitrietgehalte van het vlees (Tabel 12). Bij de vertering van stalen zonder toegevoegd nitriet waren enkel rauw vlees en T95 significant verschillend van elkaar wat betreft hun MDA gehalte. Hierbij bevatten de digesta van T95 het meest MDA. Met toegevoegd nitriet werden lagere MDA waarden gevonden in de digesta van T65 en T95, vergeleken met de digesta waar geen nitriet aan toegevoegd was. Bij rauw vlees was de MDA waarde met toegevoegd nitriet niet significant verschillend van het vlees zonder nitriet. Brown et al. (1995) keken in hun onderzoek naar het MDA gehalte in de urine van mensen die gekookt rundergehakt aten. Hierbij werd een onderscheid gemaakt tussen een kooktemperatuur van 100°C en van 250°C. Na zeven dagen het gekookt vlees bij 100°C te eten, was de MDA concentratie in hun urine hoger dan voor het experiment (normaal dieet met gemiddelde hoeveelheid vlees). Echter, na zeven dagen het gekookt vlees bij 250°C te eten, zag men dat de hoeveelheid MDA in de urine minder was dan bij 100°C. Of er oxidatie optrad tijdens de vertering is niet echt duidelijk aangezien het vlees verhit bij 100°C meer MDA bevatte dan het vlees verhit bij 250°C voordat de proefpersonen het opaten. Net zoals bij de onverteerde stalen zien we hier dat de invloed van het verhittingsproces op de aanwezigheid van MDA wegvalt, eens er nitriet aanwezig is. In het algemeen zijn in het duodenum hogere MDA waarden te zien in vergelijking met de onverteerde stalen. Dit wijst erop dat er oxidatieprocessen optreden tijdens de vertering van het vlees. Zoals hierboven beschreven (zie “2.5.4.1 Duodenum”) zijn er in het darmsap verschillende componenten aanwezig die deze oxidatie kunnen bevorderen, zoals calcium en 66

het enzym lipase. Ook BSA werd toegevoegd via het darmpsap, waarvan Vincent et al. (1988) hebben aangetoond dat het vetoxidatie, gekatalyseerd door heemijzer, bevordert. Wat ook opvalt in Tabel 12 is dat de MDA waarden in verteerd rauw vlees 5,5 keer zo hoog zijn dan de waarden in het onverteerd vlees. Daarentegen is bij de verhitte stalen (T65 en T95) deze factor ongeveer 2,5. En bovendien toont Tabel 11 dat het rauwe staal het laagste vetgehalte heeft. Hoe is het dan mogelijk dat het rauw vlees toch de hoogste aandelen MDA bevat in het duodenum? Is rauw vlees gevoeliger dan verhit vlees voor oxidatie tijdens de vertering? Volgens mij ligt de verklaring in het feit dat de vetoxidatie in vlees start ter hoogte van de celmembranen (Gray et al., 1996). Bij verhit vlees is al een groot deel van deze membranen vernietigd voor de vertering (Ladikos en Lougovois, 1990) waardoor er nadien tijdens de vertering minder membranen zullen vernietigd worden in vergelijking met het rauw vlees. Het is waarschijnlijk dat tijdens de vertering van rauw vlees meer membranen kapot kunnen gaan dan in verhit vlees, waardoor dus relatief gezien meer oxidatie kan optreden in het rauw vlees. Vandaar zou de grotere stijging in rauw vlees kunnen verklaard worden. In dit experiment bleek er voor de drie microbiota een significante interactie te zijn tussen het verhittingsproces dat het vlees onderging en de aanwezigheid van nitriet voor het MDA gehalte. Net zoals in experiment 1 en 2 heeft ook hier proefpersoon 3 de hoogste MDA waarden bij alle behandelingen. Over de drie microbiota heen zijn dezelfde trends te zien: zonder toegevoegd nitriet hadden de verhitte vleesstalen (T65 en T95) de hoogste MDA gehaltes, zoals ook bleek bij de onverteerde en duodenum stalen (Tabel 12). Met toegevoegd nitriet is te zien dat het nitriet enkel in verhit vlees zorgt voor een lager MDA gehalte: met 120 ppm nitriet werd voor T65 en T95 ongeveer half zoveel MDA gevonden dan in hetzelfde vlees zonder nitriet bij M1 en M2. Bij M3 is het verschil in MDA gehalte met en zonder nitriet niet zo groot. Voor alle microbiota geldt dat met toegevoegd nitriet, de drie processen (rauw, T65 en T95) niet van elkaar verschillen. Dit komt overeen met de resultaten van de onverteerde en duodenum stalen. Ook in dit experiment is te zien dat er heel wat variatie is tussen de drie microbiota. De MDA waarden in het colon voor M1 en M2 liggen iets lager dan deze in het duodenum, terwijl bij M3 de waarden in het colon hoger zijn dan in het duodenum. Dit was bij experiment 1 en 2 ook het geval en zou kunnen verklaard worden doordat bij proefpersoon 3 het MDA minder snel is weggereageerd dan bij proefpersonen 1 en 2 (zie ook discussie bij experiment 1 en 2). 67

5.3.2.2 Carbonyls Bij de onverteerde stalen was zonder toegevoegd nitriet het carbonylgehalte het laagst voor rauw vlees (Tabel 12). Tussen vlees verhit bij 65 en 95°C was er geen significant verschil bij 0 ppm nitriet. Met 120 ppm nitriet toegevoegd was er tussen de drie processen geen verschil in carbonylgehalte. Met nitriet was de carbonylvorming in T65 en T95 significant lager dan in hetzelfde vlees zonder nitriet. Voor rauw vlees was het carbonylgehalte bij 0 en 120 ppm nitriet niet significant verschillend. In het algemeen beschrijft men in de literatuur dat de carbonylgehaltes in rauw vlees lager zijn dan in gekookte vleesproducten (uitgedrukt in nmol/mg eiwit). Er kan gesuggereerd worden dat de handelingen tijdens het bereiden van de vleesproducten (zoals snijden en koken) het ontstaan van carbonylgroepen zou kunnen bevorderen (Estevez, 2011), wat in dit experiment ook wordt bevestigd. In tegenstelling tot vetoxidatie, is het effect van koken op de eiwitoxidatie nog niet zo uitgebreid beschreven. Sante-Lhoutellier et al. (2008) keken in hun onderzoek naar het carbonylgehalte van rundvlees gekookt bij een temperatuur van 100 en 270°C. Men zag dat de hoeveelheid carbonyls na vijf minuten koken bij 100°C al verdubbeld was en nadien bleef stijgen met een maximum bij 45 minuten koken. Het verschil in carbonylgehalte tussen rauw en gekookt vlees werd maar significant na 30 minuten koken. Bij de kooktemperatuur van 270°C werden na één minuut ongeveer evenveel carbonyls gedetecteerd dan na 45 minuten koken bij 100°C. De snelle toename in eiwitoxidatie door koken kan net zoals bij de vetoxidatie verklaard worden door een verlies aan antioxidantbescherming in het vlees (Mei et al., 1994) en door het vrijkomen van ijzer (Garcia et al., 1996). Mei et al. (1994) toonden aan dat de activiteit van een aantal antioxidant enzymen (zoals catalase en glutathion peroxidase) daalt in gekookt vlees vergeleken met ongekookt vlees. Net als bij de resultaten van MDA is te zien dat nitriet optreedt als een antioxidant in verhit vlees maar niet in rauw vlees. Voor de carbonylwaarden in het duodenum bleek er een significante interactie te zijn tussen het verhittingsproces en het nitrietgehalte van het vlees (Tabel 12). Zonder toegevoegd nitriet werd de hoogste waarde gemeten bij T95. In rauw vlees en T65 werden significant lagere waarden gevonden dan in T95, deze waarden waren niet significant verschillend van elkaar. Deze resultaten zijn analoog aan deze bij de onverteerde stalen (minder carbonylgroepen bij rauw vlees in vergelijking met T95), maar studies om deze verschillen tijdens in vitro 68

vertering te bevestigen, waren er niet. Met 120 ppm nitriet was het carbonylgehalte van T95 significant lager dan T95 met 0 ppm nitriet. Met toegevoegd nitriet waren de carbonylgehaltes voor de drie processen niet significant verschillend van elkaar. Nitriet blijft ook hier, na onderhevig te zijn geweest aan verteringsprocessen, zijn antioxidatieve werking behouden. Dit is enkel te zien bij T95. In vergelijking met de onverteerde stalen werden de grootste verschillen vastgesteld bij T65 en T95. Vooral bij T65 bleek het carbonylgehalte in het duodenum gehalveerd t.o.v. het gehalte in het onverteerd vlees. Wat betreft de aanwezigheid van carbonyls in het colon werd bij M1 geen significante interactie vastgesteld tussen het verhittingsproces en nitrietgehalte. De hoeveelheid carbonyls werd niet beïnvloed door de temperatuur waaraan het vlees werd blootgesteld en ook niet door de hoeveelheid nitriet. Bij M2 en M3 was er wel een significante interactie tussen verhitting en nitrietgehalte voor carbonylcomponenten. Het carbonylgehalte in de digesta in het colon van M2 en M3 was onderhevig aan een significante interactie tussen de verhitting en de hoeveelheid nitriet. Er werden geen relevante verschillen gevonden tussen de behandelingen zonder ntiriet, alsook niet tussen de behandelingen met nitriet. Bij de drie proefpersonen blijkt nitriet niet op te treden als antioxidant tegen eiwitoxidatie, met uitzondering van T95 bij M2 en T65 bij M3. Voor de aanwezigheid van carbonylgroepen blijkt er bij M2 en M3 een significant verschil te zijn tussen de digesta van rauw vlees en T95 bij 0 ppm nitriet. Rauw vlees heeft de laagste waarden, wat overeenkomt met de resultaten bij onverteerde en duodenum stalen. Helaas werden er ook nog geen studies gepubliceerd i.v.m. carbonyls in het colon tijdens de vertering van vlees. 5.3.2.3 Thiolgroepen De vorming van thiolgroepen in onverteerd vlees was niet significant verschillend tussen rauw vlees, T65 en T95 (Tabel 12). Dit zowel bij 0 als 120 ppm nitriet. Sante-Lhoutellier et al. (2008) zagen in rundvlees gekookt bij 100 en 270°C een daling in thiolgroepen van 35 en 16% respectievelijk. Deze daling was echter niet significant. Men denkt dat deze daling te wijten is aan de oxidatie van thiolgroepen in cysteïne residu’s aan het eiwitoppervlak, terwijl de thiolgroepen binnenin de eiwitstructuur meer beschermd zijn tegen radicalen, zelf bij een lange kooktijd. Er was geen significante interactie tussen het verhittingsprocesproces en het nitrietgehalte van het vlees voor de vorming van thiolgroepen in de digesta van het duodenum (Tabel 12). Er 69

werden geen significante verschillen gevonden tussen de behandelingen. Ook voor de drie microbiota bleek de interactie tussen het verhittingsproces en nitrietgehalte niet significant wat betreft het aandeel thiolgroepen in het colon. De hoeveelheid thiols was voor de drie behandelingen gelijk, ongeacht het nitrietgehalte. Dat er geen verschilllen gevonden werden tussen de verteerde stalen en dit zowel ter hoogte van het duodenum en het colon is waarschijnlijk te wijten aan de grote variatie tussen de herhalingen en aan het groot aantal stalen met waarden onder de detectielimiet. De verwachte uitkomst, namelijk minder thiolgroepen in T65 en T95, wordt hier niet bekomen. Integendeel, de numerieke waarden tonen dat het rauw vlees het minst thiolgroepen bevat en T65 en T95 het meest. Dit is tegenstrijdig aan het feit dat thiolgroepen het snelst oxideren en het feit dat koken van vlees zorgt voor meer oxidatie. Uit Tabel 12 blijkt dat er minder thiolgroepen aanwezig waren in de digesta van het colon in vergelijking met het onverteerd vlees. Dit wil zeggen dat er dus wel degelijk oxidatie heeft opgetreden onder invloed van verteringssappen en microbiota. Maar men zou kunnen stellen dat de rol van microbiota hierbij klein is aangezien er niet echt een verschil is in hoeveelheid thiolgroepen tussen de digesta van duodenum en colon.

70

Tabel 12. Experiment 3: Gehalte aan MDA, carbonyls en thiolgroepen (gemiddelde ± standaard afwijking) in de onverteerde stalen, de digesta van het duodenum en van het colon, uitgedrukt in nmol/ml digesta, n=2 bij onverteerde stalen en colon, n=6 bij duodenum, tenzij anders vermeld nitriet (ppm) verhitting MDA - Onverteerd - Duodenum - Colon M1 M2 M3 Carbonyls - Onverteerd - Duodenum - Colon M1 M2 M3 Thiolgroepen - Onverteerd - Duodenum - Colon M1 M2 M3 a,b,c

rauw

0 T65

rauw

120 T65

T95

T95

P verhitting

P nitriet

P verhitting*nitriet

1,71 ± 0,09b 9,34 ±1,57bc

5,40 ± 0,01a 12,5 ± 2,84ab

5,70 ± 0,29a 15,2 ± 1,34a

1,90 ± 0,20b 8,20 ± 1,57c

2,01 ± 0,00b 7,00 ± 2,24c

1,99 ± 0,08b 8,69 ± 1,77c

<0,001 0,001

<0,001 <0,001

<0,001 0,005

6,20 ± 0,25b 10,5 ± 0,31a 7,56 ± 0,76b 10,1 ± 0,20a 21,2 ± 1,61bc 24,7 ± 0,02ab

11,3 ± 0,21a 10,7 ± 0,03a 27,2 ± 1,13a

5,57 ± 0,48b 6,18 ± 0,59bc 22,1 ± 0,21bc

5,40 ± 0,01b 5,82 ± 0,15c 19,8 ± 0,09c

5,68 ± 0,03b 6,45 ± 0,26bc 19,7 ± 1,28c

<0,001 0,003 0,090

<0,001 <0,001 <0,001

<0,001 0,004 0,002

5,79 ± 2,86c (n=3) 4,03 ± 0,55b

11,8 ± 2,53ab (n=3) 5,42 ± 0,62b

14,9 ± 1,88a

4,77 ± 1,05c (n=3) 3,63 ± 0,50b

7,73 ± 2,08bc

0,005

0,001

0,007

8,97 ± 2,16a

6,41 ± 0,84c (n=4) 4,36 ± 0,36b

5,28 ± 0,90b

<0,001

<0,001

<0,001

3,11 ± 0,25 2,67 ± 0,28b 4,16 ± 0,43b

3,82 ± 0,10 4,20 ± 0,13ab 7,65 ± 0,63a

3,99 ± 0,74 4,56 ± 0,28a 7,62 ± 0,61a

4,25 ± 0,55 4,27 ± 0,25 4,45 ± 1,16 3,38 ± 0,64ab 3,36 ± 0,63ab 2,93 ± 0,05b 4,93 ± 0,34b 5,22 ± 0,53b 5,99 ± 0,04ab

0,498 0,067 0,001

0,106 0,047 0,007

0,682 0,017 0,008

593 ± 3,26 20,6 ± 11,7

358 ± 183 59,8 ± 28,5

568 ± 62,0 91,3 ± 55,1

384 ± 37,5 28,2 ± 38,2

630 ± 6,53 33,4 ± 22,4

479 ± 31,0 108 ± 97,7

0,816 0,003

0,863 0,967

0,014 0,558

20,8 ± 0,82 39,8 ± 30,2 11,5 ± 0,00

53,9 ± 42,8 36,3 ± 26,9 17,9 ± 0,82

47,9 ± 28,6 42,1 ± 18,8 50,2 ± 12,3

11,5 ± 0,00 68,1 ± 37,5 46,7 ± 31,8

16,1 ± 6,54 59,4 ± 10,6 21,9 ± 1,63

11,5 ± 0,00 45,6 ± 38,4 43,8 ± 35,9

0,475 0,885 0,235

0,063 0,314 0,384

0,590 0,819 0,380


71

5. Algemene discussie Over de drie experimenten heen zijn er in het colon in het algemeen hogere MDA gehaltes te zien dan in de onverteerde stalen, maar lagere MDA waarden dan in het duodenum. Een mogelijke verklaring voor de lagere waarden in het colon t.o.v. het duodenum wordt gegeven door een onderzoek van Hur et al. (2009). Hierin wordt aangetoond dat het toevoegen van vezels aan hamburgers (rund) geassocieerd is met minder MDA vorming tijdens de vertering. In het SHIME medium, dat werd toegevoegd aan de vleesstalen voor een goede ontwikkeling van de bacteriën, zijn heel wat vezels aanwezig die kunnen zorgen voor de lagere MDA waarden in het colon. Over de drie experimenten is ook te zien dat het MDA gehalte in het duodenum hoger is dan in onverteerd vlees wat wijst op meer oxidatie tijdens de vertering. Idem, voor de thiolgroepen zijn de waarden lager in het duodenum dus ook hier is er meer oxidatie opgetreden tijdens de vertering in vergelijking met onverteerd vlees. Hierbij moet wel opgemerkt worden dat het aandeel thiolgroepen van nature kan verschillen tussen de vleessoorten. Bij de carbonyls echter zijn de waarden in het duodenum lager dan deze in de onverteerde stalen wat wijst op minder “netto” oxidatie tijdens de vertering. Tegenstrijdig dus aan de resultaten van MDA en thiolgroepen. In het algemeen moet opgemerkt worden dat carbonyls in het menselijk lichaam niet enkel aanwezig zijn door oxidatie van eiwitten maar bijvoorbeeld ook door de voeding, wat kan zorgen voor een overschatting van eiwitoxidatie en oxidatieve stress. Omgekeerd worden carbonyls niet gevormd tijdens de oxidatie van alle aminozuren, wat kan zorgen voor een onderschatting van de eiwitoxidatie (Davies et al., 1999). Bovendien toonde een studie van Petron et al. (2007) dat het dieet van lammeren een invloed had op de oxidatieve status van hun vlees. Botanisch divers grasland als dieet zorgde later voor meer eiwitoxidatie. Dus ook het dieet van de dieren waarvan men het vlees eet kan een invloed hebben op de aanwezige carbonyls en thiolgroepen. De resultaten van de thiols vertonen vaak geen significante verschillen tussen de onverteerde stalen. Men kan zich afvragen of de aanwezigheid van thiolgroepen een goede merker is voor eiwitoxidatie. Thiolgroepen oxideren immers snel waardoor ze soms niet meer te detecteren zijn en de mate van oxidatie niet bepaald kan worden. Bovendien blijkt dat wijzigingen aan thiolgroepen niet altijd irreversibel zijn (Ghezzi en Bonetto, 2003). Thiolgroepen kunnen oxideren waardoor ze omgezet worden tot andere verbindingen. Dit kan echter op een irreversibele manier én op een reversibele manier. Dit laatste wil dus zeggen dat verdwenen 72

thiolgroepen opnieuw kunnen gereduceerd worden. Hierdoor kan men niet zomaar zeggen dat hoger gedetecteerde thiolwaarden minder oxidatie betekent. Consumenten worden alsmaar gezondheidsbewuster en eisen gezonder/veiliger voedsel, waarbij nitriet in een negatief daglicht wordt gesteld. Zoals ook in de literatuurstudie beschreven kan nitriet in vlees aanleiding geven tot de vorming van NOCs die mogelijk carcinogeen zijn. Hierdoor heeft men de vraag gesteld of het niet beter is om het nitrietgehalte in vlees te verlagen. Maar hoe groot is de bijdrage van vlees in onze nitrietinname? Weegt de hoeveelheid nitriet in vlees op tegen andere bronnen van nitriet in ons lichaam? Onderzoek heeft uitgewezen dat bij de mens minder dan 5% van de nitrietinname afkomstig is van nitrietgepekeld vlees en dat ons speeksel gemakkelijk een bijdrage kan leveren van meer dan 90% (Sindelar en Houser, 2009). Dit onderzoek toont duidelijk aan dat nitriet tijdens in vitro vertering van vlees optreedt als antioxidant. Men zou dus kunnen opteren om nitriet in het vlees te behouden aangezien de bijdrage hiervan niet opweegt tegen de bijdrage van speeksel. Omgekeerd worden vaak positieve eigenschappen toegeschreven aan PUFA (zoals ω3vetzuren). Verzadigde vetten (SFA) worden geassocieerd met hart- en vaatziekten en vlees (vooral rundvlees) in ons dieet wordt gezien als een belangrijke bron van deze vetten (Wood et al., 2004). Daarom is er de laatste jaren een trend naar ‘gezonder’ vlees. Rundvlees heeft van nature een PUFA/SFA verhouding van 0,1 maar de aanbeveling is meer dan 0,4. Via het dieet van de dieren slaagt men erin meer PUFA in hun vlees te bekomen (Wood en Enser, 1997). Hierbij mag men niet vergeten dat deze PUFA gevoeliger zijn dan SFA voor vetoxidatie en dus waarschijnlijk zorgen voor meer vetoxidatie. Zoals in de literatuurstudie beschreven kunnen de oxidatieproducten hiervan carcinogeen zijn voor de mens. Als men de samenstelling van vlees wil aanpassen omwille van gezondheidsredenen moet men zich dus ook bewust zijn van eventuele nadelige effecten, misschien zelfs schadelijkere effecten. Een onderzoek van Campo et al. (2006) toonde aan dat er meer oxidatie plaatsvindt in vlees met een hoger PUFA gehalte en dat hierdoor de smaakscore van consumenten daalde. De strategieën om ‘gezonder’ vlees te bekomen, zouden moeten aangepast worden zodat de kwaliteit van het vlees niet moet inboeten. Men moet ook in het achterhoofd houden dat ons dieet niet enkel uit vlees bestaat. In deze studie werd geen rekening gehouden met andere voedingscomponenten. Zo eten we ook groenten en fruit die een belangrijke bron zijn van antioxidanten zoals ascorbinezuur en carotenoïden (Sies et al., 1992). Onderzoek met een combinatie van deze componenten zou 73

een correcter beeld geven van ons dieet en de invloed ervan op oxidatie. Het is dan ook moeilijk om, rekening houdend met deze studie, aanbevelingen te geven i.v.m. vleesconsumptie. De resultaten tonen inderdaad dat de vertering van rundvlees gepaard gaat met meer vetoxidatie en dus mogelijks meer carcinogene stoffen. Maar willen de hogere MDA waarden bij rundvlees zeggen dat een wekelijkse steak meer risico geeft op darmkanker? Moeten we allemaal minder vetrijk vlees eten omdat uit deze studie blijkt dat een hoger vetgehalte zorgt voor meer oxidatie tijdens de vertering? Moeten we bij de bereiding van ons vlees rekening houden met de temperatuur als mogelijk gezondheidsrisico? Dit zijn vragen waarop nog steeds geen sluitend antwoord kan gegeven worden. Dit eindwerk geeft duidelijk aan welke processen zorgen voor meer oxidatie (in het bijzonder vetoxidatie) tijdens de vertering. Om de verdere link met colorectale kanker te leggen zal nog meer onderzoek moeten uitgevoerd worden waarbij ook andere voedingscomponenten en de genetische achtergrond van individuen in rekening moet worden gebracht.

74

6. Besluit In deze studie werden significante verschillen gevonden tussen de drie vleessoorten (kip, varken en rund) naar vetoxidatie toe. Zonder nitriet in het vlees had rundvlees de hoogste MDA waarden zowel voor als tijdens de vertering. Wat betreft de eiwitoxidatie was het effect van heem niet zo duidelijk te zien. Nitriet toegevoegd aan het vlees zorgde ervoor dat de verschillen tussen de drie vleessoorten vervaagden. Nitriet had een duidelijke rol als antioxidant in de vetoxidatie. Ongepekeld vlees met een hoger vetgehalte vertoonde meer vetoxidatie, in nitrietgepekeld vlees was het verschil niet zo duidelijk tussen de vetpercentages. Na vertering waren gelijkaardige resultaten te zien, met duidelijk hogere MDA waarden wat het optreden van oxidatie tijdens de vertering bevestigt. In onverteerd vlees zonder nitriet was het carbonylgehalte niet significant verschillend tussen de drie vetpercentages. Dit was ook zo voor de nitrietgepekelde stalen. Na de vertering in het duodenum werden duidelijk lagere carbonylgehaltes gedetecteerd en was er meer eiwitoxidatie bij de hogere vetpercentages. Er was weinig verschil tussen de duodenum en colon stalen. Het duidelijke antioxidatief effect van nitriet op carbonylvorming uit experiment 1 kon hier niet bevestigd worden, met uitzondering van onverteerd varkensvlees met 5% toegevoegd vet en varkensvlees met 5 en 20% toegevoegd vet in de duodenumfase. Een éénduidig besluit over de interactie tussen veten eiwitoxidatie kon niet bekomen worden uit deze studie. Verhitting van het vlees zorgde voor meer vetoxidatie voor en tijdens de vertering. Voor de eiwitoxidatie waren de resultaten niet altijd gelijklopend. Nitriet zorgde in de meeste gevallen voor een reductie in carbonylgehalte. Over de drie experimenten konden geen besluiten getrokken worden i.v.m. de hoeveelheid thiolgroepen. Er werd vastgesteld dat de groepen verdwijnen tijdens vertering maar effecten tussen de behandelingen waren moeilijk te zien.

75

Referenties Ames, B. N. (1983). Dietary Carcinogens and Anticarcinogens - Oxygen Radicals and Degenerative Diseases. Science 221(4617): 1256-1264. Aw, T. Y. (1999). Molecular and cellular responses to oxidative stress and changes in oxidationreduction imbalance in the intestine. American Journal of Clinical Nutrition 70(4): 557-565. Balder, H. F., de Vogel, J., Jansen, M. C. J. F., Weijenberg, M. P., van den Brandt, P. A., Westenbrink, S., van der Meer, R. en Goldbohm, R. A. (2006). Heme and chlorophyll intake and risk of colorectal cancer in the Netherlands Cohort Study. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention 15(4): 717-725. Bastide, N. M., Pierre, F.H.F. en Corpet, D.E. (2011). Heme Iron from Meat and Risk of Colorectal Cancer: A Meta-analysis and a Review of the Mechanisms Involved. Batifoulier, F., Mercier, Y., Gatellier, P. en Renerre, M. (2002). Influence of vitamin E on lipid and protein oxidation induced by H2O2-activated MetMb in microsomal membranes from turkey muscle. Meat Science 61(4): 389-395. Berlett, B. S. en Stadtman, E. R. (1997). Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress. Journal of Biological Chemistry 272(33): 20313-20316. Broncano, J. M., Petron, M. J., Parra, V. en Timon, M. L. (2009). Effect of different cooking methods on lipid oxidation and formation of free cholesterol oxidation products (COPs) in Latissimus dorsi muscle of Iberian pigs. Meat Science 83(3): 431-437. Brown, E. D., Morris, V. C., Rhodes, D. G., Sinha, R. en Levander, O. A. (1995). Urinary Malondialdehyde-Equivalents during Ingestion of Meat Cooked at High or Low-Temperatures. Lipids 30(11): 1053-1056. Bruce, W. R. (1987). Recent Hypotheses for the Origin of Colon Cancer. Cancer Research 47(16): 4237-4242. Buckley, D. J, Morrissey, P. A. en Gray, J. I. (1995). Influence of Dietary Vitamin-E on the Oxidative Stability and Quality of Pig Meat. Journal of Animal Science 73(10): 3122-3130. Buettner, G. R. en Jurkiewicz, B. A. (1996). Catalytic metals, ascorbate and free radicals: Combinations to avoid. Radiation Research 145(5): 532-541.

76

Campo, M. M., Nute, G. R., Hughes, S. I., Enser, M., Wood, J. D. en Richardson, R. I. (2006). Flavour perception of oxidation in beef. Meat Science 72(2): 303-311. Carlin, K. R. M., Huff-Lonergan, E., Rowe, L. J. en Lonergan, S. M. (2006). Effect of oxidation, pH, and ionic strength on calpastatin inhibition of μ- and m-calpain. Journal of Animal Science 84, 925937. Chang, D., Wang, F., Zhao, Y. S. en Pan, H. Z. (2008). Evaluation of oxidative stress in colorectal cancer patients. Biomedical and Environmental Sciences 21(4): 286-289. Cooke, M. S., Evans, M.D., Dizdaroglu, M. en Lunec, J. (2003). Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. Faseb Journal 17(10): 1195-1214. Cross, A. J., Pollock, J.R.A. en Bingham, S.A. (2003). Haem, not protein or inorganic iron, is responsible for endogenous intestinal N-nitrosation arising from red meat. Cancer Research 63(10): 2358-2360. Cummings, J. H. en Bingham, S.A. (1998). Fortnightly review - Diet and the prevention of cancer. British Medical Journal 317(7173): 1636-1640. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Giustarini, D., Milzani, A. en Colombo, R. (2003). Protein carbonyl groups as biomarkers of oxidative stress. Clinica Chimica Acta 329(1-2): 23-38. Davies, K. J. A. (1995). Oxidative stress: The paradox of aerobic life. Free Radicals and Oxidative Stress: Environment, Drugs and Food Additives(61): 1-31. Davies, M. J., Fu, S. L., Wang, H. J. en Dean, R. T (1999). Stable markers of oxidant damage to proteins and their application in the study of human disease. Free Radical Biology and Medicine 27(11-12): 1151-1163. Demeyer, D., Honikel, K. en De Smet, S. (2008). The World Cancer Research Fund report 2007: A challenge for the meat processing industry. Meat Science 80(4): 953-959. Dizdaroglu, M., Jaruga, P., Birincioglu, M. en Rodriguez, H. (2002). Free radical-induced damage to DNA: Mechanisms and measurement. Free Radical Biology and Medicine 32(11): 1102-1115. Dordevic´, V., Vuksan, B., Radetic´, P., Durdica, H., en Mitkovic´, M. (1980). Prilog ispitivanju uticaja pojedinih faktora na promene sadrzaja nitrita u mesu. Tehnologija mesa, 21(10), 287–290. Ellman, G. L. (1959). Tissue Sulfhydryl Groups. Arch Biochem Biophys 82(1): 70-77. Esterbauer, H., Eckl, P. en Ortner, A. (1990). Possible Mutagens Derived from Lipids and Lipid Precursors. Mutation Research 238(3): 223-233.

77

Estevez, M. (2011). Protein carbonyls in meat systems: A review. Meat Science 89(3): 259-279. Ferlay, J., Autier, P., Boniol, M., Heanue, M. Colombet, M. en Boyle, P. (2007). Estimates of the cancer incidence and mortality in Europe in 2006. Annals of Oncology 18(3): 581-592. Folch, J., Lees, M., & Stanley, S. G. H. (1957). A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. Journal of Biological Chemistry, 226, 497–509. Foster, M. W., McMahon, T. J. en Stamler, J. S. (2003). S-nitrosylation in health and disease. Trends in Molecular Medicine 9(4): 160-168. Frankel, E. N. (1980). Lipid oxidation. Prog. Lipid Res. 19: 1-22. Frankel, E. N. (1984). Lipid Oxidation - Mechanisms, Products and Biological Significance. Journal of the American Oil Chemists Society 61(12): 1908-1917. French, P., Stanton, C., Lawless, F., O'Riordan, E. G., Monahan, F. J., Caffrey, P. J. en Moloney, A. P. (2000). Fatty acid composition, including conjugated linoleic acid, of intramuscular fat from steers offered grazed grass, grass silage, or concentrate-based diets. Journal of Animal Science 78(11): 28492855. Freybler, L. A., Gray, J. I., Asghar, A., Booren, A. M., Pearson, A. M. en Buckley, D. J. (1993). Nitrite Stabilization of Lipids in Cured Pork. Meat Science 33(1): 85-96. Gabai, G., Testoni, S., Piccinini, R., Marinelli, L. en Stradaioli, G. (2004). Oxidative stress in primiparous cows in relation to dietary starch and the progress of lactation. Animal Science 79: 99108. Ganhao, R., Morcuende, D. en Estevez, M. (2010). Protein oxidation in emulsified cooked burger patties with added fruit extracts: Influence on colour and texture deterioration during chill storage. Meat Science 85(3): 402-409. Garcia, M. N., Martinez-Torres, C., Leets, I., Tropper, E., Ramirez, J. en Layrisse, M. (1996). Heat treatment on heme iron and iron-containing proteins in meat: iron absorption in humans from diets containing cooked meat fractions. J. Nutr. Biochem. 7: 49–54. Ghezzi, P. en Bonetto, V. (2003). Redox proteomics: Identification of oxidatively, modified proteins. Proteomics 3(7): 1145-1153. Girotti, A. W., Thomas, J. P. en Jordan, J. E. (1985a). Prooxidant and Antioxidant Effects of Ascorbate on Photosensitized Peroxidation of Lipids in Erythrocyte-Membranes. Photochemistry and Photobiology 41(3): 267-276.

78

Girotti, A. W., Thomas, J. P. en Jordan, J. E. (1985b). Lipid Photooxidation in Erythrocyte-Ghosts Sensitization of the Membranes toward Ascorbate-Induced and Superoxide-Induced Peroxidation and Lysis. Arch Biochem Biophys 236(1): 238-251. Gorelik, S., Ligumsky, M., Kohen, R. en Kanner, J. (2007). Saliva plays a dual role in oxidation process in stomach medium, Arch.Biochem. Biophys. 458: 236–243. Gorelik, S., Ligumsky, M., Kohen, R. en Kanner, J. (2008). A novel function of red wine polyphenols in humans: prevention of absorption of cytotoxic lipid peroxidation products. Faseb Journal 22(1): 4146. Goutefongea, R., Cassens, R. G. en Woolford, G. (1977). Distribution of Sodium-Nitrite in AdiposeTissue during Curing. Journal of Food Science 42(6): 1637-1641 Gray, J. I., Gomaa, E. A. en Buckley, D. J. (1996). Oxidative quality and shelf life of meats. Meat Science 43: S111-S123. Gray, J. I. en Monahan, F. J. (1992). Measurement of Lipid Oxidation in Meat and Meat Products. Trends Food Sci. Technol. 3: 315–319. Grotto, D., Santa Maria, L. D., Boeira, S., Valentini, J., Charao, M. F., Moro, A. M., Nascimento, P. C., Pomblum, V. J. en Garcia, S. C. (2007). Rapid quantification of malondialdehyde in plasma by high performance liquid chromatography-visible detection. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 43(2): 619-624. Guarner, F. en Malagelada, J. R. (2003). Gut flora in health and disease. Lancet 361(9356): 512-519. Gudiksen, K. L., Gitlin, I. en Whitesides, G. M. (2006). Differentiation of proteins based on characteristic patterns of association and denaturation in solutions of SDS. Proc Natl Acad Sci U S A, 103(21): 7968-7972. Gutteridge, J.M.C. (1975). The use of standards for malonydialdehyde. Anal. Biochem., 69: 518–526. Guven, Y., Satman, I., Dinccag, N. en Alptekin, S. (1996). Salivary peroxidase activity in whole saliva of patients with insulin-dependent (type-1) diabetes mellitus. Journal of Clinical Periodontology 23(9): 879-881. Halliwell, B. (1994). Free-Radicals, Antioxidants, and Human-Disease - Curiosity, Cause, or Consequence. Lancet 344(8924): 721-724. Halliwell, B. (2007). Biochemistry of oxidative stress. Biochemical Society Transactions 35: 11471150.

79

Halliwell, B. en Gutteridge, J. M. C. (1986). Oxygen Free-Radicals and Iron in Relation to Biology and Medicine - Some Problems and Concepts. Arch Biochem Biophys 246(2): 501-514. Halliwell, B. en Chirico, S. (1993). Lipid-Peroxidation - Its Mechanism, Measurement, and Significance. American Journal of Clinical Nutrition 57(5): S715-S725. Halliwell, B. en Gutteridge, J. M. C. (2007). Free Radicals in Biology and Medicine, 4de editie, Oxford, Clarendon Press. Hawksworth, G. M. en Hill, M. J. (1971). Bacteria and the N-nitrosation of secondary amines. Br J Cancer 25(3): 520-526. Hemminki, K. (1993). DNA-Adducts, Mutations and Cancer. Carcinogenesis 14(10): 2007-2012. Hernandez, P., Navarro, J. L. en Toldra, F. (1999). Lipids of pork meat as affected by various cooking techniques. Food Science and Technology International 5(6): 501-508. Honikel, K. O. (2008). The use and control of nitrate and nitrite for the processing of meat products. Meat Science 78(1-2): 68-76 Hornsey, H.C. (1956). The colour of cooked cured pork. I. Estimation of the Nitric oxide-haem pigments. J. Sci. Food Agric., 7, 1956. Hu, M., Li, Y., Decker, E. A. en McClements, D. J. (2010). Role of calcium and calcium-binding agents on the lipase digestibility of emulsified lipids using an in vitro digestion model. Food Hydrocolloids 24(8): 719-725. Hur, S. J., Lim, B. O., Park, G. B. en Joo, S. T. (2009). Effects of Various Fiber Additions on Lipid Digestion during In Vitro Digestion of Beef Patties. Journal of Food Science 74(9): C653-C657. Huycke, M. M. en Moore D. R. (2002). In vivo production of hydroxyl radical by Enterococcus faecalis colonizing the intestinal tract using aromatic hydroxylation. Free Radical Biology and Medicine 33(6): 818-826. Iijima, K., Fyfe, V. en McColl, K. E. L.. (2003). Studies of nitric oxide generation from salivary nitrite in human gastric juice. Scandinavian Journal of Gastroenterology 38(3): 246-252. IJssennagger, N., Derrien, M., van Doorn, G. M., Rijnierse, A., van den Bogert, B., Muller, M., Dekker, J., Kleerebezem, M. en van der Meer, R. (2012). Dietary Heme Alters Microbiota and Mucosa of Mouse Colon without Functional Changes in Host-Microbe Cross-Talk. Plos One 7(12).

80

Jo, C., Lee, J. I. en Ahn, D. U. (1999). Lipid oxidation, color changes and volatiles production in irradiated pork sausage with different fat content and packaging during storage. Meat Science 51(4): 355-361. Kaushal, D. en Kansal, V. K. (2012). Probiotic Dahi containing Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium bifidum alleviates age-inflicted oxidative stress and improves expression of biomarkers of ageing in mice. Mol Biol Rep 39(2): 1791-1799. Kiebooms, J. A. L., Vanden Bussche, J., Hemeryck, L. Y., Fievez, V. en Vanhaecke, L. (2012). Intestinal Microbiota Contribute to the Endogenous Formation of Thiouracil in Livestock. J Agric Food Chem 60(32): 7769-7776. Kingston, D. G. I., Vantassell, R. L. en Wilkins, T. D.. (1990). The Fecapentaenes, Potent Mutagens from Human Feces. Chemical Research in Toxicology 3(5): 391-400. Klaunig, J. E. en Kamendulis, L.M. (2004). The role of oxidative stress in carcinogenesis. Annual Review of Pharmacology and Toxicology 44: 239-267. Kohen, R. (1999). Skin antioxidants: their role in aging and in oxidative stress - New approaches for their evaluation. Biomedicine & Pharmacotherapy 53(4): 181-192. Kot, E., Furmanov, S. en Bezkorovainy, A. (1995). Accumulation of Iron in Lactic-Acid Bacteria and Bifidobacteria. Journal of Food Science 60(3): 547-550. Krokan, H. E., Standal, R. en Slupphaug, G. (1997). DNA glycosylases in the base excision repair of DNA. Biochemical Journal 325: 1-16. Kubow, S. (1992). Routes of Formation and Toxic Consequences of Lipid Oxidation-Products in Foods. Free Radical Biology and Medicine 12(1): 63-81. Ladikos, D. en Lougovois, V. (1990). Lipid Oxidation in Muscle Foods - a Review. Food Chemistry 35(4): 295-314. Larsson, S. C. en Wolk, A. (2006). Meat consumption and risk of colorectal cancer: A meta-analysis of prospective studies. International Journal of Cancer 119(11): 2657-2664. Levine, R. L., Berlett, B. S., Moskovitz, J., Mosoni, L. en Stadtman, E. R. (1999). Methionine residues may protect proteins from critical oxidative damage. Mechanisms of Ageing and Development 107(3): 323-332.

81

Liu, G. en Xiong, Y. L. L. (1996). Contribution of lipid and protein oxidation to rheological differences between chicken white and red muscle myofibrillar proteins. J Agric Food Chem 44(3): 779-784. Liu, G. en Xiong, Y. L. (2000). Electrophoretic pattern, thermal denaturation, and in vitro digestibility of oxidized myosin. J. Agric. Food Chem. 48, 624-630. Lombardi-Boccia, G., Martinez-Dominguez, B. en Aguzzi, A. (2002). Total heme and non-heme iron in raw and cooked meats. Journal of Food Science 67(5): 1738-1741. Lonergan, E. H., Zhang, W. A. en Lonergan, S. M. (2010). Biochemistry of postmortem muscle Lessons on mechanisms of meat tenderization. Meat Science 86(1): 184-195. Lund, M. N., Heinonen, M., Baron, C. P. en Estevez, M. (2011). Protein oxidation in muscle foods: A review. Molecular Nutrition & Food Research 55(1): 83-95. Maier, B. R., Flynn, M. A., Burton, G. C., Tsutakawa, R. K. en Hentges, D. J. (1974). Effects of a High-Beef Diet on Bowel Flora - Preliminary Report. American Journal of Clinical Nutrition 27(12): 1470-1474. Marmon, S. K. en Undeland, I. (2013). Effect of alkaline pH-shift processing on in vitro gastrointestinal digestion of herring (Clupea harengus) fillets. Food Chemistry 138(1): 214-219. Marnett, L. J. (2000). Oxyradicals and DNA damage. Carcinogenesis 21(3): 361-370. McCord, J. M. en Fridovich, I. (1969). Superoxide Dismutase an Enzymic Function for Erythrocuprein (Hemocuprein). Journal of Biological Chemistry 244(22): 6049. Mei, I., Crum, A. D. en Decker, E. A. (1994). Development of lipid oxidation and inactivation of antioxidant enzymes in cooked pork and beef. J. Food Lip. 1: 273–283. Mercier, Y., Gatellier, P., Viau, M., Remignon, H. en Renerre, M. (1998). Effect of dietary fat and vitamin E on colour stability and on lipid and protein oxidation in turkey meat during storage. Meat Science 48(3-4): 301-318. Mirvish, S. S. (1986). Effects of vitamins C and E on N-nitroso compound formation, carcinogenesis, and cancer. Cancer 58(8 Suppl): 1842-1850. Molly, K., Vandewoestyne, M., Desmet, I. en Verstraete, W. (1994). Validation of the Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (Shime) Reactor Using Microorganism-Associated Activities. Microbial Ecology in Health and Disease 7(4): 191-200.

82

Moore, S., Calder, K. A. C., Miller, N. J. en Riceevans, C. A. (1994). Antioxidant Activity of Saliva and Periodontal-Disease. Free Radic Res 21(6): 417-425. Moore, W. E. C. en Moore L. H. (1995). Intestinal Floras of Populations That Have a High-Risk of Colon-Cancer. Appl Environ Microbiol 61(9): 3202-3207. Morrissey, P. A., Buckley, D. J., Sheehy, P. J. A. en Monahan, F. J. (1994a). Vitamin-E and Meat Quality. Proceedings of the Nutrition Society 53(2): 289-295. Morrissey, P. A., Quinn, P. B. en Sheehy, P. J. A (1994b). Newer Aspects of Micronutrients in Chronic Disease - Vitamin-E. Proceedings of the Nutrition Society 53(3): 571-582. Morrissey, P. A., Sheehy, P. J. A., Galvin, K., Kerry, J. P. en Buckley, D. J. (1998). Lipid stability in meat and meat products. Meat Science 49: S73-S86. Morzel, M., Gatellier, P., Sayd, T., Renerre, M. en Laville, E. (2006). Chemical oxidation decreases proteolytic susceptibility of skeletal muscle myofibrillar proteins. Meat Science 73(3): 536-543. Mukherjee, M. (2003). Human digestive and metabolic lipases - a brief review. Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic 22(5-6): 369-376. Nagler, R. M., Klein, I., Zarzhevsky, N., Drigues, N. en Reznick, A. Z. (2002). Characterization of the differentiated antioxidant profile of human saliva. Free Radical Biology and Medicine 32(3): 268-277. Nuernberg, K., Dannenberger, D., Nuernberg, G., Ender, K., Voigt, J., Scollan, N. D., Wood, J. D., Nute, G. R. en Richardson, R. I (2005). Effect of a grass-based and a concentrate feeding system on meat quality characteristics and fatty acid composition of longissimus muscle in different cattle breeds. Livestock Production Science 94(1-2): 137-147. Norat, T., Lukanova, A., Ferrari, P. en Riboli, E. (2002). Meat consumption and colorectal cancer risk: Dose-response meta-analysis of epidemiological studies. International Journal of Cancer 98(2): 241256. Nyska, A. en Kohen, R. (2002). Oxidation of biological systems: Oxidative stress phenomena, antioxidants, redox reactions, and methods for their quantification. Toxicologic Pathology 30(6): 620650. Ouwehand, A. C., Derrien, M., de Vos, W., Tiihonen, K. en Rautonen, N. (2005). Prebiotics and other microbial substrates for gut functionality. Current Opinion in Biotechnology 16(2): 212-217. Padilla, P. A. en Roth, M. B. (2001). Oxygen deprivation causes suspended animation in the zebrafish embryo. Proc Natl Acad Sci U S A 98(13): 7331-7335.

83

Palmer, H. J. en Paulson, K.E. (1997). Reactive oxygen species and antioxidants in signal transduction and gene expression. Nutrition Reviews 55(10): 353-361. Pereslegina, I. A. (1989). The activity of antioxidant enzymes in the saliva of normal children. Lab Delo(11): 20-23. Petron, M. J., Raes, K., Claeys, E., Lourenco, M., Fremaut, D. en De Smet, S. (2007). Effect of grazing pastures of different botanical composition on antioxidant enzyme activities and oxidative stability of lamb meat. Meat Science 75(4): 737-745. Prior, R. L. en Cao, G. H. (1999). In vivo total antioxidant capacity: Comparison of different analytical methods. Free Radical Biology and Medicine 27(11-12): 1173-1181. Qiao, Y., Sun, J., Ding, Y. Y., Le, G. W. en Shi, Y. H. (2012). Alterations of the gut microbiota in high-fat diet mice is strongly linked to oxidative stress. Applied Microbiology and Biotechnology 97(4): 1689-1697. Raes, K., De Smet, S. and Demeyer, D. 2001. Effect of double-muscling in Belgian Blue young bulls on the intramuscular fatty acid composition with emphasis on conjugated linoleic acid and polyunsaturated fatty acids. Anim Sci. 73, 253–260. Raharjo, S. en Sofos, J. N. (1993). Methodology for Measuring Malonaldehyde as a Product of LipidPeroxidation in Muscle Tissues - a Review. Meat Science 35(2): 145-169. Roth, N. G. en Lively, D. H. (1956). Germination of spores of certain aerobic bacilli under anaerobic conditions. J Bacteriol 71(2): 162-166. Rowland, I. R. en Grasso, P. (1975). Degradation of N-nitrosamines by intestinal bacteria. Applied Microbiology 29(1): 7-12. Sander, J. (1968). Nitrosaminsynthese durch Bakterien. Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem. 349, 429– 432. Santarelli, R. L., Pierre, F. en Corpet, D. E. (2008). Processed meat and colorectal cancer: A review of epidemiologic and experimental evidence. Nutrition and Cancer-an International Journal 60(2): 131144. Sante-Lhoutellier, V., Aubry, L. en Gatellier, P. (2007). Effect of oxidation on in vitro digestibility of skeletal muscle myofibrillar proteins. J Agric Food Chem 55(13): 5343-5348.

84

Sante-Lhoutellier, V., Astruc, T., Marinova, P., Greve, E. en Gatellier, P. (2008). Effect of meat cooking on physicochemical state and in vitro digestibility of myofibrillar proteins. J Agric Food Chem 56(4): 1488-1494. Scheppach, W. (1994). Effects of Short-Chain Fatty-Acids on Gut Morphology and Function. Gut 35(1): S35-S38. Sesink, A. L. A., Termont, D. S. M. L., Kleibeuker, J. H. en Van der Meer, R. (2001). Red meat and colon cancer: dietary haem-induced colonic cytotoxicity and epithelial hyperproliferation are inhibited by calcium. Carcinogenesis 22(10): 1653-1659. Sethuraman, M., McComb, M. E., Huang, H., Huang, S. Q., Heibeck, T., Costello, C. E., en Cohen, R. A. (2004). Isotope-coded affinity tag (ICAT) approach to redox proteomics: Identification and quantitation of oxidant-sensitive cysteine thiols in complex protein mixtures. Journal of Proteome Research 3(6): 1228-1233. Shan, X. Q., Aw, T. Y. en Jones, D. P. (1990). Glutathione-Dependent Protection against Oxidative Injury. Pharmacology & Therapeutics 47(1): 61-71. Sies, H., Stahl, W. en Sundquist, A. R. (1992). Antioxidant Functions of Vitamins - Vitamin-E and Vitamin-C, Beta-Carotene, and Other Carotenoids. Annals of the New York Academy of Sciences 669: 7-20. Sindelar, J.J. en Houser, T.A. (2009). Alternative Curing Systems. p. 379-405. In R. Tarte (ed.), Ingredients in meat products Springer, New York, NY. Silbernagl, S. en Despopoulos, A. (2005). Atlas van de fysiologie, 13de editie, Baarn, SESAM/HBuitgevers. Stadtman, E. R. en Levine, R.L. (2003). Free radical-mediated oxidation of free amino acids and amino acid residues in proteins. Amino Acids 25(3-4): 207-218. Sun, J., Hu, X. L., Le, G. W. en Shi, Y. H. (2009). Lactobacilli prevent hydroxy radical production and inhibit Escherichia coli and Enterococcus growth in system mimicking colon fermentation. Letters in Applied Microbiology 50(3): 264-269. Takahama, U., Oniki, T. en Murata, H. (2002). The presence of 4-hydroxyphenylacetic acid in human saliva and the possibility of its nitration by salivary nitrite in the stomach. Febs Letters 518(1-3): 116118. Takahama, U. en Oniki, T. (2004). Salivary thiocyanate/nitrite inhibits hydroxylation of 2hydroxybenzoic acid induced by hydrogen peroxide/Fe(II) systems under acidic conditions: possibility

85

of thiocyanate/nitrite-dependent scavenging of hydroxyl radical in the stomach. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects 1675(1-3): 130-138. Thannickal, V. J. en Fanburg B.L. (2000). Reactive oxygen species in cell signaling. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology 279(6): L1005-L1028. Thomas, E. L., Jefferson, M. M., Joyner, R. E., Cook, G. S. en King, C. C. (1994). Leukocyte Myeloperoxidase and Salivary Lactoperoxidase - Identification and Quantitation in Human Mixed Saliva. Journal of Dental Research 73(2): 544-555. Toyokuni, S., Okamoto, K., Yodoi, J. en Hiai, H. (1995). Persistent Oxidative Stress in Cancer. Febs Letters 358(1): 1-3. Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M. en Mazur, M. (2006). Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biological Interactions 160(1): 1-40. Van Nuenen, M., Venema, K., Van Der Woude, J.C.J. en Kuipers, E.J. (2004). The metabolic activity of fecal microbiota from healthy individuals and patients with inflammatory bowel disease. Dig. Dis. Sci. 49, 485–491. Vantassell, R. L., Kingston, D. G. I. en Wilkins, T. D. (1990). Metabolism of Dietary Genotoxins by the Human Colonic Microflora - the Fecapentaenes and Heterocyclic Amines. Mutation Research 238(3): 209-221. Versantvoort, C. H. M., Oomen, A. G., Van de Kamp, E., Rompelberg, C. J. M. en Sips, A. J. A. M. (2005). Applicability of an in vitro digestion model in assessing the bioaccessibility of mycotoxins from food. Food and Chemical Toxicology 43(1): 31-40. Vincent, S. H., Grady, R. W., Shaklai, N., Snider, J. M. en Mullereberhard, U. (1988). The Influence of Heme-Binding Proteins in Heme-Catalyzed Oxidations. Arch Biochem Biophys 265(2): 539-550. Volk, J., Gorelik, S., Granit, R., Kohen, R. en Kanner, J. (2009). The dual function of nitrite under stomach conditions is modulated by reducing compounds. Free Radical Biology and Medicine 47(5): 496-502. Willett, W. C. (2001). Diet and cancer: One view at the start of the millennium. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention 10(1): 3-8. Wolff, I. A. , en Wasserman, A. E. (1972) . Nitrates, nitrites, and nitrosamines . Science, 177, 15 – 19. Wood, J. D. en Enser, M. (1997). Factors influencing fatty acids in meat and the role of antioxidants in improving meat quality. British Journal of Nutrition 78(1): S49-S60

86

Wood, J. D., Richardson, R. I., Nute, G. R., Fisher, A. V., Campo, M. M., Kasapidou, E., Sheard, P. R. en Enser, M. (2004). Effects of fatty acids on meat quality: a review. Meat Science 66(1): 21-32. World Cancer Research Fund, W., en American Institute for Cancer Research, A. (2007). Food, nutrition, physical activity, and the prevention of cancer: a global perspective. WCRF and AICR, Washington DC, 1-537. Xing, R. E., Liu, S., Guo, Z. Y., Yu, H. H., Li, C. P., Ji, X., Feng, J. H. en Li, P. C. (2006). The antioxidant activity of glucosamine hydrochloride in vitro. Bioorganic & Medicinal Chemistry 14(6): 1706-1709. Yang, Y. en McClements, D. J. (2013). Vitamin E Bioaccessibility: Influence of Carrier Oil Type on Digestion and Release of Emulsified α-Tocopherol Acetate. Food Chemistry 141: 473–481. Yeh, C. C., Lai, C. Y., Hsieh, L. L., Tang, R. P., Wu, F. Y. en Sung, F. C. (2010). Protein carbonyl levels, glutathione S-transferase polymorphisms and risk of colorectal cancer. Carcinogenesis 31(2): 228-233. Young, G. P., Rose, I. S. en St John, D. J. (1989). Haem in the gut. I. Fate of haemoproteins and the absorption of haem. J Gastroenterol Hepatol 4(6): 537-545. Zangenberg, N. H., Mullertz, A., Kristensen, H. G. en Hovgaard, L. (2001). A dynamic in vitro lipolysis model I. Controlling the rate of lipolysis by continuous addition of calcium. European Journal of Pharmaceutical Sciences 14(2): 115-122. zur Hausen, H. (2012). Red meat consumption and cancer: Reasons to suspect involvement of bovine infectious factors in colorectal cancer. International Journal of Cancer 130(11): 2475-2483.

87

Oxidatie tijdens in vitro vertering van nitrietgepekelde vleesproducten

Recommend Documents