MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE _________________________________________
Ovlivnění aktivit klíčových enzymů metabolismu hormonů štítné žlázy: Farmakologické experimenty na potkanech
Diplomová práce
Bc. Michaela Hložková
Vedoucí práce: doc. RNDr. Stanislav Pavelka, CSc.
Brno 2014
Bibliografický záznam Autor:
Michaela Hložková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav Biochemie
Název práce:
Ovlivnění aktivit klíčových enzymů metabolismu hormonů štítné žlázy: Farmakologické experimenty na potkanech
Studijní program:
Biochemie
Studijní obor:
Analytická biochemie
Vedoucí práce:
doc. RNDr. Stanislav Pavelka, CSc.
Akademický rok:
2014
Počet stran:
95
Klíčová slova:
n-3 polynenasycené mastné kyseliny, statiny, červený palmový olej, thyreoidální hormony, Harderovy
žlázy,
jodothyronin
radiometrická enzymová stanovení
dejodasy,
Bibliographic Entry Author:
Michaela Hložková Faculty of Science, Masaryk University Department of Biochemistry
Title of Thesis:
The affection of activities of the key enzymes in the
metabolism
of
thyroid
hormones:
Pharmacological experiments on the rat
Degree Programme: Biochemistry
Field of Study:
Analytical biochemistry
Supervisor:
doc. RNDr. Stanislav Pavelka, CSc.
Academic Year:
2014
Number of Pages:
95
Keywords:
n-3 polyunsaturated fatty acids, statins, red palm oil,
thyroid
hormones,
Harderian
gland,
iodothyronine deiodinases, radiometric enzyme assay
Abstrakt Tato diplomová práce se zabývá stanovením změn aktivit některých klíčových enzymů v metabolismu thyreoidálních hormonů u laboratorních potkanů, v závislosti na různém farmakologickém ovlivnění pokusných zvířat. Cílem experimentální části bylo zjistit vliv podávání statinů (STAT), červeného palmového oleje (RPO) a n-3 polynenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem (n-3 PUFA) v dietě při různých, experimentálně navozených nefyziologicky vysokých nebo nízkých sérových hladinách thyreoidálních hormonů na specifické enzymové aktivity jodothyronin dejodas D1, D2 a D3 v různých tkáních potkanů kmene Wistar, Wistar Kyoto a SHR. Zaměřili jsme se zejména na stanovení dejodas v Harderových žlázách. Monitorování thyreoidálního stavu zvířat bylo prováděno stanovením koncentrací celkových a volných frakcí thyreoidálních hormonů v krevních sérech s použitím metody RIA. Pro stanovení enzymových aktivit dejodas byly použity v laboratoři zavedené radiometrické metody. Výsledky stanovení enzymových aktivit a jejich změn v závislosti na změnách thyreoidálního stavu u kontrolních potkanů, držených na standardní dietě, odpovídají očekávaným výsledkům. Vliv podávání STAT, RPO a n-3 PUFA na sledované enzymové aktivity není příliš výrazný, ale obecně platí, že STAT, RPO a n-3 PUFA potlačují nežádoucí účinky vyvolané příliš vysokými nebo příliš nízkými hladinami thyreoidálních hormonů.
Abstract This thesis deals with the determination of changes in activities of several key enzymes of thyroid hormones metabolism in the rat, depending on different pharmacological treatments of experimental animals. The aim of the experimental part was to determine the influence of the administration to the rats of statins (STAT), red palm oil (RPO) and n-3 polyunsaturated fatty acids (n-3 PUFA) in diet at different, experimentally adjusted non-physiologically high or low serum levels of thyroid hormones, on specific enzyme activities of the key enzymes of thyroid hormones metabolism, the iodothyronine deiodinases D1, D2 and D3 in various tissues of Wistar, Wistar Kyoto and SHR rats. We focused on the determination of iodothyronine deiodinases activities in harderian glands. Monitoring of thyroid statuses was performed by determination of total and free fractions of thyroid hormones in samples of blood serum, using radioimmunoanalysis. Proved radiometric enzyme assays were used for the determination of iodothyronine deiodinases activities. The results of determination of enzyme activities and their changes according to changes of thyroid state in control rats, that were kept on a standard diet, corresponded with confirmed results. The effects of STAT, RPO and n-3 PUFA administration on the measured enzyme activities are not too marked, but in general, STAT, RPO and n-3 PUFA restrains undesirable effects, caused by too high or too low serum levels of thyroid hormone.
Poděkování: Touto cestou bych chtěla poděkovat doc. RNDr. Stanislavu Pavelkovi, CSc. za věcné rady, připomínky a vedení mé diplomové práce. Taktéž děkuji celému pracovnímu kolektivu Radiometrie Fyziologického ústavu AV ČR za vytvoření příjemného pracovního prostředí a cennou pomoc. V neposlední řadě bych ráda poděkovala celé mé rodině a příteli Lukášovi za veškerou podporu při mém studiu.
Prohlášení: Prohlašuji, že svou diplomovou práci na téma Ovlivnění aktivit klíčových enzymů metabolismu hormonů štítné žlázy: Farmakologické experimenty na potkanech jsem vypracovala samostatně pod vedením vedoucího diplomové práce a s použitím odborné literatury a dalších informačních zdrojů, které jsou všechny citovány v práci a uvedeny v seznamu použité literatury.
Brno
2014
…………………………..... Michaela Hložková
Obsah SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK .......................................................................................................... 11 1.
ÚVOD .................................................................................................................................................... 14
2.
ŠTÍTNÁ ŽLÁZA .................................................................................................................................. 15
3.
REGULACE THYREOIDÁLNÍ FUNKCE ....................................................................................... 17 3.1
HORMON UVOLŇUJÍCÍ THYREOTROPIN (TRH) .................................................................................... 17
3.2
THYREOTROPIN (TSH) ....................................................................................................................... 18
HORMONY ŠTÍTNÉ ŽLÁZY ............................................................................................................ 19
4.
4.1
STRUKTURA ....................................................................................................................................... 19
4.2
SYNTÉZA HORMONŮ ........................................................................................................................... 19
4.2.1
Thyreoglobulin (Tg) ................................................................................................................. 20
4.2.2
Vychytávání jodidu (trapping) ................................................................................................. 21
4.2.3
Thyreoidální peroxidasa .......................................................................................................... 21
4.2.4
Proteolýza thyreoglobulinu a sekrece TH ................................................................................ 21
4.3
TRANSPORT HORMONŮ ŠTÍTNÉ ŽLÁZY ................................................................................................ 23
4.4
ÚČINKY THYREOIDÁLNÍCH HORMONŮ ................................................................................................ 23
4.4.1
Kalorigenní účinek ................................................................................................................... 24
4.4.2
Vliv na vývoj a růst .................................................................................................................. 24
4.4.3
Vliv na sacharidový a lipidový metabolismus .......................................................................... 24
4.4.4
Vliv na kardiovaskulární aparát .............................................................................................. 25
4.4.5
Účinky na nervový systém ........................................................................................................ 25
METABOLISMUS HORMONŮ ŠTÍTNÉ ŽLÁZY .......................................................................... 26
5.
5.1
DEJODACE .......................................................................................................................................... 27
5.1.1
Dejodasa typu 1 (D1) ............................................................................................................... 28
5.1.2
Dejodasa typu 2 (D2) ............................................................................................................... 28
5.1.3
Dejodasa typu 3 (D3) ............................................................................................................... 29
6.
HARDEROVY ŽLÁZY ....................................................................................................................... 30
7.
STATINY .............................................................................................................................................. 34
8.
ČERVENÝ PALMOVÝ OLEJ (RPO) ............................................................................................... 36
9.
N-3 POLYNENASYCENÉ MASTNÉ KYSELINY (N-3 PUFA) ..................................................... 37
10.
POZITRONOVÁ EMISNÍ TOMOGRAFIE (PET) .......................................................................... 40
11.
CÍLE PRÁCE ....................................................................................................................................... 42
12.
MATERIÁL A METODY ................................................................................................................... 44
12.1
RADIOCHEMIKÁLIE A SPECIÁLNÍ BIOCHEMIKÁLIE PRO STANOVENÍ ENZYMOVÝCH AKTIVIT ........... 44
12.2
PŘÍSTROJE ..................................................................................................................................... 44
9
12.3
POKUSY NA ZVÍŘATECH A ODBĚR VZORKŮ BIOLOGICKÉHO MATERIÁLU ........................................ 45
12.3.1
Experiment STAT 13/1 ........................................................................................................ 45
12.3.2
Experiment PUFA 13/2 ....................................................................................................... 46
12.4
PŘÍPRAVA HOMOGENÁTŮ A POST-MITOCHONDRIÁLNÍCH (POST-MT) SUPERNATANTŮ ................... 48
12.4.1
Příprava post-mt supernatantů štítných žláz a hypofýz ....................................................... 48
12.4.2
Příprava post-mt supernatantů jater, Harderových žláz, hnědé tukové tkáně, podkožní
tukové tkáně a gonadální tukové tkáně .................................................................................................. 49 12.5
STANOVENÍ CELKOVÉ KONCENTRACE PROTEINŮ BICINCHONINOVOU METODOU ........................... 50
12.6
STANOVENÍ KONCENTRACE HORMONŮ T3 A T4 METODOU RADIOIMUNOANALÝZY (RIA) .............. 51
12.6.1
Stanovení celkových frakcí T3 a T4 ...................................................................................... 51
12.6.2
Stanovení volných frakcí T3 a T4 ......................................................................................... 52
12.7
13.
STANOVENÍ JODOTHYRONIN DEJODASOVÉ AKTIVITY ..................................................................... 53
12.7.1
Stanovení enzymové aktivity jodothyronin dejodasy typu 1 ................................................ 54
12.7.2
Stanovení enzymové aktivity jodothyronin dejodasy typu 2 ................................................ 54
12.7.3
Stanovení enzymové aktivity jodothyronin dejodasy typu 3 ................................................ 55
12.7.4
Principy vyhodnocování radiochromatogramů ................................................................... 56
VÝSLEDKY A DISKUSE ................................................................................................................... 58
13.1
STANOVENÍ CELKOVÉHO OBSAHU PROTEINU BICINCHONINOVOU METODOU V POST-MT FRAKCÍCH
TKÁNÍ POTKANA........................................................................................................................................... 58
13.2
STANOVENÍ THYREOIDÁLNÍHO STAVU ........................................................................................... 59
13.2.1
Změny anatomických parametrů v závislosti na thyreoidálním stavu a dietě ..................... 59
13.2.2
RIA stanovení celkových a volných frakcí TH v sérech potkanů ......................................... 63
13.3
STANOVENÍ SPECIFICKÉ ENZYMOVÉ AKTIVITY DEJODAS JODOTHYRONINŮ V ODLIŠNÝCH TKÁNÍCH
POTKANA ..................................................................................................................................................... 68
13.3.1
Stanovení specifické enzymové aktivity jodothyronin dejodasy D1 ..................................... 68
13.3.2
Stanovení specifické enzymové aktivity jodothyronin dejodasy D2 ..................................... 75
13.3.3
Stanovení specifické enzymové aktivity jodothyronin dejodasy D3 ..................................... 81
13.4 14.
KOMBINACE POČÍTAČOVÉ TOMOGRAFIE A POZITRONOVÉ EMISNÍ TOMOGRAFIE (CT/PET) ........... 87
ZÁVĚRY ............................................................................................................................................... 89
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY .......................................................................................................... 91
10
SEZNAM POUŽI TÝCH ZKRATE K ADG
1-alkyl-2,3-diacylglycerol
ALA
α- linolenová kyselina
BAT
hnědá tuková tkáň (angl. brown adipose tissue)
B. W.
tělesná hmotnost
D1
jodothyronin 5´-dejodasa typu 1
D2
jodothyronin 5´-dejodasa typu 2
D3
jodothyronin 5 -dejodasa typu 3
DHA
dokosahexaenová kyselina
DIT
dijodotyrosin
DTT
1,4-dithiotreitol
EPA
eikosapentaenová kyselina
fT3(4)
volná frakce T3(4)
GON
gonadální tuková tkáň (angl. gonadal adipose tissue)
GT
štítná žláza (lat. glandula thyreoidea)
H
srdce (angl. heart)
HDL
lipoproteiny o vysoké hustotě
HG
harderovy žlázy (angl. harderian gland)
HMG-CoA
3-hydroxy-3-metylglutaryl-koenzym A
IRD
dejodace na vnitřním kruhu
L
játra (angl. liver)
LDL
lipoproteiny o nízké hustotě
MIT
monojodotyrosin
n-3 PUFA
n-3 polynenasycené mastné kyseliny
ORD
dejodace na vnějším kruhu
P
hypofýza (angl. pituitary)
PET
pozitronová emisní tomografie
PIC
směs inhibitorů proteas
PMSF
fenylmetylsulfonylfluorid
post-mt
post-mitochondriální
PPARs
receptory aktivované proliferátory peroxizomů
PTU
6-n-propyl-2-thiouracil
RPO
červený palmový olej 11
SHR
spontánně hypertenzní potkan
SPECT
jednofotonová emisní výpočetní tomografie
SUB
podkožní tuková tkáň (angl. subcutaneous adipose tissue)
T0
thyronin
T2
dijodothyronin
T3
trijodothyronin
T4
thyroxin
TBG
globulin vázající thyroxin
TBPA
prealbumin vázající thyroxin, transthyretin
Tg
thyreoglobulin
TH
thyreoidální hormony
TPO
thyreoidální peroxidasa
TRH
thyreotropin uvolňující hormon
TSH
thyreotropin
tT3(4)
celková frakce T3(4)
VLDL
lipoproteiny o velmi nízké hustotě
12
TEORETICKÁ ČÁST
1. ÚVOD Hormony štítné žlázy, thyroxin (3,5,3‘,5‘-tetrajodothyronin) a trijodothyronin (3,5,3‘trijodothyronin), jsou jednoduché organické sloučeniny produkované ve štítné žláze za přítomnosti jodu. Hlavním sekrečním produktem štítné žlázy je thyroxin, který má ale malou biologickou aktivitu. Hlavní metabolickou cestou přeměny thyreoidálních hormonů jsou postupné dejodace, katalyzované třemi enzymy – dejodasami, které se liší substrátovou specifitou a výskytem ve tkáních. Dejodací thyroxinu na vnějším aromatickém kruhu vzniká aktivní forma, trijodothyronin. Dejodací thyroxinu na vnitřním aromatickém
kruhu
vzniká
inaktivní
forma,
reverzní
trijodothyronin
(3,3´,5´-
trijodothyronin). Thyreoidální hormony hrají důležitou roli ve vývoji, růstu a diferenciaci a reprezentují jeden z nejdůležitějších endokrinních regulátorů buňky a tkáňové metabolické aktivity (Soukup, 2014). Výrazné změny jejich koncentrace ale mohou vést k různým patofyziologickým stavům. Statiny jsou široce předepisované léky používané ke snižování vysokých hladin sérových lipidů (cholesterolu, LDL a triglyceridů) a k prevenci kardiovaskulárních onemocnění. Statiny blokují biosyntézu cholesterolu inhibicí 3-hydroxy-3-metylglutarylkoenzym A (HMG-CoA) reduktasy. n-3 (neboli omega 3) polynenasycené mastné kyseliny (n-3 PUFA) jsou esenciální mastné kyseliny s mnohonásobnými efekty, které zahrnují např. snižování hladin lipidů, metabolické efekty či snižování rizika kardiovaskulárních onemocnění, aterosklerózy a hyperlipidémie. Jejich efekty jsou obvykle testovány pomocí přípravků z rybího oleje, který obsahuje vysoké množství eikosapentaenové (EPA) a dokosahexaenové (DHA) kyseliny a jsou často doplňkovou léčbou ke statinům. Hlavním cílem této diplomové práce bylo definovat vliv statinů a n-3 PUFA na hladiny thyreoidálních hormonů a jejich metabolismus u laboratorních potkanů s experimentálně navozeným hyperthyreoidálním a hypothyreoidálním stavem. Na hlavním pracovišti vedoucího práce (Fyziologickém ústavu AV ČR v Praze) stanovit aktivity klíčových enzymů jodothyronin dejodas typu 1, 2 a 3 ve vzorcích tkání pokusných zvířat
pomocí
modifikovaných
radioenzymatických
metod.
Dalším
cílem
bylo
charakterizovat thyreoidální stav laboratorních potkanů pomocí radioimunoanalytického stanovení celkových a volných frakcí thyreoidálních hormonů v krevním séru.
14
2. ŠTÍTNÁ ŽLÁZA Štítná žláza (Glandula thyreoidea) a její hormonální produkty hrají nezbytnou roli v ovlivnění řady biochemických reakcí na úrovni periferních tkání, které kolektivně kontrolují bazální metabolickou aktivitu organismu. Štítná žláza (Obr. 1), jakožto největší orgán v lidském těle specializovaný na endokrinní činnost, udržuje takovou úroveň metabolismu v tkáních, jaká je optimální pro jejich normální funkci. Štítná žláza není pro život nepostradatelná, ale její nepřítomnost způsobuje závažné mentální (kretenismus) a fyzické (hypo/hyperthyreóza) poruchy. Thyreoidální tkáň se vyskytuje u všech obratlovců. Štítná žláza vzniká jako vchlípenina stěny faryngu a ductus thyreoglossus, roste dolů před tracheou, rozděluje se a tvoří skupiny buněčných provazců. Ductus thyreoglossus označuje vývojovou cestu štítné žlázy z jazyka do krku a jeho zbytky mohou přetrvávat i v dospělosti jako cysty ductus thyreoglossus. Buněčné provazce se formují v malé kuličky nebo folikuly a dávají vznik dvěma lalokům štítné žlázy, které jsou spojeny tkáňovým můstkem, thyreoidálním istmem. Istmus štítné žlázy se nalézá těsně pod prstencovou chrupavkou, uprostřed mezi vrcholem štítné chrupavky (Adamovým jablkem) a jugulární jamkou (Greenspan, 2003). Oba laloky mají hruškovitý tvar a váha žlázy dospělého jedince je cca 10 - 20 g. Štítná žláza má bohaté krevní zásobení a jeden z největších krevních průtoků na gram tkáně ze všech orgánů těla – 5 ml/g/min (Greenspan, 2003). Mezi další anatomicky důležité orgány patří dva páry příštitných tělísek, které se vyskytují za horním a středním lalokem štítné žlázy, a zvratné nervy, které probíhají podél trachey za thyreoideou. V mikroskopickém měřítku se štítná žláza skládá z mnoha váčků (acinů, folikulů) různé velikosti. Mezi nejmenší funkční jednotky štítné žlázy patří folikuly (Obr. 2), které jsou ohraničeny jednou vrstvou thyreoidálního epitelu (thyreocytů). Folikuly jsou vyplněny rosolovitým růžově zbarveným proteinovým materiálem, zvaným koloid. Lidská štítná žláza obsahuje 20 - 30 milionů folikulů (Norman, 1987). V klidovém období (žláza je inaktivní) je koloidu mnoho, folikuly jsou velké a thyreocyty ploché. Při aktivaci buňky mění svůj tvar na kubický či sloupcovitý a na okrajích koloidu vznikají tzv. reabsorpční lakuny (Obr. 3). Pro udržení správné funkce štítné žlázy má nezastupitelnou funkci prvek jod, který je v žaludku převáděn z různých forem na jodid. Doporučený příjem jodu pro dospělého jedince je minimálně 150 μg/den. Štítná žláza jodid vychytává z krve, koncentruje ho a využívá k syntéze thyreoidálních hormonů. Podobný systém vychytávání jodidu existuje rovněž v mléčných žlázách, slinných žlázách, parietálních buňkách sliznice žaludku, 15
placentě a řasnatém tělísku v oku (Norman, 1987). Štítná žláza přijímá okolo 120 µg jodu/den, okolo 80 µg jodu/den je využito k syntéze T4 a T3.
Obr. 1: Štítná žláza - čelní pohled zdroj: http://www.stitnazlaza.estranky.cz/fotoalbum/stitna-zlaza/stitnazlaza/stitna_zlaza.jpg.-.html (25. 8. 13)
Obr. 2: Folikuly štítné žlázy zdroj:http://www.vesmir.cz/files/obr/nazev/1999_247_02:j pg/type/html (25. 8. 13)
Obr. 3: Histologie štítné žlázy, rozdíl mezi inaktivní (vlevo) a aktivní žlázou převzato z Ganong, 2005
16
3. REGULACE THYREOIDÁLNÍ FUNKCE Běžnou vlastností pro všechny endokrinní systémy je kontrola konečné sekrece žláz pomocí zpětnovazebného mechanismu. V případě štítné žlázy mluvíme o negativní zpětné vazbě pomocí hypotalamo-hypofyzárního systému (Obr. 4). Hypotalamický hormon uvolňující thyreotropin (TRH, Thyrotropin-Releasing Hormone), který se dostává k thyreotropní buňce v adenohypofýze hypotalamo-hypofyzárním portálním systémem, stimuluje syntézu i uvolnění thyreotropinu (TSH, Thyroid-Stimulating Hormone). Primární regulace štítné žlázy je tedy zajištěna změnami jeho koncentrace, nicméně je taktéž kontrolována nezbytnou podmínkou pro syntézu thyreoidálních hormonů – dostupností jodu.
Každodenní
udržování
thyreoidální sekrece tedy závisí na zpětnovazebných
vztazích
mezi
thyreoidálními hormony, TSH a TRH. Ačkoli jsou hlavní procesy regulující thyreoidální
funkci
v
HPT
dráze
(Hypothtalamic-Pituitary-Thyroid axis), existuje mnoho doplňkových procesů, které přispívají k celkové regulaci HPT dráhy a k působení thyreoidálních hormonů v cílové tkáni (Zoeller et al., 2007). Z těchto dodatečných procesů jsou snad nejdůležitější metabolické enzymy, které kontrolují změny ve stavu jodace
thyreoidálních
hormonů. Obr. 4: Regulace tvorby a sekrece
Konkrétně tři třídy dejodas řídí konverzi hormonů štítné žlázy, hypotalamo-hypofyzární thyreoidálních
hormonů
na
systém
různé převzato z Greenspan, 2003
aktivní či neaktivní formy. 3.1 HORMON UVOLŇUJÍ CÍ TH YREOTRO PIN (T RH ) Hormon uvolňující thyreotropin se projevuje v široké škále biologických odpovědí. Kromě jeho ústřední role v regulaci hypotalamo-hypofyzární osy má značný vliv na aktivitu mnoha neurobiologických systémů (Monga et al., 2008). Jedná se o tripeptid,
17
L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolinamid (Obr. 5), který je syntetizován a skladován v hypotalamu, odkud je transportován do adenohypofýzy. V adenohypofýze dochází k navázání TRH na specifické membránové receptory a stimulaci syntézy a uvolňování TSH. Thyreoidální hormony způsobují pomalou depleci (úbytek) hypofyzárních TRH receptorů, a tím snižují odpověď na TRH (Greenspan, 2003). Sekrece TRH je stimulována snížením a inhibována zvýšením sérového T3 nebo T4. Sekreci TRH také inhibují dopamin, endogenní opioidy, stres, ale také cytokin IL-1 (interleukin 1) a TNF-α (Tumor Necrosis Factor). TRH je rychle metabolizován, při intravenosním podání hormonu je poločas okolo 5 minut. Hladiny TRH v séru jsou velmi nízké, v rozmezí od 25 do 100 pg/ml. Rapidní degradace TRH po uvolnění z buňky představuje významný nedostatek potenciálního použití TRH jako terapeutického činidla (Monga et al., 2008).
Obr. 5: Struktura TRH převzato z Monga et al., 2008
3.2 THYREOTROPIN (TSH) Thyreostimulační hormon neboli thyreotropin (TSH) je glykoprotein, syntetizovaný a vylučovaný thyreotropními buňkami adenohypofýzy, o molekulové váze 28 kDa a o obsahu 211 aminokyselinových reziduí. Skládá se ze dvou podjednotek alfa (α) a beta (β), které se nekovalentně vážou v hypofyzárních thyreotropech, přičemž funkční specifita TSH je dána podjednotkou β. TSH je primárním faktorem, který reguluje vstřebávání jodu, aktivitu štítné žlázy zahrnující syntézu a uvolnění thyreoidálních hormonů a dokonce i hypertrofii a hyperplasii thyreoidálních buněk. Samotná regulace TSH je kontrolována pomocí negativní zpětné vazby thyreoidálními hormony, již zmíněným uvolňováním TRH. Syntéza a sekrece TSH je inhibována/stimulována jak vysokými/nízkými hladinami T4 a T3, tak některými léky či glukokortikoidy. TSH svého účinku dosahuje tím, že se váže na specifické TSH receptory na membráně thyreocytu a aktivací systému G protein-adenylátcyklaza-cAMP. 18
Mezi hlavní účinky TSH patří změny v morfologii thyreocytů, růst buněk, stimulace všech fází jodového metabolismu, zvýšení mRNA pro thyreoglobulin a thyreoidální peroxidasu, zvýšení lysozomální aktivity a mnoho dalších.
4. HORMONY ŠTÍTNÉ ŽLÁ ZY 4.1 STRUKTURA Štítná žláza zajišťuje biosyntézu, skladování a sekreci thyreoidálních hormonů – přibližně z 90 % thyroxinu (T4, L-3,5,3‘,5‘-tetrajodothyroninu) a z 10 % trijodothyroninu (T3, L-3,5,3‘-trijodothyroninu). V malém množství je sekretován i reverzní trijodothyronin (rT3, 3,3‘,5‘-trijodothyronin), který je ale biologicky inaktivní. Mateřskou sloučeninou pro jodované aktivní hormony je thyronin neboli 4-(4´-hydroxyfenoxy)-L-fenylalanin. Struktury TH jsou zobrazeny na Obr. 6.
Obr. 6: Struktura hormonů štítné žlázy zdroj: http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/endocrine/thyroid/structures. gif (27. 8. 13)
4.2 SYNTÉZA HORMONŮ Jod vstupuje do thyreoidálních folikulárních buněk jako anorganický jodid a je transformován několika metabolickými kroky na thyreoidální hormony T4 a T3. Hormony štítné žlázy jsou syntetizovány z molekul tyrosinu v thyreoglobulinu (viz kap. 4.2.1), na kterém zůstávají navázány až do chvíle, kdy jsou secernovány do krevního oběhu. Individuální kroky v této metabolické sekvenci můžou být charakterizovány následovně: (1) aktivní transport jodidu přes bazální membránu do thyreocytu, (2) jodace tyrosylových zbytků
v thyreoglobulinu,
(3)
spojování
jodotyrosinových
molekul
vázaných 19
v thyreoglobulinu pro vytvoření T4 a T3, (4) proteolýza thyreoglobulinu s uvolněním volných jodothyroninů a jodotyrosinů, sekrece jodothyroninů do krve, (5) dejodace jodotyrosinů uvnitř thyreocytu s uchováním a opětným využitím uvolněného jodidu, (6) dejodace T4 enzymem jodothyronin dejodasou typu 1, která katalyzuje konverzi T4 na T3 (Braverman, 1996). Jodid, dříve než je navázán na tyrosin obsažený v thyreoglobulinu, musí být oxidován pomocí thyreoidální peroxidasy (TPO) (viz. kap. 4.2.3). Po vazbě jednoho atomu jodu na aromatický kruh molekuly tyrosinu na uhlík v poloze 3 vzniká monojodotyrosin (MIT), který může být dále jodován na patém uhlíku za vzniku dijodotyrosinu (DIT). Spojování těchto jodotyrosylových zbytků je rovněž katalyzováno thyreoidální peroxidasou a k uskutečnění tohoto pochodu je nezbytná dimerická struktura thyreoglobulinu. Uvnitř molekuly thyreoglobulinu dvě molekuly DIT tvoří oxidativní kondenzací T4 za současného odstranění dehydroalaninového postranního řetězce z molekuly. Případně obdobnou kondenzací jedné molekuly MIT a jedné molekuly DIT vzniká T3. Tyto spojovací coupling reakce mohou probíhat dvojím způsobem – intramolekulárním nebo intermolekulárním mechanismem. V normální lidské štítné žláze je podíl jodovaných sloučenin průměrně: 23 % MIT, 33 % DIT, 35 % T4 a 7 % T3 (Ganong, 2005).
4.2.1 Thyreoglobulin (Tg) Největší podíl jodu v normální štítné žláze se vyskytuje ve formě thyreoglobulinu, glykoproteinu, který ve své normální formě (19S thyreoglobulin) tvoří dimer s molekulovou hmotností 660 kDa. Tvoří se v endoplasmatickém retikulu thyreocytů a poté je dopraven do koloidu exocytózou granul, peptidové vazby jsou hydrolyzovány a volný T4 a T3 se může uvolňovat do kapilár. Jod představuje 0,1 - 1 % hmotnosti molekuly thyreoglobulinu. Z chemického hlediska se thyreoglobulin skládá z 5496 AMK, obsahuje 140 tyrosylových zbytků, z nichž však pouze 25 - 30 je k dispozici pro tvorbu jodotyrosinů. Tg je unikátní svým obsahem jodovaných aminokyselin. Struktury hlavních jodoaminokyselin nacházejících se v Tg jsou uvedeny na Obr. 7.
20
Obr. 7: Struktura hlavních jodoaminokyselin v thyreoglobulinu (tyrosin, monojodotyrosin, dijodotyrosin, trijodothyronin, thyroxin) převzato z Braverman, 1996
4.2.2 Vychytávání jodidu (trapping) Jodid je z cirkulace do thyreocytů aktivně transportován pomocí tzv. mechanismu jodidového zachycování (trapping) neboli jodidové pumpy. Tento Na+I- kotransportní (symportní) systém generuje iontový gradient pomocí Na+K+-ATPázy jako hnací síly (Braverman, 1996). Jodid je pumpován dovnitř buněk proti elektrickému gradientu a pak souhlasně s ním přechází do koloidu pomocí aniontového transportéru pendrinu. 4.2.3 Thyreoidální peroxidasa Jodid, forma, ve které jod vstupuje do štítné žlázy, musí být před působením jako efektivní jodizační činidlo nejprve zoxidován na vyšší oxidační stav. TPO je membránově vázaný, glykosylovaný hemoprotein, který hraje klíčovou roli v biosyntéze TH katalyzováním jak oxidace jodidových iontů, tak inkorporace jodu do tyrosinových zbytků v thyreoglobulinu. TPO je syntetizována v hrubém endoplazmatickém retikulu, poté přenesena Golgiho elementy a exocytotickými vesikulemi na povrch buňky, kde na buněčném koloidním rozhraní je k dispozici pro jodaci a hormonogenesu. 4.2.4 Proteolýza thyreoglobulinu a sekrece TH Na rozhraní buňky a koloidu je koloid endocytoticky přepraven do koloidního váčku a je absorbován do thyreocytu. Po splynutí lysozomů, které jsou naplněny proteolytickými enzymy, s koloidním váčkem dochází ke zrušení peptidových vazeb jodovaných reziduí a 21
Tg za uvolnění T4, T3, MIT, DIT, peptidových fragmentů a AMK do cytoplazmy. T4 a T3 přecházejí do oběhu, zatímco MIT a DIT jsou podrobeny intrathyreoidální dejodaci a I- je uchován. Intrathyreoidální dejodasa je flavoprotein dependentní NADPH enzym, který se nachází v mitochondriích a mikrosomech. Působí na MIT a DIT, ale nerozkládá jodované thyroniny - T4 a T3. Uvolněný jod je převážně znovu zužitkován pro hormonální syntézu (poskytuje asi 2x tolik jodidu než jodidová pumpa) a malé množství uniká do tělesných tekutin. Celý proces syntézy thyreoidálních hormonů je schematicky znázorněn na Obr. 8.
Obr. 8: Schéma biosyntézy hormonů štítné žlázy zdroj: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Thyroid_hormone_synthesis.png (3. 9. 13)
22
4.3 TRANS PO RT HO RMONŮ ŠT ÍTNÉ ŽL ÁZY Hormony štítné žlázy obíhají v krvi jak ve volné formě, tak vázané na proteiny. Protože jsou TH relativně malé hydrofobní molekuly, je převážná většina z nich transportována ve vazbě na bílkoviny krevní plazmy. Přesto, že pouze 0,02 % T4 a 0,2 % T3 je „volných“, je to právě tato volná frakce, která je zodpovědná za hormonální aktivitu. Význam vazby na proteiny se zdá být v udržování velké zásoby snadno dostupných volných hormonů (Ganong, 2005). Navíc, alespoň u T3, tato vazba umožňuje rovnoměrnou distribuci ve tkáních. Thyreoidální hormony jsou u člověka vázány na tři hlavní proteiny: globulin vázající thyroxin (TBG), transthyretin (neboli prealbumin vázající thyroxin, TBPA) a albumin (ALB). Afinita hormonů k TBG je o několik řádu větší než ke zbývajícím dvěma proteinům, proto je většina cirkulujících hormonů vázána právě na tento protein. TBG je 54 kDa protein, který se syntetizuje v játrech. Každá molekula TBG obsahuje jedno vazebné místo pro T4 a T3 a jeho koncentrace v séru odpovídá 15 - 30 µg/ml. TBPA je 55 kDa globulární protein, sestávající ze 4 identických podjednotek. Albumin má jedno silné a několik volnějších vazebných míst pro T4 a T3. Díky rychlé disociaci T4 a T3 z albuminu je albumin hlavním zdrojem volného hormonu ve tkáních (Greenspan, 2003). Normální distribuce T4 mezi tyto transportní proteiny je 70 - 75 % vazba na TBG, 15 20 % vazba na TBPA a 5 - 10 % je vázáno na ALB. V kontrastu, T3 je vázán ze 70 - 75 % na TBG a 25 - 30 % na ALB, zatímco má malou či žádnou afinitu k TBPA (Norman, 1987). Nižší vazebnost trijodothyroninu koreluje s jeho kratším poločasem (1 den) než je poločas thyroxinu (6 - 7 dní) a s jeho rychlejším účinkem ve tkáních. 4.4 ÚČINKY THYREOIDÁLNÍCH HORMONŮ Mnohé z komplexních účinků thyreoidálních hormonů jsou důsledkem stimulace celkové spotřeby kyslíku, ale u savců hormony štítné žlázy ovlivňují také růst a vývoj, účastní se regulace metabolismu lipidů a zvyšují resorpci sacharidů ze střeva. Hormony štítné žlázy procházejí plazmatickou membránou a vážou se na intracelulární, jaderné receptory, které se nacházejí ve všech buňkách organismu (Kittnar, 2011). Komplex hormon–receptor se pak prostřednictvím proteinové domény, zvané zinkový prst, váže na DNA a zvyšuje či snižuje expresi genů kódujících enzymy, které regulují buněčné funkce.
23
4.4.1 Kalorigenní účinek Jedním ze základních účinků thyreoidálních hormonů je tzv. kalorigenní účinek související se spotřebou kyslíku. Thyreoidální hormony zvyšují spotřebu kyslíku v téměř všech metabolicky aktivních tkáních vyjma mozku, sleziny, varlat, dělohy a adenohypofýzy. Tím podporují zvýšení bazálního metabolismu. Při zvýšení metabolismu se zvyšuje potřeba všech vitamínů, což může mít za následek vznik syndromů z deficitu vitamínů. 4.4.2 Vliv na vývoj a růst U lidského plodu dochází ke spolupráci štítné žlázy, hypofýzy a TSH asi od 11. týdne gravidity. Před touto dobou není fetální štítná žláza schopna vychytávat jod. Vývoj mozku a zrání kostí je v nepřítomnosti fetální thyreoidální sekrece výrazně porušen a může vyúsit v kretenismus. Sekrece thyreoidálních hormonů začíná v období střední gestace (8. - 20. týden) (Greenspan, 2003). Hladina T3 zůstává v průběhu gestace nízká a T4 je působením dejodasy typu 3 měněn na rT3. Náhlé vzestupy TSH, T3 a T4 při narození jsou v průběhu prvního měsíce života normalizovány. U předčasně narozených dětí má štítná žláza prvořadý význam pro výrobu T3 (Pavelka et al., 1997). Thyreoidální hormony jsou nepostradatelné pro normální růst a pro zrání kostní tkáně. Stimulují kostní obrat tím, že zvyšují kostní resorpci a v menší míře i kostní tvorbu. U hypothyreozních dětí se kostní růst zpomaluje a uzavírání epifyzárních štěrbin se zpožďuje (Ganong, 2005). Při nedostatku hormonů štítné žlázy se taktéž snižuje sekrece růstového hormonu se současným potencujícím účinkem růstového hormonu na tkáně. 4.4.3 Vliv na sacharidový a lipidový metabolismus Hormony štítné žlázy zvyšují rychlost resorpce cukrů z trávicího ústrojí, proto při hyperthyreóze hladina krevního cukru po jídle bohatém na cukry rychle stoupá. Hyperthyreóza zhoršuje diabetes mellitus 2 typu. Thyreoidální hormony ovlivňují jak syntézu, tak degradaci cholesterolu. Degradace cholesterolu je důsledkem zvýšení počtu jaterních receptorů lipoproteinů o nízké hustotě (LDL), takže hladina cholesterolu se při zvýšené činnosti štítné žlázy snižuje (Greenspan, 2003). Zvýšená je rovněž lipolýza, uvolňují se mastné kyseliny a glycerol. Hyperthyroidismus je spojován se sniženými hodnotami koncentrace triacylglyceridů, cholesterolu a LDL cholesterolu v séru a hypothyroidismus je spojován naopak se zvýšenými hodnotami triacylglyceridů, celkového cholesterolu a LDL cholesterolu v séru. 24
4.4.4 Vliv na kardiovaskulární aparát Mnohočetné účinky hormonů štítné žlázy na srdce jsou způsobeny přímým vlivem na myocyty, ale na srdeční funkce působí i interakce mezi hormony štítní žlázy, katecholaminy a sympatickým nervovým systémem. Srdce obsahuje dvě izoformy těžkého řetězce myozinu (α a β-MyHC). T3 stimuluje transkripci α-MyHC a inhibuje řetězce β, čímž zlepšuje kontraktilitu srdeční svaloviny. T3 také svým ovlivňováním Ca2+-ATPázy v sarkoplazmatickém retikulu zvyšuje diastolickou kontrakci srdce. Mění geny izoforem Na+K+-ATPázy, zvyšují počet a afinitu β-aderenergních receptorů v srdci a koncentraci G proteinů. Thyreoidální hormony tedy mají výrazně pozitivní inotropní a chronotropní efekt na srdce. To pak způsobuje zvýšený srdeční výdej a výrazně zvýšenou srdeční činnost u hyperthyreózy a opačný stav u hypothyreózy (Greenspan, 2003). 4.4.5 Účinky na nervový systém Hormony štítné žlázy jsou nezbytné pro normální vývoj a funkci centrálního nervového systému. V CNS nejvíce působí na mozkovou kůru a bazální ganglia (Ganong, 2005). Navíc deficit hormonů štítné žlázy působí i na kochleu (hlemýžď), což může mít za následek mentální opožďování, motorickou rigiditu a hluchoněmost.
25
5. METABOLISMUS HORMONŮ ŠTÍTNÉ ŽLÁZY Za normálních okolností štítná žláza produkuje denně zhruba 100 nmol T4, 5 nmol T3 a méně než 5 nmol metabolicky inaktivního rT3. Většina cirkulujícího T3 v plazmě vzniká periferním metabolismem T4. Okolo 80 % T4 je metabolizováno dejodací, a to cca 35 % na T3 a 45 % na rT3 (Greenspan, 2003). Zbytek T3 a T4 je v játrech konjugován a inaktivován převážně glukuronidací a sekrecí do žluče, odkud se konjugáty TH dostávají do střeva. Tam jsou hydrolyzovány, část je zpětně resorbována a část vyloučena stolicí. Menší část je také konjugována se sulfáty a dejodována v játrech nebo ledvinách. Ostatní metabolické reakce zahrnují reakce typické pro aminokyseliny jako je deaminace postranního alaninového řetězce, jíž vznikají deriváty thyrooctové kyseliny s nízkou biologickou aktivitou, nebo dekarboxylace či rozštěpení etherového můstku mezi aromatickými kruhy jodothyroninu. Shrnutí metabolických přeměn je schematicky zobrazeno na Obr. 9.
Obr. 9: Schéma metabolických drah hormonů štítné žlázy převzato z Braverman, 1996
26
5.1 DEJODACE Jedním z nejvýznamnějších metabolických procesů thyreoidálních hormonů je postupná dejodace (Obr. 10). Ta je katalyzována specifickou skupinou enzymů – jodothyronin dejodasami (D1, D2 a D3) – lišících se výskytem ve tkáních, specifitou vůči substrátu a reakční kinetikou. Všeobecně se v daném typu buněk vyskytuje v daný čas pouze jeden typ dejodasy, nicméně v některých tkáních se nevyskytuje žádná a naopak všechny tři typy aktivit jsou přítomny v hypofýze (Bianco and Kim, 2006). Dejodasy tvořené skupinou dimerických integrálních membránových proteinů mohou aktivovat a inaktivovat thyreoidální hormony v závislosti na tom, zda působí na fenolové (5‘-dejodace na vnějším kruhu, ORD) nebo tyrosylové kruhy (5-dejodace na vnitřním kruhu, IRD) jodothyroninů. Tyto dvě dráhy generují všechny jodothyroniny dejodační kaskády od plně jodované formy (T4) po nejodovou molekulu thyroninu (T0) (Braverman, 1996). Všechny dejodasy jsou membránově ukotvené proteiny o velikosti monomeru 29 – 30 kDa, které sdílí značnou sekvenční homologii, katalytické vlastnosti a obsah selenocysteinu (Sec) jako klíčového zbytku v rámci jejich katalytických center (Dentice et al., 2013). Úloha dejodas je fyziologicky významná – dejodasy hrají roli v nejrůznějších aspektech fyziologie savců, jako je udržování koncentrace T3 v plazmě, zpětnovazebná regulace TSH a TRH a v odstranění sulfonovaných jodothyroninů (Arrojo e Drigo and Bianco, 2011). Kromě homeostatických procesů hrají také roli v procesech vývoje a růstu.
Obr. 10: Schéma dejodačních reakcí zdroj: http://ipc.iisc.ernet.in/~dmanna/images/scheme1.gif (19. 8. 2013)
27
5.1.1 Dejodasa typu 1 (D1) Dejodasa typu 1 katalyzuje jak dejodaci na vnějším, tak vnitřním kruhu T4, jednak tedy 5´-dejodaci T4 na T3, ale také 5-dejodaci T4 na rT3, a dále – preferenčně, přeměnu rT3 na 3,3´-dijodothyronin (3,3´-T2), a také dejodaci dijodothyroninů a monojodothyroninů s atomy jodu na fenolovém kruhu. D1 je lokalizována v plazmatické membráně, kde je vázána pomocí jedné transmembránové domény. Jedná se pravděpodobně o heterodimer o velikosti 50 – 60 kDa, ve kterém má jedna podjednotka velikost přibližně 29 kDa. D1 se v lidském těle nalézá ve vysokých aktivitách v játrech a ledvinách, v menší míře ve štítné žláze, kosterním svalstvu a v srdečním svalu, ale na rozdíl od hlodavců není u lidí přítomna v centrálním nervovém systému. Nedávné studie uvádějí i funkční roli D1 v bílé tukové tkáni (Macek Jílková et al., 2010). Molekulové klonování 5´-dejodasy typu 1 ukázalo, že obsahuje selenocystein a že ten je patrně aktivním dejodačním místem (Greenspan, 2003). Dejodace katalyzovaná D1 probíhá ping-pongovým mechanismem se dvěma substráty – jodothyroninem a thiolovým kofaktorem. První část reakce s jodothyroninem vede pravděpodobně ke vzniku seleno-jodového meziproduktu. Ten je následně redukován pomocí thiolového kofaktoru a enzym je tímto regenerován (Bianco et al., 2002). Kriticky důležitá charakteristika dejodasy D1 je její citlivost k inhibici pomocí 6-n-propyl-2thiouracilu (PTU). PTU kompetuje s thiolovým kosubstrátem a vzniká ireverzibilní komplex Enzym-Se-S-PTU. Mezi další inhibitory aktivity D1 patří například jodoacetát (Bianco et al., 2002). Hlavní funkcí D1 je dodávat T3 do krevního oběhu. Její aktivita je zvýšená u hyperthyreózy a snížená u hypothyreózy a právě propylthiouracil snižuje hladinu T3 u těžké hyperthyreózy. Důsledkem inhibice aktivity D1 propylthiouracilem
je snížená
konverze T4 na T3. K porušení dochází také v případě deficitu selenu v dietě.
5.1.2 Dejodasa typu 2 (D2) D2 je selenodejodasa, která obligátně katalyzuje na vnějším kruhu, tedy konverzi T4 na T3 a rT3 na 3,3´-T2. Jako substrát preferuje T4 oproti rT3. Dejodasa typu 2 je klasický membránový protein, lokalizovaný na endoplazmatické membráně a obsahující hydrofobní N-konec. Modelováním stanovená velikost tohoto proteinu je přibližně 31 kDa. Aktivita D2 se nachází zejména v mozku, hypofýze a hnědém tuku. Enzym byl také nalezen v epifýze, harderových žlázách krys a ostatních hlodavců (Braverman, 1996). Dejodace katalyzovaná D2 vyžaduje endogenní redukující kofaktor, který není doposud znám (Bianco et al., 2002). Dejodace probíhá sekvenčním mechanismem, u 28
kterého musí dojít ke spojení jak substrátu, tak thiolu s aktivním místem enzymu ještě před proběhnutím vlastní katalytické reakce. D2 je PTU-rezistentní a je velmi citlivá na cirkulující T4 – její aktivita se snižuje při hyperthyreóze a naopak zvyšuje při hypothyreóze. Ve srovnání s D1 je také mnohem citlivější k inhibici jodoacetátem (Bianco et al., 2002).
5.1.3 Dejodasa typu 3 (D3) Dejodasa D3 katalyzuje specificky dejodace na tyrosylovém kruhu thyreoidálních hormonů. D3 preferenčně katalyzuje konverzi T4 na rT3 a přeměnu T3 na 3,3´-T2,oba biologicky inaktivní produkty. Dejodace tyrosylového kruhu je tedy hlavní cestou pro degradaci T3 a inaktivaci T4. Dejodasa typu 3 je také integrální membránový protein o molekulové hmotnosti přibližně 31,5 kDa, který má transmembránovou doménu na Nkonci analogickou s enzymem D1. D3 je vysoce exprimována v placentě, kde hraje kritickou roli v ochraně vývoje embrya před nadměrnou hladinou TH (Arrojo e Drigo and Bianco, 2011). Vyšší aktivity D3 se vyskytují kromě placenty také v mozku a v kůži. Stejně jako u D2, dejodační reakce katalyzovaná D3 probíhá sekvenčním mechanismem. Aktivita D3 je zvýšená u hyperthyreózy a snížená u hypothyreózy, čímž enzym D3 přispívá k ochraně tkání před nadbytkem T3.
29
6. HARDE ROVY ŽLÁZY Harderovy žlázy (HG), které byly poprvé popsány J. J. Harderem v roce 1694, se vyskytují u všech skupin suchozemských obratlovců, plazů, ptáků a savců. Výjimku tvoří ryby a některé druhy savců jako jsou např. netopýři, krávy a koně, suchozemští masožravci a vyšší primáti. Naopak u hlodavců jsou HG obzvláště vyvinuté. U člověka se tato žláza také nevyskytuje, nicméně je toto zjištění nejasné, protože stopy těchto struktur je možné najít i v lidském plodu (Payne, 1994). Harderovy žlázy (Obr. 11) jsou umístěny v očnici u vnitřního koutku oka (Obr. 12) a v mnoha případech jsou větší než oko samotné. U laboratorního potkana jsou HG velmi nepravidelné a pokrývají většinu zadního povrchu bulvy. HG se skládají z tubulů, které mají široký lumen ohraničený jednou vrstvou epiteliálních buněk, do kterých jsou na bazální membráně tubulu vmezeřeny buňky myoepiteliální (Djeridane, 1994) (Obr. 13). Na bazální membráně tubulu jsou také přítomny fibroblasty, makrofágy, nervová vlákna, některé buňky imunitního systému a cévy.
Obr. 11: Makroskopický vzhled HG Převzato z: Djeridane, 1994
Obr. 12: Pohled na lebku krysy – šipka označuje umístění HG
Obr. 13: Snímek ze světelného mikroskopu - tubuly ohraničené epiteliálními buňkami a lumen (Lm) Převzato z: Djeridane, 1994
zdroj: http://jms.org.br/PDF/v22n1a09.pdf (10. 10. 13)
30
HG jsou regulovány mnoha exogenními (světlo a teplota) a endogenními faktory (prolaktin, thyreoidální a steroidní hormony). Vztah mezi HG a štítnou žlázou byl poprvé navrhnut ve 40. letech 19. století a to hned v několika pracích, ve kterých byla taktéž studována druhová rozdílnost. Nedávné studie uvádějí efekt injekčního podání T4 nebo T3, který měl za následek redukci obsahu porfyrinů v HG a který může být zvrácen při deficitu thyreoidálních hormonů. Kromě toho bylo v další studii demonstrováno, že hormony štítné žlázy přímo působí na HG prostřednictvím změny syntézy a/nebo uvolnění thyreotropinu (TSH) (Monteforte et al., 2008). V HG jsou přítomny specifické receptory jak pro TSH, tak nukleární receptory pro TH. K dalšímu důkazu ovlivňování HG thyreoidálními hormony patří vyskytující se aktivita D2, jednoho z důležitých enzymů metabolismu thyreoidálních hormonů. D2 se nachází zejména v mozku, hnědé tukové tkáni a placentě, nicméně její aktivita byla prokázána jak v HG, tak v epifýze. V epifýze je aktivita D2 regulována thyreoidálním stavem, prostřednictvím cyklu světlo:tma. Aktivita D2 pod kontrolou diurnálního rytmu je zvyšována po nástupu tmy a maximálního vrcholu aktivity je dosaženo v druhé polovině noci (4:00 h). Tento rytmus může být změněn změnou fotoperiody. Bylo také prokázáno, že vystavení křečků světlu v noci vede k zamezení zvyšování aktivity D2 v HG (Guerrero et al., 1989). Tyto výsledky naznačují, že intenzita osvětlení prostředí reguluje aktivitu tohoto enzymu rovněž v HG, stejně jako je tomu v epifýze. Aktivita D2 může být navíc aktivována isoproterenolem, β-adrenergním agonistou a inhibována propranololem, β-blokátorem (Guerrero et al., 1988a). β-adrenergní inervace HG může zprostředkovávat nyktohemerální (nočně- denní) vzestup aktivity D2 v HG. V epifýze tento enzym vykazuje nyktohemerální rytmus shodný se syntetickou aktivitou melatoninu (Guerrero et al., 1988b). Přímý vztah mezi melatoninem a aktivitou D2 v epifýze není ale zatím znám. Ačkoli byly HG objeveny před více jak 300 lety, jejich funkce není zatím zcela objasněna. Výzkumu stojí v cestě také fakt, že studie nebyly zaměřeny pouze na jeden druh, ale spíše na různorodost druhů (morčata, křečci, myši, králíci a další). K primárnímu účelu HG můžeme zařadit omývání a lubrikaci oka, nicméně byly popsány i další různorodé funkce – mohou sloužit jako místo imunitní odpovědi, zdroj feromonů, termoregulačních lipidů či růstových faktorů. HG se účastní také fotoprotekce, fotorecepce a osmotické regulace. HG jsou exokrinní žlázy, které produkují a vylučují různorodé sekrety. Mezi hlavní syntetizované produkty patří lipidy, porfyriny a indoly. Lipidy produkované v savčích HG tvoří ve formě vakuol až 35 % celkové hmotnosti této žlázy. Dříve se předpokládalo, že žlázy uvolňují lipidy apokrinně či holokrinně, ale novější studie uvádějí vylučování 31
exokrinní pomocí exocytózy. Exocytóza je tedy nepostradatelný sekreční mechanismus jak v konstitutivní, tak regulované cestě sekrece savčích HG (Satoh et al., 1996). Hlavním sekrečním lipidem HG je 1-alkyl-2,3-diacylglycerol (ADG) a mezi další vedoucí produkty patří estery vosků. ADG obsahuje esterifikované, hydroxysubstituované alkylové řetězce namísto nasycených a nenasycených řetězců. Mimo tyto sloučeniny HG obsahují (1) mnoho neutrálních lipidů – mono-, di- a triacylglyceroly a cholesterol; (2) fosfolipidy – fosfatidylcholin, fosfatidylethanolamin a sfingomyelin a (3) glykolipidy – např. cerebrosidy. Nejdůležitějším enzymem podílejícím se jak na dráze ADG, tak na triacylglycerolové dráze je syntasa mastných kyselin, která je nezbytná pro syntézu acylCoA, jakožto donoru acylových skupin. Hlavní účel lipidů byl diskutován již v mnoha pracích, ale předpokládá se, že jejich nejdůležitějším efektem je lubrikace oka a schopnost rozpouštět feromony a růstové faktory. Lipidy mohou hrát také roli v oblasti termoregulace a baktericidních vlastností. Mezi další důležitou skupinu sekrečních produktů HG patří porfyriny. Tyto sloučeniny se vyznačují rozdílnými zbytky vyskytujícími se na uhlíku 1 až 8 tetrapyrrolového kruhu (Reis et al., 2005). Porfyriny nebývají secernovány v čisté formě, ale většinou vázané na lipidy nebo proteiny. Syntéza porfyrinů zahrnuje jak mitochondriální, tak cytoplazmatické enzymy, ale je nejasné, jak se porfyriny uvolňují z epiteliálních buněk. Hodně autorů předpokládá, že jsou porfyriny vinkorporovány do lipidových vakuol (Payne, 1994). Hlavním porfyrinem v HG je protoporfyrin IX a mezi další důležité porfyriny patří harderoporfyrin, uroporfyrin a coproporfyrin. Přítomnost velkého množství protoporfyrinu IX v HG je jedinečnou vlastností HG, především z důvodu, že výrazně zvyšuje expresi nespecifické δ-aminolevulát syntasy a snížuje expresi ferrochelatasy (Cui et al., 2003). Aminolevulová kyselina je prekurzorem biosyntézy hemoglobinu, chlorofylu, žlučových barviv a jiných porfyrinů. Exogenní aminolevulová kyselina aktivuje syntézu protoporfyrinu IX. Protoporfyrin IX, který je hlavně součástí cytoplasmy, je znám jako dobrý fotosenzitizer (generuje singletový kyslík). Porfyriny tedy hrají v organismu důležitou roli v přenosu kyslíku a oxidativních procesech. Všeobecně funkce porfyrinů může dále zahrnovat fotoprotekci a fotorecepci. Porfyriny také mohou chránit oko před škodlivými účinky UV záření díky jejich schopnosti ho absorbovat a následně vyzářit světlo o delší vlnové délce. Adaptace na roční období a světlo může představovat další možné fyziologické funkce porfyrinů v HG (Yang et al., 2006). Dalšími důležitými sekrety HG jsou indolové sloučeniny, ze kterých nejdůležitější roli hraje melatonin. HG obsahují hydroxyindol-O-metyltransferasu, enzym, který se podílí na syntéze melatoninu z jeho prekurzoru N-acetylserotoninu. Melatonin (5-methoxy-N32
acetyltryptamin) je hlavní sekreční produkt epifýzy, který ovlivňuje tzv. cirkadiánní rytmy. Melatonin je výhradně spojován s kontrolou denní fyziologie a podílí se na regulaci celoročního rytmu, tj. střídání období léta a zimy. Nicméně v posledních letech bylo potvrzeno, že melatonin je jedním z nejsilnějších, přirozeně produkovaných antioxidantů a jeho metabolity mohou chránit buňky od různých volných radikálů (Vega-Naredo et al., 2012). Melatonin může odstraňovat hydroxylové, peroxidové a (po jeho oxidaci na kationový radikál indolu) i hyperoxidové anionty (Antolín et al., 1996). Po dlouhodobém užívání melatoninu bylo na samicích křečka také demonstrováno jeho působení na snížení obsahu porfyrinů a zabránění vzestupu mRNA pro 5-aminolevulátsyntasu, enzym, který determinuje syntézu porfyrinů. Identifikace řady indolů a jejich asociovaných naznačovat
enzymů míru
v
HG
může
biosyntetické
příbuznosti mezi HG, epifýzou a sítnicí. Navzdory naměřeným sloučeninám a enzymům z biosyntetické dráhy indolů v HG však není zcela jasné, zda tato dráha syntézy je identická se syntézou v epifýze (Obr.
14).
V epifýze
je
syntéza
melatoninu stimulována noradrenergně Obr. 14: Syntetická dráha indolů v epifýze indukovanou aktivací N- Převzato z: Payne, 1994 acetyltransferasy. Syntéza melatoninu v HG je podrobena specifické regulaci indukované přítomností adrenergních a cholinergních vláken v těchto žlázách. Přítomnost indolů v HG nemusí nutně znamenat, že se zde indoly syntetizují, protože HG mají receptory pro melatonin, které naznačují, že HG musí být schopny jednat i na základě exogenního působení indolů (Payne, 1994). Nicméně aktivita klíčových enzymů, N-acetyltransferasy a hydroxyindol-O-metyltransferasy, jasně naznačuje i na endogenní syntézu. Mimo to, některé indoly, jako např. 5-methoxy indoly, mohou být syntetizovány tkání HG in vitro.
33
7. STATINY Hypercholesterolémie je primárním rizikovým faktorem vývoje aterosklerózy a ischemické choroby srdeční. Celosvětově jsou tyto nemoci nezanedbatelnými příčinami úmrtí a z tohoto důvodu je kontrola biosyntézy cholesterolu důležitým prostředkem pro snižování plazmatických hladin cholesterolu. Cholesterol je steroidní látka, která je esenciální komponentou buněčných membrán a substrátem pro biosyntézu žlučových kyselin nezbytných pro absorpci tuků a v tucích rozpustných vitamínů. Biosyntetická dráha cholesterolu začíná acetyl-CoA, zahrnuje více než 25 enzymů, ale rychlost omezujícím krokem je konverze 3-hydroxy-3-metylglutaryl-koenzymu A (HMG-CoA) na mevalonát za katalýzy HMG-CoA-reduktasou (Obr. 15) (Manzoni and Rollini, 2002). Inhibice HMGCoA-reduktasy vede k akumulaci HMG-CoA, který může být metabolizován na jednodušší produkty, aniž by vznikaly lipofilické intermediáty se sterolovým jádrem. Biosyntézu cholesterolu inhibicí HMG-CoA-reduktasy blokují statiny (Obr. 16).
Obr. 16: Statiny blokují konverzi HMG-CoA na mevalonát inhibicí rychlost omezujícího enzymu, HMG-CoA reduktasy převzato z: Wong et al., 2002
Obr. 15: Schéma biosyntézy cholesterolu zdroj: http://oldweb.izip.cz/ds3/hypertext/SVAAP_soubory/i mage002.jpg (10. 1. 2014)
34
Statiny jsou účinné, široce předepisované léky v léčbě hypercholesterolémie. Statinová rodina je složena z 9 příbuzných sloučenin, které jsou přírodního nebo syntetického původu. Statiny pocházející z plísňové fermentace zahrnují lovastatin, compactin, pravastatin a simvastatin, zatímco fluvastatin, atorvastatin, cerivastatin, rosuvastatin a pitavastatin jsou syntetické sloučeniny (Wong et al., 2002; Barrios-González and Miranda, 2010). Přírodní statiny je možné získat z rozdílných rodů a druhů vláknitých hub, např. lovastatin je produkován hlavně druhem Aspergillus terreu, compactin plísní Penicillium citrinum a pravastatin může být získán biotransformací compactinu pomocí Streptomyces carbophilus. Všechny přírodní statiny mají podobnou chemickou strukturu, obsahují polyketidovou část (hydroxy-hexahydronaftalenový systém), na kterou jsou navázány rozdílné postranní řetězce. Syntetické statiny jsou odvozené od mevalonátu a pyridinu (Manzoni and Rollini, 2002). Struktury nejdůležitějších statinů jsou zobrazeny na Obr. 17. Strukturální charakteristikou všech statinů je postranní řetězec, který se vyskytuje buď v uzavřené (neaktivní, lakton) nebo v otevřené (aktivní, kyselina) formě (Obr. 18). K aktivaci in vivo dochází v plazmě a v játrech pomocí karboxyesterasy. Otevřená konformace těchto léků reverzibilně inhibuje katalytickou aktivitu HMG-CoA-reduktasy tím, že strukturně napodobuje reakční meziprodukty, které jsou tvořeny v aktivním místě tohoto enzymu.
Obr. 18: Uzavřená (neaktivní) a otevřená (aktivní) forma statinových postranních řetězců zdroj: http://patentimages.storage.googleapis.com/US65 69461B1/US06065694-20030527-C00001.png (11. 1. 2014)
Obr. 17: Struktury statinů v otevřené formě převzato z: Wong et al., 2002
35
Z důvodu více různých účinků mohou být statiny použity v širokém spektru kardiovaskulárních i nekardiovaskulárních onemocnění. Hypocholesterolemický efekt statinů spočívá ve snížení obsahu velmi nízkodenzitního lipoproteinu (VLDL) a nízkodenzitního lipoproteinu (LDL) zapojeného do translokace cholesterolu, a ve zvyšování vysokodenzitního lipoproteinu (HDL) s následnou redukcí poměru LDL cholesterolu k HDL cholesterolu, jakožto nejlepšího indikátoru aterogenního rizika (Manzoni and Rollini, 2002). Redukce LDL cholesterolu zahrnuje též antitrombotické a protizánětlivé účinky, které mohou poskytovat ochranu proti růstu aterosklerotického povlaku stěn. Statiny vedou k podstatné redukci srdečních příhod, mohou zabraňovat mrtvici a pozitivně ovlivňovat rozvoj periferních cévních onemocnění. Kromě toho pozitivně působí na řadu chronických nemocí jako je např. metabolický syndrom či diabetes mellitus 2. typu. Další potenciální použití statinů je v oblasti léčby hypertenze, osteoporotických zlomenin, Parkinsonovy nemoci, roztroušené sklerózy, revmatoidní artritidy či ve snižování rizika tvorby Alzheimerovy choroby (Barrios-González and Miranda, 2010; Manzoni and Rollini, 2002).
8. ČERVENÝ PALMOVÝ OLEJ (RPO) RPO je olej vyráběný z plodů palmy olejné (Elaeis guineensis). 90 % světové produkce tohoto oleje je použito pro potravinářské účely a zbývajících 10 % je používáno na výrobu mýdel či tuků (mastných kyseliny, metylesterů, povrchově aktivních látek a detergentů). RPO obsahuje přibližně 50 % nasycených a 40 % mononenasycených mastných kyselin a 10 % polynenasycených mastných kyselin (Edem, 2002). Z nasycených kyselin je nejhojněji zastoupená kyselina palmitová, mezi zástupce nenasycených kyselin patří kyselina olejová či linolová. RPO je nejstabilnější dietní olej na světě a to jak z důvodu shodného obsahu nasycených i nenasycených mastných kyselin, tak i z důvodu vysokého obsahu provitaminu A a vitaminu E a naopak nízkého obsahu kyselin linolové a linolenové. Charakteristická červená barva oleje je způsobena vysokým obsahem karotenoidů, především β-karotenu a lykopenu. Karoteny jsou spolu s vitamínem E, kyselinou askorbovou, enzymy a proteiny členy biologické antioxidantní sítě, která konvertuje vysoce reaktivní radikály (•OH) a volné mastné peroxidové radikály na méně aktivní sloučeniny, čímž chrání buňky před oxidativním poškozením (Edem, 2002). Mezi další sloučeniny, které jsou zastoupeny v RPO patří např. stopové prvky, skvalen, fytosteroly a koenzym Q10. Příznivé účinky RPO na zdraví člověka jsou dány zejména 36
vysokým obsahem nejdůležitějšího antioxidantu v těle – vitaminu E, který, jak již bylo zmíněno, chrání buňky před účinky volných radikálů a který má také pozitivní vliv na imunitní odpověď, reprodukci a brání rozvoji rakoviny. Další výhody příjmu RPO zahrnují snižování rizika arteriální trombózy a aterosklerózy, inhibici endogenní syntézy cholesterolu a agregaci krevních destiček, redukci oxidativního stresu a redukci vysokého krevního tlaku (Oguntibeju at al., 2009).
9. n-3 POLYNENASYCENÉ MASTNÉ KYSELINY (n-3 PUFA) n-3 (neboli omega 3) polynenasycené mastné kyeliny (PUFA) patří do rodiny esenciálních mastných kyselin, které jsou charakterizované jejich první dvojnou vazbou na třetím uhlíku od metylového konce uhlíkatého řetězce. Živočichové tyto kyseliny spolu s n-6 (neboli omega 6) PUFA, které obsahují dvojnou vazbu na šestém uhlíku molekuly, nedovedou sami vytvářet, i navzdory jejich nezbytnosti pro organismus. Tyto mastné kyseliny se vyskytují v různých třídách lipidů, především ve fosfolipidech – základních součástech buněčných membrán, a také v esterech cholesterolu. Ve fosfolipidech jsou PUFA obvykle lokalizovány v pozici sn-2, zatímco nasycené a mononenasycené kyseliny jsou obvykle situovány v pozici sn-1 (Flachs et al., 2009). n-3 PUFA můžeme rozdělit do dvou základních podskupin. První, kyselina α- linolenová (ALA) je odvozená z rostlinných olejů (např. z řepkového oleje či oleje lněného semínka) a je složena z 18 uhlíkových atomů se třemi dvojnými vazbami (18:3) (Obr. 19) (Schmidt et al., 2005). Druhá skupina n-3 PUFA je odvozena z mořských ryb a mezi nejdůležitější zástupce patří kyselina eikosapentaenová (EPA, 20:5) a dokosahexaenová (DHA, 22:6) (Obr. 19). Nejbohatšími zdroji EPA a DHA jsou tučné mořské ryby jako např. losos nebo makrela či méně tučnější ryby jako např. platýz. Kyselina α- linolenová je metabolickým prekurzorem mořských n-3 mastných kyselin. Tento fakt spolu s její dostupností z rostlinných zdrojů vytváří vysoký zájem jejího použití jako náhrady za kyseliny mořského původu. ALA a kyselina linolová (LA, 18:2), která je výchozí látkou pro omega 6 kyseliny, sice dávají vznik odlišným metabolitům (Obr. 19), ale enzymy, které metabolity obou řad tvoří, jsou stejné. Proto LA a ALA vzájemně kompetují o enzym Δ-6-desaturasu, který je potřebný již na úrovni prvního metabolického kroku jejich konverze. Nadbytek LA brzdí tvorbu EPA a DHA. I bez této inhibice však syntéza EPA a DHA probíhá relativně pomalu a proto má zvýšení příjmu EPA a DHA za určitých situací efekt i při nedostatku ALA v potravě. 37
Obr. 19: Struktury nenasycených mastných kyselin a jejich metabolická konverze zdroj: http://www.hindawi.com/journals/drt/2011/467349.fig.001.jpg (22. 1. 2014)
Metabolické efekty n-3 PUFA jsou převážně zprostředkovány transkripčními faktory a receptory aktivovanými proliferátory peroxizomů (PPARs, resp. PPARα, PPARδ a PPARγ), které jsou zodpovědné za efekty vyvolané metabolity odbourávání lipidů n-3 PUFA (Flachs et al., 2009). PPAR hrají pleiotropní roli v metabolismu lipidů a sacharidů, buněčné proliferaci a diferenciaci a také v zánětu (Sugiyama et al., 2008). PPARα je exprimován na poměrně vysoké úrovni v játrech, tenkém střevě, ledvinách, srdci a hnědé tukové tkáni, a hraje důležitou roli v regulaci transportu a oxidaci mastných kyselin, buněčné proliferaci a zánětlivých procesech (Bordoni et al., 2006). PPARδ se podílí na vývoji, metabolismu lipidů, proliferaci epidermálních buněk, myelinizaci nervů a hojení ran. PPARγ hraje roli v homeostáze glukózy, metabolismu lipidů, buněčném cyklu, zánětu, karcinogenezi a je to diferenciační faktor adipocytů (Bordoni et al., 2006). Kromě tohoto přímého působení je mnoho biologických účinků PUFA závislých na působení jejich aktivních metabolických produktů – eikosanoidů. Eikosanoidy jsou sloučeniny odvozené od polyenových nenasycených mastných kyselin s řetězcem dlouhým 20 uhlíků a můžeme je rozdělit do dvou skupin – prostanoidy a leukotrieny. Do skupiny prostanoidů patří prostaglandiny, prostacykliny a thromboxany. Tyto látky vznikají po uvolnění PUFA z fosfolipidů. Eikosanoidy působí apokrinně i parakrinně a jsou to látky málo stabilní, které působí velmi rychle prostřednictvím asi 10 různých receptorů v imunokompetentních buňkách, krevních destičkách, hladkém svalstvu, tuku a dalších tkáních. Epidemiologické údaje poskytly jasný důkaz, že konzumace mořských ryb je spojena se sníženým rizikem kardiovaskulárních onemocnění, aterosklerózy a hyperlipidémie (Souza et al., 2010). Omega 3 polynenasyceným mastným kyselinám je také připisováno 38
několik dalších zdraví prospěšných vlastností zahrnujících snižování triglyceridů a koncentrace LDL cholesterolu v séru. Příznivé efekty n-3 polynenasycených mastných kyselin na kardiovaskulární systém mohou být zprostředkovány užitečnými modifikacemi lipoproteinového profilu (Riediger et al., 2009). Omega 3 mastné kyseliny jsou silnými hypotriacylglycerolemickými prostředky – dávka 3 - 4 g/den EPA nebo DHA obvykle sníží hladiny triglyceridů v séru o 25 - 30 %, a až o 50 % u pacientů s těžkou hypertriglyceridémií (Davidson et al., 2011). EPA je současně užívaná jako hypolipidemické léčivo (etylester-cis-5,8,11,14,17-eikosapentaenová kyselina) a je prokázáno,
že
moduluje
genovou
expresi
v
homeostaze
lipidů
a
glukosy.
Hypotriglykemický efekt EPA je hlavně následkem kombinace účinků inhibice lipogeneze a stimulace oxidace mastných kyselin v játrech (Sugiyama et al., 2008). Konzumace n-3 PUFA dále snižuje klidovou tepovou frekvenci a systolický a diastolický krevní tlak. K dalším kardiovaskulárním efektům omega 3 mastných kyselin patří možné antidysrytmické, antiaterogenické, antitrombotické a protizánětlivé endoteliální účinky (Bays et al., 2008). PUFA jsou studovány také pro jejich potenciální použití v řadě nekardiovaskulárních onemocnění, jako jsou artritické nemoci, oční nemoci, rakovina a pro jejich pozitivní ovlivnění dětského vývoje. Omega 3 mastné kyseliny jsou také nezbytné pro správné složení spermatu, sítnice a lipidů v mozku. Bylo dokonce prokázáno, že nedostatek DHA je spojen s abnormalitami mozkové funkce (Tapiero et al., 2002). Současná doporučení ohledně velikosti příjmu n-3 PUFA vychází zejména z jejich účinku na kardiovaskulární systém. V denních dávkách EPA a DHA kolem 0,5 g doporučovaných pro běžnou populaci a dosažitelných příjmem stravy bohaté na mořské ryby (alespoň dvě jídla týdně), se již projevuje preventivní působení těchto látek na kardiovaskulární nemoci. Dávky kolem 1 g EPA a DHA denně jsou doporučovány jako prevence opakování ischemické choroby srdeční. Tohoto příjmu lze dosáhnout kombinací konzumace jídel z mořských ryb a rybího tuku, či koncentrátů EPA a DHA. Dávky do 3 g EPA a DHA/den, které jsou hraniční z hlediska vzniku nežádoucích rizik, vedou k potlačení hypertriglyceridémie nezvládnutelné běžnou úpravou diety a působí také protizánětlivě.
39
10. POZITRONOVÁ EMISNÍ TOMOGRAFIE (PET) Emisní tomografie (ET) je základní lékařská zobrazovací technika, která k zobrazení funkčních vlastností lidských orgánů a tkání užívá radioaktivní materiály. ET můžeme rozdělit na dvě základní techniky - PET (positron emission tomography) a SPECT (singlephoton emission computed tomography). Podstatou ET jsou dva základní principy: zobrazování pomocí užití emise γ-záření (tzv. tracer princip) a objemové zobrazování vnitřních částí těla (tzv. tomografie). „Tracer princip“ je založen na zapojení radioaktivních sloučenin ve fyziologických procesech organismu stejným způsobem, jako jsou zapojovány sloučeniny neradioaktivní. Radioaktivní materiály mohou být detekovány pomocí emise γ-paprsků, a proto mohou být užity ke sledování toku a distribuce důležitých látek v těle. Užití radioaktivních materiálů jako reprezentativního markeru přírodních neradioaktivních látek je základem současné technologie PET a SPECT. Radiofarmaka a radiotracery mohou být navrženy tak, aby se chovaly jako markery pro velkou skupinu látek podílejících se na přirozených procesech v těle. Z toho důvodů může ET přinést cenné diagnostické informace. PET je nejpřesnější forma radiotracerových zobrazovacích technik. Tato technika umožňuje
studovat
(farmakodynamiku)
tkáňovou a
fyziologii
farmakokinetiku.
a
biochemii,
Tento
přístup
funkční poskytuje
efekty
léků
nástroje
pro
experimentální medicínu ve výzkumu biologie poškozené tkáně a umožňuje provádět důkazové studie mechanismu působení, účinku a účinnosti terapie a převést výsledky do klinické praxe (Jones and Price, 2012). Funkční zobrazení pomocí PET taktéž hraje stále větší roli v diagnostice maligních onemocnění, plánování terapie a monitorování léčby (Blodgett et al., 2007). Mezi radionuklidy používané pro PET vyšetření patří 15O, 13N, 11C a 18F. Tyto izotopy umožňují značení specifických biomolekul bez rušení jejich biologické funkce. Nejčastěji užívaným
radiofarmakem
je
v
dnešní
době
18F-fluorodeoxyglukosa.
Tento
radiofarmaceutický analog glukosy vstupuje do buněk stejným způsobem jako glukosa, ale je metabolizován na nový metabolit, jehož koncentrace roste s časem, v poměru k rychlosti buněčného metabolismu glukosy. 18F-fluorodeoxyglukosa je také důležitá látka v zobrazování nádorů a mozku (Wernick and Aarsvold, 2004). PET studie začíná injekcí nebo inhalací radiofarmaka. V rozmezí několika sekund až minut, po transportu a vstřebání látky do orgánu zájmu, začíná samotné skenování. Při rozpadu radioizotopu dochází k emisi pozitronů, které jsou kromě jejich opačného náboje
40
téměř totožné se záporně nabitými elektrony. Po přiblížení pozitronu k elektronu tyto částice anihilují (= zaniknou). Při anihilaci se vyprodukují dva vysokoenergetické (511 keV) fotony, které se šíří v opačných směrech (180° proti sobě) (Ollinger and Fessler, 1997). Fotony putují opačnými směry tak, aby byl zachován moment hybnosti. Podstatou PET je tedy detekce gama paprsků vzniklých z anihilace. Registrací těchto dvou gama paprsků může PET skener poskytnout obraz místa v těle, kde došlo k anihilaci pozitronů. Celý princip PET je schématicky zobrazen na Obr. 20. PET doplňuje více konvenční anatomické zobrazovací techniky – počítačovou tomografii (CT) a magnetickou rezonanci (MR). Anatomické zobrazovací metody jsou komplementární k funkčnímu zobrazování v tom smyslu, že CT poskytuje informace o přesné lokalizaci orgánů a lézí, PET poskytuje informace o funkci tkání, jak normálních, tak patologických (Blodgett et al., 2007). Při kombinaci, mohou tyto dva způsoby identifikovat a lokalizovat funkční abnormality. Pomocí PET je možné také studovat malá zvířata. Nejčastěji používanými zvířaty pro tyto studie jsou myši a potkani. Výhodou tohoto zobrazování je možnost stanovení na jediném živém zvířeti, po celou dobu biodistribuce radioaktivně značeného traceru (= zvíře může být studováno opakovaně i v pozdější době). Tento způsob umožňuje snížení počtu laboratorních zvířat pro experiment a taktéž snížení nákladů a zvýšení rychlosti dosažení výsledků (Wernick and Aarsvold, 2004). Důležitou výhodou zobrazovacích technik u malých zvířecích modelů lidských nemocí je umožnění spojitosti mezi zvířecím modelem a studiem na lidech. PET poskytuje příležitost realizovat přesně stejné experimenty u myší a lidí, usnadňuje přímé srovnání a vhodnou interpretaci dat na zvířecích modelech (Wernick and Aarsvold, 2004).
Obr. 20: Schematické znázornění principu pozitronové emisní tomografie zdroj: http://www.cellsighttech.com/technology/pet.html (23.4.2014)
41
11. CÍLE PRÁCE
U laboratorních potkanů s experimentálně navozeným různým thyreoidálním stavem stanovit vliv statinů, RPO, n-3 PUFA a případně jejich kombinace na metabolismus thyreoidálních hormonů
Charakterizovat
thyreoidální
stav
laboratorních
potkanů
pomocí
radioimunoanalytického stanovení koncentrací celkových a volných frakcí thyreoidálních hormonů v krevním séru
Pomocí modifikovaných radioenzymatických metod vyvinutých a zavedených na hlavním pracovišti vedoucího práce stanovit aktivity klíčových enzymů zapojených do metabolismu thyreoidálních hormonů – jodothyronin dejodas D1, D2 a D3 ve vzorcích tkání odebraných od zvířat v probíhajících farmakologických experimentech
42
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
12. MATERIÁL A METODY 12.1 RADIOCHEMIKÁLIE
A
SPE CI ÁLNÍ
BIOCHEMIKÁLIE
PRO
STANOVENÍ ENZYMOVÝCH AKTIVIT Všechny použité chemikálie pro jednotlivá stanovení enzymových aktivit byly nejvyšší dostupné čistoty (p. a.). Seznam reagencií je popsán jednotlivě u každé samostatné metodiky. Tyto chemikálie pocházely z velké části od firmy Sigma-Aldrich, s výjimkou kyseliny bicinchoninové od firmy Fluka a běžně používaných anorganických sloučenin od firmy Lachema. Dodavatelem radioaktivně značených 125I-jodothyroninů byla firma Perkin Elmer (Boston, USA). Od již zmíněné firmy Sigma byly použity neradioaktivní jodothyroniny, jakož i kofaktor dithiotreitol (DTT) a inhibitor enzymu D1 6-n-propyl-2thiouracil (PTU). In vitro radioimunoanalytické stanovení koncentrace jodothyroninů v séru bylo provedeno za použití komerčních RIA kitů od firmy Immunotech (Beckman Coulter Company, Praha). Pro
tenkovrstevnou
chromatografii
s
vyvíjející
soustavou
chloroform/methanol/koncentrovaný amoniak v poměru 40:20:3 byly používány komerční skleněné TLC desky se silikagelovou vrstvou od firmy Merck No. 11798 (0,25 mm Kieselgel 60 F254 s koncentrační zónou 2,5 cm, 20 x 20 cm).
12.2 PŘÍSTROJE Kromě běžně dostupného laboratorního zařízení byly použity i velmi nákladné přístroje, které nebyly dostupné na Ústavu biochemie PřF MU v Brně, ale pouze na hlavním řešitelském pracovišti na Fyziologickém ústavu AV ČR v Praze. Pro přípravu subcelulárních frakcí tkání byly použity chlazené centrifugy Janetzki K23 a K24 a ultracentrifuga Sorvall RC M100 s rotorem AT4. Pro měření radioaktivity
125
I u RIA
stanovení byl použit pěti-detektorový γ-počítač Cobra II Auto-Gamma (Packard). K vyhodnocování enzymových aktivit všech dejodas byly využity unikátní přístroje jako laserový scanner PhosphorImager SF (Molecular Dynamics, USA). Jedná o zařízení, které umožňuje vyvolání a počítačové zpracování radiochromatogramu metodou tzv. bezfilmové autoradiografie (viz kap. 12.7.4).
44
12.3 POKUS Y NA ZVÍŘATECH A O DBĚR VZORKŮ BIOLOGICKÉHO MATERIÁLU Na hlavním řešitelském pracovišti – na Oddělení radiometrie FGÚ AV ČR v Praze, v izotopovém zvěřinci, bylo postupně provedeno několik farmakologických experimentů in vivo, na dospělých samcích a samicích laboratorního potkana kmenů Wistar, Wistar Kyoto a SHR (spontánně hypertenzní potkan). Biologický materiál používaný pro tuto diplomovou práci pocházel z probíhajících experimentů na laboratorních zvířatech a byl dlouhodobě uchovávaný v hlubokomrazících boxech při -80 °C. Experimenty byly prováděny podle protokolů, jež byly v souladu s vnitřními směrnicemi Fyziologického ústavu AV ČR vycházejícími ze zákona na ochranu zvířat proti týrání (č. 264/1992 Sb.). Po ukončení každého experimentu byla zvířata usmrcena v etherové narkóze přestřižením krční tepny s následným odebráním krve do zkumavek (v co největším množství). Krev byla ponechána pro zlepšení úplného vysrážení 20 - 30 minut při laboratorní teplotě. Odebrané vzorky krve byly po koagulaci zcentrifugovány a séra byla uchována v mrazicím boxu při teplotě -18 °C. Po vykrvácení byli potkani ihned pitváni a byly z nich odebrány vzorky následujících tkání: štítné žlázy (GT, lat. Glandula thyreoidea), jater (L, angl. liver), Harderovy žlázy (HG, angl. harderian gland), hypofýzy (P, angl. pituitary), srdce (H, angl. heart), hnědé tukové tkáňe (BAT, angl. brown adipose tissue), podkožní tukové tkáně (SUB, angl. subcutaneous adipose tissue), gonadální tukové tkáně (GON, angl. gonadal adipose tissue). Všechny vzorky byly ihned po odebrání zmrazeny v kapalném dusíku a uloženy v hlubokomrazícím boxu při -80 °C.
12.3.1 Experiment STAT 13/1 Použitá farmaka Pravastatin
Sigma-Aldrich
Avarastatin
Sigma-Aldrich
RPO
dar od Prof. Van Rooyen , Cape Peninsula University of Technology, Bellville, Jihoafrická republika
Experiment byl proveden celkem na 40 pokusných zvířatech, samcích a samicích kmenů Wistar a SHR rozdělených do 4 skupin podle další aplikace testovaných farmak (Tab. I), podávaných po dobu 8 týdnů. Zvířata byla krmena standardní laboratorní dietou ve formě pelet – ST-1 BERGNAM (Česká republika). Potkani byli při zahájení 45
experimentu 8 měsíců staří, s živou hmotností mezi 200 - 700 g. Potkani byli umístěni v plastových klecích (po 3 - 4 zvířatech) v klimatizované chovné místnosti se zajištěnou stálou teplotou 23±1 °C, s pravidelným dvanácti-hodinovým světelným cyklem (světlo 6.00 - 18.00 h). Od počátku 1. týdne se potkanům ze skupin 2 (STAT) a 4 (STAT+RPO) začala podávat směs statinů v pitné vodě, v množství uvedeném v Tab. I. Již od 4. dne byl potkanům ze skupin 3 (RPO) a 4 (STAT+RPO) podáván červený palmový olej – pro snazší aplikaci ve ztuhlém stavu, rozetřený na piškotech. Kontrolní zvířata (skupina 1, EU) pila vodu bez přídavku farmak. V devátém týdnu byla zvířata postupně usmrcena. Tabulka I: Rozpis jednotlivých skupin potkanů zařazených v experimentu STAT 13/1 (podle aplikovaných farmak) Sk.
Označení
n
Dávkování látek
1
EU
8
bez ovlivnění
2
STAT
6
5 mg pravastatinu/1 l H2O 6 mg avarastatinu /1 l H2O
3
RPO
14
80 mg RPO/100 g B.W.
4
STAT+RPO
12
5 mg pravastatinu/1 l H2O 6 mg avarastatinu /1 l H2O 80 mg RPO/100 g B.W.
12.3.2 Experiment PUFA 13/2 Použitá farmaka n-3 PUFA (OMACOR) 3,5,3´-trijodo-L-thyronin
Pronova BioPharma Norge AS, Norsko
Sigma-Aldrich
Mr = 651,0
zásobní roztok T3 o c = 0,65 µg/µl 6,51 mg bylo rozpuštěno v 0,2 M NaOH a následně naředěno vodou na objem 10 ml 3,5,3´,5´-tetrajodo-L-thyronin
Sigma-Aldrich
Mr = 776,9
zásobní roztok T4 o c = 0,78 µg/µl 7,77 mg bylo rozpuštěno v 0,2 M NaOH a následně naředěno vodou na objem 10 ml
0,05 % roztok methimazolu
Sigma-Aldrich
46
Experiment PUFA 13/2 byl proveden za stejných podmínek ustájení a podávání diety jako předešlý experiment. Bylo při něm však použito vyššího počtu zvířat na každou experimentální skupinu. Experiment byl proveden celkem na 157 pokusných zvířatech, samcích a samicích kmenů Wistar Kyoto a SHR rozdělených do 6 skupin. Potkani byli při zahájení experimentu 10 měsíců staří, s živou hmotností mezi 200 - 500 g. Od konce 1. týdne se potkanům ze skupin 2 (EU+PUFA), 4 (HYPO+PUFA) a 6 (TH+PUFA) začaly podávat PUFA – pro snazší aplikaci v tekutém stavu, ve formě kapek rozetřených na piškotech. Zvolené dávkování experimentu je uvedeno v Tab. II. Spolu s farmaky se pro dosažení změny thyreoidálního stavu potkanům ze skupin 5 (TH) a 6 (TH+PUFA) (hyperthyreoidálním) začala podávat směs thyreoidálních hormonů v pitné vodě, v množství uvedeném v Tab. II, a zvířatům ze skupin 3 (HY) a 4 (HY+PUFA) (hypothyreoidálním) namísto vodovodní pitné vody 0,05 % roztok methimazolu. Po 4 týdnech se dávka thyreoidálních hormonů snížila, viz. Tab II. Podávání farmak bylo denně adjustováno vzhledem k aktuální tělesné hmotnosti pokusných zvířat tak, aby obdržela v průběhu celého experimentu stále stejná předem definovaná množství příslušných látek vztažená na 100 g tělesné hmotnosti a den. Na konci experimentu, který trval 2 měsíce, byla zvířata usmrcena. Tabulka II: Rozpis jednotlivých skupin potkanů zařazených v experimentu PUFA 13/2 (podle aplikovaných farmak) Sk.
Označení
n
Dávkování látek
1
EU
29
bez ovlivnění
2
EU+PUFA
28
0,32 g PUFA /100 g B.W.
3
HYPO
31
0,05% methimazol
4
HYPO+PUFA
21
0,05% methimazol + 0,32 g PUFA /100 g B.W.
5
TH
25
6
TH+PUFA
23
1.-4. týden 5.-8. týden
3,3 μg T3/100 g B.W. + 16,7 μg T4 /100 g B.W. 3,0 μg T3/100 g B.W.+ 15 μg T4 /100 g B.W.
1.-4. týden
3,3 μg T3/100 g B.W. + 16,7 μg T4 /100 g B.W. + 0,32 g PUFA /100 g B.W. 3,0 μg T3/100 g B.W.+ 15 μg T4 /100 g B.W + 0,32 g PUFA /100 g B.W.
5.-8. týden
47
12.4 PŘÍPRAVA HOMOGENÁTŮ A POST-MITOCHONDRIÁLNÍCH (POST -MT) SUPERNAT ANT Ů Odebraný a zamražený biologický materiál z pokusných zvířat byl zhomogenizován a rozdělen diferenciální centrifugací na jednotlivé požadované frakce. Byly připraveny postmitochondriální supernatanty tkání: štítných žláz (post-mt GT), hypofýz (post-mt P), Harderových žláz (post-mt HG), jater (post-mt L), hnědého tuku (post-mt BAT), podkožní tukové tkáně (post-mt SUB) a gonadálního tuku (post-mt GON). 12.4.1 Příprava post-mt supernatantů štítných žláz a hypofýz Pomůcky a chemikálie stolní centrifuga na eppendorfky MPW 211, vortex, analytické váhy, polystyrenové korýtko
s
ledem,
pinzeta,
sada
automatických
pipet
se
špičkami,
stolní
mikrohomogenizátory sklo-sklo Zásobní roztoky Izolační médium STE PIC (směs inhibitorů proteas) 100 mmol.l-1 PMSF (fenylmetylsulfonylfluorid) v isopropanolu 0,25 mol.l-1 sacharosa 0,5 mol.l-1 Tris-HCl pufr, pH=7,2 100 mmol.l-1 EDTA, pH=7,2
Postup Příprava post-mt supernatantů štítných žláz a hypofýz je podobná jako u jiných tkání, s tím rozdílem, že se pracuje s menšími objemy a homogenizace je pouze ruční. Izolační STE médium bylo připraveno smícháním zásobních roztoků sacharosy, Tris-HCl a EDTA v poměru 96:2:2 a těsně před jeho použitím bylo přidáno na 1 ml alikvotu 2 μl PIC a 5 μl PMSF. Poté bylo STE médium uloženo do korýtka s ledem, následující kroky byly prováděny v chlazených eppendorfkách a za stálého chlazení mikrohomogenizátorů ledem. Zamražené
štítné
žlázy
byly
zváženy,
přeneseny
do
mikrohomogenizátoru
a
homogenizovány s STE médiem o objemu, který se rovná devítinásobku hmotnosti štítné žlázy či hypofýzy. Poté byly homogenáty přelity do 1,5 ml zkumavek a na stolní zchlazené centrifuze zcentrifugovány po dobu 10 minut při 12 000 g. Z post-mt supernatantů byly
48
odpipetovány alikvoty 20 μl na stanovení proteinů. Post-mt supernatanty i alikvoty byly uloženy před dalším zpracováním do hlubokomrazicího boxu při teplotě -80 °C. 12.4.2 Příprava post-mt supernatantů jater, Harderových žláz, hnědé tukové tkáně, podkožní tukové tkáně a gonadální tukové tkáně Pomůcky a chemikálie chlazená centrifuga Janetzki K24 s úhlovým rotorem pro 12 kyvet, chlazená centrifuga Janetzki K23 s výkyvným rotorem se 4 držáky pro 16 kyvet, polystyrenová korýtka s ledem, malé nůžky, kopistky, parafilm, skleněná destička, homogenizátor teflon-sklo, sada automatických pipet Zásobní roztoky Izolační médium STE PIC 100 mmol.l-1 PMSF v isopropanolu 0,25 mol.l-1 sacharosa 0,5 mol.l-1 Tris-HCl pufr, pH=7,2 100 mmol.l-1 EDTA, pH=7,2
Postup Pro přípravu těchto post-mt supernatantů bylo použito taktéž STE médium. Z hlubokozmražených vzorků tkání bylo na digitálních váhách odváženo cca 0,5 g tkáně, která byla přenesena do homogenizátoru a následně k ní bylo přidáno STE médium o objemu rovnému čtyřnásobku hmotnosti tkáně. Tkáň byla za stálého chlazení zhomogenizována, homogenáty byly přelity do centrifugačních kyvet a byla provedena centrifugace po dobu 10 minut při 4 °C a 700 g na centrifuze Janetzki K23. Kalné supernatanty byly přelity do opět chlazených tenkostěnných kyvet a byla provedena druhá centrifugace na centrifuze K24 po dobu 10 minut při 4 °C a 12 000 g. Kalné post-mt supernatanty byly odebrány do nachlazených eppendorfek a byly z nich odpipetovány alikvoty 20 μl na stanovení celkového proteinu. Post-mt supernatanty i alikvoty byly uloženy před dalším zpracováním do hlubokomrazicího boxu při teplotě -80 °C.
49
12.5 STANOVENÍ
CELKOVÉ
KONCENTRACE
PROTEINŮ
BICINCHONINOVOU METODOU Koncentrace bílkovin ve frakcích homogenátů jednotlivých tkání byla stanovena za použití tzv. bicinchoninové metody, která je modifikací fotometrického stanovení celkové bílkoviny dle Lowryho. Měďnaté ionty v alkalickém prostředí katalyzují oxidaci hydroxylové skupiny tyrosylových zbytků v proteinu a samy se redukují na ionty měďné. Kyselina
bicinchoninová
(kyselina
2,2‘-bichinolin-4,4‘-dikarboxylová)
reaguje
se
vzniklými měďnými ionty a vytváří intenzivně fialově zbarvený komplex, který je velice stabilní, barevně stálý a který absorbuje při vlnové délce 562 nm. Optimální hodnota pH pro tuto reakci je 11,25.
Pomůcky a chemikálie spektrofotometr PharmaSpec UV-1700 (Shimadzu), skleněná semimikrokyveta Hellma 10x2x40 mm o objemu max. 800 μl, skleněná semimikrokyveta Beckmann 10x3x30 mm o objemu max. 900 μl, vyhřívané suché lázně Grant Boekel, vortex, eppendorfky 1,5 ml, pasteurka, sada automatických pipet se špičkami, opakovací pipeta s 5 ml nástavcem, skleněná pipeta 10 ml, polystyrenové korýtko s ledem Reakční činidla 1) roztok A: 1 % BCA-Na2 (dvojsodná sůl kyseliny 2,2´-bichinolin-4,4´-dikarboxylové) 2 % Na2CO3·10 H2O (p.a.) 0,16 % KOOCCH(OH)CH(OH)COONa·4 H2O 0,4 % NaOH (p.a.) 0,95 % NaHCO3 (p.a.) Vypočtené množství navážek jednotlivých látek, dle požadovaného objemu roztoku A, bylo rozpuštěno v destilované vodě. Roztok byl upraven přidáním koncentrovaného NaOH nebo pevného NaHCO3 na pH 11,25 a doplněn destilovanou vodou na požadovaný objem.
2) roztok B 4 % CuSO4·5 H2O (p.a.) Vypočtené množství síranu bylo rozpuštěno v destilované vodě a doplněno na konečný objem.
50
Roztoky A a B byly těsně před použitím smíchány v poměru 50:1 (vznikla reakční směs o intenzivně zeleném zbarvení).
Postup Před stanovením celkové bílkoviny ve vzorcích bylo potřeba zjistit kalibrační závislost na základě použitého standardu - hovězího sérového albuminu (BSA). Roztoky BSA obsahovaly 0 - 10 μg albuminu na zkumavku. Toto množství odpovídá rozmezí koncentrací proteinu 0 - 1 mg/ml. Stanovované vzorky byly podle typu tkáně, či buněčné frakce předředěny destilovanou vodou tak, aby množství proteinu v reakční směsi nabývalo hodnot v rámci kalibrační křivky. Stanovení obsahu proteinu v každém vzorku se provádělo v triplikátech, při různých konečných ředěních. Vzorky byly naneseny do mikrozkumavek v celkovém objemu 15 μl. Po přidání 300 μl reakční směsi, připravené smícháním roztoků A a B, byly směsi inkubovány v suchém vyhřívaném bloku při 37 °C po dobu 30 minut. Po inkubaci byly zkumavky přeneseny do ledu pro zastavení reakce a bezprostředně poté byla měřena absorbance světla o vlnové délce 562 nm. Z kalibrace byly odečteny hodnoty koncentrace celkové bílkoviny a po přepočtu na obsah celkové bílkoviny v neředěném vzorku byly hodnoty z triplikátů zprůměrovány.
12.6 STANOVENÍ KONCENTRACE HORMONŮ T3 A T4 METODOU RADIOIMUNOANALÝZY (RIA) Radioimunoanalytické stanovení thyroxinu resp. trijodothyroninu je imunochemická metoda jejímž principem je kompetice mezi radioaktivně značeným antigenem (Ag*) a neznačeným Ag ze séra o vazebná místa na monoklonální protilátce (Ab). Neznámé vzorky sér nebo hydrolyzátů a standardy se spolu s 125
125
I-thyroxinem resp.
I-trijodothyroninem inkubují ve zkumavkách potažených specifickou protilátkou proti
thyroxinu resp. trijodothyroninu. Po inkubaci se obsah zkumavek (volný Ag od Ag vázaného protilátkou) odsaje a určí se aktivita jedné nebo obou frakcí na gama-čítači. Koncentrace analytu v neznámém vzorku se určí z kalibrační závislosti sestrojené pomocí standardů. 12.6.1 Stanovení celkových frakcí T3 a T4 Ke stanovení koncentrací celkových frakcí TH (tT3, resp. tT4) byl použit komerční set firmy Immunotech (Beckman Coulter Company), který je určen pro měření hladin TH v 51
lidském séru. Fyziologické hodnoty, stanovené touto soupravou měřením hladiny TH u euthyroidních jedinců, se pohybují v rozmezí 1,2 - 2,8 nmol/l pro tT3 a 60 - 160 nmol/l pro tT4. Součástí této soupravy byly zkumavky potažené příslušnou monoklonální Ab, tracer (125I značený T3 resp. T4), lyofilizovaná kontrolní séra a příslušné standardní roztoky. Pro toto stanovení je nutné vytěsnit TH z vazby na plazmatické bílkoviny, což zajišťuje kyselina α-naftalensulfonová, která je součástí roztoku traceru. Provedení stanovení bylo následující: na dno zkumavky potažené Ab byl v množství uvedeném v návodu napipetován vzorek (standard, kontrolní sérum). Po následném napipetování traceru se směs nechala inkubovat při laboratorní teplotě 1 hodinu za intenzivního třepání (280 kmitů/min), kdy v průběhu dochází ke kompetici analytu a traceru o vazebná místa omezeného množství Ab vázané na zkumavce. Po inkubaci byla ze zkumavky odsána nenavázaná frakce roztoku zbylého traceru a dalších složek vzorku od vázaného Ag na Ab. Následně bylo provedeno měření aktivity, která je nepřímo úměrná množství analytu ve vzorku. 12.6.2 Stanovení volných frakcí T3 a T4 Ke stanovení koncentrací volných frakcí TH (fT3, resp. fT4) byl použit opět komerční set firmy Immunotech (Beckman Coulter Company). Uspořádání stanovení volných frakcí TH je založeno na stejném principu jako stanovení celkových frakcí TH, ale radioaktivně značena je nyní Ab a zkumavky jsou potažené analogem analytu (T3, resp. T4). Fyziologické hodnoty, stanovené tímto kitem měřením hladiny TH u euthyroidních osob, se pohybují v rozmezí 2,5 - 5,8 pmol/l pro fT3 a 11,5 - 23 pmol/l pro fT4. Volná frakce T3 Součástí setu pro stanovení fT3 byly zkumavky potažené analogem 3,5,3´-trijodo-Lthyroninu, monoklonální Ab proti T3 značená radionuklidem
125
I, standardní roztoky a
lyofilizovaná kontrolní séra. Na dno zkumavky potažené analogem T3 byl v množství uvedeném v návodu napipetován vzorek (standard, kontrolní sérum) a následně monoklonální značená Ab. V průběhu inkubace dochází ke kompetici volného T3 vzorku a ligandu. Po inkubaci byl obsah ze zkumavky odsán a bylo provedeno měření aktivity, která je nepřímo úměrná množství analytu ve vzorku. Volná frakce T4 Stanovení fT4 je založeno na složitějším principu, kdy je do systému přidán další amplifikující systém, kterým je biotin-avidin. Avidin má vysokou afinitu vůči molekule 52
biotinu, který může být konjugován k řadě biomolekul, včetně protilátek. V komerčním setu bylo uspořádání následující: zkumavky byly potažené avidinem, ligand (analog T4) byl biotinylován a tracerem byla monoklonální Ab proti T4 radioaktivně značená 125I. Další součástí kitu byly standardní roztoky a lyofilizovaná kontrolní séra. Na dno zkumavky potažené avidinem byl v množství uvedeném v návodu napipetován vzorek (standard, kontrolní sérum) a následně k němu byl přidán tracer a ihned poté biotinylovaný ligand. V průběhu inkubace dochází ke kompetici volného T4 ve vzorku a ligandu o vazebná místa na Ab - ta část Ab, která je vázána na ligand, se váže na stěnu zkumavky, neboť ligand je biotinylován. Po inkubaci byl obsah ze zkumavky odsán a bylo provedeno měření vázané aktivity, která je nepřímo úměrná množství analytu ve vzorku. Vlastní postup RIA stanovení Provedený postup a uspořádání zkumavek byl společný oběma frakcím TH. Inkubace reakční směsi byla prováděna při laboratorní teplotě, 1 hodinu za intenzivního třepání (frekvence 280 kmitů za minutu). Navázaná radioaktivita frakcí TH byla stanovena přístrojem Packard Cobra 5000. Tento gama-čítač obsahuje 5 identických scintilačních detektorů, které převádí ionizující záření na elektrický impuls dvoustupňovým procesem. Ionizující gama záření dopadající na detektor (monokrystal NaI) aktivovaný thaliem způsobuje uvolnění elektronů, které svým pohybem krystalem způsobují excitaci atomů. Při zpětném přechodu atomů z excitovaného stavu na základní energetickou hladinu dochází k emisi světla, které dopadá na světlocitlivou katodu fotonásobiče. Dopad fotonů způsobuje uvolnění fotoelektronů, které dopadají na dynodu a z ní vyráží sekundární elektrony. Výsledkem je takto amplifikovaný signál. Vyhodnocování kalibrační závislosti a odečtení koncentrace analytu je prováděno zabudovaným počítačovým programem.
12.7 STANOVENÍ JODOTHYRONIN DEJODASOVÉ AKTIVITY Princip stanovení enzymových aktivit jodothyronin dejodas je založen na enzymaticky katalyzované konverzi radioaktivně značeného substrátu na radioaktivně značené produkty a měření radioaktivity produktů po jejich kvantitativní separaci (Pavelka, 2010a). K oddělení produktů enzymatické reakce od nadbytku nepřeměněného substrátu byla použita tenkovrstvá chromatografie s použitím silikagelových TLC desek s následnou kvantifikací pomocí radiografické detekce (Pavelka, 2010b).
53
Pomůcky a chemikálie silikonované špičky a eppendorfky, sada automatických pipet, opakovací pipeta s 0,5 ml nástavci, polystyrenová korýtka s ledem, vyhřívané suché lázně Grant Boekel, stolní centrifuga na mikrozkumavky, tenkovrstevné chromatografické (TLC) silikagelové desky Merck, skleněné kyvety na vyvíjení chromatogramů, tenká polyethylenová fólie, „storage phosphor screens“ desky, kazety Molecular Dynamics, laserový scanner PhosphorImager SF 12.7.1 Stanovení enzymové aktivity jodothyronin dejodasy typu 1 Substrátem tohoto isoenzymu je L-3,3´,5´-[125I]-trijodothyronin. Produkty štěpení této enzymatické reakce jsou radioaktivní jodid a radioaktivní L-3,3‘-[125I]-dijodothyronin. Reakční směs (konečné koncentrace): • 100 mmol.l-1 Na-fosfátový pufr + 1 mmol.l-1 EDTA, pH 7,0 • 10 mmol.l-1 DTT (dithiothreitol) • 100 nmol.l-1 rT3 s přídavkem cca. 50 000 cpm *rT3 Tabulka III: Příprava premixu pro stanovení D1 Zásobní roztok 500 mM DTT 10 μM rT3
Objem na 1 zk* (µl) 0,8 0,4
Koncentrace látky v premixu 20 mM 200 nM
3,6 x10-7 M *rT3 0,14 ~ 1 kBq *Doplněno na objem 20 μl (premix na jednu reakční zkumavku) 100 mmol.l-1 Na-fosfátovým pufrem + 1 mmol.l-1 EDTA, pH=7,0 12.7.2 Stanovení enzymové aktivity jodothyronin dejodasy typu 2 Substrátem toho isoenzymu je L-3,3´,5,5´-[125I]-thyroxin. Produktem štěpení je radioaktivní jodid a radioaktivní L-3,3‘,5-[125I]-trijodothyronin. Reakční směs (konečné koncentrace): • 100 mmol.l-1 Na-fosfátový pufr + 1 mmol.l-1 EDTA, pH 7,0 • 20 mmol.l-1 DTT • 1 mmol.l-1 PTU • 1 µmol.l-1 T3 • 2 nmol.l-1 T4 s přídavkem cca. 50 000 cpm *T4 54
Tabulka IV: Příprava premixu pro stanovení D2 Objem na 1 zk*
Zásobní roztok
Koncentrace látky v premixu
500 mM DTT 100 mM PTU
(µl) 1,6 0,4
40 mM 2 mM
100 µM T3
0,4
2 µM
0,1 μM T4
0,45
4 nM
3,3x10-7 M *T4
0,1
~ 1 kBq
*Doplněno na objem 20 μl (premix na jednu reakční zkumavku) 100 mmol.l-1 Nafosfátovým pufrem + 1 mmol.l-1 EDTA, pH=7,0 12.7.3 Stanovení enzymové aktivity jodothyronin dejodasy typu 3 Substrátem toho isoenzymu je L-3,3´,5-[125I]-trijodothyronin. Produktem štěpení je neradioaktivní jodid a radioaktivní L-3,3‘-[125I]-dijodothyronin. Reakční směs (konečná koncentrace): • 100 mmol.l-1 Na-fosfátový pufr + 1 mmol.l-1 EDTA, pH 7,6 • 40 mmol.l-1 DTT • 1 mmol.l-1 PTU • 8 nmol.l-1 T3 s přídavkem cca. 50 000 cpm *T3 Tabulka V: Příprava premixu pro stanovení D3 Zásobní roztok 500 mM DTT 100 mM PTU 0,1 μM T3
Objem na 1 zk* (µl) 3,2 0,4 0,236
Koncentrace látky v premixu* 80 mM 2 mM 16 nM
4,4x10-7 M *T3 0,19 ~ 1 kBq *Doplněno na objem 20 μl (premix na jednu reakční zkumavku) 100 mmol.l-1 Na-fosfátovým pufrem + 1 mmol.l-1 EDTA, pH=7,6 Pracovní roztoky společné pro stanovení všech isoenzymů STOP-mix:
10 μmol.l-1 T3 + 10 μmol.l-1 T4 v koncentrovaném amoniaku
Extrakční směs:
99 objemových dílů methanolu + 1 objemový díl koncentrovaného amoniaku
Vyvíjecí směs:
chloroform:methanol:koncentrovaný amoniak (40:20:3) 55
Postup provedení stanovení enzymové aktivity Enzymová aktivita dejodas se stanovovala ve frakcích post-mt supernatantů. Všechny jednotlivé kroky postupu bylo nutné provést na polystyrenovém korýtku s ledem. Ve vzorku se obsah proteinu pohyboval v rozmezí 1–300 μg proteinu na zkumavku a lišil se podle typu tkáně. Nejdříve byly připraveny všechny zásobní a pracovní roztoky, premix a reakční směsi. Do reakčních mikrozkumavek bylo napipetováno po 20 μl vzorků post-mt supernatantů a rychlým přidáním 20 μl alikvotů premixu byla reakce nastartována. Vzorky byly inkubovány 30 minut (event. vyjímečně 60 minut) při 37 °C v suchém vyhřívaném bloku. Ke každému vzorku byl připraven blank se stejným složením reakční směsi, který byl inkubován po stejnou dobu při 0 °C. Po uplynutí inkubační doby byly vzorky uloženy zpět do ledu. Enzymová reakce, jak u vzorků, tak u blanků byla zastavena přidáním 10 µl STOP-mixu. Nadbytek T3 a T4 způsobí inhibici enzymu a koncentrovaný amoniak je denaturační činidlo pro veškeré proteiny. Ihned po přidání STOP mixu bylo do zkumavek přidáno 30 µl extrakční směsi. Eppendorfky byly důkladně zvortexovány a vysrážené proteiny ve směsi byly sedimentovány pomocí centrifugace. Poté bylo na komerční TLC desky do předem označených startovních míst naneseno vždy 3 x 2,7 μl supernatantu a pomocí tenkovrstevné chromatografie byly separovány jednotlivé produkty reakce. Vyvíjení chromatogramu trvalo cca 80 minut. 12.7.4 Principy vyhodnocování radiochromatogramů Po oddělení produktů od nespotřebovaných substrátů tenkovrstevnou chromatografií bylo vyhodnocováno rozložení radioaktivity mezi jednotlivými značenými sloučeninami. Za tímto účelem byla využita metoda bezfilmové autoradiografie s využitím „strorage phosphor“ desek (Imaging Plate, FUJIFILM, BAS-MS 2025) s vrstvou mikrokrystalického BaFBr, aktivovaného Eu2+. V reakci na γ−záření produkované radioaktivní látkou dochází k excitaci elektronů v Eu2+, jejich vyražení z elektronového obalu a k zachycení v krystalové mřížce BaFBr. Eu 2+ se tak oxiduje na Eu3+. Ve „storage phospohor“ desce se vytváří časově stabilní latentní obraz plošného rozložení radioaktivity na původní TLC desce. Poté se po potřebné době k expozici deska s latentním obrazem vložila do laserového scanneru PhosphorImager SF, kde je deska ozařována laserovým paprskem o vlnové délce 600 nm, což způsobí uvolnění elektronů zachycených na BaFBr a převedení europia z oxidačního stavu Eu3+ na excitovanou formu Eu2+*. Elektrony vzniklého excitovaného stavu Eu2+* při přechodu na základní energetickou hladinu vyzáří modré světlo, které je snímané vláknovou optikou. Optický signál je poté zesílen fotonásobičem a zaznamenán. 56
Citlivost této metody je oproti klasické filmové radiografii mnohonásobně (až 250x) vyšší při významně zkráceném čase expozice. Další výhodnou vlastností „storage phospor“ folií je možnost jejich opakovaného použití, protože exponovaný obraz je možné snadno a rychle odstranit pouhým ozářením intenzivním bílým světlem, neboť tím dojde k vymazání naexponovaného obrazu. K počítačovému vyhodnocení získaných výstupů se použil speciální grafický program AIDA (Raytest, NSR), který rozlišuje až 256 stupňů zčernání, čímž umožňuje velice přesnou kvantifikaci jednotlivých skvrn na radiochromatogramu.
57
13. VÝSLEDKY A DISKUSE 13.1 STANOVENÍ
CELKOVÉHO
BICINCHONINOVOU
METODOU
OBSAHU V
POST -MT
PROTE INU FRAKCÍCH
TKÁNÍ POT KANA Obsah celkového proteinu ve vzorcích post-mt supernatantů, vyizolovaných z odebraných tkání, bylo nutné stanovit pro výpočet specifických enzymových aktivit dejodas. Stanovení se provádělo fotometricky bicinchoninovou metodou ve všech odebraných tkáních a bylo vyhodnoceno pomocí předem nadefinované šablony. Jako ukázka vyhodnocení stanovení koncentrace bílkovin je následující protokol (Obr. 21).
Obr. 21: Ukázka šablony vyhodnocení stanovení celkové bílkoviny v post-mt frakci Harderových žláz pro vzorky číslo 25, 26 a 27 bicinchoninovou metodou
58
13.2 STANOVENÍ THYREOIDÁLNÍHO STAVU 13.2.1 Změny anatomických parametrů v závislosti na thyreoidálním stavu a dietě Vzhledem ke změnám způsobeným podáváním různých farmak bylo před vlastními biochemickými analýzami prováděno pozorování pokusných zvířat in vivo. Protože víme, že při zvýšené koncentraci TH dochází ke zrychlení srdeční akce a nárůstu srdeční hmoty, byla post mortem srdce odebrána a zvážena. K posouzení thyreoidálního stavu experimentálních zvířat byly taktéž odebrány štítné žlázy, jejichž zvětšení kompenzuje hypothyreoidální stav zvířat. V Tab. VI a Tab. VII jsou shrnuty průměrné hodnoty sledovaných anatomických parametrů (průměr ± SD) u jednotlivých skupin zvířat podle farmakologického ovlivnění z experimentů STAT 13/1 a PUFA 13/2. Je zde uvedena tělesná hmotnost potkanů na konci experimentu a absolutní a relativní hmotnosti štítné žlázy a srdce. Tabulka VI: Souhrn sledovaných anatomických parametrů u jednotlivých skupin zvířat podle farmakologického ovlivnění z experimentu STAT 13/1 Tělesná hmotnost
Štítná žláza
Srdce
Skupina
Absolutní (g)
Absolutní (mg)
Relativní (mg/g)
Absolutní (mg)
Relativní (mg/g)
EU
408 ± 225
25 ± 8
0,07 ± 0,02
1 302 ± 408
3,6 ± 1,4
STAT
387 ± 185
25 ± 10
0,07 ± 0,01
1 233 ± 470
3,3 ± 0,6
RPO
390 ± 170
26 ± 10
0,07 ± 0,02
1 227 ± 361
3,3 ± 0,7
STAT+RPO
430 ± 290
23 ± 8
0,06 ± 0,03
1277 ± 433
3,3 ± 0,9
Tabulka VII: Souhrn sledovaných anatomických parametrů u jednotlivých skupin zvířat podle farmakologického ovlivnění z experimentu PUFA 13/2 Tělesná hmotnost
Štítná žláza
Srdce
Skupina
Absolutní (g)
Absolutní (mg)
Relativní (mg/g)
Absolutní (mg)
Relativní (mg/g)
EU
354 ± 100
28 ± 10
0,08 ± 0,03
1 234 ± 331
3,6 ± 0,7
EU+PUFA
328 ± 92
34 ±17
0,11 ± 0,05
1 195 ± 369
3,7 ± 0,7
HY
330 ± 89
68 ± 26
0,21 ± 0,07
991 ± 222
3,1 ± 0,8
HY+PUFA
294 ± 85
59 ± 31
0,20 ± 0,09
845 ± 204
3,0 ± 0,6
TH
299 ± 81
20 ± 9
0,07 ± 0,02
1 529 ± 424
5,2 ± 1,1
TH+PUFA
292 ± 61
22 ± 11
0,08 ± 0,03
1 542 ± 312
5,4 ± 1,3
59
Grafy 1 a 2 ilustrují absolutní tělesnou hmotnost potkanů v závislosti na farmakologickém ovlivnění a na jejich thyreoidálním stavu. U potkanů z experimentu STAT 13/1, u kterých nebyl thyreoidální stav ovlivněn, je tělesná hmotnost mírně snížena u skupin STAT a RPO (cca o 5 %). Naopak kombinace přídavků RPO a STAT způsobila cca 5 % zvýšení tělesné hmotnosti. Zvířatům z experimentu PUFA 13/2 byl navozen různý thyreoidální stav. Aplikované vysoké dávky thyreoidálních hormonů se u zvířat projevily zvýšenou noční i denní aktivitou a agresivnějším chováním oproti skupině kontrolní, proto bylo u hyperthyreoidálních jedinců zaznamenáno očekávané snížení tělesné hmotnosti. Jedincům, kterým byl podáván methimazol, se oproti očekávání tělesná hmotnost rovněž snížila, o cca 7 % ve srovnání se skupinou kontrolních zvířat. Podáváním n-3 PUFA nebyl u žádné skupiny prokázán měřitelný vliv na tělesnou hmotnost potkanů.
Graf 1 a 2: Průměrné hodnoty absolutní tělesné hmotnosti (B. W.) potkanů, v závislosti na farmakologickém ovlivnění Grafy 3 a 4 znázorňují průměrné absolutní a relativní hmotnosti GT v závislosti na podávané dietě u zvířat v experimentu PUFA 13/2. Je patrné, že štítné žlázy hypothyreoidálních jedinců hypertrofovaly a u hyperthyreoidálních zvířat byly hodnoty hmotnosti štítných žláz sníženy. Ukazatelem hypothyreoidálního stavu je očekávaný nárůst hmotnosti štítných žláz, který kompenzuje nedostatek thyreoidálních hormonů, ukazatelem hyperthyreoidálního stavu je demonstrované snížení hmotnosti štítných žláz. n-3 PUFA mají u skupiny HY+PUFA tendenci snižovat absolutní i relativní hmotnost GT a u skupiny TH+PUFA májí naopak tendenci je mírně zvyšovat. I takovéto malé změny mohou vést k závěru, že n-3 PUFA mají pozitivní vliv na potlačení negativních změn, vyvolaných experimentálně navozenými změnami thyreoidálního stavu.
60
Graf 3 a 4: Průměrné hodnoty absolutní a relativní hmotnosti štítných žláz, v závislosti na farmakologickém ovlivnění u zvířat v experimentu PUFA 13/2
K dalšímu posouzení správného navození hypo-, resp. hyperthyreoidálního stavu potkanů v experimentu PUFA 13/2 sloužilo i stanovení parametrů srdce (H). Grafy 5 a 6 znázorňují průměrné absolutní a relativní hmotnosti H v závislosti na farmakologickém ovlivnění. U potkanů s vysokými dávkami TH dochází k výraznému zvýšení hmotnosti srdcí, protože hyperthyreoidální jedinci se nárůstem srdeční hmoty přizpůsobují zvýšené srdeční aktivitě. U zvířat ovlivněných methimazolem se tyto hmotnosti naopak snižují ve srovnání s kontrolní skupinou. Tyto změny jsou charakteristické pro hypo-, resp. hyperthyreoidální stav. Rozdíly absolutních i relativních hmotností H mezi zvířaty krmenými dietou bez n-3 PUFA a s n-3 PUFA nejsou významné.
Graf 5 a 6: Průměrné hodnoty absolutní a relativní hmotnosti srdce, v závislosti na farmakologickém ovlivnění u zvířat v experimentu PUFA 13/2
61
Výhodou provádění experimentů na zvířatech je možnost in vivo sledování vlivu podávaných farmak již v průběhu experimentu. U potkanů v experimentu STAT 13/1, u kterých nebyl experimentálně navozen různý thyreoidální stav, nebyly pozorovány výrazné změny chování či změny absolutní tělesné hmotnosti pokusných zvířat způsobené podávanými farmaky (Graf 1). Naopak u zvířat v experimentu PUFA 13/2, u kterých byly navozeny suprafyziologické hodnoty TH, které mají vliv především na štítnou žlázu a kardiovaskulární systém, byly výrazné změny potvrzeny. Správné dávkování TH a methimazolu pro navození hyper-, resp. hypothyreoidálního stavu jsme zvolili na základě předešlých experimentů a upravili v průběhu experimentu na hodnoty, které nebyly pro experimentální zvířata letální a zároveň zaručovaly správné navození hyperthyreoidálního stavu. Příslušný experimentálně navozený thyreoidální stav jsme potvrdili sledováním vhodných parametrů (absolutní a relativní hmotnosti štítné žlázy a srdce), které jsme porovnali s hodnotami zjištěnými u kontrolních skupin. Průměrná hodnota absolutní i relativní hmotnosti srdce byla signifikantně zvýšena u skupiny TH oproti kontrolní skupině (absolutní hmotnost cca o 20 %, relativní hmotnost cca o 30 %), pravděpodobně jako důsledek zvýšené srdeční aktivity. Skupina ovlivněná methimazolem (HY) měla naopak sníženou relativní i absolutní hmotnost srdce cca o 20 % oproti kontrole (Graf 5 a 6). Pozitivní vliv n-3 PUFA na hmotnost srdce při různých thyreoidálních stavech nebyl přímo prokázán. Nicméně v některých studiích byly příznivé účinky n-3 PUFA na funkci srdce prokázány (Radosinska et al., 2013). K dalším anatomickým parametrům popisujícím thyreoidální stav patří absolutní a relativní hmotnost štítné žlázy. Hladina TH v krvi ovlivňuje funkci štítné žlázy, podstatným snížením této hladiny dochází ke zvýšení činnosti štítné žlázy za účelem vyrovnání nedostatku TH a naopak vysoká hladina TH v krvi vede k utlumení funkce štítné žlázy. Obecně
platí,
že
štítná
žláza
je
u
hypothyreoidálních
jedinců
zvětšena
a
u hyperthyreoidálních jedinců zmenšena. Tyto změny anatomických parametrů štítné žlázy byly potvrzeny i v našem případě (Graf 3 a 4), relativní i absolutní hmotnosti štítné žlázy byly u hypothyreoidálních potkanů zvýšeny a u hyperthyreoidálních sníženy ve srovnání s kontrolní skupinou. U potkanů ze skupin HY+PUFA a TH+PUFA byl zjištěn mírný příznivý vliv podávání n-3 PUFA. Byly zaznamenány menší změny v absolutní i relativní hmotnosti štítné žlázy – snížení absolutní i relativní hmotnosti štítné žlázy u skupiny HY+PUFA a zvýšení u skupiny TH+PUFA. Výše uvedené anatomické parametry jsou v souladu s literárními údaji (Soukup et al., 2000). 62
13.2.2 RIA stanovení celkových a volných frakcí TH v sérech potkanů Stanovení sérových hladin thyreoidálních hormonů bylo rozhodujícím kritériem pro posouzení dosaženého thyreoidálního stavu experimentálních zvířat. Pro zjištění thyreoidálního stavu jedinců byly metodou radioimunoanalýzy s použitím komerčních RIA souprav stanoveny koncentrace celkových i volných frakcí thyreoidálních hormonů v krevním séru všech pokusných zvířat v experimentech STAT 13/1 a PUFA 13/2. Dále jsou uvedeny pro ilustraci jen některé reprezentativní výsledky RIA stanovení. Stanovení sérové koncentrace volného T3 a T4 u zvířat v experimentu STAT 13/1 Sérové koncentrace volného trijodothyroninu a volného thyroxinu lépe zobrazují skutečný thyreoidální stav než celkové hodnoty těchto hormonů, protože se jedná o aktivní formu TH vykonávající příslušné regulační funkce. Průměry naměřených hodnot sérové koncentrace volného T3 a T4, včetně směrodatných odchylek u všech skupin pokusných zvířat v experimentu STAT 13/1, jsou uvedeny v tabulce Tab. VIII. Grafy 7 a 8 ilustrují koncentrace volných frakcí trijodothyroninu a thyroxinu v závislosti na farmakologickém ovlivnění zvířat v experimentu STAT 13/1. Tabulka VIII: Průměrné hodnoty ± SD sérových koncentrací volného trijodothyroninu a volného thyroxinu u jednotlivých skupin zvířat v experimentu STAT 13/1
skupina
n
fT3 (pmol/l)
fT4 (pmol/l)
EU
9
12,2 ± 2,4
21,1 ± 4,4
STAT
5
8,6 ± 1,6
18,1 ± 4,1
RPO
14
11,2 ± 3,3
20,2 ± 4,0
STAT+RPO
12
9,3 ± 1,7
19,3 ± 3,1
63
Graf 7: Sérová koncentrace volného trijodothyroninu, v závislosti na farmakologickém ovlivnění zvířat v experimentu STAT 13/1
Graf 8: Sérová koncentrace volného thyroxinu, v závislosti na farmakologickém ovlivnění zvířat v experimentu STAT 13/1 Fyziologické hodnoty u euthyreoidálních osob se pohybují v rozmezí 2,5 - 5,8 pmol/l pro fT3 a 11,5 - 23 pmol/l pro fT4. Stanovením sérových koncentrací volného trijodothyroninu a thyroxinu u potkanů s experimentálně nenavozenými suprafyziologickými hodnotami TH jsme chtěli prokázat neovlivnění jejich thyreoidálního stavu samotnými podávanými farmaky. Z naměřených výsledků je patrné, že průměrné hodnoty fT3 u všech skupin jsou nad hranicí fyziologických hodnot u lidí. Máme však praktickou zkušenost, že při použití RIA setu určeného pro stanovení fT3 v lidských sérech se v sérech potkanů vždy naměří vyšší hodnoty. Proto nejsou důležité absolutní naměřené hodnoty fT3, ale relace mezi jednotlivými experimentálními skupinami. Průměrné naměřené hodnoty fT4 se pohybují v rozmezí fyziologických hodnot u lidí. Rozdíly průměrných hodnot fT3 a fT4 mezi jednotlivými experimentálními skupinami nejsou signifikantní, z čehož lze usuzovat, že samotná podávaná farmaka nevykazují tendenci ovlivňovat thyreoidální stav potkanů. 64
Stanovení sérové koncentrace celkového T3 a T4 u zvířat v experimentu PUFA 13/2 Cílem stanovení celkového trijodothyroninu a celkového thyroxinu v sérech pokusných potkanů z experimentu PUFA 13/2 bylo prokázat hyperthyreoidální stav u skupin s vysokými dávkami TH a hypothyreoidální stav u skupin, kterým byl podáván methimazol. Naměřené hodnoty sérové koncentrace celkového T3 a T4 jsme v experimentu PUFA 13/2 porovnávali podle kmenů (Wistar Kyoto a SHR) a pohlaví potkanů. Průměry naměřených hodnot sérové koncentrace celkového T3 a T4, včetně směrodatných odchylek u všech skupin pokusných zvířat z experimentu PUFA 13/2, jsou uvedeny v tabulce Tab. IX. Grafy 9 a 10 zobrazují koncentrace celkového trijodothyroninu u samců (M) potkanů kmene Wistar Kyoto a SHR, v závislosti na farmakologickém ovlivnění pro experiment PUFA 13/2 a Grafy 11 a 12 ilustrují koncentrace celkového thyroxinu u samic (F) potkanů kmene Wistar Kyoto a SHR, v závislosti na farmakologickém ovlivnění pro experiment PUFA 13/2. Tabulka IX: Průměrné hodnoty ± SD sérových koncentrací celkového trijodothyroninu a celkového thyroxinu u jednotlivých skupin zvířat v experimentu PUFA 13/2
65
Graf 9 a 10: Sérová koncentrace celkového trijodothyroninu u samců potkanů kmenů Wistar Kyoto a SHR, v závislosti na farmakologickém ovlivnění zvířat v experimentu PUFA 13/2
Graf 11 a 12: Sérová koncentrace celkového thyroxinu u samic potkanů kmenů Wistar Kyoto a SHR, v závislosti na farmakologickém ovlivnění zvířat v experimentu PUFA 13/2 Fyziologické hodnoty u euthyreoidálních osob se pohybují v rozmezí 1,2 – 2,8 nmol/l pro tT3 a 60 – 160 nmol/l pro tT4. U kontrolních (EU) skupin zvířat obou pohlaví a obou kmenů byla naměřena sérová koncentrace tT3 průměrně 0,8 nmol/l, což je pod rozmezím fyziologických hodnot pro lidi. Sérová koncentrace tT4 u EU samců obou kmenů byla naměřena průměrně kolem 60 nmol/l, což je na hranici fyziologických hodnot, ale u EU samic byly hodnoty pod hranicí fyziologických hodnot u lidí. Stejně jako v případě stanovení fT3 však platí, že nejsou směrodatné absolutní naměřené hodnoty, ale relace mezi jednotlivými experimentálními skupinami potkanů. Jak je patrné z grafů (Graf 9, Graf 10, Graf 11, Graf 12), podávání thyreoidálních hormonů způsobilo zvýšení celkového T3 i T4 oproti kontrolním skupinám. U skupiny TH (hyperthyreoidální) byl zaznamenán nárůst koncentrací celkového T3 a T4 o cca 100 %, což je podle našich očekávání a potvrzuje to, že zvolené dávkování podávaných TH bylo správné. Pro 66
navození hypothyreoidálního stavu (HY) byl zvířatům podáván methimazol, který snižuje hladinu TH inhibicí thyreoidální peroxidasy. U skupin zvířat, kterým byl podáván methimazol, byla naměřena koncentrace tT3 a tT4 dosahující v průměru pouze cca 40 % hodnot kontrolních skupin, což opět odpovídá očekávaným výsledkům. Naměřené výsledky stanovení celkových koncentrací thyreoidálních hormonů jsou ve shodě s obdobnými předchozími experimenty (Soukup et al., 2000). n-3 PUFA podávané jednotlivým skupinám zvířat (skupiny: EU+PUFA, HY+PUFA a TH+PUFA) ve srovnání se skupinami bez n-3 PUFA (skupiny: EU, HY a TH) vykazují stejnou tendenci ovlivňovat hladinu jak tT3, tak tT4. n-3 PUFA způsobují u zvířat ze skupin EU+PUFA zvýšení koncentrace celkových T3 a T4 oproti kontrole (EU), u zvířat ze skupin HY+PUFA mírné snížení koncentrace celkových T3 a T4, s výjimkou mírného zvýšení koncentrace tT4 u potkanů kmene SHR, ve srovnání se skupinou HY. U potkanů ze skupin TH+PUFA způsobují n-3 PUFA výrazné snížení koncentrace tT3 a tT4 oproti skupinám TH. Podávání n-3 PUFA tedy podle naměřených výsledků vykazuje pozitivní vliv na změnu hodnot celkového T3 i T4 u jedinců s navozeným hyperthyreoidálním stavem, ale u hypothyreoidálního stavu pozitivní vliv potvrzen nebyl.
67
13.3 STANO VEN Í S PE CI FI CKÉ E NZYMOVÉ AKT IVITY DEJO DAS JODOTHYRONINŮ V ODLIŠNÝCH TKÁNÍCH POTKANA Specifické enzymové aktivity jodothyronin dejodas D1, D2 a D3 byly stanoveny ve vzorcích post-mt supernatantů připravených z různých tkání experimentálních zvířat, se zvláštním zřetelem na Harderovy žlázy, pomocí na pracovišti zavedených, vysoce citlivých radiometrických metod využívajících TLC, která umožňuje oddělení produktů enzymové reakce
od
nespotřebovaného
substrátu
(Pavelka,
2010a).
Elektronické
obrazy
radiochromatogramů, získané expozicí TLC desek na „storage phospor“ fólie, byly vyhodnoceny pomocí speciálního softwaru AIDA. Tento program mimo jiné umožňuje ohraničení skvrn na radiochromatogramu a stanovení hodnoty intenzity jejich průměrného zčernání. Od hodnoty intenzity skvrn je pak automaticky odečítána hodnota námi definovaného pozadí, což umožní eliminovat artefakty vzniklé neenzymatickým rozkladem radiopreparátu. Výsledná hodnota intenzity průměrného zčernání izolované skvrny zmenšená o hodnotu definovaného pozadí je plošně zintegrována a takto získaná data je možné exportovat do MS Excelu. Pomocí předem definovaných šablon, zohledňujících ředění vzorků, obsah proteinu a hodnoty blanků, lze vypočítat specifickou enzymovou aktivitu dejodas v jednotkách fmol T2/h/mg pro D1 a D3, resp. fmol T3/h/mg pro D2. 13.3.1 Stanovení specifické enzymové aktivity jodothyronin dejodasy D1
Obr. 22: Nevyhodnocený radiochromatogram získaný při stanovení aktivity D1 ve vzorcích GT
68
Obr. 23: Vyhodnocený radiochromatogram získaný při stanovení aktivity D1 ve vzorcích GT
Na Obr. 22 jsou vidět v jednotlivých liniích skvrny dokonale odseparovaných radioaktivně značených produktů enzymové reakce (T2* a I-*) od nespotřebovaného radioaktivně značeného substrátu (rT3*). Obr 23 je shodný z předchozím radiochromatogramem ovšem vyhodnocený pomocí softwaru AIDA. V prvních pěti drahách jsou naneseny alikvoty reakčních směsí, které obsahují post-mt frakce štítné žlázy (sup GT 122-126), ředěné 150x, inkubované při 37 °C po dobu 30 minut. V šesté linii je pufr, u něhož je konverze substrátu na produkt téměř nulová. Slouží jako negativní kontrola. V drahách 7 - 12 jsou naneseny příslušné blanky (b sup GT 122-126), tedy stejné vzorky v reakční směsi, ale inkubované po dobu 30 minut při 0 °C. Dále na Obr. 23 vidíme definovanou plochu pozadí (označeno číslem 37).
69
Tabulka X: Výsledná tabulka s hodnotami integrálů jednotlivých ohraničených ploch radiochromatogramu (viz Obr. 23) vygenerovaná softwarem AIDA
Vygenerování
výsledných
hodnot
integrálů
jednotlivých
ohraničených
ploch
radiochromatogramu softwarem AIDA zobrazuje Tabulka X. Tyto hodnoty se převádí v MS Excel do šablony pro vyhodnocení dejodas, kterou lze vidět na Obr. 24. V této šabloně jsou uváděny veškeré hodnoty potřebné pro výpočet specifické enzymové aktivity a jednotlivá označení vzorků. V kolonce vzorek je název vzorku a jeho bližší specifikace, v kolonce ředění je uveden násobek předředění původních vyizolovaných vzorků. Pod symbolem # jsou v tabulce uvedena čísla skvrn na chromatogramu přidělená při jejich kvantifikaci programem AIDA. V kolonce integrálů jsou uvedeny hodnoty integrované plošné intenzity pro vzorky a jim odpovídající blanky. Dále je u vzorku uvedeno vypočtené procento konverze působením v něm obsažené D1, stejně tak i u blanku. Ve sloupci protein jsou udávány naměřené hodnoty celkového proteinu ve vzorku ve dvojích jednotkách, a to v mg/ml a µg/zkumavku. Vypočítaná specifická aktivita enzymu je udávána v jednotkách fmol T2/h/mg proteinu. V hlavičce tabulky jsou uváděny informace o experimentu, jeho provedení a vyhodnocení.
70
Obr. 24: Šablona pro vyhodnocování specifické enzymové aktivity jodothyronin dejodasy typu 1
13.3.1.1 Výsledky stanovení enzymové aktivity jodothyronin dejodasy D1 u zvířat v experiment STAT 13/1 Enzymové aktivity jodothyronin dejodasy D1 byly vyhodnocovány pro jednotlivé skupiny zvířat dle jejich farmakologického ovlivnění v závilosti na druhu potkanů a jejich pohlaví. V tabulce Tab. XI jsou jako příklad uvedeny průměrné hodnoty výsledků stanovení specifické enzymové aktivity jodothyronin dejodasy D1, včetně směrodatných odchylek, měřené v post-mt frakcích štítných žláz samic potkanů kmene Wistar, které představují nejvyšší naměřené aktivity tohoto enzymu. U vzorků dalších tkání byla specifická aktivita D1 mnohonásobně nižší. Tabulka XI: Průměrná specifická enzymová aktivita jodothyronin dejodasy D1 (fmol T2/h/mg) v post-mt frakcích štítných žláz samic potkanů kmene Wistar skupina EU STATIN RPO STATIN+RPO
n
průměrná s. a. ± SD
2
671 560 ± 115 140
2
1 013 400 ± 76 070
2
529 620 ± 35 990
1
181 460
71
Graf 13 přehledně znázorňuje výsledky z tabulky Tab. XI. Jednotlivé sloupce představují průměrné hodnoty dejodasové aktivity v závislosti na ovlivnění potkanů podáváním statinů (STAT), červeného palmového oleje (RPO) a jejich kombinace (STAT + RPO). EU označuje kontrolní skupinu zvířat bez farmakologického ovlivnění.
Graf 13: Specifická enzymová aktivita jodothyronin dejodasy D1 v post-mt frakcích štítných žláž samic potkanů kmene Wistar, v závisloti na farmakologickém ovlivnění Ve srovnání s kontrolní skupinou (EU) byla specifická aktivita jodothyronin dejodasy D1 zvýšená u skupiny potkanů ovlivněných podáváním statinů (STAT). Podáváním červeného palmového oleje (RPO) byla tato aktivita naopak snížena, stejně tak jako v případě kombinace těchto dvou farmak.
13.3.1.2 Výsledky stanovení enzymové aktivity jodothyronin dejodasy D1 u zvířat v experiment PUFA 13/2 Enzymové aktivity jodothyronin dejodasy D1 byly vyhodnocovány obdobně jako v experimentu STAT 13/1 v závilosti na druhu potkanů a jejich pohlaví. Nejvyšší aktivity D1 byly naměřeny v játrech a štítných žlázách. V post-mt supernatantech dalších tkání byly naměřeny mnohonásobně nižší D1 dejodasové aktivity. Některé výsledky jsou jako příklady demonstrovány v tabulkách Tab. XII a Tab. XIII. Jsou zde souhrně uvedeny průměrné hodnoty specifické enzymové aktivity jodothyronin dejodasy D1, včetně směrodatných odchylek, měřené v post-mt frakcích štítných žláz samců potkanů kmene SHR (Tab. XII) a průměrné hodnoty specifické enzymové aktivity jodothyronin dejodasy D1, včetně směrodatných odchylek, měřené v post-mt frakcích Harderových žláz samic potkanů kmene Wistar Kyoto (Tab. XIII). 72
Tabulka XII: Průměrná specifická enzymová aktivita jodothyronin dejodasy D1 (fmol T2/h/mg) v post-mt frakcích štítných žláz samců potkanů kmene SHR skupina EU EU+PUFA
n
průměrná s. a. ± SD
7
768 800 ± 330 550
9
1 300 710 ± 825 090
HY
5
2 390 880 ± 818 710
HY+PUFA
5
1 785 170 ± 541 890
TH
6
79 320 ± 17 080
TH+PUFA
3
163 070 ± 27 060
Tabulka XIII: Průměrná specifická enzymová aktivita jodothyronin dejodasy D1 (fmol T2/h/mg) v post-mt frakcích Harderových žláz samic potkanů kmene Wistar Kyoto n
průměrná s. a. ± SD
5
3 635 ± 1 638
EU+PUFA
6
2 339 ± 1 581
HY
6
2 116 ± 1 358
HY+PUFA
2
3 048 ± 965
TH
5
3 310 ± 1 784
TH+PUFA
5
3 334 ± 653
skupina EU
V grafu Graf 14 jsou přehledně znázorněny výsledky z tabulky Tab. XII. EU označuje euthyreoidální zvířata (kontrolní skupina bez farmakologického ovlivnění), HY hypothyreoidální (skupina ovlivněná methimazolem) a TH hyperthyreoidální (skupina ovlivněná podáváním hormonů T3 a T4), + PUFA značí skupiny, které byly navíc ovlivněny i podáváním n-3 PUFA. Ve srovnání s kontrolní skupinou (EU) je průměrná hodnota specifické aktivity D1 ve štítné žláze u skupiny hypothyreoidálních (HY) zvířat zvýšená a u skupiny hyperthyreoidálních (TH) potkanů naopak snížená. Tyto relace jsou opačné ve srovnání s hodnotami specifické aktivity D1 ve všech ostatních tkáních. Dejodasa D1 totiž vykazuje ve štítné žláze anomální vlastnosti oproti jiným tkáním (Bianco et al., 2002). Podávání n-3 PUFA vedlo k poměrně výraznému ovlivnění aktivit D1 u všech skupin zvířat.
73
Graf 14: Specifická enzymová aktivita jodothyronin dejodasy D1 v post-mt frakcích štítných žláž samců potkanů kmene SHR, v závisloti na farmakologickém ovlivnění Graf 15 souhrnně uvádí pro ilustraci průměrné hodnoty specifické enzymové aktivity D1 u jednotlivých skupin experimentálních zvířat v post-mt frakcích Harderových žláz samic potkanů kmene Wistar Kyoto, které jsou uvedeny v Tab XIII.
Graf 15: Specifická enzymová aktivita jodothyronin dejodasy D1 v post-mt frakcích Harderových žláž samic potkanů kmene Wistar Kyoto, v závisloti na farmakologickém ovlivnění Ve srovnání s kontrolní skupinou (EU) je průměrná hodnota specifické aktivity D1 u skupiny hypothyreoidálních (HY) zvířat snížená a u skupiny hyperthyreoidálních (TH) potkanů naopak mírně zvýšená. Tyto relace jsou ve shodě s očekávanými (viz kap. 5.1.1). Vliv podávání n-3 PUFA je výrazný pouze u skupiny HY+PUFA; u těchto hypothyreoidálních zvířat způsobuje významné zvýšení aktivity D1. 74
13.3.2 Stanovení specifické enzymové aktivity jodothyronin dejodasy D2
Obr. 25: Vyhodnocený radiochromatogram získaný při stanovení aktivity D2 ve vzorcích HG
Na příkladu vyhodnoceného elektronického obrazu radiochromatogramu (Obr. 25) vidíme dokonalé odseparování radioaktivních produktů enzymové reakce (T3*, I-*), katalyzované jodothyronin dejodasou D2, od nespotřebovaného substrátu (T4*). Na místech startu TLC desky byly naneseny alikvoty reakčních směsí, obsahujících post-mt frakce vzorků Harderových žláz (HG 41-45), v nichž je aktivita D2 dobře měřitelná. Ve čtvrté linii je místo vzorku HG přítomen pouze pufr, který slouží jako negativní kontrola. Vzorky byly inkubovány 30 minut při 37 °C. V posledních šesti liniích jsou naneseny blanky, které obsahují stejnou reakční směs se stejnými vzorky HG, které však byly inkubovány 30 minut při 0 °C.
75
Obr. 26:Šablona pro vyhodnocování specifické enzymové aktivity jodothyronin dejodasy typu 2
Na Obr. 26 je uvedeno vyhodnocení příslušného radiochromatogramu (z Obr. 25), včetně plošných integrálů jednotlivých skvrn, ředění vzorků, obsahu celkového proteinu ve vzorcích, označení vzorků a výsledné hodnoty specifické enzymové aktivity D2 v jednotkách fmol T3/h/mg proteinu.
13.3.2.1 Výsledky stanovení enzymové aktivity jodothyronin dejodasy D2 u zvířat v experimentu STAT 13/1 Specifická enzymová aktivita jodothyronin dejodasy D2 byla stanovována v Harderových žlázách a štítných žlázách ve frakcích post-mt supernatantů. Specifická enzymová aktivita D2 je řádově 1000x nižší oproti jodothyronin dejodase D1. D1 byla proto při tomto stanovení specificky inhibována propylthiouracilem. V Harderových žlazách byla naměřena vyšší aktivita jodothyronin dejodasy D2 než ve štítných žlázách, kde byla aktivita D2 téměř nulová. Reprezentativní výsledky jsou uvedeny v tabulce Tab. XIV, kde jsou shrnuty průměrné hodnoty specifické enzymové aktivity D2, včetně směrodatných 76
odchylek, měřené v post-mt frakcích Harderových žláz samců potkanů kmenů Wistar a SHR. Tabulka XIV: Průměrná specifická enzymová aktivita jodothyronin dejodasy D2 (fmol T3/h/mg) v post-mt frakcích Harderových žláz samců potkanů kmenů Wistar a SHR v experimentu STAT 13/1 Wistar, M
SHR, M
skupina
n
průměrná s. a. ± SD
n
průměrná s. a. ± SD
EU
2
23 ± 4
2
7±4
STATIN
1
9
1
5
RPO
2
23 ± 4
3
26 ± 5
STATIN+RPO
3
12 ± 4
2
14 ± 0
V grafech 16 a 17 jsou zobrazeny výsledky z tabulky Tab. XIV. Jednotlivé sloupce znázorňují průměrné hodnoty dejodasové aktivity D2 v závislosti na ovlivnění zvířat podáváním statinů (STAT), červeného palmového oleje (RPO) a jejich kombinace (STAT + RPO). EU označuje kontrolní skupinu zvířat bez farmakologického ovlivnění.
Graf 16: Specifická enzymová aktivita jodothyronin dejodasy D2 v post-mt frakcích Harderových žláž samců potkanů kmene Wistar, v závisloti na farmakologickém ovlivnění zvířat
77
Graf 17: Specifická enzymová aktivita jodothyronin dejodasy D2 v post-mt frakcích Harderových žláž samců potkanů kmene SHR, v závisloti na farmakologickém ovlivnění zvířat Jak u potkanů kmene Wistar, tak u potkanů kmene SHR měla podávaná farmaka stejnou tendenci ovlivňovat aktivitu jodothyronin dejodasy D2. Ve srovnání s kontrolní skupinou (EU) byla specifická aktivita D2 snížená u skupiny potkanů ovlivněné podáváním statinů (STAT). Podáváním červeného palmového oleje (RPO) byla tato aktivita naopak zvýšena, stejně tak jako v případě kombinace těchto dvou farmak. Výrazné rozdíly ve změnách hodnot aktivit dejodasy D2 v závisloti na druhu potkana nebyly v Harderových žlázách zaznamenány.
13.3.2.2 Výsledky stanovení enzymové aktivity jodothyronin dejodasy D2 u zvířat v experimentu PUFA 13/2 Enzymové aktivity jodothyronin dejodasy D2 byly měřeny v řadě tkání a jejich hodnoty byly vyhodnocovány v závilosti na druhu potkana a jeho pohlaví. Dobře měřitelná byla aktivita dejodasy D2 v hypofýzách, Harderových žlázách a hnědé tukové tkáni. V post-mt supernatantech dalších tkání byla naměřena téměř nulová aktivita. Pro ilustraci jsou v tabulce Tab. XV souhrně uvedeny průměrné hodnoty specifické enzymové aktivity jodothyronin dejodasy D2, včetně směrodatných odchylek, měřené v post-mt frakcích Harderových žláz samců potkanů kmenů Wistar Kyoto a SHR.
78
Tabulka XV: Průměrná specifická enzymová aktivita jodothyronin dejodasy D2 (fmol T3/h/mg) v post-mt frakcích Harderových žláz samců potkanů kmenů Wistar Kyoto a SHR v experimentu PUFA 13/2 Wistar Kyoto, M
SHR, M
skupina
n
průměrná s. a. ± SD
průměrná s. a. ± SD
EU
8
28 ± 24
25 ± 8
EU+PUFA
3
31 ± 32
19 ± 15
HY
10
113 ± 37
153 ± 36
HY+PUFA
3
181 ± 28
261 ± 75
TH
5
6 ± 11
2±3
TH+PUFA
5
23 ± 15
0±0
V grafech 18 a 19 jsou zobrazeny výsledky z tabulky Tab. XV. EU označuje euthyreoidální zvířata (kontrolní skupina bez farmakologického ovlivnění), HY hypothyreoidální (skupina ovlivněná methimazolem) a TH hyperthyreoidální (skupina ovlivněná podáváním TH hormonů), + PUFA značí skupiny, které byly navíc ovlivněny i podáváním n-3 PUFA.
Graf 18: Specifická enzymová aktivita jodothyronin dejodasy D2 v post-mt frakcích Harderových žláž samců potkanů kmene Wistar Kyoto, v závisloti na farmakologickém ovlivnění zvířat
79
Graf 19: Specifická enzymová aktivita jodothyronin dejodasy D2 v post-mt frakcícch Harderových žláž samců potkanů kmene SHR, v závisloti na farmakologickém ovlivnění zvířat V závislosti na experimentálně navozených změnách thyreoidálního stavu potkanů dochází k signifikantním změnám aktivity D2. Ve srovnání s kontrolní skupinou (EU) je průměrná hodnota specifické aktivity D2 u skupiny hypothyreoidálních (HY) zvířat zvýšená a u skupiny hyperthyreoidálních (TH) potkanů naopak snížená. Tyto relace jsou ve shodě s očekávanými výsledky (viz. kap. 5.1.2). Podávání n-3 PUFA vedlo k výraznému ovlivnění aktivity D2, zejména v případě skupiny HY+PUFA.
80
13.3.3 Stanovení specifické enzymové aktivity jodothyronin dejodasy D3
Obr. 27: Vyhodnocený radiochromatogram získaný při stanovení aktivity D3 ve vzorcích různých tkání
Obr. 27 je ukázka vyhodnoceného radiochromatogramu při stanovení enzymové aktivity jodothyronin dejodasy D3 v různých tkáních. Patrné jsou linie odseparovaných skvrn produktů enzymové reakce, radioaktivně značeného (T2*) a neznačeného (I-), od nespotřebovaného radioaktivně značeného substrátu (T3*). V drahách 1 – 6 jsou vždy naneseny vzorky inkubované při 37 °C, v drahách 7 - 12 jsou naneseny příslušné blanky inkubované při 0 °C. V jednotlivých drahách jsou naneseny vzorky tukové tkáně označené sup GON/66, sup SUB/66 a sub BAT/66 a dále vzorky hypofýzy (sup P/66, sup P/1) a Harderových žláz (sup HG/66). Plocha pozadí má v tomto případě číslo 25, protože při stanovení dejodasy D3 vzniká pouze jeden radioaktivně značený produkt. Na Obr. 28 je uvedena šablona pro vyhodnocení dejodas v MS Excel.
81
Obr. 28: Šablona pro vyhodnocování specifické enzymové aktivity jodothyronin dejodasy typu 3
13.3.3.1 Výsledky stanovení enzymové aktivity jodothyronin dejodasy D3 u zvířat v experimentu STAT 13/1 Specifická enzymová aktivita jodothyronin dejodasy D3 byla stanovována v post-mt frakcích hypofýz a Harderových žláz. V Tab. XVI a Tab. XVII jsou souhrně uvedeny průměrné hodnoty specifické enzymové aktivity jodothyronin dejodasy D3, včetně směrodatných odchylek, měřené v post-mt frakcích Harderových žláz u skupiny potkanů kmene SHR (Tab. XVI) a v post-mt frakcích hypofýz samic potkanů kmene Wistar (Tab. XVII), kde byly podle očekávání naměřeny nejvyšší aktivity tohoto enzymu. Tabulka XVI: Specifická enzymová aktivita jodothyronin dejodasy D3 (fmol T2/h/mg) v post-mt frakcích Harderových žláz potkanů kmene SHR skupina EU STATIN RPO STATIN+RPO
n
průměrná s. a. ± SD
5
11 ± 4
2
13 ± 4
8
14 ± 4
6
2±2
82
Tabulka XVII: Specifická enzymová aktivita jodothyronin dejodasy D3 (fmol T2/h/mg) v post-mt frakcích hypofýz samic potkanů kmene Wistar skupina EU STATIN RPO STATIN+RPO
n
průměrná s. a. ± SD
2
155 ± 40
2
197 ± 44
3
225 ± 78
3
149 ± 52
V Grafech 20 a 21 jsou přehledně zobrazeny výsledky z tabulky Tab. XVI a Tab XVII. Jednotlivé sloupce znázorňují průměrné hodnoty dejodasové aktivity D3 v závislosti na ovlivnění zvířat podáváním statinů (STAT), červeného palmového oleje (RPO) a jejich kombinace (STAT + RPO). EU označuje kontrolní skupinu zvířat bez farmakologického ovlivnění.
Graf 20: Specifická enzymová aktivita jodothyronin dejodasy D3 v post-mt frakcích Harderových žláz potkanů kmene SHR, v závisloti na farmakologickém ovlivnění zvířat
Graf 21: Specifická enzymová aktivita jodothyronin dejodasy D3 v post-mt frakcích hypofýz samic potkanů kmene Wistar, v závisloti na farmakologickém ovlivnění zvířat 83
Ve srovnání s kontrolní skupinou (EU) byla specifická aktivita jodothyronin dejodasy D3 mírně zvýšená u skupiny potkanů ovlivněné podáváním statinů (STAT). Podáváním červeného palmového oleje (RPO) byla tato aktivita také zvýšena, ale v případě kombinace těchto dvou farmak se aktivita jodothyronin dejodasy D3 snížila nebo zůstala téměř nezměněna.
13.3.3.2 Výsledky stanovení enzymové aktivity jodothyronin dejodasy D3 u zvířat v experimentu PUFA 13/2 Enzymové aktivity jodothyronin dejodasy D3 byly vyhodnocovány v závilosti na druhu potkana a jeho pohlaví. Nejvyšší aktivita dejodasy D3 byla naměřena v hypofýze. V postmt supernatantech dalších žláz byla naměřena mnohonásobně nižší D3 aktivita. Tyto výsledky jsou demonstrovány v tabulkách Tab. XVIII a Tab. XIX, kde jsou souhrně uvedeny průměrné hodnoty specifické enzymové aktivity D3, včetně směrodatných odchylek, měřené v post-mt frakcích Harderových žláž u skupiny potkanů kmene Wistar Kyoto (Tab. XVIII) a v post-mt frakcích hypofýz samců potkanů kmene SHR (Tab. XIX). Tabulka XVIII: Specifická enzymová aktivita jodothyronin dejodasy D3 (fmol T2/h/mg) v post-mt frakcích Harderových žláz potkanů kmene Wistar Kyoto skupina
n
průměrná s. a. ± SD
EU
16
33 ± 20
EU+PUFA
10
33 ± 21
HY
16
20 ± 11
HY+PUFA
7
23 ± 11
TH
7
36 ± 11
TH+PUFA
12
23 ± 18
Tabulka XIX: Specifická enzymová aktivita jodothyronin dejodasy D3 (fmol T2/h/mg) v post-mt frakcích hypofýz samců potkanů kmene SHR n
průměrná s. a. ± SD
EU
6
147 ± 60
EU+PUFA
10
136 ± 63
HY
5
78 ± 56
HY+PUFA
5
179 ± 92
TH
5
300 ± 94
TH+PUFA
6
161 ± 44
skupina
84
V Grafu 22 jsou přehledně zobrazeny výsledky z tabulky Tab. XVIII. EU označuje euthyreoidální zvířata (kontrolní skupina bez farmakologického ovlivnění), HY hypothyreoidální (skupina ovlivněná methimazolem) a TH hyperthyreoidální (skupina ovlivněná podáváním hormonů T3 a T4), + PUFA značí skupiny, které byly navíc ovlivněny i podáváním n-3 PUFA.
Graf 22: Specifická enzymová aktivita jodothyronin dejodasy D3 v post-mt frakcích Harderových žláz potkanů kmene Wistar Kyoto, v závisloti na farmakologickém ovlivnění zvířat Graf 23 souhrnně uvádí vztahy průměrných hodnot specifické enzymové aktivity D3 mezi jednotlivými skupinami experimentálních zvířat v post-mt frakcích hypofýz samců potkanů kmene SHR, které jsou uvedeny v Tab XIX.
Graf 23: Specifická enzymová aktivita jodothyronin dejodasy D3 v post-mt frakcích hypofýz samců potkanů kmene SHR, v závisloti na farmakologickém ovlivnění zvířat 85
Podobně jako v případě aktivit jodothyronin dejodasy D1 lze očekávat sníženou aktivitu jodothyronin dejodasy D3 u hypothyreoidálních zvířat a zvýšenou aktivitu u hyperthyreoidálních zvířat (kap. 5.1.3). Ve srovnání s kontrolní skupinou (EU) jsou námi stanovené
průměrné
hodnoty
specifické
enzymové
aktivity
D3
u
skupiny
hypothyreoidálních (HY) zvířat snížené a u skupiny hyperthyreoidálních (TH) potkanů naopak zvýšené, což odpovídá očekávaným výsledkům. Podávání n-3 PUFA vedlo k pozitivnímu ovlivnění u obou experimentálně navozených stavů, v případě skupiny HY+PUFA došlo ke zvýšení a v případě skupiny TH+PUFA ke snížení aktivity jodothyronin dejodasy D3. Z těchto výsledků je patrné, že n-3 PUFA mírně potlačují nepříznivé účinky vyvolané velmi vysokými nebo velmi nízkými hladinami TH.
86
13.4 KO MBI NA CE PO ČÍTAČOVÉ TO MO GRAFIE A PO ZITRONOVÉ EMIS NÍ TO MO GRAFIE (CT/ PET ) Při CT skenování je anestetizované zvíře fixováno na posuvném lůžku (Obr. 29), které postupně prochází snímací aparaturou. Na jedné straně rotujícího disku je zdroj rentgenového záření (rentgenka) a na opačné straně jsou scintilační detektory (Obr. 30). Expermentální zvíře je ozařováno postupně bod po bodu a výsledkem je transverzální řez těla, který je tedy počítačovou rekonstrukcí mnoha „klasických“ RTG snímků určité roviny. Transversální řez zobrazovaného objektu počítačovou tomografií je tvořen více než 250 000 voxely (volume matrix element), tj. malými jednotkami objemu tkáně s různou průměrnou absorpcí a rozptylem použitého RTG záření. Výsledná hodnota absorpce voxelu je následně vyjádřena pomocí denzitní jednotky - Hounsfieldovy jednotky (HU), která je vyjádřením denzity (míry absorpce a rozptylu rentgenového záření) konkrétních voxelů. Pro každý voxel je z naměřené hodnoty absorbce vypočítána příslušná HU, která je vztažena (nejčastěji) k hodnotě absorbce RTG záření vodou (pro vodu platí HU = 0). V praxi mohou nabývat Hounsfieldovy jednotky hodnot od -1000 (vzduch), do cca +1000 (kost).
Obr. 29: Experimentální zvíře fixované na posuvném lůžku přístroje µCT/PET pro malá laboratorní zvířata převzato z: User Guide Albira PET/CT Carestream Molecular Imaging
Obr. 30: Princip počítačové tomografie (CT), převzato z: User Guide Albira PET/CT
Po naměření
hodnot
absorpcí
jednotlivých voxelů
a výpočtu
příslušných
Hounsfieldových jednotek, jsou tyto hodnoty převedeny na monitor, kde konkrétním hodnotám Hounsfieldových jednotek odpovídají konkrétní odstíny šedi. Takto vzniká výsledný CT obraz zkoumaného modelu. 87
Pro naše účely byl použit bi-modální µCT/PET přístroj Albira (Carestream Molecular Imaging) pro malá laboratorní zvířata (Obr. 31), pomocí něhož jsme určovali distribuci tělesné tukové tkáně u laboratorních potkanů. Jak je patrné z Obr. 32, µCT/PET přístroj je díky 3D zobrazení schopen spolehlivě stanovit distribuci tukové tkáně a kvantifikovat obsah tuku v těle experimentálních zvířat. Vzhledem k časové a technické náročnosti však naše CT skeny potkanů dosud nebyly interpretovány.
Obr. 31: Bi-modaníl µCT/PET přístroj Albira pro malá laboratorní zvířata převzato z: User Guide Albira PET/CT Carestream Molecular Imaging
Obr. 32: CT snímky ditribuce tělesného tuku
88
14. Z Á V Ě R Y Jedním z cílů této diplomové práce bylo najít vhodné podmínky pro experimentální navození hyperthyreoidálního a hypothyreoidálního stavu potkanů, jako modelu patofyziologického stavu organismu. Měřením řady parametrů bylo nutné správně navozený thyreoidální stav prokázat. Jako vhodné parametry byly vybrány jednak některé biometrické (absolutní a relativní hmotnosti srdce a štítné žlázy) a jednak biochemické změny (koncentrace celkových a volných frakcí thyreoidálních hormonů v krevním séru). Dalším cílem bylo zjistit vliv podávání statinů, červeného palmového oleje (RPO) a jejich kombinace v dietě na metabolismus thyreoidálních hormonů u potkanů. Dále jsme pak využili hyper- a hypothyreoidální potkany jako model „poškozeného organismu“ a analyzovali, zda podávání n-3 polynenasycených mastných kyselin (n-3 PUFA) může indukované změny kompenzovat. Stanovení specifických enzymových aktivit jodothyronin dejodas D1, D2 a D3 pomocí radiometrických metod bylo dalším experimentálním přístupem pro kvantifikaci vyvolaných změn metabolismu thyreoidálních hormonů u potkanů. Neprokázali jsme žádný významný vliv statinů a červeného palmového oleje na sérové koncentrace thyreoidálních hormonů a na jejich metabolismus. Naopak jsme zjistili pozitivní vliv podávání n-3 polynenasycených mastných kyselin na koncentrace thyreoidálních hormonů, tj. zvyšování u hypothyreoidálních a snižování u hyperthyreoidálních zvířat. Tento vliv nebyl příliš výrazný, přesto změny vybraných parametrů směřovaly příznivým směrem k mírnému potlačení nepříznivých účinků vyvolaných velmi vysokými nebo velmi nízkými hladinami thyreoidálních hormonů. Provedli jsme rozsáhlé experimenty in vivo na laboratorních potkanech, kterým byly podávány kombinace různých farmak po dobu 8 týdnů. Použité látky byly jednak statiny, RPO a kombinace RPO a statinů, jednak thyreoidální hormony (trijodothyronin
a
thyroxin),
methimazol,
n-3
PUFA
a
kombinace
thyreoidálních hormonů s n-3 PUFA a methimazolu s n-3 PUFA. Na konci experimentů byli potkani usmrceni a byly z nich odebrány vzorky různých tkání a krve. Tkáně byly následně zpracovány pro izolaci frakcí. Stanovením vybraných anatomických a biochemických parametrů, standardně používaných k posouzení thyreoidálního stavu jedinců, jsme definovali správně navozený hyperthyreoidální a hypothyreoidální stav experimentálních potkanů. 89
Stanovili jsme specifické enzymové aktivity jodothyronin dejodas D1, D2 a D3 pomocí zavedených radiometrických metod,
založených na konverzi
radioaktivního substrátu na radioativní produkty. Kvantitativní separace produktů se prováděla pomocí tenkovrstevné chromatografie, vizualizace pomocí bezfilmové autoradiografie s použitím „storage phosphor“ fólií a vyhodnocení pomocí speciálního programu AIDA. V post-mitochondriálních frakcích Harderových žláz jsme podle očekávání prokázali snížení aktivity dejodasy D1 u hypothyreoidálních potkanů. Naopak v post-mt frakcích štítných žláz jsme podle očekávání prokázali zvýšení aktivity D1 u hypothyreoidálních potkanů a snížení aktivity D1 u hyperthyreoidálních potkanů. Vliv n-3 PUFA se projevil při podávání kombinace n-3 PUFA a thyreoidálních hormonů, které vedlo k mírnému potlačení nepříznivých účinků vyvolaných suprafyziologickými koncentracemi thyreoidálních hormonů. V post-mt frakcích Harderových žláz jsme podle očekávání prokázali zvýšení specifické enzymové aktivity jodothyronin dejodasy D2 u hypothyreoidálních potkanů a snížení u hyperthyreoidálních potkanů. Změny způsobené podáváním n-3 PUFA nebyly signifikantní. V post-mt frakcích Harderových žláz a hypofýz jsme podle očekávání prokázali zvýšení specifické enzymové aktivity jodothyronin dejodasy D3 u hypethyreoidálních potkanů a snížení u hypothyreoidálních potkanů. Podávání n-3 PUFA vedlo ke snížení aktivity D3 u skupin hyperthyreoidálních zvířat a zvýšení u skupin hypothyreoidálních zvířat, tedy k mírnému potlačení nepříznivých
účinků
vyvolaných
suprafyziologickými
koncentracemi
thyreoidálních hormonů.
90
SEZNAM POUŽI TÉ LITERATURY 1.
ANTOLÍN I., RODRÍGUEZ C., SAÍNZ R. M., MAYO J. C., URÍA H., KOTLER M. L., RODRÍGUEZ-COLUNGA M. J., TOLIVIA D. AND MENÉNDEZ-PELÁEZ A. (1990) “Neurohormone Melatonin Prevents Cell Damage: Effect on Gene Expression for Antioxidant Enzymes.” The FASEB Journal 10 (8): 882–90
2.
ARROJO E DRIGO R. AND BIANCO A. C. (2011) “Type 2 Deiodinase at the Crossroads of Thyroid Hormone Action.” The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 43 (10): 1432–41
3.
BARRIOS-GONZÁLEZ J. AND MIRANDA R. U. (2010) “Biotechnological Production and Applications of Statins.” Applied Microbiology and Biotechnology 85 (4): 869–83
4.
BAYS H. E., TIGHE A. P., SADOVSKY R. AND DAVIDSON M. H. (2008) “Prescription Omega-3 Fatty Acids and Their Lipid Effects: Physiologic Mechanisms of Action and Clinical Implications.” Expert Review of Cardiovascular Therapy 6 (3): 391–409
5.
BIANCO A. C. AND BRIAN W. K. (2006) “Deiodinases: Implications of the Local Control of Thyroid Hormone Action.” Journal of Clinical Investigation 116 (10): 2571–79
6.
BIANCO A. C., SALVATORE D., GEREBEN B., BERRY M. J. AND LARSEN P. R. (2002) “Biochemistry, Cellular and Molecular Biology, and Physiological Roles of the Iodothyronine Selenodeiodinases.” Endocrine Reviews 23 (1): 38–89
7.
BLODGETT T. M., MELTZER C. C. AND TOWNSEND D. W. (2007) “PET/CT: Form and Function.” Radiology 242 (2): 360–85
8.
BORDONI A., NUNZIO M. DI, DANESI F., AND BIAGI P. L. (2006) “Polyunsaturated Fatty Acids: From Diet to Binding to Ppars and Other Nuclear Receptors.” Genes & Nutrition 1 (2): 95–106
9.
BRAVERMAN L. E. (1996) Werner & Ingbar’s the Thyroid. A Fundamental and Clinical Text. Edited by Robert D. Utiger. 7th ed. Philadelphia: Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins
10. CUI Z. J., ZHOU Y. D., SATOH Y. AND HABARA Y. (2003) “A Physiological Role for Protoporphyrin IX. Photodynamic Action in the Rat Harderian Gland?” Acta Physiologica Scandinavica 179 (2): 149 11. DAVIDSON M. H., KLING D. AND MAKI K. C. (2011) “Novel Developments in Omega-3 Fatty Acid-Based Strategies:” Current Opinion in Lipidology 22 (6): 437–44 91
12. DENTICE M., MARSILI A., ZAVACKI A., LARSEN P. R. AND SALVATORE D. (2013) “The Deiodinases and the Control of Intracellular Thyroid Hormone Signaling during Cellular Differentiation.” Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects 1830 (7): 3937–45 13. DJERIDANE Y. (1994) “The Harderian Gland and Its Excretory Duct in the Wistar Rat. A Histological and Ultrastructural Study.” Journal of Anatomy 184 (Pt 3): 553–66 14. EDEM D. O. (2002) “Palm Oil: Biochemical, Physiological, Nutritional, Hematological and Toxicological Aspects: A Review.” Plant Foods for Human Nutrition 57 (3-4): 319–41 15. FLACHS P., ROSSMEISL M., BRYHN M. AND KOPECKY J. (2009) “Cellular and Molecular Effects of n−3 Polyunsaturated Fatty Acids on Adipose Tissue Biology and Metabolism.” Clinical Science 116 (1): 1 16. GANONG W. F. (2005) Přehled Lékařské Fyziologie. 20. vyd. Praha: Galén 17. GREENSPAN F. S. (2003) Základní a Klinická Endokrinologie. Edited by J. D. Baxter. 4. vyd. (1. české vyd.). A Lange Medical Book. Praha: H & H 18. GUERRERO J. M., GONZALEZ-BRITO A., SANTANA C. AND REITER R. J. (1989) “Nocturnal Increase of Type II Thyroxine 5′-Deiodinase Activity in the Syrian Hamster Harderian Gland Is Abolished by Light Exposure and Induced by Isoproterenol.” Experimental Biology and Medicine 190 (2): 186–89 19. GUERRERO J. M., SANTANA C. AND REITER R. J. (1988a). “Effect of Isoproterenol and Dibutyryl Cyclic AMP on Thyroxine Type-II 5′-Deiodinase and NAcetyltransferase Activities in Rat Pineal Organ Cultures.” Neuroscience Letters 89 (2): 229–33 20. GUERRERO J. M., PUIG-DOMINGO M. AND REITER R. J. (1988b) “Thyroxine 5′-Deiodinase Activity in Pineal Gland and Frontal Cortex: Nighttime Increase and the Effect of Either Continuous Light Exposure or Superior Cervical Ganglionectomy.” Endocrinology 122 (1): 236–41 21. HARRIS W. (1997) “N-3 Fatty Acids and Serum Lipoproteins: Human Studies.” The American Journal of Clinical Nutrition 65: 1645S–54S 22. JONES T. AND PRICE P. (2012) “Development and Experimental Medicine Applications of PET in Oncology: A Historical Perspective.” The Lancet Oncology 13 (3): e116–e125 23. KITTNAR O. (2011) Lékařská Fyziologie. 1. vyd. Praha: Grada 92
24. MANZONI M. AND ROLLINI M. (2002) “Biosynthesis and Biotechnological Production of Statins by Filamentous Fungi and Application of These CholesterolLowering Drugs.” Applied Microbiology and Biotechnology 58 (5): 555–64 25. MIYAZAKI M., KIM H., MAN W. CH. AND NTAMBI J. M. (2001) “Oleoyl-CoA Is the Major de Novo Product of Stearoyl-CoA Desaturase 1 Gene Isoform and Substrate for the Biosynthesis of the Harderian Gland 1-Alkyl-2,3-Diacylglycerol.” Journal of Biological Chemistry 276 (42): 39455–61 26. MONGA V., MEENA CH. L., KAUR N. AND JAIN R. (2008) “Chemistry and Biology of Thyrotropin-Releasing Hormone (TRH) and Its Analogs.” Current Medicinal Chemistry 15 (26): 2718–33 27. MONTEFORTE R., SANTILLO A., LANNI A., D’ANIELLO S. AND BACCARI G. CH. (2008) “Morphological and Biochemical Changes in the Harderian Gland of Hypothyroid Rats.” Journal of Experimental Biology 211 (4): 606–12 28. NORMAN A. W. (1987) Hormones. Orlando: Academic Press (Orlando) 29. OGUNTIBEJU O. O., ESTERHUYSE A. J. AND TRUTER E. J. (2009) “Red Palm Oil: Nutritional, Physiological and Therapeutic Roles in Improving Human Wellbeing and Quality of Life.” British Journal of Biomedical Science 66 (4): 216–22 30. OLLINGER J. M. AND FESSLER J. A. (1997) “Positron-Emission Tomography.” IEEE Signal Processing Magazine 14 (1): 43–55 31. PAVELKA S. (2010a) “Radiometric Enzyme Assays: Development of Methods for Extremely Sensitive Determination of Types 1, 2 and 3 Iodothyronine Deiodinase Enzyme Activities.” Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry 286 (3): 861– 65 32. PAVELKA S. (2010b) “125I-Labelled Iodothyronines: Useful Tools for Studies of Effects of an Antidepressant Drug Fluoxetine in the Rat.” Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry 286 (3): 867–71 33. PAVELKA S., KOPECKÝ P., BENDLOVÁ B., ŠTOLBA P., VÍTKOVÁ I., VOBRUBA V., PLAVKA R., HOUŠTĚK J. AND KOPECKÝ J. (1997) “Tissue Metabolism and Plasma Levels of Thyroid Hormones in Critically Ill Very Premature Infants.” Pediatric Research 42 (6): 812–18 34. PAYNE A. P. (1994) “The Harderian Gland: A Tercentennial Review.” Journal of Anatomy 185 (Pt 1): 1–49
93
35. RADOSINSKA J., BACOVA B., KNEZL V., BENOVA T., ZURMANOVA J., SOUKUP T., ARNOSTOVA P., SLEZAK J., GONÇALVESOVA E. AND TRIBULOVA N. (2013) “Dietary Omega-3 Fatty Acids Attenuate Myocardial Arrhythmogenic Factors and Propensity of the Heart to Lethal Arrhythmias in a Rodent Model of Human Essential Hypertension:” Journal of Hypertension 31 (9): 1876–85 36. REIS E. R., NICOLA E. M. D. AND NICOLA J. H. (2005) “Harderian Gland of Wistar Rats Revised as a Protoporphyrin IX Producer” Brazilian Journal of Morphological Sciences 22 (1): 43–51 37. RIEDIGER N. D., OTHMAN R. A., SUH M. AND MOGHADASIAN M. H. (2009) “A Systemic Review of the Roles of N-3 Fatty Acids in Health and Disease.” Journal of the American Dietetic Association 109 (4): 668–79 38. SATOH Y., GESASE A. P., HABARA Y., ONO K. AND KANNO T. (1996) “Lipid Secretory Mechanisms in the Mammalian Harderian Gland.” Microscopy Research and Technique 34 (2): 104–10 39. SCHMIDT E. B., ARNESEN H., DE CATERINA R., RASMUSSEN L. H. AND KRISTENSEN S. D. (2005) “Marine N-3 Polyunsaturated Fatty Acids and Coronary Heart Disease: Part I. Background, Epidemiology, Animal Data, Effects on Risk Factors and Safety.” Thrombosis Research 115 (3): 163–70 40. SOUKUP T. (2014) “Effects of Long-Term Thyroid Hormone Level Alterations, N-3 Polyunsaturated Fatty Acid Supplementation and Statin Administration in Rats.” Physiological Research 63 Suppl 1: 119–131 41. SOUKUP T., ZACHAROVÁ G., SMERDU V. AND JIRMANOVÁ I. (2000) “Body, Heart, Thyroid Gland and Skeletal Muscle Weight Changes in Rats with Altered Thyroid Status.” Physiological Research 50 (6): 619–26 42. SOUZA L. L., NUNES M. O., PAULA G. S. M., CORDEIRO A., PENHA-PINTO V., NETO J. F. N., OLIVEIRA K. J., CARMO M. G. T. AND PAZOS-MOURA C. C. (2010) “Effects of Dietary Fish Oil on Thyroid Hormone Signaling in the Liver.” The Journal of Nutritional Biochemistry 21 (10): 935–40 43. SUGIYAMA E., ISHIKAWA Y., LI Y., KAGAI T., NOBAYASHI M., TANAKA N., KAMIJO Y., YOKOYAMA S., HARA A. AND AOYAMA T. (2008) “Eicosapentaenoic Acid Lowers Plasma and Liver Cholesterol Levels in the Presence of Peroxisome Proliferators-Activated Receptor Alpha.” Life Sciences 83 (1–2): 19–28 44. TAPIERO H., BA G. N., COUVREUR P. AND TEW K. D. (2002) “Polyunsaturated Fatty Acids (PUFA) and Eicosanoids in Human Health and Pathologies.” Biomedicine & Pharmacotherapy 56 (5): 215–22 94
45. VEGA-NAREDO I., CABALLERO B., SIERRA V., GARCÍA-MACIA M., DE GONZALO-CALVO D., OLIVEIRA P. J., RODRÍGUEZ-COLUNGA M. J. AND COTO-MONTES A. (2012) “Melatonin Modulates Autophagy through a RedoxMediated Action in Female Syrian Hamster Harderian Gland Controlling Cell Types and Gland Activity.” Journal of Pineal Research 52 (1): 80–92 46. WERNICK M. N. AND AARSVOLD J. N. (2004) Emission Tomography: The Fundamentals of PET and SPECT. Academic Press 47. WONG W. W. L., DIMITROULAKOS J., MINDEN M. D. AND PENN L. Z. (2002) “HMG-CoA Reductase Inhibitors and the Malignant Cell: The Statin Family of Drugs as Triggers of Tumor-Specific Apoptosis.” Leukemia 16 (4): 508–19 48. YANG J. W., AFJEHI-SADAT L., GELPI E., KUNZE M., HÖGER H., FLECKNER J., BERGER J. AND LUBEC G. (2006) “Proteome Profiling in the Rat Harderian Gland.” Journal of Proteome Research 5 (7): 1751–62 49. MACEK JÍLKOVÁ Z., PAVELKA S., FLACHS P., HENSLER M., KŮS V. AND KOPECKÝ J. (2010) “Modulation of Type I Iodothyronine 5’-Deiodinase Activity in White Adipose Tissue by Nutrition: Possible Involvement of Leptin.” Physiological Research 59: 561–69 50. ZOELLER R. T., TAN S. W. AND TYL R. W. (2007) “General Background on the Hypothalamic-Pituitary-Thyroid (HPT) Axis.” Critical Reviews in Toxicology 37 (1/2): 11–53 51. User Guide Albira PET/CT Carestream Molecular Imaging, příbalová brožura přístroje
95
