SEMMELWEIS EGYETEM GYÓGYSZERTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA
Orvosi maszlag (Datura innoxia Mill.) szövettenyészetek univerzális és speciális anyagcseréjének vizsgálata
Doktori (Ph.D.) értekezés
LÁSZLÓ IMRE
Témavezeto: Szoke Éva D.Sc.
Semmelweis Egyetem Farmakognózia Intézet Budapest, 2003.
1
Szigorlati bizottság: Elnök:
Takács Mihály D.Sc.
Tagok:
Lemberkovics Éva D.Sc. Nyeste László D.Sc.
2
Doktori (Ph.D.) értekezés Készült: Semmelweis Egyetem, Farmakognózia Intézet, Budapest, 2003. Témavezeto: Prof. Dr. Szoke Éva László Imre Orvosi maszlag (Datura innoxia Mill.) szövettenyészetek univerzális és speciális anyagcseréjének vizsgálata Összefoglaló A Datura innoxia Mill. (orvosi maszlag) számos, gyógyászati szempontból fontos hatóanyagot tartalmaz. A növényben több mint 30 tropán- és pirrolidinvázas alkaloidot azonosítottak, melyek együttesen 0,05% -0,5% mennyiségben fordulhatnak elo. Foalkaloidok a hioszciamin és szkopolamin, melyek paraszimpatolitikus hatásúak. Tanulmányoztuk az in vitro D. innoxia növények, valamint a felhasználásukkal nyert kallusz- és géntranszformált, ún. hairy root kultúrák növekedését, tropán alkaloid összetételét (MALDI-MS) és hioszciamin, szkopolamin, apoatropin tartalmát (HPLC). Az A. rhizogenes A4 törzs alkalmazásával eloállított hairy root kultúrák géntranszformált sajátságát PCR technikával és a termelt opinok kimutatásával igazoltuk. A vizsgált hairy root klónok (# 410, # 411 és # 415) alkaloid tartalma (0,23% hioszciamin és 0,21% szkopolamin) elérte az in vivo növény gyökerében mért értékeket. Eredményeink ugyanakkor azt jelzik, hogy a véletlenszeru bakteriális tDNS beépülés eredményeként kialakuló, eltéro genetikai felépítésu klónok hasonló növekedési jellemzoi mellett nagy mértéku eltéréseket észlelhetok a kultúrák speciális anyagcseréjében, alkaloid termelésében. A kultúrák növekedését és alkaloid tartalmát számos körülmény befolyásolhatja kedvezoen, így részletesebben vizsgáltuk a megvilágítás, továbbá az MS tápközeg szacharóz és Mg 2+ tartalmának hatását a géntranszformált szövetek fejlodésére, és tropán alkaloid tartalmára. A különbözo szövetkultúrákban lezajló apoptotikus folyamatokat TUNEL reakció alkalmazásával mutattuk ki. Abiogén stresszhatások és a növekedés, alkaloid metabolizmus, mérheto endogén HCHO tartalom közötti kapcsolat tanulmányozása során célul tuztük ki – a szakirodalmi adatok alapján a transzmetilezési reakciókat befolyásoló, – a tenyészetek tápközegébe különbözo koncentrációban adagolt vegyületek (dimedon, szemikarbazid, aminoguanidin, vagy hidralazin, 1ppm, 10ppm, 100ppm és 1000ppm) hatásának vizsgálatát [1]. A kallusz- (4,6µg/g - 27,0µg/g) és hairy root kultúrák endogén HCHO tartalmát (345,0µg/g) MALDI-MS módszerrel mutattuk ki, valamint OPLC és HPLC technikák alkalmazásával határoztuk meg, formaldimedon formájában [2]. A dimedon és szemikarbazid alkalmazását követoen TUNEL reakció segítségével részletesebben tanulmányoztuk a molekulák apoptotikus folyamatokra gyakorolt hatását [3]. A 4 hetes géntranszformált gyökérkultúrákban (kontroll és dimedonnal, vagy szemikarbaziddal kezelt) nem tudtunk kimutatni apoptotikus folyamatokra jellemzo morfológiai változásokat, továbbá DNS fragmentálódást, mely arra utal, hogy a hairy root szövetek fejlodése eltér a korábban vizsgált kultúrákétól. Eredményeinkkel hozzá kívánunk járulni a D. innoxia szövettenyészetek növekedésének, a lezajló apoptotikus folyamatok és a tropánvázas alkaloidok metabolizmusának jobb megismeréséhez, továbbá az abiogén stresszhatások (speciális kémiai stressz) során bekövetkezo változások alaposabb megértéséhez. 1. László, I., Szoke, É., Tyihák, E. (1998) Relationship between abiotic stress and formaldehyde concentration in tissue culture of Datura innoxia Mill. Plant Growth Regulation, 25, 195-199. 2. László, I., Szoke, É., Tyihák, E., Németh, Zs. and Albert, L. (2003): Identification and measurement of endogenous formaldehyde in Datura innoxia Mill. tissues by OPLC, HPLC and MALDI MS techniques. Acta Horticulturae, 597, 265-270. 3. László, I., Szoke, É., Tyihák, E., Szende, B. (2001) Programmed cell death in Datura innoxia Mill. cultures cultivated in light and in dark. Plant Growth Regulation, 33, 231-236.
3
Ph.D. Thesis Prepared under the guidance of Prof. Éva Szoke, D.Sc., in the Institute of Pharmacognosy, Semmelweis University, Budapest, 2003 Imre László Investigation on primary and secondary metabolism of Datura innoxia Mill. tissue cultures Summary Datura innoxia Mill. contains several secondary metabolites with pharmacological and toxicological importance, including more than 30 tropane- and pirrolidin-base alkaloids. Total amount of these alkaloids varies between 0.05%-0.5% in different organs of the plant. Main alkaloids are scopolamine and hyoscyamine which have parasympatholytic effect. The aim of our experiments was to study different – genetically modified and non-transformed – in vitro cultures of D. innoxia. The growth (fresh and dry weight, dry matter content, growth value and pH of liquid culture media) and tropane alkaloid content (scopolamine, hyoscyamine and apoatropine, using HPLC technique) of in vitro plants, callus tissues and genetically modified, so called hairy root cultures were investigated. The transferred character of hairy root tissues obtained by Agrobacterium rhizogenes A4 microinjection was demonstrated by using polimerase chain reaction (PCR) and opine detection (paper electrophoresis). We have established that the total alkaloid content of hairy root clones (#410, #411 and #415, 0.23% hyoscyamine and 0.21% scopolamine) reached that of the root of the in vivo plants. Growth and alkaloid content of in vitro cultures has been effected by several circumstances. We studied the effects of culturing in light, the sucrose and Mg 2+ content of liquid MS basal medium on the growth, biomass production and tropane alkaloid content of the tissues. The presence of apoptotic processes in cells of different tissues (callus and root) accompanied with the shrinkage of the nuclei was investigated by TUNEL reaction. To study the relationship among abiotic stress, growth, alkaloid metabolism and measurable endogenous HCHO concentration different molecules affecting transmethylation reactions have been administered to the culture media (dimedone, semicarbazide, aminoguanidine and hidralazine, 1ppm1000ppm) of tissues [1]. The endogenous HCHO concentration of callus (4.6µg-27.0µg) and hairy root cultures (345.0µg) was determined by OPLC and HPLC techniques as formaldemethone [2]. Following administration of dimedone and semicarbazide the apoptotic processes were investigated by TUNEL reaction [3]. The results obtained might help deepening our knowledge about the growth of D. innoxia in vitro cultures, tropane alkaloid metabolism, apoptotic processes in plant cells and the effect of abiotic stress (special chemical stress). 1. László, I., Szoke, É. and Tyihák, E. (1998) Relationship between abiotic stress and formaldehyde concentration in tissue culture of Datura innoxia Mill. Plant Growth Regulation, 25, 195-199. 2. László, I., Szoke, É., Tyihák, E., Németh, Zs. and Albert, L. (2003): Identification and measurement of endogenous formaldehyde in Datura innoxia Mill. tissues by OPLC, HPLC and MALDI MS techniques. Acta Horticulturae, 597, 265-270. 3. László, I., Szoke, É., Tyihák, E. and Szende, B. (2001) Programmed cell death in Datura innoxia Mill. cultures cultivated in light and in dark. Plant Growth Regulation, 33, 231-236.
4
AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZÕ SAJÁT KÖZLEM ÉNYEK Folyóiratban megjelent cikk: 1, László, I., Szoke, É. and Tyihák, E. (1998) Relationship between abiotic stress and formaldehyde concentration in tissue culture of Datura innoxia Mill. Plant Growth Regulation, 25, 195-199. 2, Kiss, A.S., Galbács, Z., László, I., Szoke, É., Galbács, G. (1998) A deutériumtartalom változásának biológiai, biokémiai hatásai. Múzeumi füzetek, az Erdélyi Múzeum-Egyesület Természettudományi és Matematikai Szakosztályának közleményei, 7, 72-76. 3, László, I., Szoke, É., Németh, Zs., Albert, L. (1998) Plant tissue culture as a model for study of diversity in formaldehyde bounding. Acta Biologica Hungarica, 49 (2-4), 247-252. 4, Szende, B., Tyihák, E., Trézl, L., Szoke, É., László, I., Kátay, Gy., Király-Véghely Zs. (1998) Formaldehyde generators and capturers as influencing factors of mitotic and apoptotic processes. Acta Biologica Hungarica, 49 (2-4), 323-330. 5, László, I., Szoke, É., Tyihák, E., Szende, B. (2001) Programmed cell death in Datura innoxia Mill. cultures cultivated in light and in dark. Plant Growth Regulation, 33 (3), 231-236. 6, László I., Szoke, É. (2002): Biotechnológiai módszerek alkalmazása terápiás szempontból fontos, növényi eredetu hatóanyagok eloállítására. Képzés egy életen át, II/10, 10-16. 7, László, I., Szoke, É., Tyihák, E., Németh, Zs. and Albert, L. (2003): Identification and measurement of endogenous formaldehyde in Datura innoxia Mill. tissues by OPLC, HPLC and MALDI MS techniques. Proceedings of the International Conference on Medicinal and Aromatic Plants, Part II. Acta Horticulturae, 597, 265-270. 8, Hank, H., László I., Bálványos, I. and Tóth, E. (2003): Effect of magnesium on the growth and alkaloid production of hairy root cultures. Proceedings of the International Conference on Medicinal and Aromatic Plants, Part II. Acta Horticulturae, 597, 271-274.
Folyóiratban megjelent absztrakt: 1, László I., Szoke É. and Tyihák E. (1998) Effect of Magnesium on the Methylation of Alkaloids in Datura innoxia Mill. Tissue Cultures. Magnesium Research, 11, 236-237.
Könyvfejezetek: 1, Kiss, A.S., László, I., Szoke, É., Galbács, Z. and Galbács, G. (1997) The Effect of Deuterium Depleted Medium on Plant Tumors. In: Magnesium: Current Status and New Developments (Theophanides, T. and Anastassopoulou, J. editors) Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Boston, London, 81-84. 2, László, I., Szoke, É., Németh, Zs., Kursinszki, L., Albert, L., and Tyihák, E. (1998) Effect of Magnesium on the Methylation of Alkaloids in Datura innoxia Mill. Tissue Cultures. In: Magnesium: Magnesium and Interaction of Magnesium with Trace Elements (Kiss, A.S. editor) Hungarian Chemical Society, Budapest, Hungary, 353-357.
5
3, Szoke, É., László, I., Liszt, K. (2001) A mákalkaloidok képzodése szövettenyészetekben (a mák alkaloidjainak in vitro bioszintézise). In: Magyarország Kultúrflórája, A mák (Papaver somniferum L.). (Sárkány, S., Bernáth, J., Tétényi, P. editors) Akadémiai Kiadó, Budapest, 135154.
Eloadások jegyzéke nemzetközi és hazai konferenciákon (eloadás/poszter): 1, Szoke, É., Lemberkovics, É. and László, I. (1995) Bioactive Compounds of Chamomile Hairy Root Cultures. 43rd Ann. Congr. on Med. Plant Res. Abstracts, p. 40. Halle (Germany). 2, Szoke, É., Lemberkovics, É., Troilina, J. and László, I. (1995) Essential Oil Formation in Chamomile Hairy Root Cultures. 26th International Symposium on Essential Oils, Abstracts, p. 52. Hamburg (Germany). 3, Kiss, A.S., László, I., Szoke, É., Galbács, Z. and Galbács, G. (1997) The Effect of Deuterium Depleted Medium on Plant Tumors. VIII. International Symposium on Magnesium, Book of Abstracts. p. 26. Heraklion, Crete (Greece). 4, László, I. and Szoke, É. (1997) Change of Formaldehyde Level in Tissue Culture of Datura innoxia Mill. For Abiotic Stresses. Stress of Life, International Congress of Stress, Abstracts, p. 186. Budapest. 5, László, I., Szoke, É. and Tyihák, E. (1997) The Effect of Abiotis Stresses on Formaldehyde Level in Datura innoxia Mill Tissue Culture. Second International Symposium on Natural Drugs, Abstracts p. 144. Maratea (Italy). 6, László, I., Szoke, É. and Tyihák, E. (1997) Change of Formaldehyde Level in Tissue Culture of Datura innoxia Mill. For Abiotic Stresses. VI. Semmelweis Science Fair, Abstracts p. 38. Budapest. 7, László I., Szoke É. and Tyihák E. (1998) Tropánvázas alkaloidok vizsgálata genetikailag módosított növényi szövettenyészetekben. Farmakokinetika és Gyógyszermetabolizmus Szimpozium, Abstracts p. 23. Mátraháza. 8, László I., Szoke É. and Tyihák E. (1998) Effect of Magnesium on the Methylation of Alkaloids in Datura innoxia Mill. Tissue Cultures. 6th European Magnesium Congress, Book of Abstracts p. 79. Budapest. 9, László I., Szoke É., Tyihák E. (1998) Abiotikus stresszkörülmények hatása Datura innoxia Mill. szövettenyészetek formaldehid tartalmára. Pécsi Fitoterápiás Napok, Abstracts p. 30. Pécs. 10, Szende B., Tyihák E., Trézl L., Szoke É., László I., Kátay Gy., Király-Véghely Zs. (1998) Foemaldehyde generators and capturers as influencing factors of mitotic and apoptotic processes. 4th International Conference on the Role of Formaldehyde in Biological Systems, Abstracts p. 18. Budapest. 11, László I., Szoke É., Németh Zs., Albert L. (1998) Plant tissue culture as a model for study of diversity in formaldehyde bounding. 4th International Conference on the Role of Formaldehyde in Biological Systems, Abstracts p. 26. Budapest.
6
12, László I., Szoke É., Tyihák E., Kursinszki L., Németh Zs., Albert L. (1998) The influence of culturing conditions on Datura innoxia Mill. callus and genetically modified tissue cultures. 46th Annual Congress of the Society for Medicinal Plant Research, Abstracts C30 Vienna (Austria). 13, László, I., Szoke, É., Tyihák, E., Kursinszki, L., Németh, Zs., Albert, L. (1998) The influence of culturing conditions on Datura innoxia Mill. callus and genetically modified tissue cultures. VII. Semmelweis Science Fair, Abstracts p. 31. Budapest. 14, László I., Szoke É., Tyihák E. and Szende B. (1999) Programozott sejt halál vizsgálata növényi szövettenyészetek sejtjeiben. SOTE PhD Tudományos Napok '99 Abstracts p. 44-45. Budapest. 15, László, I., Szoke, É., Tyihák, E. and Szende, B. (1999) Programmed cell death in plant tissue cultures cultivated in light and in dark. 2000 Years of Natural Products Research, Joint Meeting of: American Society of Pharmacognosy, Association Francaise pour l‘Enseignement et la Recherche en Pharmacognosie, Gesellschaft für Arzneipflanzenforschung and Phytochemical Society of Europe, Book of Abstracts P 325 Amsterdam (The Netherlands). 16, László, I., Szoke, É., Tyihák, E., Szende, B. (1999) Investigation of apoptotic processes in Datura innoxia Mill. tissue cultures. X. Symposium of Plant Anatomy in Hungary, Programme and Abstracts of Papers pp. 98-99. Debrecen. 17, László, I., Szoke, É., Tyihák, E., Sze nde, B. (1999) Investigation of apoptotic processes in Datura innoxia Mill. tissue cultures. Gyógyszerészek Országos Kongresszusa IX., Congressus Pharmaceuticus Hungaricus XI., Programme and Abstracts p. 66. Siófok. 18, László, I., Szoke, É., Tyihák, E., Szende, B. (2000) Biochemical and morphological investigation of Datura innoxia Mill. tissue cultures. 1st International Colloquium “Health, Environment and Natural Substances”, Programme and Abstracts of Papers p. 80. Metz (France). 19, László, I., Szoke, É., Kursinszki, L., Szende, B., Tyihák, E. (2000) Investigation of genetically modified and non-transformed Datura innoxia tissue cultures. The 6th European Congress of Pharmaceutical Sciences, Final Program p. 15. Budapest. 20, László, I., Szoke, É., Szende, B. (2000) Effect of dimedone and semicarbazide on the growth and metabolism of D. innoxia tissue cultures. 5th International, Jubilee Conference on Role of Formaldehyde in Biological Systems, Scientific Program and Abstracts p. 7. Sopron. 21, László, I., Kursinszki, L., Szoke, É., Tyihák, E., Szende, B. (2001) Datura innoxia Mill. szövettenyészetek biokémiai és morfológiai vizsgálata. Dr. Mozsonyi Sándor Alapítvány emlékülése Díjkiosztása és Tudományos Ülése, Program p.8. Budapest. 22, Bálványos, I., László, I., Vida, K., Hank, H., Kursinszki, L., Tóth, E., Szoke, É. (2001) Effect of magnesium on the genetically modified Atropa belladonna cultures. 7th Hungarian Magnesium Symposium, Program and Abstracts pp. 13-14. Siófok. 23, Kiss, A.S., László, I., Stefanovits-Bányi, É., Galbávs, Z., Szoke, É. (2001) Effect of magnesium on the growth of of plant tumors cultivated on culture media with reduced deuterium content. 7th Hungarian Magnesium Symposium, Program and Abstracts pp. 24-25. Siófok.
7
24, László, I., Szoke, É., Kursinszki, L., Tyihák, E., Szende, B. (2001) Effect of dimedone and semicarbazide on the growth and metabolism of plant tissue cultures. World Conference on Medicinal and Aromatic Plants, Abstracts p. 164. Budapest. 25, Kursinszki, L., László, I., Albert, L., Németh, Zs., Szoke, É. (2001) Determination of tropane alkaloids in plant samples using extrelut column and high-performance liquid chromatography. World Conference on Medicinal and Aromatic Plants, Abstracts p. 170. Budapest. 26, Hank, H., Vida, K., László, I., Bálványos, I., Kursinszki, L., Tóth, E., Szoke, É. (2001) Investigation on the tropane alkalid production of genetically modified Atropa belladonna L. in vitro cultures. World Conference on Medicinal and Aromatic Plants, Abstracts p. 265. Budapest. 27, Hank H., László I., Bálványos I., Kursinszki L., Vida K., Kovács Gy., Tóth E., Szoke É. (2002) Influence of culturing conditions on the primary and secondary metabolism of genetically modified Atropa belladonna L. tissues. PhD Tudományos Napok, P 34, Budapest. 28, Hank H., Bálványos I., László I., Vida K., Kursinszki L., Kovács Gy., Tóth E., Szoke É. (2002) Effect of magnesium on the growth and alkaloid production of hairy roots and reorganised plant cultures, P 29. The IIIrd Romanian Magnesium Symposium With International Participation, Iasi (Romania). 29, Hank H., Bálványos I., László I., Vida K., Kursinszki L., Kovács Gy., Tóth E., Szoke É. (2002) Effect of magnesium on the growth and alkaloid production of hairy roots and reorganised plant cultures. Medical plant research and utilization 2002, Program and Book of Abstracts p. 92. Kecskemét.
8
TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITUZÉS.........................................................................
1.
2. IRODALMI HÁTTÉR .......................................................................................... 2.1. Rendszertani besorolás ........................................................................................... 2.2. Morfológiai jellemzés ............................................................................................. 2.3. Elofordulás ............................................................................................................. 2.4. Tartalmi anyagok................................................................................................... 2.4.1. A Datura innoxia Mill. tartalmi anyagai............................................................
3. 3. 3. 5. 5. 7. 8. 9. 11. 12. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 18. 19. 19.
2.4.1.1. A tropánvázas alkaloidok kémiai áttekintése.................................................. 2.5. Felhasználás, terápiás hatások, toxikológia.................................................................. 2.6. A tropánvázas alkaloidok és rokon vegyületek bioszintézise...................................... 2.6.1. A tropán alkaloid bioszintézisben résztvevo fontosabb enzimek............................ 2.6.1.1. Az ornitin és arginin dekarboxilázok.............................................................. 2.6.1.2. Putreszcin-N-metiltranszferáz .................................................................. 2.6.1.3. N -metilputreszcin oxidáz.......................................................................... 2.6.1.4. Tropinon reduktázok................................................................................ 2.6.1.5. Acil transzferázok .................................................................................... 2.6.1.6. Hioszciamin 6 β-hidroxiláz....................................................................... 2.7. Tropánvázas alkaloidok kvalitatív és kvantitatív vizsgálata...................................... 2.7.1. Alkaloidtartalom meghatározása denzitometriás módszerrel.................................. 2.7.2. Gáz-folyadékkromatográfiás technikák................................................................... 2.7.3. Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszerek......................................... 2.8. In vitro tenyészetek alkalmazása az univerzális és speciális anyagcsere vizsgálatára...................................................................................................................... 2.8.1. A kallusztenyészetekrol általában............................................................................ 2.8.1.1. Datura innoxia Mill. kalluszszövetek növekedése és tropán alkaloid produkciója..................................................................................................... 2.8.2. A hairy root kultúrákról általában............................................................................ 2.8.2.1. Géntranszformáció Agrobacterium vektor rendszerek alkalmazásával......... 2.8.2.2. Kointegráns és bináris vektor rendszerek....................................................... 2.8.3. A géntranszformáció igazolása hairy root kultúrákban........................................... 2.8.3.1. A polimeráz láncreakció („polimerase chain reaction”, PCR) alkalmazása..................................................................................................... 2.8.3.2. Southern és Northern lenyomattechnika......................................................... 2.8.3.3. Opinok kimutatása.......................................................................................... 2.8.4. Tropán alkaloidok termeltetése hairy root kultúrákkal............................................ 2.8.4.1. Az inokulum tömegének hatása a növekedésre és alkaloid tartalomra.......... 2.8.4.2. A tenyésztési ido és a táptalaj pH-jának hatása a növekedésre és hatóanyag produkcióra................................................................................... 2.8.4.3. A megvilágítás hatása Datura hairy root tenyészetek növekedésére és tropán alkaloid produkciójára.................................................................... 2.8.4.4. A tápközeg összetételének hatása a kultúrák növekedésére és tropán alkaloid produkciójára.................................................................... 2.8.4.5. Transzgének hatása a tropán alkaloid metabolizmusra................................. 2.8.4.6. A Datura hairy root kultúrák genetikai stabilitása.........................................
9
20. 20. 20. 21. 22. 24. 26. 26. 26. 27. 29. 31. 32. 33. 34. 36. 38.
2.9. Formaldehid a biológiai rendszerekben...................................................................... 2.9.1. Az endogén formaldehid szerepe a növényi anyagcserében.................................. 2.9.2. Az endogén HCHO tartalom és a stresszhatások kapcsolata................................. 2.10. Programozott sejthalál és apoptotikus formája a növényekben, kis - (pl. H2O 2 és HCHO) és nagymolekulák szerepe .................................................. 2.10.1. A növényi apoptózis morfológiai jellemzése......................................................... 2.10.2. TUNEL reakció alkalmazása a növényi apoptózis detektálására.......................... 2.10.3. Az apoptózis folyamatában szerepet játszó gének................................................. 2.10.4. Programozott sejthalál aktiválásában szerepet játszó hírvivo folyamatok............ 2.10.5. Mitokondrium és enzimfehérjék szerepe a programozott sejthalál során.............. 2.10.6. Reaktív oxigéntartalmú molekulák (ROS) szerepe................................................ 2.10.7. Oxidatív stressz, mitokondriumok és Ca2+ homeosztázis kapcsolata a PCD folyamatában............................................................................ 2.10.8. A szingulet oxigén toxikus és apoptotikus hatásai................................................ 2.10.9. A HCHO szerepe a sejtek apoptotikus folyamataiban...........................................
3. VIZSGÁLATI ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK................................................. 3.1. D. innoxia in vitro növények létrehozása és tenyésztése.............................................. 3.2. Szövetkultúrák eloállítása és fenntartása..................................................................... 3.2.1. Kallusztenyészetek................................................................................................... 3.2.2. H airy root kultúrák................................................................................................... 3.2.3. A géntranszformáció igazolása hairy root kultúrákban........................................... 3.2.3.1. D. innoxia in vitro növény és hairy root kultúrák vizsgálata PCR technikával.............................................................................................. 3.2.3.2. A szövetek opin termelésének vizsgálata papír elektroforézissel.................... 3.3. A kultúrák növekedési aktivitásának jellemzése......................................................... 3.3.1. Friss súly meghatározása......................................................................................... 3.3.2. Szárazsúly meghatározása....................................................................................... 3.3.3. Szárazanyag tartalom meghatározása...................................................................... 3.3.4. Növekedési érték (NÉ) számítása............................................................................ 3.4. A folyékony MS tápközeg pH-jának meghatározása.................................................. 3.5. Az AMS és M S tápközegek összetételének módosítása............................................... 3.5.1. Szacharóz tartalom változtatása............................................................................... 3.5.2. MgSO4 tartalom módosítása.................................................................................... 3.5.3. Dimedon és szemikarbazid alkalmazása.................................................................. 3.5.4. Aminoguanidin és hidralazin alkalmazása............................................................... 3.6. Tropán alkaloidok kimutatása és meghatározása....................................................... 3.6.1. Növényi szövetek hisztokémiai vizsgálata Dragendorff-reagens alkalmazásával......................................................................................................... 3.6.2. MALDI-MS módszer............................................................................................... 3.6.3. HPLC módszer......................................................................................................... 3.7. Endogén HCHO kimutatása és meghatározása........................................................... 3.7.1. MALDI-MS módszer............................................................................................... 3.7.2. OPLC eljárás............................................................................................................ 3.7.3. HPLC módszer......................................................................................................... 3.8. TUNEL reakció alkalmazása az apoptotikus sejtek kimutatására............................ 3.9. A kísérleti eredmények statisztikai kiértékelése..........................................................
10
39. 43. 45. 47. 48. 51. 52. 52. 53. 54. 57. 59. 60. 61. 61. 61. 61. 61. 63. 63. 64. 65. 65. 65. 66. 66. 66. 66. 66. 67. 67. 67. 68. 68. 68. 69. 70. 70. 71. 71. 71. 72.
4. EREDMÉNYEK.................................................................................................... 4.1. D. innoxia in vitro növények vizsgálata......................................................................... 4.1.1. Az in vitro növények növekedése és alkaloid tartalma............................................ 4.1.2. D. innoxia in vitro növények gyökereinek szövettani vizsgálata............................ 4.1.2.1 A fiatal gyökerek vizsgálata HE festést követoen............................................ 4.1.2.2. Hisztokémiai vizsgálatok Dragendorff reagens alkalmazásával.................... 4.1.2.3. TUNEL reakció alkalmazása.......................................................................... 4.2. Kallusz kultúrák ............................................................................................................. 4.2.1. A tenyészetek növekedése és mérheto endogén HCHO koncentrációja................. 4.2.2. Szövettani jellemzés................................................................................................. 4.2.3. Abiogén stressz hatása a kultúrák növekedésére..................................................... 4.2.4. Abiogén stressz hatása a kultúrák mérheto HCHO tartalmára................................ 4.2.5. A kalluszsejtek apoptotikus folyamatainak vizsgálata............................................ 4.3. Hairy root tenyészetek.................................................................................................... 4.3.1. A géntranszformáció igazolása................................................................................ 4.3.1.1. Polimeráz láncreakció.................................................................................... 4.3.1.2. Opinok kimutatása.......................................................................................... 4.3.2. A hairy root klónok növekedési jellemzoinek vizsgálata sötétben és fényen.......... 4.3.3. A klónok tropán alkaloid tartalma és alkaloid produkciója..................................... 4.3.4. A hairy root kultúrák szövettani vizsgálata............................................................. 4.3.4.1. Az MS alaptáptalajon nevelt szövetek vizsgálata............................................ 4.3.4.2. Hisztokémiai vizsgálatok Dragendorff reagens alkalmazásával.................... 4.3.5. A tápközeg összetételének hatása a növekedésre és hatóanyag produkcióra.......... 4.3.5.1. Szacharóz hatása............................................................................................ 4.3.5.2. A MgSO4 hatása.............................................................................................. 4.3.6. Abiogén stressz hatása a hairy root szövetek növekedésére és hatóanyag produkciójára........................................................................................................... 4.3.6.1. A dimedon hatása............................................................................................ 4.3.6.2. A szemikarbazid hatása................................................................................... 4.3.6.3. A dimedonnal és szemikarbaziddal kezelt hairy root kultúrák szövettani vizsgálata....................................................................................... 4.3.6.4. Terápiában alkalmazott vegyületek hatása D. innoxia hairy root szövetek fejlodésére és alkaloid termelésére................................................................
73. 73. 73. 74. 74. 74. 75. 75. 76. 78. 79. 82. 82. 83. 85. 85. 86. 87. 90. 97. 97. 98. 98. 99. 100. 104. 104. 113. 120. 122.
5. EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA ÉS TÁRGYALÁSA........................... 127. 5.1. D. innoxia in vitro kultúrák vizsgálata.......................................................................... 127. 5.2. A tápközeg összetevoinek hatása a hairy root tenyészetekre ...................................... 132. 5.3. Abiogén stressz hatása a kallusz és hairy root kultúrákra......................................... 133.
6. KÖSZÖNETNYILVÁNÍT ÁS............................................................................... 141. 7. IRODALOMJEGYZÉK 8. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK KÜLÖNLENYOMATAI
11
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ACH
α-ciano-4-hidroxi-szinnapinsav
ADC
arginin dekarboxiláz
Ai
apoptotikus index
AOX
alternatív oxidáz
ATP
adenozin-trifoszfát
BI-1
BAX-inhibitor 1
CaMV35S
karfiol mozaik vírus 35S promoter
2,4-D
2,4-diklórfenoxi ecetsav
#410, #411, #415 Di HMA
Agrobacterium rhizogenes A4 törzzsel fertozött orvosi maszlagból (Datura innoxia Mill.) nyert hairy root klónok N G-dihidroximetil-14 C-arginin
DML
N ε-N ε-dimetil-L-lizin
DPX
DNS-fehérje keresztkötéseket
GC
gázkromatográfia
GLC
gáz-folyadékromatográfia
GUS
β-glukuronidáz gén
H 2 O2
hidrdogén-peroxid
H6H HCHO
hioszciamin 6β-hidroxiláz formaldehid
HE
haematoxilin-eozin
HPLC
nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia
HR
hiperszenzitív válaszreakció
i.d.
internal diameter, belso átméro
MALDI-MS
mátrix lézer ionizációs tömegspektrometria
MAO
monoamin-oxidáz
Me-Asc
metil-aszkorbigén
MML Mo HMA
N ε-monometil-L-lizin N G-monohidroximetil-14 C-arginin
MPO
N-metilputreszcin oxidáz
MS
Murashige-Skoog táptalaj
NADPH
hidrogénezett nikotinsavamid-dinukleotid-foszfát
NMR
mágneses magrezonancia spektroszkópia
NO
nitrogén monoxid
NPT II
neomycin -foszfotranszferáz
1
szingulett oxigén
O2
12
ODC
ornitin dekarboxiláz
OPLC
túlnyomásos folyadékkromatográfia
PCD
programozott sejthalál
PMT
putreszcin-N-metiltranszferáz
PT
„pore transit ion”
ROI
reactive oxygen intermediates
ROS
reactive oxygen species
SA
szalicilsav
SAH
S-adenozil-homocisztein
SAM
S-adenozil-metionin
SOD
szuperoxid dizmutáz
SPE
”solid phase extraction”, szilárd fázisú extrakció
SSAO
szemikarbazid-szenzitív amin oxidáz
T-DNS
transzfer-DNS
THF
tetrahidrofolát
TML
N ε-N ε-N ε-trimetil-L-lizin
TMV
dohánymozaik vírus
TR I és II
tropinon reduktáz I és II
Tri HMA
N G-trihidroximetil-14 C-arginin
TUNEL UV
(„terminal deoxynuclotidyl labelling”) ultraviola
VRK
vékonyréteg kromatográfia
YMB
Yeast Mannitol Broth táptalaj
13
transferase-mediated dUTP nick end
1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITUZÉS A növényi speciális anyagcsere termékei fontos alapanyagforrást jelentenek az élelmiszer-, kozmetikai- és gyógyszeripar számára. Ezek a vegyületek a legtöbbször csupán kis mennyiségben találhatók meg a növényekben, felépítésük pedig a legtöbbször bonyolult, így szintézis útján történo ipari méretu eloállításuk – néhány kivételtol eltekintve - nem megoldott. Az analitikai módszerek fejlodésével ugyanakkor egyre nagyobb számú növényi anyagcseretermék feltárására és megismerésére van lehetoség. A biotechnológiai módszerek és molekuláris biológiai ismeretek bovülésével párhuzamosan új lehetoségek nyíltak a növényi sejtek univerzális és speciális anyagcseréjének jobb megismerésére laboratóriumi körülmények között, így egyes sejt- és szövetkultúrák ma már reális lehetoséget nyújtanak bizonyos növényi vegyületek ipari méretu eloállításához is. Az in vitro fenntartott növényi sejtek és szövetek vizsgálata – hasonlóan a humán/állati sejt- és szövetkultúrákhoz – információt adhat egyes vegyületek univerzális és speciális anyagcserére, apoptotikus folyamatokra gyakorolt hatásának jobb megértéséhez (pl. rákkelto hatás vizsgálata). A növényi sejtekben, szövetekben lezajló programozott sejthalál (PCD) folyamatáról rendelkezésre álló, rohamosan bovülo ismeretanyag alapján feltételezheto, hogy - a humán/állati és növényi sejtek felépítésében lévo alapveto különbségek ellenére – egyes alapveto szabályozó folyamatok közösek maradtak az evolúció során. Vizsgálataink során Datura innoxa Mill. (orvosi maszlag) különbözo – genetikailag nem módosított és géntranszformált – szövetkultúráit használtuk fel. A növény – sok más speciális anyagcseretermék mellett – gyógyászati szempontból fontos tropánvázas alkaloidokat, többek között szkopolamint és hioszciamint tartalmaz. Mindkét vegyület paraszimpatolitikus hatású (pl. spazmolitikus, nyál és gyomornedv szekréciót csökkento, midriatikus hatás), így szélesköruen alkalmazzák oket a szemészetben, továbbá szívbetegségekben és gyomor-, bélrendszeri panaszok esetén. Bár a tropánvázas alkaloidok bioszintézise, a folyamatban résztvevo enzimek legtöbbje ma már ismert, ennek ellenére még számos lépés nem tisztázott részletesen. Az S-adenozil-metionin (SAM) közremuködésével végbemeno transzmetilezési reakciók alapveto szerepet játszanak a bioszintézis során. A tropán alkaloidok bioszintézise ugyanakkor szoros kapcsolatban áll a poliaminok bioszintézisével, melyeknek többek között a különbözo stresszhatások leküzdésében játszanak szerepet. Munkánk során vizsgálni kívánjuk az in vitro D. innoxia növények felhasználásával nyert kallusz-, valamint géntranszformált gyökérkultúrák (ún. hairy root tenyészetek) növekedését és tropán alkaloid tartalmát. A kultúrák növekedését és alkaloid bioszintetizáló képességét számos körülmény
14
befolyásolhatja kedvezoen, így tanulmányozni kívánjuk a megvilágítás, továbbá a tápközeg szacharóz (szénforrás) és Mg 2+ (makroelem) tartalmának hatását a szövetek fejlodésére, biomassza produkciójára, hioszciamin és szkopolamin tartalmára. A különbözo szövetkultúrák sejtjeiben lezajló, jellegzetes morfológiai változásokkal kísért apoptotikus folyamatokat is kiemelt figyelemmel kísérjük. Irodalmi adatok támasztják alá, hogy a különbözo humán, állati és növényi sejtek, szövetek mérheto mennyiségu endogén formaldehidet (HCHO) tartalmaznak, valamint a mérheto HCHO tartalom szoros kapcsolatban áll a különbözo biogén és abiogén stresshatásokkal. A D. innoxia kallusz és hairy root szövetek endogén HCHO tartalmát dimedon alkalmazásával tervezzük kimutatni és mérni, mely irreverzibilisen reagál a HCHO-el, és a keletkezo reakciótermék (formaldimedon) több analitikai módszerrel is kimutatható és mérheto. Abiogén stresszhatások, valamint a növekedés, alkaloid metabolizmus, mérheto endogén HCHO tartalom közötti kapcsolat tanulmányozása során célul tuztük ki – a szakirodalmi adatok alapján a transzmetilezési reakciókra alapveto hatást gyakorló – a tenyészetek tápközegébe adagolt vegyületek hatásának (pl. dimedon, szemikarbazid, aminoguanidin és hidralazin) vizsgálatát. A dimedon és szemikarbazid adagolását követoen részletesebben kívánjuk tanulmányozni a molekulák apoptotikus folyamatokra gyakorolt esetleges hatását. Eredményeinkkel szeretnénk hozzájárulni a D. innoxia szövettenyészetek növekedésének, a lezajló apoptotikus folyamatok és a tropánvázas alkaloidok metabolizmusának jobb megismeréséhez, továbbá az abiogén stresszhatások (speciális kémiai stressz) során bekövetkezo változások alaposabb megértéséhez.
15
2. IRODALMI HÁTTÉR 2.1. Rendszertani besorolás A Datura innoxia
Mill. (orvosi maszlag) a Spermatophyta
(magvas növények) törzs,
Angiospermatophyta (zárvatermok) altörzs, Dicotyledonopsida (kétszikuek) osztály, Lamiidae (Tubiflorae) alosztály, Solananae rendcsoport, Solanales rend, Solanaceae (burgonyafélék) családjába sorolható [1]. A Datura nemzetségbe mintegy 20-25 faj tartozik, melyek négy további szekcióba oszthatók: -
Brugmansia (pl. D. arborea L., D. sanguinea Ruiz et Pav.),
-
Stramonium (pl. D. ferox L., D. quercifolia , D. stramonium L.),
-
Datura (pl. D. innoxia Mill., D. metel L.),
-
Ceratocaulis (pl. D. ceratocaula Ort.) [2].
2.2. Morfológiai jellemzés A Datura nemzetség növényei lágyszárúak, de cserjék és fatermetu növények is elofordulnak közöttük. A lomblevelek osztatlanok, többnyire nyelesek és gyakran hullámos, vagy fogazott széluek. A virágokra a 4 körösség és 5 tagúság jellemzo. A virágtakaró forrt, a csésze csoszeru, teljesen, vagy részle gesen az elvirágzás után is megmarad. A nagy, tölcsér formájú virág alul henger alakú, felül kiszélesedik, leggyakrabban fehér színu (1. és 2. ábra). A porzók szála a pártacsohöz no. A magház kétüregu, a járulékos válaszfalak révén négyüregunek tunik. A te rmés tok, vagy bogyó, melyek nagy számú lapos magvat tartalmaznak. Közép- és Dél-Amerikában fa termetu Datura fajok is megtalálhatók, melyek virágai elérhetik a 26cm hosszúságot, termésük pedig bogyó [2]. A D. innoxiát Miller írta le eloször 1768-ban. A növény hazájaként Mexikót jelölte meg és utalt arra hogy a termése lecsüngo, tüskés, szabálytalanul felnyíló tok [3]. A növény 1-2m magas egyéves növény, elágazó földfeletti hajtással. A gyökér 30- 60cm hosszú, 2-4cm vastag, orsó formájú, több mellékgyökérrel. A levelek erosen aszimmetrikusak, szív alakúak, épszéluek, vagy enyhén fogazottak, továbbá - a fiatal szárakhoz hasonlóan - szorösek. A virágok fehérek, a párta 10 cimpájú. A cimpák hosszúak, karomszeruen görbültek (1. ábra). A termés 0,5-1cm hosszú tüskékkel borított, szabálytalanul felnyíló, lelógó, gömb alakú toktermés. A magok barna színuek, vese alakúak,
karunkulával nem rendelkeznek (1. ábra ) [2]. Citológiailag a paliszád és szivacsos parenchima sejtrétegei között elhelyezkedo kristályok típusa diagnosztikai értéku, az orvosi maszlag kálcium oxalát rozettákat tartalmaz. Szövettanilag a
16
bikollaterális szállítónyalábok és a többsejtu nyelu, egysejtu fejjel rendelkezo mirigyszorök jellemzoek. Elofordulnak ún. Solanaceae mirigyszorök is, melyek 6-8 sejtu fejjel rendelkeznek. Az érszigetek szögletesek, a benyúló érágak V-alakban ágaznak el. A D. innoxiát leggyakrabban a D. metel var. metel-lel tévesztik össze, utóbbinak azonban fülkagyló formájú magja van, lila, vagy fehér színu karunkulával, pártája pedig 5 cimpájú. A D. metel levele továbbá 3 karéjú és majdnem kopasz [3].
1. ábra A Datura innoxia Mill. virág (a): párta (b), csésze (c), termo- (d) és porzótáj (e), valamint mag (f), és termés (g) habitusképe [2].
17
2. ábra Datura in noxia Mill. virágzó hajtás 2.3. Elofordulás A Solanaceae családba tartozó fajok foként trópusi-, szubtrópusi területeken honos növények, de egyes fajok a mérsékelt égövi területeken is megtalálhatók. A különbözo Datura fajok több kontinensen elofordulnak: Dél Ázsiában (D. metel), Kína mérsékelt övi területein (D. ferox), Amerika trópusi és szubtrópusi tájain, továbbá Ausztráliában (D. leichhardtii) is megtalálhatók. A Közép-Európában igen elterjedt D. stramonium amerikai eredetu, a XVI. században került Európába [4]. A D. innoxia megtalálható Mexikóban, Nyugat-Indiában, Dél-Amerikában, valamint egyéb szubtrópusi területeken. Termesztik Közép- és Dél-Amerikában, Észak-Afrikában, Indiában és Európában (pl. Nagy-Britannia) is [2 ]. Hazánkban szintén termesztheto, alsó három elágazásában általában beérleli termését [3]. 2.4. Tartalmi anyagok A Datura nemzetség valamennyi növényfajára a tropán alkaloidok elofordulása jellemzo néhány tized százaléktól néhány százalékig terjedo mennyiségben. Az alkaloid tartalom széles határok között, 52µg/g-tól 1350 µg/g értékig változhat (friss súlyra vonatkoztatva). A nemzetség legtöbb növényfajában foalkaloidként hioszciamin, vagy szkopolamin, valamint nagyobb mennyiségben meteloidin található. A hioszciamin-szkopolamin arány fajonként eltéro [5,6]. Jelentos D. starmonium magjának aminosav és fehérje, hemagglutinin (lecitin), továbbá cserzoanyag tartalma, de a tropánvázas vegyületek mellett β-karbolin alkaloidok is találhatók bennük. A szteránvázas vegyületek közé sorolható vitanolidok elofordulását írták le D. ferox , D. innoxia, D. metel, D. quercifolia és D. stramonium fajokban (3. ábra) [2,6,7].
CH3
CH2OH O
O H O CH3
H
O CH3
3. ábra A D. metel-bol izolált daturilinol vitanolid szerkezeti képlete [2].
18
I. táblázat A Datura quercifolia-ból izolált daturalaktonok szerkezete [2]. CH3 24
R1
R2
H3C
25
CH3
CH 2R 3
O
daturalakton
R1
R2
R3
24-25
1
-OH
-H
-H
-epoxi
2
=O
-H
-epoxi
3
-H
-OH
-H
---
4
-H
-H
-H
-epoxi
CH2
O CH3
CH3
O
A D. quercifolia -ban több daturalaktont is azonosítottak (I. táblázat). A különbözo fajokra ezeken túl kumarinok (pl. szkopoletin), kaliszteginek, lektinek, flavonoidok, továbbá kávésav és származékainak elofordulása jellemzo [2]. Újabb kutatási eredmények tárták fel az ún. kaliszteginek jelenlétét, melyek pszeudotropinból vezethetok le. A hidroxil csoportok polárissá teszik a molekulákat, ezért a hagyományos apoláris kivonószerek nem távolítják el oket a vizes fázisból az extrakció tisztítási lépése során [8,9]. Eloször a Calystegia sepium (L.) géntranszformált gyökérkultúráiból sikerült izoláln i ezeket a vegyületeket, melyek polihidroxi származékok, nortropán alapvázzal (4. ábra). HN
HN
HN
HO
OH
HO OH
OH
OH
HO
kalisztegin A 5
kalisztegin A 3
HN
HN OH
HO
HO
OH
HO
OH
OH
kalisztegin B 3
kalisztegin B 2
HN
kalisztegin B 4
HN OH
HO HO
OH
HN
OH
OH
OH
OH
kalisztegin B1
OH
HO
OH
OH
H2N
OH
OH
kalisztegin C 1
kalisztegin N 1
4. ábra Néhány jellemzo kalisztegin molekula szerkezete [11].
19
OH
OH
Több típusukat különböztethetjük meg, így pl a trihidroxi származékok a kalisztegin-A csoportba, a tetrahidroxi származékok a kalisztegin-B csoportba, a pentahidroxi származékok pedig a kaliszteginC csoportba sorolhatók (4. ábra) [10,11]. 2.4.1. A Datura innoxia Mill. tartalmi anyagai A D. innoxia Mill. és más Datura fajok - a szintén Solanaceae családba tartozó Atropa, Duboisia, Hyoscyamus és Scopolia fajokhoz hasonlóan - számos, gyógyászati és toxikológiai szempontból fontos tropánvázas alkaloidot tartalmaznak [10,12-14]. Az eddigi vizsgálatok során a D. innoxia-ban több mint 30 tropán- és pirrolidinvázas alkaloidot sikerült kimutatni és azonosítani (II. táblázat) [2,15]. A növény különbözo szervei általában 0,05%-0,5% összalkaloidot tartalmaznak [6,16,17]. Legjelentosebbek az L-hioszciamin (racém elegye az atropin), és L-szkopolamin (hioszcin). A hioszciamin elnevezés a Hyoscyamus niger nevébol származik, melybol az elobb említett alkaloidokat II. táblázat A Datura innoxia Mill. tropán- és pirrolidinvázas alkaloidjai [15].
20
eloször izolálták. Mindkét alkaloid megtalálható D- és L- formában, de csupán az L-konfigurációjú vegyületek a terápiásan aktívak. Racemizáció, atropin (D-L-hioszciamin) keletkezése foleg a növénybol történo izoláció során következik be. A hioszciaminnal szemben a szkopolamin jóval kisebb mértékben racemizálódik [10]. A növény különbözo részei eltéro alkaloid spektrummal rendelkeznek. A gyökér - mint az alkaloid bioszintézis helye - igen nagy számú tropán alkaloidot tartalmaz, de a pirrolidinvázas alkaloidok jelenléte is jellemzo (pl. higrin, kuszkohigrin) (II. táblázat). A hajtásra a szkopolamin, mint foalkaloid jelenléte, továbbá a hioszciamin és meteloidin elofordulása jellemzoek. A levelekben a hioszciamin és szkopolamin mellet nagy számú egyéb tropán észter és tiramin (biogén amin) található, mely utóbbi a virágok alkaloid kivonatának is egyik fo összetevoje (II. táblázat) [2,15]. A D. innoxia szöveteiben az alkaloidok kristályos formában raktározódhatnak, különbözo idioblasztokban. Izotópos és hisztokémiai vizsgálatok eredményei támasztják alá tropán alkaloidok
21
jelenlétét a mirigyszorökben is. Intercelluláris raktározás elsosorban a gyökér szöveteire jellemzo [3,6]. 2.4.1.1. A tropánvázas alkaloidok kémiai áttekintése A tropánvázas alkaloidok kémiai szerkezetük alapján észterek, melyek amino-alkohol részbol (pl. tropinból és szkopinból) (5. ábra) és észterifikáló alifás, vagy aromás savból állnak (6. ábra). Az aminoalkohol molekularész egy pirrolidin és egy piperidin gyurut tartalmaz, melyek N atomja és két C atomja közös [18]. A tropánváz acetát prekurzorból, továbbá a glutamin-prolin-ornitin ciklus egy tagjából alakul ki. Ma már közel 200 olyan alkaloidot ismerünk, melyek az említett biciklusos
gyururendszert
CH3
tartalmazzák
[6,19].
Az
CH3
N
molekularész
3-as
CH3 HN
N
N HO
OH OH
OH tropin
aminoalkohol
OH
nortropin
pszeudotropin
6-hidrox i-tropin
CH3
CH3
N
HN
N HO HO
O
O
OH
OH szkopin
norszkopin
OH tel oidi n
5. ábra Fontosabb tropanol alapvázak szénatomján rendszerint α-térállású hidroxil csoport található (β-OH pl. a pszeudotropinban). Több hidroxil csoport is lehet az alapvázon - pl. a 6-os és 7-es szénatomokon a teloidin esetén -, így a monoészter származékok mellett lehetoség van di- és triészterek kialakulására is. A szkopin molekulában a 6-7-es helyzetben epoxidáció történik (5. ábra) [20]. A tropánvázas alkaloidok túlnyomó többsége észter, melyek felépítésében a hidroxitropán/tropanol molekularész mellett számos karbonsav vehet részt. A savak egy része kizárólag a tropánvázas alkaloidok kialakításában vesz részt (pl. tropasav), mások viszont igen elterjedtek az élovilágban (pl. fahéjsav, benzoesav). Szerkezetüket tekintve elofordulnak aromás és alifás savak, továbbá dikarbonsavak is (6. ábra) [19].
22
CH3 CH CH3
CH3 HOOC CH2
HOOC CH CH3 izovajsav
HOOC C CH3 H C CH3
izovaleriánsav
COOH
tiglinsav
CH CH COOH
COOH
OCH3 OH
benzoesav
CH CH COOH
vanillinsav
HOOC CH CH
fahéjsav
H HOOC C CH2OH
HOOC C CH2 truxillsav
tropasav
atropasav
6. ábra A leggyakrabban eloforduló észterifikáló savak 2.5. Felhasználás, terápiás hatások, toxikológia A tropánvázas alkaloidok a gyógyászatban legrégebben alkalmazott vegyületek közé tatroznak, így a különbözo Datura fajokat is több földrész népi gyógyászatában alkalmazták. Az oshonos területeken foleg a bennszülött törzsek orvos-varázslói alkalmazták oket, mivel hatóanyagaik mérgek, továbbá narkotikus és hallucinogén hatásúak. A központi idegrendszerre hatva transzszeru állapotot idéznek elo [4,6,21,22]. CH3
CH3 N
N O
O O
C CH
O O
C CH CH2OH
CH2OH hioszciamin
szkopolamin
7. ábra A hioszciamin és szkopolamin szerkezeti képlete A hioszciamin (atropin) és szkopolamin (7. ábra) befolyásolják a paraszimpatikus idegrendszer muködését. Az acetilkolin és más muszkarin agonisták ko mpetitív antagonistái a posztganglionáris
23
kolinerg rostokkal beidegzett szervekben. Paraszimpatolitikus hatásaik miatt - spazmolitikus, nyál és gyomornedv szekréciót csökkento, midriatikus hatás - szélesköruen alkalmazzák oket a szemészetben, továbbá szívbetegségekben és gyomor-, bélrendszeri panaszok esetén [3,23]. Kolinészteráz gátló vegyületekkel történt mérgezés esetén antidótumként használhatók. Perifériás antikolinerg hatásaik mellett a központi idegrendszer muködésére is hatással vannak. Az atropin és szkopolamin lényegében azonos perifériás hatásaival szemben a központi idegrendszer muködését ellentétesen befolyásolják. Az atropin izgató hatású, a szkopolamin viszont bódulatot okoz, mivel az agyban gátolja a kéreg alatti magvak muködését. Ezen alapul utóbbi alkaloid felhasználása anesztetikumként. A Parkinson kór tüneteinek enyhítésére is jól alkalmazhatók, továbbá a szkopolamin tartalmú készítményeket a tengeribetegség kialakulásának megelozésére is felhasználják [3,6,10]. A tropán alkaloid tartalmú növényi mérgezések fo tünetei a vizuális hallucinációk jelentkezése, midriázis, tachicardia, végül az agykérgi muködések gátlása (letargia, kóma). Antidótumként kolinészteráz gátlók (pl. fizosztigmin) adása, továbbá hánytatók (pl. emetin) alkalmazása, a felszívódás gátlása (aktív szén) és a gyomor-bélperisztaltika serkentése (Mg-citrát) jöhet szóba [21]. A kaliszteginek - melyek nortropán alapvázzal rendelkezo polihidroxilezett alkaloidok – más polihidroxi alkaloidokhoz hasonlóan számos glikozidáz enzim kompetitív inhibitorai. Hatásuk alapja feltehetoen a szénhidrátokhoz látszólag hasonló kémiai szerkezet. A glikozidázoknak több alapveto élettani folyamatban van szerepük, így pl. az emésztésben, a glikoproteinek bioszintézisében és a glikokonjugátumok
lizoszómális
lebontásában.
Glikozidáz
inhibitorok -
mint
potenciális
gyógyszerkészítmények - antidiabetikus, antivirális, antimetasztatikus és immunomoduláns hatásaik révén kerülhetnek felhasználásra [24-26]. Kalisztegin tartalmú növények takarmányként történt felhasználásakor degeneratív idegrendszeri elváltozásokat figyeltek meg szarvasmarhákban. Újabb vizsgálatok kimutatták számos kalisztegin (kalisztegin A1 , B1 , B2 és C 1 ) jelenlétét több gyümölcsben és zöldségben (pl. burgonya, édesburgonya, paradicsom, stb.), így nagy mennyiségek fogyasztása esetén felmerülhet a humán intoxikáció lehetosége is [27,28 ]. 2.6. A tropánvázas alkaloidok és rokon vegyületek bioszintézise A tropán alkaloid bioszintézis lépéseinek feltárása már az 1950-es évek óta folyik, amikor si az izotópok alkalmazása új lehetoségeket adott a kutatók számára [29,30 ]. A különbözo in vitro sejt és szövetkultúrák felhasználása szintén nagy elorelépést hozott. A részletes vizsgálatok - így pl. a bioszintézis sztereokémiai sajátságainak alapos tanulmányozása - ellenére azonban a folyamat és a benne résztvevo enzimek még napjainkban sem ismertek teljes részletességgel [10,31].
24
Romeike úttöro munkáját követoen [23,32,33] vált elfogadottá, hogy a hioszciamin bioszintézise a növények gyökereiben történik. Az alkaloidok bioszintézisével, egymásba történo átalakulásával kapcsolatban azonban figyelembe kell venni a transzlokáció, akkumuláció szerepét is [5,12]. Korábban elvégzett vizsgálatok eredményei azt mutatták ki, hogy a hioszciamin tartalom a gyökerek felol a föld feletti részek, levelek felé haladva jelentosen csökken ugyanakkor a szkopolamin aránya egyre no. A gyökerek hioszciamin - szkopolamin aránya 50% körüli, míg a levelekben ez alig éri el a 10%-ot a hioszciaminra nézve. Ezek az eredmények megerosítik a hioszciamin transzport közbeni átalakulását szkopolaminná [12]. Az alkaloidok amino-alkohol molekularészének bioszintézise ornitin, arginin és putreszcin prekurzorokból egyaránt levezetheto [18,34,35]. A putreszcinnek központi szerepe van a bioszintézis kezdeti fázisában, mivel ornitinbol, vagy argininbol kiindulva egyaránt ezen a molekulán keresztül megy végbe a metabolizmus (8. ábra). A tropánvázas alkaloidok bioszintézisének kezdeti szakasza ugyanakkor szoros kapcsolatban áll a poliaminok, a pir idin- és pirrolidinvázas alkaloidok bioszintézisével (8. ábra). A putreszcin a spermidin és spermin poliaminok prekurzora, melyek befolyásolhatják a tropán alkaloid bioszintézist is [36]. A poliaminok kialakításában – a prekurzor vegyületen túl – a SAM molekula is alapveto szerepet játszik. A putreszcin, spermidin és spermin a legtöbb növényi szövetben megtalálható. Alapveto szerepet töltenek be a sejtosztódásban, a morfogenezisben, az öregedésben a növény növekedése, fejlodése során, valamint lényeges szerepük van a különbözo stresszhatások leküzdésében [35,37].
25
ornitin
arginin
ADC agmatin
ODC N-karbamoilputreszcin
putreszcin
spermidin
PMT N-metilputreszcin
spermin
MPO N-metilpirrolinium só
piridin- és pirrolidinvázas alkaloidok (pl. nikotin, kuszkohigrin)
higrin
tropinon
TR I
TR II
tropin
hioszciamin
pszeudotropin
más észterek
kaliszteginek
H6H sz kopolamin
8. ábra A tropánvázas alkaloidok és rokon vegyületek bioszintézisének feltételezett mechanizmusa és kapcsolata [39,40]. (ADC: arginin dekarboxiláz, ODC: ornitin dekarboxiláz, PMT: putreszcin-Nmetiltranszferáz, MPO: N-metilputreszcin oxidáz, TR I és II: tropinon reduktáz I és II, H6H: hioszciamin 6β-hidroxiláz) 2.6.1. A tropán alkaloid bioszintézisben résztvevo fontosabb enzimek 2.6.1.1. Az ornitin és arginin dekarboxilázok Az ornitin ornitin-dekarboxiláz (ODC) hatására putreszcinné alakul. Az ornitin beépülése során az aminosav α-C atomjából alakul ki a tropán váz egyes számú C atomja. Az elso prekurzor valószínuleg az α-keto-δ-amino valeriánsav, mely az ornitinbol oxidatív deaminálás során alakulhat ki, az α-keto-δ valeriánsav pedig spontán módon 1 -prolin-2-karbosavvá alakul. A putreszcin az ornitinhez hasonló arányban épülhet az alapvázba (közel 50%), ami azt jelenti, hogy a tropint szintetizáló enzimrendszer nem specifikus, vagyis nem tesz különbséget az ornitin és
26
putreszcin között. Mivel a metil-putreszcin beépülése igen jelentos, a metilezés feltehetoen a ciklizációt megelozoen következik be [38]. Izotópos vizsgálatokkal igazolták, hogy H. albus gyökérkultúrákban a tropanol váz pirrolidin gyuruje ornitinbol, vagy agmatinon keresztül argininbol alakulhat ki [41]. A. belladonna és D. stramonium hairy root kultúrák alkalmazásával megerosítették az L-arginin prekurzor funkcióját, ugyanakkor a korábban intermedier vegyületnek tartott δ-N-metilornitin szerepét sikerült kizárni [19]. NH NH2 H2N
N H
COOH
arginin ADC NH
NH2 H2N
NH2
COOH H2N
ornitin
N agmatin
ODC O NH2
NH2
H2N putreszcin
H2N
N N-karbamoilputreszcin
9. ábra A putreszcin bioszintézise az ornitin és arginin aminosavakból [10]. Az ODC az ornitin-putreszcin átalakulás folyamatát katalizálja, az arginin dekarboxiláz (ADC) pedig az agmatin N-karbamoilputreszcinen át történo kialakulását szabályozza argininbol kiindulva (9. ábra). A két enzim aktivitása eltéro lehet, így pl. H. albus gyökérkultúrákban az ADC aktivitás több mint kétszerese volt az ODC aktivitásának [41]. Az ADC csupán baktériumokban és növényekben fordul elo, az ODC viszont minden élolényben megtalálható, fontos szerepe van a sejtproliferációs folyamatokban és elengedhetetlenül szükséges a sejtek normális fejlodéséhez. 2.6.1.2. Putreszcin-N-metiltranszferáz Az ornitintol N-metilpirrolinium kation kialakulásához vezeto folyamat (mely a tropánvázas és piridinvázas alkaloidok bioszintézisének közös szakasza) legfontosabb intermedierjei a putreszcin és az N-metilputreszcin (10. ábra). A putreszcin ugyanakkor a poliamin bioszintézis (pl. spermin és spermidin) prekurzor vegyülete is. A putreszcin-N-metiltranszferáz enzim (PMT) a putreszcin – Nmetilputreszcin átalakulást katalizálja, mely a tropán alkaloidok bioszintézisének elso specifikus lépése [42]. Az enzim - melyet A. belladonna, D. stramonium, H. albus és N. tabacum szöveteibol is
27
sikerült izolálni – az SAM metil csoportjának a putreszcin egyik amino csoportjára történo transzportját katalizálja [42-45]. A PMT a tropán- és piperidinvázas alkaloidok kialakulásának kulcsfontosságú enzimjének tunik, mivel muködésének következtében válik el egymástól eloször az említett alkaloidok és a poliaminok bioszintézise. NH2 H2N put reszcin
PMT poliaminok
NH2
H3C N N-metilputreszcin
10. ábra Az N-metilputreszcin képzodése putreszcinbol [10]. 2.6.1.3. N-metilputreszcin oxidáz Egybehangzó kísérleti eredmények támasztják alá, hogy az N-metil-∆1 -pirrolinium só a tropánváz bioszintézisének
prekurzora,
mely
N-metilputreszcinbol
keletkezik
4-metilaminobutanal
intermedieren keresztül [1 9]. A reakciót egy diamin oxidáz enzim, az N-metilputreszcin oxidáz (MPO) katalizálja (11. ábra). A diamin oxidázok széles körben elterjedtek az élovilágban, számos növény- és állatfajból sikerült oket izolálni. Az enzimet D. starmonium hairy root kultúrákban is sikerült kimutatni [40]. A korábbi eredmények arra utaltak, hogy a tropánváz kialakulása során az N-metil-∆1 -pirrolinium kation és acetoacetil-Co-A kondenzációja, majd dekarboxilezodése történik, higrinen keresztül, mely végül dehidrohigrinen átalakul tropinonná (12. ábra) [19,30]. D. innoxia -val végzett vizsgálatok ezzel CH3 H3C
NH2 N
N-metilputresz cin
MPO
N+
H3C N
CHO
4-metilaminobutanal
N-metilpirrolinium kation
11. ábra N-metilpirrolinium kation képzodése N-metilputreszcinbol [10]. szemben azt mutatták, hogy az izotóppal jelzett higrin nem épül be a tropánvázba. Az eredmények alapján sokkal valószínubbnek tunik, hogy a tropinon 2-karboxitropinon intermedieren keresztül alakul ki dekarboxilezodést követoen (12. ábra ) [46,47]. A folyamatot katalizáló enzimet eddig nem
28
sikerült azonosítani, de az sem zárható ki, hogy az átalakulás enzim közremuködése nélkül zajlik le [48]. H3C CH3
COOH O
N H3C
N+
H3C
CH3 +
N
higrin CH3
N-metilpirrolinium kation
O
N
H3C
N+ COOH
N
COOH tropinon
O
O
2-karboxitropinon
O
12. ábra A tropinon kialakulása N-metilpirrolinium kationból [10]. 2.6.1.4. Tropinon reduktázok A tropin tropán alkaloid bioszintézisben betöltött intermedier szerepét már 1972-ben igazolták [49], ezzel szemben a tropinon pontos funkcióját sokáig nem sikerült tisztázni. Csupán 1990-ben, intakt D. innoxia növényekkel végzett vizsgálatok során mutatták ki eloször az izotóppal jelzett [N-metil14
C]tropinon beépülését különbözo tropán észterekbe [50]. Koelen és Gross D. stramonium
gyökerének sejtmentes kivonatát használva megállapították, hogy a tropinon redukcióját követoen tropin keletkezik [51]. Enzimkivonatokkal végzett további vizsgálatok tárták fel a tropinon tropinná és pszeudotropinná történo enzim katalizálta redukcióját [52]. A redukciót két különálló, sztereospecifikus enzim végzi, melyek közül a tropinon reduktáz I (TR I) a tropinont tropinná, a tropinon reduktáz II (TR II) pedig a tropinont pszeudotropinná alakítja (13. ábra) [6,35,53,54]. Az enzimek szerkezetének feltárása alapján megállapították, hogy a tropinon reduktázok a rövid láncú
29
H3C N H3C
' alkaloidok tropan TR-I
N
tropin
tropinon
O TR-II
HO
H3C N
N HO
OH
OH
HO
pszeudotropin
kalisztegin A3
13. ábra A tropánvázas alkaloidok és kaliszteginek képzodése tropinonból [10]. dehidrogenázok/reduktázok családjába tartoznak és muködésükhöz redukált nikotinsavamiddinukleotid-foszfát (NADPH) kofaktorra van szükég [55]. Egyes eredmények azt mutatják, hogy a TR I által katalizált folyamat nem sebesség meghatározó lépés a tropán alkaloidok bioszintézise során, így a TR I aktivitás növelése, vagy a TR II aktivitás csökkentése géntranszformációs módszerek alkalmazásával várhatóan nem emeli jelentos mértékben a hioszciamin és szkopolamin produkcióját [53]. A TR II pontos funkciója sokáig nem volt pontosan ismert. Több Solanaceae fajban is jelentos TR II aktivitást mértek, holott a pszeudotropinból levezetheto észterek az akkumulálódott alkaloidok csupán igen kis részét adták. A polihidroxi nortropán vegyületek (kaliszteginek) megismerése kínált megoldást a problémára, mivel a pszeudotropin metabolizmus fo iránya ezen vegyületek felé mutat [10]. A TR I és TR II enzimek funkcióit összegezve elmondható, hogy tropinon redukciója a tropán alkaloid bioszintézis igen fontos lépése, mivel a tropin felhalmozódása tropán alkaloidok, a pszeudotropin képzodése pedig kaliszteginek kialakulását eredményezi. 2.6.1.5. Acil transzferázok A tropán alkaloidokat tartalmazó növények számos alifás és aromás savval észterezett tropin, ill. pszeudortopin származékot termelhetnek, melyek kialakítását különbözo acil transzferáz (észteráz) enzimek végzik. Kimutatták, hogy az A. belladonna, D. stramonium, D. tatula, D. innoxia, Hyoscyamus niger, Scopolia japonica gyökereiben mért atropin észteráz aktivitás az egyedfejlodés minden szakaszában jelentos volt [56]. A hioszciamin és szkopolamin aromás savi összetevoje az (S)-(-)-tropasav, melyet hosszú idon át a hioszciamin bioszintézis egyik intermedier vegyületének tartották, biokémiai vizsgálatokkal azonban igazolták, hogy ez a sav nem épül be az alkaloidba (14. ábra) [57]. Izotóppal jelzett fenil[1,3-
30
13
C2]tejsav adagolását követoen a D. stramonium szöveteibol izolált hioszciamin és szkopolamin
13
C-
NMR vizsgálatának eredményei a fenillaktát észterifikációt követo, intramolekuláris átrendezodését jelezték [58]. Chesters és munkatársai (59) D. stramonium gyökérkultúrákat alkalmazva megerosítették a fenil tejsav beépülését, melyet a feleslegben adagolt tropasav csupán kis mértékben befolyásolt. Ezen eredmények alapján feltételezheto, hogy a hioszciamin prekurzora a littorin, mely a tropin (R)-(+)-feniltejsavas észtere (14. ábra). Ennek igazolására izotópokkal többszörösen jelzett littorin molekulákat adagoltak D. stramonium gyökérkultúrákhoz, melyek végül változatlan formában épültek be a tropánvázas alkaloidokba [10,60]. Az alkaloid képzodés ezen szakaszának felülvizsgálata alapján a bioszintézis aktivált feniltejsav (fenillaktoil-CoA) és a tropin kapcsolódásával kialakuló littorin molekulán keresztül zajlik, melynek intramolekuláris átrendezodésével kialakulhat a hioszciamin (14. ábra). H3C NH2
N HO O tropin
fenilalanin
HO O
H3C
HO
N O H
fenilpiroszõlõsav
OH H
O
OH
HO littorin
O
H3C
O
feniltejsav
N H H
CH2OH
CH2OH
HO
O O hios zciamin
O
tropasav
14. ábra A littorin és hioszciamin képzodése a tropin feniltejsavval történt észterezodése után [10]. 2.6.1.6. Hioszciamin 6 β-hidroxiláz A szkopolamin - mely a hioszciamin 6,7β-epoxid származéka – hioszciaminból képzodik 6βhidroxihioszciaminon keresztül (15. ábra). A hioszciamin 6β-hidroxiláz (H6H) 2-oxoglutarát függo dioxigenáz enzim, melynek muködéséhez az alkaloid szubsztrát mellett 2-oxoglutarátra, Fe2+ ionokra és aszkorbinsavra is szükség van [10]. Az enzimet tisztított formában H. niger gyökérkultúrákból
31
állították elo. A H6H nagy mennyiségben a gyökerek periciklusában található meg, a földfeletti szervekbol azonban nem sikerült kimutatniuk [16]. A hioszciamin hidroxilációját követoen 6β-hidroxihioszciamin képzodik, mely a 7β-H kilépésével epoxidálódik szkopolaminná. A hidroxiláció és epoxidáció folyamatát egyaránt a H6H enzim katalizálja, mely a 6,7-dehidrohioszciamint szintén szkopolaminná alakítja, a vegyület esetleges CH3
CH3
N
H6H
N
H6H
HO
O O
CH3
N
O
O
C CH
O
CH2OH
O
C CH
O
C CH
CH2OH
CH2OH
6-hidroxi-hioszciamin
hioszciamin
szkopolamin
15. ábra A szkopolamin bioszintézise [10] intermedier szerepét azonban kísérletesen kizárták [6]. Az epoxidáció már a D. innoxia gyökerében elkezdodhet, azonban a szárban fejezodik be. Kimutatták, hogy a H6H hidroxiláz aktivitása 40-szer nagyobb, mint az epoxidáz aktivitás. Ennek ellenére a szkopolamin termelo növényekben nem halmozódik fel nagyobb mennyiségben 6β-hidroxihioszciamin [61,62]. 2.7. Tropánvázas alkaloidok kvalitatív és kvantitatív vizsgálata A növényekben, sejt- és szövettenyészetekben eloforduló tropánvázas alkaloidok viszonylag kis mennyisége és változatossága számos, egyre érzékenyebb és szelektívebb kvalitatív és kvantitatív analitikai módszer kidolgozását eredményezte. Ezek - többek között - titrimetriás [63], denzitometriás [64], spektrofotometriás [65-67], tömegspektroszkópiával kombinált gázkromatográfiás, gáz-folyadék kromatográfiás
(GC,
GC-MS,
GLC
és
GLC-MS)
[5,68-72],
nagyhatékonyságú
folyadékkromatográfiás (HPLC) [73-79], és kappillár elektroforézissel végzett módszerek [80-82]. Hiltunen és munkatársai [83] mágneses magrezonancia spektroszkópiás (NMR) módszert dolgoztak ki atropin és hioszciamin kvantitatív meghatározására Atropa belladonna, Hyoscyamus niger, és Datura stramonium leveleibol. Más szerzok szabadföldön termesztett D. metel hioszciamin és szkopolamin tartalmát [84], vagy D. stramonium és A. belladonna hairy root kultúráinak poliamin - és alkaloid metabolizmusát tanulmányozták NMR technika alkalmazásával [85,86]. Több szerzo alkalmazott immunbiológiai módszert („radioimmunoassay”, RIA, „enzyme linked immunosorbent assay”, ELISA) kis alkaloidmennyiség szelektív és pontos meghatározására [7476,87 -92]. Monoklonális antitestek segítségével a hioszciamin és szkopolamin kimutatása és tartalmi meghatározása gyorsabbá teheto, továbbá pikogramm mennyiségu alkaloid is kimutatható [74].
32
2.7.1. Alkaloidtartalom meghatározása denzitometriás módszerrel Dorosiev és munkatársai [93] a szkopolamin növényi mintákból történo meghatározására dolgoztak ki denzitometriás módszert, melynek segítségével a nyers kivonat alkalmazásával is jó elválasztás érheto el. Az elohíváshoz p-dimetilamino-benzaldehid tartalmú oldatot használtak, melynek érzékenysége (0,1 µg szkopolaminra, 0,5 µg atropinra) meghaladta a Dragendorff reagensét (KBiI 4 , 0,5 µg szkopolaminra, 1,0 µg atropinra). A p-dimetilamino-benzaldehid tartalmú elohívó oldat alacsony H 2 SO4 tartalma következtében (100ml-ben: 1,0g p-dimetilaminobenzaldehid és 5,0ml 98,0% -os H 2 SO4 ) a réteglapok háttere csaknem fehér marad az elohívást követoen. A D. innoxia és D. stramonium alkaloid tartalmának denzitometriás és HPLC módszerrel végzett meghatározását összehasonlítva azt találták, hogy a kapott értékek nem térnek el jelentosen egymástól. Az eredmények azt mutatták, hogy a denzitometria jól alkalmazható a minták alkaloid tartalmának gyors meghatározására. A réteglapok elohívása szintén p-dimetilamino-benzaldehid tartalmú reagenssel történt (200 mg oldva 40 ml CH 3 OH - 8N H2 SO 4 , 1:1 v/v, λ=495nm) [64]. Nagyszámú
D.
stramonium hairy
root
klón
szkopolamin
és
hioszciamin
tartalmának
meghatározásakor alkalmaztak Dragendorff reagenst. A kifejleszto rendszer CHCl3 -(CH3 )2 COCH3OH-NH 4 OH (28,4%) (75:10:15:2 v/v/v/v) volt, a kiértékelés pedig λ=515nm–en történt [94]. 2.7.2. Gáz-folyadékkromatográfiás technikák A tropánvázas alkaloidok növényi mintákból történo kimutatására korábban több szerzo alkalmazott gázkromatográfiás módszert, melyek segítségével nagy számú alkaloid kimutatására és azonosítására nyílt lehetoség növényi mintákból. Robins és munkatársai [95] több mint 30 tropánvázas alkaloidot azonosítottak D. candida x D. aurea hibridbol eloállított hairy root klónokban vékonyrétegkromatográfiás elválasztást követoen GC/MS módszerrel. A mérési eredmények alapjá n megállapították, hogy a szkopolamin és hioszciamin (aposzármazékaikkal együtt) az összalkaloid tartalom mintegy kétharmadát adják. Tömegspektroszkópiás detektálással kombinált gáz-folyadék kromatográfiás módszer (GLC-MS) segítségével részletesen vizsgálták a D. innoxia növény alkaloid spektrumát. A növényi minták kivonása több módszerrel: 2M HCl-al, CH 3 OH -25% NH 4OH eleggyel (9:1 v/v) vagy CH3OH trietilamin eleggyel (9:1 v/v) történt. A szerzoknek nem sikerült a gyökerek kivonatában littorint kimutatni, más alkaloidokat viszont – a rendelkezésre álló tömegspektrumok alapján – gyorsan és hatékonyan lehetett azonosítani, az észterek savi kompone nseinek azonosításához pedig a retenciós adatok nyújtottak segítséget (pl. 3α-n-butiriloxitropán és 3α-izobutiriloxitropán azonosítása). A
33
kimutatott apoatropin és aposzkopoalmin – a szerzok feltételezése szerint – csupán a folyamat során keletkezo mutermék [15]. 2.7.3. Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszerek A HPLC technika fejlodésével lehetoség nyílt nagy számú, kis mennyiségu minta (pl. gyógyszerkészítmények és növényi kivonatok) gyors, rutinszeru ellenorzésére. A növényi mintákból készült kivonatok összetettsége azonban még napjainkban is nehézségeket okoz a megfelelo elválasztás elérésében, amit a különbözo módszerek változatossága is jelez [8]. A minták kivonására leggyakrabban más oldószerekkel kombinált CH 3 OH-NH4OH elegyet alkalmaznak. A kiértékelése széles hullámhossz tartományon belül történhet (λ=200nm-280nm), a legtöbbször λ=210nm-en végzik. A III/A-C táblázat néhány, ma már klasszikusnak tekintheto és több, korszerubb mérési eljárás fobb jellemzoit foglalja össze.
34
2.8. In vitro tenyészetek alkalmazása az univerzális és speciális anyagcsere vizsgálatára 2.8.1. A kallusztenyészetekrol általában A kallusz kultúra homogén, parenchimatikus sejtek halmaza, mely egyaránt kialakítható nem differenciált és differenciált növényi szövetekbol. Ezen tenyészeteknél általában az a cél, hogy ne alakuljon ki szöveti differenciálódás, illetve ne induljon meg organizáció. Kalluszosodás létrejöhet spontán módon, de kiváltható növényi hormon(ok) adagolásával is. Figyelembe kell venni azonban, hogy a kalluszkultúrák fenntartásához legtöbbször elengedhetetlen exogén hormonadagolás következtében a tenyészetek genetikai stabilitása és ennek következtében pl. alkaloid produkciója általában csökken [108]. A Solanaceae családba tartozó fajok, így a Datura nemzetség növényeibol eloállított, de-differenciálódott sejtekbol álló kallusz kultúrák tropán alkaloid tartalma is – a legtöbb esetben – jóval alacsonyabb, mint a kiindulási növényé [65,109]. 2.8.1.1. Datura innoxia Mill. kalluszszövetek növekedése és tropán alkaloid produkciója D. innoxia kallusz szöveteit vizsgálva, Dung és munkatársai [110] megállapították, hogy a tenyészetek növekedése szempontjából az MS [111] tápközeg 1 mg/l kinetin és 1 mg/l 2,4diklórfenoxi ecetsav (2,4-D) tartalma a legmegfelelobb. A kultúrák biomassza produkciója általában a 6. hétre érte el a legmagasabb értéket, ezt követoen a növekedés lassult, majd teljesen megállt. A gyökér eredetu kallusz fényen lassabban, míg a levél eredetu gyorsabban növekedett. A tenyészetek összalkaloid tartalma az átoltást követo 2. hétig emelkedett (gyökér eredetu kalluszban 0,125%, szárazsúlyra vonatkoztatva), majd a szövetek intenzív növekedésének beindulásával jelentosen csökkent. Ismételt emelkedés csak a növekedés stacionárius szakaszának elérése után (4-6. hét) volt mérheto. A megvilágítás – a tenyészetek növekedéshez hasonlóan – hatással volt a tropán alkaloid produkcióra is. Mind a gyökér, mind pedig a levél eredetu kultúrák alkaloid tartalma közel duplájára nott (gyökér eredetu kalluszban 0,259%, szárazsúlyra vonatkoztatva). Ez az érték tovább emelkedett a táptalaj 2,4-D tartalmának 5 mg/l-re emelésével, és így elérte, ill. meghaladta az intakt szervek alkaloid tartalmát [66]. Palazón és munkatársai [109] D. stramonium hairy root klón és a belole eloállított, géntranszformált kalluszszövet növekedését és alkaloid produkcióját hasonlították össze. A gyökértenyészeteket folyékony MS táptalajon, a kalluszszöveteket pedig 1,0µM kinetint és különbözo mennyiségu 2,4-D – t (0,1µM, 0,5µM és 1,0µM) tartalmazó szilárd MS tápközegen tartották fenn. A transzformált gyökerek növekedése meghaladta a kalluszszövetek növekedését. 1,0µM 2,4-D alkalmazása növelte a kallusztenyészetek biomassza produkcióját, de gátolta a gyökérképzodést. A hairy root szövetek
35
hioszc iamin produkciója magasabb volt a transzformált kalluszokban mért értékeknél, utóbbiakban a differenciálódás mértékével, a gyökérképzodéssel arányosan nott a hioszciamin mennyisége. Szkopolamint csak a kalluszszövetek tartalmaztak kimutatható mennyiségben, a csökkeno 2,4-D koncentrációval arányosan egyre többet. A 2,4-D és a kalluszszövetek alkaloid tartalma közötti kapcsolat nem az auxin alkaloid bioszintézisre gyakorolt direkt hatásának eredménye, hanem sokkal inkább az intracelluláris hormonegyensúlyra kifejtett hatása.
A magasabb 2,4-D koncentráció
(1,0µM) elosegítette a növekedést, ezzel gátolva a hioszciamin szintézist, az alacsony 2,4-D szint (0,1µM) viszont elosegítette a kultúrák differenciálódását, ezáltal gyakorolva jótékony hatást az alkaloid szintézisre. Az alacsony 2,4-D koncentráció mellett, a kallusztenyészetekben mért szkopolamin tartalom nagy valószínuséggel a képzodo gyökerekben szintetizálódó hioszciamin transzportjából és kalluszsejtekben történt átalakításából származik. Összefoglalva elmondható tehát, hogy a kallusz tenyészetek növekedése és alkaloid produkciója csak kivételes esetekben, pl. a tápközeg hormontartalmának optimalizálását követoen éri el a hairy root kultúrákban mért értékeket. A kívülrol adagolt hormonok azonban csökkenthetik a differenciálódás mértékét, a sejtek genetikai stabilitását és így a tropánvázas alkaloidok bioszintézisét is. 2.8.2. A hairy root kultúrákról általában Az utóbbi néhány évtizedben egyre több kutatócsoport kísérli meg – más speciális anyagcseretermékekhez hasonlóan – a tropán alkaloidok eloállítását különbözo növényi sejt - és szövetkultúrák segítségével. A különbözo kallusz- és sejtszuszpenziós kultúrákkal nem sikerült jelentos és hosszabb távon is stabil szintu hatóanyag produkciót elérni [112]. Mivel a tropán alkaloidok bioszintézise szempontjából a gyökerek alapveto fontosságúak, ezért értheto, hogy a gyökértenyészetekben magasabb alkaloid szintek érhetok el [62]. Számos vizsgálati eredmény jelzi továbbá, hogy a speciális metabolitok szintézise és a kultúrák organizációs szintje között szoros kapcsolat van [113-115]. A tropán alkaloidok eloállításánál további nehézséget okozhat, hogy különösen a lassabban növekvo gyökérkultúrák alkaloid szintje a magasabb. A virulens Agrobacterium rhizogenes törzsekkel végzett fertozést követoen létrehozott hairy root kultúrák
nagy
mennyiségben
tartalmazzák
a
kiindulási
növényre
jellemzo
speciális
anyagcseretermékeket. A transzformált gyökérkultúrák – a sejtszuszpenziós tenyészetekhez hasonlóan - gyorsan növekednek in vitro, ugyanakkor genetikailag és biokémiailag stabilak [114,116]. A hairy root-ok hormonmentes táptalajon tenyészthetok, mivel a növényi genomba épült Ri T-DNS szabályozza az endogén hormontermelést.
36
2.8.2.1.
GÉNTRANSZFORMÁCIÓ
AGROBACTERIUM
VEKTOR
RENDSZEREK
ALKALMAZÁSÁVAL Az Agrobacterium, mint természetes vektor rendszer ma már széles körben elterjedt és alkalmazott. A Rhizobiaceae családba tartozó Gram-negatív A. tumefaciens és A. rhizogenes talajbaktériumok a fogékony növényeket (általában kétsziku, de egysziku fajokat is) a sebzési helyeken fertozve ún. gyökérnyakgolyva ill. járulékos gyökér (hairy root) képzodést indukálnak [117-120]. A fertozés során, az Agrobacterium felismeri a sérült növényi szövetek által kibocsátott szignál molekulákat és a sérült sejtekhez kapcsolódik (kemotaktikus válasz). A transzformált növényi szövetek – baktériummentesítést követoen - in vitro hormonmentes táptalajon korlátlan növekedésre képesek és a talajbaktériumokra jellemzo speciális anyagcseretermékeket (ún. opinokat) termelnek. A gyökérnyakgolyvát és hairy root-okat alkotó növényi sejteket két alapveto sajátság különbözteti meg a növény egyéb sejtjeitol: -
in vitro körülmények között kívülrol adagolt növényi hormonok nélkül fenntarthatók, - a talajbaktériumokra jellemzo speciális anyagcseretermékeket állítanak elo és választanak ki, melyeket összefoglaló néven opinoknak nevezünk.
Ezekért a sajátságokért a növényi sejtekben jelenlévo bakteriális DNS szakasz, az ún. transzfer-DNS (T-DNS) felelos. A génátviteli mechanizmus során a bakteriális plazmid (A. tumefaciens: Ti-plazmid, A. rhizogenes: Ri-plazmid) részét képezo transzfer vagy T-DNS átkerül a növényi sejtbe és stabilan integrálódik a sejtmag DNS-be [121]. A T-DNS a baktérium plazmidjának meghatározott szakasza, mely számos olyan gént tartalmaz, melyek a transzformált növényi sejtekben expresszálódnak. Ezek egy része ún. onc gén, melyek a növényi hormonok szintéziséért felelos enzimeket kódolnak, vagy az opinszintézis irányításában vesznek részt. A Ri plazmid T-DNS –ének ún. rol génjei a gyökérképzodésért, valamint az opinok szintéziséért felelosek [122]. A Ti- és Ri-plazmidok T-DNS átvitelével kapcsolatos alapveto tulajdonságai megegyeznek. A fertozés után létrejövo gyökérnyakgolyva és hairy root szövetek sajátságai azonban alapvetoen eltérnek egymástól. A géntranszformált gyökérszövetekbol viszonylag könnyen teljes növény regenerálható, mely intakt T-DNS-sel rendelkezik. A vad típusú A. tumefaciens törzsekkel eloállított gyökérnyakgolyva szöveteibol ezzel szemben igen nehezen hozható létre teljes növény, melynek TDNS állománya általában át is rendezodik [123]. Meg kell jegyezni, hogy a különbözo A. rhizogenes törzsek virulenciája eltéro, a különbözo baktérium törzsekkel eloállított hairy root-ok pedig eltéro hatóanyag tartalommal és morfológiával rendelkezhetnek [124].
37
- A DNS transzferben résztvevo virulencia gének és fehérjék szerepe IV. TÁBLÁZAT NÉHÁNY, A VIR GÉNEK INDUKCIÓJÁBAN SZEREPET JÁTSZÓ FENOLOS VEGYÜLET SZERKEZETE ÉS INDUKCIÓS HATÁSÁNAK RELATÍV EROSSÉGE [122]. R1
H3CO
OCH3 OH
vegyület
R1 O C
vir gén indukciós hatás
ac etosz iringon
+++++
szinapinsav
++++
CH3 O CH
CH
C OH
O C H
sziringaldehid
+++
s ziringins av
++
O C OH
A T-DNS átvitelt a bakteriális kromoszómán lévo chv gének és a Ri-plazmid vir génjei szabályozzák. Utóbbiak a plazmid virulencia régiójában helyezkednek el, a T-DNS szomszédságában. A vir gének csak speciális, fenolos vegyületek megjelenésekor (pl. acetosziringon) lépnek muködésbe, melyek nagy mennyiségben képzodnek a növényi szövetek sérülését követoen (IV. tálázat) [120,125]. A vir gének muködéséhez ezen túlmenoen alacsony pH (pH 5-6) és 29o C alatti homérséklet is szükséges. A vir gének regulációjában a VirA és VirG fehérjék vesznek részt, melyek közül a VirA kemoreceprtorként muködik a fenolos vegyületek megjelenésekor, a VirG pedig – miután a VirA aktiválja - beindítja a transzkripciót. A T-DNS szakasz növényi sejtbe jutásáért a VirB és VirD fehérjék felelosek (pl. a VirD2 fehérje segíti elo a T-DNS sejtmagba jutását), a VirE fehérje pedig megvédi a DNS szakaszt a növényi sejtben található nukleázok hatásától. A megfertozött növényi sejtbe nem csak az elobb említett nukleoprotein komplex jut be, hane pl. a VirF fehérje is, mely az elobbitol függetlenül transzportálódik és a hatékony transzformációt segíti elo [122]. - A T-DNS szakasz beépülése és expressziója A T-DNS véletlenszeruen, rendellenes rekombináció útján épül be a növényi génállományba, melynek során a legtöbbször törlodnek az adott növényi lókusz kisebb szakaszai. Az adott T-DNS egyetlen másolata, de akár egy, vagy több lókuszon több másolata is beépülhet a növényi sejtmagba
38
[122]. Az A. rhizogenes Ri-plazmidjában lévo T-DNS felosztható bal T-DNS-szakaszra (TL -DNS) és jobb TDNS-szakaszra (TR-DNS), melyek bizonyos esetben - pl. oktopin típusú Agrobacterium törzsekkel történt fertozés során – egymástól függetlenül is beépülhetnek a növényi genomba [120]. A T-DNS –ben bejuttatott idegen gének megfelelo muködéséhez promoter és terminátor szakaszokra van szükség, melyeket a növény saját transzkripciós mechanizmusa képes érzékelni. Ezek régiók általában növényi génekbol, vagy növényi vírusokból (pl. a karfiol mozaik vírus 35S promotere – CaMV35S) származnak. Az utóbbi 15 évben egyre többet tudtunk meg az Agrobacterium mediálta géntranszformáció mechanizmusáról. A felmerülo problémák ellenére azonban egyre nagyobb ismeretanyag áll rendelkezésünkre, mely elosegíti, hogy ez a transzformációs rendszer részletesebben ismert és jobb hatásfokú legyen. 2.8.2.2. Kointegráns és bináris vektor rendszerek Mivel a Ti és Ri plazmidok in vitro manipulációja méretük miatt (kb. 200 kbp) nehézségekbe ütközik, ezért több módszert is kidolgoztak a probléma megoldására. Az egyik lehetoség a kívánt transzgén(ek) közbenso vektorral (pl. Eserichia coli) történo bejuttatása a T-DNS határszekvenciák közé, ezt az ún. kointegráns rendszert azonban napjainkban már alig alkalmazzák [122]. A másik, sokkal elterjedtebb lehetoség az ún. bináris vektor rendszer alkalmazása. Ebben a rendszerben a T-DNS egy kisebb méretu, különálló plazmidban (klónozó plazmid) helyezkedik el, a vir gének pedig egy másik T-DNS nélküli, legyengített plazmidban (segíto plazmid) találhatók. Erre azért van lehetoség, mert a külön plazmidban található, transz helyzetu virulencia régió is képes elosegíteni a génátvitelt [126]. - Az Agrobacterium rhizogenes A4 plazmidjainak felépítése Az A. rhizogenes A4 (más Agrobacterium törzsekhez hasonlóan, mint pl. az 15834 és 8196 törzsek) három plazmidot tartalmaz (pArA4a, pArA4b és pArA4c), melyek közül a legnagyobb - pArA4c (430kb) - az elso ketto integrált formája. A pArA4b jelu plazmid (250kb) azonos a Ri plazmiddal (pRiA4) (16. ábra) [127-130]. A 180kb méretu pArA4a plazmid nem szükséges a növényi géntranszformációhoz (az A. rhizogenes A4RS törzs pl. nem tartalmaz pArA4a plazmidot), mivel az eddigi ismeretek alapján a mannopin, mannopinsav és agropinsav katabolizmusát szabályozó gének találhatók benne. A megfigyelések ugyanakkor azt támasztják alá, hogy az A. rhizogenes A4 három plazmidja nem stabil állapotú, mivel mennyiségük egymáshoz viszonyított aránya folyamatosan változik a baktériumon belül [130]. A három plazmid restrikciós (Bam HI) térképének részletes vizsgálata alapján megállapították, hogy a
39
pRiA4 plazmid tartalmazza a virulenciá ért felelos régiót, az agropin lebontás génjeit, valamint a TDNS –t mely a T L és T R szakaszokra bontható (17. ábra).
16. ábra Az Agrobacterium rhizogenes A4 pArA4a, pArA4b (pRiA4) és pArA4c plazmidjainak cirkuláris Bam HI restrikciós térképe [130].
17. ábra Az Agrobacterium rhizogenes A4 T-DNS szakaszának Bam HI, Kpp I, Eco RI és Hind III restrikciós térképe [131]. A TL szakaszban található pl. a gyökerek kialakulásáért és speciális anyagcsere fokozásáért felelos rol
40
gének (rol A, rol B és rol C), a TR szakaszban pedig az auxin szintézis génjei helyezkednek el [131134]. A T-DNS –ben eloidézett mutációkat tanulmányozva megállapították, hogy a TL és TR szakaszokban található gének együttesen felelosek a fertozést követo morfológiai változásokért [132]. A pArA4a és pRiA4 plazmidok replikációs szakaszának kezdete eltéro, ami magyarázatot ad a két plazmid egy baktériumon belüli független replikációjára. A két plazmid egy viszonylag homológ régiót (II és II’ szakaszok, 16. ábra), és egy megegyezo szakaszt (I és I’ szakaszok, 16. ábra) tartalmaz, mely utóbbiak alapján nyílhat lehetoség a plazmidok integrációjára és a pArA4c plazmid kialakulására [130]. 2.8.3. A géntranszformáció igazolása hairy root kultúrákban Bár a növényeken megjeleno járulékos gyökerek jelzik az A. rhizogenes fertozés sikerét, a T-DNS szakasz sejtmagba jutását, mégis szükségessé vált olyan kémiai és biokémiai módszerek kidolgozása, melyek segítségével meghatározható a növényi sejtekbe került idegen gének jelenléte és muködése. Erre – a T-DNS –be épített riporter gének alkalmazásán túl – számos lehetoség van. 2.8.3.1. A polimeráz láncreakció („polimerase chain reaction”, PCR) alkalmazása A PCR a biológiai tudományok számos területén sikeresen alkalmazható alapveto fontosságú technika, melynek segítségével specifikus DNS szakaszok kimutatására és tanulmányozására nyílik lehetoség a vizsgált DNS csupán igen kis mennyiségének felhasználásával is. A módszer lehetoséget ad a növényi genomba beépült idegen gé nek kimutatására. Nagy elonye, hogy DNS polimeráz, megfelelo oligonukleotid szakaszok (pl. A rhizogenes TL T-DNS Rol B gén) és nukleotidok jelenlétében a minta DNS megfelelo szakasza nagy mennyiségben eloállítható, és így könnyen detektálható [92,135-137]. A Nicotiana tabacum és N. rustica kultúrákból eloállított, a T-DNS –ben GUS gént is tartalmazó hairy root-okat vizsgálva megállapították, hogy már csupán 50ng –nyi minta DNS (mely kb. 30006000 sejt DNS állományának felel meg) elegendo a GUS gén PCR-el történo kimutatásához [137]. 2.8.3.2. Southern és Northern lenyomattechnika A módszer bizonyos eukarióta gének szerkezetének megállapítására alkalmasak. A Southern-féle lenyomattechnika szerint a DNS-t restrikciós enzim(ek)kel emésztik, a keletkezo fragmentumokat pedig méretük szerint elválasztják agarózgél-elektroforézis segítségével. A DNS fragmentumokat ezt követoen nitrocellulóz szuröre mossák át puffer segítségével, ahol azok megkötodnek. Ezt követoen a vizsgált génre specifikus, izotóppal jelzett próbával (általában mRNS, vagy cDNS, esetleg E. coli-ban klónozott DNS-szakasz) hibridáltatják a megkötött komplementer DNS szakaszokat, melyek
41
autoradiográfiás módszerrel detektálhatók, így megkapjuk a vizsgált gént tartalmazó DNS-szakaszok pontos mintázatát. Ez a módszer – klónozó tecnikák alkalmazásával – lehetové teszi egy gén adott genomban lévo kópiái számának meghatározását is. Az RNS analízisére kidogozott analóg technika a Northern lenyomatmódszer [138]. Mindkét
módszert
elterjedten
alkalmazzák
hairy
root
kultúrák
genetikai
vizsgálatára
[12,109,139,140]. 2.8.3.3. Opinok kimutatása Különbözo, Agrobacterium törzsekkel történo fertozést követoen a növényi sejtek speciális vegyületeket kezdenek termelni, melyeket összefoglaló néven opinoknak nevezünk. Az opinokat a talajbaktériumok használják fel, így teremtve saját fejlodésükhöz még kedvezobb környezetet [128,141]. Az A. rhizogenes A4 törzs az agropin típusú Agrobacterium törzsek közé tartozik, mely a gyakorlatban azt jelenti, hogy a fertozés után kele tkezo hairy root-ok agropint, mannopint, agropinsavat és mannopinsavat termelnek. Az agropin típusú törzsekre jellemzo, hogy az agropin termelést és lebontást az opinok szintéziséért felelos vir gének szabályozzák. A mannopin, mannopinés agropinsav eseté ben a lebontását azonban a kisebb plazmidban található gének irányítják [128]. Az opinok viszonylag könnyen detektálhatók vizes, híg savas, vagy etanolos extrakciót követo papír elektroforézissel, majd AgNO3 -tal történt elohívással [128,141-143]. Petit és munkatársai [128] több A. rhizogenes törzset (agropin, mannopin és nopalin típusúakat) és fertozött növényi szövetet vizsgáltak az opintermelés vonatkozásában. Az agropint, mannopint, agropin- és mannopinsavat (18. ábra) mind a hairy root-okban, mind pedig a belolük regenerált transzformáns növényekben kimutatták. Az izolált, primer hairy root-ok vizsgálata azt mutatta, hogy az agropin jelenléte esetén (pl. A. rhizogenes A4-el történt fertozés után), a többi opinnal összehasonlítva ez a vegyület adta a legnagyobb AgNO 3 pozitív foltot. A szerzok ugyanakkor megállapították, hogy az opinok kivonása során – és feltehetoen az élo szöveteken belül is - az agropin és mannopin agropinsavvá alakulnak, így a primer géntranszformált gyökerekbol létrehozott kultúrákat vizsgálva ez utóbbi válik a leginkább detektálható opinná. A. belladonna géntranszformált gyökérkultúrákat tanulmányozva, melyeket A. rhizogenes 15834-es törzzsel végzett fertozés után nyertek, megállapították, hogy a fertozést követoen izolált gyökerekben az agropin és a mannopin egyaránt kimutatható. A kultúrák átoltása során azonban megfigyelték, hogy az opinok mennyisége fokozatosan csökkent az egy éves vizsgálati periódus alatt annak ellenére, hogy a T-DNS megorizte integritását (Southern lenyomattechnikával vizsgálva) és a tenyészetek morfológiai jellemzoi sem változtak meg [144]. Savka és munkatársai különbözo genotípusú Glycine maximum egyedeket fertoztek, agropin (A4,
42
1855), mannopin (8196) és kukumopin típusú A. rhizogenes törzsekkel. A létrehozott hairy root klónok opin tartalmának vizsgálata azt mutatta, hogy a K599-es törzzsel történt fertozés után H2N NH
(CH2)3
HOOC
(CH2)2
C
CH
HN
(CH2)3
H2N
COOH
CH NH
NH CH
COOH
COOH
HOOC (CH2)2
nopalin
CH
COOH
nopalinsav
H2N C
NH
(CH2)3
CH
HN
COOH
H2N (CH2) 3
COOH
H3C
CH
NH H3C
CH
NH
(CH2)4
CH
COOH
(CHOH) 4
HOCH2
CH
NH HOOC
COOH
CH
(CH2)2
CONH2
mannopin
lizopin HOCH2
CH2 HOH2(CHOH)4C H NH O
COOH
CH2
NH H3C
CH
oktopinsav
oktopin H2N
COOH
(CHOH)4
CH2 NH
CH(CH2)2CONH2
HOOC
CH
(CH2)2 COOH
CO mannopinsav
agropin HOCH2
(CHOH)4
N COOH
H2N
CH2 CO
C
CH
CH2
O
NH
CH CH2 CH2
(CH2)2
HOOC
CH
CH2OH O
H3C CH
CH2
HOOC
CH
COOH
NH (CH2)2
CH
leucinopin
COOH
szukcinamopin
agropinsav
H3C
COOH
HO COOH OH
O
OH HOCH2 O
O OH
HO
OH
O O
P
O
OH agrocinopin A
18. ábra Néhány fontosabb opin molekula szerkezeti képlete létrhozott tenyészetek mindegyike tartalmazott opinokat, a többi Agrobacterium törzs esetében
43
azonban az arány az 50%-ot sem érte el, ami a transzformáció hatékonyságának csökkenését jelzi [142]. Hasonló eredményeket hozott Solanum tuberosum L. hairy root szövetek opin tartalmának vizsgálata is. Különbözo Agrobacterium törzsekkel (15834, 2659, 2659 GUS és 8196 GUS) végzett fertozés után a vizsgált transzformált gyökerek szöveteinek mintegy 80%-a bizonyult opin pozitívnak. Ez az arány a 2659 GUS és 8196 GUS törzsekkel végzett fertozés esetén közel megegyezett a GUS gén expresszálódásának mértékével, ami ezen esetekben egyértelmuen jelezte a sikeres transzformációt [143]. A Brassica oleracea L. var. Botrytis A. rhizogenes A4-es törzzsel végzett fertozés után képzodo szöveteknek csupán 10% -a tartalmazott opinokat és az egyes hairy root klónok opin tartalma is jelentos eltéréseket mutatott. A mannopin típusú 8196-os törzzsel végzett fertozés után nyert klónokból regenerált növények szövetei – a kiindulási hairy root kultúrákhoz hasonlóan – kimutatható mennyiségu mannopint és agropint tartalmaztak. A levelek mannopin tartalma, friss súlyra vonatkoztatva mintegy 0,05% volt, a gyökerekben ez az érték 0,01% és 0,06% között változott [123]. 2.8.4. Tropán alkaloidok termeltetése hairy root kultúrákkal A Solanaceae család több nemzetségének növényfajából állítottak már elo tropán alkaloidokat termelo hairy root tenyészeteket (pl. Atropa, Datura, Duboisia, Hyoscyamus, Scopolia) (V. táblázat). A különbözo hairy root-ok tropán alkaloid tartalma – növényfajtól függoen - jelentosen eltérhet egymástól. Sok esetben a magas alkaloid tartalom gyenge biomassza képzéssel jár együtt, így az alkaloidprodukció értéke alacsony marad. A géntranszformált gyökérkultúrák többségében a hioszciamin a fo alkaloid, melynek mennyisége sok esetben eléri, néha pedig meg is haladja a megfelelo növényben mért értéket. Több Datura fajból eloállított hairy root kultúrát tanulmányozva megállapították, hogy a D. innoxia gyökérkultúrái tartalmaznak szkopolamint (110µg/g, friss súlyra vonatkoztatva) – a hioszciaminon mellett (486µg/g) - a legnagyobb mennyiségben, ezen kívül 6-hidroxihioszciamin tartalmuk is jelentos (VI. táblázat) [5]. A legmagasabb szkopolamin tartalmat Duboisia myoporoides hairy root-okban sikerült elérni, többszöri szelekciót követoen (V. táblázat). Szisztematikus klón szelekcióval, pl. hairy root-ból származó protoplasztok létrehozásával, akár egyetlen sejtbol is magas alkaloid produkciójú kultúra hozható létre. Erre lehetoséget ad az is, hogy egyes megfigyelések alapján a hairy root-okra nagyfokú szomaklonális variabilitás jellemzo [92,145]. Mivel genetikailag minden egyes klón eltéro, tápanyagigényük is különbözo lehet, ezért a növekedés és az alkaloid produkció optimalizálását minden esetben külön kellene elvégezni [146].
44
V. táblázat Solanaceae fajokból eloállított hairy root kultúrák alkaloid tartalma [10].
Növényfaj
Alkaloid
Atropa belladonna
atropin atropin+ hioszciamin szkopolamin hioszciamin szkopolamin hioszciamin szkopolamin hioszciamin szkopolamin hioszciamin hioszciamin szkopolamin hioszciamin szkopolamin szkopolamin hioszciamin szkopolamin hioszciamin szkopolamin hioszciamin szkopolamin hioszciamin szkopolamin hioszciamin szkopolamin hioszciamin szkopolamin hioszciamin szkopolamin hioszciamin szkopolamin hioszciamin szkopolamin
Brugmansia candida Datura candida D. innoxia D. metel D. stramonium Duboisia hybrid D. leichhardtii D. myoporoides Hyoscyamus albus H. aureus H. x györffyi H. muticus H. niger Scopolia carniolica S. jabonica S. tangutica
A hairy root tenyészet alkaloidtartalma (mg/g szárazsúlyra vonatkoztatva) 3,7 9,5 3,0 8,2 0,25 5,7 1,1 14 1,9 3,1 6,4 5,6 2,1 2,5 18 8,6 32 12 4,6 6,6 0,6 8,8 0,4 12,2 1,0 12,5 1,3 0,2 0,02 13 5,0 0,52 0,2
A hairy root tenyészetek tropán alka loid produkciója általában a növekedés késo-stacionárius szakaszában éri el a maximumát, ami rázatott lombikban, folyékony tápközegben fenntartott kultúrák esetében 3-4 hét után következik be [146]. Általános tenyésztési feltételek mellett az összalkaloid tartalomnak ilyenkor csupán maximum 5%-a található meg a tápközegben [35,147].
45
Datura candida hibrid hairy root kultúráit vizsgálva megállapították, hogy a tenyészetek alkaloid tartalma a 4 hetes tenyésztési periódus végére elérte a 0,68%-ot (szárazsúlyra vonatkoztatva), mely az VI. táblázat Datura innoxia hairy root klón (A. rhizogenes LBA9402) százalékos alkaloid összetétele (összalkaloid tartalom = 100%) [5]. alkaloid hioszciamin
% 55
szkopolamin
10
kuszkohigrin
10
higrin
5
3-hidroxi-6-tigloiloxitropán
4
6-hidroxihioszciamin
3
3-α-acetoxitropán
3
tropin 3-tigloiloxi-6-hidroxitropán
2 2
3-acetoxi-6-hidroxitropán
1
3,6-ditigloiloxitropán
1
3,6-ditigloiloxi-7-hidroxitropán
1
in vitro növény föld feletti részeiben mért érték 1,6-szerese, a gyökerek alkaloid tartalmának pedig 2,6-szerese volt. A géntranszformált gyökerekben a szkopolamin fordult elo legnagyobb mennyiségben, mintegy ötször meghaladva a mért hioszciamin tartalmat. Az alkaloidok túlnyomó része a szövetekben raktározódott, az össz mennyiségnek csupán 3% -a volt mérheto a folyékony tápközegben [148]. Nagy számú (több mint 500) D. stramonium hairy root klón vizsgálata azt mutatta, hogy a tenyészetek növekedése és alkaloid szintetizáló képessége több év elteltével (5 év) is stabil szinten maradt. A fertozéshez hét különbözo Agrobacterium törzset használtak (TR-105, ATCC15834, A4, 1855, A41027, ATCC13333, AR-10), melyek közül az A4-es törzs sorrendben a harmadik legfertozobb A. rhizogenes típusnak bizonyult az adott növényen. A klónok szelekcióját követoen (növekedés és alkaloidprodukció alapján) megvizsgált tenyészetek alkaloid tartalma az átoltást követo 30-35. napra érte el a maximumát. A hioszciamin esetében ez 4,5 mg/g, a szkopolamin esetében pedig 1,5 mg/g volt szárazsúlyra vonatkoztatva [94]. 2.8.4.1. Az inokulum tömegének hatása a növekedésre és alkaloid tartalomra A H. muticus géntranszformált gyökerek esetében részletesen tanulmányozták az inokulum mennyiségének (2,5g/l - 25g/l) hatását a növekedésre és tropán alkaloid produkcióra. Megállapították,
46
hogy az inokulum tömege nem befolyásolja a maximális biomassza- és alkaloid produkció értékét. A legmagasabb értékek eléréséhez szükséges ido azonban csökken az inokulum mennyiségének növelésével. A maximális hioszciamin és szkopolamin produkció egy héttel a növekedés stacionárius szakaszának elérése után volt mérheto (89-151mg/l és 0,6mg/l ), a hioszciaminnak pedig 3-10% -a került a tápközegbe. A szerzok kiemelték ugyanakkor, hogy az inokulum tömegének meghatározásakor nem vették figyelembe a kiindulási klón idosebb és fiatalabb szöveteinek megoszlását [92]. 2.8.4.2. A tenyésztési ido és a táptalaj pH-jának hatása a növekedésre és hatóanyag produkcióra A folyékony tápközegben nevelt D. innoxia , D. candia és D. stramonium géntranszformált gyökérkultúrák friss- és szárazsúlya folyamatosan növekedett az 5, valamint 6 hetes tenyésztési idoszak alatt, melyek értékei jellegzetes szigmoid növekedési görbét alkottak [22,149-151]. A D. innoxia szövetek hioszciamin tartalma a kultiválási ido végéig (40. nap) emelkedett [149]. A D. candida tenyészetek alkaloid tartalma a 20-23. napra érte el a maximumot, az intenzív növekedési szakasz befejezodésével párhuzamosan. Ezt követoen a hioszciamin és szkopolamin mennyisége egyaránt csökkent a szövetekben [22]. A D. stramonium szövetek hioszciamin tartalma az idovel fokozatosan nott, maximumát az 5-6. hétre érte el (szkopolamin a kultúrákban nem volt kimutatható). A tropin mennyisége az 5. hétre érte al a maximális értéket, mely a 6. hétre jelentosen – mintegy felére – csökkent [150]. Az A. rhizogenes A4 törzzsel fertozott H. muticus egyedekrol izolált gyökérklónok – más törszekkel végzett fertozés után nyert klónoktól eltéroen - világos színuek, vékony keresztmetszetuek
és
hosszúak voltak. Más Agrobacterium fetozés után kapott klónokkal (pl. LBA9402, 15834) össszehasonlítva növekedésük lassabb volt, a növekedés stacionárius szakaszát a 21 nap után érték el. A hioszciamin tartalom maximumát a stacionárius növekedési szakasz kezdetét követo 1 hét után érte el, melynek mintegy 10%-a volt mérheto a tápközegben [91]. Az A. baetica hairy root –ok esetében a friss- és szárazsúly értékek emelkedése szintén folyamatos volt az 56 napos tenyésztési idoszak végéig, de a növekedés stacionárius szakasza ekkor még nem volt detektálható. A táptalaj pH értéke – kezdeti csökkenést követoen – emelkedett, a táptalaj típusától függoen eltéro mértékben. A pH változását egyrészt a tápanyagok táptalajból történt felhasználása, másrészt a szövetekbol történt anyagcseretermék kiválasztás teheto felelossé, így a megemelkedett pH kialakításában szerepe lehet a táptalajba kiválasztott tropán alkaloidoknak is, mint ahogy azt a D. candida szövetek esetében is megfigyelték. Az atropin esetén ez a mennyiség mintegy 2,8%, szkopolamin esetén pedig 15% volt. A táptalaj jóval magasabb szkopolamin tartalmát az eltéro transzport, de az atropin esetleges újbóli felvétele és szkopolamminná alakítása is eloidézheti. A hairy
47
root szövetek atropin tartalma a 40-49. napig emelkedett, míg a szkopolamin tartalom folyamatosan nott az 56. napig [71]. A táptalaj pH értékének hatását vizsgálva A. belladonna hairy root tenyészetekben azt tapasztalták, hogy a biomassza produkció nem változott lényegesen a pH 4-pH 8 tartományban 28 napos inkubálási idot követoen. Hasonló megfigyelést tettek a szövetek és a táptala j hioszciamin tartalmának vonatkozásában, a szkopolamin mennyisége azonban jelentosen (a kontrollhoz, pH 5,8-as táptalajon nevelt kultúrákhoz képest) több mint hatszorosára nott a tápközeg kezdeti pH 7 és pH 8-ra történt beállítását követoen [152]. 2.8.4.3. A megvilágítás hatása Datura hairy root tenyészetek növekedésére és tropán alkaloid produkciójára Sötétben és fényen, 3% szacharózt tartalmazó folyékony MS táptalajon tenyésztett D. candida hairy root-ok esetében a kultúrák növekedése hasonló volt a 6. hétig, ezt követoen azonban a fényen nevelt tenyészetek friss súlya gyorsabb ütemben nott, és a 8. hétre mintegy kétszerese volt a sötétben nevelt kultúrákénak. Az alkaloid tartalom (hioszciamin+szkopolamin) az 5-6. hétre el a legmagasabb értéket, a sötétben nevelt kultúrákban 0,1%-ot, a fényen tenyésztettek esetében viszont csupán mintegy 0,056% -ot (szárazsúlyra vonatkoztatva). A tápközegben az alkaloid tartalom kb. 3%-a volt mérheto [73]. A fényen nevelt (Gamborg B5 táptalajon, 16 óra/nap megvilágítás 32 napon át) H. niger géntranszformált gyökérkultúrákat tanulmányozva (3% szacharózt tartalmazó Gamborg B5 táptalajon, 16 óra/nap megvilágítás 32 napon át) azt tapasztalták, hogy a fény hatására nem változott minoségileg a tenyészetek alkaloid összetétele, bá r a sötétben és fényen nevelt szövetek morfológiailag eltértek egymástól (pl. színük). Lényegesen magasabb biomassza produkciós értékeket mértek a fényen nevelt tenyészetek esetében, a sötétben tenyésztett kultúrák pedig már 28 nap után megbarnultak és elpusztultak. Sötétben, az átoltást követo 18. napig a szövetek friss súlya lényegesen magasabb, közel duplája volt, mint a fényen nevelt gyökereknek. Minden esetben a hioszciamint lehetett kimutatni foalkaloidként, melynek mennyisége fényen magasabb, 1,2% volt szárazsúlyra vonatkoztatva [97]. Más vizsgálatok azt jelezték, hogy az autotróf körülmények között, fényen nevelt D. stramonium hairy root tenyészetek szkopolamin és hioszciamin produkciója megemelkedik, így elérve a 6,4 mg/g hioszciamin és 0,24 mg/g szkopolamin at rtalmat (szárazsúlyra vonatkoztatva). Meg kell jegyezni ugyanakkor, hogy az elozetesen sötétben nevelt szövetekben nem volt mérheto mennyiségu szkopolamin [153]. Maldano-Mendoza és Loyola -Vargas részletesen tanulmányozták fotoszintetikus (szacharózmentes táptalajon nevelt) és fotomixotróf (csökkentett, 0,3% szacharóz tartalmú táptalajon tenyésztett) D.
48
stramonium hagyományos gyökérkultúrák és hairy root szövetek anyagcseréjét (klorofill szintézis, 14
CO2 fixálás, stb.) [154]. Folyamatos fényen tenyésztés mellett a hagyományos gyökértenyészetek
szöveteiben klorofill A és B tartalma jelentosen megemelkedett, továbbá kalluszosodás jelei is mutatkoztak. A hairy root tenyészetek ezzel szemben megorizték struktúrájukat, viszont a vizsgált 6 klónból csupán 2 „zöldült” meg a fenntartás során. A fényen nevelt klónok szárazsúlya kétszerese volt a heterotróf, sötétben nevelt hairy root-ok esetében mért értéknek. A „megzöldült” 2 klón – szemben a másik 4 tenyészettel – fényen, heterotróf körülmények között nem tartalmaztak mérheto mennyiségu szkopolamint. Elobbi kultúrákban fényen csupán 1% tápközeg szacharóz koncentráció mellett jelent meg mérheto mennyiségu szkopolamin. A hagyományos gyökértenyészetekben heterotróf körülmények között, fény hatására jelentosen megnott a szkopolamin hioszciaminhoz viszonyított mennyisége. 2.8.4.4. A tápközeg összetételének hatása a kultúrák növekedésére és tropán alkaloid produkciójára Számos kutató tanulmányozta a tápközeg típusának és összetételének hatását különbözo, tropán alkaloidokat
termelo
Atropa,
Datura
Hyoscyamus
és
Duboisia
hairy
root
klónokra
[14,44,97,106,114,146,155-159]. A legtöbb esetben eltéro táptalajtípus/összetétel volt optimális a tenyészetek növekedésére és hatóanyag produkciójára, melyet az anyanövény típusa mellett az egyes klónok sajátságai is befolyásoltak [97,107]. Az egyes alkaloidok megoszlása – a táptalaj összetételének hatására - szintén változatos képet mutat [97]. Az eredmények azt jelzik, hogy minden egyes hairy root klón esetén alapveto fontosságú a megfelelo táptalajtípus és összetétel kiválasztása az optimális alkaloidprodukció eléréséhez. - A szacharóz koncentráció hatása Sauerwein és Shimomura [156] folyékony tápközegben (WP) nevelt H. albus hairy root tenyészetek növekedését és alkaloid produkcióját vizsgálták különbözo szacharóz koncentrációk mellett (3%, 4%, 5%, 6%, 8% és 10%), 19 napos tenyésztési periódust követoen. A legnagyobb biomassza produkció 8% cukorkoncentráció mellett volt mérheto. A táptalaj cukortartalmának emelésével (8%, 10%) csökkent az összalkaloid tartalom, a 7β-hidroxihioszciamin tartalom azonban emelkedett és meghaladta a 0,012% -ot (szárazsúlyra vonatkoztatva). A legmagasabb szkopolamin (0,04%) és hioszciamin (6,65%) tartalmat 3% szacharózkoncentráció mellett mérték. Az A. rhizogenes A4 törzzsel fertozott H. albus növényekrol izolált géntranszformált gyökerek vizsgálata az alkaloidspektrum - 7β-hidroxihioszciamin, 6β-hidroxihioszciamin, szkopolamin, hioszciamin és littorin arányának - változását mutatta a különbözo táptalajokon. A legmagasabb hioszciamin tartalom a Gamborg B5 táptalajon volt mérheto 3% szacharóztartalom mellett, az
49
optimális 6β-hidroxihioszciamin és szkopolamin tartalmat azonban, hasonló cukorkoncentráció mellet az ½ MS táptalajon lehetett elérni. Külön vizsgálva a szacharóz hatását Gamborg B5 táptalajon tenyésztett szövetek esetében megállapították, hogy a cukortartalom változása nem befolyásolta lényegesen a friss súly alakulását. Az optimális hioszciamin és littorin tartalmat 3% szacharóz mellett (0,58% és 0,067%, szárazsúlyra vonatkoztatva), míg a 6β-hidroxihioszciamin és szkopolamin szempontjá ból 2% szacharóz bizonyult a legmegfelelobbnek [97]. D. stramonium hairy root szövetek növekedését tanulmányozva 0%-10% szacharózt tartalmazó táptalajokban a biomassza produkció szempontjából a 4%-6% cukortartalom bizonyult optimálisnak, míg a hioszciamin produkció 5% szacharóz alkalmazása mellett érte el a maximumot [160]. Más megfigyelések azonban azt mutatták, hogy a tápközeg 6%-os szacharóz tartalma növelte legjelentosebben a D. stramonium hairy root-ok alkaloid produkcióját [161]. H. muticus géntranszformált gyökereket vizsgálva (0g/l -80g/l szacharóz) azt tapasztalták, hogy a különbözo klónok esetén nagy eltérések mutatkoznak a növekedés (3-8% szacharóz) és hioszciamin produkció (2-6% szacharóz) szempontjából optimális cukortartalmak között. Christen és munkatársainak [97] megfigyelésével szemben azt találták, hogy a cukortartalom jelentos hatással van a hioszciamin produkcióra (egyes esetekben több mint háromszoros emelkedés) [146]. Vizsgálták a D. candida x D. aurea hibridbol A. rhizogenes A4 törzzsel végzett fertozést követoen nyert hairy root-ok növekedését és alkaloid produkcióját különbözo mennyiségu szacharózt (3%-8%) tartalmazó Gamborg B5 folyékony táptalajon. A 28 napos tenyésztést követoen a legnagyobb szárazsúly értékeket 5% szacharóz alkalmazásakor mérték. A hioszciamin mennyisége csupán kis mértékben növekedett, és viszonylag változatlan maradt a 4%-7% szacharóz tartalom mellett (0,36% hioszciamin, szárazsúlyra vonatkoztatva). Az eredmények azt mutatták, hogy a szkopolamin mennyiségét (0,17%) és a szkopolamin-hioszciamin arányt nem befolyásolta lényegesen a tápközeg szacharóz tartalma. Az alkaloidprodukció értéke – a biomasszaprodukció értékeinek megfeleloen – 5% szacharóz tartalom mellett érte el a maximumot [105]. - A tápközeg MgSO4 tartalmának hatása A Mg 2+ alapveto élettani szerepet tölt be a sejtek univerzális és speciális anyagcsere folyamataiban. Szerepe van a riboszómák megfelelo muködésében, elosegíti az aminosavak t-RNS-hez való kötodését és a polipeptidlánc riboszómák felületérol való leválását, számos enzim specifikus és nem specifikus aktiválásához szükséges, ezen kívül a foszforilálási reakciók kofaktora, így a különbözo táptalajok összetevojeként alapveto szerepet tölt be a növényi sejtek fejlodésében [162]. A tápközeg magnézium koncentrációjának helyes megválasztásával a különbözo növényi tenyészetek biomassza produkcióját és hatóanyag termelését hatékonyan lehet befolyásolni.
50
A N. tabacum kallusz kultúrák tápközegébe, különbözo koncentrációkban adagolt MgSO 4 jelentosen csökkentette azAl3+ toxikus hatását. Már kis mennyiségu Al2 (SO 4 )3 a friss súly jelentos csökkenését eredményezte, a tápközeg MgSO 4 tartalmának megemelésével viszont a biomassza produkció ismét megemelkedett. A friss súly emelkedésével azonban a tenyészetek nikotin tartalma lecsökkent [163,164]. A MgSO4 kedvezo hatást gyakorol az organizált kultúrák gyökérképzodésére, továbbá a géntranszformált gyökérkultúrák növekedésére és hatóanyag produkciójára [165]. Matricaria recutita hairy root tenyészetek lineáris növekedését és egyes illóolaj komponensek produkcióját befolyásolta pozitívan a tápközeg megnövelt MgSO 4 tartalma [166]. Ammi visnaga hairy root-ok lineáris növekedése és szárazanyag tartalma szintén nott az alkalmazott, megemelt MgSO 4 koncentráció hatására. Ezzel párhuzamosan azonban a visznagin produkció nem emelkedett jelentosen, feltehetoen az intenzív növekedés, az univerzális anyagcsere túlsúlyának következtében [167]. D. candida x D. aurea hibrid géntranszformált gyökérkultúráinak lineáris növekedése nem tért el jelentosen MS és Gamborg B-5 táptalajon, 60 nap tenyésztési idoszak alatt. Az MS tápközeg MgSO 4 tartalmát duplájára emelve (370 mg/l –rol 740 mg/l –re) azonban a 20. naptól tovább folytatódott a gyökerek lineáris növekedése és a 60. napra elérte a kontroll tenyészetekben mért érték kétszeresét [165]. A MgSO4 koncentrációja ugyanakkor hatással van a tápközeg alkaloid tartalmára is, mivel kisebb MgSO 4 szintek mellett kevesebb hioszciamint és szkopolamint lehetett kimutatni D. stramonium hairy root tenyészetek tápközegében [161]. Szilárd- és folyékony B5 táptalajon tenyésztett A. belladonna hairy root kultúrák növekedését és alkaloid termelését vizsgálva megállapították, hogy mind szilárd, mid pedig folyékony Gamborg B-5 táptalajon a biomassza produkció szempontjából az 500 mg/l MgSO 4 , a tropán alkaloid tartalom tekintetében pedig a 125 mg/l MgSO4 alkalmazása bizonyult optimálisnak. Meg kell jegyezni, hogy hasonlóan a kallusz szövetek esetében korábban megfigyelt tendenciákhoz - az alkaloid tartalom csökkenését mérték a legintenzívebben növekvo szövetekben [168]. 2.8.4.5. Transzgének hatása a tropán alkaloid metabolizmusra A legtöbb, tropán alkaloidokat termelo Solanaceae növényfaj és a belolük eloállított in vitro tenyészetek hioszciamint tartalmaznak foalkaloidként, ezzel szemben egyre nagyobb igény van – a gyakorlati szempontból értékesebb - szkopolamin tartalom emelésére. Ennek érdekében megvizsgálták, hogy a H6H enzim fokozott expressziójával sikerül-e elérni az alkaloid metbolizmus hioszciamintól szkopolamin felé történo irányítását. A vizsgált két növényfajba (A. belladonna és H. muticus) A. rhizogenes T-DNS segítségével juttattak be H6H gént [169,170 ]. Mindeddig, az alkaloid
51
metabolizmus és a klónozott gének muködésének pontos ismeretének hiányában, azonban nem sikerült jelentosebb gyakorlati eredményeket elérni. Yun és munkatársai [171] A. belladonna növényekbe transzformáltak levélkorong módszerrel, melynek során karfiol mozaik vírus 35S promoterbol (CaMV 35S) és H6H génbol álló kiméra gént juttattak a növényi sejtbe. Csaknem 30 kanamycin rezisztens klónt hoztak létre, melyeket tovább vizsgáltak a H6H gén expressziójának vonatkozásában. Az egyik ígéretes klónt teljes növénnyé regenerálva, majd önmegporzással utódokat létrehozva megállapították, hogy valamennyi utódnövény tartalmazta a 35S-H6H gént (Southern lenyomattecnikával vizsgálva). A növények mindegyikének levelében, hajtásában és gyökerében magas a H6H aktivitást mértek. A vizsgált transzformáns növények – melyek morfológiailag eltértek a kontroll A. belladonna egyedektol - szkopolamin tartalma jelentosen megemelkedett, és a kontroll levelek összalkaloid tartalmának 97%-át is elérte. Ezek az eredmények alátámasztották, hogy az alkaloid metabolizmus módosításával egy alapvetoen hioszciamin foalkaloidos növény alkaloid összetételében jelentos, gyakorlati szempontból is elonyös változást lehet elérni. Megemelt szkopolamin szintet nem csupán transzformáns növényben, de hairy root tenyészetekben is sikerült megvalósítani [169,170]. A H. niger-bol származó, CaMV35S promoter irányítása alatt álló H6H gént A. rhizogenes bináris vektor rendszerének segítségével juttatták A. belladonna sejtjeibe. Valamennyi vizsgált hairy root klón H6H aktivitása és 6β-hidroxihioszciamin produkciója megemelkedett. A kontroll hairy root szövetekkel összehasonlítva a H6H transzgént tartalmazó klónok szkopolamin tartalma jelentosen, akár ötszörösére is megemelkedett (0,3% szárazsúlyra vonatkoztatva) [169]. Kanegae és munkatársai [172] H6H és GUS géneket juttattak Agrobacterium vektor segítségével H. muticus, A. belladonna és N. tabacum egyedek sejtjeibe. A létrehozott hairy root klónok hisztokémiai vizsgálata azt mutatta, hogy a H6H gén expressziója fajonként eltéro. Nagyobb számú klónt vizsgálva Jouhikainen és munkatársai [170] a H6H gént H. muticus sejtjeibe juttatták, melynek hairy root-jai a hioszciamin mellett általában csupán igen kis mennyiségben tartalmaznak szkopolamint. A H6H gént hordozó A. rhizogenes 15834 és LBA9402 klónokat alkalmazva 68 különbözo klónt hoztak létre. Csupán 43 klón hordozta a transzgént (PCR módszerrel vizsgálva), melyeknek 40% -ában mértek magasabb szkopolamin tartalmat. A vizsgált klónok egyikének szkopolamin produkciója (17 mg/l) közel két nagyságrenddel meghaladta a kontrollként használt hairy root klónokban mért értékeket. A klónonként mért különbözo szkopolamin-hioszciamin arány és az eltéro szkopolamin produkciós értékek ugyanakkor azt jelzik, hogy a transzgén expressziója klónonként változhat. A tropán alkaloid tartalom emelésének érdekében kísérletek történtek a pmt gén muködésének fokozására is. A. belladonna és N. sylvestris transzgénikus növényekkel végzett vizsgálatok azt
52
mutatták, hogy a pmt gén túlmuködése nem befolyásolta lényegesen a nadragulya tropán alkaloid szintjét, ezzel szemben jelentosen megemelte a dohánynövény nikotin tartalmát [173]. Más szerzok A. rhizogenes A4 törzs alkalmazásával eloállított Duboisia myoporoides X D. leichhardtii hairy root klónokat vizsgáltak, melyekbe CaMV 35S promoter irányitása alatt álló, Nicotia na tabacum-ból származó pmt gént juttattak. A transzgént tartalmazó hairy root-ok Nmetilputreszcin tartalma 2-4-szer magasabb volt, mint a kontrollként alkalmazott géntranszformált gyökérkultúrákban mért érték. A tropán- és piridinvázas alkaloidok szintjé ben azonban nem történt jelentos változás. A vizsgált növények esetében kapott eltéro eredmények arra utalnak, hogy a pmt transzgén muködésének szabályozása fajonként eltéro [140]. 2.8.4.6. A Datura hairy root kultúrák genetikai stabilitása Különbözo növényfajokból (pl. D. stramonium, Nicotiana fajok, stb) eloállított hairy root kultúrák citogenetikai vizsgálata megerosítette, hogy a különbözo tenyészetek sejtjei – hosszabb ideje fenntartott szövetekben is - a fajra jellemzo kromoszóma számmal rendelkeznek. A kromoszómák szerkezetében csupán kisebb mértéku eltéréseket sikerült kimutatni. A vizsgált sejtszuszpenziós kultúrák – a kallusztenyészetekhez hasonlóan – ugyanakkor nagyfokú genetikai instabilitást mutattak, mely a poliploid és aneuploid sejtek nagy számában mutatkozott meg [174]. Baíza és munkatársai [175] részletesen tanulmányozták D. stramonium A. rhizogenes TR-105 –ös törzzsel végzett fertozése után nyert hairy root klónok genetikai stabilitását. A vizsgált három klónt a kísérleteket több évvel (8-10 évvel) megelozoen hozták létre és nem-transzformált gyökérkultúrákkal hasonlították össze. Mivel a tenyészetekben – más hairy root kultúrákhoz hasonlóan – a speciális anyagcseretermékek szintézise hosszú idon keresztül stabil szinten maradt feltételezheto volt, hogy a tenyészetek genetikai stabilitása is igen nagy. Más, dedifferenciált kultúrák estén a szekunder metabolitok termelésének csökkenésével párhuzamosan a kromoszóma állományban is különbözo változásokat figyelték meg (pl. aneuploidia, poliploidia) [176]. Ismert tény továbbá, hogy az in vitro fenntartott növényi sejtek kromoszóma állományában mind számszeru, mind pedig szerkezeti változások gyakran elofordulhatnak [177]. A vizsgált D. starmonium hairy root-ok kariotípusa és kromoszóma száma (2n=24) megegyezett az anyanövényével. Annak ellenére, hogy a hagyományos gyökérkultúrák táptalaja indolvajsavat is tartalmazott, a vizsgált sejtek közel 80%-a diploid volt és csupán a sejtek 20%-a volt aneuploid (2n=2n±x), vagy tetraploid (2n=48). A kromoszómák szerkezete minden vizsgált gyökérkultúrában stabil volt. Az eredmények alapján megállapítható, hogy a vizsgált D. stramonium hairy root szövetek kromoszóma állományára igen nagyfokú stabilitás jellemzo, mely egyértelmuen felülmúlja a hagyományos gyökértenyészetek genetikai stabilitását [175].
53
A különbözo hairy root kultúrák citogenetikai vizsgálatának eredménye azt jelzi, hogy a stabil szekunder metabolit produkció nem csupán a szöveti differenciálódás mértékével, hanem a nagyfokú genetikai stabilitással is szoros kapcsolatban áll. 2.9. Formaldehid a biológiai rendszerekben A formaldehidet (HCHO) a közelmúltig csupán környezetszennyezo anyagnak tartották, mely nagyobb mennyiségben pl. a bútorokból, háztartási vegyi árukból, muanyagipari termékekbol, dohányfüstbol és a kipufogógázokból kerülhet az emberi szervezetbe [178,179]. Toxikus vegyületként elsosorban a légzorendszer, de más szervek daganatos megbetegedéseinek kialakulásában is fontos szerepet tulajdonítanak ezen aldehidnek [180-182]. A szervezetbe került exogén HCHO DNS-DNS, valamint DNS-fehérje keresztkötéseket (DPX) alakíthat ki, melyek genotoxikus hatása pl. a DNS replikáció gátlásában nyilvánulhat meg [183]. Több, DNS-DNS és DNS-fehérje keresztkötéseket kialakító vegyületet (pl. alkilezo ágensek, króm és nikkel tartalmú vegyületek, HCHO) megvizsgálva azt találták, hogy a keresztkötések kialakításához szükséges koncentrációk egyedül a HCHO esetén maradtak a citotoxikus értékek alatt (a vizsgált V79-es sejtek több mint 75%-a életképes maradt) [184,185]. Mivel a sejtek HCHO kezelés mellett megorizték életképességüket, a kialakuló keresztkötések pedig több órán át megmaradtak, így ténylegesen fennáll a DNS károsodásának lehetosége az osztódás során. Ezeket a megfigyeléseket több vizsgálati módszerrel egyértelmuen alátámasztották. A HCHO kezelést követoen 24 órával ugyanakkor már nem sikerült kimutatni a DPX-ek jelenlétét, ami a repair mechanizmusok hatékonyságát jelzi. Mivel azonban a HCHO egyéb makromolekulákkal is (pl. repair fehérjék) reagálhat, így indirekt DNS károsító hatások szintén érvényesülhetnek. Korábbi vizsgálatok a HPRT lókusz mutációs frekvenciájának emelkedésére utaltak HCHO kezelést követoen [186], Merk és Speit eredményei [184] azonban ezt egyértelmuen cáfolták, így nem találták bizonyítottnak az exogén HCHO génmutáción keresztül kialakuló karcinogén hatását. Az exogén és endogén HCHO kromoszóma állományra gyakorolt hatásait azonban még részletesebben fel kell tá rni. Az 5-metil-citozin (m5 C) eukarióta genomban betöltött szerepét vizsgálva megállapították, hogy a korábban deamináció eredményeként mutációs „forró pontnak” tartott bázisnak sokkal inkább a DNS elektrokémiai tulajdonságainak módosításában van szerepe, így pl. hatással van a makromolekula speciális regulátor fehérjékkel való kapcsolódására és ezen keresztül többek között a DNS transzkripciójára [187]. Ezek az eredmények is jelzik, hogy DNS-metilezés és demetilezés, a génaktivitás változásának tanulmányozása a kutatások egyik újabb és egyre fontosabb területévé válik [183,185].
54
Bizonyított, hogy az exogén eredetu HCHO-en túl a humán, állati és növényi szövetekben mérheto mennyiségu endogén HCHO is detektálható, mely a különbözo anyagcserefolyamatok során keletkezik [183-185,188]. Az endogén HCHO keletkezése túlnyomó részben a sejtekben végbemeno metilezési-demetilezési/oxidációs -redukciós folyamatokhoz kapcsolható (19. ábra) [183,185,189]. akceptor molekulák
demetilezett vegyüle tek
oxidáci ó
+ hidrolízis
al kilezõdés
HCHO
metile zett vegyületek
+ redukció
metilezett vegyületek
demetilezés
metilezés
19. ábra Az endogén formaldehid (HCHO) képzodésének sematikus vázlata a metilezésidemetilezési/oxidációs -redukciós folyamatok során [189]. A sejteken belül HCHO képzodhet számos exogén és endogén eredetu, N-, O-, vagy S-metilcsoportot tartalmazó vegyületbol oxidatív demetilezés során (demetilázok és speciális peroxidázok közremuködésével), továbbá nem kontrollált enzimatikus reakciók eredményeként (pl. szemikarbazidszenzitív amin oxidáz - SSAO közremuködésével), mely utóbbiak patológiás folyamatok elindításában játszanak szerepet [183]. Thorndike és Beck [190] már a 70-es években kimutatták, hogy a limfocitákban és granulocitákban HCHO keletkezik a metil-tetrahidrofolát tetrahidrofolát (THF) átalakulás során. Az egészséges limfocitákhoz viszonyítva, krónikus leukémiás limfocitasejtekben a HCHO szint jelentosen nagyobbnak bizonyult. A dohányfüst nagy mennyiségben tartalmaz metilamint, mely (az aminoacetonhoz hasonlóan) egyben a SSAO enzim endogén szubsztrátja. A nikotin metabolizmus végterméke szintén a metilamin, melynek SSAO által történo deaminálása során HCHO, ammónia, valamint a vízbol hidrogén-peroxid (H2 O2 ) egyaránt keletkezik. A dohányzás és a nikotin hatására felszabaduló adrenalinból a monoaminoxidáz (MAO) hatására szintén metilamin keletkezik. Vizsgálatai során Yu [191] trícium izotóppal
55
jelzett, L-(-)-[N-metil-3 H]-nikotint alkalmazott egerekben a metabolizmus nyomon követése, a keletkezo HCHO indirekt kimutatása céljából. Megállapította, hogy az alkalmazást követo radioaktivitás túlnyomó része makromolekulákban jelentkezik, melyek HCHO hidakkal összekapcsolt fehérje komplexeknek bizonyultak. A komplexek kialakulása sikeresen blokkolható volt SSAO inhibitorokkal (MDL-72974A és szemikarbazid). Mivel a HCHO és H 2O2 reakciójának eredményeként különösen reaktív szingulett oxigén (1 O2) és gerjesztett HCHO (H*CHO) képzodik [192,193], továbbá a dohányzás során nagyobb mennyiségben keletkezo HCHO keresztkötések kialakításával károsíthatja a makromolekulákat (pl. fehérjék, DNS) így a szerzo alapveto szerepet tulajdonít ezen molekuláknak a dohányzás káros hatásainak kialakulásában [191]. A nikotin Nicotiana plumbaginifolia Viv. szuszpenziós kultúra sejtekben történo nor-nikotinná alakítását izotóppal jelzett nikotin molekulák ((R,S)-[2 H-metil]nikotin, (R,S)-[13 C-metil]nikotin és (R,S)-[14 H-metil]nikotin) alkalmazásával tanulmányozták. Az eredmények azt mutatják, hogy a nikotin metil csoportja demetilezést követoen a növényi sejt univerzális anyagcsere folyamataiban vesz részt, így pl. izotóppal jelzett szerin és metionin jelenlétét lehetett kimutatni a sejtekben. A szerzok feltételezik, hogy a nikotin demetilezése során N-hidroximetil-nor-nikotin képzodik mint intermedier termék, melybol HCHO formájában kerül át a metil csoport a sejtek univerzális anyagcsere folyamataiba, így pl. a C1 metabolizmus szempontjából fontos folát ciklusba [194]. Napjainkban már egyre nyilvánvalóbb, hogy a különbözo metilezett vegyületek potenciális HCHO forrásnak tekinthetok. Kísérleti eredmények támasztják alá a HCHO molekula jelentoségét a metilezési folyamatokban. Az SAM különbözo transzmetilezési reakciókban szerepel metildonorként (20. ábra), így pl. a DNS-metilezés során is [183,195 ]. A hisztamin - N τ-metil-hisztamin átalakulás közben kimutatható a HCHO keletkezése az S-adenozil-metionin (SAM) S-metilcsoportjából [196]. A folyamatot a hisztamin-N-metiltranszferáz enzim katalizálja, az SAM-ból pedig S-adenozilhomocisztein (SAH) képzodik. A HCHO detektálása formaldimedon formájában történt, dimedon segítségével, mely irreverzibilisen reagál a HCHO -el (21. ábra). Izotóppal jelzett, S-[metil-3 H]SAM adagolása mellett jelentos mennyiségu jelzett formaldimedon keletkezését mérték. A HCHO dimedonnal történt elvonása ugyanakkor a transzmetilezés jelentos csökkenését eredményezte [197]. Az L-lizin HCHO-el történo in vitro metilezésének vizsgálatakor Tyihák és munkatársai [183] megállapították, hogy a reakció során nagy mennyiségben keletkezik Nε-monometil-L-lizin (MML), valamint kisebb mennyiségben N ε-N ε-dimetil-L-lizin (DML) és Nε-N ε-N ε-trimetil-L-lizin (TML), továbbá egyéb termékek is. A különbözo metilezett L-lizin származékok – különös tekintettel a MML-re – jelentos fiziológiás hatással rendelkeznek, mivel elosegítik a sejtproliferációt egészséges és daganatos sejttenyészetekben egyaránt [198-201].
56
-- OOC H2N
-- OOC
C
H
H1 H2 C* H3
H2N
NH2
CH2
N
S
N
N
CH2 O H
H
NH2
CH2
CH
CH2
+
C
N
N
N
CH
H1 H2 CH2
H2O
HO
δ-
δ-
H3
H
+ CH 2
C* S
OH OH
N
N
O
H
H OH OH
SAM --OOC H2N
C
H
CH2
H1 HO
C
N
S
H3
N CH
CH2
+
H2
NH2
CH2 O H
N
+
N
H+
H OH OH
SAH H HO
C
` ` oxidacio
H
H2O2
H
HCHO
+ 2 H2O
20. ábra Az s-adenozil-metionin (SAM) demetilezodésének folyamata, az S-adenozil-homocisztein (SAH) és formaldehid (HCHO) képzodése [183]
O 2
H3C H3C
4
C
3
5 6
1
O
O
2 CH
2
+
CH2O
C
H3C H3C
4
C
C 3' C HC 2' 1' C H
O
O
3
5 6
O
Dimedon (5,5-dimetil-ciklohexán-1,3-dion)
C
H
1
2CH
4' 5' 6'
CH3 CH3
+ H2O
Formaldimedon (1,1`,3,3`-tetraketo-5,5,5`,5`-tetrametil2,2`-diciklohexi lmetán)
21. ábra A dimedon és formaldehid között lejátszódó irreverzibilis reakció, mely formaldimedon kialakulásához vezet [197]. Kísérleti eredmények és a fentebb említett biokémiai folyamatok alapján feltételezheto, hogy a különbözo biológiai rendszerekben gyors, primer HCHO körfolyamat muködik, melyben az Lmetionin képzodése az L-homociszteinbol, valamint a HCHO keletkezése az SAM-ból alapveto fontosságú (22. ábra).
57
22. ábra A primer HCHO körfolyamat lehetséges fo biotranszformációs lépései[203]. Az SAM-ból keletkezo HCHO számos molekulához kapcsolódhat (akceptor molekulák, pl. nukleinsavak, aminosavak, fehérjék, hisztamin, stb.), az L-homocisztein – L-metionin átalakuláshoz szükséges HCHO pedig szintén több forrásból származhat (HCHO generátorok, pl. 5-metiltetrahidrofolát, betainok, stb.) [202]. Az endogén HCHO szélesköru elofordulása a különbözo biológiai rendszerekben, valamint szerepe a transzmetilezési reakciókban egyaránt azt jelzik, hogy a korábbi feltételezésekkel szemben a molekula nem melléktermék, hanem alapveto szereploje a sejtek anyagcsere folyamatainak, nagyrészt még ismeretlen funkciókkal. 2.9.1. Az endogén formaldehid szerepe a növényi anyagcserében Nagyszámú növényfaj vizsgálata támasztja alá az endogén HCHO jelenlétét a növényi szövetekben, sejtekben [166,204-207]. Adrian-Romero és munkatársai [204], valamint Blunden [208] átfogó vizsgálataik során több alga, zuzmó, moha, haraszt, nyitvatermo és zárvatermo fajt (valamint több gombát és néhány cianobaktérium fajt) vizsgáltak meg az endogén HCHO tartalom szempontjából. A meghatározás
dimedon
adduktum
(formaldimedon)
formájában
történt,
túlnyomásos
rétegkromatográfiás (OPLC ) és HPLC módszerekkel. A vizsgált minták valamennyiében sikerült a HCHO-et kimutatni és mérni, változó mennyiségben (friss súlyra vonatkoztatva <1 µg g-1 – 5370 µg g-1 ). A vizsgált egyedekben mért értékek közötti jelentos eltéréseket egyrészt a fajok közötti különbség, másrészt az adott növények begyujtési ideje is befolyásolhatta. A tavasszal gyujtött mintákban jóval nagyobb HCHO-tartalmat sikerült mérni, mint az osszel és a tél folyamán begyujtött egyedekben. A fiatal szövetekben zajló intenzív osztódással és növekedéssel párhuzamosan jelentosen
58
megemelkedik a metilezett vegyületek (pl. metilezett bázikus aminosavak) és a mérheto HCHO mennyisége, mely feltehetoen az intenzív metilezési reakciók eredménye [209]. A szövetek, szervek öregedése során (pl. az oszi levélhullás idején) ismételten nagyarányú endogén HCHO szint emelkedés észlelheto, melyet ekkor a metilezett vegyületek szintjének csökkenése kísér. Ez a demetilezési folyamatok túlsúlyba kerülésének tulajdonítható, melyek során mind HCHO, mind pedig különbözo demetilezett vegyületek képzodhetnek [189]. Az idos szövetekben ugyanakkor fokozottan fennáll a H∗ CHO képzodésének lehetosége, mely igen reaktív, toxikus molekula. Elobbi vegyület pl. a HCHO és H 2O2 reakciója során keletkezhet. Mivel a H2 O 2 fontos szerepet tölt be az oxidatív demetilezés során, az idos szövetekben lezajló intenzív demetilezés lehetoséget biztosít a HCHO és H 2 O2 közvetlen reakciójára [210]. Albert és munkatársai [205] Quercus cerris L. makkok csírázása során vizsgálták az endogén HCHO mennyiségét formaldimedon formájában HPLC és MALDI-MS módszerekkel. A csírázás kezdetéig a mérheto HCHO koncentráció jelentosen megemelkedett (173% -al a csírázást megelozo 48 órán belül), majd magas értéken stabilizálódott. Érdekes megfigyelés, hogy a kialakuló gyökerek mérheto HCHO tartalma nott a csírázás egész folyamata során. Az Ascophyllum nodosum alga vizsgálatakor, az endogén HCHO koncentráció meghatározása során alkalmazott dimedon hatására irreverzibilisen keletkezo formaldimedont VRK, OPLC, EItömegspektrum, valamint H-NMR spektrum alapján is azonosították, mind a friss, mind pedig a szárított mintákból. A különbözo, N-, S- és O-metil csoportokat tartalmazó vegyületek a sejtekben lezajló, dinamikus metilezési és demetilezési folyamatok során mind HCHO megköto, raktározó, mind pedig HCHO forrásként szerepelhetnek. Ezekbol a funkciós csoportokból eltéro pH viszonyok mellett, dimedon jelenlétében egyaránt képzodhet formaldimedon [189]. Az L-arginin és 14 HCHO in vitro reakciójának vizsgálata során sikerült igazolni különbözo izotóppal jelzett hidroximetil-arginin származék (NG-trihidroximetil-14 C-arginin – Tri HMA, NG-dihidroximetil14
C-arginin – Di HMA és NG -monohidroximetil-14 C-arginin – Mo HMA) képzodését, melyek
reverzibilis módon kötik meg a HCHO-et és viszonylag stabil molekulák [207]. A különbözo HMA molekulák – melyek nagyobb mennyiségben találhatók meg a növényekben – fiziológiás körülmények között, közvetlen kémiai reakció során képesek átadni a hidroximetil csoport(ok) formájában kötött HCHO-et a THF-nak, melynek eredményeként a folát ciklus egyik tagja, az N5-N 10metiléntetrahidrofolát koenzim képzodik. Ez felveti annak lehetoségét, hogy az endogén HCHO, illetve a különbözo HMA molekulák a folát ciklustól részben elkülönülo, de szükség esetén gyorsan mobilizálható tartalékot képeznek a C1 metabolizmus számára [211]. Korábbi kísérleti eredmények ugyanakkor azt mutatták, hogy a C1 metabolizmus szempontjából alapveto fontosságú, a szerin-
59
hidroximetiltranszferáz által katalizált szerin - glic in konverzió során az enzim aktív centrumában, a szerinrol származó kötött HCHO-et tartalmaz, mely a THF-al reagálva szintén a N 5-N 10metiléntetrahidrofolát képzodéséhez vezet [212]. Szarvas és munkatársai [213] 14 CO2 felhasználásával igazolták, hogy a fotoszintézis során H14CHO keletkezett, melynek jelenlétét szintén dimedonnal sikerült kimutatni. Zea mays sejtekben már rövid ido elteltével sikerült azonosítani a Tri HMA, Di HMA és Mo HMA molekulákat, ami szintén arra utal, hogy a fotoszintézis során HCHO képzodhet, melyet a levelekben jelenlévo L-arginin képes megkötni. A keletkezo hidroximetil-arginin származékok nem citotoxikusak, antiproliferatív hatással rendelkeznek [207]. A legújabb kísérleti eredmények azt mutatják, hogy a fotoszintézis során keletkezo HCHO nem csupán az L-argininnel, hanem – akár Rubisco enzim hiányában – a ribulóz1,5-difoszfát molekulákkal is képes reagálni a HCHO és L-aszkorbinsav reakciójához hasonlóan [214]. Ez azt jelzi, hogy a HCHO nem csupán keletkezhet a fotoszintézis során, hanem annak egyik kulcsfontosságú molekulájával, közvetlenül is képes reagálni. Phaseolus vulgaris L. egyedfejlodésének tanulmányozása során a fiatal és idosebb levelek viszonylag nagyobb HCHO szintje mellett kimutatták a kolin és trigonellin koncentrációjának folyamatos csökkenését és a peroxidázok aktivitásának emelkedését a növény öregedésével párhuzamosan [215]. A betainok a növényvilágban széles körben elterjedt, változatos funkciókkal rendelkezo N-metilezett amino- és iminosavszármazékok. Ismert a TML sejtosztódást elosegíto, valamint abiogén stresszhatások során érvényesülo védo hatása [216]. A trigonellin fitohormon hatással rendelkezik, a kolin pedig számos foszfolipid (pl. lecitin) alkotórésze [217,218]. D. innoxia L. kallusztenyészetek vizsgála ta is alátámasztotta az endogén HCHO koncentrációban és a metilezett vegyületek mennyiségében, a növényekben az egyedfejlodés során észlelt változásokat. A fiatal D. innoxia kalluszkultúrákban viszonylag nagyobb HCHO koncentráció volt mérheto, mely a tenyészetek öregedése során csökkent, majd a 6. hetet követoen ismét megemelkedett. Ezzel párhuzamosan a TML, kolin és trigonellin koncentrációk folyamatosan csökkentek az ido elorehaladtával, így a 6. hetes kultúrákban észlelt nagyobb HCHO szint már kis betain koncentrációval társult. Ezen eredmények alapján megállapítható, hogy növényi szövettenyészet is sikeresen alkalmazható a HCHO anyagcserében betöltött szerepének vizsgálatára [189]. 2.9.2. Az endogén HCHO tartalom és a stresszhatások kapcsolata A növényi szervezeteket életük során számtalan stresszhatás érheti, melyek biogén (pl. vírusfertozés, hiperszenzitív reakció - HR) és abiogén stresszhatások (pl. hostressz) egyaránt lehetnek. Mivel az endogén HCHO tartalom, valamint a növények anyagcsere folyamatai, vegetációs periódusa között
60
sikerült kapcsolatot kimutatni, így nem meglepo, hogy a különbözo stresszhatások – melyek az anyagcserefolyamatokra szintén jelentos hatással vannak – során jellemzo módon változott egyes megvizsgált növények HCHO tartalma. N. tabacum cv. Xanthi nc növények dohánymozaik vírussal (TMV) történt fertozését követoen a mérheto HCHO szint emelkedése volt regisztrálható a fertozést követo 24 órán belül. Gázkromatográfiás és radiometriás (dimedon-6-14 C alkalmazásával) mérések igazolták, hogy a megemelkedett HCHO szint a fertozést követo 2-3 nap után ismét a kontroll (nem fertozött növény) szinten stabilizálódott. Ezen eredmények alapján feltételezheto volt, hogy a megemelkedett HCHO szint, illetve a HCHO metabolizmusban történt változás kapcsolatban állhat a vírusfertozéssel [203,219]. Mivel jelen esetben is felmerült a potenciális HCHO forrásként szereplo metilezett vegyületek szerepe, Burgyán és munkatársai [220]. megvizsgálták a növényekbol eloállított, tisztított demetiláz enzim aktivitását több, szubsztrátként szereplo molekula segítségével. Nem jelzett Lmetionin, SAM, N-metil-taurin, L-metionin-DL-szulfoxid, 4-metoxitirozin + jelzett dimedon-6-14 C alkalmazásával mérheto volt a reakció során keletkezo HCHO mennyisége. A fertozött növények demetiláz aktivitása minden szubsztrát esetén meghaladta az egészséges növényekben mért értékeket. Az eredmények igazolására L-metionin-(S-14 CH3 ) + dimedon alkalmazásával is megismételték a mérést, így bizonyítható volt, hogy a keletkezo HCHO az L-metionin S-metilcsoportjából keletkezett az oxidatív demetilezési folyamat során. Ezek az eredmények az oxidatív metabolizmus korai megváltozását jelzik a TMV fertozés során. Ismert, hogy számos metabolikus változás történik a dohány TMV-al történt fertozését követoen (pl. polifenol-oxidáz, peroxidáz és fenilalanin-ammonia-liáz enzimek aktivitásának emelkedése, stb.), ezek a változások azonban csak a fertozést követo legalább 2 napot követoen voltak mérhetok a de novo enzimszintézis eredményeként [221]. Citrullus vulgaris L. Fusarium oxisporummal történt fertozését követoen szintén a HCHO szint rendkívül gyors emelkedését, valamint a metilezett vegyületek koncentrációjának csökkenését lehetett észlelni [206,222]. Szárazság-stressz hatására a Phaseolus vulgaris L. szöveteiben mérheto HCHO tartalom emelkedett, míg ezzel párhuzamosan a trigonellin koncentrációja csökkent [223]. Abiogén stresszhatások közül a hostressz HCHO metabolizmusra gyakorolt hatását részletesen vizsgálták Phaseolus vulgaris cv. Pinto nö vényekben [224]. A szerzok kimutatták, hogy a vizsgált homérséklettartományban (10o C – 40o C) szoros kapcsolat mutatható ki a homérséklet és a mérheto HCHO
tartalom
között.
megháromszorozódott
a
A
környezeti
detektált
homérséklet
endogén
HCHO
emelkedésével mennyisége.
párhuzamosan Néhány
közel
kvaterner
ammóniumvegyületet (TML, kolin, trigonellin), mint potenciális HCHO forrást vizsgálva megállapították, hogy ezek koncentrációja csökkent a levelekben a 20 o C – 40o C –ig terjedo
61
homérséklet-tartományban.
Fontos
megjegyezni,
hogy
a
kvaterner
ammóniumvegyületek
stresszhatások során betöltött szerepét már korábban feltételezték [225]. Az endogén HCHO keletkezéséhez szükséges enzimatikus reakciókat tanulmányozva, a hidrogénperoxid függo N-demetilázok és peroxidázok aktivitása P. vulgaris sejtmentes kivonatában, szobahomérsékleten közel megegyzett a kontroll növényekben mért értékkel. A hosokkot követo megemelkedett HCHO szintre magyarázatot adhat ezen enzimek aktivitásának homérsékletfüggése [226]. Csírázó tölgymakk (Quercus cerris L.) hideg- és hostressz hatására (-20o C-on és +40o C-on) bekövetkezo endogén HCHO tartalom változását vizsgálva megállapították, hogy a mérheto HCHO tartalom két alkalommal ér el minimális értéket a vészfázis során (az elso három órán belül, majd a 3. és 5. nap között), valamint a késobbiekben a kontrollhoz képest nagyobb értéken stabilizálódik [227]. 2.10. Programozott sejthalál és apoptotikus formája a növényekben, kis- (pl. H2 O2 és HCHO) és nagymolekulák szerepe A soksejtes szervezetek fejlodése szempontjából alapveto fontosságú egy olyan fiziológiai mechanizmus, mely lehetové teszi a sejtosztódás és elimináció egyensúlyának fenntartását [228]. A humán és állati szervezetekhez hasonlóan - bizonyos körülmények között - a növényekben is genetikai program lép muködésbe a nem kívánt sejtek eltávolítására. Ezt a folyamatot, melyben az adott sejt aktívan vesz részt saját elpusztításában programozott sejthalálnak (PCD) nevezzük [229,230]. Ennek során - külso kiváltó ok, vagy belso folyamatok hatására - meghatározott gének aktiválódnak és specifikus enzimek lépnek muködésbe, melyek az adott sejt eliminációjában vesznek részt [231]. Ez a folyamat alapvetoen eltér a nekrózistól, melynek során a sejtnek nincs aktív szerepe saját pusztulásában. Nekrózis során valamilyen stresszhatás (pl. iscemia, ho- , kémiai-, ill. más biogén, vagy abiogén stressz), traumás sérülés a sejtmembrán, sejtorganellumok közvetlen sérülését idézi elo, melynek eredményeként a károsodott sejt szétesik [232,233]. A humán és állati szövetekben megfigyeltek alapján a nekrózissal ellentétben a PCD során nem alakul ki gyulladásos válaszreakció, továbbá nagyon lényeges eltérés, hogy a folyamat energiát is igényel [233]. Megfigyelték, hogy alacsony adenozin-trifoszfát (ATP) szint mellett azok a folyamatok, melyek PCD -t indukálnának, végül nekrózist indítanak el [234]. Egyes szerzok megkülönböztetik a fiziológiás sejthalál folyamatát is azokban az esetekben, ahol nem tisztázott, hogy PCD, vagy apoptózis történik (23. ábra) [235]. Alapveto felismerés, hogy a PCD folyamatának zavara számos kóros elváltozás, betegség kialakulásáért teheto felelossé [236].
62
Környezeti stresszhatások Egyedfejlõdés
A sejt véletlenszerû pusztulása
Véletlenszerû DNS lebomlás, a sejtorganellumok és plazma membránjának szétesése
Fiziológiás sejthalál
Genetikai program, kaszpázok, DNS lebontás 180 bp hosszúságú szakaszokra
Nekrózis
Jellegzetes morfológia, apoptotikus testek keletkezése
PCD
Apoptózis
23. ábra A sejthalállal kapcsolatos jelenségek sematikus vázlata (folyamatos vonalak: aktív folyamatok, szaggatott vonalak: passzív folyamatok) [235]. A PCD folyamatát funkcionálisan három fo szakaszra lehet bontani [233]: -
Stimulus függo indukciós fázis.
-
Effektor szakasz, mely során a különbözo kiváltó okok eredményeként szabályozó mechanizmusok aktiválódnak.
-
Degradációs fázis, mely során a PCD –re jellemzo morfológiai változások végbemennek.
PCD történik pl. a HR során, de alapveto szerepe van a folyamatnak a növényi egyedfejlodés alatt is (pl. szervek öregedése, szállítószövet rendszer differenciálódása, magvak fejlodése és csírázás során) [237-239]. A szervek, szövetek öregedését lezáró PCD lassúbb folyamat, melyet az öregedo sejtek anyagcseretermékeinek fiatalabb sejtek számára történo újrahasznosítása is megeloz, ezzel szemben a HR során gyors sejtelhalásra van szükség a kórokozókkal szembeni reakció során [230,231,240]. A növényi sejtek programozott halálát kiváltó folyamatok közül (pl. fertozés apatogén kórokozóval hiperszenzitív válaszreakció során) még viszonylag keveset ismerünk részletesebben, továbbá a folyamatok biokémiai háttere is kevéssé tisztázott [241]. 2.10.1. A növényi apoptózis morfológiai jellemzé se Az apoptózis elnevezést eloször Kerr és munkatársai [242] használták, magát a folyamatot azonban már sokkal korábban, a XIX. század közepén leírták [243]. Az apoptózis a PCD speciális típusa,
63
melynek számos morfológiai jellemzoje van és jellemzo fiziológiai folyamat kísér (24. ábra) [228]. Kiváltó oka lehet többek között citotoxikus vegyület, mely pl. DNS károsodást okoz, ceramidok, mycotoxinok, SA, UV (ultraviola) sugárzás és oxidatív stressz. A klasszikus szemléletnek megfeleloen az apoptózis aktív folyamat, mely során fehérjeszintézis történik. Ezzel szemben számos esetben igazolták, hogy a folyamathoz nem szükséges fehérjeszintézis, továbbá a szintézis gátlása apoptózist indukál [243].
24. ábra Morfológiai és ultrastrukturális változások az apoptózis során állati sejtben (a) és hiperszenzitív válaszreakció során növényi sejtben (b). A sejtmag lebontásában mindkét esetben endonukleázok vesznek részt. Állati sejtekben a keletkezett apoptotikus sejteket a szomszédos sejtek fagocitálják (a). Növényi sejtekben a szomszédos sejtek által kiválasztott nukleázok is résztvesznek a sejtmag lebontásában (b). Rövidítések: M, mitokondrium; N, nukleusz; ER, endoplazmatikus retikulum; G, Golgi apparátus; V, vakuólum [228]. Az apoptózist kíséro jellegzetes morfológiai változások a kromatin állomány kondenzálódása, a sejtfalfelépítés asszimetriájának elvesztése, a citoplazma és a sejtmag zsugorodása és vakuolizációja, sejt-sejt kapcsolatok megszunése, a sejtmag DNS fragmentálódása, oligonukleoszómális fragmentumok kialakulása, valamint membránnal határolt, ún. apoptotikus testek kialakulása [228,244-249]. A sejtfalfelépítés asszimetriájának elvesztése, valamint kulcsfontosságú fehérjék (pl. poli(ADPribóz)polimeráz) hasítása a kaszpázok aktiválásának eredményeként pedig fontos biokémiai változások [235]. Megfigyelték ugyanakkor, hogy mindezen változások során a mitokondriumok viszonylag hosszú ideig megorzik integritásukat [228,250], funkciójuk azonban károsodik az
64
apoptózis folyamata alatt [243]. A növényi sejtek felépítése eltér a humán és állati sejtektol, mivel a sejtmembrán mellett sejtfal is határolja oket, ez pedig hatással van az apoptózis folyamatára is. A sejtfal pl. gátolja membránnal határolt apoptotikus testek kialakulását és szomszédos sejtek általi fagocitózisát. A növényekben ezért nagy je lentosége lehet az autolízisnek, melyet a tracheák kialakulása során is megfigyeltek [251]. Egyéb eltéréseket is észleltek, mivel a növényi sejtmag állománya általában a sejtmag egészében kondenzálódik, eltéroen az állati sejtektol, ahol a kromatin állomány a maghártya mentén lokalizálódik a kondenzálódás során. A növényi sejtmag általában nem
25. ábra A növényi sejt sorsa a PCD-t követoen. Mind a sejttartalom, mind pedig a sejtfal eltunik (1). A sejt maradványait a szomszédos, növekvo sejtek összepréselik (2). A sejtfal marad meg (3). A sejthalál a sejttartalom szervezett remobilizációját követi az öregedés során, majd az elhalt sejteket tartalmazó szerv leválik a növényrol (4) [232]. fragmentálódik és viszonylag intakt marad apoptózis során [228]. Elektronmikroszkópos vizsgálatok tárták fel ún. sarló alakú sejtmagok jelenlétét Nicotiana tabacum sejtekben TMV fertozést követo PCD során, további vizsgálatoknak kell azonban igazolni, hogy ez a morfológiai jellemzo apoptotikus markerként is alkalmazható-e [235]. A sejttartalom eltávolítása többféle módon is történhet, melyet a sejthalált kiváltó körülmény alapvetoen befolyásol. Az apoptózis idobeli lefutása a növényi szervezetekben általában hosszabb
65
(esetleg több óra), valamint sok esetben a jellemzo morfológiai bélyegek közül csupán néhányat sikerült egyértelmuen leírni [229]. Glycine maximum L. sejtekben, Pseudomonas syringae fertozés, valamint Alternaria toxin hatására indukálódó PCD során azonban a jellegzetes apoptózisnak megfelelo morfológia legtöbb jellemzojét sikerült detektálni alapos mikroszkópos analízist követoen [228]. Az eddig elért kísérleti eredmények tükrében a növények esetében inkább apoptózis-szeru jelenségekrol beszélhetünk, mivel az állati sejtek apoptózisára jellemzo változások közül egyesek hiányoznak [235]. 2.10.2. TUNEL reakció alkalmazása a növényi apoptózis detektálására Az apoptózis folyamatát kíséro jellegzetes változások egyike a DNS fragmentálódása, melyet Ca 2+dependens endonukleáz enzimek katalizálnak. A DNS lebontásában fontos szerepe lehet továbbá a Zn2+-dependens DNáz enzimeknek is [252]. A DNS lebontása 300 és/vagy 50 kb nagyságú fragmentumok endonukleolitikus képzodésével veszi kezdetét, majd ezek a fragmentumok hasadnak tovább a nukleoszómák közötti, összeköto DNS szakaszok mentén [228]. A keletkezo, általában 180 bázispár (, vagy ennek többszörösének megfelelo) hosszúságú fragmentumok in situ detektálhatók olyan reagensekkel, melyek a DNS szakaszok szabadon álló 3`-OH végével képesek reagálni. Fontos megjegyezni azonban, hogy a keletkezo DNS fragmentumok mérete - úgy tunik - ettol eltéro is lehet, mivel pl. Nicotiana tabacum sejtekben lezajló PCD során 50 kb méretu fragmentumok kialakulását észlelték [253]. Nekrózis során a DNS lebomlása véletlenszeruen történik, így a keletkezo fragmentumok mérete is igen heterogén [235]. Az ún. TUNEL reakció („terminal deoxynuclotidyl transferase-mediated dUTP nick end labelling”) során UTP konjugált terminális dezoxinukleotid-transzferáz segítségével marker molekulá t kapcsolnak a nukleoszómális fragmentumok 3`-OH
végéhez [235,254]. A vizsgálatot
körültekintéssel kell végezni, mivel a DNS nem apoptotikus sejthalál során is degradálódhat, ami szintén pozitív reakciót adhat [255]. Egyes szerzok beszámoltak arról, hogy a növényi szövetek feldolgozása, fixálása, metszése során is bekövetkezhet olyan mértéku DNS fragmentálódás, amely pozitív TUNEL reakciót adhat. A reakció kivitelezése során ezek a hibák azonban ma már kiküszöbölhetok. Szövettenyészetek alkalmazásával pl. a fixálás egyszerubbé válik, ami kiküszöböli a DNS hasadását a folyamat során [235]. A TUNEL reakció alkalmazásakor azonban más, pl. morfológiai jellemzoket is célszeru figyelemmel kísérni az apoptózis pontosabb detektálásához. A sejtmag DNS fragmentálódását kimutatták növényi sejtekben is TUNEL reakció segítségével, melyet pl. patogén által szintetizált toxin, ill. UV-C besugárzás váltott ki [256,257]. Wang és
66
munkatársai [255] árpa csírázása során sikeresen alkalmazták a TUNEL reakciót aleuron tartalmú sejtek PCD-ának tanulmányozására, a folyamat idobeli és az embrióhoz viszonyított térbeli lefutásának vizsgálatára. 2.10.3. Az apoptózis folyamatában szerepet játszó gének Az állati szervezetekben számos gén ismert, melyek indukáló (pl. BAX), vagy gátló (pl. BCL-2, BI-1, DAD1) szerepet töltenek be az apoptózis szabályozásában. Ezen gének növényi homológjainak azonosítása, klónozása még alig adott konkrét eredményeket. Vizsgálták azonban a növényekbe juttatott állati gének muködését. Nicotiana tabacum-ba juttatott patkányból származó BAX gén pl. HR szeru sejthalált indukált [258]. Egy állati gén növényi expressziója azonban önmagában még nem támasztja alá homológ gén jelenlétét. Immunokémiai vizsgálatokkal azonban további részleteket tárhatnak fel. Humán BCL-2 ellen eloállított antitestekkel N. tabacum kivonatában sikerült azonosítani egy lehetséges növényi homológot [259]. 2.10.4. A programozott sejthalál aktiválásában szerepet játszó hírvivo folyamatok A növényi sejtek PCD-jának aktiválásában szerepet játszó szignál folyamatok – úgy tunik – az állati sejtekben megfigyeltekhez hasonlóan igen változatosak lehetnek [251]. Számos kísérlet irányul az állati és növényi PCD-t szabályozó molekuláris mechanizmusok közötti esetleges párhuzamok feltárására, így pl. az ún. dad1 fehérje („defender against death”) – mely a PCD gátlására képes homológját sikerült azonosítani Oryza sativa és Arabidopsis thaliana sejtjeiben is (26. ábra) [228]. Ez az eredmény is egyértelmuen jelzi, hogy a szabályozó mechanizmusok egy része közös lehet a növényi és állati szervezetekben. Igazolták a sebzés és növényi növekedésszabályozó anyagok (auxin és citokinin kezelés) PCD-t kiváltó hatását in vitro fenntartott Zinnia sejteken [260]. A citokinin ugyanakkor gátolja a levelek öregedése során bekövetkezo PCD-t , ezzel szemben indukálja a folyamatot a trachea elemeiben, mely megfigyelések jelzik a szabályozó mechanizmusok sokrétuségét [229]. Kimutatták a Ca2+, etilén, szalicilsav (SA), reaktív oxigéntartalmú molekulák (ROS), extracelluláris proteázok és nukleázok szerepét is a folyamat megindításában, feltételezik az elektron- és protontranszport folyamatok változásának hatását, valamint egyre több megfigyelés támasztja alá a mitokondrium központi szabályozó szerepét [228,261,262].
67
26. ábra A dad1 fehérje nagymértékben konzerválódott, mintegy 90 aminosavból álló szakasza. Vastag betuk: megegyezo aminosavak; X: nem azonosított aminosav; -- : nem részletezett fehérje szakasz [228]. 2.10.5. Mitokondrium és enzimfehérjék szerepe a programozott sejthalál során A PCD folyamatának elindításában résztvevo különbözo anyagcsereutak kapcsolata még nem ismert részletesebben, a mitokondrium alapveto szerepe az emlos sejtekben lezajló PCD kialakulásában (pl. a citokróm c felszabadulása mitokondriumból, kaszpázok aktiválása) azonban felveti, hogy pl. a ROI, hypoxia, tápanyagmegvonás, elektrontranszport folyamatának károsodása a mitokondriumon keresztül állnak összefüggésben a növényi szervezetekben is [235,263,264]. A citokróm c kiáramlása a mitokondriumból alapveto fontosságú a kaszpázok aktiválásában, felszabadulásának pontos mechanizmusa a mitokondrium membránján keresztül azonban még további vizsgálatokat igényel. Lehetséges, hogy egy speciális pórus komplex aktiválódik, létrehozva az ún. átmeneti permeabilitási pórust, esetleg a feszültségfüggo anion-csatorna segítségével [264]. Különbözo fehérjék szerepének tanulmányozása során, a Bcl-2 családba tartozó pro- és antiapoptotikus fehérjék - transzgénként növényekbe juttatva is - hatással vannak a PCD folyamatára a mitokondriumok membránjának permeabilitására gyakorolt hatásuk révén [265]. Az anti-apoptotikus hatású Bcl-2, Bcl-x és CED-9 fehérjék N. tabacum-ban gátolták a sejthalál kialakulását több, gomba eredetu
fitopatogén
anyaggal
szemben
[266].
Bcl-2
fehérjék
a
mitokondriumokban,
plazmamebránban, az endoplazmatikus retikulumban és a sejtmaghártyában is megtalálhatók (ezek a helyek a reaktív oxigéntartalmú molekulák képzodése szempontjából is alapveto fontosságúak) [243].
68
A szintén Bcl-2 családba tartozó, pro-apoptotikus hatású Bax expresszálódása HR–szeru sejthalált idézett elo a dohányszövetben [258]. Ezek az eredmények egyértelmuen jelzik, hogy a mitokondrium a növényekben is alapveto szerepet tölt be a PCD szabályozásában, és ezen muködése emlosgének bejuttatásával is aktiválható. Bár a Bcl-2 családba tartozó fehérjéket eddig nem sikerült növényekben kimutatni, kaszpáz jellegu (ú.n. metakaszpáz) fehérjék szintéziséért felelos géneket már azonosítottak növényekben [267], valamint kaszpáz inhibitorok alkalmazásával sikerült befolyásolni a növényi PCD folyamatát. A kaszpázok blokkolhatók a megfelelo szubsztráthoz kapcsolt aldehid (reverzibilis inhibitor), vagy metilketon (irreverzibilis inhibitor) molekulával [235]. Peptid-klórmetil keton kaszpáz inhibitorral sikeresen blokkolható a NO - H2O 2 által indukált sejthalál Arabidopsis thaliana szuszpenziós kultúrákban [268]. Újabb eredmények azonban azt mutatják, hogy a kaszpázok - pl. kaszpáz 3 és kaszpáz 8 - gátlása mellett is bekövetkezhet a sejt halála az ún. onkózis során [264]. Humán és állati sejtekben megfigyeltek alapján az onkózist nem tekintik programozott sejthalálnak, mivel a sejt szétesése és a sejttartalom kiáramlása gyulladásos válaszreakciót indukál. A növényi szövetekben azonban a sejtfalak jelenléte miatt a sejttartalom szabad kiáramlása gátolt, ezért egyes szerzok felvetik, hogy a növényekben számos esetben programozott onkózis lehet a felelos a sejtek eliminációjáért [264]. A kaszpázok mellett egyéb, cisztein és szerin proteázok is szerepet játszhatnak a HR folyamatában. Solomon és munkatársai [269] sikeresen gátolták ROS képzodését és baktérium által aktivált sejthalál kialakulását a cisztein proteáz inhibitor cisztatin segítségével G. maximum sejtkultúrákban. Gietl és Schmid Ricinus communis magvak csírázását tanulmányozva [231] a ricinoszómákból felszabaduló papain típusú cisztein endopeptidázok jelentoségét emelik ki a PCD késoi szakaszában. A növényi sejtek esetében felmerül a – mitokondriumokhoz hasonlóan szintén mikrobális eredetu kloroplasztok PCD –ban betöltött esetleges koordináló szerepe [228]. Megfigyelték a fény/sötétség hatását a PCD (pl. HR) folyamatára [270,271], valamint azt, hogy a kloroplaszt membránjainak szétesése a sejthalál végso fázisában volt csupán észlelheto P. vulgaris levelének sejtjeiben HR során [272]. Ezzel szemben, levelek öregedésekor a kloroplasztoknak a folyamat korai szakaszában történt autolízisét és szétesését figyelték meg PCD során [273]. 2.10.6. Reaktív oxigéntartalmú molekulák (ROS) szerepe Különbözo stresszhatások, különösen azok, melyek hatással vannak a sejt redox homeosztázisára PCD folyamatokat indíthatnak el. A növényi szövetekben számos folyamat vezet ROI –k keletkezéséhez és a PCD aktivációjához. Ilyenek pl. az öregedés, melynek során csökken a sejt ROI –
69
el szembeni detoxikáló képessége [271] a hideg [274] és az ozmotikus stressz [275], UV sugárzás [276], SA [270], és avirulens kórokozóval történo fertozés a HR során [277,278]. Újabb vizsgálati eredmények alapján hasonlóságokat tártak fel a különbözo stresszhatások, mint pl. a toxin és patogén által kiváltott PCD között [239]. A PCD (pl. HR) vizsgálata során számos esetben felmerült a reaktív oxigéntartalmú molekulák (ROI, ROS), mint pl. szuperoxid (.O2 -) és a H 2O 2 szerepe, mint szignálmolekula és/vagy a folyamat kiváltója, bár több ellentmondó eredmény áll rendelkezésre [270,279]. A HR során keletkezo ROI továbbá közvetlenül is károsíthatja a kórokozókat, ezzel is erosítve a növény védekezo mechanizmusait [240,277]. Ezeken túlmenoen, a HR aktivációjának korai szakaszában megfigyelt változások (a szövetek oxidatív károsodása, Ca 2+ és H+ beáramlás a sejtekbe, K + és Cl- kiáramlás a sejtekbol) jelzik, illetve hozzájárulnak ROI (pl. .O 2 -) termeléshez [280]. A plazmamembránon át lezajló iontranszportban történo változások ugyanakkor a citoszol pH-jának csökkenéséért is felelosek [228]. Lycopersicon esculentum Mill. sejtszuszpenziós kultúrákban megfigyelték, hogy a humán daganatterápiában alkalmazott topo izomeráz-I inhibitor kamptothecin adagolása programozott sejthalált váltott ki a sejtekben, mely során az apoptózisra jellemzo morfológiai változások (kromatin kondenzáció , DNS fragmentáció) is észlelhetok voltak. A kamptothecin alkalmazását követo 2 órán belül a H2O 2 produkció jelentos emelkedését mérték a sejteken belül, mely Ca2+-csatorna blokkolóval, kaszpáz- és NADPH inhibitorral egyaránt gátolható. A szerzok az etilén mellett több reaktív oxigéntartalmú molekula és az oxidatív stressz alapveto szerepét is feltételezik az apoptotikus folyamat aktiválásában [249]. Hasonló megfigyeléseket tettek Daucus carota L. sejtszuszpenziós kultúrákban a C-források megvonását követoen. A stresszhatás során észlelt megemelkedett szuperoxid produkciót, mind pedig a PCD folyamatát sikeresen blokkolták NADPH oxidáz gátló alkalmazásával [281]. Humán sejteken végzett számos megfigyelés utal továbbá arra, hogy a sejt redox homeosztázisa, oxidatív stressz közvetlenül befolyásolja a citoszol iontartalmát [243]. Kísérleti eredmények jelzik, hogy az oxidatív stressz hatással lehet a citoszol Ca2+ tartalmára, mivel a Ca2+ sejtbe történo beáramlását timocitákban blokkolni lehet az antioxidáns hatású N-acetil-L-ciszteinnel [282]. Hasonló hatást figyeltek meg a sejten belüli raktárakból történo Ca2+ felszabadulásra vonatkozóan hepatocitákban, glutation adagolását követoen [283]. Úgy tunik tehát, hogy minden, a sejtben található Ca2+ pumpa (plazmamembránban, mitokondriumban és endoplazmatikus retikulumban) közvetlen redox szabályozás alatt állnak [243]. Az elektrontranszport folyamatának károsodása a mitokondriumon belül közvetlenül is hozzájárulhat ROS felhalmozódáshoz [251]. A HR során, az infekció helyén lezajló gyors sejtpusztulás a szisztémás
70
rezisztencia erosödését is eredményezheti különbözo, eddig még alaposan fel nem tárt folyamatokon keresztül [229]. A ROI-k kettos szerepet töltenek be a PCD folyamatában. Az indukciós fázis során, mint fakultatív szignálmolekulák szerepelhetnek, valamint a mitookondriális permeabilitás változás eredményeként közvetlenül is hozzájárulhatnak a sejt felbomlásához [233]. Kis dózisú H2 O 2 [277,284], .O 2 - [270], OH [285], vagy lipid peroxid kezelés [286] önmagában is elegendo PCD kiváltásához.
.
Delledonne és munkatársai [279] megállapították, hogy a HR viszont blokkolható a szuperoxid dizmutáz (SOD) enzim gátlásával, mely a .O2 - - H 2 O 2 –á történo átalakulását katalizálja. Más eredmények azt mutatják, hogy a növényi sejtek saját .O 2 - termelo rendszere hasonló lehet a makrofágok NADPH oxidáz complexéhez, mivel a ROI termelés – hasonlóan az emlos sejtekhez – növényi sejtekben is blokkolható NADPH oxidáz gátló vegyüket mikromoláris koncentrációival [229,277,280]. Az emlosök immunrendszerének muködése során a keletkezo ROI reagálhatnak a nitrogén monoxiddal (NO), mely reakcióknak fontos szerepe van a PCD szabályozásában. Újabb eredmények alapján a HR folyamatában hasonló szerepe van a NO –nak a növényekben is [251,279,287]. Úgy tunik, hogzy a PCD szabályozásában alapveto szerepe lehet a NO – ROI aránynak, melyet a SOD muködése befolyásol, mely átalakítja a jelenlévo .O 2 - -ot és így elosegíti a PCD –t kiváltó NO és H 2 O2 felhalmozódását. A NO és .O2 - - valamint indirekt módon a H 2 O2 – reakciója során keletkezo peroxinitrit (ONOO-) szójabab sejtekben megfigyeltek alapján feltehetoen gátolja a PCD folyamatát. Fontos kiemelni tehát, hogy a .O 2 - egyrészt aktiválhatja a HR –t a H2 O 2 képzodésén keresztül, másrészt gátolhatja is a NO –al történo reakción keresztül (27. ábra) [239]. Az emlos sejtekben ROI plazmamembránhoz kötött NADPH oxidáz komplex segítségével képzodhetnek kontrolláltan, míg a NO –ot nitrogén monoxid szintáz enzim termeli (NOS). A NOS enzim növényi homoló gját eddig nem sikerült megtalálni, a NADPH oxidáz komplex homológjának jelenlétét azonban sikerült alátámasztani Arabidopsis thaliana sejtekben [288]. Egyes eredmények azt jelzik, hogy a SA-nak is szerepe van a ROI és NO által befolyásolt mechanizmusban - mely feltehetoen a sejtciklusra van hatással - a folyamat biokémiai háttere azonban eddig nem tisztázott (27. ábra) [239]. Mivel a növényeket számos környezeti hatás érheti, melyek befolyásolhatják a ROS keletkezését, aktív mechanizmusoknak kell muködni a ROS szint szabályozásában, ezzel is megóva a sejteket a véletlenszeruen aktiválódó PCD folyamatától [251]. Ezt a szerepet töltheti be pl. az úgynevezett alternatív oxidáz (AOX), mely az állati sejtekben nem, csupán a növényekben található meg.
71
Az oxidatív elektrontranszportot gátló anyagok - mint az antimicin A és a cianid - aktiválták az AOX expressziót, mely így kivédheti a ROS káros hatásait [289]. Jelentos AOX indukciót figyeltek meg számos egyéb, biogén stresszhatás következményeként is [251]. Proximális (fertõzött) sejt
Disztális (nem fertõzött) sejt
patogén
receptor . O2
NO
. O2
NO
ONOO
-
SOD
SOD H2 O2 H2 O2
HR
antioxidáns enzimek mikro HR, HR hiánya
mobilis szignálmolekula (pl. ROI/SA?)
27. ábra A reaktív oxigéntartalmú molekulák (ROI) és nitrogén monoxid (NO) hiperszenzitív válaszreakcióra (HR) gyakorolt negatív és pozitív hatásának hipotetikus vázlata. (szuperoxid dizmutáz: SOD, szuperoxid: .O2 -, hidrogén peroxid: H2 O2 , peroxinitrit: ONOO -, szalicilsav: SA) [239]. 2.10.7. Oxidatív stressz, mitokondriumok és Ca2+ homeosztázis kapcsolata a PCD folyamatában Az eddigi vizsgálatok alapján megállapítható, hogy a Ca 2+ alapveto szerepet tölthet be a PCD folyamatának elindításában a mitokondriumok membránjának permeabilitására gyakorolt hatásán keresztül (pl. a mitokondrium membrán PT pórusainak aktiválása és a citokróm c kiáramlás megindítása) azokban az esetekben, amik or a sejt ATP szintje kicsi [290]. A sejt redox homeosztázisának változása, az oxidatív stressz ugyanakkor a sejt szabad Ca2+ tartalmára gyakorolt hatásán túl közvetlenül is aktiválhatja a PT pórusokat a ROS termelésén keresztül. Az elektrontranszport gátlása pl. NO-al csökkenti a sejt ATP szintjét, emeli a ROS szintet, mely folyamatok a Ca 2+ tartalom emelkedésével a mitokondriumon keresztül aktiválják a PCD folyamatát. A citoszol Ca2+ tartalmának emelkedése ugyanakkor nem elegendo önmagában a PCD elindításához (28. ábra) [264].
72
28. ábra A növényi sejtben lezajló programozott sejthalál szabályozásának egyik hipotetikus modellje [233]. A citokróm c felszabadulását a mitokondriumból sikerült kimutatni Cucumis sativus szikleveleinek sejtjeiben PCD során, továbbá más növények sejtjeiben is abiogén stresszhatást követoen [291]. Zea mays sejteket vizsgálva megállapították, hogy D-mannóz adagolás hatására a citoszolban citokróm c szabadult fel. A D-mannóz gátolja a hexokinázokat és csökkenti a sejt ATP tartalmát, mely a PT pórusok kialakulásának egyik feltétele. A sejt ATP szintjének csökkentésén túl a D-mannóz emelheti a sejt ROS szintjét, mely folyamatok a citoplazma nagy Ca 2+ szintjével társulva segítik a PT pórusok kialakulását és így a citokróm c felszabadulását [264]. Megfigyelték, hogy egyéb stresszhatások, így pl. a hostressz is citokróm c felszabadulást váltanak ki a növényi sejtben [291]. 2.10.8. A szingulet oxigén toxikus és apoptotikus hatásai A molekuláris oxigén (O2 ) nélkülözhetetlen az aerob élolények számára, ugyanakkor potenciálisan toxikus anyag. Alapállapotban, a két páratlan elektronnal rendelkezo O2 viszonylag inert molekula. Gerjesztés hatására két, energiaszintjében eltéro állapot alakulhat ki, melyek közül a magasabb energiaszintu rendkívül rövid di o alatt (kb. 10-11 s) a kisebb energiaszintu állapotba kerül, melynek
73
hosszabb életideje (kb. 4 µs és >1 ms között) már lehetové teszi, hogy különbözo reakciókban vegyen részt. Ez utóbbi molekulát nevezzük szingulett oxigénnek (1 O 2). Habár a 1O 2 energiaszintje csupán 94kJ/móllal nagyobb az alapállapotú O 2 -hez, a két molekula reaktivitása mégis alapvetoen eltér, mivel a legkülso elektronhéjukon elhelyezkedo elektronok kvantumkémiai tulajdonságai különböznek egymástól [292]. A 1 O2 rendkívül reaktív molekula, mely károsítja a biomolekulákat, genotoxikus, citotoxikus hatású, továbbá szerepe van a génexpresszió aktiválásában is. Fotokémiai (bizonyos vegyületek látható, vagy UV fénnyel történt besugárzásával) és kémiai úton egyaránt eloállítható, továbbá a sejtekben endogén körülmények között is létrejöhet (pl. a gyulladásos folyamatok során) [292]. Dahl és munkatársai [293] olyan kísérleti rendszert hoztak létre, melyben más tényezoket kiküszöbölve vizsgálták a 1 O 2 baktériumokra kifejtett toxikus hatását. A 1O 2 eloállítása azonban a sejteken kívül történt, így nem volt lehetséges annak pontos modellezése, hogy közvetlenül a sejteken belül képzodo 1O 2 hogyan fejti ki hatását az ott jelenlévo makromolekulákra. A baktériumok sejtfala fizikai és kémiai határt képez a kívülrol behatoló 1 O 2 számára, mely csak ezt követoen léphet reakcióba az életfolyamatok számára alapveto funkciójú molekulákkal. A kísérleti eredmények azt mutatták hogy a 1 O2 a H2 O2 –nál nagyságrendekkel toxikusabb molekula. Míg 30 percnél rövidebb, kevesebb, mint 10 -6 M-os 1 O 2 a Salmonella typhimurium sejtek 99% -át elpusztította, hasonló hatást csupán 60 perces, 10 -2 M-os H2 O2 kezeléssel sikerült elérni. A 1O 2 toxikus hatásai azonban – a viszgált baktériumfajok némelyikében – gátolhatók voltak a fehérje metabolizmus megváltoztatásával, így pl. az L-hisztidin túltermeltetésével, vagy a karnozináz enzim gátlásával [293]. Kochevar és munkatársai egy fotoszenzibilizáló festékanyag, a bengáli vörös látható (514nm) és UVA fénnyel (355nm) történt besugárzásával állítottak elo elobb 1O 2 -t, majd más oxidatív gyököket. A vizsgálatok során használt HL-60 sejtszuszpenziós kultúrák sejtjeiben észlelt nukleáris fragmentáció kvantitatív értékelése és a keletkezo oligonukleoszómális fragmentumok kimutatását követoen megállapították, hogy a látható fénnyel történt besugárzás hatására keletkezo 1 O2 teheto felelossé az apoptotikus folyamatok beindításáért, melynek pontos mechanizmusa még nem ismert. Ezzel szemben, az UV-A fénnyel történt besugárzás eredményeként keletkezo oxidatív gyökök lipid oxidációs hatása volt jelentos, mely azonban nem jelent közvetlen apoptózis indukciót [294]. A 1 O2 és H2 O2 apoptózis indukáló hatásának alaposabb vizsgálata feltárta, hogy HL-60 sejtekben a p38 protein-kináz aktivációját mindkét molekula eloidézheti, ezzel szemben a citokróm c felszabadulása a mitokondriumokból és a kaszpáz 3 aktivációja csak a 1O 2 hatására következik be [295].
74
Egyes eredmények arra utalnak, hogy az antitestek közvetve – mintegy katalizátorként muködve képesek 1O2 termelésre és annak vízmolekulákkal történo reakciójával H2 O2 eloállítására. Kimutatták, hogy ezen folyamatok segítségével az antitestek képesek a baktériumok elpusztítására immunsejtek (pl. makrofágok) közremuködése nélkül. Antitestek szerkezetének vizsgálatá val megállapították, hogy bizonyos aktív centrumok jelenléte, a különbözo aminosavak elhelyezkedése lényeges a
1
keletkezése szempontjából. Mivel az elvégzett kísérletekben UV sugárzást használtak a
1
O2
O2
képzodésének beindításához, így a szerzoknek nem sikerült megmagyarázni, hogy a szervezet belsejében, a bor felszínétol távol mi szolgáltathatja az energiát ehhez a reakcióhoz [296]. 2.10.9. A HCHO szerepe a sejtek apoptotikus folyamataiban A korábban leírt megfigyelések alapján – az oszi levélhullás (görög nevén apoptózis) során észlelt drasztikusan megemelkedo mérheto HCHO koncentráció, továbbá a potenciális HCHO források (pl. kolin és trigonellin) szintjének csökkenése – feltételezheto, hogy az exogén eredetu és a sejtekben kötött formában (pl. hidroximetil csoportok) jelenlévo HCHO fontos szerepet tölthet be az apoptotikus folyamatok elindításában és szabályozásában. Ennek során a koncentráció függvényében serkento és gátló hatás egyaránt érvényesülhet. HT-29 humán vastagbél karcinóma és HUV-EC-C humán endoteliális sejtek kultúráit vizsgálva megállapították, hogy a tápközegekbe adagolt HCHO kis koncentrációban (0,1 mM) elosegítette mind a daganatos, mind pedig az endoteliális sejtek osztódását, továbbá csökkentette az apoptotikus aktivitást. Magasabb koncentrációt alkalmazva (1,0 mM HCHO) a sejtproliferációt gátló és apoptózis indukáló hatás volt észlelheto, tovább emelve a HCHO mennyiségét (10 mM) pedig már toxikus hatások érvényesültek [297]. Az 1’-metil-aszkorbigén (Me-Asc) - mely több zöldségnövény (pl. káposztafélék) szöveteiben is megtalálható kis mennyiségben – egy N-metilindol tartalmú aszkorbinsav származék. Szende és munkatársai [298] PC-3 humán prosztata karcinóma sejtekkel végzett kísérleteik során azt találták, hogy Me-Asc adagolását követoen jelentosen no a daganatos sejtek száma és megemelkedik az apoptotikus sejtek aránya. Hasonló mefigyeléseket tettek NG -hidroximetilezett arginin származékok adagolása után is [299]. Az irreverzibilis HCHO megköto dimedon és a Me-Asc együttes alkalmazásakor a fenti hatás elmaradt (a kontrollal összevetve a dimedon önmagában nem volt hatással a kultúrák növekedésére), ami arra utal, hogy a Me-Asc –ból a sejtekben in situ keletkezo HCHO fontos szerepet játszik a sejtproliferációt és apoptózist szabályozó folyamatokban [202,298 ]. A sokasodó kísérleti eredmények azt jelzik, hogy a biológiai rendszerekbe kerülo exogén HCHO, valamint a kötött formában (pl. labilis hidroximetil csoportok) található endogén HCHO fontos szerepet tölthet be a fiziológiás és patológiás folyamatok elindításában és szabályozásában.
75
1.: Partisil töltet µBondapak C18 2.: Pellosil HC töltet 10µm 30cm x 4,6mm 30cm x 3,9mm 1.: 1% dietilamin, Na-heptán-szulfonát dietil-éter + metanol vizes oldata (10 elegy (négyféle mM) arányban) ecetsavval pH4-re 2.: 1% dietilamin, beállítva + metanol dietil-éter + metanol (6:4 v/v) elegy (95:5 v/v) 1,0 ml/p 215 nm [97]
1.: 2,00-2,29ml/p 2.: 1,33ml/p
254 nm és 280 nm
[96]
Oszlop
Áramlási sebesség Detektálás (λ) Forrás
HPLC eluens
Kivonási módszer
apoatropin, atropin Datura candida és szkopolamin hibrid hairy root (hioszciamin és szkopolamin) Kivonás liofilizálást ---------és porítást követoen 0,2 M kénsav (2 óra), centrifugálás, lúgosítás (1M NaOH, pH 12), kirázás kloroformba, bepárlás, oldás a HPLC eluensben
Vizsgált objektum (vegyület)
[98]
210 nm
1,2ml/p
76
Spherisorb C6 5µm 16,5cm x 4,6mm bidesztillált víz 15% acetonitril Ultrasphere C8 25cm x 4,6mm
Porított, szárított, zsírtalanított minta+ metanol, Soxhlet készülékben 18 órán át, bepárlás néhány ml-re, szurés, kiegészítés metanollal 10ml-re, szilrárd fázisú eztrakció után bepárlás, 1ml metanolban felvenni
[21]
200 nm
0,8ml/p
sejt-
µBondapak C18 30cm x 3,9mm
[90]
229 nm
1,0ml/p
[99]
210 nm
------------------
I. 1/15M Na-foszfát oldat (pH 3,5-re beállítva H3PO4 -val)+ metanol (48:52 v/v) II. I.+1,75mM SDS III. I.+175mM SDS
ODS 120A 5µm 25cm x 4mm
Szárított, porított drog+ 25ml I.-es mobilfázis, 30 p reflux, centrifugálás, dekantálás, maradékot mosni 2x10ml mobilfázissal, egyesítés, kiegészítés 50ml-re a HPLC mérést megelozoen
és Duboisia és Scopolia fajok (hioszciamin)
Liofilizált minta+etanolNH3(28%)(19:1 v/v) óra Soxhlet készülékben, bepárlás, oldás 0,1M HCl-ban, lúgositás NaOH-al, pH 9,8-ra, átrázás kloroformba, bepárlás, oldás 0,5% TFA-ban, tisztítás szilárd fázisú extrakcióval, bepárlás, oldás a HPLC eluensban
és bidesztillált víz - vizes 0,2%-os metanol foszforsav (pH (64:36 v/v) + foszfát 7,25 trimetilpuffer + 0,01M aminnal) és dibutilamin 15%-os metanol (60:40 v/v)
Kivonás 0,2M H2 SO4 val (ultrahang), 1,5-2 óra után szurés, lúgosítás (pH 12-re) 1M NaOH-al, 10ml kloroformmal 30percig állni hagyni, centrifugálni, kloroformos rész bepárlása, HPLC eluensben felvenni
Datura innoxia hairy Datura stramonium Datura fajok root (hioszciamin és növény (atropin és szövetkultúrái szkopolamin) szkopolamin) (szkopolamin)
III/A. táblázat Néhány, a tropánvázas alkaloidok kimutatására és meghatározására alkalmazott nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszer fobb jellemzoje.
0,8ml/p
254 nm
MeCN és 10mM Na dodecilszulfonat (pH 3,3) (2:3 v/v)
1,1ml/p
215 nm
[75]
HPLC eluens
Áramlási sebesség
Detektálás (λ)
Forrás
[100]
bidesztillált acetonitril (65:35 v/v) 0,5% trietilaminnal
víz
[101]
[74]
77
204 nm
0,8ml/p
12,5% -os vizes acetonitril és 0,3% (v/v) foszforsav (pH 2,2-re trietilaminnal)
Novapack C18 4µm 15cm x 4mm
229 nm
1,0ml/p
és 45% -os metanol és 0,1% (v/v) foszforsav (pH 7-re beállítva trimetilaminnal)
Hypersil ODS (C18) 10µm 25cm x 4mm
[102]
210 nm
1,0ml/p
acetonitril+metanol+ 0,05M ammóniumacetát (20,9:27,9:51,2 v/v/v)
30ml n-hexánnal 2 óra, 25ml cc. NH4 OH, 30 p keverés, 15ml diklórmetán hozzáadása után 10 p keverés, fázisok elválasztása és a szerves fázis kirázása 15ml desztillált vízzel, centrifugálás, vizes fázisok egyesítése, kirázás 15ml diklórmetánnal, centrifugálás, bepárlás, oldás 3ml metanolban, belso standard hozzáadása, tisztítás szilárd fázisú eztrakcióval, bepárlás, oldás 1ml MeOH-ban, HPLC mérés Spherisorb ODS-2 (C18) 10µm 25cm x 4,6mm
ODS 120A RP C18 + RP CN 25cm x C18 5µm 4,6mm 15cm x 3,9mm
Többféle extrakciós módszer összehasonlítása, nincs számottevo eltérés
Oszlop
(szkopolamin) Drogpor+10ml metanol, 30 p reflux, szurés, 10ml-re kiegészítés a HPLC mérés elott
Liofilizált minta+5ml cc. metanolcc. NH4 OH (20:1 v/v), további tisztítás
Kivonási módszer
szkopolamin) Szárított, porított drog+ 10ml diklórmetánmetanol-NH4 OH (70:25:5 v/v/v) 2 órán át, szurés, extrakció 100ml 0,5M H2SO4 val, lúgosítás (NH 4 OH), extrakció diklórme tánnal, bepárlás, oldás 10ml metanolban, szurés, HPLC mérés
Duboisia és Hyoscyamus muticus Hyoscyamus, Datura stramonium Élelmiszerek és biológiai minták Scopolia fajok és H. niger növény Brugmansia és levél (hioszciamin, (hioszciamin és szkopolamin) (hioszciamin és (atropin és Duboisia fajok szkopolamin, szkopolamin ) tropasav)
Vizsgált objektum (vegyület)
[103]
254 nm
2,0ml/p
0,2%-os foszforsav (pH 7,3-ra beállítva dimetil propilaminnal) + metanol (60:40 v/v)
µBondapak C18 10µm 25cm x 4,6mm
extrakció, szurés, 0,7M Nakarbonáttal lugosítás, extrakció 3x5ml metilén-kloriddal, bepárlás, metanolos oldás, tisztítás sziláed fázisú extrakcióval, oldás a mobilfázisban, szurés, HPLC meghatározás
(95:5 v/v) 20ml szobahomérsékleten, szurés, bepárlás, 2x10ml 1N HCl -val
Kivonás EtOH+28% NH4 OH
Datura ferox növény (hioszciamin, szkopolamin és aposzkopolamin)
III/B. táblázat Néhány, a tropánvázas alkaloidok kimutatására és meghatározására alkalmazott nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszer fobb jellemzoje.
1ml/p 210nm [105]
bidesztillált víz és 15% acetonitril
1,2ml/p
210 nm
[104]
HPLC elue ns
Áramlási sebesség Detektálás (λ) Forrás
CH3 CN + acetát puffer (0,06M ammónium-acetát + 0,03 M ecetsav, pH 4) (95:5 v/v)
Nucleosil 100 -5 CN 25cm x 4mm
Spherisorb C6 5µm 12,5cm x 4,6mm
Oszlop
Kivonási módszer
Datura candida x D. aurea hibrid hairy root (hioszciamin és szkopolamin) Kivonás diklór-metán metanol - 25% NH4 OH eleggyel, bepárlás, oldás 5ml diklórmetán - 2ml 5% ammónia elegyben, bepárlás 2ml-re, minta felvitele Extrelut oszlopra, lemosás 25ml diklórmetánnal, bepárlás, oldás 1ml CH3 CN-ban.
Datura innoxia és Hyoscyamus x györffy hairy root (hioszciamin és szkopolamin) Háromféle kivonási módszer összehasonlítása
Vizsgált objektum (vegyület)
----------------
[71]
215nm
78
1,0-1,5 ml/p
[106]
----------------
----------------
[107]
204nm
----------------
acetonitril + bidesztillált víz (90:10 v/v) trietilaminnal pH 3,1-re beállítva
fordított fázisú C18-as oszlop 25cm x 4,6mm
Liofilizálás és porítás után kivonás kloroform - metanol - 28% NH4OH eleggyel (50:50:1,4 v/v/v), bepárlás, oldás 0,1M sósavban, lúgosítás 3ml 28% kirázás NH4 OH-ban, kloroformmal, bepárlás (táptalaj esetén 3ml 28% NH4 OH hozzáadásától hasonlóan), oldás a HPLC eluensben
root Datura innoxia hairy root és és tápközeg (hioszciamin)
Kivonás Soxhlet készülékben metanollal, bepárlás, oldás 200 mM-os NH 4 Cl oldatban (pH 9,8), tisztítás Extrelut oszlopon (4,5g, lemosás telített ammóniával kloroformmal), bepárlás, oldás a HPLC mobil fázisban
hairy
22% acetonitril + 78% puffer 17% acetonitril (v/v) 50mM (50 mM kálium-foszfát pH 3- os ra beállítva KH2 PO4 oldatban (pH 3,0) ortofoszforsavval)
Hypersil ODS 25cm x 4,6mm
Táptalaj kivonása: kirázás kloroformba (lúgosítás nélkül), bepárlás, oldás a HPLC eluensben.
Atropa baetica hairy root és Datura metel tápközeg (atropin és (hioszciamin szkopolamin) szkopolamin)
III/C. táblázat Néhány, a tropánvázas alkaloidok kimutatására és meghatározására alkalmazott nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszer fobb jellemzoje.
3. VIZSGÁLATI ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 3.1. D. innoxia in vitro növények létrehozása tenyésztése A vizsgált in vitro kultúrák eloállításához a Magyar Tudományos Akadémia Vácrátóti Botanikai Kutatóintézetébol származó, szabadföldön nevelt D. innoxia Mill. növények magjait használtuk fel. A D. innoxia magok 5-10 másodpercig történo 70%-os etanolos elokezelését követoen a sterilizálást diocid oldattal (30 mg/100ml etil-higany-klorid és 60 mg/100 ml cetil-piridin-klorid) végeztük, háromszor (2 x 0,5 perc és 1 x 1 perc). A diocid oldatot a magok háromszoros desztillált vizes mosásával távolítottuk el. A magokat sterilizált Petri csészékbe helyeztük, melyekbe elozetesen desztillált vízzel nedvesített szuropapírt helyeztünk és fényen (2500Lux, 12 óra/nap, 24±2°C homérsékleten) csíráztattuk. A sziklevelek, valamint a gyökérkezdemény megjelenését követoen a csíranövényeket 3% szacharóz tartalmú szilárd S táptalajra helyeztük (V. táblázat), és napi 12 órás megvilágítást alkalmazva (2500Lux) 24±2°C homérsékleten neveltük. A kultúrák fenntartását és szaporítását vegetatív mikroszaporítással végeztük. A leválasztott 2-3cm méretu hajtásdarabokat 8-10 hetente helyeztük kettesével friss S tápközegre, ahol azokból gyökerek és hajtások fejlodtek. Az alkaloidtartalom meghatározása céljából a képzodött in vitro növényeket 8 hét után gyujtöttük be (hajtásokat és gyökereket külön), majd fagyasztva-szárítva tároltuk. 3.2. Szövetkultúrák eloállítása és fenntartása 3.2.1. Kallusztenyészetek A D. innoxia in vitro növények hajtásán spontán képzodött kalluszszöveteket izoláltuk és 3% szacharózt, valamint növényi növekedésszabályozó anyagokat is tartalmazó, módosított MS szilárd tápközegen (AMS) tenyésztettük tovább (VII. táblázat) sötétben és fényen (2500Lux, 12 óra/nap). A kultúrákat 4-5 hetente helyeztük friss tápközegre. 3.2.2. Hairy root kultúrák Az S táptalajon tenyésztett 2 hónapos D. innoxia növények szárát Agrobacterium rhizogenes A4 (Rhizobiaceae)
törzzsel
fertoztük
mikroinjektálással.
A
géntranszformációhoz
felhasznált
agrobaktériumokat YMB táptalajon [300] tenyésztettük (VIII. táblázat), és a virulencia fokozása
79
érdekében 3 nappal a növények fertozése elott a baktériumokat frissen készített YMB táptalajra oltottuk át. VII. táblázat Az S, AMS és MS [110] tápközegek összetétele Összetevok Makroelemek
S AMS Koncentráció (mg/l)
NH4NO3 KNO3 CaCl2 x 2 H2O MgSO 4 x 7 H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
MS
Mikroelemek H 3BO3 MnSO 4 x 4 H2O ZnSO 4 x 4 H2O KI Na2 MoO4 x 2 H2 O CuSO 4 x 5 H2O CoCl2 x 6 H2 O FeSO 4 x 7 H2O Na2 -EDTA
6,2 22,3 8,6 0,83 0,25 0,025 0,025 27,85 37,25
Vitaminok Ca-pantotenát 5 inozit 100 nikotinsav 0,5 piridoxin 0,5 tiamin 0,1 Növényi növekedésszabályozó anyagok kinetin -2,4-D -Egyéb kazein-hidrolizátum 100 agar 7 pH=5,7
5
--
1 1
---
100 7
---
Az elso járulékos gyökerek a fertozést követo 8. napon jelentek meg. 14 nappal a fertozést követoen 26 hairy root klónt izoláltunk, melyeket 250 mg/l cefotaxim és 1000 mg/l ampicillin tartalmú szilárd 2% szacharóz tartalmú MS [110] táptalajra (VII. táblázat) helyeztünk baktériummentesítés céljából. A klónok tenyésztését az antibiotikum tartalmú táptalajon (24±2°C homérsékleten, sötétben) addig folytattuk, míg azok baktériummentessé váltak (3-5 átoltás). A baktériummentes hairy root klónokat a továbbiakban antibiotikumot nem tartalmazó 2% szacharóz tartalmú szilárd (7g/l agar) MS táptalajon (VII. táblázat) 24±2°C homérsékleten, sötétben tartottuk
80
fenn. Az izolált klónok közül, növekedésük és alkaloid tartalmuk alapján kiválasztva 3 klónt (410, 411 és 415) használtunk fel további vizsgálatok céljából. VIII. táblázat Az YMB táptalaj összetétele [300]. Összetevok
YMB
K2 HPO4 x 3 H2 O MgSO4 x 7 H 2 O NaCl mannit éleszto kivonat (Difco) agar pH=7,0
0,6550 0,20 0,10 10,0 0,40 20,0
Koncentráció (g/l)
Kísérleteinket klimatizált rázószekrényben, 2% szacharóz tartalmú MS folyékony tápközegben, (40ml tápközeg/100ml-es Erlenmeyer lombik, rázatás B.Braun Biotech International Certomat BS 4 készülékben: 100rpm, 24±1o C) sötétben és fényen (2500Lux, 12 óra/nap) tenyésztett klónokkal végeztük el. A kultúrák átoltását szilárd tápközegre esetén 4 hetente, folyékony tápközeg esetén 3 hetente végeztük. 3.2.3. A géntranszformáció igazolása hairy root kultúrákban 3.2.3.1. D. innoxia in vitro növény és hairy root kultúrák vizsgálata PCR technikával A növényi DNS izolálása Dneasy Plant Mini Kit segítségével történt (Qiagen). A sejtek feltárását dörzsmozsárban végeztük, 0,1g friss növényi mintát (levél és hairy root) folyékony nitrogénben (-196o C) porítottuk el. Az így elokészített mintákat Eppendorf csövekbe helyeztük, hozzájuk adtunk 400µl AP1 puffert (Qiagen), majd 4µl RNáz A-t (Qiagen) (RNS emésztés). A mintákat homogenizáltuk (Vortex), majd 10 percig 65o C-on inkubáltuk (közben 2-3-szor összeráztuk) (DNS kivonás). Ezt követoen a mintákhoz 130µl AP 2 puffert adtunk (Qiagen), összeráztuk, majd 5 percre jégre helyeztük (0±1o C) (fehérjék kicsapása). Az oldatot centrifugáltuk (12000rpm, 2-3 perc) és a felülúszót használtuk fel a továbbiakban. A mintákat felvittük az elokészített QIAshredder oszlopokra (2ml, Qiagen), majd az oldatot 2 percig centrifugáltuk (12000rpm) (fehérjék és sejttörmelék eltávolítása). Az átfolyó oldat 450µl-ét új centrifugacsobe helyezve 675µl AP3/E oldatot adtunk hozzá (Qiagen) a DNS kicsapása céljából. Az oldat 650µl-ét a DNáz mini spin oszlopra (Qiagen) vittük, majd 1 percig centrifugáltuk (10000rpm). A cso alján megjeleno folyadékot elöntöttük. Az elokészített oldat maradék részével a lépést megismételtük. A DNáz mini spin oszlopot ezt követoen
81
Eppendorf csobe helyeztük és hozzáadtunk 500µl AW puffert (Qiagen) (DNS tisztítás) és 1 percig centrifugáltuk (10000rpm). Az alul megjeleno folyadékot elöntöttük. A tisztítási lépést még egyszer megismételtük, de az utóbbi esetben 2 percig centrifugáltuk a mintát. A tisztított DNS leoldása céljából 2 x 100µl 65o C-os AE puffert (Qiagen) mértünk az oszlopra, 2 x 5 percig szobahomérsékleten (24±1o C) inkubáltuk, majd centrifugáltuk (2 x 1 perc, 10000rpm). Az elkülönült folyadék réteg tartalmazta a tisztított DNS-t. Az oldatot 20x –ára (D. innoxia gyökér kivonat) és 15x – ére hígítottuk (hairy root kivonat), majd 8µl-t vittünk fel a gélre. Jelzofestékként Blue/Orange-ot (12µl) alkalmaztunk. Az A. rhizogenes A4 plazmid DNS izolálását a kolónia PCR-hez szükséges módszer segítségével végeztük. 50µl steril desztillált vízben szuszpendáltunk 1 kolónia A. rhizogenes A4 baktériumot. A szuszpenziót vízfürdon forraltuk (100o C, 2-5 perc), majd centrifugá ltuk (12000rpm, 2-3 perc). A felülúszó tartalmazta a plazmid DNS-t. A minták elokészítését steril boxban, jégen végeztük (0±1oC). Az alkalmazott
DNS nélküli
összetevok (Master Mix): 3,3µl steril desztillált víz - 1,0µl 25mM MgCl2 - 1,0µl puffer (REDTaq Reaction Buffer) - primerekbol 1,0-1,0µl (rolB gén 5’ primer: 42,2nmól 422µl steril desztillált vízben, majd 10x –ére hígítva, bázissorrend: ATGGATCCCAAATTGCTATTCCTTCCACGA és 3’ primer: 55,7nmól
557µl
steril
desztillált
vízben,
majd
10x
–ére
híg,
bázissorrend:
TTAGGCTTCTTTCTTCAGGTTTACTGCAGC [301]) - 0,5µl DNS polimeráz (REDTaq DNA Polymerase) és 0,2µl 100mM dezoxi-nukleotid-trifoszfát (dNTP).
A fenti oldathoz (8µl) adtunk 2µl tisztított DNS-t tartalmazó oldatot (összesen 10µl). A markerbol 3,5µl-t alkalmazt unk (Gene Ruler 100bp DNA Ladder Plus). A polimeráz láncreakciót GeneAp PCR System 9700-as készülékben (Perkin Elmer Applied Biosystem) végeztük el (denaturáció 94o C-on 1 percig, kapcsolódás 55o C-on 1 percig, lánchosszabbítás 72oC-on 3 percig, mindhárom lépés 30 cikluson át ismételve). A keletkezo 780bp méretu fragmentumokat agarózgél elektroforézis segítségével választottuk el. Az 1,25%-os agaróz gél összetétele: 0,75g agaróz (Gibco BRL, ultra pure) - 60ml trisz-acetát-etiléndiamin-tetraecetsav (TAE) puffer: 0,04M trisz acetát - 0,001M etiléndiamin-tetraecetsav (EDTA) [242,0g trisz-hidroximetilaminometán - 57,1ml jégecet - 100,0ml 0,5M EDTA (pH=8,0)], továbbá 2,8 µl etídium-bromid festék (UV aktív festék) volt. A kifejlesztés 70V cellafeszültség mellett 30-40 percig történt. A kiértékelést UV fényben (λ=302nm) végeztük.
82
3.2.3.2. A szövetek opin termelésének vizsgálata papír elektroforézissel Az Agrobacterium Ri-plazmidjának meghatározott szakasza, az ún. transzfer DNS (tDNS) a fertozés során stabilan integrálódik a növény genomjába. Ennek egyik következményeként a növényi sejtek a baktériumok számára fontos speciális aminosavakat, ún. opinokat kezdenek termelni, melyek sikeres Agrobacterium fertozést követoen kimutathatóak a sejtekben. Az A. rhizogenes fertozéssel nyert 410, 411, és 415-ös hairy root klónok opin szintézisét Petit módszere alapján mutattuk ki [128]. 0,2 g liofilizált mintát 3 x 20 ml 70 % etanollal forraltunk (3 x 5 perc). A kivonatot rotációs vákuumbepárlón szárazra pároltuk, majd 1 ml desztillált vízben oldottuk. A három mintából ötszörös hígítást követoen 6 µl-t vittünk fel „Filtrat 14” kromatográfiás papírra elektroforézis céljából. Tesztként 5 µl mannopint használtunk (4 mg/ml). Jelzofestékbol (0,1 % metilénzöld) 4 µl-t vittünk fel az elozetesen pufferral (cc. hangyasav - cc. ecetsav - víz (30 : 60 : 910, v/v/v) impregnált papírra. Az elektroforézis készülékben (LaborMIM) történt futtatást követoen (kb. 2 óra) a papírt megszárítottuk és 0,4 % acetonos AgNO 3 oldattal hívtuk elo. Szárítást követoen a papírt 2 % etanolos (90 %) NaOH oldatba helyeztük. Végül szárítás után fixátor oldatba (Kodak X-Al-4, 30 %-os tioszulfát oldat + 3 %-os tioszulfit oldat + 2,3 %-os ecetsav oldat) mártottuk és megszárítottuk. 3.3. A kultúrák növekedési aktivitásának jellemzése 3.3.1. Friss súly meghatározása
A szövetek leoltási és begyujtési friss súlyának (g), meghatározása (g) analitikai mérlegen (Mettler AE 240) történt 4 tizedes jegynyi pontossággal. A leoltási friss súly meghatározásához a tápközeget tartalmazó lombikokat közvetlenül az átoltást megelozoen és azt követoen lemértük. Az értékek különbségébol számítással határoztuk meg a leoltási friss súly értékét. Folyékony tápközegben nevelt hairy root klónok esetén az értékek számításánál figyelembe vettük a szövetek felszínén átvitt tápközeg tartalmat. Ennek meghatározásához a tápközeget papírvattán itattuk fel a szövetdarabok felszínérol, majd meghatároztuk az átlagos tömegveszteséget (20 párhuzamos, átlagos tömegveszteség mindhárom vizsgált klón esetében: 43,54±3%), melyet a számításoknál figyelembe vettünk.
83
A begyujtési friss súly meghatározása szilárd tápközegen nevelt kallusz szövetek esetében a tápközeg darabjainak eltávolítása, folyékony tápközegben nevelt hairy root klónoknál a tápközeg papírvattán történt felitatása után történt. 3.3.2. Szárazsúly meghatározása
A szövetek szárazsúlyának meghatározása (g) a fentiekhez hasonlóan analitikai mérlegen történt 4 tizedes jegynyi pontossággal fagyasztva-szárítást (liofilizálást) követoen, melyet B.Braun Christ Loc-1M Alpha 1-4 készülékben végeztünk. A leoltási szárazsúly számításánál kallusz szövetek esetében a kísérletek elvégzéséhez használt (kiindulási) 4 hetes szövetek szárazanyag tartalmát vettük figyelembe a leoltási friss súly meghatározását követoen. A hairy root kultúráknál a 3 hetes tenyésztek szárazanyag tartalma szolgált alapul. 3.3.3. Szárazanyag tartalom meghatározása
A szárazanyag tartalom számításához a begyujtési friss- és szárazsúly értékeket vettük figyelembe. Az értékeket az aktuális friss súly százalékában adtuk meg (%). 3.3.4. Növekedési érték (NÉ) számítása A szárazsúlyra vonatkoztatott növekedési érték meghatározása a kallusz és hairy root szövetek esetében egyaránt a leoltási és begyujtési szárazsúlyok figyelembevételével történt, az alábbi képlet alapján: B-L NÉ = L
melyben B: a begyujtéskor mért szárazsúly, L: a leoltáskor mért friss súlyból és a megfelelo szárazanyag tartalomból számított szárazsúly. 3.4. A folyékony MS tápközeg pH-jának meghatározása A növényi szövetek begyujtését követoen a tápközeget redos szuropapíron szurtük. A pH meghatározását Radelkis Laboratory Digital pH Meter OP-211/1-es készülékkel végeztük 23±1oC-on 20ml táptalajban, minden egyes tenyészet esetében, három tizedesjegynyi pontossággal. 3.5. Az AMS és MS tápközegek összetételének módosítása
84
3.5.1. Szacharóz tartalom változtatása A folyékony MS tápközegben [110] nevelt D. innoxia hairy root klón (410) esetében vizsgáltuk a tápközeg szacharóz koncentrációjának hatását a tenyészetek növekedésére és tropán alkaloid tartalmára. A szacharózt 0%, 1,0%, 2,0% (az általunk használt MS tápközeg szacharóz koncentrációjának felel meg), 3,0% és 6,0%-ban (m/v) adagoltuk. A sötétben nevelt kultúrákat (100rpm, 24±1oC) 4 hetet követoen gyujtöttük be (párhuzamos minták száma: n=7).
3.5.2. MgSO4 tartalom módosítása A folyékony, 2% szacharózt tartalmazó MS tápközegben [110] nevelt 410-es D. innoxia hairy root klón esetében vizsgáltuk a tápközeg MgSO4 tartalmának hatását a tenyészetek növekedésére és tropán alkaloid tartalmára. A magnéziumsót 0 mg/l, 185 mg/l, 370 mg/l (az MS tápközeg MgSO 4 koncentrációjának felel meg), 740 mg/l és 1480 mg/l koncentrációban adagoltuk. A sötétben és fényen (2500Lux, 12 óra/nap, 100rpm, 24±1o C) nevelt kultúrákat 4 hetet követoen gyujtöttük be (párhuzamos minták száma: n=7). 3.5.3. Dimedon és szamikarbazid alkalmazása A szilárd AMS tápközegen nevelt D. innoxia kallusz kultúrák és folyékony, 2% szacharózt tartalmazó MS tápközegen [110] nevelt 410-es hairy root klón esetében vizsgáltuk a tápközeg dimedon (21. ábra) tartalmának hatását a tenyészetek növekedésére, mérheto endogén HCHO koncentrációjára és tropán alkaloid tartalmára. A kontroll (dimedon mentes táptalaj) mellett a dimedont 7,133 x 10-3 mM/l (1ppm), 7,133 x 10-2 mM/l (10ppm), 0,7133mM/l (100ppm) és 7,133mM/l (1000ppm) koncentrációban adagoltuk. A 410-es hairy root klón esetében vizsgáltuk a tápközeg szemikarbazid (29. ábra) tartalmának hatását is a tenyészetek növekedésére, mérheto endogén HCHO és tropán alkaloid tartalmára. A kontroll (szemikarbazid mentes táptalaj) mellett a szemikarbazidot 1,3321 x 10-2 mM/l (1ppm), 0,13321 mM/l (10ppm), 1,3321 mM/l (100ppm) és 13,221 mM/l (1000ppm) koncentrációban adagoltuk. A tápközegek pH -ját minden esetben pH=5,7 -re állítottuk. A sötétben és fényen nevelt (2500Lux, 12 óra/nap, 24±1o C) nevelt kallusz és hairy root kultúrákat (2500Lux, 12 óra/nap, 100rpm, 24±1o C) 2, 4 és 6 hetet követoen gyujtöttük be (párhuzamos minták száma: n=7).
85
3.5.4. Aminoguanidin és hidralazin alkalmazása A folyékony MS tápközegben [110] nevelt 410-es D. innoxia hairy root klón esetében vizsgáltuk a tápközeg aminoguanidin és hidralazin (1-hidrazino-ftalazin) (29. ábra) koncentrációjának hatását a tenyészetek növekedésére és tropán alkaloid tartalmára. A kontroll (aminoguanidin mentes táptalaj) mellett az aminoguanidint 1,35 x 10-2 mM/l (1ppm), 0,135 mM/l (10ppm), 1,35 mM/l (100ppm) és 13,50 mM/l (1000ppm) koncentrációban adagoltuk. A kontroll (hidralazin mentes táptalaj) mellett a hidralazint 6,245 x 10 -3 mM/l (1ppm), 6,245 x 10-2 mM/l (10ppm), 0,6245 mM/l (100ppm) és 6,245 mM/l (1000ppm) koncentrációban adagoltuk. A tápközegek pH -ját minden esetben pH=5,7 -re állítottuk. A sötétben nevelt kultúrákat (100rpm, 24±1o C) 4 hetet követoen gyujtöttük be (párhuzamos minták száma: n=20). N H2N H2N NH CO NH2 szemikarbazid
N NH
H2 N HN aminoguanidin
NH NH2 hidralazin
29. ábra A szemikarbazid, aminoguanidin és hidralazin szerkezeti képlete
3.6. Tropán alkaloidok kimutatása és meghatározása 3.6.1. Növényi szövetek hisztokémiai vizsgálata Dragendorff-reagens alkalmazásával
Az alkaloidok gyökereken belüli lokalizációjának vizsgálata céljából in vitro D. innoxia növény gyökerét, valamint a 410-es hairy root klónt használtuk fel, melyeket cc. vizes pikrinsav oldat – pufferolt formalin – cc. ecetsav (55,6:37:7,4 v/v/v) elegyben fixáltuk 30 percen át, szobahomérsékleten. A mintákat ezt követoen 70%-os etanolban mostuk a fixáló oldat
teljes
eltávolítása
céljából.
Abszolút
etanolban
végzett
dehidrálás
után
a
szövetdarabokat folyékony paraffinba ágyaztuk. A 8µ-os metszeteket hagyományos rotációs mikrotómmal készítettük. A metszeteket tárgylemezre helyeztük, majd a paraffin eltávolítása céljából xylolban áztattuk (2 x 10 perc). A Dragendorff festést (KBiI4 reagens alkalmazásával) megfelelo elokészítés után - 5 perc 96%-os etanolban, 5 perc 70%-os etanolban, mosás desztillált vízben - végeztük, a metszeteket 2 órán át tartottuk a reagensben [302], majd 0,1n H2 SO 4 –al mostuk és vizes glicerinben fedtük le. Az elkészült metszeteket
86
fénymikroszkóppal vizsgáltuk (Zeiss Axioskop, Germany), a látottakat MC 80 fotó feltét (Zeiss, Germany) segítségével dokumentáltuk. 3.6.2. MALDI-MS módszer
A tropán alkaloidok kimutatását/azonosítását Finnigan LASERMAT 2000 készülékben is elvégeztük. Mátrixként α–ciano-4-hidroxi szinnapinsavat (ACH) alkalmaztunk. A HPLC meghatározáshoz eloállított, tisztított kivonatokat
CH3 OH-al hígítottuk 1:100 arányban,
majd a minták 5µl-ét elegyítettük 5µl ACH tartalmú oldattal (2mg/ml ACH 60%-os CH3OHban) a mintatartó lemezeken. Az autentikus hioszciamin és szkopolamin standard oldatokat (2 x 10-5 M, 5-5 µl) elozetesen CH3 OH-al hígítottuk 1:100 arányban, majd 5µl ACH tartalmú oldattal elegyítettük, szintén a mintatartó lemezen. A készülékbe helyezés elott az oldatokat szobahomérsékleten beszárítottuk. 3.6.3. HPLC módszer - A minták elokészítése és tisztítása A begyujtött szöveteket a friss súly meghatározását követoen mélyhutoben fagyasztottuk le (-14±1o C). A minták fagyasztva szárítását B.Braun Christ Loc-1M Alpha 1-4 liofilizáló készülékben végeztük el. A szárazsúly meghatározását követoen a kivonást 3 x 10ml CHCl3 – CH3 OH – 25% NH 4OH 15:5:1 (v/v/v) eleggyel végeztük B.Braun Labsonic U (power level: 200, duty cycle: 0,5s) ultrahangos sejtfeltáró készülékben. Az egyesített, szurt és szárított (Na2 SO 4 siccum) kivonatokat BÜCHI Rotavapor R-3000-es vákuumbepárló készülékben, 80 o C-on szárítottuk be, majd 1,5ml CHCl3 -ban oldottuk és a minták tisztításáig Eppendorf csövekben, mélyhutoben tároltuk -14±1o C-on, majd szobahomérsékleten beszárítottuk. A minták tisztítása szilárdfázisú extrakcióval történt SUPELCO Supelclean LC-18 SPE (3 ml) oszlopokon, melyeket elozetesen 2 x 2,5 ml metanollal és 2 x 2,5 ml KH 2 PO4 pufferrel (30mM, pH=6,8) aktiváltunk. A beszárított kivonatokat 2 x 1,5ml és 1 x 1,0ml 3% -os metanolban (30mM KH 2PO4 puffer – metanol, 97:3, v/v) oldottuk (ultrahangfürdoben, 3 x 4 perc) és a visszaoldásnak megfelelo részletekben vittünk fel az LC-18 SPE oszlopokra. A mintafelvitelt követoen az oszlopokat 2 x 2,5ml
3%-os metanollal mostuk (30mM KH2 PO4 puffer – metanol, 97:3, v/v). A tropán
alkaloidokat tartalmazó frakciót 2 x 2,5ml 80%-os metanollal (metanol - 30mM KH 2 PO 4 puffer, 80:20, v/v) eluáltuk és a szükséges hígítás után (5x-ös) vizsgáltuk.
87
A HPLC mérés alapján a hioszciamin visszanyerése az SPE oszlopról 98,2±1,3%, a szkopolamin esetében 96,3 ±1,3%, az apoatropinnál pedig 102,5 ±1,8% volt (n = 3). - HPLC meghatározás
A meghatározáshoz Surveyor moduláris HPLC rendszert használtunk (Thermo Finnigan, USA), mely kvaterner gradiens pumpábó l, diódasoros detektorból és a mintaadagolóból állt. Az adatok kiértékelését ChromQuest 4.0 kromatográfiás szoftver (Thermo Finnigan, USA) alkalmazásával, személyi számítógépen végeztük. Az elválasztást LUNA C18 (5 µ m) fordított fázisú oszlopon
(250 x 4,6 mm i.d.) végeztük
(Phenomenex, USA), melyhez azonos töltetu elotétoszlopot (8 x 3 mm i.d.) csatlakoztattunk. Eluensként acetonitril : 30mM foszfát puffer (pH=6.00) : metanol (12 : 80,1 : 7,9 , v/v/v) elegyet alkalmaztunk, az áramlási sebesség 1,00 ml/perc volt. A csúcsok azonosítását autentikus standardok retenciós idejének és a megfelelo UV spektrumok adatainak felhasználásával végeztük (30. ábra). A kvantitatív meghatározás λ=210nm-en történt, az injektált mintamennyiség 5µ l volt. A kalibrációs egyenest 10-200 µg/ml tartományban vettük fel. A kalibrációs egyenesek egyenlete: hiszciamin y=1,10615 *10 -5x–3,405; szkopolamin y=1,59418 *10 -5 x–7,17809; apoatropin y=1,0000 *10 5
x–7,17809.
Az alkaloid tartalom értékeit µg/g, illetve mg/g-ban (száraz súlyra vonatkoztatva) adtuk meg. A kultúrák száraz súlyának és száraz súlyra vonatkoztatott hatóanyag tartalmának szorzataként kiszámítottuk a hatóanyag produkció értékeket hioszciamin, szkopolamin, apoatropin alkaloidokra (mg alkaloid/kultúra).
C
A
88
D
B
30. ábra A tartalmi meghatározáshoz használt tesztkeverék kromatogramja (A), továbbá a hioszciamin (B), szkopolamin (C) és apoatropin (D) UV spektruma. 3.7. Endogén HCHO kimutatása és meghatározása 3.7.1. MALDI-MS módszer
A kimutatás formaldimedon formájában történt. A frissen begyujtött szövetmintákat folyékony nitrogénben fagyasztottuk, porítottuk (0,25g), majd 0,7 ml 0,2 % metanolos dimedon oldatot adtunk hozzájuk (dimedon addukt, formaldimedon kialakulása céljából). Az oldatokat centrifugáltuk (500g, 5 perc, 4o C-on). Az elkészült oldatok felülúszójának 5-5 µl-ét elozetesen CH3 OH-al hígítottuk 1:100 arányban, majd 5µl ACH tartalmú oldattal (2mg/ml ACH 60%-os CH3 OH-ban) elegyítettük a mintatartó lemezen. Ezt követoen az oldatot szobahomérsékleten beszárítottuk. A formaldimedont autentikus standard (5µl, CH3 OH-al 1:100 arányban higított 2%-os dimedonos CH3 OH oldat) alkalmazásával azonosítottuk. 3.7.2. OPLC ELJÁRÁS A D. innoxia kallusz és hairy root kultúráiban határoztuk meg az endogén HCHO tartalmat OPLC technikával, denzitometriás értékeléssel. A frissen begyujtött szövetmintákat 3.7.1.-szerint készítettük elo, majd centrifugálást követoen a felülúszók 30µl-ét impregnált szélu vékonyrétegre (Kieselgel 60 F254 ) vittük. A formaldimedon elválasztása OPLC készülékkel (OPLC-NIT CO., Ltd., Budapest, Hungary) történt. Kifejleszto: kloroform – metilén-klorid (35:65, v/v). A kvalitatív és kvantitatív analízis denzitometriás (Shimadzu CS 930, Kyoto, Japan) értékelés alapján történt (λ = 260nm). A formaldimedont autentikus standard (olvadáspont: 191o C) oldatával és UV spektrum alapján azonosítottuk [303]. A formaldimedon standard elkészítéséhez 20ml 38% -os desztillált vizes HCHO oldatot és dimedon oldatot (5g dimedon
63
30ml C2 H5 OH és 5ml desztillált víz elegyében oldva) elegyítettünk. A keletkezo csapadékot szurtük, majd C2 H5 OH-ban oldottuk. Az oldatot centrifugáltuk (1000g 10percig 20 o C-on), majd a felülúszó megfelelo részleteit (10µl, 12µl, 14µl 16µl, 18µl és 20µl) vittük fel a vékonyrétegre. 3.7.3. HPLC módszer
A meghatározá shoz használt HPLC készülék Gynkotec M 480 pumpából, TOSOH 6040 UV detektorból és Rheodyne 8125 injektorból (20µl loop) állt. Az alkalmazott oszlop Chrompack ChromSpher C-18 (150 x 4,6 mm i.d., 5µm), a mobil fázis pedig CH3 OH : 0,01M HCl 76:24 (v/v) arányú elegye (pH=2.63) volt. A detektálás λ = 260nm-en történt. Az adatok kiértékelését EF 2102 ADDA konverteren keresztül (Elektroflex GM, Szeged), személyi számítógépben végeztük el. 3.8. TUNEL reakció alkalmazása az apoptotikus sejtek kimutatására
A kallusz és hairy root szöveteket a 3.6.1-es alfejezetben leírtaknak megfeleloen fixáltuk és metszettük. A párhuzamos metszeteket Superfrost tárgylemezekre helyeztük a haematoxilineozin (HE) festés és a TUNEL reakció elvégzése céljából. A TUNEL reakciót in situ sejthalál kimutatására szolgáló készlettel (Apop-Tag, Oncor, Gaithersburg, MD, USA) végeztük [298]. A negatív kontroll esetében - amikor a terminális transzferáz helyett desztillált vizet használtunk - a sejtmagok nem festodtek. Az elkészült metszeteket hagyományos fénymikroszkóppal vizsgáltuk (Zeiss Axioskop, Germany), a látottakat MC 80 fotó feltét (Zeiss, Germany) segítségével dokumentáltuk. A vizsgát szövetekben meghatároztuk az apoptotikus sejtmagok arányát (apoptotikus index, Ai), melyet véletlenszeruen kiválasztott 10, legnagyobb nagyítással (400x) vizsgált látómezoben található TUNEL pozitív sejtmagok alapján számítottuk ki. A számítást minden esetben háromszor végeztük el. 3.9. A kísérleti eredmények statisztikai kiértékelése A vizsgálatok során végzett párhuzamos mérések (n=7 és 20) eredményeit átlagoltuk. Az adatok statisztikai kiértékeléséhez kiszámítottuk a szórást és a megbízhatóságot (± SD, p< 0,05), valamint T-próbát végeztünk [304].
74
4. EREDMÉNYEK 4.1. D. innoxia in vitro növények vizsgálata 4.1.1. Az in vitro növények növekedése és alkaloid tartalma A sterilizált D. innoxia magokból kifejlodött csíranövényeket szilárd S táptalajon, fényen tenyésztettük tovább vegetatív mikroszaporítással. Az izolált, 2-3cm –es, levél nélküli hajtásdarabokat helyeztük a tápközegre. A friss tápközegen a hajtások növekedésnek indultak és gyökereket fejlesztettek. Az áttetszo tápközegben kifejlodött gyökerek esetében gyakran klorofill tartalomra utaló zöldes elszínezodés volt megfigyelheto (31. ábra).
A
B
31. ábra D. innoxia in vitro növény hajtása (A) és gyökere (B) S táptalajon, 8 hetet követoen. Külön vizsgáltuk a 8 hetes in vitro növények gyökerének és hajtásának (szár és levél) alkaloid tartalmát. A gyökerek – az intakt növény gyökeréhez hasonlóan - legnagyobb mennyiségben hioszciamint tartalmaztak (30,0µg/g liofilizált szövet), kisebb mennyiségben szkopolamint (10,4µg/g) és apoatropint (7,0µg/g) sikerült kimutatni (32. ábra). A hajtás tropán alkaloid tartalmának vizsgálata
Alkaloid tartalom (ug/g)
során csupán apoatropint sikerült mérheto mennyiségben azonosítani (5,0µg/g) (32. ábra).
50 40 30
gyökér
20
hajtás
10 0 hioszciamin
szkopolamin
apoatropin
32. ábra D. innoxia in vitro növény gyökerének és hajtásának alkaloid tartalma (S táptalajon nevelve, 6 hetet követoen, µg/g liofilizált szövet).
75
4.1.2. D. innoxia in vitro növények gyökereinek szövettani vizsgálata 4.1.2.1. A fiatal gyökerek vizsgálata HE festést követoen A növények fiatal gyökereinek szövettani vizsgálata céljából metszeteket készítettünk a hajtástól elválasztott és megfeleloen fixált, 8. hetes gyökerekbol, melyeket HE festést követoen vizsgáltunk (33. ábra).
A
B
33. ábra 8 hetes, szilárd S tápközegen nevelt D. innoxia in vitro növények gyökereibol készült metszetek, HE festést követoen (A: 200x –os nagyítás; a: rhizodermisz, b: kéregparenchima, e: fanyalá bok, f: háncsnyalábok; B: 400x –os nagyítás; nyilak: apoptotikus folyamatokra utaló sejtmagok). A rhizodermisz alatt a kéregparenchima sejtjeit figyeltük meg. A kéreghatár nehezen felismerheto, a központi hengerben háncs- és fanyalábok különíthetok el. Az edények hálózatos, vermes gödörkés sejtfal vastagodásúak. A legtöbb metszetben jellegzetesen zsugorodott, kompakt, sötétebben festodo sejtmagokat figyeltünk meg, melyek jelenléte apoptotikus folyamatokra utalt (33. ábra).
4.1.2.2. HISZTOKÉMIAI VIZSGÁLATOK DRAGENDORFF REAGENS ALKALMAZÁSÁVAL
A
B
34. ábra 8 hetes, szilárd S tápközegen nevelt in vitro D. innoxia növények gyökereibol készült metszetek, Dragendorff reagenssel történt hisztokémiai reakciót követoen kereszt- (A) és hosszmetszeti (B) képen (100x –os nagyítás)
76
Az alkaloidok szöveteken, sejteken belüli lokalizációjának tanulmányozása céljából hisztokémiai reakciót végeztünk Dragendorff reagens alkalmazásával. A D. innoxia in vitro növények gyökereiben (34. ábra) - a Dragendorff reagens alkalmazását követoen - sikerült kimutatni alkaloidok jelenlétére utaló sárgásbarna, kristályos csapadékot. A csapadékkristályok minden esetben a sejtfal közelében fordultak elo, leggyakrabban a kéregparenchima rhizodermisz és hipodermisz közelében elhelyezkedo sejtjeiben (34/A. ábra), valamint a háncs- és fanyalábok közelében található parenchima sejtekben (34/B. ábra).
4.1.2.3. TUNEL REAKCIÓ ALKALMAZÁSA A HE festést követoen, egyes sejtmagokban észlelt jellegzetes morfológiai változások pontosabb vizsgálata céljából TUNEL reakciót alkalmaztunk az apoptotikus folyamatok kimutatására. A TUNEL reakciót követoen az apoptotikus sejtmagok szelektíven, barna színnel festodtek (35. ábra). Apoptotikus sejtmagokat jellemzoen a rhizodermiszben, a hipodermiszben és a kéregparenchima külso sejtjeiben, valamint a háncs- és fanyalábok sejtjeiben találtunk (35. ábra).
A
B
C
35. ábra 8 hetes, szilárd S tápközegen nevelt D. innoxia in vitro növények gyökereibol készült metszetek, TUNEL reakciót követoen (A: 200x –os nagyítás; B: 400x –os nagyítás, C: 200x –os nagyítás ; a: apoptotikus folyamatokra utaló TUNEL pozitív sejtmagok). 4.2. Kallusz kultúrák A D. innoxia in vitro növény hajtásán képzodött kalluszszöveteket növényi növekedésszabályozó anyagokat (kinetin és 2,4-D) tartalmazó, szilárd tápközegen (AMS) tenyésztettük sötétben és fényen. A sötétben nevelt kultúrák az átoltást követo 2-3. hétig sárgásfehér színuek, majd ezt követoen világos barnák (36/A. ábra), a 7-8. hetet követoen pedig sötétebb barnák voltak a szövetek öregedésével párhuzamosan. A fényen nevelt kultúrák klorofill tartalmuk miatt megzöldültek, színük csak kis mértékben mélyült a tenyésztési ido során, életképességüket pedig – a sötétben nevelt kalluszszövetekkel összehasonlítva – hosszabb ideig megorizték (9-12 hétig) (36/B. ábra).
77
B
A
36. ábra D. innoxia kallusz kultúrák (AMS tápközgen, 5 hetet követoen, A : sötétben és B: fényen tenyésztve). 4.2.1. A tenyészetek növekedése és mérheto endogén HCHO koncentrációja Mind a sötétben, mind pedig a fényen nevelt kalluszszövetek friss súlya növekedett a 6 hetes tenyésztési idoszak alatt. Méréseink azt mutatták, hogy a fényen nevelt szövetek friss súlya minden esetben meghaladta a sötétben nevelt szövetek megfelelo értékeit, a 6. héten azonban már nem észleltünk szignifikáns eltérést (40/A. ábra). A kalluszszövetek mérheto endogén HCHO tartalmát dimedon adduktum (formaldimedon) formájában határoztuk meg, denzitometriás és HPLC módszerekkel (37. és 38. ábrák), a formaldimedon jelenlétét ugyanakkor MALDI-MS technika segítségével is kimutattuk (39. ábra). A korábbi megfigyelésekkel összhangban azt tapasztaltuk, hogy az endogén HCHO koncentráció a fiatal szövetekben magas volt, mely a szövetek öregedésével fokozatosan csökkent a 6. hét végéig (40/B. ábra).
A tenyészeteket ezt követoen kísérleteink során nem vizsgáltuk, az irodalmi
37. ábra D. innoxia kalluszszövetek endogén HCHO tartalmának meghatározásához használt réteglap (6 hetes, sötétben nevelt kultúrákból készült kivonatok, 1 és 7: formaldimedon teszt, 2: 0ppm dimedon – kontroll, 3: 1ppm dimedon, 4: 10ppm dimedon, 5: 100ppm dimedon és 6: 1000ppm dimedon a tápközegben).
78
38. ábra Endogén HCHO tartalom meghatározása HPLC módszerrel D. innoxia kaluszszövetben (standard: formaldimedon tesztoldat, minta: 6 hetes, sötétben nevelt, a tápközegben 1000ppm dimedont tartalmazó D. innoxia kalluszszövetbol készült kivonat).
A
B
39. ábra Endogén HCHO tartalom kimutatása MALDI-MS módszerrel D. innoxia kaluszszövetben (A: formaldimedon tesztoldat, B: 6 hetes, sötétben nevelt, a tápközegben 1000ppm dimedont tartalmazó D. innoxia kalluszszövetbol készült kivonat). adatok azonban azt jelzik, hogy az idosebb szövetek endogén HCHO tartalma ismét megemelkedik [189,305]. Eredményeink ugyanakkor azt mutatták, hogy a fényen nevelt szövetek HCHO koncentrációja minden vizsgált idopontban (2, 4 és 6 hetet követoen egyaránt) szignifikáns mértékben meghaladta a sötétben tenyésztett kalluszokban mért értékeket (40/B. ábra).
79
A szövetek HCHO koncentrációja (ug/g)
Friss súly (g)
24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
sötétben fényen
2
4
6
sötétben fényen
2
Tenyésztési ido (hét)
A
24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 4
6
Tenyésztési ido (hét)
B
40. ábra D. innoxia kalluszszövetek friss súlyának (A) és mérheto endogén HCHO koncentrációjának változása (B) sötétben és fényen, a 6 hetes tenyésztési ido alatt. 4.2.2. Szövettani jellemzés A sötétben és fényen nevelt, 6 hetes kalluszszövetek mikroszkópos vizsgálatát a megfeleloen elokészített (fixált, dehidrált és beágyazott) szövetekbol készült metszetek HE festését követoen végeztük el. A sötétben és fényen tenyésztett szövetek sejtjei nem mutattak morfológiai eltérést, a sejtek parenchimatikusak voltak, szöveti differenciálódás jeleit nem mutatták. Kisebb sejtekbol álló, jól festodo sejtmagokat tartalmazó sejtcsoportokat minden metszetben megfigyeltünk (41/A. ábra). A HE festést követoen néhány esetben – különösen a kultúrák felszínhez közeli sejtjeiben - a sejtmagok jellegzetes zsugorodását figyeltük meg, mely apoptotikus folyamatokra engedett következtetni (41/B. ábra).
B
A
41. ábra D. innoxia kallusz szövetminták HE festést követoen, A: 6 hetes, fényen nevelt szövet (k: kis méretu sejtekbol álló csoport, 100x –os nagyítás), B: 6 hetes, sötétben nevelt szövet (a: apoptotikus folyamatokra utaló, zsugorodott sejtmagok, 200x –os nagyítás).
80
4.2.3. Abiogén stressz hatása a kultúrák növekedésére A dimedont sikeresen alkalmazták – többek között – D. innoxia kalluszszövetekben az endogén HCHO kimutatására és meghatározására a molekula és a HCHO között lezajló irreverzibilis reakciót felhasználva [189]. A dimedon in vivo sejtekre, szövetekre gyakorolt, endogén HCHO elvonáson alapuló hatásának tanulmányozása céljából a vegyüle tet növekvo koncentrációban alkalmaztuk D. innoxia kalluszszövetek tápközegében. A szilárd AMS tápközegbe adagolt dimedon (0ppm – kontroll, 1ppm, 10ppm, 100ppm és 1000ppm) jellegzetes hatással volt a szövetek növekedésére sötétben (42. és 44/A. ábrák ) és fényen (43. és 44/B: ábrák) egyaránt. Alacsonyabb dimedon koncentrációk elosegítették a szövetek növekedését, így 1ppm és 100ppm dimedon tartalom mellett a friss súly értékei (4 hét elteltével sötétben: 17,19g és 17,75g, fényen: 15,62g és 16,34g) elérték, ill. kis mértékben meghaladták a kontroll szöveteknél mért értékeket (sötétben: 15,36g, fényen: 17,07g) (40/A. és 44. ábrák), míg 10ppm dimedon adagolása mellett 4 hét után jelentosen megnott a szövetek friss súlya (sötétben: 19,55g, fényen: 18,76g) (44. ábra). A legmagasabb alkalmazott dimedon koncentráció (1000ppm) jelentos növekedésgátlást okozott
sötétben
és
fényen
egyaránt,
csupán a
6
hetes, sötétben
nevelt
A
B
C
42. ábra D.innoxia kallusz kultúrák 2 (A), 4 (B) és 6 (C) hét nevelés után sötétben, szilárd AMS tápközegen (balról jobbra: 0ppm, 1ppm, 10ppm, 100ppm és 1000ppm dimedon a tápközegben).
81
A
B
C
22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
Friss súly fényenen (g)
Friss súly sötétben (g)
43. ábra D.innoxia kallusz kultúrák 2 (A), 4 (B) és 6 (C) hét nevelés után fényen, szilárd AMS tápközegen (balról jobbra: 0ppm, 1ppm, 10ppm, 100ppm és 1000ppm dimedon a tápközegben).
2 hetes 4 hetes 6 hetes
1
10
100 1000
2 hetes 4 hetes 6 hetes
1
Tápközeg dimedon tartalma (ppm)
A
22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 10
100 1000
Tápközeg dimedon tartalma (ppm)
B
44. ábra D. innoxia kalluszszövetek friss súlyának változása sötétben (A) és fényen (B) 2, 4 és 6 hetet követoen. kalluszkultúrák friss súlya (14,70g) közelítette meg a kontroll értéket (16,12g) (40/A. és 44/A. ábrák). Az 1000pm dimedont tartalmazó táptalajon nevelt szövetek ugyanakkor hamar megbarnultak és az idos szövetekre jellemzo megjelenést mutattak (42. és 43. ábrák). A sötétben és fényen nevelt szövetek szárazanyag tartalma – hasonlóan a mért friss súlyokhoz – nem tért el jelentosen egymástól. Általában elmondható, hogy a sötétben nevelt szövetek szárazanyag tartalma, minden alkalmazott dimedon koncentráció mellett kissé magasabb volt (45. ábra). A 4.
82
hétre – a szövetek fejlodésével párhuzamosan – jelentosebben visszaesett a szárazanyag tartalom. 1000ppm dimedon alkalmazását követoen mindhárom vizsgálati idopontban magas (más kezelésekkel összehasonlítva sötétben közel 25%-al, fényen közel 70%-al magasabb) szárazanyag tartalom értékeket kaptunk (45. ábra). Ezzel szemben 6 hete t követoen, sötétben alacsony értéket mértünk
7
7 Szárazanyag tartalom fényen (%)
Szárazanyag tartalom sötétben (%)
(45/A. ábra).
6 5 2 hetes
4
4 hetes 3
6 hetes
2 1 0
6 5 2 hetes
4
4 hetes 3
6 hetes
2 1 0
0
1
10
100
1000
0
Tápközeg dimedon tartalma (ppm)
1
10
100
1000
Tápközeg dimedon tartalma (ppm)
A
B
18
18
16
16
14
14
Növekedési érték fényen
Növekedési érték sötétben
45. ábra D. innoxia kalluszszövetek szárazanyag tartalmának változása sötétben (A) és fényen (B) 2, 4 és 6 hetet köve toen.
12 2 hetes
10
4 hetes 8
6 hetes
6 4 2
2 hetes
10
4 hetes 8
6 hetes
6 4 2
0
0 0
1
10
100
1000
0
Tápközeg dimedon tartalma (ppm)
A
12
1
10
100
1000
Tápközeg dimedon tartalma (ppm)
B
46. ábra D. innoxia kalluszszövetek növekedési értékének változása sötétben (A) és fényen (B) 2, 4 és 6 hetet követoen. A legmagasabb növekedési értékeket 10ppm dimedon a lkalmazása mellet kaptuk (pl. 6 hetet követoen sötétben: 9,50; fényen: 14,67), a fényen nevelt szövetek értékei pedig jelentosen meghaladták a sötétben tenyésztett szövetek esetében számolt értékeket (46. ábra). A legmagasabb dimedon tartalom hatására (1000ppm) a szövetek növekedése jelentosen lelassult, a legtöbb esetben a kontroll szövetek növekedése alatt maradt. A 6. hétre a növekedési értékek közötti különbségek ugyanakkor csökkentek (46. ábra). Az 1000ppm dimedont tartalmazó táptalajon,
83
sötétben nevelt kalluszok esetében pl. a növekedési érték (7,60), a friss súly változásánál észlelteknek megfeleloen megközelítette a kontroll értékét (8,84) (46/A. ábra). 4.2.4. Abiogén stressz hatása a kultúrák mérheto HCHO tartalmára A szövetek endogén HCHO tartalmát – hasonlóan a kontroll tenyészetekhez – denzitometriás és HPLC módszerekkel határoztuk meg. A tápközegbe adott dimedon – a szövetek növekedése mellett – jellegzetes módon befolyásolta a kalluszszövetek mérheto endogén HCHO tartalmát sötétben és fényen egyaránt. A kontroll (dimedon mentes táptalajon nevelt) tenyészetekhez hasonlóan a szövetek endogén HCHO koncentrációja jelentosen csökkent a 6. hét végéig (47. ábra). A különbözo dimedon tartalmú táptalajokon nevelt kalluszszövetek esetében is azt tapasztaltuk, hogy a fényen nevelt szövetek mérheto HCHO tartalma meghaladta a sötétben nevelt mért értékeket (47. ábra). A tápközegbe adott 1ppm dimedon hatására – a kontroll tenyészetekhez képest - kis mértékben csökkent az endogén HCHO koncentráció (40/B. és 47. ábrák). 10ppm és 100ppm dimedon hatására kissé tovább csökkentek, vagy nem változtak szignifikánsan az értékek. 1000ppm dimedon hatására azonban a 4. és 6. hétre megemelkedett a HCHO koncentráció, mely nem csupán elérte, hanem pl. a 4. héten sötétben és fényen is (17,0µg/g; illetve 27,0µg/g liofilizált szövet) meghaladta a kontroll
30 27 24 21 18 15 12 9 6 3 0
A szövetek HCHO koncentrációja fényen (ug/g)
A szövetek HCHO koncentrációja sötétben (ug/g)
szövetekben mért értékeket (15,0µg/g; illetve 18,0µg/g liofilizált szövet) (40/B. és 47. ábrák ).
2 hetes 4 hetes 6 hetes
1
10
100
1000
2 hetes 4 hetes 6 hetes
1
10
100
1000
Tápközeg dimedon tartalma (ppm)
Tápközeg dimedon tartalma (ppm)
A
30 27 24 21 18 15 12 9 6 3 0
B
47. ábra D. innoxia kalluszszövetek mérheto endogén HCHO koncentrációjának változása a tápközeg dimedon tartalmának függvényében sötétben (A) és fényen (B), 2,4 és 6 hetet követoen. 4.2.5. A kalluszsejtek apoptotikus folyamatainak vizsgálata A korábban, HE festést követoen észlelt, jellegzetesen zsugorodott sejtmagok (41/B. ábra) a TUNEL reakció elvégzését követoen szelektíven festodtek (48/B. és D. ábrák), mely alátámasztotta az apoptotikus folyamatok jelenlétét ezekben a sejtekben. (Meg kell jegyezni azonban, hogy néhány esetben olyan sejtek is TUNEL pozitív reakciót adtak, melyekben a HE festést követoen nem lehetett
84
kimutatni az apoptózisra jellemzo morfológiai változásokat, pl. a sejtmag és citoplazma zsugorodását.) Az apoptotikus sejtek megoszlása nem volt egyenletes a szöveteken belül. A TUNEL pozitív sejtmagok esetében azt észleltük, hogy számuk a tenyészet felszínéhez közeli 10-20 sejtrétegben magasabb volt (a sejteknek akár 30%-a), míg arányuk a mélyebben található sejtrétegek felé haladva gyorsan csökkent. A tápközegbe adagolt dimedon - hasonlóan a kultúrák növekedéséhez – jellegzetes hatást gyakorolt az apoptotikus sejtek számára. Az A i értéke nott az alkalmazott dimedon mennyiségével párhuzamosan, de 1000ppm dimedon tartalom mellett csaknem teljesen megszunt a DNS fragmentálódás, az Ai értéke pedig jelentosen csökkent, különösen a fényen nevelt szövetek esetében (48/F. és 49. ábra). Megfigyeltük továbbá, hogy a fényen nevelt szövetekben – 10ppm dimedon tartalom kivételével minden alkalmazott dimedon koncentráció mellett – jelentosen kevesebb apoptotikus sejtmag volt kimutatható (49. ábra).
Apoptotikus index (Ai
45 40 35 30 25
sötétben
20 15
fényen
10 5 0 0
10
100
1000
Tápközeg dimedon tartalma (ppm)
49. ábra D. innoxia kalluszszövetek apoptotikus indexének (Ai) változása (sötétben és fényen, 6 hét tenyésztési ido után) a tápközeg dimedon tartalmának függvényében. 4.3. Hairy root tenyészetek A D. innoxia in vitro növények szárának A. rhizogenes A4 törzzsel történt mikroinjektálása után megjeleno járulékos gyökereket (50. és 51. ábrák) izolálás és baktériummentesítés után szilárd (52. ábra), majd folyékony (53. ábra), 2% szacharózt tartalmazó MS táptalajon tenyésztettük.
85
50. ábra D. innoxia hajtás hairy root-okkal 12 nappal az A. rhizogenes A4 törzzsel történt fertozés után.
A
B
51. ábra D. innoxia # 410 hairy root klón 4 hét nevelés után, szilárd MS tápközegen (A: 100x és B: 200x nagyítás).
A
B
C
52. ábra D. innoxia # 410 (A), # 411 (B) és # 415 (C) hairy root klónok 4 hét nevelés után, szilárd MS tápközegen.
86
A
B
C
53. ábra D. innoxia # 410 (A), # 411 (B) és # 415 (C) hairy root klónok 4 hét nevelés után sötétben, folyékony MS tápközegben. Az eloállított, genetikailag eltéro hairy root klónok szelekcióját követoen részletesebb vizsgálatainkhoz – növekedésük és tropán alkaloid tartalmuk alapján – két hioszciamin foalkaloidos (# 410 és # 415), valamint egy szkopolamin foalkaloidos klónt (# 411) használtunk fel (52. és 53. ábrák). 4.3.1. A géntranszformáció igazolá sa A kísérleteink során felhasznált géntranszformált gyökérkultúrák (hairy root klónok) genetikai vizsgálatára több módszert alkalmaztunk. A bakteriális, A. rhizogenes A4 törzsbol származó DNS állomány (rolB gén meghatározott szakasza) kimutatására PCR te chnikát alkalmaztunk, míg a transzgén expressziójának, muködésének bizonyítása céljából az opinok jelenlétét mutattuk ki a transzformált növényi szövetekben. Az A. rhizogenes fertozést követoen kialakuló járulékos gyökerek, valamint a belolük létrehozott hairy root kultúrák az Agrobacterium-okra jellemzo speciális anyagcsretermékeket (opinokat) termelnek. A nem transzformált növényi sejtek nem tartalmaznak opinok szintéziséért felelos géneket, így nem képesek eloállítani ezeket, az Agrobacteriumok anyagcseréje szempontjából fontos vegyületeket. Mivel a fertozés során az A. rhizogenes Ri plazmidjának meghatározott szakasza (t-DNS) – mely pl a rolB gént és az opinok szintéziséért felelos géneket is tartalmazza – bejut a növényi sejtbe és stabilan integrálódik a sejtmag DNS-ébe, a különbözo opinok növényi sejtekbol, szövetekbol történo kimutatása igazolja a sikeres géntranszformációt. 4.3.1.1. Polimeráz láncreakció Az A. rhizogenes t-DNS –ben található rolB transzgén meghatározott szakaszának hairy root genomban való jelenlétét PCR technika segítségével igazoltuk a kísérleteink során legtöbbször felhasznált # 410 hairy root klón esetében. A DNS izolálás ellenorzése céljából külön vizsgáltuk a PCR kivitelezésekor negatív kontrollként alkalmazott (nem transzformált) D. innoxia in vitro növény
87
gyökerét, továbbá a # 410 hairy root klón sejtjeit. Az izolált DNS mindkét kivonat esetében jól meghatározott foltokat adott az agarózgélen (54/A. ábra, világos sávok). A PCR elvégzését követoen a D. innoxia in vitro növény gyökerének sejtjeibol izolált DNS (negatív kontroll) nem tartalmazott a rolB gén jelenlétére utaló szekvenciát (54/B. ábra 1 és 2). Az A. rhizogenes A4 törzsbol izolált plazmid DNS (pozitív kontroll) ugyanakkor a marker által jelzett helyen (700bp-800bp) (54/B . ábra 5) a rolB génnek megfelelo, 780bp méretu szekvenciát tartalmazott (54/B. ábra 6 és 7). A kontroll eredmények alapján igazoltuk, hogy a # 410 hairy root klón szöveteinek sejtjeiben szintén jelen volt a rolB génre jellemzo DNS szakasz (54/B. ábra 3 és 4).
B
A
54. ábra A: D. innoxia in vitro növény levelének (1 és 2) és az A. rhizogenes A4-es törzs alkalmazásával eloállított hairy root klón (# 410) (3 és 4) DNS kivonata agarózgél elektroforézist követoen, B: polimeráz láncreakció (PCR) eredménye (1 és 2: D. innoxia in virto növény levele negatív kontroll, 3 és 4: D. innoxia # 410 hairy root klón, 5: marker, 6 és 7: A. rhizogenes A4 törzs plazmid DNS - pozitív kontroll). 4.3.1.2. Opinok kimutatása A kísérleteink során vizsgált D. innoxia hairy root klónok (# 410, # 411 és #415) opin termelését papír elektroforézis segítségével igazoltuk (55. ábra). A tesztvegyületként használt mannopint - vagy a vele azonos Rf értéken megjeleno mannopinsavat - a vizsgált hairy root klónok közül kettoben (# 410 és # 411) sikerült kisebb mennyiségben kimutatni (Rf = 0,46). Viszonylag nagyobb mennyiségben tartalmaztak a kultúrák két másik opin komponenst, melyeket az irodalomban közölt Rf értékek alapján agropinként (Rf = 0,56) és agropinsavként (Rf = 0,25) azonosítottunk [128, 306 ]. Agropint és agropinsavat a # 410 és # 411 klónok egyaránt tartalmaztak, a # 415 klón szöveteiben azonban kiemelten csak agropinsavat sikerült kimutatnunk (55. ábra). Az irodalmi adatoknak megfeleloen az említett opin molekulák (agropin, agropinsav, mannopin és mannopinsav) mindegyikének jelenléte jellemzo az A. rhizogenes A4 törzs alkalmazásával eloállított hairy root szövetekre, a viszonylag
88
nagyobb agropinsav tartalomért pedig a tenyésztési ido és az opinok izolálása egyaránt felelossé teheto [128].
1
2
3
4
5
front
_________________agropin _________________mannopin (mannopinsav) _________________agropinsav start
89
55. ábra Opinok kimutatása D. innoxia hairy root klón esetében haladta meg az 1. héten kapott klónokban papír elektroforézist követoen (1 és 5: értéket (57/A. ábra). mannopin teszt, 2: # 410, 3: # 411 és 4: # 415 klónokból készült kivonatok). Friss súly (g) sötétben
8
4.3.2. A hairy root klónok növekedési jellemzoinek vizsgálata sötétben és fényen Részletesen vizsgáltuk három, folyékony MS tápközegen nevelt D. innoxia hairy root klón (# 410, #411 és # 415) növekedési jellemzoit (friss-
7 6 5
410
4
411 415
3 2 1 0 0
1
és szárazsúly, szárazanyag tartalom, növekedési
2
3
4
5
6
7
Tenyésztési ido (hét)
érték) és a tápközegek pH-jának változását a 6 hetes tenyésztési idoszak alatt. Friss súly (g) fényen
8
A vizsgált klónok friss súlya – az átoltást követo kisebb csökkenéstol eltekintve – folyamatosan emelkedett az 5. hétig sötétben és fényen egyaránt. A 6. hétre a friss súly értéke változatlan maradt, illetve kis mértékben csökkent (56. ábra). A
7 6 5
410
4
411 415
3 2 1 0 0
fényen tenyésztett klónok friss súlya jelentosen,
1
2
3
4
5
6
7
Tenyésztési ido (hét)
1,7-2,3-szorosan meghaladta a sötétben tenyésztett szövetekét mindhárom klón esetében (56. ábra).
A B
56. ábra D. innoxia hairy root klónok (# 410, # 411 és # 415) friss súlyának változása sötétben (A) és tért el jelentosen egymástól. Míg sötétben a # 410 fényen (B) a 6 hetes tenyésztési idoszak alatt. és #415 klónok friss súlya közel megegyezett, A fényen nevelt kultúrákat tanulmányozva fényen egyértelmuen a # 410 klón friss súlya volt megállapítottuk, hogy a szárazanyag tartalom – magasabb (56. ábra). ellentétben a sötétben nevelt szöveteknél A szövetek szárazanyag tartalma jellemzo tapasztaltakkal – tovább csökkent az 5. hétig, majd módon változott (nott, majd csökkent) a változatlan szinten maradt a 6. hét végéig (57/B. tenyésztési ido alatt, ugyanakkor a 4. hétig nem ábra). mutatott jelentos eltérést a sötétben és fényen A szövetek számított növekedési értéke nevelt kultúrák között (57. ábra). Az átoltást folyamatosan nott a vizsgált idoszakban (58. követoen minden klón esetében gyorsan nott a ábra). Az egyes klónok növekedési értékei szárazanyag tartalom, majd – feltehetoen a sejtek ugyanakkor nem tértek el jelentosen egymástól térfogatának növekedésével párhuzamosan – sem sötétben, sem pedig fényen. A három vizsgált fokozatosan csökkent. A 4. hetet követoen a klón növekedési értékét összehasonlítva a # 411 sötétben nevelt szövetek szárazanyag tartalma kis mértékben ismét megemelkedett, de csupán a # 410 klón növekedése volt viszonylag kisebb, sötétben Az egyes klónok friss súlyának gyarapodása nem
és fényen közel megegyezo (58. ábra). A # 410 és
90
Növekedési érték sötétben
#415 klónok növekedési értéke nem tért el szignifikánsan a 6. hétre, és az érté kek – hasonlóan a #411 klónhoz – csaknem megegyeztek a sötétben és fényen nevelt kultúrák között (58. ábra). A kapott eredmények alapján elmondható tehát, hogy a három vizsgált hairy root klón növekedési jellemzoi nem térnek el szignifikánsan sötétben és
5
4
3
410 411
2
415
1
0 0
1
fényen.
2
3
4
5
6
7
Tenyésztési ido (hét)
5
Növekedési érték fényen
Szárazanyag tartalom (%) sötétben
10 9 8 410
7
411 6
415
5 4 3 0
1
2
3
4
5
6
4
3
410 411 415
2
1
0
7
0
Tenyésztési ido (hét)
2
3
4
5
6
7
Tennyésztési ido (hét)
A
10
Szárazanyag tartalom (%) fényen
1
B
58. ábra D. innoxia hairy root klónok (# 410, # 411 és #415) növekedési értékeinek változása sötétben (A) és fényen (B ) a 6 hetes tenyésztési idoszak alatt.
9 8 410
7
411 6
415
5
A folyékony MS tápközegek pH-ját – hasonlóan
4
a növekedési jellemzokhöz – hetente határoztuk
3 0
1
2
3
4
5
6
7
meg. Az átoltást követoen, a 2. hétig gyorsan
Tenyésztési ido (hét)
csökkent a tápközegek pH értéke pH 5,7-rol pH
A B
4,5 körüli értékre (59. ábra). A 2. hetet követoen, 57. ábra D. innoxia hairy root klónok (# 410, # 411 a kultúrák öregedésével és feltehetoen a és #415) szárazanyag tartalmának változása kiválasztott tropán alkaloidok sötétben (A) és fényen (B) a 6 hetes tenyésztési tápközegbe idoszak alatt. mennyiségének emelkedésével párhuzamosan, egészen az 5-6. hét végéig nott a tápközegek pH értéke (59. ábra). A sötétben nevelt kultúrákat tanulmányozva megállapítottuk, hogy a 6. hét végére a tápközegek pH értéke csaknem elérte, vagy kis mértékben meghaladta a kezdeti pH 5,7es értéket (pH 5,47-5,80) (59/A. ábra). A fényen tenyésztett szövetek esetében nagyobb mértékben
91
nottek a tápközeg pH értékei a tenyésztési ido az átoltást követoen nott, majd fokozatosan végére (pH 5,7-rol pH 6,35-6,53-ra) (59/B. ábra).
csökkent. A sötétben és fényen nevelt klónok
A három klón esetében mért értékek – kevés szárazanyag tartalmának változása ugyanakkor kivételtol eltekintve – nem mutattak szignifikáns
eltérést mutatott az átoltást követo 5-6. hétre. Míg
eltérést (59. ábra).
fényen a tenyésztési ido végén kis szárazanyag tartalom értékeket kaptunk, sötétben egyértelmuen
Tápközeg pH sötétben
7
az értékek növekedését mértük mindhárom klón
6.5
esetében (57. ábra), mely alátámasztja azon
6 410 5.5
megfigyelésünket, hogy a sötétben nevelt kultúrák
411 415
5
rövidebb ideig orzik meg életképességüket. A
4.5
klónok növekedési értékei egyenletes növekedést mutattak, egészen a 6. hét végéig, jelentos eltérést
4 0
1
2
3
4
5
6
7
nem észleltünk a sötétben és fényen nevelt
Tenyésztési ido (hét)
Tápközeg pH fényen
szövetek között (58. ábra). A tápközeg pH 7
értékek alakulása megfelet az irodalmi adatoknak
6.5
[71], kezdeti csökkenés után növekvo értékeket
6
mértünk. A fényen nevelt klónok tápközegének
410 5.5
411
pH-ja – a sötétben nevelt szövetekkel ellentétben –
415 5
a 2. hét után gyorsan elérte, majd meghaladta a
4.5
kiindulási pH 5,7 értéket. A 4-6. héten, fényen
4 0
1
2
3
4
5
6
7
szignifikánsan magasabb pH-kat mértünk (59.
Tenyésztési ido (hét)
ábra). A B
59. ábra D. innoxia hairy root klónok (# 410, # 411 4.3.3. A klónok tropán alkaloid tartalma és és # 415) tápközeg pH értékeinek változása alkaloid produkciója sötétben (A) és fényen (B) a 6 hetes tenyésztési idoszak alatt. A szövetek növekedéséhez hasonlóan részletesen Összefoglalva a D. innoxia hairy root klónok növekedésének
vizsgálata
során
kapott
eredményeinket elmondhatjuk, hogy az átoltást követoen észlelt kisebb csökkenéstol eltekintve mindhárom
klón
friss
súlya
tanulmányoztuk a kiválasztott hairy root klónok alkaloid tartalmát és alkaloid produkciós értékeit mind a sötétben, mind pedig a fényben nevelt kultúrák esetében.
egyenletesen - Tropán alkaloidok kimutatása MALDI-MS
gyarapodott az átoltást követo 4-5. hétig, amikor is technikával a #410 és # 415 (sötétben), illetve a # 410 (fényen)
Az alkaloid tartalom meghatározásához készített,
klónok esetében mértük a legnagyobb értékeket
tisztított
(56. ábra). A friss súly alakulásával összhangban
segítségével sikerült kimutatnunk és azonosítanunk
változott a szövetek szárazanyag tartalma, mely
a hioszciamint és szkopolamint (60. és 61. ábrák).
92
kivonatokban
MALDI-MS
technika
A D. innoxia # 410 klón vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy a szövetek hioszciamin tartalma az átoltást követo 4. hétre érte el a legmagasabb értéket sötétben és fényen egyaránt (1,99mg/g és 2,08mg/g liofilizált szövet) (63. ábra). A sötétben nevelt szövetek hioszciamin tartalma gyorsan emelkedett, és már a 2. hét végére megközelítette a legmagasabb értéket, mely a 4. hét után is csak kisebb mértékben csökkent (63/A. ábra). A szövetekben mért hioszciamin tartalom fényen lassabban érte el a maximális értéket, a 4. hét után pedig jelentosen csökkent (63/B. ábra). Eredményeink azt mutatják, hogy a # 410 klón szöveteinek hioszciamin tartalma – a fényen nevelt 3 és 5 hetes kultúrák kivételével – meghaladja a szkopolamin tartalmat. A szkopolamin tartalom sötétben szintén
A B
tenyésztés
gyorsan
emelkedett
és
a
2-4. hetére ért el maximális értéket
60. ábra Hioszciamin (A) és szkopolamin (B) tesztoldatok MALDI-MS spektruma.
62. ábra D. innoxia # 410 hairy root klón (2 héten 61. ábra D. innoxia # 410 hairy root klón át fényen tenyésztve) alkaloid kivonatának HPLC felhasználásával készült kivonat MALDI-MS kromatogramja. spektruma. (1,62mg/g – 1,67mg/g liofilizált szövet) (63/A. - Alkaloid tartalom meghatározása HPLC ábra). A fényen nevelt szövetek szkopolamin módszerrel tartalma valamivel késobb, a 3-5. hétre érte el a A szövetek hioszciamin, szkopolamin és legmagasabb értékeket (1,58mg/g – 1,68mg/g apoatropin tartalmát kvantitatívan HPLC technika segítségével határoztuk meg (62. ábra).
93
liofilizált szövet), és csak ezt követoen csökkent
(0,47mg/liofilizált
jelentosen (63/B. ábra).
produkciója pedig már a 3. héten elérte a
Az apoatropin tartalom sötétben a 2-4. hétig volt
legmagasabb
magasabb (0,17mg/g – 0,21mg/g liofilizált szövet),
kultúra)
az 5. és 6. héten a hioszciamin és szkopolamin
kultúrák esetében a
kultúra),
értékeket
szkopolamin (0,33mg/liofilizált
(64/A. ábra). A
fényen
nevelt
tartalom csökkenésével párhuzamosan kisebb mértünk
(0,10mg/g
és
0.9
0,08mg/g
Alkaloid produkció (mg/kultúra)
értékeket
liofilizált szövet) (63/A. ábra). Fényen egészen a 2-5. hétig viszonylag nagyobb apoatropin tartalmat mértünk (0,19mg/g – 0,22mg/g liofilizált szövet), csupán a 4. héten csökkent kisebb mértékben ezen
0.8 0.7 0.6 hioszciamin
0.5
szkopolamin 0.4
apoatropin
0.3 0.2 0.1 0
alkaloid mennyisége (0,11mg/g liofilizált szövet)
1
2
3
4
5
6
Tenyésztési ido (hét)
2.5 0.9
Alkaloid produkció (mg/kultúra)
Alkaloid tartalom (mg/g)
(63/B. ábra).
2 1.5
hioszciamin szkopolamin
1
apoatropin
0.5 0 1
2
3
4
5
6
0.8 0.7 0.6 hioszciamin
0.5
szkopolamin 0.4 apoatropin 0.3 0.2 0.1 0 1
Tenyésztési ido (hét)
2
3
4
5
6
Alkaloid tartalom (mg/g)
Tenyésztési ido (hét)
A
2.5
B
64. ábra D. innoxia # 410 hairy root klón sötétben (A) és fényen (B) tenyésztett szöveteinek alkaloid produkciós értékei (szárazsúlyra vonatkoztatva).
2 hioszciamin
1.5
szkopolamin 1
apoatropin
szkopolamin produkció szintén a 3. héten érte el a
0.5
maximumot
0 1
2
3
4
5
6
(0,60mg/liofilizált
kultúra),
a
hioszciamin produkció viszont a 4. héten volt a
Tenyésztési ido (hét)
legnagyobb (0,77mg/liofilizált kultúra) (64/B. A
ábra). Fontos kiemelni azonban, hogy míg az
B
63. ábra D. innoxia # 410 hairy root klón sötétben (A) és fényen (B) tenyésztett szöveteinek alkaloid tartalma (szárazsúlyra vonatkoztatva).
alkaloid tartalom szempontjából nem volt jelentos eltérés, az alkaloid produkció esetében azonban jelentosen magasabb - közel kétszeres - értékeket
Az alkaloid tartalom és az átlagos szárazsúly értékeibol számított alkaloid produkció értékei alapján megállapítható, hogy a sötétben tenyésztett szövetek hioszciamin produkció ja az 5. héten
94
kaptunk a fényen tenyésztett kultúrák esetében (64. ábra).
A # 415 klón alkaloid tartalmát tanulmányozva 2.5
Alkaloid tartalom (mg/g)
azt találtuk, hogy – hasonlóan a # 410 klónhoz – ezekben a szövetekben is a hioszciamin a foalkaloid (65. és 66. ábrák). Sötétben tenyésztett szövetekben az átoltást
követoen
gyorsan
csökkent mind a hioszciamin, mind pedig a szkopolamin tartalom. Csak az 5-6.
héten
2
1.5
hioszciamin szkopolamin
1
apoatropin
0.5
0 1
tapasztaltunk növekedést, de a 6. héten mért
2
3
4
5
6
Tenyésztési ido (hét)
értékek (2,26mg/g hioszciamin és 1,34mg/g szkopolaminliofilizált szövet) sem haladták meg Alkaloid tartalom (mg/g)
2.5
jelentosen
2
1.5
hioszciamin szkopolamin
1
apoatropin
0.5
0 1
2
3
4
5
6
Tenyésztési ido (hét)
A B
66. ábra D. innoxia # 415 hairy root klón sötétben (A) és fényen (B) tenyésztett szöveteinek alkaloid tartalma (szárazsúlyra vonatkoztatva). az 1 hetes kultúrákban mért értékeket (1,86mg/g 65. ábra D. innoxia # 415 hairy root klón (4 héten át fényen tenyésztve) alkaloid kivonatának HPLC kromatogramja.
hioszciamin és 1,27mg/g szkopolamin liofilizált szövet) (66/A. ábra). Fényen a 3. és 5. héten mértünk nagyobb hioszciamin (1,85mg/g és 1,89mg/g liofilizált szövet)
és
szkopolamin
tartalom
értékeket
(1,09mg/g és 1,07mg/g liofilizált szövet), melyek az 5. hét után csökkentek (66/B. ábra). A sötétben nevelt kultúrákban - hasonlóan az alkaloid tartalom étékeihez - egészen a 6. hétig (0,63mg hioszciamin, 0,37mg szkopolamin és 0,02mg apoatropin/liofilizált kultúra) növekedtek az
alkaloid
produkciós
adatok
(67/A.
ábra).Fényen – szintén az alkaloid tartalom értékeinek megfeleloen – a 3. és az 5. héten
95
kaptunk kiugró értékeket (0,68mg és 0,730g héten maximális szkopolamin tartalmat mértünk hioszciamin,
illetve
0,38mg
és
0,42mg (1,21mg/g liofilizált szövet), mely ebben az
szkopolamin/liofilizált kultúra), (67/B. ábra), de
esetben is fokozatosan csökkent, majd az 5. héten
csupán az 5. héten mért értékek közelítették meg a
mért kis mértéku emelkedés után jelentosen
#410 klónnál, fényen kapott értékeket (64/B. és
csökkent (69/B. ábra).
67/B. ábrák).
A sötétben nevelt kultúrák hioszciamin tartalma a 3. héten volt a legnagyobb (1,09mg/g liofilizált
0.9
szövet), majd csökkenést követoen az 5. héten
Alkaloid produkció (mg/kultúra)
0.8
kissé újra megnott (0,99mg/g liofilizált szövet)
0.7 0.6
(69/A. ábra). Fényen – hasonlóan a szkopolamin
hioszciamin
0.5
szkopolamin 0.4
tartalomhoz –
apoatropin
kisebb értékeket mértünk, a
0.3
maximumot az 5. héten detektáltuk (0,77mg/g
0.2 0.1
liofilizált szövet) (69/B. ábra).
0 1
2
3
4
5
6
Tenyésztési ido (hét)
0.9
Alkaloid produkció (mg/kultúra)
0.8 0.7 0.6 hioszciamin
0.5
szkopolamin 0.4
apoatropin
0.3 0.2 0.1 0 1
2
3
4
5
6
Tenyésztési ido (hét)
A B
67. ábra D. innoxia # 415 hairy root klón sötétben (A) és fényen (B) tenyésztett szöveteinek alkaloid produkciós értékei (szárazsúlyra vonatkoztatva). A
különbözo
hairy
root
tenyészetek
növekedésének és alkaloid tartalmának elozetes vizsgálatát követoen sikerült kiszelektálnunk egy klónt (# 411), mely szkopolamin foalkaloidot tartalmazott (68. és 69. ábrák). A # 411 klón szkopolamin tartalma sötétben volt nagyobb, a 3. hétre érte el a maximumot (1,72mg/g liofilizált szövet), majd az 5. hét után jelentosen csökkent (69/A. ábra). Fényen nevelt szövetekben már a 2.
96
68. ábra D. innoxia # 411 hairy root klón (5 héten át fényen tenyésztve) alkaloid kivonatának HPLC kromatogramja.
viszonylag Alkaloid tartalom (mg/g)
2.5
magasabb
értékeket
kaptunk
(0,02mg/liofilizált kultúra). (70/A. ábra).
2
Fényen a hioszciamin produkció csupán az 5.
1.5
héten haladta meg jelentosen a sötétben kapott
hioszciamin szkopolamin
1
értékeket (0,30mg/liofilizált kultúra), szkopolamin
apoatropin
esetében
0.5
azonban
már
a
2.
héttol
(0,30mg/liofilizált kultúra) jelentosen magasabb
0 1
2
3
4
5
6
értékeket kaptunk. A legnagyobb, 5. heti értékeket
Tenyésztési ido (hét)
követoen (szkopolamin esetében 0,34mg/liofilizált kultúra) mindkét alkaloid produkciójának esetében
Alkaloid tartalom (mg/g)
2.5
jelentos csökkenést detektáltunk (70/B. ábra).
2
Az apoatropin produkció csupán fényen volt 1.5
hioszciamin
jelentosebb, a 2-5. héten viszonylag egyenletesen
szkopolamin 1
apoatropin
magasabb értékekkel (0,04mg – 0,060g/liofilizált
0.5
kultúra) (70. ábra).
0 1
2
3
4
5
6 0.9
Alkaloid produkció (mg/kultúra)
Tenyésztési ido (hét)
A B
69. ábra D. innoxia # 411 hairy root klón sötétben (A) és fényen (B) tenyésztett szöveteinek alkaloid tartalma (szárazsúlyra vonatkoztatva).
0.8 0.7 0.6 hioszciamin
0.5
szkopolamin 0.4
apoatropin
0.3 0.2 0.1
Az apoatropin tartalom viszonylag egyenletesen
0 1
alakult a tenyésztési ido alatt, csökkenés csak a 3.
2
3
4
5
6
Tenyésztési ido (hét)
hét után következett be (69. ábra). alkaloid
tartalom
meghatározásánál
0.9
Alkaloid produkció (mg/kultúra)
Az
tapasztaltakkal ellentétben az alkaloid produkciós értékek a # 411 klón esetében is nagyobbak voltak a fényen nevelt szövetek esetében, bár ebben az esetben nem tapasztaltunk akkora eltérést, mint a #410 klónnál (64. és 70. ábrák).
0.8 0.7 0.6 hioszciamin
0.5
szkopolamin 0.4
apoatropin
0.3 0.2 0.1 0
A sötétben tenyésztett kultúrák
1
hioszciamin
2
3
4
5
6
Tenyésztési ido (hét)
produkciója egészen a tenyésztési ido végéig, a 6. A
hétig emelkedett (0,23mg/liofilizált kultúráig). A
B
héten 70. ábra D. innoxia # 411 hairy root klón sötétben maximumot mutatott (0,29mg/liofilizált kultúra), (A) és fényen (B) tenyésztett szöveteinek alkaloid produkciós értékei (szárazsúlyra vonatkoztatva). az apoatropin esetében még az 5. és 6. héten is szkopolamin
produkció
már
az
5.
97
a
Összefoglalva
szelekciót
követoen hioszciamin
produkciós
értékeket,
míg
a
részletesebben vizsgált 3 klón esetében kapott szkopolamin produkció már a 3. héten elérte a alkaloid tartalom eredményeket elmondható, hogy
maximumot. A sötétben tenyésztett kultúrák
a #410 és # 415 klónokban a hioszciamin található
hioszciamin és szkopolamin produkciós értékei
foalkaloidként, a # 411 klón pedig egyértelmuen
közül a # 415 klón esetében, 6 hetet követoen
szkopolamin foalkaloidos. A sötétben nevelt # 410 kapott értékek a legnagyobbak (64/A., 67/A. és klón hioszciamin tartalma 4 héten volt a 70/A. ábrák).
A fényen nevelt szövetek
legnagyobb, a # 415 klón esetében ugyanekkor hioszciamin produkciója szemponjából a # 410 minimumot mértünk, a # 411 klón esetében pedig a klón
bizonyult
hioszciamin tartalom viszonylag hamar, a 3. hétre
tenyésztést
elérte a legnagyobb értéket. A sötétben nevelt
produkciója
a
legelonyösebbnek
követoen, pedig
a
klón
egészen
4
hét
szkopolamin
a
3-5.
hétig
klónok szkopolamin tartalma hasonlóan alakult egyenletesen nagy volt. Ki kell emelni (63/A., 66/A. és 69/A. ábrák). A # 411 klón ugyanakkor, hogy a # 411 klón esetébe a sötétben esetében a 3. héten mértük a legnagyobb
és
a
fényen
nevelt
szövetek
szkopolamin
szkopolamin tartalmat is, mely ekkor közel 1,7-
produkciója a 2-5. hétig szignifikánsan meghaladta
szeresen múlta felül a hioszciamin tartalmat (69/A.
a hioszciamin produkciós értékeket (64/B., 67/B.
ábra). A 6. héten csökkent a # 410 és # 411 klónok és 70/B. ábrák). hioszciamin
és
szkopolamin
és
apoatropin
tartalma, a # 415 klón esetében azonban a 4. héttol jelentos alkaloid tartalom növekedést mértünk (63/A., 66/A. és 69/A. ábrák). Fényen a # 410 és #415 klónok alkaloid tartalma volt magasabb (3-5. héten). A # 410 klón hioszciamin tartalma – hasonlóan a sötétben nevelt szövetekhez – a 4. héten volt a legnagyobb. A # 415 klón alkaloid tartalmának alakulása jelentosen eltért a sötétben nevelt szövetekétol, mivel fényen a 3. és 5. héten is maximális hioszciamin és szkopolamin értékeket kaptunk. A # 411 klón szkopolamin tartalma már az átoltást követo 2. héten elérte a legnagyobb értéket, a 6. hétre azonban mindhárom klón esetében alkaloid tartalom csökkenést mértünk (63/B., 66/B. és 69/B. ábrák). Az alkaloid produkció mindhárom klón esetén fényen volt nagyobb. A # 410 klón esetében, sötétben az 5. és 6. héten kaptunk maximális
98
4.3.4. A hairy root kultúrák szövettani vizsgálata 4.3.4.1. Az MS alaptáptalajon nevelt szövetek vizsgálata A D. innoxia # 410 hairy root klón szöveteibol készült metszetek HE festést követo mikroszkópos vizsgálata során a fiatal gyökerekre jellemzo szöveti
felépítést
figyeltük
meg.
Kívül
a
rhizodermisz található, melynek sejtjei között sok esetben a gyökérszorök is láthatók (71. ábra).
apoptotikus
folyamatokra
utaló,
jellegzetes
morfológiájú sejtmagokat észlelnünk (71. ábra).
4.3.4.2. HISZTOKÉMIAI DRAGENDORFF ALKALMAZÁSÁVAL
VIZSGÁLATOK REAGENS
Az
sejteken
alkaloidok
szöveteken,
belüli
lokalizációjának tanulmányozása céljából – a D. innoxia in vitro növény gyökereihez hasonlóan – hisztokémiai
reakciót
végeztünk
Dragendorff
reagens alkalmazásával. A vizsgált hairy root klón (# 410)
szöveteiben
Dragendorff
reagens
alkalmazásával sikerült kimutatni az alkaloidok jelenlétére utaló sárgásbarna, kristályos csapadékot (72. ábra). A csapadékkristályok - D. innoxia in vitro növény gyökereihez hasonlóan - minden A
esetben a sejtfal közelében helyezkedtek el,
B
71. ábra D. innoxia # 410 hairy root klón szöveteinek hossz- (A, 100x –os nagyítás) és keresztmetszeti (B, 200x –os nagyítás) képe (4 héten át, sötétben tenyésztve, HE festést követoen. a: rhizodermisz, c: hipodermisz, d: kéregparenchima, e: fanyalábok , f: háncsnyalábok , g: edények hálózatos és vermes-gödörkés sejtfalvastagodással).
leggyakrabban a kéregparenchima rhizodermisz és hipodermisz közelében elhelyezkedo sejtjeiben (72. ábra), valamint a háncs- és fanyalábok közelében található parenchima sejtekben.
A rhizodermisz alatt tág lúmenu sejtekbol álló hipodermisz található, melyet a kéregparenchima sejtjei követnek (71. ábra). A kéreghatár nem, vagy csak alig kiveheto. A háncs és faelemek jól láthatóak, a hosszmetszeti képen megfigyelheto az edények
hálózatos
és
vermes-gödörkés
sejtfalvastagodása is (71. ábra). A sötétben és a fényen nevelt szövetek között – a HE festést követoen - nem tudtunk morfológiai különbségeket kimutatni. Érdekes módon az MS alaptáptalajon nevelt szövetekbol készült metszetek sejtjeiben egyáltalán nem, vagy csupán nagyon kis számban tudtuk a sejtmagokat megfigyelni (71. ábra). A
A
HE festést követoen a metszetekben nem sikerült
99
B
72. ábra 4 hetes, folyékony MS tápközegen, fényen nevelt D. innoxia hairy root kultúrából (# 410 klón) készült metszet, Dragendorff reagenssel történt hisztokémiai reakciót követoen (A: 100x -os és B: 400x -os nagyítás). 4.3.5.
A
tápközeg
összetételének
hatása
a
súlyok fokozatosan csökkentek a 6% szacharóz alkalmazásáig (73/A. ábra). A tenyészetek szárazsúlya fokozatosan nott az általunk alkalmazott MS alaptáptalajnak megfelelo 2%-os szacharóz tartalomig (0,20g), ezt követoen azonban, a magasabb szacharóz koncentrációk
növekedésre és hatóanyag produkcióra
alkalmazása mellett nem változott jelentosen A tápközeg összetétele alapveto hatással van az in (73/B. ábra). vitro kultúrák univerzális és speciális anyagcseréjére. A megfelelo táptalaj kiválasztása
4.5
mellett további lehetoségeket kínál az összetevok
3.5
megváltoztatása,
Friss súly (g)
mennyiségének
4
melynek
segítségével a szövetek növekedése és/vagy hatóanyag termelése optimalizálható. A táptalaj
3 2.5 2 1.5 1 0.5
összetételének helyes megválasztása a különbözo
0 0
hairy root klónok esetében is alapveto fontosságú,
1
2
3
6
Tápközeg szacharóz tartalma (%)
mivel az egyes klónok eltéro genetikai felépítése, valamint ennek eredményeként fejlodése és (pl.
tropán
alkaloid)
termelése
0.25
Szárazsúly (g)
hatóanyag
0.3
jelentosen eltérhet egymástól.
0.2 0.15 0.1 0.05 0 0
4.3.5.1. Szacharóz hatása
1
2
3
6
Tápközeg szacharóz tartalma (%)
Részletesebben vizsgáltuk a tápközeg szacharóz koncentrációjának hatását sötétben tenyésztett D. innoxia #410 hairy root klón növekedésére és tropán alkaloid tartalmára. A szacharóz hatásának kiküszöbölése céljából - a kontrollként alkalmazott
A B
73. ábra A tápközeg szacharóz koncentrációjának hatása D. innoxia # 410 hairy root klón friss súlyára (A) és szárazsúlyára (B) (4 hetet követoen, sötétben nevelve).
MS alaptáptalaj mellett – negatív kontrollként szacharóz mentes táptalajt is felhasználtunk. A tenyészeteket 4 hetet követoen gyujtöttük be. A várakozásoknak megfeleloen a szacharóz mentes tápközegben nevelt szövetek friss súlya volt a legkisebb (1,26g). 1% szacharóz tartalom (m/v) mellett a szövetek jól fejlodtek (3,0g), majd a friss
100
Szárazanyag tartalom (%)
szkopolamin, valamint 1,76mg/g hioszciamin, 14
1,61mg/g szkopolamin) 2% és 3% tápközeg
12
szacharóz tartalomnál mértük, a legnagyobb (6%)
10 8
szacharóz mennyiség azonban már a tropán
6
alkaloid tartalom jelentos csökkenését idézte elo
4
(1,08mg/g hioszciamin, 1,02mg/g szkopolamin),
2
mely alatta maradt a szacharóz mentes tápközegen
0 0
1
2
3
6
nevelt szövetekben mért értékeknek is (1,42mg/g
Tápközeg szacharóz tartalma (%)
Növekedési érték
hioszciamin, 1,10mg/g szkopolamin) (75/A. ábra). 2.5
Az alkaloid tartalomhoz hasonlóan a hioszciamin
2
és szkopolamin produkció is 2% és 3% szacharóz
1.5
alkalmazása mellett érte el a maximális értékeket (0,37mg
1
hioszciamin,
0,31mg
szkopolamin/liofilizált kultúra, illetve 0,34mg
0.5
hioszciamin,
0 0
1
2
3
6
0,32mg
szkopolamin/liofilizált
kultúra), melyek közel kétszeresen múlták felül a
Tápközeg szacharóz tartalma (%)
1% és a 6% szacharóz tartalmak esetében számított A
értékeket (75/B. ábra).
B
Alkaloid tartalom (mg/g)
74. ábra A tápközeg szacharóz koncentrációjának hatása D. innoxia # 410 hairy root klón szárazanyag tartalmára (A) és növekedési értékére (B) (4 hetet követoen, sötétben nevelve).
A szárazanyag tartalom egyenletes növekedést mutatott a szacharóz koncentráció emelésével párhuzamosan, a szacharóz mentes táptalajon
2.5 2 1.5
szkopolamin hioszciamin
1
apoatropin
0.5 0 0
1
2
3
6
Tápközeg szacharóz tartalma (%)
nevelt tenyészetek szárazanyag tartalma (6,98%) viszont csaknem elérte a 2% szacharózt tartalmazó tápközegen tenyésztett szövetek esetében kapott Alkaloid produkció (mg/kultúra)
0.45
értéket (7,20%) (74/A. ábra). A szacharóz mentes táptalajon fejlodo tenyészetek – a várakozásoknak megfeleloen – alig növekedtek (74/B. ábra). A legnagyobb növekedési értéket az
0.4 0.35 0.3
szkopolamin
0.25 hioszciamin
0.2
apoatropin
0.15 0.1 0.05 0
MS
alaptáptalajnak
megfelelo
szacharóz
0
koncentráció mellett kaptuk (1,67), majd a növekedési értékek ismét csökkentek (74/B. ábra). A legnagyobb hioszciamin és szkopolamin tartalmat
(1,83mg/g
hioszciamin,
1
2
3
6
Tápközeg szacharóz tartalma (%) A B
1,52mg/g
101
75. ábra A tápközeg szacharóz koncentrációjának folyékony MS tápközegben sötétben (A) és fényen hatása D. innoxia # 410 hairy root klón alkaloid (B) (balról jobbra: 0 mg/l, 185 mg/l, 370 mg/l, 740 tartalmára (A) és alkaloid produkciójára mg/l és 1480 mg/l MgSO 4 ). (szárazsúlyra vonatkoztatva, 4 hetet követoen, sötétben nevelve). 4.5
4.3.5.2. A MgSO4 hatása különbözo
MgSO 4 koncentrációk
Friss súly (g)
A
4
hatását
sötétben és fényen nevelt D. innoxia # 410 hairy
3.5
sötét fény
3
root szöveteket esetében egyaránt vizsgáltuk (76.
2.5
ábra). A Mg2+ hatásainak kiküszöbölése céljából -
2 0
a kontrollként alkalmazott MS alaptáptalaj mellett
185
370
740
1480
Tápközeg MgSO4 koncentrációja (mg/l)
– negatív kontrollként MgSO 4 mentes táptalajt is 15 Szárazanyag tartalom (%)
felhasználtunk. Sötétben a 740 mg/l MgSO 4 -ot tartalmazó táptalajon nevelt szövetek friss súlya (3,41g), míg fényen az MS alaptápközegnek megfelelo 370 mg/l
MgSO 4
tartalmú
tápközegben
fejlodo
14 13 12 11
sötét
10
fény
9 8 7 6 0
szövetek friss súlya bizonyult a legnagyobbnak
185
370
740
1480
Tápközeg MgSO4 koncentrációja (mg/l)
(3,70g) (77/A. ábra). A MgSO 4 mentes tápközegen A
nem, a 185 mg/l MgSO 4 tartalmú táptalajon
B
azonban a friss súly csökkenését lehetett észlelni. befolyásolta jelentosen a friss súly gyarapodását
77. ábra A tápközeg MgSO 4 koncentrációjának hatása a D. innoxia # 410 hairy root klón friss súlyára (A) és szárazanyag tartalmára (B) (4 hetet követoen, sötétben és fényen nevelve).
(77/A. ábra).
A szövetek szárazanyag tartalma a kevésbé jól
Magasabb MgSO 4 koncentrációk alkalmazása nem
növekvo kultúrák esetében, 185 mg/l MgSO 4 koncentrációnál volt a legnagyobb sötétben és fényen egyaránt (18,12%). A 0 mg/l és 185 mg/l MgSO 4 koncentrációk mellett a sötétben és fényen nevelt kultúrák szárazanyag tartalma gyakorlatilag meggyezett (77/B. ábra). Az alaptáptalajon (370 A
mg/l), illetve magasabb (740-1480 mg/l) MgSO 4 koncentrációk alkalmazása mellett a szövetek szárazanyag tartalma kis mértékben csökkent, a fényen nevelt kultúrák esetében pedig - a sötétben nevelt tenyészetekkel összehasonlítva - magasabb
B
szárazanyag tartalom értékeket kaptunk (77/B.
76. ábra D. innoxia # 410 hairy root klón 4 hét ábra). nevelés után, módosított MgSO 4 tartalmú
102
A
növekedési
szempontjából alkaloid tartalmak között (79/B. ábra). 370mg/l
értékek
egyértelmuen a 370mg/l MgSO 4 -ot tartalmazó MS
MgSO 4 koncentráció már jelentos hioszciamin és
alaptáptalaj bizonyult a legkedvezobbnek sötétben szkopolamin tartalom növekedést eredményezett, és fényen egyaránt (1,77; illetve 1,91). Ennél 740mg/l MgSO 4 alkalmazása azonban tovább alacsonyabb és magasabb MgSO 4 koncentrációknál növelte
az
alkaloid
tartalmat
(1,74mg/g
hioszciamin és 1,67mg/g szkopolamin), mely
valamivel kisebb értékeket kaptunk (78. ábra).
ekkor kissé meghaladta a sötétben, 370mg/l MgSO 4 mellett mért értékeket (79. ábra). Az Növekedési érték
3
1480mg/l
2.5 sötét
fényen nevelt szövetekben is jelentos alkaloid
fény
tartalom csökkenést eredményezett, mely viszont
2 1.5 1
MgSO 4 koncentráció azonban már a
nem volt olyan kifejezett, mint sötétben (79. ábra).
0.5 0 0
185
370
740
Az alkaloid produkció szempontjából sötétben –
1480
a
Tápközeg MgSO koncentrációja (mg/l) 4
hioszciamin
és
szkopolamin
tartalommal
megegyezoen – a 370mg/l MgSO 4 koncentráció volt a legkedvezobb (0,54mg hioszciamin, 0,49mg
78. ábra A tápközeg MgSO 4 koncentrációjának szkopolamin/liofilizált kultúra), mely csaknem hatása a D. innoxia # 410 hairy root klón megegyezett a fényen kapott értékekkel (0,53mg növekedési értékére (C) (4 hetet követoen, hioszciamin, 0,48mg szkopolamin/liofilizált sötétben és fényen nevelve). Bár
a
változása
tápközeg
MgSO 4
jelentosen
koncentrációjának
befolyásolta
a
tropán
alkaloid tartalmat a sötétben és fényen nevelt kultúrák esetében is, a szövetek tropán alkaloid tartalma, azonban sötétben és fényen nem tért el jelentosen egymástól (79. ábra). A sötétben nevelt szövetekben, a tápközeg MgSO 4 koncentrációjának emelésével egyenletesen nott a kultúrák alkaloid tartalma
az
MS
alaptápközegnek
megfelelo
370mg/l-es MgSO4 koncentrációig (1,69mg/g hioszciamin és 1,52mg/g szkopolamin), mely optimálisnak bizonyult. Ennél nagyobb MgSO 4 tartalom
a
hioszciamin
és
kultúra) (80. ábra). Fényen, 740mg/l MgSO 4 alkalmazását követoen tovább nott az alkaloid produkció értéke (0,62mg hioszciamin, 0,60mg szkopolamin/liofilizált 1480mg/l jelentosen
MgSO 4
kultúra), koncentráció
felülmúlta
a
mely mellett
sötétben
még is
fejlodött
szövetekben kapott értékeket. A fényen nevelt kultúrák apoatropin produkciója – a tartalmi adatoknak megfeleloen, a MgSO 4 mentes táptalaj kivételével – jelentosen meghaladta a sötétben tenyésztett szövetek esetében kapott értékeket (80. ábra).
szkopolamin
mennyiségének jelentos csökkenését idézte elo (79/A. ábra). A fényen tenyésztett kultúrák esetében nem észleltünk szignifikáns eltérést a MgSO 4 -mentes és a 185mg/l MgSO 4 esetében mért
103
0.7
2.5
0.6
1.5
Alkaloid produkció (mg/kultúra)
Alkaloid tartalom (mg/g)
2
hioszciamin szkopolamin apoatropin
1
0.5
0.5 0.4
hioszciamin szkopolamin
0.3
apoatropin
0.2 0.1
0 0
185
370
740
1480
0
Tápközeg MgSO 4 tartalma (mg/l)
0
185
370
740
1480
Tápközeg MgSO4 tartalma (mg/l)
2.5 0.7 0.6
1.5
Alkaloid produkció (mg/kultúra)
Alkaloid tartalom (mg/g)
2
hioszciamin szkopolamin apoatropin
1
0.5
0 0
185
370
740
0.5 0.4
hioszciamin szkopolamin
0.3
apoatropin
0.2 0.1
1480
Tápközeg MgSO4 tartalma (mg/l)
0 0
A
185
370
740
1480
Tápközeg MgSO4 tartalma (mg/l)
B
79. ábra Különbözo MgSO 4 koncentrációjú B A tápközegeken, sötétben (A) és fényen (B) nevelt D. innoxia hairy root szövetek (# 410 klón) alkaloid 80. ábra Különbözo MgSO 4 koncentrációjú tápközegeken, sötétben (A) és fényen (B) nevelt tartalma (szárazsúlyra vonatkoztatva). D. innoxia hairy root szövetek (# 410 klón) alkaloid produkciója (szárazsúlyra vonatkoztatva).
4.3.6. Abiogén stressz hatása a hairy root szövetek növekedésére és hatóanyag produkciójára 4.3.6.1. A dimedon hatása A kallusz kultúrákhoz hasonlóan vizsgáltuk a tápközegbe adagolt dimedon hatását a D. innoxia # 410 hairy root klón növekedésére és tropán alkaloid termelésére sötétben és fényen történt tenyésztést követoen (81. és 82. ábrák). A szöveteket 4 hetet követoen gyujtöttük be, a kontroll (dimedon mentes) és a tápközegben
104
10ppm dimedont tartalmazó kultúrákat pedig a 2. és 6. héten is vizsgáltuk. A 4. hét után begyujtött kultúrák friss súlya – a kontroll tenyészetekhez (sötétben: 2,20g; fényen: 2,61g) képest - kis mértékben csökkent az 1ppm – 100ppm dimedon kezelés hatására. A tápközegbe adott 1000ppm dimedon azonban már nagy mértékben csökkentette a friss súly értékeket (sötétben: 031g; fényen: 0,48g) (83/A. ábra). A fényen nevelt szövetek esetén nagyobb friss
B C
súlyokat mértünk, az eltérés azonban csak 100ppm
81. ábra Sötétben tenyésztett D.innoxia # 410 hairy root klón 2 szövetei (A) és 4 hét (B) nevelés után, (balról jobbra: 0ppm, 1ppm, 10ppm, 100ppm és szignifikánsnak (83/A. ábra). 1000ppm dimedon a tápközegben), valamint 6 A szövetek szárazanyag tartalma csupán kis hetet követoen (C) folyékony MS tápközegben mértékben csökkent a tápközeg dimedon (balról jobbra: 0ppm és 10ppm dimedon a tápközegben). tartalmának emelésével. A friss súly alakulásával dimedon
alkalmazása
mellett
bizonyult
ellentétben a szárazanyag tartalom – 1000ppm dimedon alkalmazását kivéve – tenyésztett
szövetekben
volt
kis
a sötétben mértékben
nagyobb, 100ppm dimedon hatására azonban jelentosen, 9,77%-ra nott a sötétben fenntartott kultúrák szárazanyag tartalma (83/B. ábra).
A
A
B C
82. ábra Fényen tenyésztett D.innoxia # 410 hairy root klón szövetei 2 (A) és 4 hét (B) nevelés után, (balról jobbra: 0ppm, 1ppm, 10ppm, 100ppm és 1000ppm dimedon a tápközegben), valamint 6 hetet követoen (C) folyékony MS tápközegben
105
(balról jobbra: 0ppm és 10ppm dimedon a koncentráció mellett mértünk kissé magasabb pH tápközegben). értékeket (pH 4,58), melyek azonban alatta maradtak a kontroll szövetek esetében kapott 4.5
értékeknek (sötétben: pH 4,40; fényen: pH 4,77)
4
(84/B. ábra).
3 2.5
sötétben
0 0
1
10
100
1000
Tápközeg dimedon tartalma (ppm)
14 12 10 8
sötétben
Tápközeg pH
Szárazanyag tartalom (%)
fényen
0
Tápközeg dimedon tartalma (ppm)
sötétben
1000
1 0.5
3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 100
1.5
10
fényen
2
1
Növekedési érték
Friss súly (g)
3.5
fényen
6 4 2 0 0
1
10
100
4.7 sötét 4.2
fény
3.7
1000
0
Tápközeg dimedon tartalma (ppm)
1
10
100
1000
Tápközeg dimedon tartalma (ppm)
A B
A 83. ábra D.innoxia # 410 hairy root klón B szöveteinek friss súlya (A) és szárazanyag tartalma (B) különbözo dimedon tartalmú folyékony MS 84. ábra D.innoxia # 410 hairy root klón szöveteinek növekedési értéke (A) és tápközeg pH tápközegen, 4 hetet követoen. értékei (B) különbözo dimedon tartalmú folyékony Dimedon hatására jelentosen csökkent a kultúrák MS tápközegen, 4 hetet követoen
növekedési értéke sötétben és fényen egyaránt, A 4 hetes szövetek tropán alkaloid tartalma 1000ppm dimedon pedig teljesen gátolta a sötétben meghaladta a fényen mért értékeket (85. szövetek növekedését (84/A. ábra). ábra). A sötétben fejlodött kultúrák szkopolamin A folyékony MS tápközegek pH értékét 4 hetet
tartalma
minden
alkalmazott
dimedon
követoen minden vizsgált dimedon koncentráció koncentrációnál meghaladta a szövetek esetében meghatároztuk. Eredményeink azt hioszciamin tartalmát. 1ppm és 100ppm dimedon mutatják, hogy a fényen nevelt szövetek hatására jelentos szkopolamin tartalom növekedés táptalajainak pH-ja minden esetben meghaladja a
következett be (1,51mg/g és 1,65mg/g liofilizált
sötétben tenyésztett szövetek megfelelo értékeit
szövet) (85/A. és 86/A. ábrák), míg a hioszciamin
(84/B. ábra). Sötétben és fényen is alacsonyabb
esetében csupán 1ppm tápközeg dimedon tartalom
pH-kat mértünk a tápközeg dimedon tartalmának
hatására mértünk –
növekedésével párhuzamosan. Sötétben csupán (0,93mg/g) 10ppm (pH 4,32), fényen pedig 100ppm dimedon
106
a kontroll szövetekhez
viszonyítva
–
kissé
nagyobb
alkaloidtartalmat (1,01mg/g) (85/A. ábra). Mind a hioszciamin, mind pedig az apoatropin tartalom csökkent
a
tápközeg
növekedésével.
dimedon
1000ppm
sötétben (A) és fényen nevelve (B), 4 hetet követoen.
tartalmának
dimedon
hatására
azonban már jelentosen csökkent a szövetekben mindhárom vizsgált tropán alkaloid mennyisége (85/A. és 86/B ábrák).
A fényen nevelt
szövetekben 10ppm dimedon alkalmazása mellett nott meg valamelyest a szövetek szkopolamin tartalma (0,46mg/g), 100ppm hatására pedig a hioszciamin tartalom (0,75mg/g). Ezek az értékek azonban egyik esetben sem haladták meg a kontroll tenyészetekben mért értékeket (0,78mg/g hioszciamin és 0,46mg/g szkopolamin), 1000ppm dimedon alkalmazása pedig fényen is jelentos A
tropán alkalo id tartalom csökkenést eredményezett
86. ábra A tropán alkaloid tartalom meghatározásához, D. innoxia #410 hairy root klón felhasználásával készült kivonatok HPLC kromatogramja (4 héten át sötétbe n tenyésztve, A: 100ppm dimedon és B: 1000ppm dimedon a tápközegben).
(85/B. ábra). Alkaloid tartalom (mg/g)
B
1.8 1.6 1.4 1.2 hioszciamin 1 szkopolamin 0.8 apoatropin
A szövetek alkaloid produkciója sötétben és
0.6 0.4
fényen egyaránt csökkent a tápközegbe adagolt
0.2 0 0
1
10
100
1000
dimedon
Tápközeg dimedon tartalma (ppm)
hatására,
1000ppm
alkalmazását
követoen pedig a tenyészetek már nem állítottak elo tropán alkaloidokat számottevo mennyiségben.
1.8
Megfigyeltük, hogy a dimdon kezelés hatására – az
Alkaloid tartalom (mg/g)
1.6
alkaloid tartalom alakulásának megfeleloen – a
1.4 1.2
sötétben nevelt szövetek szkopolamin produkciója
hioszciamin
1
szkopolamin 0.8
meghaladta a megfelelo hioszciamin produkciós
apoatropin
0.6 0.4
értékeket. A fényen nevelt szövetek alkaloid
0.2
produkciója
0 0
1
10
100
1000
ugyanakkor
10ppm
és
100ppm
dimedon alkalmazása mellett felülmúlta a sötétben
Tápközeg dimedon tartalma (ppm)
kapott értékeket (87. ábra).
A B
85. ábra D.innoxia # 410 hairy root klón szöveteinek tropán alkaloid tartalma különbözo dimedon tartalmú folyékony MS tápközegen
107
HCHO tartalom (ug/g liofilizált szövet)
Alkaloid produkció (mg/kultúra)
0.25
0.2
hioszciamin
0.15
szkopolamin apoatropin
0.1
0.05
0
0
1
10
100
450 400 350 300 250 200 150 100 50 0
1000
0
1
10
100
Tápközeg dimedon tartalma (ppm)
Tápközeg dimedon tartalma (ppm)
Alkaloid produkció (mg/kultúra)
0.25
88. ábra D.innoxia # 410 hairy root klón szöveteinek endogén HCHO tartalma különbözo dimedon tartalmú folyékony MS tápközegen, fényen nevelve, 4 hetet követoen.
0.2
0.15
hioszciamin szkopolamin
0.1
apoatropin
0.05
100ppm dimedon hatására kis mértékben ismét 0 0
1
10
100
nott
1000
a
mérheto
endogén
HCHO
tartalom
Tápközeg dimedon tartalma (ppm)
(308,8µg/g), azonban ez nem érte el a kontroll A
szövetekben mért értéket (88. ábra).
B
87. ábra D.innoxia # 410 hairy root klón A 4 hetes kultúrák mellett – amikor is minden szöveteinek alkaloid produkciója különbözo dimedon tartalmú folyékony MS tápközegen alkalmazott dimedon koncentráció mellett fejlodo sötétben (A) és fényen nevelve (B), 4 hetet szövetet részletesen vizsgáltunk – tanulmányoztuk követoen. a 2 és 6 hetes szövetek fejlodését és tropán A
szövetek
tropán
tartalmának alkaloid tartalmát is, melyek dimedon mentes és
alkaloid
meghatározását követoen, a fényen
nevelt 10ppm dimedont tartalmazó táptalajon fejlodtek.
kultúrákból – az 1000ppm dimedon kezelés A friss súlyok, melyek értékei növekedtek a 6 hét kivételével
-
rendelkezésre
feldolgozásával, meghatároztuk
OPLC a
technika
szövetek
minták alatt,
álló
az
elso
2
hetet
követoen
csaknem
segítségével megegyeztek a dimedon mentes és a 10ppm
endogén
HCHO dimedont tartalmazó táptalajok esetében. Ezzel
tartalmát (88. ábra). A formaldimedon adduktum
szemben a 10ppm dimedonnal kezelt szövetek friss
formájában meghatározott HCHO tartalom a
súlya 4. és 6. hétre már a kontroll értékek alatt
kontrollhoz
(345,0µg/g
liofilizált
szövet) maradt (89. ábra). Fényen minden esetben kissé
viszonyítva kissé megnott 1ppm dimedon hatására (380,8µg/g), majd szignifikáns csökkent
a
10ppm
táptalajon (274,2µg/g).
dimedon
magasabb friss súlyt mértünk, azonban az értékek
mértékben csupán a 2 hetes kontroll és a 6 hetes 10ppm tartalmú
dimedont tartalmazó táptalajon nevelt szövetek esetében tértek el szignifikánsan egymástól (89. ábra).
108
A B
6
Friss súly (g)
5 4 sötét
3
fény
90. ábra D.innoxia # 410 hairy root klón szöveteinek szárazsúlya 2, 4 és 6 hetet követoen dimedon mentes (A) és 10ppm dimedont tartalmazó (B) folyékony MS tápközegen.
2
A sötétben és fényen fejlodo szövetek szárazsúlya
1
a 4. hétig nott dimedon mentes táptalajon, míg
0 2
4
6
dimedon hatására sötétben fokozatosan csökkentek
Tenyésztési ido (hét)
az értékek a 2. és 6. hét között. A fényen nevelt szövetek szárazsúlya 10ppm dimedon hatására a 6.
5 4.5
héten jelentosen megnott (0,17g) (90/B. ábra).
Friss súly (g)
4
A fényen fejlodo szövetek szárazanyag tartalma
3.5 3 sötétben
2.5
fényen
2
az esetek többségében szignifikáns mértékben meghaladta
1.5 1
a
sötétben
tenyésztett
szövetek
megfelelo értékeit (91. ábra). A kontroll szövetek
0.5 0 2
4
esetében legnagyobb szárazanyag tartalmat 4 hetet
6
Tenyésztési ido (hét)
követoen kaptuk (8,21% sötétben és 7,86% fényen) (91/A. ábra), míg 10ppm dimedon
A B
alkalmazása mellett a 6. hétre nottek meg az 89. ábra D.innoxia # 410 hairy root klón szöveteinek friss súlya 2, 4 és 6 hetet követoen értékek (8,91% sötétben és 7,13% fényen) (91/B. dimedon mentes (A) és 10ppm dimedont ábra). A friss és szárazsúlyokkal szemben a tartalmazó (B) folyékony MS tápközegen. szövetek szárazanyag tartalma sötétben volt kis
Szárazsúly (g)
mértékben nagyobb (91. ábra). 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0
sötét fény
2
4
6
Szárazsúly (g)
Tenyésztési ido (hét)
0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0
sötét fény
2
4
6
Tenyésztési ido (hét)
109
7
8
6
6
sötét
4
fény
Növekedési érték
Szárazanyag tartalom (%)
10
2 0 2
4
6
5 4
sötét
3
fény
2 1 0
Tenyésztési ido (hét)
2
4
6
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
7
sötét
Növekedési érték
Szárazanyag tartalom (%)
Tenyésztési ido (hét)
fény
2
4
6
Tenyésztési ido (hét)
6 5 4
sötét
3
fény
2 1 0 2
A B
4
6
Tenyésztési ido (hét)
91. ábra D.innoxia # 410 hairy root klón szöveteinek szárazanyag tartalma 2, 4 és 6 hetet B A követoen dimedon mentes (A) és 10ppm dimedont 92. ábra D.innoxia # 410 hairy root klón tartalmazó (B) folyékony MS tápközegen. szöveteinek növekedési értékei 2, 4 és 6 hetet követoen dimedon mentes (A) és 10ppm dimedont A sötétben nevelt kontroll tenyészetek növekedési tartalmazó (B) folyékony MS tápközegen. értéke (2,86) a 4. hétre, míg a fényen nevelt kultúrák esetében a 6. hétre érte el a legnagyobb értéket (5,27). A 10ppm dimedon kezelés hatására jelentosen csökkent a szövetek növekedése a vizsgált 6 hetes idoszakban. A legnagyobb növekedési értékek sötétben (2 hét után 0,47) és fényen
(6
hetet
követoen
1,65)
csupán
megközelítették a kontroll tenyészeteknél 2 hét elteltével meghatározott értékeket (sötétben 0,85; fényen 2,08) (92. ábra).
110
0,74mg/g hioszciamin, 0,86mg/g szkopolamin) 7
(94.
Tápközeg pH
6
A
ábra).
szövetek
hioszciamin
és
szkopolamin tartalma fényen nem érte el a sötétben
5 4
sötét
3
fény
nevelt szövetekben mért értékeket, csupán az apoatropin tartalom haladta meg kis mértékben a 2.
2
és 6. héten, sötétben kapott adatokat (94. ábra).
1 0 2
4
6
Alkaloid tartalom (mg/g)
Tenyésztési ido (hét)
7
Tápközeg pH
6 5 4
sötét fény
3 2
1.4 1.2 1 hioszciamin 0.8
szkopolamin apoatropin
0.6 0.4 0.2 0
1
2
0 2
4
4
6
Tenyésztési ido (hét)
6
Tenyésztési ido (hét) Alkaloid tartalom (mg/g)
A B
93. ábra D.innoxia # 410 hairy root klón szöveteinek tápközeg pH értékei 2, 4 és 6 hetet követoen dimedon mentes (A) és 10ppm dimedont tartalmazó (B) folyékony MS tápközegen. A tápközegek pH értékei csupán a kontroll
tápközegek
pH
értéke
1 hioszciamin 0.8
szkopolamin apoatropin
0.6 0.4 0.2
2
4
6
Tenyésztési ido (hét)
5,14 sötétben, illetve pH 5,42 fényen), a 10ppm tartalmazó
1.2
0
szövetek esetében emelkedtek meg a 6. hétre (pH dimedont
1.4
A B
94. ábra D.innoxia # 410 hairy root klón 4,27 – 4,39 sötétben, illetve pH 4,21 – 4,66 szöveteinek tropán alkaloid tartalma 2, 4 és 6 hetet követoen folyékony MS tápközegen sötétben (A) fényen) (93. ábra). és fényen nevelve (B). ugyanakkor nem változott jelento mértékben (pH
A sötétben és fényen tenyésztett, kontroll szövetek tropán
alkaloid
tartalma
nem
növekedett
számottevoen az átoltást követo 6. hétig. A tenyésztési ido végén mért értékek (sötétben: 1,00mg/g hioszciamin, 1,12mg/g szkopolamin; fényen:
0,99mg/g
hioszciamin,
0,89mg/g
szkopolamin) nem, vagy csupán alig haladták meg a 2. héten mért értékeket (sötétben: 1,23mg/g hioszciamin,
0,97mg/g
szkopolamin;
fényen:
111
Meg kell jegyezni ugyanakkor, hogy a 4. héten – a 0.25
csökkenést észleltünk (96. ábra).
0.15
hioszciamin szkopolamin apoatropin
0.1
Alkaloid tartalom (mg/g)
Alkaloid produkció (mg/kultúra)
kontroll szövetekhez hasonlóan – alkaloid tartalom 0.2
0.05
0 2
4
6
Tenyésztési ido (hét)
0.25
1.4 1.2 1 hioszciamin 0.8
szkopolamin apoatropin
0.6 0.4 0.2
2
4
6
Tenyésztési ido (hét) 0.15
hioszciamin szkopolamin apoatropin
0.1
Alkaloid tartalom (mg/g)
Alkaloid produkció (mg/kultúra)
0 0.2
0.05
0 2
4
6
Tenyésztési ido (hét)
A B
1.4 1.2 1 hioszciamin 0.8
szkopolamin apoatropin
0.6 0.4 0.2 0
95. ábra D.innoxia # 410 hairy root klón szöveteinek alkaloid produkciója 2, 4 és 6 hetet követoen folyékony MS tápközegen sötétben (A) és fényen nevelve (B).
2
4
6
Tenyésztési ido (hét)
A B
Az alkaloid produkció értékei mind sötétben, 96. ábra D.innoxia # 410 hairy root klón szöveteinek tropán alkaloid tartalma 2, 4 és 6 hetet mind pedig fényen nottek a 6 hetes tenyésztési követoen 10ppm dimedon tartalmú folyékony MS periódusban (95. ábra) Sötétben és fényen közel tápközegen sötétben (A) és fényen nevelve (B). azonos eredményeket kaptunk, csupán a 6 hetes, fényen nevelt kultúrák alkaloid produkciós értékei (0,24mg hioszciamin, 0,22mg szkopolamin és 0,06mg apoatropin/liofilizált kultúra) haladták meg a sötétben nevelt szövetek megfelelo adatait (95. ábra). A 10ppm dimedont tartalmazó táptalajon nevelt szövetek hioszciamin és szkopolamin tartalma a 6. hétre meghaladta a kontroll szövetekben mért értékeket sötétben és fényen egyaránt, csupán a sötétben nevelt szövetek esetében mértünk a kontroll értéknél kisebb hioszciamin tartalmat.
112
gátolta a szövetek fejlodését, mivel hatására 0.25
Alkaloid produkció (mg/kultúra)
egyaránt csökkentek a mért friss- és szárazsúlyok, 0.2
valamint a számított szárazanyag tartalom
0.15
értékek,
hioszciamin
különösen
1000ppm
alkalmazását
szkopolamin
követoen (83. és 88-91. ábrák). A növekedési
apoatropin
0.1
értékek csökkenése szignifikáns mértéku volt
0.05
valamennyi alkalmazott dimedon koncentráció
0 2
4
6
mellett sötétben és fényen egyaránt (84/A. ábra).
Tenyésztési ido (hét)
A sötétben nevelt szövetek hioszciamin és szkopolamin tartalma felülmúlta a fényen nevelt
Alkaloid produkció (mg/kultúra)
0.25
kultúrákban mért értékeket (85. és 93. ábrák). A 4
0.2
hetes, sötétben nevelt szövetekben 1ppm és 0.15
100ppm dimedon hatására a szkopolamin tartalom
hioszciamin szkopolamin 0.1
szignifikáns növekedését észleltük. Az 1000ppm
apoatropin
dimedon adagolását követoen pedig, – a szövetek
0.05
fejlodéséhez hasonlóan – szignifikáns mértékben
0 2
4
6
csökkent a kultúrák alkaloid tartalma és a számított
Tenyésztési ido (hét)
alkaloid produkció értéke mindhárom vizsgált
A
tropán alkaloid esetében (85. ábra). 97. ábra D.innoxia # 410 hairy root klón szöveteinek alkaloid produkciója 2, 4 és 6 hetet 4.3.6.2. A szemikarbazid hatása követoen 10ppm dimedon tartalmú folyékony MS A dimedon mellet tanulmányoztuk a tápközegbe tápközegen sötétben (A) és fényen nevelve (B). B
A táptalajban lévo 10ppm dimedon már 2 hét elteltével kisebb alkaloid produkció csökkenést eredményezett a kontroll szövetekhez viszonyítva (97. ábra). Az értékek a 4. hétre érték el a minimumot, ezt követoen ismét nottek, és a 6 hetes, fényen nevelt szövetek esetében meg is közelítették értékeket szkopolamin
a
kontroll
(0,20mg és
szövetekben
hioszciamin,
0,06mg
kapott 0,21mg
apoatropin/liofilizált
adagolt szemikarbazid hatását, sötétben és fényen tenyésztett D. innoxia # 410 hairy root klón növekedésére és tropán alkaloid termelésére (98. és 99. ábrák). A HCHO-el reverzibilis reakcióba lépo szemikarbazid in vivo sejtekre, szövetekre gyakorolt hatásának tanulmányozása céljából a vegyületet növekvo koncentrációban alkalmaztuk D.
innoxia
kalluszszövetek
tápközegében.
Hasonlóan a dimedon kezeléshez a szöveteket ebben az esetben is 4 hetet követoen gyujtöttük be.
kultúra) (97. ábra).
A Összefoglalva a D. innoxia #410 hairy root klón
kontroll
(szemikarbazid
mentes)
és
a
tápközegben 10ppm szemikarbazidot tartalmazó
növekedésének és tropán alkaloid termelésének kultúrákat a 2. és 6. héten is vizsgáltuk. vizsgálata során kapott eredményeinket A tápközeg növekvo szemikarbazid tartalma elmondhatjuk, hogy a tápközegbe adagolt dimedon jellegzetes hatással volt a 4 hét után begyujtött
113
szövetek fejlodésére. A friss súly – a kontroll szövetekkel összehasonlítva - 1ppm szemikarbazid hatására szignifikáns mértékben megnott (3,91g sötétben és 4,40g fényen), majd fokozatosan csökkent
egészen
1000ppm
tápközeg
szemikarbazid tartalomig. A sötétben és fényen nevelt szövetek friss súlya között nem észleltünk jelentos eltérést (100/A. ábra).
B C
99. ábra Fényen tenyésztett D.innoxia # 410 hairy root klón 2 szövetei (A) és 4 hét (B) nevelés után, (balról jobbra: 0ppm, 1ppm, 10ppm, 100ppm és 1000ppm szemikarbazid a tápközegben), valamint 6 hetet követoen (C) folyékony MS tápközegben (balról jobbra: 0ppm és 10ppm szemikarbazid a tápközegben).
A
6
Friss súly (g)
5 4 sötétben
3
fényen
2 1 0 0
1
10
100
1000
Tápközeg szemikarbazid tartalma (ppm)
B C
Szárazanyag tartalom (%)
98. ábra Sötétben tenyésztett D.innoxia # 410 hairy root klón 2 szövetei (A) és 4 hét (B) nevelés után, (balról jobbra: 0ppm, 1ppm, 10ppm, 100ppm és 1000ppm szemikarbazid a tápközegben), valamint 6 hetet követoen (C) folyékony MS tápközegben (balról jobbra: 0ppm és 10ppm szemikarbazid a tápközegben).
16 14 12 10 sötétben 8 fényen 6 4 2 0 0
1
10
100
1000
Tápközeg szemikarbazid tartalma (ppm) A B A
100. ábra D.innoxia # 410 hairy root klón szöveteinek friss súlya (A) és szárazanyag tartalma
114
101. ábra D.innoxia # 410 hairy root klón szöveteinek növekedési értéke (A) és tápközeg pH értékei (B) különbözo szemikarbazid mentes 1ppm folyékony MS tápközegen, 4 hetet követoen.
(B) különbözo szemikarbazid tartalmú folyékony MS tápközegen, 4 hetet követoen. A
szövetek
szárazanyag
tartalma
szemikarbazid alkalmazásának hatására csökkent, majd 10ppm és 100ppm mellett (sötétben 10,0712,80%, fényen 9,48-10,15%) -
a kontroll
értékeket (7,92-8,26%) is meghaladva – megnott. 1000ppm szemikarbazid hatására ismét a kontroll értékek alá, az 1ppm-es kezeléshez hasonló értékekre
csökkent
a
szövetek
szárazanyag
tartalma (100/B. ábra). A
szövetek
szemikarbazid
hatására
1ppm
értéke
jelentosen
megnott
(sötétben 5,18; fényen 6,56), majd a tápközeg
párhuzamosan
tartalmának nagy
növekedésével
mértékben
csökkent,
a
100ppm és 1000ppm szemikarbazidot tartalmazó táptalajon
fejlodött
kultúrák
növekedése
gyakorlatilag meg is állt (101/A. ábra).
mellett meghaladták a kontroll táptalajokban mért értékeket. A 100ppm és 1000ppm szemikarbazidot tartalmazó MS folyékony táptalajok pH-ja ezzel szemben nem érte el a kontroll táptalajokét (101/B. ábra). A fényen nevelt tenyészetek esetében – szemikarbazid kezelések mellett – magasabb tápközeg pH értékeket mértünk (101/B. ábra). A szemikarbazid mentes táptalajon, sötétben fejlodo szövetek hioszciamin és szkopolamin tartalma (0,93mg/g, illetve 0,59mg/g) meghaladta a fényen nevelt kultúrákban mért értékeket (0,78mg/g hioszciamin és 0,46mg/g szkopolamin), szemikarbazid hatására azonban – a 100ppm alkalmazásának kivételé vel – fényen mértünk
8
magasabb tropán alakloid tartalmat (102. ábra).
7 6
Növekedési érték
1ppm, illetve 10ppm szemikarbazid tartalom
mind a kontroll szöveteknél, mind pedig a
növekedési
szemikarbazid
A 4 hetes kultúrák tápközegének pH értékei
Bár 100ppm szemikarbazid tartalmú tápközegen,
5 sötétben
4
fényen
sötétben magasabb hioszciamin és szkopolamin
3
tartalmat mértünk (0,68mg/g, valamint 0,36mg/g),
2 1
ezek az értékek azonban nem érték el a kontroll
0 0
1
10
100
szövetek alkaloid tartalmát (102/A. és 103/A
1000
Tápközeg szemikarbazid tartalma (ppm)
ábrák). A 4.9
Tápközeg pH
4.7 4.5 sötét 4.3
fény
4.1 3.9 3.7 0
1
10
100
1000
Tápközeg szemikarbazid tartalma (ppm)
A B
115
dimedon
alkalmazásához
103. ábra A tropán alkaloid tartalom meghatározásához, D. innoxia #410 hairy root klón felhasználásával készült kivonatok HPLC kromatogramja (4. héten át sötétben tenyésztve, A: 100ppm szemikarbazid és B: 1000ppm szemikarbazid a tápközegben).
Alkaloid tartalom (mg/g)
1.8 1.6 1.4 1.2 hioszciamin 1 szkopolamin
0.8
apoatropin 0.6 0.4 0.2
0.25
0 1
10
100
1000
Alkaloid produkció (mg/kultúra)
0
Tápközeg szemikarbazid tartalma (ppm)
1.8
1.4 1.2
hioszciamin
0.15
szkopolamin apoatropin
0.1
0.05
0
hioszciamin
1
0
szkopolamin
1
10
100
1000
Tápközeg szemikarbazid tartalma (ppm)
0.8 apoatropin
0.6 0.4 0.2
0.25 Alkaloid produkció (mg/kultúra)
Alkaloid tartalom (mg/g)
1.6
0.2
0 0
1
10
100
1000
Tápközeg szemikarbazid tartalma (ppm)
A B
102. ábra D.innoxia # 410 hairy root klón szöveteinek tropán alkaloid tartalma különbözo szemikarbazid tartalmú folyékony MS tápközegen sötétben (A) és fényen nevelve (B), 4 hetet követoen.
0.2
0.15
hioszciamin szkopolamin
0.1
apoatropin
0.05
0 0
1
10
100
100
Tápközeg szemikarbazid tartalma (ppm)
A B
104. ábra D.innoxia # 410 hairy root klón szöveteinek alkaloid produkciója különbözo szemikarbazid tartalmú folyékony MS tápközegen sötétben (A) és fényen nevelve (B), 4 hetet követoen. hasonlóan,
1000ppm
mellett
szövetekben
a
szemikarbazid csupán
tartalom
nagyon
kis
mennyiségben mértünk tropán alkaloidokat (102. és 103/B. ábrák). A
kultúrák
tropán
alkaloid
produkciója
egyenletesen csökkent a táptalaj szemikarbazid tartalmának
emelésével
sötétben
és
fényen
egyaránt. A fényen nevelt szövetek alkaloid produkciója minden vizsgált szövetben alatta maradt a sötétben kapott értékeknek (104. ábra). A B
116
A fényen
nevelt kultúrákból – az 1000ppm kontrollnál
(sötétben
3,16g;
fényen
3,57g)
szemikarbazid kezelés kivételével - rendelkezésre
magasabb friss súlyokat mértünk sötétben (3,58g)
álló minták feldolgozásával, hasonlóan a dimedon
és fényen (4,42g) egyaránt (89/A. és 106/A.
kezeléshez,
OPLC
technika
segítségével ábrák). Fényen a legtöbb esetben kissé magasabb
meghatároztuk a szövetek endogén HCHO friss súlyt mértünk, mint sötétben, azonban a 2 tartalmát (105. ábra). A kapott eredmények hetes kontroll szövetek mellett – hasonlóan a alapján
elmondható,
hogy
a
szemikarbazid dimedon kezeléshez - csupán a 6 hetes 10ppm
tartalmú táptalajokon nevelt D. innoxia hairy root szemikarbazidot szövetek HCHO tartalma, ha kis mértékben is, de fokozatosan
csökkent
a
kontroll
szövetek
tartalmazó
esetében
tértek
táptalajon el
nevelt
szignifikánsan
(345µg/g egymástól (89/A. és 106/A. ábrák).
liofilizált szövet) tenyészetekhez képest egészen a 100ppm szemikarbaziddal történt kezelésig. Az
6
Friss súly (g)
utóbbi esetben mért HCHO tartalom (286,4µg/g) ugyanakkor már szignifikáns mértékben kisebbnek bizonyult a kontroll értékénél (105. ábra).
5 4 sötétben
3
fényen 2
0
500
2
400
4
6
Tenyésztési ido (hét)
300 200
0.35
100
Szárazsúly (g)
HCHO tartalom (ug/g liofilizált szövet)
1
0 0
1
10
100
Tápközeg szemikarbazid tartalma (ppm)
0.3 0.25 0.2
sötét
0.15
fény
0.1 0.05 0
105. ábra D.innoxia # 410 hairy root klón szöveteinek endogén HCHO tartalma különbözo szemikarbazid tartalmú folyékony MS tápközegen, fényen nevelve, 4 hetet követoen.
2
4
6
Tenyésztési ido (hét) A B
106. ábra D.innoxia # 410 hairy root klón A 4 hetes kultúrák mellett – a dimedon szöveteinek friss súlya (A) és szárazsúlya (B) 2, 4 és 6 hetet követoen 10ppm szemikarbazidot alkalmazásához hasonlóan – részletesebben tartalmazó folyékony MS tápközegen. tanulmányoztuk a 2 és 6 hetes szöveteket is, meyek
szemikarbazid
mentes
és
10ppm A sötétben és fényen fejlodo szövetek szárazsúlya
szemikarbazidot tartalmazó táptalajon fejlodtek.
a 4. hétig nott szemikarbazid mentes tápközegen
A friss súlyok - melyek értékei növekedtek a 6 hét (sötétben alatt - 10ppm szemikarbazid alkalmazása mellett
0,18g;
fényen
0,24g),
10ppm
szemikarbazidot tartalmazó táptalajokon azonban
nem érték el jelentosen a kontroll szövetek még a 6. héten is jelentos szárazsúly gyarapodást esetében mért értékektol, a 6. héten azonban már a észleltünk (sötétben 0,24g; fényen 0,31g) (90/A. és
117
107/B. ábrák). A kultúrák szárazanyag tartalma szemikarbazid
hatására
elérte
és
7
Tápközeg pH
10ppm
meghaladta a kontroll szövetek esetében kapott értékeket, azonban utóbbiakhoz hasonlóan értéke a 4. hétre kis mértékben megnott, majd a 6. hétre
6 5 4
sötét
3
fény
2 1
lecsökkent sötétben és fényen egyaránt (91/A. és
0 2
107/A. ábrák).
4
6
Tenyésztési ido (hét)
A
10ppm
szemikarbaziddal
kezelt
szövetek
108. ábra D.innoxia # 410 hairy root klón szöveteinek tápközeg pH értékei 2, 4 és 6 hetet fényen 0,26) még nem érték el a kontroll követoen 10ppm szemikarbazidot tartalmazó tenyészeteknél kapott értékeket (sötétben 0,85; folyékony MS tápközegen. növekedési értékei 2 hét elteltével (sötétben 0,20;
fényen 2,08), a 4. és 6. hétre azonban (4 hét után sötétben és fényen 2,68 és 1,78; 6 hét után 3,02 és 5,34) elérték és meghaladták a kontroll szövetek
A tápközegek pH értéke – a kontroll szöveteknél mért értékekhez hasonlóan – fokozatosan nott a 2. és
a
6.
hét
között
10ppm
szemikarbazid
növekedését (4 hét után sötétben és fényen 2,86 és alkalmazása mellett, a kapott értékek pedig a 6. 1,60; 6 hét után 2,81 és 5,27) (92/A. és 107/B. hétre (sötétben pH 5,75; fényen pH 5,80) kissé
Szárazanyag tartalom (%)
ábrák)
meghaladták a szemikarbazid mentes táptalajban mért pH-kat (sötétben pH 5,12; fényen pH 5,42)
12
(93/A. és 108. ábrák).
10 8 sötét
6
fény 4
A
10ppm
szemikarbazidot
tartalmazó
MS
tápközegen, fényen nevelt szövetek hioszciamin, szkopolamin és apoatropin tartalma (0,63mg/g,
2 0 2
4
0,92mg/g, valamint 0,12mg/g) az átoltást követo 2.
6
hétre fényen jelentosen meghaladta a sötétben
Tenyésztési ido (hét)
fejlodo szövetekben mért értékeket (0,41mg/g, Növekedési érték
7
0,30mg/g, valamint 0,04mg/g), a 6. hétre azonban
6
a
5 4
sötét
3
fény
2
sötétben
Adataink
0 2
4
Tenyésztési ido (hét)
kultúrák
hioszciamin
és
szkopolammin tartalma volt magasabb (0,92mg/g, 0,59mg/g,
1
nevelt valamint
alapján
0,14mg/g) a
10ppm
(109.
ábra).
szemikarbazidot
6
tartalmazó táptalajon, fényen, 2 hét elteltével a szkopolamin tartalom felülmúlta a szövetek
A
hioszciamin tartalmát, más esetekben azonban a 107. ábra D.innoxia # 410 hairy root klón hioszciamin volt a foalkaloid (109. ábra). A szöveteinek szárazanyag tartalma (A) és növekedési értékei (B) 2, 4 és 6 hetet követoen 10ppm szemikarbaziddal kezelt szövetek alkaloid 10ppm szemikarbazidot tartalmazó folyékony MS tartalma ugyanakkor nem érte el a 2-6 hetes tápközegen. B
118
kontroll szövetekben mért értékeket (93. és 109. 0.3
Alkaloid produkció (mg/kultúra)
ábrák). A táptalajban lévo 10ppm szemikarbazid hatására a 6. hét végéig fokozatosan nott a szövetek tropán alkaloid produkciója. A dimedon alkalmazásával ellentétben, szemikarbazid hatására nem tért el jelentosen
a
tenyészetek
tropán
0.25
0.2
hioszciamin 0.15
szkopolamin apoatropin
0.1
0.05
alkaloid
0 2
produkciója sötétben és fényen (110. ábra). A 6.
4
6
Tenyésztési ido (hét)
hétre ugyanakkor mind a sötétben (0,23mg hioszciamin, 0,15mg szkopolamin és 0,03mg mid
pedig
a
Alkaloid produkció (mg/kultúra)
apoatropin/liofilizált kultúra),
0.3
fényen nevelt kultúrák (0,23mg hioszciamin,
Alkaloid tartalom (mg/g)
0,21mg
1.4
szkopolamin apoatropin
0.1
0.05
2
4
6
Tenyésztési ido (hét)
1 hioszciamin 0.8
A
szkopolamin
0.6
apoatropin
0.2
4
B
110. ábra D.innoxia # 410 hairy root klón szöveteinek alkaloid produkciója 2, 4 és 6 hetet követoen 10ppm szemikarbazid tartalmú folyékony MS tápközegen sötétben (A) és fényen nevelve (B).
0.4
6
Tenyésztési ido (hét)
Alkaloid tartalom (mg/g)
hioszciamin 0.15
0
2
szkopolamin
1.4
és
0,06mg
apoatropin/liofilizált
kultúra) alkaloid produkciója – a sötétben nevelt
1.2 1 hioszciamin 0.8
szkopolamin
0.6
apoatropin
szövetek szkopolamin produkciójának kivételével – elérte, vagy meghaladta a megfelelo korú, kontroll szövetekben kapott értékeket (sötétben
0.4 0.2
0,21mg hioszciamin, 0,20mg szkopolamin és
0 2
4
6
Tenyésztési ido (hét)
B
0.2
1.2
0
A
0.25
0,03mg
apoatropin/liofilizált
kultúra,
fényen
0,24mg hioszciamin, 0,22mg szkopolamin és 0,06mg apoatropin/liofilizált kultúra) (94. és 110.
109. ábra D.innoxia # 410 hairy root klón ábrák). szöveteinek alkaloid tartalma 2, 4 és 6 hetet követoen 10ppm szemikarbazid tartalmú Összefoglalva a szemikarbazid D. innoxia # 410 folyékony MS tápközegen sötétben (A) és fényen hairy root klón növekedésére gyakorolt hatását nevelve (B). elmondhatjuk, hogy a vegyület – a dimedonnal
119
ellentétben
–
bizonyos
koncentrációkban
határozottan serkenti a szövetek fejlodését. Az 1ppm
szemikarbazid
hatására
szignifikáns
mértékben nott a tenyészetek friss súlya és a számított
növekedési
(utóbbi
érték
csupán
sötétben), 100ppm és 1000ppm szemikarbazid azonban egyértelmuen gátolta a szövetek fejlodését (100/A. és 101/A. ábrák). Az alkaloid tartalom (sötétben 10ppm és 100ppm kivételével) és alkaloid produkció alakulására nem
volt
alkalmazása,
pozitív
hatással
mivel
az
a
értékek
szemikarbazid fokozatosan
csökkentek az 1000ppm táptalaj szemikarbazid tartalomig (102-104. ábrák). 4.3.6.3. A dimedonnal és szemikarbaziddal kezelt A
hairy root kultúrák szövettani vizsgálata
B
- A szövetek HE festése
111. ábra 4 hetes, dimedon tartalmú folyékony A dimedont és a szemikarbazidot tartalmazó MS tápközegen, fényen nevelt D. innoxia hairy root kultúrákból (# 410 klón) készült metszetek, HE táptalajokon nevelt D. innoxia # 410 hairy root klón festést követoen (A: 10ppm dimedon a szöveteinek vizsgálata során, a HE festést tápközegben, 400x –os nagyítás; B: 1000ppm dimedon a tápközegben, 400x –os nagyítás. a: követoen – a kontroll szövetekkel elle ntétben – rhizodermisz, b: gyökérszorök, c: hipodermisz, d: nagy számban sikerült megfigyelni a sejtmagokat, kéregparenchima, g:edények hálózatos és vermesgödörkés sejtfalvastagodással). melyek azonban nem mutatták az apoptotikus folyamatokra jellemzo morfológiai változásokat (pl. a sejtmag zsugorodása) (111. és 112. ábrák).
120
szemikarbazid
mentes
folyékony
MS
alaptápközegen nevelt hairy root-ok felépítésétol sem a sötétben, sem pedig a fényen történt tenyésztés után (111. és 112. ábrák).
HISZTOKÉMIAI DRAGENDORFF ALKALMAZÁSÁVAL A
dimedon,
vagy
VIZSGÁLATOK REAGENS
szemikarbazid
tartalmú
tápközegen (sötétben és fényen) nevelt hairy root szövetek
között
felépítéshez
–
–
hasonlóan
az
alkaloidok
a
szövettani lokalizációja
tekintetében sem észleltünk különbségeket (113. ábra). Az 1000ppm szemikarbazid és 1000ppm dimedon kezelések
kivételével
szövetek mindegyikében sikerült
a
vizsgált
alkaloidokat
kimutatni, a
A
B C
112. ábra 4 hetes, szemikarbazid tartalmú folyékony MS tápközegen nevelt D. innoxia hairy root kultúrákból (# 410 klón) készült metszetek, HE festést követoen (A: 10ppm szemikarbazid a tápközegben, fényen, 200x –os nagyítás; B: 10ppm szemikarbazid a tápközegben, fényen, 200x –os nagyítás; C:1ppm szemikarbazid a tápközegben, sötétben, 100x –os nagyítás. a: rhizodermisz, b: gyökérszorök, c: hipodermisz, d: kéregparenchima, e: fanyalábok , f: háncsnyalábok , g: edények
hálózatos és sejtfalvastagodással).
vermes-gödörkés
A
B
113. ábra 4 hetes, folyékony MS tápközegen nevelt D. innoxia hairy root kult úrákból (# 410 A szövetek morfológiailag – a sejtmagok jelenlétét klón) készült metszetek, Dragendorff reagenssel történt hisztokémiai reakciót követoen (100x –os kivéve - nem különböztek a dimedon és nagyítás, A: 10ppm dimedon a tápközegben,
121
fényen és B: 100ppm tápközegben, sötétben). csapadékkristályok
szemikarbazid
elhelyezkedése
a
pedig
megegyezett az in vitro gyökereknél és kezeletlen hairy root-oknál megfigyeltekkel, tehát a sejtfal közelében, rhizodermisz
leggyakrabban és
a
kéregparenchima
hipodermisz
közelében
elhelyezkedo sejtjeiben, valamint a háncs- és fanyalábok
közelében
található
parenchima
sejtekben helyezkedtek el (113. ábra). - TUNEL rekació alkalmazása az apoptotikus sejtmagok kimutatására Annak igazolására, hogy a HE festést követoen megfigyelheto jellegzetes morfológiai változások (pl. sejtmeg zsugorodása) hiánya az apototikus folyamatok elmaradását jelzi, a kontroll kultúrák mellett a dimedonnal, vagy szemikarbaziddal kezelt szövetek esetében is elvégeztük a TUNEL reakciót. Ennek eredménye alátámasztotta, hogy a kezelt (dimedon, vagy szemikarbazid) szövetekben
A
nem lehet apoptotikus sejtmagokat kimutatni (114.
B C
ábra). 114. ábra 4 hetes, folyékony MS tápközegen nevelt D. innoxia hairy root kultúrákból (# 410 klón) készült metszetek, TUNEL reakciót követoen (A: 1000ppm dimedon a tápközegben, sötétben, 200x –os nagyítás; B: 1ppm dimedon a tápközegben, sötétben, 200x –os nagyítás; C:1000ppm szemikarbazid a tápközegben, fényen, 200x –os nagyítás. a: rhizodermisz, c: hipodermisz, d: kéregparenchima, e: fanyalábok , f: háncsnyalábok , g: edények hálózatos és vermesgödörkés sejtfalvastagodással). 4.3.6.4. Terápiában alkalmazott vegyületek hatása D. innoxia hairy root szövetek fejlodésére és alkaloid termelésére Tanulmányoztuk néhány, terápiában alkalmazott vegyület hatását D. innoxia # 410 hairy root klón
122
növekedésére és tropán alkaloid termelésére. 20
Kísérleteinkhez az aminoguanidint – melyet a Szárazanyag tartalom (%)
18
cukorbetegség terápiájában alkalmaznak -, illetve a vérnyomáscsökkento hatású hidralazint
(1-
hidrazino-ftalazin) választottuk.
16 14 12 10 8 6 4 2
- Az aminoguanidin hatása
0 0
1
10
100
1000
Tápközeg aminoguanidin tartalma (ppm)
A kultúrák folyékony MS alaptápközegéhez – a dimedon és szemikarbazid kezeléshez hasonlóan – 8
1ppm, 10ppm, 100ppm és 1000ppm aminouanidint adagoltunk, majd a sötétben tenyésztett szövetek
Növekedési érték
6
növekedési jellemzoit és tropán alkaloid termelését 4
hét
elteltével
szárazanyag
vizsgáltuk.
tartalma
csak
A kis
szövetek
2
mértékben
változott az emelkedo aminoguanidin tartalommal összefüggésben
(115/A.
ábra).
A
4
0 0
kontroll
tenyészetekhez viszonyítva 1ppm és 10ppm
1
10
100
1000
Tápközeg aminoguanidin tartalma (ppm)
A B
aminoguanidin hatására nem változott szignifikáns
115. ábra A tápközeg aminoguanidin tartalmának mértékben a százalékos szárazanyag tartalom hatása D. innoxia # 410 hairy root klón szárazanyag tartalmára (A) és növekedési értékére (B) (4 hetet (8,88% és 9,92%), 100ppm alkalmazását követoen követoen, sötétben tenyésztve). azonban jelentosebben, 11,81%-ra nott, 1000ppm aminoguanidin hatására pedig nagyobb mértékben, A szövetek növekedési értékei ezzel szemben 7,88%-ra csökkent (115/A. ábra).
jellegzetes
eltérést
mutattak.
A
kontroll
tenyészetekhez (4,26) viszonyítva 1ppm és 10ppm aminoguanidin alkalmazását követoen (7,24 és 6,25) jelentosen megnottek a hairy root kultúrák növekedési értékei, majd 100ppm és 1000ppm hatására hirtelen lecsökkentek (3,58 és 0,06) (115/B.
ábra).
A
100ppm
aminoguanidin
adagolását követoen a szövetek növekedési értéke még megközelítette a kontroll tenyészeteknél kapott
értéket,
1000ppm
hatására
azonban
csaknem teljesen megszunt a kultúrák növekedése (115/B. ábra). A szövetek tropán alkaloid tartalmának HPLC vizsgálata azt mutatta, hogy a hioszciamin, szkopolamin és apoatropin tartalom a 10ppm és
123
100ppm aminoguanidint tartalmazó táptalajokon 2.5 Alkaloid tartalom (mg/g)
jelentosen meghaladja az egyéb szövetekben mért értékeket (116. és 117/A. ábrák). Az 1ppm aminoguanidin tenyészetek
alkalmazását növekedési
követoen
értékei
a
jelentosen
felülmúlták a kontroll kultúráknál kapott értékeket
2
szkopolamin 1
(0,47mg/g
hioszciamin,
apoatropin
0.5 0
(115/A. ábra), de elobbiek tropán alkaloid tartalma
hioszciamin
1.5
0
1
10
100
1000
Tápközeg aminoguanidin tartalma (ppm)
0,460g/mg
szkopolamin és 0,13mg/g apoatropin) alatta maradt a kontroll szövetekének (0,73mg/g hioszciamin, Alkaloid produkció (mg/kultúra)
0.8
0,60mg/g szkopolamin és 0,25mg/g apoatropin) (117/A. ábra).
0.7 0.6 0.5
hioszciamin
0.4
szkopolamin apoatropin
0.3 0.2 0.1 0 0
1
10
100
1000
Tápközeg aminoguanidin tartalma (ppm)
A B
117. ábra A tápközeg aminoguanidin tartalmának hatása D. innoxia # 410 hairy root klón tropán alkaloid tartalmára (A) és alkaloid produkciójára (B) (4 hetet követoen, sötétben tenyésztve). A
10-1000ppm
aminoguanidin
hatására
csökkentek ugyan a számított növekedési értékek (117/A. ábra), ezzel párhuzamosan azonban a tenyészetek hioszciamin és szkopolamin tartalma jelentosen megnott (1,53-1,68mg/g hioszciamin, 1,07-1,25mg/g
A B
szkopolamin
és
0,21mg/g
apoatropin) (117/A. ábra). A szövetek hioszciamin
116. ábra A tropán alkaloid tartalom meghatározásához, D. innoxia # 410 hairy root klón felhasználásával készült kivonatok HPLC kromatogramja (4 héten át sötétben tenyésztve, A: aminoguanidin mentes MS tápközegben és B: 100 ppm aminoguanidin a tápközegben).
és szkopolamin tartalma még 1000ppm tápközeg aminoguanidin alkalmazása mellett is (0,47mg/g és 0,41mg/g) csaknem elérte az 1ppm aminoguanidin esetében kapott értékeket (117/A. ábra). A szárazsúlyra vonatkoztatott alkaloid produkció értékei
megfeleltek
az
alkaloid
tartalom
meghatározásánál kapott eredményeknek (117/B. ábra). A legnagyobb értékeket a 10ppm és
124
100ppm aminoguanidin tartalmú tápközegben 20
fejlodo szövetekben mértük (0,40mg hioszciamin, szkopolamin,
valamint
Szárazanyag tartalom (%)
0,26mg
18
0,34mg
hioszciamin és 0,28mg szkopolamin/liofilizált kultúra), mely esetekben – az alkaloid tartalom alakulásának produkció
megfeleloen szignifikánsan
–
a
hioszciamin
meghaladta
16 14 12 10 8 6 4 2 0
a
0
1
10
100
1000
Tápközeg hidralazin tartalma (ppm)
szkopolamin produkció értékeit (117/B. ábra). - A hidralazin hatása 8
Az aminoguanidinhez hasonlóan tanulmányoztuk a Növekedési érték
hidralazin sötétben, MS folyékony tápközegben 4 héten át nevelt D. innoxia # 410 hairy root klón növekedésére és tropán alkaloid termelésére gyakorolt hatásait.
6
4
2
0
A szövetek szárazanyag tartalma – szemben az
0
1
10
100
1000
Tápközeg hidralazin tartalma (ppm)
aminoguanidin esetében tapasztaltakkal – kis mértékben
csökkent
a
tápközeg
hidralazin
A B
tartalmának emelésével, 1000ppm alkalmazását 118. ábra A tápközeg hidralazin tartalmának hatása D. innoxia # 410 hairy root klón szárazanyag követoen viszont a kontroll értékének (9,1%) közel tartalmára (A) és növekedési értékére (B) (4 hetet követoen, sötétben tenyésztve). kétszeresére nott (16,8%) (118/A. ábra). A szárazsúlyra vonatkoztatott növekedési értékek – hasonlóan az aminoguanidin kezeléshez – alacsony tápközeg hidralazin tartalom mellett megnottek, ez azonban csupán 1ppm hidralazin hatására következett be (118/B. ábra). 10ppm és 100ppm hidralazin hatására fokozatosan csökkent, majd 1000ppm alka lmazását követoen teljes mértékben leállt a szövetek növekedése (118/B. 119. ábra A tropán alkaloid tartalom meghatározásához, D. innoxia #410 hairy root klón készült kivonat HPLC A szövetek hioszciamin, szkopolamin és felhasználásával kromatogramja (4 héten át sötétben tenyésztve, apoatropin tartalma – hasonlóan az 100 ppm hidralazin a tápközegben). aminoguanidin esetében észleltekhez - 10ppm és 100ppm hidralazint tartalmazó táptalajokon hioszciamin, 1,04-1,41mg/g szkopolamin és ábra).
(2,00-2,35mg/g
0,31mg/g apoatropin) jelentosen meghaladta az egyéb szövetekben mért értékeket (119. és 120. ábrák).
125
Az 1ppm hidralazin alkalmazását követoen a követoen is megfeleltek az alkaloid tartalom tenyészetek növekedési értékei ebben az esetben is meghatározásánál kapott eredményeknek (120/B. jelentosen felülmúlták a kontroll kultúráknál kapott
ábra). A legnagyobb értékeket a 10ppm és
értékeket (118/B. ábra), ugyanakkor elobbiek 100ppm hidralazin tartalmú tápközegben fejlodo tropán alkaloid tartalma alatta maradt a kontroll
szövetekben mértük (0,47-0,70mg hioszciamin,
szövetekben mért értékeknek (120/A. ábra). A 10-
0,21-0,42mg
1000ppm hidralazin hatására csökkentek ugyan a
apoatropin/kultúra), mely esetekben – az alkaloid
szkopolamin
és
0,07-0,09mg
számított növekedési értékek (118/B. ábra), a tartalom alakulásának megfeleloen – a hioszciamin tenyészetek hioszciamin és szkopolamin tartalma
produkció
mégis jelentosen megnott (120/A. ábra). A
szkopolamin produkció értékeit. Az aminoguanidin
szövetekben
1000ppm
tápközeg
szignifikánsan
meghaladta
hidralazin kezeléssel szemben az 1000ppm
a
hidralazint
tartalom mellett csupán nyomokban sikerült tropán tartalmazó MS tápközegben nevelt szövetek 4 hét alkaloidokat kimutatnunk (120/A. ábra).
elteltével gyakorlatilag nem termeltek tropán alkaloidokat (120/B. ábra).
Alkaloid tartalom (mg/g)
2.5 2 hioszciamin
1.5
szkopolamin 1
apoatropin
0.5 0 0
1
10
100
1000
Tápközeg hidralazin tartalma (ppm)
Alkaloid produkció (mg/kultúra)
0.8 0.7 0.6 0.5
hioszciamin
0.4
szkopolamin apoatropin
0.3 0.2 0.1 0 0
1
10
100
1000
Tápközeg hidralazin tartalma (ppm)
A
B
120. ábra A tápközeg hidralazin tartalmának hatása D. innoxia # 410 hairy root klón tropán alkaloid tartalmára (A) és alkaloid produkciójára (B) (4 hetet követoen, sötétben tenyésztve). A
szárazsúlyra
vonatkoztatott
alkaloid
produkciós értékek a hidralazin alkalmazását
126
A
B
C
D
E
F
127
48. ábra Apoptotikus folyamatok kimutatása D. innoxia kalluszszövetekben (sötétben nevelve, 6 hetet követoen, 200x nagyítás). A és B: kontroll szövetek (0ppm dimedon), C és D: 100ppm dimedon a tápközegben, E és F: 1000ppm dimedon a tápközegben (a: jellegzetes, apoptotikus folyamatokra utaló zsugorodott sejtmagok). A, C és E: HE festés. B, D és F: TUNEL reakció, a: apoptotikus sejtmagok.
5. EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA ÉS TÁRGYALÁSA Munkánk során vizsgáltuk a gyógyászati szempontból fontos tropánvázas alkaloidokat szintetizáló Datura innoxia Mill. in vitro kultúrák növekedési sajátosságait, valamint univerzális és speciális anyagcseréjét. A D. innoxia tropánvázas alkaloidjai (szkopolamin és hioszciamin) paraszimpatolitikus hatásúak, így széles körben alkalmazzák oket, pl. a szemészetben, szívbetegségek és gyomorbélrendszeri panaszok esetén, továbbá a mutéti elokészítésben. A genetikailag nem módosított és géntranszformált in vitro kultúrák szövettani- , illetve növekedési jellemzoi mellett részletesen vizsgáltuk a szövetek hioszciamin, szkopolamin és apoatropin termelését a különbözo tenyésztési feltételek (sötét és fény, tápközeg összetételének módosítása) mellett. A tropán alkaloidok bioszintézis során alapveto szerepe van a transzmetilezési és oxidációs/redukciós reakcióknak, tová bbá a folyamat szorosan kapcsolódik a – különbözo stresszhatások leküzdésében is szerepet játszó – poliaminok képzodéséhez is. Az alkaloidok lebontását vizsgálva ugyanakkor megállapították, hogy a hioszciamin és szkopolamin terápiás hatásainak kialakulásában lényeges a molekulákban található N-metil csoport jelenléte [50]. Számos kísérleti eredmény támasztja alá, hogy az endogén HCHO keletkezése a transzmetilezési, oxidációs/redukciós folyamatok alapveto jellemzoje a sejtek szövetek növekedése, valamint öregedése és pusztulása során, továbbá a különbözo biogén és abiogén stresszhatások alkalmával [184,185,189,194,202]. Ezzel összefüggésben részletesebben vizsgáltuk abiogén stresszhatások – a tápközegbe adagolt dimedon, szemikarbazid, vagy a humán terápiában is felhasznált aminoguanidin és hidralazin – D. innoxia in vitro szövetek növekedésére és tropán alkaloid termelésére gyakorolt hatását. Néhány esetben meghatároztuk a kultúrák endogén HCHO tartalmát, továbbá – az elvégzett szövettani vizsgálatokkal párhuzamosan – tanulmányoztuk a programozott sejthalál egyes részfolyamatait (sejtmagok zsugorodása, DNS fragmentálódás TUNEL reakció alkalmazásával) az általunk vizsgált növényi szövetekben. 5.1. D. innoxia IN VITRO KULTÚRÁK VIZSGÁLATA Kísérleteink során a D. innoxia különbözo in vitro kultúráit használtuk fel. Minden esetben részletesen vizsgáltuk a tenyészetek növekedését és – amennyiben erre lehetoség volt – tropán alkaloid termelését.
In vitro növénykultúrák
A különbözo szövetkultúrák létrehozásához felhasznált, steril magokból eloállított és vegetatív mikroszaporítással fenntartott D. innoxia in vitro növénykultúrák jól fejlodtek a szilárd S - Capantotenátot és kazein -hidrolizátumot is tartalmazó MS [110] - táptalajon. A friss táptalajon a levél
nélküli hajt ásdarabokból egészséges hajtások és gyökerek fejlodtek, utóbbiak klorofill tartalmuk miatt zöldes színuek voltak. A 8 hetes hajtásokban csupán az apoatropint sikerült mérheto mennyiségben kimutatni. Az azonos korú gyökerekben ezzel szemben sikerült meghatározni a hioszciamin, szkopolamin és apoatropin tartalmat is. A kapott eredmények alapján megállapítottuk, hogy az általunk vizsgált in vitro növények hajtásának és gyökerének tropán alkaloid tartalma (a gyökerekben 3,0‰ hioszcaimin és 1,04‰ szkopolamin, szárazsúlyra vonatkoztatva) jelentosen elmarad az in vivo növényekétol (0,05%0,5%) [5,6]. A D. innoxia in vitro kultúrák gyökereinek szövettani vizsgálata céljából metszeteket készítettünk a fiatal gyökerek felhasználásával, melyeket HE festést követoen vizsgáltuk. A hajtástól elválasztott és megfeleloen fixált, 8. hetes gyökereket használtuk fel, melyek szöveti felépítése megfelelt a fiatal gyökerekrol leírtaknak [302]. A rhizodermisz alatt több metszetben egy sejtsoros, vastagabb falú, tág lúmenu sejtekbol álló hipodermiszt, majd a kéregparenchima sejtjeit figyeltünk meg. A kéreghatár nehezen felismerheto, a központi hengerben háncs- és fanyalábok különíthetok el. Az edények hálózatos, vermes gödörkés sejtfal vastagodásúak. Az alkaloidok szöveteken, sejteken belüli lokalizációját Dragendorff reagens alkalmazásával vizsgáltuk. A D. innoxia in vitro növények gyökereiben sikerült kimutatni alkaloidok jelenlétére utaló sárgásbarna, kristályos csapadékot. A csapadékkristályok – az irodalmi adatokkal összhangban [307] minden esetben a sejtfal közelében fordultak elo, leggyakrabban a kéregparenchima rhizodermisz és hipodermisz közelében elhelyezkedo sejtjeiben, valamint a háncs- és fanyalábok közelében található parenchima sejtekben. A HE festést követoen néhány esetben jellegzetesen zsugorodott, kompakt, sötétebben festodo sejtmagokat figyeltünk meg, melyek jelenléte apoptotikus folyamatokra engedett következtetni. Ennek bizonyítására TUNEL reakciót végeztünk, melynek segítségével az apoptózis során keletkezo, meghatározott méretu DNS fragmentumok in situ detektálhatók. Az in vitro gyökerekben TUNEL reakció elvégzését követoen sikerült szelektíven kimutatnunk az apoptotikus sejtmagokat, melyeket jellemzoen a rhizodermiszben, a hipodermiszben és a kéregparenchima külso sejtjeiben, valamint a háncs- és fanyalábok sejtjeiben találtunk.
Kallusz tenyészetek
A D. innoxia in vitro növények hajtásán képzodött kalluszszöveteket kinetin és 2,4-D tartalmú szilárd AMS táptalajon tartottuk fenn, sötétben és fényen. A sötétben nevelt szövetek sárgásfehér, illetve világos barna színuek, majd a 7-8. hét után sötétbarnává váltak a szövetek öregedésével párhuzamosan. A fényen fenntartott szövetek klorofill tartalmuk miatt világoszöldek voltak, mely szín
csupán kis mértékben mélyült a tenyészetek öregedésével. A sötétben és fényen nevelt szövetek fejlodését összehasonlítva elmondható, hogy utóbbiak hosszabb idon át megorizték életképességüket. Mind a sötétben, mind pedig a fényen nevelt szövetek egyenletesen fejlodtek a 6. hét végéig , friss súlyuk mintegy 14-16-szorosára (szárazsúlyuk kb. ötszörösére) nott. A fényen tenyésztett kultúrák friss súlya már a második hét után jelentosen meghaladta a sötétben nevelt szövetekét, és az eltérés – ha kisebb mértékben is – egészen a vizsgált 6 hetes idotartam végéig megmaradt. A kalluszszövetek szövettani vizsgálata céljából készített metszeteket HE festést követoen vizsgáltuk. A sötétben és fényen nevelt, 6 hetes kalluszszövetek mikroszkópos tanulmányozását a megfeleloen elokészített (fixált, dehidrált és beágyazott) szövetek felhasználásával végeztük el. A sötétben és fényen tenyésztett szövetek között nem észleltünk morfológiai eltérést, a sejtek parenchimatikusak voltak, szöveti differenciálódás jeleit nem mutatták. Kisebb sejtekbol álló, jól festodo sejtmagokat tartalmazó sejtcsoportok minden metszetben megfigyelhetok voltak. A kalluszszövetekben HE festést követoen észlelt, jellegzetesen zsugorodott sejtmagok a TUNEL reakció elvégzése után szelektíven festodtek, mely igazolta az apoptotikus folyamatok lezajlását ezekben a sejtekben. Az apoptotikus sejtek megoszlása nem volt egyenletes a szöveteken belül, a TUNEL pozitív sejtmagok száma a tenyészet felszínéhez közeli 10-20 sejtrétegben magasabb volt (a sejteknek akár 30%-a), míg arányuk a mélyebben található sejtrétegek felé haladva gyorsan csökkent.
Géntranszformált gyökérkultúrák
A D. innoxia in vitro növények hajtásának A. rhizogenes A4 törzzsel történt fertozését követoen számos géntranszformált, ún. hairy root-ot nyertünk, melyekbol több klónt állítottunk elo. A szövetek géntranszformált sajátságai, fejlodése és alkaloid tartalma szempontjából 3 klónt #( 410, # 411 és # 415) vizsgáltunk részletesebben. Az A. rhizogenes A4-bol származó tDNS növényi genomban történo kimutatására és muködésének igazolására számos lehetoség kínálkozik [128,135-141]. A tDNS meghatározott szakaszának (rolB gén bizonyos szekvenciáinak) D. innoxia # 410 hairy root klón szöveteinek sejtjeiben történo kimutatására PCR technikát alkalmaztunk. Negatív (D. innoxia in vitro növény gyökere) és pozitív (A. rhizogenes A4 plazmid DNS állomány) kontrollok jelenlétében igazoltuk a megfelelo rolB szekvenciák jelenlétét a vizsgált klón sejtjeiben. A tDNS növényi sejtben történo muködését a transzformált növényi sejtekben termelt és az Agrobacterium-ok által felhasznált speciális anyagcseretermékek, az ún. opinok kimutatásával bizonyítottuk. Papír elektroforézist követoen mindhárom hairy root klónban (# 410, # 411 és # 415) kimutattunk opin molekulákat. A # 410 és # 411 klónok agropint (Rf = 0,56) és agropinsavat (Rf = 0,25), továbbá az azonos Rf értékekkel jelentkezo mannopint és mannopinsavat (Rf = 0,46) egyaránt
tartalmaztak, a # 415 klón szöveteiben azonban kiemelten az agropinsavat sikerült kimutatni, mely opinok mindegyike jellemzo az A. rhizogenes A4 törzzsel fertozött növényi szövetekre [128]. Fenti módszerekkel egyértelmuen bizonyítottuk, hogy a vizsgált hairy root klónok bakteriális géneket tartalmaznak, melyek az opinok termelése révén megfeleloen muködnek a D. innoxia sejtekben. A sötétben és fényen tenyésztett klónok fejlodését vizsgálva megállapítottuk, hogy a friss súlyok értéke az átoltást követo 2. héttol az 5. hétig növekedett. Fényen – a kallusz tenyészetekhez hasonlóan – magasabb friss súlyokat mértünk. A szövetek szárazanyag tartalma nem tért el jelentosen sötétben és fényen; az átoltást követoen megnott a szárazanyag tartalom, majd a kultúrák fejlodésével párhuzamosan értéke lecsökkent. A klónok növekedési értékei folyamatosan nottek sötétben és fényen egyaránt, az értékek pedig nem tértek el egymástól jelentosebben. A tápközegek pH értéke – az irodalmi adatoknak megfeleloen [71] - az átoltást követoen hirtelen csökkent, majd a 6. hét végéig fokozatosan, a kezdeti pH 5,7-et is meghaladóan emelkedett. Ennek oka lehet egyrészt a szövetek tápanyag felvétele, valamint egyes anyagcseretermékek, így pl. a tropán alkaloidok tápközegbe történo kiválasztása [71]. A kapott pH értékek alapján elmondhatjuk, hogy a fényen nevelt szövetek tápközegében egyértelmuen magasabb pH értékeket mértünk a 6 hetes tenyésztési idoszak egésze alatt, mindhárom vizsgált klón esetében. A szövetek fejlodését összefoglalva megállapítottuk, hogy a D. innoxia # 410, # 411 és # 415 hairy root klónok fejlodése nem tért el jelentosen egymástól. A fényen nevelt szövetek esetében – különösen a 3. hetet követoen – magasabb friss súlyokat mértünk, mely kisebb szárazanyag tartalommal párosult, a táptalajok pH értéke pedig már az átoltást követo 1. héttol felülmúlta a sötétben nevelt szöveteknél kapott adatokat. A hairy root klónok tropán alkaloid (hioszciamin, szkopolamin és apoatropin) termelését HPLC technika segítségével vizsgáltuk. Az alkaloid tartalom meghatározása azt mutatta, hogy a különbözo klónok között – a szövetek fejlodésével ellentétben - jelentos eltérések észlelhetok. A #410 klón hioszcaimin foalkaloidot tartalmaz, melybol a 4 hetes szövetekben mértünk a legnagyobb mennyiségben, sötétben (0,20%, szárazsúlyra vonatkoztatva-) és fényen (0,21%) egyaránt. Az apoatropin tartalom jelentosen elmaradt az elobb említett tropán alkaloidokhoz képest (általában 0,01-0,02%), és mennyisége csupán a 5-6. hétre csökkent jelentosebben a hioszciamin és szkopolamin tartalom visszaesésével párhuzamosan. Az elvégzett mérések azt mutatták, hogy a # 411 klón kisebb hioszciamin tartalommal rendelkezik sötétben (0,11%) és fényen (0,01%) egyaránt, ezek az értékek azonban a sötétben nevelt szövetek esetében (0,17%) a #410 klónban mérthez hasonló szkopolamin tartalommal párosultak. A fényen nevelt kultúrák is a hioszciaminnál nagyobb mennyiségu szkopolamint tartalmaztak (a 2. héten 0,12%) egészen az alkaloid tartalom 6. hétre történt csökkenéséig, így eredményeink azt igazolták,
hogy a # 411 klón egyértelmuen szkopolamint tartalmaz foalkaloidként. A # 411 klón apoatropin tartalma a # 410 klónhoz hasonlóan, 0,01-0,02% között alakult. A # 410 klónhoz hasonlóan hioszciamin foalkaloidos # 415 klón esetében jelentosen eltért a sötétben és fényen nevelt szövetek alkaloid tartalmának alakulása. A hioszciamin és szkopolamin tartalom csökkent a tenyésztési idovel és csupán a 5-6. héten növekedett ismét. A legnagyobb hioszciamin (0,23%) és szkopolamin tartalmat (0,13%) a 6. héten mértük sötétben. A fényen nevelt kultúrákban a 3. és 5. héten mértünk nagyobb hioszciamin (0,18-0,19%) és szkopolamin (0,11%) tartalmat, de a 6. hétre az értékek már csökkentek. Az alkaloid produkciós értékek azt mutatták, hogy a fényen nevelt kultúrák – nagyobb biomassza produkciójuk révén – a sötétben tenyésztett szövetekhez hasonló, vagy kisebb alkaloid tartalmuk ellenére nagyobb mennyiségu tropán alkaloidot képesek eloállítani. A legnagyobb hioszciamin és szkopolamin produkciót sötétben a # 415 klón 6 hetes szöveteiben (0,63mg és 0,37mg/kultúra), míg fényen a # 410 klón 3 és 4 hetes kultúráiban kaptuk (3 hét után 0,60mg szkopolamin, valamint 4 hét után 0,77mg hioszciamin/kultúra). A vizsgált D. innoxia hairy root klónok (# 410, # 411 és # 415) alkaloid tartalmát és produkciós értékeit figyelembe véve megállapítottuk, hogy a # 410 és # 415 klónok hioszciamin, míg a # 411 klón szkopolamin foalkaloidot tartalmaz. Eredményeink azt jelzik, hogy a véletlenszeru bakteriális tDNS beépülés eredményeként kialakuló, eltéro genetikai felépítésu klónok hasonló növekedési jellemzoi (pl. friss súly, szárazanyag tartalom) mellett nagy mértéku eltéréseket észlelhetok a kultúrák speciális anyagcseréjében, alkaloid termelésében. A fényen tenyésztett kultúrák alkaloid produkciója - a nagyobb biomassza produkció következtében - mindhárom klón esetében meghaladta a sötétben kapott értékeket, így ha a fényen történo tenyésztés nem is járt az alkaloid tartalom emelésével, közvetve növelte a szövetek tropán alkaloid produkcióját. A nagyobb tropán alkaloid produkció ugyanakkor – a tápközegbe kiválasztott alkaloidok révén – magyarázatot adhat a fényen mért magasabb tápközeg pH értékekre. Bár a sötétben nevelt szövetek közül a # 415 klón hioszciamin és szkopolamin tartalma volt a legnagyobb, a fényen kapott eredmények, továbbá az egyenletesebb alkaloid termelés alapján a # 410 klónt választottuk további kísérleteinkhez. A 4 hetes D. innoxia #410 hairy root klón szöveteibol készült metszetek HE festést követo mikroszkópos vizsgálata során – az in vitro növények gyökereihez hasonlóan – a fiatal gyökerekre jellemzo szöveti felépítést figyeltük meg. A sötétben és a fényen nevelt szövetek között – a HE festés elvégzését követoen – nem tudtunk morfológiai különbségeket kimutatni. Érdekes módon az MS alaptáptalajon [110] nevelt szövetekbol készült metszetek sejtjeiben egyáltalán nem, vagy csupán nagyon kis számban tudtuk a sejtmagokat megfigyelni.
A vizsgált hairy root klón (# 410) szöveteiben Dragendorff reagens alkalmazását követoen sikerült kimutatni az alkaloidokat. A csapadékkristályok elhelyezkedése teljes mértékben megegyezett a D. innoxia in vitro növény gyökereinél leírtakkal. 5.2. A TÁPKÖZEG ÖSSZETEVOINEK HATÁSA A HAIRY ROOT TENYÉSZETEKRE A tápközeg összetételének D. innoxia # 410 hairy root klón szöveteinek növekedésére és hioszciamin, szkopolamin, valamint apoatropin termelésére gyakorolt hatását az MS táptalaj [110] szacharóz és MgSO 4 tartalmának módosítását követoen vizsgáltuk.
Szacharóz hatása
A szacharóz, mint szerves szénforrás alapveto összetevoje a táptalajoknak. Számos kísérleti eredmény támasztja alá, hogy a táptalaj szacharóz tartalma nem csupán különbözo Solanaceae fajokból eloállított in vitro kultúrák növekedését, hanem tropán alkaloid tartalmát és az alkaloidok egymáshoz viszonyított arányát befolyásolhatja jelentosen [97,105,156,161]. Az általunk részletesebben vizsgált 4 hetes D. innoxia # 410 hairy root klón szöveteit sötétben tenyésztettük 0-6% szacharózt tartalmaz folyékony MS tápközegen [110]. Az irodalmi adatoknak megfeleloen eltérést tapasztaltunk a szövetek növekedése szempontjából legkedvezobb, és a legmagasabb alkaloid tartalmat, illetve produkciót eredményezo szacharóz mennyiségek között. A szövetek friss súlya 1-2% szacharóz, míg szárazsúlya 2-6% szacharóz hatására volt magasabb. A tenyészetek szárazanyag tartalma egyértelmuen az általunk alkalmazott legmagasabb, 6%-os szacharóz tartalom mellett érte el a maximumát, mely a tápközeg hipertóniás viszonyaira és vízelvonó hatására utalhat [159,160]. Legnagyobb növekedési értéket a magas friss és szárazsúllyal rendelkezo, az MS alaptáptalajnak [110] megfelelo 2%-os szacharóz tartalom mellett kaptuk. A hioszciamin és szkopolamin tartalom (0,18% hioszciamin és 0,16% szkopolamin, szárazsúlyra vonatkoztatva), valamint produkció szempontjából 2-3% szacharóz bizonyult optimálisnak az általunk vizsgált 3 tropán alkaloid (hioszciamin, szkopolamin és apoatropin) egymáshoz viszonyított mennyiségét azonban nem befolyásolta jelentosen egyik vizsgált cukortartalom sem.
MgSO4 hatása
A különbözo tápközegek ásványi összetevoi között kiemelt szerepe van a Mg2+-nak, mivel alapveto élettani szerepet tölt be a sejtek univerzális és speciális anyagcsere folyamataiban [162]. A tápközeg Mg2+ tartalmának helyes megválasztása számos esetben bizonyult kedvezonek a különbözo in vitro szövetkultúrák növekedésére, az univerzális anyagcserére gyakorolt pozitív hatás azonban néhány
esetben a speciális anyagcseretermékek, így az alkaloidok mennyiségének alakulására kedvezotlennek bizonyult [161,167,168]. Kísérleteink során sötétben és fényen egyaránt vizsgáltuk, hogy a 2% szacharózt tartalmazó folyékony MS alaptápközeg [110] Mg2+ tartalma milyen hatással van a 4 hetes D. innoxia #410 hairy root klón fejlodésére és alkaloid termelésére. A legnagyobb friss súlyt sötétben az alaptápközegnek megfelelo 370mg/l, míg fényen a 740mg/l MgSO 4 tartalom mellett mértük. A szárazanyag tartalom mindkét esetben a legkisebb friss súllyal rendelkezo, 185mg/l MgSO 4 tartalmú táptalajon nevelt szövetek esetében volt a legnagyobb. A növekedési értékek 370mg/l MgSO4 tartalom mellett érték el a maximális értékeket sötétben és fényen egyaránt. Annak ellenére, hogy a szövetek fejlodése nem tért el jelentosen, a sötétben és fényen fenntartott kultúrák alkaloid tartalmának és produkciójának optimuma egyértelmuen eltért egymástól. Míg sötétben a 370mg/l MgSO4 bizonyult optimálisnak (0,054% hioszciamin és 0,049% szkopolamin, szárazsúlyra vonatkoztatva), fényen a 740mg/l MgSO4 tartalmú táptalajon fejlodo szövetek alkaloid tartalma (0,062% hioszciamin és 0,060% szkopolamin szárazsúlyra vonatkoztatva) és produkciós értékei voltak a legmagasabbak. Eredményeink azt jelzik, hogy az alkaloid tartalom és produkció szempontjából optimális MgSO 4 koncentrációktól való kis mértéku eltérés is jelentosen csökkenti a szövetek tropán alkaloid termelését. Az általunk vizsgált hairy root klón esetében a szövetek növekedési értéke (NÉ) és az alkaloid tartalom szempontjából optimális MgSO 4 koncentráció csupán a fényen nevelt szövetek esetében tért el egymástól. Bár a tenyészetek fejlodése (friss és szárazsúlyok, NÉ) nem tért el szignifikánsan sötétben és fényen, az alkaloid tartalom és produkció alakulása szempontjából elonyösebbnek bizonyult a fényen történo tenyésztés. 5.3. ABIOGÉN STRESSZ HATÁSA A KALLUSZ ÉS HAIRY ROOT KULTÚRÁKRA Az endogén HCHO transzmetilezési és oxidációs/redukciós reakciókban játszott alapveto szerepének, illetve a növényi sejtek univerzális és speciális anyagcseréjében betöltött funkcióinak jobb megismerése céljából több, az endogén HCHO tartalomra és azon keresztül a sejtek/szövetek anyagcseréjére (pl. szövetek fejlodése, öregedése, tropán alkaloid termelése) potenciálisan hatással bíró vegyületet vizsgáltunk meg. A vegyületeket – kontroll szövetek alkalmazása mellett – nagyobb koncentráció tartományban: 1ppm, 10ppm, 100ppm és 1000ppm mennyiségben adagoltuk a kultúrák szilárd, vagy folyékony tápközegébe. Kísérleteink során meghatároztuk a szövetek növekedési jellemzoit, tropán alkaloid termelését, továbbá néhány esetben lehetoségünk volt az endogén HCHO tartalom formaldimedon adduktum formájában történo mérésére is.
Dimedon hatása a kalluszkultúrákra
A dimedont - mely a HCHO-el történo irreverzibilis reakciója révén jól alkalmazható az endogén HCHO kimutatására és meghatározására [189,197] - növekvo mennyiségben adagoltuk sötétben és fényen nevelt D. innoxia kalluszszövetek szilárd AMS tápközegébe a vegyület in vivo sejtekre, szövetekre gyakorolt – endogén HCHO elvonáson alapuló – hatásának tanulmányozása céljából. A szöveteket 2, 4 és 6 hét után vizsgáltuk. Azt tapasztaltuk, hogy a kultúrák friss súlya mindhárom vizsgálati idopontban jellegzetes módon változott. 1ppm, 10ppm és 100ppm dimedon tartalom mellett a kultúrák friss súlya elérte, vagy kis mértékben meghaladta a kontroll szövetek megfelelo értékeit, 1000ppm hatására azonban jelentosen csökkenést észleltünk. Nem észleltünk eltérést a sötétben és fényen nevelt szövetek friss súlyának alakulása között, a 6 hetes, sötétben, 1000ppm dimedont tartalmazó táptalajon nevelt szövetek friss súlya azonban – a fényen tenyésztett szövetekkel ellentétben – csaknem elérték a megfelelo korú kontroll értékét. A szövetek növekedésével összhangban 1ppm-100ppm dimedon tartalom mellet a kontrollnak megfelelo, vagy kissé alacsonyabb volt a szövetek szárazanyag tartalma, 1000ppm mellett azonban – a 6 hetes sötétben tartott szövetek kivételével – jelentos szárazanyag tartalom növekedést (20-80%) észleltünk. A növekedési értékek 10ppm dimedon alkalmazása mellett haladták meg legjobban a kontroll értékeket (50-200%-al) sötétben és fényen egyaránt. Fényen 1ppm dimedon hatására csökkentek a növekedési értékek, 1000ppm azonban – a 6 hetes, sötétben nevelt szövetek kivételével – csaknem teljesen gátolta a kultúrák fejlodését mind sötétben, mind pedig fényen. A kallusz kultúrák alkaloid tartalmának változását nem sikerült tanulmányoznunk, mivel az AMS táptalajon nevelt szövetek nem tartalmaztak tropán alkaloidokat mérheto mennyiségben. A tenyészetek endogén HCHO tartalmát meghatározva a kontroll és a dimedonnal kezelt szövetek esetében is nagyobb értékeket kaptunk, valamint a 6. hétre minden esetben csökkent a mérheto HCHO tartalom. Dimedon keze lés, különösen 10ppm és 100ppm hatására csökkent az endogén HCHO mennyisége. 1000ppm hatására nagyobb értékeket kaptunk, melyek a sötétben, különösen pedig a fényen nevelt 4 hetes szövetekben meg is haladták a kontroll tenyészetekben kapott eredményeket, a 6. hétre azonban közel 60-70%-al csökkent a mérheto HCHO mennyisége. A fényen nevelt szövetekben minden esetben szignifikánsan nagyobb endogén HCHO koncentrációkat mértünk, ami arra enged következtetni, hogy a fotoszintézis során keletkezo HCHO – mely az Largininnel és a ribulóz-1,5-difoszfát molekulákkal is képes reagálni [207,213,214 ] – teheto felelossé az észlelt eltérésekért. Eredményeink azt jelzik, hogy a dimedonnal történt, kisebb mértéku irreverzibilis HCHO elvonás elosegítette a kalluszszövetek fejlodését, a nagyobb mennyiségu (1000ppm) dimedon azonban már jelentos gátlást eredményezett, csupán a sötétben, hosszabb idon át (6 hét) nevelt szövetek
alkalmazkodtak bizonyos mértékben. A formaldimedon adduktum formájában történt mérés eredményei alapjá n a vizsgált D. innoxia kalluszszövetek 4,6µg/g - 27,0µg/g mennyiségben tartalmaztak mérheto endogén HCHO-et. A tápközegbe adagolt 1ppm, 10ppm és 100ppm dimedon hatására csökkent a mérheto HCHO mennyisége, mely kapcsolatban állhat – fényen, 1ppm dimedont tartalmazó tápközegen nevelt kultúrák kivételével – a tenyészetek nagyobb arányú növekedésével, amikor is – az irodalmi adatok alapján – csökken a szövetekben a potenciális HCHO forrásként jelenlévo N-metilezett vegyületek (pl. kolin, trigonellin, trimetil-lizin) mennyisége [189]. Az 1000ppm dimedon hatására 4 hetet követoen jelentosen megemelkedett HCHO tartalom azt jelzi, hogy a szövetek pótolni próbálják az elvont HCHO-et – feltehetoen elsosorban az univerzális anyagcsere folyamatok fenntartása érdekében -, a kémiai stresszhez történo alkalmazkodás azonban csak a már említett 6 hetes, sötétben nevelt szövetek esetében tunik sikeresnek. A HE festés elvégzését követoen megállapítottuk, hogy kallusz kultúrák tápközegébe adagolt dimedon nem befolyásolta a szöveti szerkezetet, jellegzetes hatást gyakorolt azonban az apoptotikus sejtek számára. A TUNEL reakció elvégzése után meghatározott Ai értéke nott az alkalmazott dimedon mennyiségével párhuzamosan, de 1000ppm dimedon tartalom mellett csaknem teljesen megszunt a DNS fragmentálódás, az Ai értéke pedig jelentosen csökkent, különösen a fényen nevelt szövetek esetében. Megfigyeltük továbbá, hogy a fényen nevelt szövetekben – 10ppm dimedon tartalom kivételével minden alkalmazott dimedon koncentráció mellett – jelentosen kevesebb apoptotikus sejtmag volt kimutatható.
Dimedon hatása a hiry root tenyészetekre
A sötétben és fényen nevelt D. innoxia # 410 hairy root klón folyékony MS tápközegébe [110] adagolt dimedon, 4 hetet követoen 1ppm, 10ppm és 100ppm alkalmazása mellett 30-40%-al csökkentette a szövetek friss súlyát, mely csökkenés már a 2. hét után megfigyelheto volt. 1000ppm dimedon hatására jelentosen, a kontroll értékének 15-20%-ra csökkentek a mért friss súlyok. A tenyészetek szárazanyag tartalma – a sötétben 100ppm dimedont tartalmazó MS táptalajon [110] nevelt szövetek kivételével - szintén csökkent a dimedon koncntráció emelésével sötétben és fényen. A számított növekedési értékek már 1ppm dimedon hatására is jelentosen, 60-75%-al csökkentek. 10ppm és 100ppm további kis mértéku csökkenést, 1000ppm azonban a növekedés teljes leállását idézte elo. A tápközegek pH értékének meghatározását követoen azt tapasztaltuk, hogy fényen – hasonlóan a klónok MS alaptáptalajon [110] történt fejlodésének vizsgálata során észleltekhez – magasabb pH értékeket kaptunk mind a kontroll, mind pedig a diemdonnal kezelt szöveteknél. A táptalaj pH értékek ugyanakkor a dimedon tartalom emelkedésével összhangban egyre kisebbek voltak, annak ellenére, hogy a kezdeti pH minden esetben pH 5,7-re került beállításra.
A 4 hetes, sötétben nevelt kultúrák hioszcaimin és apoatropin tartalma fokozatosan csökkent a dimedon koncentráció emelésével, a szkopolamin mennyisége azonban 1ppm és 10ppm dimedon hatására jelentosen, mintegy 150-180% -al megnott. Fényen 10ppm és 100ppm dimedon idézett elo kisebb mértéku hioszciamin, illetve szkopolamin tartalom emelkedést, mely azonban nem haladta meg a kontroll értékeit. 1000ppm dimedon adagolását követoen a vizsgát tropán alkaloidok termelése gyakorlatilag leállt, csupán a sötétben nevelt kultúrákban sikerült csekély mennyiségu szkopolamint kimutatnunk. Az alkaloid tartalom esetében sötétben, 10ppm dimedon hatására a 6. héten észleltünk – a 4. héten 1ppm és 100ppm-es kezelések után mérthez hasonló – jelentos szkopolamin tartalom növekedést. Az alkaloid produkciós eredmények egységesebb képet mutattak, mivel sötétben és fényen egyaránt jelentosen, 45-85%-al csökkentek a produkciós értékek már 1ppm dimedon hatására is. 10ppm további csökkenést, 100ppm azonban kisebb arányú emelkedést idézett elo, 1000ppm mellett a szövetek már nem termeltek alkaloidokat. Meg kell jegyezni azonban, hogy a 6. héten, a fényen nevelt szövetek hioszciamin, szkopolamin és apoatropin produkciója egyaránt megközelítette a kontroll kultúrákban kapott értékeket. A kapott eredmények azonban azt jelzik, hogy a folyékony MS tápközegbe [110] adagolt dimedon egyaránt negatív hatással volt a hairy root szövetek univerzális és speciális anyagcseréjére. A fényen nevelt szövetek esetében elvégzett endogén HCHO tartalom meghatározásának eredményei azt mutatták, hogy a hairy root szövetek a kallusz tenyészeteknél egy nagyságrenddel nagyobb mennyiségben (kontroll szövetekben 345,0µg/g) tartalmaznak mérheto HCHO-et, melyben szerepe lehet a hairy root szövetek komplexebb anyagcseréjének, vagy géntranszformált sajátságainak egyaránt.
Szemikarbazid alkalmazása
A sötétben és fényen nevelt D. innoxia # 410 hairy root klón folyékony MS tápközegébe [110] adagolt 1ppm szemikarbazid – mely reverzibilis reakcióba léphet a jelenlévo HCHO molekulákkal –, 4 hét után jelentos friss súly gyarapodást eredményezett, mely a kontroll értékeket 80-100%-al múlta felül. Nagyobb tápközeg szemikarbazid tartalom hatására (10ppm, 100ppm és 1000ppm) a friss súlyok hirtelen csökkentek. A kapott eredményekkel összhangban a szövetek szárazanyag tartalma 1ppm szemikarbazid hatására csökkent, majd a friss súlyok csökkenésével párhuzamosan nott. Az 1000ppm szemikarbazid tartalmú MS tápközegen [110] fejlodött szövetek szárazanyag tartalma azonban ismét, az 1ppm mellett kapott értékekhez hasonló szintre csökkent. A 4 hetes hairy root kultúrák növekedési értékei – eltéroen a dimedon kezeléstol - jelentosen megnottek 1ppm szemikarbazid alkalmazása után, 10ppm és 100ppm hatására azonban hirtele n csökkent, majd 1000ppm mellett teljesen leállt a szövetek növekedése. A szemikarbazid alkalmazása során fényen – a korábbi vizsgálatokhoz
hasonlóan – magasabb tápközeg pH értékeket kaptunk. 1ppm és 10ppm hatására pH emelkedést mértünk, majd 100ppm és 1000ppm alkalmazása után fokozatosan a kontroll értékek alá csökkent a tápközegek pH-ja. A szövetek tropán alkaloid tartalma fokozatosan csökkent az alkalmazott szemikarbaid mennyiségének növekedésével, csupán a sötétben, 10ppm és 100ppm hatására nott meg kissé a hioszciamin és szkopolamin mennyisége. 1000ppm szemikarbazid mellett – a dimedon alkalmazásánál megfigyeltekhez hasonlóan – mellett sötétben és fényen sem tudtunk a kultúrákban tropán alkaloidokat mérheto mennyiségben kimutatni. Az alkaloid produkciós értékek egyik esetben sem haladták meg a kontroll tenyészetekben kapott értékeket, egyenletes csökkenést mutattak 1000ppm szemikarbazid alkalmazásáig, mely már teljes tropán alkaloid produkció gátlást idézett elo. A fényen nevelt szövetek endogén HCHO tartalma egyenletesen csökkent a kontroll tenyészetekben mért 345,0µg/g-tól a 100ppm szemikarbaziddal kezelt szövetekben meghatározott 286,4µg/g értékig, azonban a dimedonnal kezelt kultúrákhoz hasonlóan, 1000ppm adagolását követoen, a szövetek rossz növekedése következtében nem állt rendelkezésünkre elég minta a mérések elvégzéséhez. A kapott eredmények ugyanakkor azt jelzik, hogy – a dimedon kezeléshez hasonlóan – a HCHO elvonás ellenére nem csökken drámaian a szövetek mérheto HCHO koncentrációja, a kultúrák igyekeznek azt viszonylag állandó szinten tartani.
A dimedonnal, vagy szemikarbaziddal kezelt hairy root kultúrák szövettani vizsgálata
A dimedont és a szemikarbazidot tartalmazó táptalajokon nevel D. innoxia # 410-es hairy root kultúrák HE festést követo szövettani vizsgálata során – a kontrol, MS alaptáptalajon [110] nevelt szövetekkel ellentétben – nagy számban sikerült megfigyelni a sejtmagokat. Megállapítottuk, hogy a szövetek morfológiailag – a sejtmagok jelenlétét kivéve – nem különböztek a dimedon és szemikarbazid mentes folyékony MS alaptápközegen [110] nevelt hairy root-ok felépítésétol sem a sötétben, sem pedig a fényen történt tenyésztés után. A dimedon, vagy szemikarbazid tartalmú tápközegen nevelt kultúrák esetében is vizsgáltuk az alkaloidok lokalizációját a szövetekben Dragendorff reagens alkalmazásával. A sötétben és fényen nevelt hairy root szövetek között – hasonlóan a szövettani felépítéshez – az alkaloidok lokalizációja tekintetében sem sikerült különbségeket észlelnünk. A vizsgált szövetek csaknem mindegyikében sikerült alkaloidokat kimutatni, csupán az 1000ppm dimedonot és 1000ppm szemikarbazidot tartalmazó táptalajon nevelt szövetekben nem észleltünk Dragendorff pozitív reakciót, mely összhangban volt az alkaloid tartalom meghatározásánál kapott eredményekkel. Annak ellenére, hogy a D. innoxia # 410 hairy root klón szöveteinek HE festését követoen nem sikerült a sejtmagokban apototikus folyamatokra utaló változásokat megfigyelni, az észleltek
alátámasztása céljából elvégeztük a TUNEL reakciót. Ennek eredménye igazolta, hogy sem az MS alaptáptalajon [110] nevelt kultúrákban, sem pedig a dimedonnal, vagy szemikarbaziddal kezelt szövetekben nem lehet apoptotikus sejtmagokat kimutatni.
Aminoguanidin hatása
Az aminoguanidint sötétben nevelt D. innoxia #410 hairy root klón folyékony MS tápközegébe [110] adagoltuk a vegyület növekedésre és tropán alkaloid termelésre gyakorolt hatásánal vizsgálata céljából. A szövetek növekedését és tropán alkaloid termelését 4 hét után tanulmányoztuk. Az aminoguanidinrol már korábban ismertté vált, hogy képes megkötni az endogén HCHO-et és DNS-t metilzni [308]. A molekula – mely hidrazin származék – erosen elektrofil reagens, képes reagálni a sejtekben kötött formában jelenlévo HCHO-el, pl. a HMA hidroximetil csoportjával. Az N 5 ,N10 -metilén-tetrahidrofolát koenzimrol azonban nem képes lehasítani a kötött HCHO-et, így az aminoguanidin csak közvetve befolyásolja a folát ciklust, csökkentve a C1 fragmentum forrás HMA mennyiségét ill. feltehetoen más biomolekulákét is Az aminoguanidin és HCHO reakciója ugyanakkor a sejtekben, szövetekben megtalálható lizin és H2 O2 jelenlétében rendkívül reaktív, gerjesztett HCHO kialakulását eredményezheti, mely az élo szervezetekre káros, szabályozatlan metilezési és formilezési reakciókat okozhat [211]. Eredményeink azt mutatták, hogy 1ppm és 10ppm aminoguanidin hatására nem változott jelentosen a kultúrák szárazanyag tartalma, 100ppm hatására azonban a kontroll tenyészetekhez (9,12%) viszonyítva szignifikánsan nagyobb értéket kaptunk (11,81%). 1000ppm hatására azonban jelentosen, a kontroll értékek alá csökkent a szárazanyag tartalom. A növekedési értékek 1ppm és 10ppm aminoguanidin alkalmazását követoen jelentosen, 70% és 46%-al múlták felül a kontroll tenyészetek esetében kapott értéket, majd 100ppm és 1000ppm adagolását követoen fokozatosan csökkentek. Utóbbi esetben a szövetek növekedése gyakorlatilag teljesen leállt. Az alkaloid tartalom alakulása is érdekes képet mutatott. A legnagyobb hioszciamin (0,17%), szkopolamin (0,13%) és apoatropin tartalmat (0,02%) 10ppm és 100ppm aminoguanidin alkalmazása mellett mértük, mely mintegy duplája-háromszorosa volt a kontroll szövetekben mért értékeknek. A szövetek növekedése ezekben az esetekben nem érte el a legnagyobb értéket, de meghaladta, vagy elérte a kontroll tenyészetekét. 1ppm hatására – mely a növekedést a legelonyösebben befolyásolta – igen alacsony, az 1000ppm aminoguanidin adagolását követohöz hasonló alkaloid tartalmat mértünk, mely egyik esetben sem érte el a kontroll értékeket. A legnagyobb alkaloid produkciós eredményeket – a tartalmi adatoknak megfeleloen – 10ppm és 100ppm aminoguanidin adagolását követoen kaptuk. A 10ppm és 100ppm aminoguanidin alkalmazását követo jelentos tropán alkaloid tartalom és produkció növekedés azonban – az irodalmi adatok tükrében [211] – felveti annak lehetoségét, hogy a
folyamat specifikus hatások, így pl. a génaktivitás DNS metilezésen keresztül történt megváltozásának eredménye.
Hidralazin hatása
Részletesebben vizsgáltuk a vérnyomáscsökkento hatású hidralazint is, melyet szintén sötétben nevelt D. innoxia # 410 hairy root klón folyékony MS tápközegébe [110] adagoltuk a vegyület növekedésre és tropán alkaloid termelésre gyakorolt hatásainak vizsgálata céljából. A hidralazin – az aminoguanidinhez hasonlóan – hidrazin származék, mely képes lehasítani az L-arginin molekulákhoz kötött HCHO-et, mivel erosebben nukleofil sajátságú, mint az L-arginin guanidino csoportja és így alkalmas az endogén HCHO tartalom biológiai mintákban történo meghatározására is [207]. A szövetek növekedését és tropán alkaloid termelését 4 hét után tanulmányoztuk. A szárazanyag tartalom kis mértékben csökkent a tápközeg hidralazin tartalmának emelésével (1ppm, 10ppm és 100ppm hatására), 1000ppm adagolását követoen azonban jelentosen, a kontroll értékénél 84%-al nagyobb értéket kaptunk. A szövetek fejlodése, a növekedési értékek alakulása az minoguanidin alkalmazásához hasonlóan alakult, ebben az esetben azonban csupán az 1ppm hidralazin idézett elo a kontrollnál nagyobb – azonban nem szignifikáns mértéku - növekedési érték gyarapodást. 10ppm, 100ppm és 1000ppm alkalmazása után gyorsan csökkentek a növekedési értékek, 1000ppm hatására pedig a hidralazin esetében is leállt a szövetek fejlodése. Az alkaloid tartalom alakulása – hasonlóan az aminoguanidin kezeléshez – jellegzetes képet mutatott. A szövetek fejlodését negatív módon befolyásoló 10ppm és 100ppm hidralazin kezelés a kultúrák tropán alkaloid termelését egyértelmuen elosegítette. A legnagyobb hioszciamin (0,24%), szkopolamin (0,14%) és apoatropin tartalmat (0,03%) 10ppm adagolását követoen mértük, mely értékek átlagosan 135% -al haladták meg a kontrollban mért alkaloid tartalmat, de 100ppm adagolását követoen is a kontrollnál mintegy 100% -al magasabb értékeket mértünk. Ezek a hidralazin kezelések – az alkaloid tartalom emelése mellett – drámai alkaloid produkció növekedést eredményeztek, mely értékek a hioszciamin esetében közel 6-7-szeresen múlták felül a kontroll adatokat. Az 1ppm és 1000ppm hidralazin alkalmazása – az aminoguanidin adagolásához hasonlóan – csökkentette a szövetek alkaloid termelését és produkciós értékeit. 1000ppm hidralazin hatására nem tudtunk a szövetekben mérheto mennyiségben hioszciamint, szkopolamint, vagy apoatropint kimutatni. Összefoglalva eredményeinket megállapítható, hogy az általunk létrehozott D. innoxia in vitro kultúrák (növény, kallusz és ún. hairy root tenyészetek) mindegyike jól fejlodik, tropán alkaloidokat azonban csupán a géntranszformált gyökérkultúrák szintetizálnak nagyobb mennyiségben (0,23% hioszciamin és 0,21% szkopolamin, szárazsúlyra vonatkoztatva). A hairy root klónok tropán alkaloid
tartalma elérte az in vivo D. innoxia növények gyökereiben mért értékeket. A tenyésztési körülmények (pl. fényen történo tenyésztés), a táptalaj összetételének (pl. szacharóz és MgSO 4 tartalom) módosítása ugyanakkor további ígéretes lehetoségeket kínál nem csupán a hioszciamin foalkaloidos # 410 és #415 klónok, hanem a szkopolamin foalkaloidos # 411 klón alkaloid termelésének további, jelentos fokozására is. Az abiogén stresszhatások (dimedon, szemikarbazid, aminoguanidin és hidralazin alkalmazása) részletes vizsgálata azt mutatta, hogy a szövetek fejlodése, mérheto endogén HCHO tartalma és tropán alkaloid termelése jelentos mértékben megváltozhat. A vegyületeket kisebb mennyiségben felhasználva (általában 1-100ppm) több esetben a biomassza produkció, vagy a tropán alkaloid termelés nagy arányú növekedését észleltük, mely felveti specifikus hatások (pl. génexpressiós változások) lehetoségé t. Nagyobb mennyiségek (1000ppm) azonban már jelentos növekedés gátlást és alkaloid tartalom csökkenést okoztak, mely az univerzális és speciális anyagcsere eros gátlására vezetheto vissza, mivel az alkalmazott molekulák ekkor már jelentos mennyiségben von ják el a sejtekben kötött formában jelenlévo endogén HCHO-et. Az általunk vizsgált in vitro szövetek felépítése megfelelt az irodalomban leírtaknak. Megállapítottuk, hogy a különbözo tenyésztési körülmények (sötét, fény, különbözo abiogén stresszhatások) nem voltak hatással a szövetek felépítésére. A D. innoxia kalluszszövetekben, valamint az in vitro növények gyökereiben elvégzett TUNEL reakció eredményei azt mutatják, hogy az irodalmi adatoknak megfeleloen [255-257] a növényi sejtek, szövetek fejlodése és öregedése során – a humán és állati sejtekhez hasonlóan – kimutatható az apoptózisra jellemzo DNS fragmentálódás. Az AMS táptalaj dimedon tartalma – a kallusz kultúrák növekedése mellett – jellegzetes hatással volt a szövetekben megfigyelt apoptotikus sejtek számára. A 10ppm és 100ppm dimedon mellett jobban fejlodo szövetek több TUNEL pozitív sejtmagot tartalmaztak, 1000ppm azonban a kultúrák növekedése mellett a DNS fragmentációt is gátolta. A 4 hetes D. innoxia # 410 hairy root klón szöveteiben (kontroll és dimedonnal, vagy szemikarbaziddal kezelt kultúrákban) nem tudtunk kimutatni apoptotikus folyamatokra jellemzo morfológiai változásokat, továbbá DNS fragmentálódást, mely arra utal, hogy a hairy root szövetek fejlodése eltér a korábban vizsgált kultúrákétól. Ebben szerepe lehet többek között a vizsgált klón egyedi genetikai felépítésének, vagy a tDNS-en elhelyezkedo auxin szintézisért felelos géneknek és így a szövetek magasabb hormon tartalmának is.
6. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Hálás köszönetemet fejeze m ki Dr. Szoke Éva professzor asszonynak, a biológiai tudományok doktorának, a Farmakognózia Intézet igazgatójának, aki lehetoséget adott számomra Ph.D. kutatómunkám elvégzéséhez, valamint témavezetomként értékes szakmai tanácsaival és támogatásával nagymé rtékben hozzájárult az elért tudományos eredményekhez. Körültekinto és alapos munkája követendo példaként szolgál számomra. Köszönettel tartozom Verzárné Dr. Petri Gizella professzor asszonynak, az Intézet korábbi vezetojének, hogy lehetoséget biztosított kutatói munkám elkezdéséhez. Hálásan köszönöm Dr. Kursinszki László egyetemi adjunktusnak a tropán alkaloidok nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel történo meghatározásában nyújtott nélkülözhetetlen és önzetlen segítségét. Köszönetet szeretnék mondani Dr. Marczal Gabriella egyetemi adjunktusnak az elsajátított szövettani és toxikológiai ismeretekért és értékes szakmai tanácsaiért. Köszönöm Ditrói Kálmán tudományos munkatársnak az opin kimutatásban nyújtott segítségét. Nagyon köszönöm Mathuny Rudolfnénak kísérletes munkám során nyújtott felbecsülhetetlen közremuködését. Ezúton szeretnék köszönetet mondani Dr. Tyihák Ernonek, a kémiai tudományok doktorának, a Magyar Tudományos Akadémia Növényvédelmi Kutatóintézete tudományos fomunkatársának, számos kísérlet megtervezésében és kiértékelésében adott segítségéért, támogatásáért. Köszönöm Kátay Györgynek és Dobosné Harsányi Editnek az OPLC meghatározások elvégzésében nyújtott elengedhetetlen segítségét. Köszönetemet fejezem ki Dr. Szende Béla egyetemi tanárnak, az orvostudományok doktorának, az I.sz. Pathológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetének egyetemi tanárának, hogy bevezetett a programozott sejthalál „világába”, valamint értékes tanácsaival hozzájárult az elért tudományos eredményekhez. Köszönöm Dr. Paczolay Gyozonének a TUNEL reakció kivitelezésében nyújtott nélkülözhetetlen segítségét. Hálásan köszönöm Dr. Albert Leventének, a Nyugat-Magyarországi Egyetem, Erdomérnöki Kar, Kémiai Intézete igazgatójának és Dr. Németh Zsoltnak a HPLC és MALDI-MS meghatározások elvégzésében és kiértékelésében nyújtott segítségét. Köszönettel tartozom Dr. Heszky Lászlónak, a Szent István Egyetem Genetika és Növénynemesítési Tanszék tanszékvezeto egyetemi tanárnak és Dr. Kiss Erzsébet egyetemi tanárnak a polimeráz láncreakció kivitelezéséhez adott támogatásáért és segítségéért. Köszönöm Secenji Máriának a
reakció kivitelezésében nyújtott elengedhetetlen segítségét. Köszönetet szeretnék mondani a Semmelweis Egyetem Farmakognózia Intézetében dolgozó valamennyi munkatársamnak, akik munkámat mindvégig önzetlen támogatásukkal segítették. Végül köszönöm családomnak a támogatást, szereto bíztatást és gondoskodást, mellyel mindvégig mellettem álltak.
7. IRODALOMJEGYZÉK 1,
Dános, B. (1997): Farmako-botanika, A gyógynövénytan alapjai (Kemotaxonómia). Arguentum Kiadó, Budapest.
2,
Hänsel, R., Keller, K., Rimpler, H. and Schneider, G. (1992): Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis, Drogen A-D. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, London, Paris, Tokyo, Hong Kong, Barcelona, Budapest, pp. 1138-1141.
3,
Petri, G. (1991): Gyógynövény- és drogismeret. Medicina Kiadó, Budapest.
4,
Danert, S., Hanelt, P., Helm, J., Kruse, J. és Schultze-Motel, J. (1976): Növényvilág, Magasabbrendu növények II., Gondolat Kiadó, Budapest.
5,
Parr, A.J., Payne, J., Eagles, J., Chapman, B.T., Robins, R.J., and Rhodes, M.J.C. (1990): Variation in tropane alkaloid accumulation within the Solanaceae and strategies for its exploitation. Phytochemistry, 29, 2545-2550.
6,
Evans, W.C. (1996): Trease and Evans’ Pharmacognosy, WB Saunders Company Ltd., London, Philadelphia, Toronto, Sydney, Tokyo.
7,
Siddiqui, B.S., Hashmi, I.A. amd Begum, S. (2002): Two new withanolides from the aerial parts of Datura innoxia, Heterocycles, 57, 715.
8,
Dräger, B. (2002): Analysis of tropane and related alkaloids. J. Chromatogr. A., 29, 1-35.
9,
Dräger, B., Funck, C., Höhler, A., Mrachatz, G., and Nahrstedt, A. (1994): Calystegines as a new group of tropane alkaloids in Solanaceae. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 38, 235240.
10,
Oksman-Caldentey, K.M. and Arroo, R. (2000): Regulation of tropane alkaloid metabolism in plants and plant cell cultures. In: Metabolic engineering of plant secondary metabolism (Verpoorte, R. and Alfermann, A.W., Eds.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Boston, London, pp.253-281.
11,
Bekkouche, K., Daali, Y., Cherkaoui, S., Veuthey, J.L. and Christen, P. (2001): Calystegine distribution in some solanaceous species. Phytochemistry, 58, 455-462.
12,
Payne, J., Hamill, J.D., Robins, R.J., and Rhodes, M.J.C. (1987): Production of hyoscyamine by "hairy root" cultures of Datura stramonium. Planta Medica, 53, 474-478.
13,
Oksman-Caldentey, K.M., Laaksonen, M.R., and Hiltunen, R. (1989): „Hairy root” cultures of Hyoscyamus muticus and their hyoscyamine production. Planta Medica, 55, 229.
14,
Petri, G., and Spassova, N. (1989): Regeneration ability and alkaloid production in tissue cultures of Datura innoxia. Planta Medica, 55, 682-683.
15,
Witte, L., Müller, K., and Arfmann, H.A. (1987): Investigation of the alkaloid pattern of Datura innoxia plants by capillary gas-liquid-chromatography-mass-spectrometry. Planta Medica, 53, 192-197.
16,
Mechler, E., and Kohlenbach, H.W. (1978): Alkaloid content in leaves of diploid and haploid Datura species. Planta Medica, 33, 350-355.
17,
Hérouart, D., Sangwa n, R.S., Fliniaux, M.A., and Sangwan-Norreel, B.S. (1988): Variations in the leaf alkaloid content of androgenic diploid plants of Datura innoxia . Planta Medica, 54, 1417.
18, 19,
Yamada, Y., Hashimoto, T., Endo, T., Yukimune, Y., Kohno, J., Hamaguchi, N., and Dräger, B. (1990): Biochemistry of alkaloid production in vitro. In: Secondary Products from Plant Tissue Culture (Charlwood, B.V., and Rhodes, M.C.J. Eds.), Clarendon Press, Oxford, pp. 227-242. Leete, E. (1990): Recent developments in the biosynthesis of the tropane alkaloids. Planta Medica, 56, 339-352.
20,
Luckner, M. (1984): Secondary Metabolism in Microorganisms, Plants, and Animals. Veb Gustav Fischer Verlag, Jena.
21,
Friedman, M., and Levin, C.E. (1989): Composition of jimson weed (Datura starmonium) seeds. J. Agric. Food Chem., 37, 998-1005.
22,
Giulietti A.M., Parr, A.J., and Rhodes, M.J. (1993): Tropane alkaloid production in transformed root cultures of Burgmansia candida. Planta Medica, 59, 428-431.
23,
Romeike, A. (1953): Beiträge zur chemischen physiologie der mydriatisch wirkenden Solanaceen-alkaloide II. Pharmazie, 8, 729-747.
24,
Winchester, B. and Fleet, G.W.J. (1992): Amino-sugar glycosidase inhibitors – Versatile tools for glycobiologists. Glycobiology, 2, 199-210,
25,
Asano, N., Oseki, K. and Tonioka, E. (1994): N-containing sugars from Morus alba and their glycosidase inhibitory activities. Carbohydrate Res., 259, 243-255.
26,
Asano, N. (2000): Water soluble nortropane alkaloids in crude drugs, edible fruits and vegetables: biological activities and therapeutic applications. Mechanisms of Ageing and Development, 116, 155-156.
27,
Molyneux, R.J., McKenzie, R.A. and O’Sullivan (1995) : Identification of the glycosidase inhibitors swainsonine and calystegine B2 in weir vine (Ipomoea sp. Q6 {aff. calobra}) and correlation with toxicity. J. Nat. Products, 58, 878-886.
28,
Todd, F.G., Stermitz, F.R. and Schultheis, P. (1995): Tropane alkaloids and toxicity of Convulvulus arvensis. Phytochemistry, 39, 301-303.
29,
Leete, E. (1958): The biogenesis of nicotine. V. Nem prcursors of the pyrrolidine ring. J. Am. Chem. Soc., 80, 2162-2164.
30,
Leete, E. (1979): Biosynthesis and metabolism of the tropane alkaloids. Planta Medica, 36, 97112.
31,
Fodor, G. (1970): Tropane Alkaloids. In: Chemistry of the Alkaloids (Ed. by Pelletier S. W.) Van Nostrand Reinhold Company New York, Cincinatti, Toronto, London, Melbourne, pp. 431467.
32,
Romeike, A. (1952): Beitrag zur papierchromatographischen tennung von alkaloiden. Pharmazie, 7, 496-497.
33,
Romeike, A. (1960): Die rolle von spross und wurzel bei der umwandlung des hyoscyamins in verschiedenen Datura -arten. Planta Medica, 8, 496-497.
34,
Torsell, K.B.G. (1983): Natural Product Chemistry, A mechanistic and biosynthetic approach to secondary metabolism. John Wiley and Sons Ltd.
35,
Sevón, N., Hiltunen, R. and Oksman-Caldentey, K.M. (1992): Chitosan increases hyoscyamine content in hairy root cultures of Hyoscyamus muticus. Pharm. Pharmacol. Lett., 2, 96-99.
36,
Yoshioka, T., Yamagata, H., Ithoh, A., Deno, H., and Fujita, Y. (1989): Effects of exogenous polyamines on tropane alkaloid production by a root culture of Duboisia myoporoides. Planta Medica, 55, 523-524.
37,
Sudha, G. and Ravishankar, G.A. (2002): Involvement and interaction of various signaling compounds on the plant metabolic events during defense response, resistance to stress factors, formation of secondary metabolites and their molecular aspects. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 71, 181-212. Petri, G. and Bajaj, Y.P.S. (1989): Datura spp.: In vitro regeneration and the production of tropanes. In: Bajaj, Y.P.S. (Ed) Biotechnology in Agriculture and Forestry 7, Medicinal and Aromatic Plants III, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, London, Paris, Tokyo, pp. 135-161.
38,
39,
Rhodes, M.J.C., Robins, R.J., Hamill, J.D., Parr, A.J., Hilton, M.G., and Walton, N.J. (1990): Properties of transformed root cultures. In: Secondary Products from Plant Tissue Culture (Charlwood, B.V., and Rhodes, M.C.J. Eds.), Clarendon Press, Oxford, pp. 201-225.
40,
Robins, R.J., Parr, A.J. and Bent, E.G. (1991a): Studies on the biosynthesis of tropane alkaloids in Datura stramonium L. transformed root cultures. 2. On the relative contributions of Larginine and L-ornithine to the formation of tropane ring. Planta, 183, 196-201.
41,
Hashimoto, T., Yukimune, Y. and Yamada, Y. (1989): Putrescine and putrescine Nmethyltransferase in the biosynthesis of tropane alkaloids in cultured roots of Hyoscyamus albus. II Incorporation of labelled precursors. Planta, 178, 131-137.
42,
Hibi, N., Fujita, T. and Hatano, M. (1992): Putrescine N-methyltransferase in cultured roots of Hyoscyamus albus. Plant Physiol., 100, 826-835.
43,
Feth, F., Arfmann, H.A., Wray, V. and Wagner, K.G. (1985): Determination of PMT by high performance liquid chromatography. Phytochemistry, 24, 921-923.
44,
Piñol, M.T., Palazón, J., Cusidó, R.M. and Ribó, M. (1999): Influence of calcium ionconcentration in the medium on tropane alkaloid accumulation in Datura stramonium hairy roots. Plant Science, 141, 41-49.
45,
De Luca, V. and St Pierre, B. (2000): The cell and developmental biology of alkaloid biosynthesis. Trends in Plant Science, 5, 168-173.
46,
Abraham, T.W. and Leete. E. (1995): New intermediate in the biosynthesis of the tropane alkaloids in Datura innoxia. J. Am. Chem. Soc., 117, 8199-8105.
47,
Robins, R.J., Abraham, T.W. and Parr, A.J. (1997): The biosynthesis of tropane alkaloids in Datura stramonium: The identity of the intermediates between N-methyl-∆1 -pyrrolinium salt and tropinone. J. Am. Chem. Soc., 119, 10929-10934.
48,
Endo, T., Hamaguchi, N. and Hashimoto, T. (1988): Non-enzymatic synthesis of hygrine from acetoacetic acid and from acetonedikarboxylic acid. FEBS Lett., 234, 86-90.
49,
Leete, E. (1972): Biosynthesis of meteloidine. Phytochemistry, 11, 1713-1717.
50,
Landgrebe, M.E. and Leete, E. (1990): The metabolism of tropinone in intact Datura innoxia plants. Phytochemistry, 29, 2521-2524.
51,
Koelen, K.J. and Gross, G.G. (1982): Partial purification and properties of tropine dehydrogenase from root culture of Datura stramonium. Planta Med., 44, 227-230.
52,
Dräger, B., Hashimoto, T. and Yamada, Y. (1988): Purification and characterization of pseudotropin forming reductase from Hyoscyamus niger root cultures. Agric. Biol. Chem., 52, 2663-2667.
53,
Hashimoto, T., Nakajima, K. and Ongena, G. (1992): Two tropinone reducteses with distinct stereospecifities from cultured roots of Hyoscyamus niger. Plant Physiol., 100, 836-845.
54,
Portsteffen, A., Dräger, B. and Nahrstedt, A. (1992): Two tropinone reducing enzymes from Datura stramonium transformed root cultures. Phytochemistry, 31,1135-1138.
55,
Nakajima, K., Hashimoto, T. and Yamada, Y. (1993): Two tropinone reductases with different stereospecitifities are short-chain dehydrogenases evolved from a common ancestor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 9591-9595.
56,
Kitamura, Y., Sato, M., and Miura, H. (1992): Differences of atropine esterase activity between intact roots and cultured roots of various tropane alkaloid-producing plants. Phytochemistry, 31, 1191-1194.
57,
Robins, R.J., Chesters, C.C.J.E. and O’Hagan, D. (1995): The biosynthesis of hyoscyamine: The process by which littorine rearranges to hyoscyamine. J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1, 481-485.
58,
Ansarin, M. and Woolley, J.G. (1994): The rearrangement of phenyllactate in the biosynthesis of tropic acid. Phytochemistry, 35,935-939.
59,
Chesters, N.J.C.E., O’Hagan, D. and Robins, R.J. (1994): The biosyntesis of tropic acid in plants: Evidence for the direct rearrangement of 3-phenyllactate to tropane. J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1, 1159-1162.
60,
Zabetakis, I., Edwards, R., Hamilton, J.T.G., and O'Ha gan, D. (1998): The biosynthetic relationship between littorine and hyoscyamine in transformed roots of Datura stramonium. Plant Cell Reports, 18, 341-345.
61,
Hashimoto, T. and Yamada, Y. (1986): Hyoscyamine 6β-hydroxyalse from cultured roots of alkaloid pro ducing root cultures. Plant Physiol., 81, 619-625.
62,
Hashimoto, T., Yun, D.J., Yamada, Y. (1993b): Production of tropane alkaloids in genetically engineerd root cultures. Phytochemistry, 32, No 3, 713-718.
63,
Plank, K.H., and Wagner, K.G. (1986): Determination of hyoscyamine and scopolamine in D. innoxia plants by high performance liquid chromatography. Z. Naturforsch, 41, 391-395.
64,
Duez, P., Chamart, S., Hanocq, M., Molle, L., Vanhaelen, M., and Vanhaelen-Fastré, R. (1985): Comparison between thin-layer chromatograohy-densitometry and high-performance liquid chromatography for the determination of hyoscyamine and hyoscyne in leaves, fruit and seeds of Datura (Datura spp .). Journal fo Chromatography, 329, 415-421.
65,
Hiraoka, N., and Tabata, M. (1974): Alkaloid production by plants regenerated from cultured cells of Datura innoxia. Phytochemistry, 13, 1671-1675.
66,
Szoke, É., Dung, N.N., Verzár-Petri, G., and Potoczki, Á. (1982): Change in the total alkaloid contents in the tissue cultures of Datura innoxia Mill. in the function of the cultural circumstances. Acta Bot. Cad. Scient. Hung., 29, 403-410.
67,
Jaziri, M., Legros, M., Homes, J. and Vanhaelen, M. (1988): Tropine alkaloids production by hairy root cultures of Datura stramonium and Hyoscyamus niger. Phytochemistry, 27, 419-420.
68,
Padula, L.Z., Bandoni, A.L., Rondina, R.V.D., and Coussio, J.D. (1976): Quantitative determination of total alkaloids and scopolamine in Datura ferox growing in Argentina. Planta Medica, 29, 357-360.
69,
Wilms, V.J., Röder, E., and Kating, H. (1977): Gas-chromatographic determination of tropan alkaloids in organs of Atropa belladonna. Planta Medica, 31, 249-256.
70,
Hartmann, T., Witte, L., Oprach, F., and Toppel, G. (1986): Reinvestigation of the alkaloid composition of Atropa belladonna plants, root cultures, and cell suspension cultures. Planta Medica, 52, 390-395.
71,
Zárate, R. (1999): Tropane alkaloid production by Agrobacterium rhizogenes transformed hairy root cultures of Atropa baetica Wilk. (Solanaceae). Plant Cell Reports, 18, 418-423. Zehra, M., Banerjee, S., Sharma, S., and Kumar, S. (1999): Influence of Agrobacterium rhizogenes strains on biomass and alkaloid productivity in hairy root lines of Hyoscyamus muticus and H. albus. Planta Medica, 65, 60-63.
72,
73,
Kephalas, T.A., McLennan, C.J., Ewans, W.C., Phillipson, J.D., and Roberts, M.F. (1989): Production of hyoscyamine and scopolamine in transformed roots of Datura candida hybrid. J. Pharm. Pharmacol., 41, 68.
74,
Hagemann, K., Piek, K., Stöckigt, J., and Weiler, E.W. (1992): Monoclonal antibody-based enzyme immunoassay for the quantitative determination of the tropane alkaloid scopolamine. Planta Medica, 58, 68-72.
75,
Kikuchi, Y., Irie, M., Yoshimatsu, K., Ishimaru, K., Shimomura, K., Satake, M., Sueyoshi, S., Tanno, M., Kamya, S., Sawada, J.I., and Terao, T. (1991): A monoclonal antibody to scopolamine and its use for competitive anzyme-linked immunosorbent assay. Phytochemistry, 30, 3273-3276.
76,
Gontier, E., Fliniaux, M.A., Barbotin, J.N., and Sangwan-Norreel, B.S. (1993): Tropane alkaloid leve ls in the leaves of micropropagated Datura innoxia plants. Planta Medica, 59, 432435.
77,
Jaziri, M., Yoshimatsu, K., Homés, J. and Shimomura, K. (1994): Traits of transgenic Atropa belladonna doubly transformed with different Agrobacterium rhizogenes strain. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 38, 257-262.
78,
Woo, S.H., Park, J.M., and Yang, J.W. (1997): Induction of branch roots by cutting method in Hyoscyamus niger root culture. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 48, 131-134.
79,
Lee, K.T., Suzuki, T., Yamakawa, T., Kodama, T., Igarashi, Y., and Shimomura, K. (1999): Production of tropane alkaloids by transformed root cultures of Atropa belladonna in strirred bioreactors with a stainless steel net. Plant Cell Reports, 18, 567-571.
80,
Tomás-Barberán, F.A. (1995): Capillary electrophoresis: A new technique in the analysis of plant secondary metabolites. Phytochemical Analysis, 6, 177-192.
81,
Cherkaoui, S., Mateus, L., Christen, P., and Veuthey, J.L. (1997): Micellar electokinetic capillary chromatography for selected tropane alkaloid analysis in plant extract. Chromatographia, 46, 351-357.
82,
Cherkaoui, S., Mateus, L., Christen, P., and Veuthey, J.L. (1999): Nonaqueous capillary electrophoresis for the analysis of selected tropane alkaloids in a plant extract. Chromatographia, 49, 54-60.
83,
Hiltunen, R., Rautio, M., and Rahkamaa, E. (1982): Application of NMR techniques in the quantitative analysis of tropane alkaloids and sennosides. Planta Medica, 45, 162.
84,
Kitagawa, I., Ishizu, T., Ohashi, K. and Shibuya, H. (2000): Chirality of natural products: Hyoscyamine and scopolamine. Yakugaku Zasshi-J. of the Pharmaceutical Society of Japan, 120, 1017-1023.
85,
Ford, Y.Y., Ratcliffe, R.G.,and Robins, R.J. (1998): In vivo nuclear-magnetic -resonance analysis of polyamine and alkaloid metabolism in transformed root cultures of Datura stramonium L.: evidence for the involvement of putrescine in phytohormone-induced dedifferentiation. Planta, 205, 205-213.
86,
Nakanashi, F., Sasaki, K., and Shimomura, K. (1998): Isolation and identification of littorine from hairy roots of Atropa belladonna . Plant Cell Reports, 18, 249-251.
87,
Lehtola, T., Huhtikangas, A., and Virtanen, R. (1982): Application of radioimmunoassay to the quantitation of hyoscyamine in plant material.Planta Medica, 45, 237-239.
88,
Weiler, E.W., Stöckigt, J., and Zenk, M.H. (1981): Radioimmunoassay for the quantitative determination of scopolamine. Phytochemistry, 20, 2009-2016.
89,
Oksman-Caldentey, K.M., and Strauss, A. (1986): Somaclonal variation of scopolamine content in protoplast-derived cell culture clones of H. muticus. Planta Medica, 52, 6-12. Savary, B.J., and Dougall, D.K. (1990): Scopolamine radioimmunoassay for tissue cultures of Datura. Phytochemistry, 29, 1567-1569.
90, 91,
Vanhala, L., Hiltunen, R., and Oksman-Caldentey, K.M. (1995): Virulence of different Agrobacterium strains on hairy root formation of Hyoscyamus muticus. Plant Cell Reports, 14, 236-240.
92,
Sevón, N., Hiltunen, R. and Oksman-Caldentey, K.M. (1998): Somaclonal variation in transformed root cultures and protoplast-derived hairy root cultures of Hyoscyamus muticus, Planta Med., 64, 37-41.
93,
Dorosiev, I., Simova, M., Kolarova, R., and Pangarova, T. (1983): Densitometric determination of scopolamine in plants. Pharmazie, 38, 419.
94,
Maldano-Mendoza, I.E., Ayora-Talavera, T., and Loyola -Vargas, V.M. (1993): Establishment of hairy root cultures of Datura stramonium. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 33, 321-329.
95,
Robins, R.J., Parr, A.J., Payne, J., Walton, N.J., and Rhodes, M.J.C. (1990): Factors regulating tropane-alkaloid production in a transformed root culture of a Datura candida x D. aurea hybrid. Planta, 181, 414-422.
96,
Veerporte, R., and Svendsen, A.B. (1976): High-performance liquid chromatography of some tropane alkaloids. Journal of Chromatography, 120, 203-205.
97,
Christen, P., Aoki, T., and Shimomura, K. (1992): Characteristics of growth and tropane alkaloid production in Hyoscyamus muticus hairy roots transformed with Agrobacterium rhizogenes A4. Plant Cell Reports, 11, 597-600.
98,
Ionkova, I., Witte, L., and Alfermann, A.W. (1989): Production of Alkaloids by Transformed Root Cultures of Datura innoxia. Planta Medica, 55, 229-230.
99,
Oshima, T., Sagara, K., Hirayama, F., Mizutani, T., He, L.Y., Tong, Y.Y., Chen, Y.H., and Itokawa, H. (1991): Combination of ion-pa ir and column switching in high-performance liquid chromatograohy of tropane alkaloids. Journal fo Chromatography, 547, 175-183.
100, Mandal, S., Naqvi, A.A., and Thakur, R.S. (1991): Analysis of some tropane alkaloids in plants by mixed column high-performance liquid chromatographya. Journal fo Chromatography, 547, 468-471. 101, Fliniaux, M.A., Manceau, F., and Jacquin -Dubreuil, A. (1993): Simultaneous analysis of lhyoscyamine, l-scopolamine and dl-tropic acid in plant material by reversed-phase highperformance liquid chomatography. Journal fo Chromatography, 644, 193-197. 102, Papadoyannis, I.N., Samanidou, V.F., Theodoridis, G.A., Vasilikiotis, G.S., van Kempen, G.J.M., and Beelen, G.M. (1993): A simple and quick solid phase extraction and reversed phase HPLC analysis of some tropane alkaloids in feedstuffs and biological samples. Journal fo Liquid Chromatography, 16, 975-998. 103, Vitale, A.A., Acher, A., and Pomilio, A.B. (1995): Alkaloids from Datura ferox from Argentina. Journal of Ethnopharmacology, 49, 81-89. 104, Ionkova, I., Witte, L., and Alfermann, A.W. (1994): Spectrum of tropane alkaloids in transformed roots of Datura innoxia and Hyoscyamus x györffyi cultivated in vitro. Planta Medica, 60, 382-384. 105, Nussbaumer, K., Kapétanidis, I., and Christen, P. (1998): Hairy roots of Datura candida x D. aurea : effect of culture medium composition on growth and alkaloid biosynthesis. Plant Cell Reports, 17, 405-409. 106, Cusido, R.M., Palazón, J., Piñol, M.T., Bonfill, M., and Morales, C. (1999): Datura metel: In vitro production of tropane alkaloids. Planta Medica, 65, 144-148. 107, Boitel-Conti, M., Laberche, J.-C., Lanoue, A., Ducrocq, C. and Sangwan-Norreel, B.S. (2000): Influence of feeding precursors on tropane alkaloid production during an abiotic stress in D. innoxia transformed roots. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 60, 131-137. 108, Maróti, M. (1976): A növényi szövettenyésztés alapjai. Akadémiai Kiadó, Budapest. 109, Palazón, J., Altabella, T., Cusidó, R., Ribó, M., and Pinol, M.T. (1995): Growth and tropane alkaloid production in Agrobacterium transformed roots and derived callus of Datura. Biologia Plantarum, 37, 161-168. 110, Murashige, T. and Skoog, F. (1968): A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant., 15, 473-497. 111, Dung, N.N., Szoke, É., and Verzár-Petri, G. (1981): The growth dynamics of callus tissues of root and leaf origin in Datura innoxia Mill. Acta Bot. Acad. Sci. Hung., 27, 325-333. 112, Misawa, M. (1995): Plant tissue culture: An alternative for production of useful metabolite. FAO Agricultural Services Bulletin, 108. 113, Endo, T., and Yamada, Y. (1985): Alkaloid production in cultured roots of three species of Duboisia. Phytochemistry, 24, 1233-1236.
114, Missaleva, N.V. (1991): Comparative study on the biosynthetic abilities of tissue and organ cultures of Datura innoxia Mill. Candidate Thesis, Semmelweis Medical University, Institute of Pharmacognosy, Budapest. 115, Robins, R.J., Parr, A.J. and Bent, E.G. (1991b): Studies on the biosynthesis of tropane alkaloids in Datura stramonium L. transformed root cultures. 3. The relationship between morphological integrity and alkaloid biosynthesis. Planta, 185, 385-390.
116, Tanaka, N. (1997): Strategies for the production of secondary metabolites by pRi-transformed regenerants. Plant Tissue Culture and Biotechnology, 3, 128-137. 117, Conner, A.J., and Dommisse, E.M. (1992): Monocotyledonous plants as hosts for Agrobacterium. Int. J. Plant Sci., 153, 550-555. 118, Burchi, G., Mercuri, A., De Benedetti, L., and Giovannini, A. (1996): Transformation methods applicable to ornamental plants. Plant Tissue Culture and Biotechnol., 2, 94-104. 119, Siemens, J., and Schieder, O. (1996): Transgenic plants: genetic transformation - recent developments and the state of the art. Plant Tissue Culture and Biotechnology, 2, 66-75. 120, Giri, A. and Narasu, M.L. (2000): Transgenic hairy roots: recent trends and applications. Biotechnology Advances, 18, 1-22. 121, Gyurján, I. (1999): Biotechnológia a mezogazdaságban. In: Humánökológia. A természetvédelem, a környezetvédelem és az embervédelem tudományos alapjai és módszerei (Nánási, I. Ed.), Medicina Könyvkiadó Rt., Budapest, pp. 451-477. 122, Hooykaas, P.J.J. (2000): Agrobacterium, a natural metabolic engineer of plants. In: Metabolic engineering of plant secondary metabolism (Verpoorte, R. and Alfermann, A.W., Eds.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Boston, London, pp.51-67. 123, David, C., and Tempé, J. (1988): Genetic transformation of cauliflower (Brassica oleracea L.var. Botrytis) by Agrobacterium rhizogenes. Plant Cell Reports, 7, 88-91. 124, Knopp, E., Strauss, A., and Wehrli, W. (1988): Root induction on several Solanaceae species by Agrobacterium rhizogenes and the determination of root tropane alkaloid content. Plant Cell Reports, 7, 590-593. 125, Flores, H.E., and Medina -Bolivar, F. (1995): Root culture and plant natural products: "unearthing" the hidden half of plant metabolism. Plant Tissue Culture and Biotechnology, 1, 59-74. 126, Dudits, D. és Heszky, L. (2000): Növényi biotechnológia és géntechnológia. Agroinform Kiadó, Budapest. 127, White , F.F. and Nester, E.W. (1980): Relationship of plasids responsible for hairy root and crown gall tumorigenicity. J. Bacteriol., 144, 710-720. 128, Petit, A., David, C., Dahl, G.A., Ellis, J.G., and Guyon, P. (1983): Further extension of the opine concept: Pla smids in Agrobacterium rhizogenes cooperate for opine degradation. Mol. Gen. Genet., 190, 204-214. 129, Jouanin, L. (1984): Restriction map of an agropine-type Ri plasmid and its homologies with Ti plasmids. Plasmid, 12, 91-102. 130, Jouanin, L., Tourneur, J., Tourneur, C., and Casse-Delbart, F. (1986): Restriction maps and homologiesof the three plasmids of A. rhizogenes strain A4. Plasmid, 16, 124-134. 131, Durand-Tardif M., Broglie, R., Slightom, J., and Tepfer, D. (1985): Structure and expression of Ri T-DNA from Agrobacterium rhizogenes in Nicotiana tabacum, Organ and phenotypic specificity. J. Mol. Biol., 186, 557-564. 132, Estramareix, C., Ratet, P., Boulanger, F., and Richaud, F. (1986): Multiple mutations in the transferred regions of the A. rhizogenes root-inducing plasmids. Plasmid, 15, 245-247. 133, Di Cola, A., Costantino, P., and Spanó, L. (1996): Cell commitment and rolB gene expression in the induction of root differentiation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 46, 203-209.
134, Bonhomme, V., Laurain-Mattar, D., and Fliniaux, M.A. (2000): Effects of the rol C gene on hairy root: Induction development and tropane alkaloid production by Atropa belladonna. Journal of Natural Products, 63, 1249-1252. 135, Sevón, N., Oksman-Caldentey, K.M., and Hiltunen, R. (1995): Efficient plant regeneration from hairy root-derived protoplasts of H. muticus, Plant Cell Reports, 14, 738-742. 136, Xu, P., Yun, D.J., Hasegawa, P.M., and Bressan, R.A. (1997): An expedient and reliable method to identify gene constructs in Agrobacterium vectors. Plant Tissue Culture and Biotechnology, 3, 37-40. 137, Hamill, J.D., Rounsley, S., Spencer, A., Todd, G., and Rhodes, M.J.C. (1991): The use of the polimerase chain reaction in plant transformation studies. Plant Cell Rep., 10, 221-224. 138, Watson, J.D., Tooze, J. and Kurtz, D.T. (1988): A rekombináns DNS. Mezogazdasági Kiadó, Budapest. 139, Curtis, I.S., Power, J.B., Hedden, P., Ward, D.A., Phillips, A., Lowe, K.C., and Davey, M.R. (1999): A stable transformation system for the ornamental plant, Datura meteloides D. C., Plant Cell Reports, 18, 554-560. 140, Moyano, E., Fornalé, S., Palazón, J., Cusidó, R.M., Bagni, N. and Pinol, T. (2002): Alkaloid production in Duboisia hybrid hairy root cultures overexpressing the pmt gene. Phytochemistry, 59, 697-702. 141, Dahl, G.A., Guyon, P., Petit, A., and Tempé, J. (1983): Silver nitrate-positive opines in crown gall tumors. Plant Science Letters, 32, 193-203. 142, Savka, M.A., Ravillion, B., Noel, G.R., and Farrand, S.K. (1990): Induction of hairy roots on cultivated soybean genotypes and their use to propagate the soybean cyst nematode. Phyophatology, 80, 503-508. 143, Dobigny, A., Ambroise, A., Haicour, R., David, C., Rossignol, L., and Sihachakr, D. (1995): Transformation of potato using mannopine and cucumopine strains of Agrobacterium rhizogenes. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 40, 225-230. 144, Kamada, H., Okamura, N., Satake, M., Harada, H., and Shimomura, K. (1986): Alkaloid production by hairy root cultures in Atropa belladonna . Plant Cell Reports, 5, 239-242. 145, Mano, Y., Okhawa, H. and Yamada, Y. (1989): Production of tropane alkaloids by hairy root cultures of Duboisia leichhardtii transformed by A. rhizogenes. Plant Sci., 59, 191-201. 146, Oksman-Caldentey, K.M., Sevón, N., Vanhala, L., and Hiltunen, R. (1994): Effect of nitrogen and sucrose on the primary and secondary metabolism of transformed root cultures of Hyoscyamus muticus. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 38, 263-272. 147, Muranaka, T., Okhawa, H. and Yamada, Y. (1992): Scopolamine release into media by Duboisia leichhardtii hairy root clones. Appl. Microbiol. Biotechnol., 37, 554-559. 148, Christen, P., Roberts, M.F., Phillipson, J.D., and Evans, W.C. (1989): High-yield production of tropane alkaloids by hairy-root cultures of a D. candida hybrid. Plant Cell Rep., 8, 75-77. 149, Boitel-Conti, M., Gontier, E., Laberche, J.C., Ducroucq, C., and Sangwan-Norreel, B.S. (1996): Inducer effect of tween 20 permeabilization treatment used for release of stored tropane alkaloids in Datura innoxia Mill. hairy root cultures. Plant Cell Rep., 16, 241-244.
150, Sikuli, N.N., and Demeyer, K. (1997): Influence of the ion-composition of the medium on alkaloid production by „hairy roots” of Datura stramonium. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 47, 261-667. 151, Baíza, A.M., Quiroz, A., Ruíz, J.A., Maldano-Mendoza, I., and Loyola -Vargas, V.M. (1998): Growth patterns and alkaloid accumulation in hairy root and untransformed root cultures of Datura stramonium. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 54, 123-130. 152, Subroto, M.A., Kwok, K.H., Hamill, J.D., and Doran, P.M. (1996): Coculture of genetically transformed roots and shoots for synthesis, translocation, and biotransformation of secondary metabolites. Biotechnology and Bioengineering, 49, 481-494. 153, Flores, H.E., Yao-Rem, D., Cuello, J.L., Maldano-Mendoza, I.E. and Loyola-Vargas, V.M. (1993): Green roots: photosynthesis and photoautotrophy in an underground plant organ. Plant Physiology, 101, 363-371. 154, Maldonado-Mendoza, I.E., and Loyola -Vargas, V.M. (1995): Establishment and characterization of photosynthetic hairy root cultures of Datura stramonium. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 40, 197-208. 155, Furze, J.M., Rhodes, M.J.C., Parr, A.J., Robins, R.J., Withehead, I.M., and Threlfall, D.R. (1991): Abiotic factors elicit sesquiterpenoid phytoalexin production but not alkaloid production in transformed root cultures of Datura stramonium. Plant Cell Rep., 10, 111-114. 156, Sauerwein, M., and Shimomura, K. (1991): Alkaloid production in hairy roots of Hyoscyamus albus transformed with A. rhizogenes. Phytochemistry, 30, 3277-3280. 157, Missaleva, N.V., Petri, G., Reuter, G., Szoke, É. and Markish, U. (1993): Influence of phaseolotoxin on the alkaloid accumulation in Datura innoxia Mill. Acta Pharm. Hung., 63, 307-312. 158, Rhodes, M.J.C., Parr, A.J., Giulietti, A., and Aird, E.L.H. (1994): Influence of exogenous hormones on the growth and secondary metabolite formation in transformed root cultures. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 38, 143-151. 159, Khanam, N., Khoo, C. and Khan, A.G. (2000): Effects of cytokinin/auxin combinatio ns on organogenesis, shoot regeneration and tropane alkaloid production in Duboisia myoporoides. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 62, 125-133. 160, Hilton, M.G., and Rhodes, J.C. (1993): Factors affecting the growth and hyoscyamine production during batch culture of transformed roots of Datura stramonium. Planta Medica, 59, 340-344. 161, Miraldi, E., Masti, A., Ferri, S. and Comparini, I.B. (2001): Distribution of hyoscyamine and scopolamine in Datura stramonium. Fitoterapia, 72, 644-648. 162, Peto, M. (1984): Mezogazdasági növények élettana. Mezogazdasági Kiadó, Budapest. 163, Szoke, É., Kiss, A.S., Kursinszki, L., and Petri, G. (1992): Inhibition of aluminium toxicity by magnesium and citric acid in tobacco tissue culture. Magnesium Research, 5, 83-87. 164, Szoke, É. (1994a): Inhibition of the toxicity of aluminium by magnesium and citric acid in tobacco tissue cultures. In: Magnesium in biological systems, Environmental and biomedical aspects, Fazekas, T., Selmeczi, B. and Stefanovits, P. (Eds.), Akadémia Kiadó, Budapest, pp. 94-98. 165, Szoke, É. (1994b): The effects of magnesium on changes in growth intensity of hairy root cultures of the Datura candida x D. aurea hybrid. In: Magnesium in biological systems,
Environmental and biomedical aspects, Fazekas, T., Selmeczi, B. and Stefanovits, P. (Eds.), Akadémia Kiadó, Budapest, pp. 93-94.
166, Máday, E., Szoke, É., Lemberkovics, É. and Muskáth, Zs. (1998): Essential oil content of chamomile hairy root cultures cultivated on magnesium containing media. In: Magnesium, Magnesium and Interaction of Magnesium with Trace Elements, Kiss, A.S. (Ed.), Hungarian Chemical Society, Budapest, pp. 362-366. 167, Kursinszki, L., Troilina, J. and Szoke, É. (2000): Quantitative TLC of visnagin in genetically transformed root cultures of A. visnaga. J. of Planar Chromatogr., 13, 463-467. 168, Bálványos, I., Vida, K., Tóth, E. and Szoke, É. (2001) The effect of magnesium on the alkaloid production of Atropa belladonna L. hairy roots. Magnesium Research, 14, 163-164. 169, Hashimoto, T., Matsuda, J. and Yamada, Y. (1993a): Two-step epoxidation of hyoscyamine to scopolamine is catalyzed by bifunctional H6H. FEBS Lett., 329, 35-39. 170, Jouhikainen, K., Lindgren, L., Jokelainen, T., Hiltunen, R., Teeri, T.H., and Oksman-Caldentey, K.M. (1999): Enhancement of scopolamine production in Hyoscyamus muticus L. hairy root cultures by genetic engineering. Planta, 208, 545-551. 171, Yun, D.J., Hashimoto, T. and Yamada, Y. (1992): Metabolic engineering of medicinal plants: Transgenic Atropa belladonna with an improved composition. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 11799-11803. 172, Kanegae, T., Kayija H., Amano, Y., Hashimoto, T., and Yamada, Y. (1994): Species-dependent expression of the hyoscyamine 6 beta-hydroxylase gene in the perycycle. Plant Physiology, 105, 483-490. 173, Sato, F., Hashimoto, T., Hachiya, A., Tamura, K., Choi, K., Morishige, T., Fujimoto, H. and Yamada, Y. (2000): Metabolic engineering of plant alkaloid biosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 367-372. 174, Aird, E.L.H., Hamill, J.D.,and Rhodes, M.J.C. (1988): Cytogenic analys is of hairy root cultures from a number of plant species transformed by Agrobacteruim rhizogenes. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 15, 47-57. 175, Baíza, A.M., Quiroz-Moreno, A., Ruíz, J.A., and Loyola -Vargas, V.M. (1999): Genetic stability of hairy root cultures of Datura stramonium. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 59, 9-17. 176, Deus-Neumann, B. and Zenk, M.H. (1984): Exploitation of plant cells for the production of natural compounds. Biotechnol. Bioeng., 24, 1965-1974. 177, Bayliss, M.W. (1980): Chromosomal variation in plant tissues in culture. Int. Rev. Cytol., 1117, 113-144. 178, Walker, J.K. (1964): Formaldehyde. Kieger, R.E. Publ. Co., Huntington, New York. 179, International Agency for Research on Cancer (1995): IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, Wood Dust and Formaldehyde, 62. 180, Swenberg, J.A., Kerns, W.D., Mitchell, R.I., Gralla, E.J. and Pavkov, K.I. (1980): Induction of squamous cell carcinomas of the rat nasal cavity by inhalation exposure to formaldehyde vapor. Cancer Res., 4, 3398 -3402. 181, Heck, H., Casanova, M. and Starr, T.B. (1990): Formaldehyde toxicity – new understanding. Crit. Rev. Toxicol., 2, 397-426.
182, Collins, J.J., Esmen, N.A. and Hall, T.A. (2001): A review and meta-analysis of formaldehyde exposure and pancreatic cancer. Am. J. Ind. Med., 39, 336-345. 183, Tyihák, E., Trézl, L., and Rusznák, I. (1980): Spontaneous N∈-methylation of L-lysine by formaldehyde. Pharmazie, 35, 18-20. 184, Merk, O., and Speit, G. (1998): Significance of formaldehyde-induced DNA-protein crosslinks for mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis, 32, 260-268. 185, Tyihák, E. (2002): Formaldehid ciklus az élovilágban. Biokémia, 26, 2-9. 186, Grafström, R.C., Hsu, I.C. and Harris, C.C. (1993): Mutagenicity of formaldehyde in Chinese hamster lung fibroblasts: synergy with ionizing radiation and N-nitroso-N-methylurea. Chem. Biol. Interact., 86, 41-49. 187, Barry, M.A., and Eastman, A. (1992): Endonuclease activation during apoptosis: The role of cytosolic Ca 2+ and pH. Biochem. Biophys. Res. Commun. , 186, 782-789. 188, Trézl, L., Rusznák, I., Tyihák, E., Szarvas, T. and Szende, B. (1983): Spontaneous N epsilonmethylation and N epsilon-formilation reactions between L-lysine and formaldehyde inhibited by L-ascorbic acid. Biochem J., 214, 289-292. 189, Tyihák, E., and Szoke, É. (1996): Measurement of formaldehyde and some fully N-methylated substances in cultures of Datura innoxia. Plant Growth Regulation, 20, 317-320. 190, Thorndike, J. and Beck, W.S. (1977): Production of formaldehyde from N5-methyltetrahydrofolate by normal and leukemic leukocytes. Cancer Res., 37, 1125-1132. 191, Yu, P.H. (1998): Increase of formation of methylamine and formaldehyde in vivo after administration of nicotine and the potential cytotoxicity. Neurochem. Res., 23, 1205-1210. 192, Trézl, L. and Pipek, J. (1988): Formation of excited formaldehyde in model reactions simulating real biologycal systems. J. Mol. Struct. (Theochem), 170, 213-223. 193, Trézl, L., Török, G., Vasvári, G., Pipek, J. and Hullán, L. (1992): Formation of burst chemiluminescence, excited aldehydes and singlet oxygen in model reactions and from carcinogenic compound in rat liver S9 fractions. Periodica Polytechnica Ser. Chem. Eng., 36, 239-247 194, Mesnard, F., Roscher, A., Garlick, A.P., Girard , S., Baguet, E., Arroo, R.R.J., Lebreton, J., Robins, R.J. and Ratcliffe, R.G. (2002): Evidence of the involvement of tetrahydrofolate in the demethylation of nicotine by Nicotiana plumbaginifolia cell-suspension cultures. Planta, 214, 911-919. 195, Adams, R.L.P. and Burdon, R.H. (1985): Molecular biology of DNA methylation. SpringerVerlag, New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo. 196, Huszti, T., and Tyihák, E. (1986): Formation of formaldehyde from S-adenosyl-L-[methyl3 H]methionine during enzymic transmethylation of histamine. FEBS Letters, 209, 362-366. 197, Spencer, D. and Henshall, T. (1955): The kinetics and mechanisms of the reaction of formaldehyde with dimedone (Part I). J. Am. Chem. Soc., 77, 1943-1948. 198, Tyihák, E., Szende, B. and Lapis, K. (1977): Biological significance of methylated derivatives of lysine and arginine. Life Sci., 20, 385-392.
199, Jeney, A., Gyapay, G., Lapis, K., Szende, B., Bursics, L., and Tyihák, E. (1980): Methylationlike reaction of [3 H-methyl]-N-6-trimethyllysine (TML) to chromatin components. Biochemical Pharmacology, 29, 2729-2732. 200, Trézl, L., Tyihák, E. and Lotlikar, P.D. (1990): Nonenzymatic protein methylation and its biological significance. In: Protein Methylation (Paik, W.K. and Kim, S. Eds.), CRP Press, Boca Raton, Florida, pp. 408-431. 201, Tyihák, E., Szende, B. and Trézl, L. (1990): Biological effects of methylated amino acids. In: Protein Methylation (Paik, W.K. and Kim, S. Eds.), CRP Press, Boca Raton, Florida, pp.363388. 202, Tyihák, E., Trézl, L., and Szende, B. (1998): Formaldehyde cycle and the phases of stress syndrome. In: Stress of Life, From Molecules to Man (Csermely, P. Ed.), Annals of the New York Academy of Sciences, New York, 851, 259-270. 203, Tyihák, E., Gáborjányi, R., János, É., Trézl, L., Rusznák, I. and Balla, J. (1987): Increased Ndemethylase activity in TMV infected hypersensitive tobaccos and the supposed reactions of formed formaldehyde. Proc. 18th Hung. Annu. Meet. Biochem., Salgótarján, Hungary, pp. 135136. 204, Adrian-Romero, M., Blunden, G., Carpenter, B.G., and Tyihák, E. (1999): HPLC quantification of formaldehyde, as formaldemethone, in plants and plant-like organisms. Chromatographia, 50, 160-166. 205, Albert, L., Németh, Zs., Barna, T., Varga, Sz., and Tyihák, E. (1998): Measurement of endogenous formaldehyde in early developmental stages of European turkey oak (Quercus cerris L.). Phytichemical Analysis, 9, 1-5. 206, Sárdi, É. and Tyihák, E. (1998): Relationship between dimedone concentration and formaldehyde captured in plant tissues. Acta Biol. Hung., 49, 291-301. 207, Trézl, L., Hullán, L., Szarvas, T., Csiba, A. and Szende, B. (1998): Determination of endogenous formaldehyde in plants (fruits) bound to L-arginine and its relation to folate cycle, photosynthesis and apoptosis. Acta Biol. Hung., 49, 253-263. 208, Blunden, G., Carpenter, B.G., Adrian-Romero, M., Yang, M.H. and Tyihák, E. (1998): Formaldehyde in the plant kingdom. Acta Biol. Hung., 49, 239-246.
209, Tyihák, E., Rozsnyai, Z., Sárdi, É. and Szoke, É. (1992b): Formaldehyde cycle and the cell proliferation: Plant tissue as a model. In: Proc. 3rd Intern. Conf. on the Role of Formaldehyde in Biological Systems. Tyihák E. (ed.), Hungarian Biochemical Society, Budapest, pp. 139-144. 210, Tyihák, E., Rozsnyai, Z., Sárdi, É., Gullner, G., Trézl, L. and Gáborjányi, R. (1994): Possibility of formation of excited formaldehyde and singlet oxigen in biotic and abiotic stress situations. Acta Biol. Hung., 45, 3-10. 211, Hullán, L., Trézl, L., Szarvas, T. and Csiba, A. (1998): The hydrazine derivative aminoguanidine inhibits the reactio n of tetrahydrofolic acid with hydroxymethylarginine biomolecule. Acta Biol. Hung., 49, 265-273. 212, Chen, M.S. and Schirch, L. (1973): Serine transhydroxymethylase. J. Biol. Chem., 248, 36313635. 213, Szarvas, T., Pozsár, B. and Simon, L.P. (1983): Detection of endogenous free formaldehyde in plants and its relationship with photosynthesis. Acta Agron. Acad. Sci. Hung., 32, 313-29.
214, Trézl, L., Hullán, L., M. Jászay, Zs., Szarvas, T., Petneházy, I., Szende, B., Bocsi, J., Takáts, Z., Vékey, K. and Toke, L. (2003): Antagonistic reactions of arginine and lysine against formaldehyde and their relation to cell proliferation, apoptosis, folate cycle and photosynthesis. Molecular and Cellular Biochemistry, 244, 167-176. 215, Sárdi, É. and Stefanovits-Bányai, É. (1998): Investigation of some methylated compounds and peroxidase activity during plant ontogenesis in snap bean. Acta Biol. Hung., 49, 381-91. 216, Szende, B., Lapis, K. and Simon, K. (1982): Combined effect of cytostatic drugs and E-N-Ltrimethyllysyne in healthy and transplantable tumor bearing mice. Neoplasma, 29, 427-39. 217, Tramontano, W.A., Harmett, C.M., Lynn, D.G. and Evans, L.S. (1982): Relationship between trigonelline concentration and promotion of cell arrest in G2 in cultured roots of Pisum sativum. Phytochemistry, 21, 1201-1206. 218, Blunden, G. and Gordon, S.M. (1986): Betaines and their sulphonio analogues in marine algae. In: Progress in Phycological Research, Round-Chapman, ed., Vol. 4., Biopress Ltd., London. 219, Tyihák, E., Balla, J., Gáborjányi, R. and Balázs, E. (1978): Increased free formaldehyde level in crude extracts of virus infected hypersensitive tobaccos. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung., 13, 29-31. 220, Burgyán, J., Szarvas, T., and Tyihák, E. (1982): Increased formaldehyde production from Lmethionine -(S-14 CH3) by crude enzyme of TMV-infected tobacco leaves. Acta Phytopathol. Acad. Scient. Hung., 17, 11-15. 221, Simons, T.J. and Ross, A.F. (1971): Metabolic changes associated with systemic induced resistance to tobacco mosaic virus in Samsun SS tobacco. Phytopath., 61, 293-300. 222, Sárdi, É. and Tyihák, E. (1992): Effect of Fusarium infection on the formaldehyde cycle in parts of water melon (Citrullus vulgaris L.) plants. In: Proc. 3rd Intern. Conf. Role of Formaldehyde in Biological Systems. Methylation and Deme thylation Processes, Tyihák, E., ed., Hung. Biochem. Soc., Sopron, Hungary, pp. 145-150. 223, Stefanovits-Bányai, É., Sárdi, É., Lakatos, S., Zayan, M. and Velich, I. (1998): Drought stress, peroxidase activity and formaldehyde metabolism in bean plants. Acta Biol. Hung., 49, 309316. 224, Tyihák, E., Király, Z., Gullner, G., and Szarvas, T. (1989): Temperature-dependent formaldehyde metabolism in bean plants. The heat shock response. Plant Sci., 59, 133-189. 225, Anthoni, U., Christophersen, C., Hougaard, L., and Nielsen, P.H. (1991): Quaternary ammonium compounds in the biosphere - An example of a versatile adaptive strategy. Comp. Biochem. Physiol., 99B , 1-18. 226, Gullner, G. and Tyihák, E. (1987): Hydrogen peroxide dependent N-demethylase activity in the leaves of normal and heat-shocked bean plants. Plant Sci., 52, 21-27. 227, Németh, Zs.I., Albert, L. and Varga, Sz. (1998): Changes in formaldehyde contents of germinating acorns of Quercus cerris L. under low temperature stress conditions. Acta Biol. Hung., 49, 369-374. 228, Mittler, R. and Lam, E. (1996): Sacrifice in the face of foes: pathogen-induced programmed cell death in plants. Trends in Microbiology, 4, 10-15. 229, Jones, A.M. and Dangl, J.L. (1996): Logjam at the Styx: programmed cell death in plants. Trends in Plant Science, 1, 114-119.
230, Heath, M.C. (1998): Apoptosis, programmed cell death and the hypersensitive response. European Journal of Plant Pathology, 104, 117-124. 231, Gietl, C. and Schmid, M. (2001): Ricinosomes: an organelle for developmentally regulated programmed cell death in senescing plant tissues. Naturwissenschaften, 88, 49-58. 232, Beers, E.P. (1997): Programmed cell death during plant growth and development. Cell Death and Differentiation, 4, 649-661. 233, Jabs, T. (1999): Reactive oxygen intermediates as mediators of programmed cell death in plants and animals. Biochemical Pharmacology, 57, 231-245. 234, Leist, M., Single, B., Castoldi, A.F., Kuhnle, S. and Nicotera, P. (1997): Intracellular, adenosine triphosphate (ATP) concentration: A switch in the decision, between apoptosis and necrosis, J. Exp. Med., 185, 1481-1486. 235, Danon, A., Delorme, V., Mailhac, N. and Gallois, P. (2000): Plant programmed cell death: A common way to die. Plant Physiol. Biochem. 38, 647-655. 236, Carson, D.A. and Ribeiro, J.M. (1993): Apoptosis and disease. The Lancet, 341, 1251-1254. 237, Papini, A., Mosti, S., and Brighigna, L. (1999): Programmed-cell-death events during tapetum development of angiosperms. Protoplasma, 207, 213-221. 238, Simeononva, E., Sikora, A., Charzynska, M. and Mostowska, A. (2000): Aspects of programmed cell death during leaf senescence of mono- and dicotyledonous plants. Protoplasma, 214, 93-101. 239, Beers, E.P. and McDowell, J.M. (2001): Regulation and execution of programmed cell death in response to plant pathogens, stress and developmental cues. Current Opinion in Plant Biology, 4, 561-567. 240, Greenberg, J.T., Guo, A., Klessig, D.F., and Ausubel, F.M. (1994): Programmed Cell Death in Plants: A Pathogen-Triggered Response Activated Coordinately with Multiple Defense Functions. Cell, 77, 551-563. 241, Taylor, C.B. (1998): Defense responses in plants and animals – More of the same. The Plant Cell, 10, 873-876. 242, Kerr, J.F.R., Wyllie, A.H. and Currie, A.R. (1972): Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer, 26, 239-257. 243, Lawen, A., Baker, M.A., and Malik, S. (1998): Apoptosis and redox homostasis: on a possible mechanism of action of Bcl-2. Protoplasma, 205, 10-20. 244, Delorme, V.G.R., McCabe, P.F., Kim, D.J. and Leaver, C.J. (2000): A matrix metalloproteinase gene is expressed at the boundary of senescence and programmed cell detath in cucumber. Plant Physiol., 123, 917-927. 245, Filonova, L.H., Bozhkov, P.V., Brukhin, V.B., Daniel, G. and Zhivotovsky, B. (2000): Two waves of programmed cell death occur during formation and development of somatic embryos in the gymnosperm, Norway spruce. J. Cell Sci., 113, 4399-4411. 246, Schussler, E.E. and Longstreth, D.L. (2000): Changes in cell structure during the formation of root aerenchyma in Sagittar ia lancifolia (Alismataceae ). Am. J. Botany, 87, 12-19. 247, Xu, Y. and Hanson, M.R. (2000): Programmed cell death during pollination-induced petal senescence in petunia. Plant Physiol., 122, 1323-1333.
248, Yamada, T., Marubashi, W. and Niwa, M. (2000): Apoptotic cell death induces temperaturesensitive lethality in hybrid seedlings and calli derived from the cross of Nicotiana suaveolens x N. tabacum. Planta, 211, 614-622. 249, de Jong, A.J., Yakimova, E.T., Kapchina, V.M. and Woltering, E.J. (2002): A critical role for ethylene in hidrogen peroxide release during programmed cell death in tomato suspension cells. Planta, 214, 537-545. 250, Cohen, J.J. (1993): Apoptosis. Immunol. Today, 14, 126-130. 251, Lam, E., Pontier, D. and del Pozo, O. (1999): Die and let live – programmed cell death in plants. Current Opinion in Plant Biology, 2, 502-507. 252, Aoyagi, S., Sugiyama, M. and Fukuda, H. (1998): BEN1 and ZEN1 cDNAs encoding S1-type DNases that are associated with PCD in plants. FEBS Letters, 429, 134-138. 253, Mittler, R., Simon, L. and Lam, E. (1997): Pathogen-induced programmed cell death in tobacco. J. Cell Sci., 110, 1333-1344. 254, Gorczyca, W., Tuziak, T., Kram, A., Melamed, M.R. and Darzynkiewicz, Z. (1994): Detection of apoptosis DNA strands breaks in fine-needle aspiration biopsies by in situ end labelling of fragmented DNA. Cytometry, 15, 169-175. 255, Wang, H., Li, J., Bostock, R.M., and Gilchrist, D.G. (1996a): Apoptosis: A functional paradigm for programmed plant cell death induced by a host-selective phytotoxin and invoked dur ing development. The Plant Cell, 8, 375-391. 256, Wang, M., Oppedijk, B.J., Lu, X., Van Duijn, B., and Schilperoort, R.A. (1996b): Apoptosis in barley aleurone during germination and its inhibition by abscisic acid. Plant Molecular Biology, 32, 1125-1134. 257, Danon, A. and Gallois, P. (1998): UV-C radiation induces apoptotic -like changes in Arabidopsis thaliana. FEBS Letters, 437, 131-136. 258, Lacomme, C. and Santa Cruz, S. (1999): Bax-induced cell death in tobacco is similar to the hypersensitive response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 7956-7961. 259, Dion, M., Chamberland, H., St-Michel, C., Plante, M., Darveau, A., Lafontaine, J.G. and Brisson, L.F. (1997): Detection of a homologue of bcl-2 in plant cells. Biochem. Cell Biol., 75, 457-461.
260, Fukuda, H. (1996): Xylogenesis: initiation, progression, and cell death. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 47, 299-325. 261, Richberg, M.H., Aviv, D.H. and Dangl, J.L. (1998): Dead cells do tell tales. Curr. Opin. Plant Biol., 1, 480-485. 262, Groover, A. and Jones, A.M. (1999): Tracheary element differentiation uses a novel mechanism coordinatingprogrammed cell death and secondary cell wall synthesis. Plant Physiol., 119, 375384. 263, Kroemer, G., Zamzami, N. and Susin, S.A. (1997): Mitochondrial control of apoptosis. Immunol. Today, 18, 44-51. 264, Jones, A.M. (2000): Does the plant mitochondrion integrate cellular stress and regulate programmed cell death, Trends in Plant Science, 5, 225-230. 265, Thornberry, N.A. and Lazebnik, Y. (1998): Caspases: enemies within. Science, 281, 1312-1316.
266, Dickman, M.B., Park, Y.K., Oltersdorf, T., Li, W., Clemente, T. and French, R. (2001): Abrogation of disease development in plants expressing animal antiapoptotic genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 6957-6962. 267, Uren, A.G., O`Rourke, K., Aravind, L.A., Pisabarro, M.T., Seshagiri, S., Koonin, E.V. and Dixit, V.M. (2000): Identification of paracaspases and metacaspases: two ancient families of caspase-like proteins, which plays a key role in MALT lymphoma. Mol. Cell, 6, 961-967. 268, Clarke, A., Desikan, R., Hurst, R.D., Hancock, J.T. and Neill, S.J. (2000): No way back: nitric oxide and programmed cell death in Arabidopsis thaliana suspension cultures. Plant J., 24, 667677. 269, Solomon, M., Belenghi, B., Delledonne, M., Menachem, E. and Levine, A. (1999): The involvement of cysteine proteases and protease inhibitor genes in the regulation of programmed cell death in plants. Plant Cell, 11, 431-444. 270, Jabs, T., Dietrich, R.A. and Dangl, J.L. (1996): Initiation of runaway cell death in an Rabidopsis mutant by extracellular superoxide. Science, 273, 1853-1856. 271, Pastori, G.M. and del Rio, L.A. (1997): Natural senescence of pea leaves. An active oxygenmediated function for peroxisomes. Plant Physiol., 113, 411-418. 272, Roebuck, P., Sexton, R. and Mansfield, J.W. (1978): Ultrastructural observations on the development of the hypersensitive reaction in leaves of Phaseolus vulgaris cv. Red Mexican inoculated with Pseudomonas phaseolicola (race 1). Physiol. Plant Pathol., 12, 151-157. 273, Smart, C.M. (1994): Gene expression during leaf senescence. New Phytol., 126, 419-448. 274, Koukalová, B., Kovarik, A., Fajkus, J. and Siroky, J. (1997): Chromatin fragmentation associated with apoptotic changes in tobacco cells exposed to cold stress. FEBS Letters, 414, 289-292. 275, Streb, P. and Feierabend, J. (1996): Oxidative stress responses accompanying photoinactivation of catalase in NaCl-treated rye leaves. Bot. Acta, 109, 125-132. 276, Green, R. and Fluhr, R. (1995): UV-B–induced PR-1 accumulation is mediated by active oxygen species. Plant Cell, 7, 203-212. 277, Levine, A., Tenhaken, R., Dixon, R. and Lamb, C. (1994): H2 O 2 from the oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease resistance response. Cell, 79, 583-593. 278, Chandra, S., Martin, G.B. and Low, P.S. (1996): The Pto kinase mediates a signaling pathway leading to the oxidative burst in tomato. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 13393-13397. 279, Delledonne, M., Xia, Y., Dixon, R.A. and Lamb, C. (1998): Nitric oxide functions as a signal in plant disease resistance. Nature, 394, 585-588. 280, Jabs, T., Colling, C., Tschöpe, M., Hahlbrock, K. and Scheel, D. (1997): Elicitor-stimulated ion fluxes and O2 - from the oxidative burst are essential components in triggering defense gene activation and phytoalexin synthesis in parsley. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4800-4805. 281, Chae, H.S. and Lee, W.S. (2001): Ethylene - and enzyme-mediated superoxide production and cell death in carrotcells grown under carbon starvation. Plant Cell Rep., 20, 256-261. 282, Fernandez, L., Kiefer, J., Fosdick, L. and McConkey, D. (1995): Oxygen radical production and thiol depletion are required for Ca2+-mediated endogenous endonuclease activation in apoptotic thymocytes. J. Immunol., 155, 5133-5139.
283, Jones, D.P., Thor, H., Smith, M.T., Jewell, S.A. and Orrenius, S. (1983): Inhibition of ATPdependent microsomal Ca 2+ sequestration during oxidative stress and its prevention by glutathione. J. Biol. Chem., 258, 6390-6393. 284, Zettl, U.K., Mix, E., Zielasek, J., Stangel, M., Hartung, H.P. and Gold, R. (1997): Apoptosis of myelin-reactive T cells induced by reactive oxigen and nitrogen intermediates in vitro. Cell Immunol., 178, 1-8. 285, Jacobson, M.D. and Raff, M.C. (1995): Programmed cell death and Bcl-2 protection in very low oxigen. Nature, 374, 814-816. 286, Sandstrom, P.A., Tebbey, P.W., Van Cleave, S. and Buttke, T.M. (1994): Lipid hydroperoxides induce apoptosis in T cells displaying a HIV-associated glutathione peroxidase deficiency, J. Biol. Chem., 269, 798-801. 287, Durner, J., Wendehenne, D. and Klessig, D.F. (1998): Defense gene induction in tobacco by nitric oxide, cyclic GMP, and cyclic ADP-ribose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 10328-10333. 288, Torres, M.A., Onouchi, H., Hamada, S., Machida, C., Hammond-Kosack, K.E. and Jones, J.D. (1998): Six Arabidopsis thaliana homologues of the human respiratory burst oxidase (gp91phox).Plant J., 14, 365-370. 289, Chivasa, S. and Carr, J.P. (1998): Cyanide restores N gene-mediated resistance to tobacco mosaic virus in transgenic tobacco expressing salicylic acid hydroxylase. Plant Cell, 10, 14891498. 290, Crompton, M. (1999): The mitochondrial permeability transition pore and its role in cell death. Biochem J., 341, 233-249. 291, Balk, J., Leaver, C.J. and McCabe, P.F. (1999): Translocation of cytochrome c from the mitochondria to the cytosol occurs during heat-induced programmed cell death in cucumber plants. FEBS Letters, 463, 151-154. 292, Briviba, K., Klotz, L.O. and Sies, H. (1997): Toxic and signaling effects of photochemically or chemically generated singlet oxygen in biologycal systems. Biol. Chem., 378, 1259-1265. 293, Dahl, T.A., Midden, W.R. and Hartman, P.E. (1987): Pure singlet oxygen cytotoxicity for bacteria. Photochemistry and Photobiology, 46, 345-352. 294, Kochevar, I.E., Lynch, M.C., Zhuang, S. and Lambert, C.R. (2000): Singlet oxygen, but not oxidizing radicals, induces apoptosis in HL-60 cells. Photochemistry and Photobiology, 72, 548-553. 295, Zhuang, S., Demirs, J.T. and Kochevar, I.E. (2000): p38 mitogen-activated protein kinase mediates bid cleavage, mitochondrial dysfunction, and caspase-3 activation during apoptosis induced by singlet oxygen but not by hidrogen peroxide. The J. of Biol. Chem., 275, 2593925948. 296, Service, R.F. (2001): Body’s secret weapon: burning water?, News of the week, Science, 293, 174. 297, Tyihák, E., Bocsi, J., Timár, F., Rácy, G., and Szende, B. (2001): Formaldehyde promotes and inhibits cell proliferation of cultured tumor and endothelial cells. Cell Prolif. 34, 135-141. 298, Szende, B., Tyihák, E., Szókán, Gy., and Kátay, Gy. (1995): Possible role of formaldehyde in the apopotic and mitotic effect of 1-methyl-ascorbigen. Pathol. Oncol. Res., 1, 38-42.
299, Bocsi, J., Nagy, K., Tyihák, E., Trézl, L. and Szende, B. (1998): Reduction of apoptosis of in vitro cultured lymphocytes of HIV-positive persons by NG -hydroxy-methilated-L-arginine and 1’-methyl-ascorbigen. Acta Biol. Hung., 49, 331-337. 300, Hooykaas, P. J. J., Klapwik, P., Nuti, M. P., Schilperoort, R. A. and Rorsch, A. (1977) Transfer of Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid to avirulent agrobacteria and to Rhizobium ex planta. J. Gen. Microbiol., 98, 477-484. 301, Villalobos-Amador, E., Rodríguez-Hernández, G. and Pérez-Molphe-Balch, E. (2002): Organogenesis and Agrobacterium rhizogenes-induced rooting in Pinus maximartinezii Rzedowsky and P. pinceana Gordon. Plant Cell Reports, 20, 779-785.
302, Petri, G. (1979): Drogatlasz, Drogok mikroszkópos vizsgálata. Laboratóriumi tankönyv gyógyszerészhallgatók részére, Medicina Kiadó, Budapest. 303, Tyihák, E., Blunden, G., Yang, M.H., Crabb, T.A., and Sárdi, É.(1996): Formaldehyde, as its dimedone adduct, from Ascophyllum nodosum. J. of Applied Phycology, 8, 211-215. 304, Sváb, J. (1981): Biometriai módszerek a kutatásban. Harmadik, átdolgozott és bovített kiadás. Mezogazdasági Kiadó, Budapest. 305, Szoke, É. (1995): Gyógynövény szövettenyészetek hatóanyag képzésének optimalizálása, Tudományok doktotra értekezés, Budapest. 306, Nuutila, A.M., Vestberg, M. and Kauppinen, V. (1994): Infection of hairy roots of strawberry (Fragaria x Ananassa Duch.) with arbuscular mycorrhizal fungus. Plant Cell Reports, 14, 505509.
307, Petri, G. (1971): Alkaloidok képzodése és lokalizációja a növényi szövetekben. Doktori értekezés, Eötvös Lóránd Tudományegyetem, Budapest. 308, Lambert, C.E. and Shank, R.C. (1988): Role of formaldehyde hydrazone and catalase in hydrazine-induced methylation of DNA guanine. Carcinogenesis, 9, 65-70.
