UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Farmaceutische Analyse Laboratorium voor Radiofarmacie Academiejaar 2012-2013
OPTIMALISATIE RADIOSYNTHESE VAN 2-(2-[18F]FLUOROETHYL)-L-FENYLALANINE EN O-(2-[18F]FLUOROETHYL)-L-TYROSINE Stef DE LOMBAERDE 1ste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling
Promotor
Prof. dr. F. De Vos Commissarissen
Prof. Dr. B. De Spiegeleer Dr. K. Kersemans
UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Farmaceutische Analyse Laboratorium voor Radiofarmacie Academiejaar 2012-2013
OPTIMALISATIE RADIOSYNTHESE VAN 2-(2-[18F]FLUOROETHYL)-L-FENYLALANINE EN O-(2-[18F]FLUOROETHYL)-L-TYROSINE Stef DE LOMBAERDE 1ste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling
Promotor
Prof. dr. F. De Vos Commissarissen
Prof. Dr. B. De Spiegeleer Dr. K. Kersemans
AUTEURSRECHT
"De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef."
Mei, 2013
Promotor Prof. dr. F. De Vos
Auteur Stef De Lombaerde
SAMENVATTING Positron Emisson Tomography (PET) behoort tot het domein van de nucleaire geneeskunde en is de laatste decennia aan een opmars bezig. Deze techniek kan aanvullende, functionele informatie verschaffen die nuttig is voor het karakteriseren van tumoren. Het huidige PET-radiofarmacon bij uitstek, [18F]FDG, vertoont enkele gebreken waarvoor
18
F-gelabelde aminozuren een oplossing kunnen bieden. Momenteel blijft succes
met deze laatste klasse verbindingen echter beperkt tot hoofd- en nektumoren.
18
F-
aminozuren die de LAT-1 aminozuurtransporter als substraat hebben, zouden mogelijks wel voor karakterisatie van perifere tumoren gebruikt kunnen worden. 2-(2-[18F]fluoroethyl)-L-fenylalanine (2-[18F]FELP) is een nieuw PET-radiofarmacon dat met hoge affiniteit bindt op LAT-1. Een eerste deel van deze masterproef omvatte de synthese van de precursormolecule voor de radiosynthese van 2-[18F]FELP , (S)-2-tertbutoxycarbonylamino-3-(2-(2-tosyloxyethyl)fenyl)-propaanzuur verbinding
werd
succesvol
aangemaakt
met
tert-butylester.
Deze
(S)-2-tert-butoxycarbonylamino-3-(2-
bromofenyl)-propaanzuur als startproduct. Het totale syntheserendement bedroeg 34,57 %. In een tweede luik werd de manuele radiosynthese, die een
18
F-labeling van de
precursor en een daarop volgende deprotectie omvatte, van zowel [18F]FET en 2-[18F]FELP geoptimaliseerd. Om met [18F]FET een hoog rendement te bekomen, diende 1,48 mM [18F]FET-precursor bij 110°C voor 5 minuten gelabeld te worden, waarna het gedurende 10 minuten met 1 M HCl bij 110°C gedeprotecteerd moest worden. Om 2-[18F]FELP met een hoog rendement te bekomen, diende tenminste 9,62 mM 2-[18F]FELP-precursor bij 110°C voor 10 minuten gelabeld te worden, waarna gedurende 6 minuten met 1 M HCl bij 110°C gedeprotecteerd moest worden. Geschatte radiochemische yields van [18F]FET en 2-[18F]FELP bedroegen respectievelijk 54 % en >53 %, rekening houdend met 60 minuten synthese. Tenslotte werd de radiosynthese van [18F]FET geautomatiseerd uitgevoerd m.b.v. een Scintomics Hotbox3 systeem. T.o.v. de manuele radiosynthese werden enkele aanpassingen doorgevoerd. In de toekomst zou ook 2-[18F]FELP m.b.v. hetzelfde systeem aangemaakt kunnen worden. Mits verdere gunstige in vitro en in vivo proeven, kan 2[18F]FELP m.b.v. het geautomatiseerd systeem mogelijks als een routine PET-radiofarmacon in kankeronderzoek gebruikt worden.
DANKWOORD Allereerst zou ik graag prof. dr. De Vos bedanken mij de kans te geven om te proeven van het vakgebied van de radiofarmacie door de lessen en het ter beschikking stellen van het labo. Verder zou ik de professor ook willen bedanken voor het nalezen en verbeteren van mijn masterproef.
Ik zou in het bijzonder dr. Ken Kersemans willen bedanken voor de fijne tijd in het labo. Het was zeer verrijkend om enkele maanden samen te werken met iemand die heel wat boeiends te vertellen heeft; daarom niet enkel maar over wetenschap. Verder wil ik dr. Kersemans ook bedanken voor de vele praktische tips, het nalezen van mijn masterproef en het vertrouwen in mij om zelfstandig experimenten uit te voeren. Maar bovenal ben ik zeer dankbaar aangemoedigd te worden om de uitdaging voor wetenschappelijk onderzoek aan te gaan.
Ook houd ik goede herinneringen over aan de andere masterproefstudenten en assistenten in het labo. Door die goed samenhangende groep was het elke dag opnieuw aangenaam om verder te werken.
Tot slot ben ik ook zeer dankbaar voor de steun en interesse van mijn ouders en familie in een voor hen toch wat vreemd onderwerp. Na de soms wat tegenvallende resultaten kon ik altijd mijn verhaal eens doen bij hen, om er daarna opnieuw met goede moed in te vliegen.
INHOUDSTABEL 1
INLEIDING ........................................................................................................................... 1 1.1
BEELDVORMING VAN TUMOREN ................................................................................ 1
1.2
POSITRON EMISSION TOMOGRAPHY (PET) ................................................................. 2
1.2.1
Principe................................................................................................................. 2
1.2.2
Het belang van PET in de geneeskunde ............................................................... 3
1.3
PET-RADIOFARMACA ................................................................................................... 4
1.3.1
Algemeen ............................................................................................................. 4
1.3.2
[18F]FDG ................................................................................................................ 5
1.3.3
Radioactief gelabelde aminozuren....................................................................... 6
1.4
AMINOZUURTRANSPORT ............................................................................................ 7
1.4.1
Aminozuurtransport in een gezonde cel .............................................................. 7
1.4.2
Aminozuurtransport in een tumorcel .................................................................. 8
1.4.3
Transport van aminozuur PET-radiofarmaca ....................................................... 9
1.5
ONDERZOEK NAAR NIEUWE LAT-1 GETRANSPORTEERDE GELABELDE AMINOZUREN9
1.6
SYNTHESE VAN 2-(2-[18F]FLUOROETHYL)-L-FENYLALANINE...................................... 10
1.6.1
Beschermingsreactie (Reactiestap A)................................................................. 11
1.6.2
Vinylering via Stille reactie (Reactiestap B) ........................................................ 11
1.6.3
Hydroboratie-oxidatie (Reactiestap C)............................................................... 12
1.6.4
Tosylering (Reactiestap D).................................................................................. 14
1.6.5
Labeling met 18F (Reactiestap E) ........................................................................ 14
1.6.6
Deprotectie (Reactiestap F) ............................................................................... 15
1.6.7
Geautomatiseerde radiosynthese ...................................................................... 15
2
OBJECTIEF ......................................................................................................................... 16
3
MATERIALEN EN METHODEN........................................................................................... 17 3.1
REAGENTIA ................................................................................................................ 17
3.2
APPARATUUR ............................................................................................................. 18
3.2.1
Kolomchromatografie ........................................................................................ 18
3.2.2
Dunnelaag chromatografie (TLC) ....................................................................... 19
3.2.3
Module voor de geautomatiseerde radiosynthese ........................................... 19
3.2.4
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ............................................ 20
3.3
EXPERIMENTELE PROTOCOLS .................................................................................... 21
3.3.1
Synthese van (S)-2-tert-butoxycarbonylamino-3-(2-bromofenyl)-propaanzuur tbutylester (verbinding 2; reactiestap A) ............................................................ 21
3.3.2
Synthese van (S)-2-tert-butoxycarbonylamino-3-(2-vinylfenyl)-propaanzuur tert-butylester (verbinding 3; reactiestap B) ..................................................... 21
3.3.3
Synthese van (S)-2-tert-butoxycarbonylamino-3-(2-(2-hydroxyethyl)fenyl)propaanzuur tert-butylester (verbinding 4; reactiestap C)................................ 22
3.3.4
Synthese van (S)-2-tert-butoxycarbonylamino-3-(2-(2-tosyloxyethyl)fenyl)propaanzuur tert-butylester (verbinding 5, reactiestap D) ............................... 23
3.3.5
Manuele radiosynthese van 2-[18F]FELP en [18F]FET.......................................... 23
3.3.5.1
Labelingsreactie met 18F-............................................................................. 25
3.3.5.2
Deprotectie ................................................................................................. 26
3.3.6 4
Geautomatiseerde radiosynthese van [18F]FET ................................................. 27
RESULTATEN EN DISCUSSIE .............................................................................................. 29 4.1
BESCHERMINGSREACTIE (REACTIESTAP A) ............................................................... 29
4.1.1
Opzuivering ........................................................................................................ 29
4.1.2
Rendement ......................................................................................................... 30
4.2
STILLE REACTIE (REACTIESTAP B) ............................................................................... 30
4.2.1
Opzuivering ........................................................................................................ 30
4.2.2
Rendement ......................................................................................................... 31
4.3
HYDROBORATIE-OXIDATIE (REACTIESTAP C)............................................................. 31
4.3.1
Reactie met 9-BBN ............................................................................................. 31
4.3.2
Reactie met BH3 ................................................................................................. 32
4.3.3
Rendement ......................................................................................................... 33
4.4
TOSYLERING (REACTIESTAP D)................................................................................... 34
4.4.1
Opzuivering ........................................................................................................ 34
4.4.2
Rendement ......................................................................................................... 35
4.5
OPTIMALISATIE MANUELE RADIOSYNTHESE VAN [18F]FET EN 2-[18F]FELP ............... 35
4.5.1
Optimalisatie bepaling van het radiolabelingsrendement ................................ 35
4.5.2
Optimalisatie radiosynthese [18F]FET ................................................................. 36
4.5.2.1
Concentratie precursor voor radiolabeling ................................................ 36
4.5.2.2
Reactietemperatuur radiolabeling .............................................................. 37
4.5.2.3
Reactietijd radiolabeling ............................................................................. 38
4.5.2.4
Deprotectiecondities................................................................................... 39
4.5.2.5
Deprotectietijd ............................................................................................ 39
4.5.3
4.6
Optimalisatie radiosynthese 2-[18F]FELP............................................................ 41
4.5.3.1
Concentratie precursor voor radiolabeling ................................................ 41
4.5.3.2
Reactietemperatuur radiolabeling .............................................................. 42
4.5.3.3
Reactietijd radiolabeling ............................................................................. 42
4.5.3.4
Deprotectietijd ............................................................................................ 43
4.5.3.5
Schatting specifieke activiteit 2-[18F]FELP................................................... 44
GEAUTOMATISEERDE RADIOSYNTHESE VAN [18F]FET .............................................. 44
4.6.1
Eerste synthese .................................................................................................. 44
4.6.2
Tweede synthese................................................................................................ 45
4.6.3
Radiochemisch rendement van [18F]FET en 2-[18F]FELP .................................... 45
5
CONCLUSIE ........................................................................................................................ 46
6
LITERATUURLIJST .............................................................................................................. 47
LIJST MET AFKORTINGEN AcN 9-BBN Boc CaCl2 CH2Cl2 K222 Et3N EtOAc EtOH [18F]FDG 2-[18F]FELP (=verbinding 7) [18F]FET 2-[18F]FMLP HCl H20 H2O2 K2CO3 LAT-1 LiCl MeOH MG MF MgSO4 NaCl NaF NaHCO3 Na2S2O3 NH4Ac PBS Pd(PPh3)4 P2O5 Rf-waarde TET TFA THF TLC TosCl Verbinding 1
Acetonitrile 9-Borabicyclo[3.3.1]nonane Tert-butyloxy carbonyl (beschermingsgroep) Calciumchloride Dichloormethaan Kryptand-222 Triethylamine Ethylacetaat Ethanol 2-deoxy-2-[18F]fluoro-D-glucose 2-(2-[18F]fluoroethyl)-L-fenylalanine O-(2-[18F]fluoroethyl)-L-tyrosine 2-[18F]fluoromethyl-L-fenylalanine Waterstofchloride Water Waterstofperoxide Kaliumcarbonaat Systeem L Aminozuur Transporter 1 Lithium chloride Methanol Moleculair gewicht Mobiele fase Magnesiumsulfaat Natriumchloride Natriumfluoride Natriumbicarbonaat Natriumthiosulfaat Ammoniumacetaat Phosphate buffered saline Palladium tetrakis(trifenylfosfine) Fosforpentoxide Retardatiefactor O-(2-tosyloxyethyl)-N-trityl-L-tyrosine tertbutylester Trifluorazijnzuur Tetrahydrofuraan Thin Layer Chromatography Para-tolueensulfonylchloride (S)-2-tert-butoxycarbonylamino-3-(2bromofenyl)-propaanzuur
Verbinding 2 Verbinding 3 Verbinding 4
Verbinding 5
Verbinding 6 Verbinding 7
(S)-2-tert-butoxycarbonylamino-3-(2bromofenyl)-propaanzuur tert-butylester (S)-2-tert-butoxycarbonylamino-3-(2vinylfenyl)-propaanzuur tert-butylester (S)-2-tert-butoxycarbonylamino-3-(2-(2hydroxyethyl)fenyl)-propaanzuur tertbutylester (S)-2-tert-butoxycarbonylamino-3-(2-(2tosyloxyethyl)fenyl)-propaanzuur tertbutylester (S)-2-tert-butoxycarbonylamino-3-(2-(2[18F]fluoroethyl)fenyl)-propaanzuur tertbutylester 2-(2-[18F]fluoroethyl)-L-fenylalanine
1 1.1
INLEIDING BEELDVORMING VAN TUMOREN Tumorweefsel kenmerkt zich door een ongebreidelde celdeling en proliferatie. Bij
maligne tumoren gebeurt deze celdeling zeer snel en ongecontroleerd in vergelijking met omringend weefsel. Deze tumorgroei kan opgedeeld worden in verschillende stadia met behulp van de TNM classificatie (Tumor Node Metastase) (UICC, 2013). In latere stadia kan metastasering optreden: tumorcellen kunnen zich via de bloedbaan verspreiden over het lichaam en zich nestelen in andere weefsels. De groei van deze secundair ontstane tumoren is vooral verontrustend in vitale organen. Hersenmetastasen kunnen bijvoorbeeld de normale functionering van het ademhalingscentrum onderdrukken, leidend tot de dood. Om succesvol kanker te bestrijden is het uitermate belangrijk om de tumor zo vroeg mogelijk te kunnen detecteren. Verder moet informatie ingewonnen worden over de precieze plaats waar het tumorweefsel aanwezig is en in welk stadium de tumor zich bevindt. Deze informatie is tevens van belang om te bepalen op welke plaats precies een biopsie kan genomen worden of om een reeds uitgevoerde antikankertherapie te evalueren. Om de benodigde informatie te vergaren, bestaan er verschillende niet-invasieve medische beeldvormingstechnieken. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen anatomische en functionele beeldvorming van tumoren. Anatomische beeldvorming is in staat een anatomische kaart van het lichaam te maken. Er wordt morfologische informatie bekomen. Magnetic Resonance Imaging (MRI) en Computed Tomography (CT) zijn twee anatomische beeldvormingstechnieken die gebruikt worden in de oncologie. De mogelijkheid om met behulp van deze technieken een tumor te kunnen detecteren is onder andere afhankelijk van zijn grootte. In dit opzicht is het bijzonder moeilijk om metastasen tijdig te detecteren. Het tweede type beeldvorming, functionele beeldvorming, heeft een andere invalshoek om tumoren te visualiseren en is de voorbije decennia aan een opmars bezig. Dit type beeldvorming berust op het feit dat tumoren veranderde biochemische en fysiologische eigenschappen hebben ten opzichte van gezond weefsel. Een gewijzigde biochemische pathway gaat vooraf aan de uiteindelijke anatomisch waarneembare veranderingen, wat
1
toelaat om tumoren in een vroeger stadium te kunnen detecteren. Positron Emission Tomography (PET) en Single Photon Emission Computed Tomography (SPECT) zijn hier voorbeelden van en maken voor hun werking gebruik van radio-isotopen. Deze technieken behoren tot het domein van de nucleaire geneeskunde (Kitson et al., 2009). Teneinde de positieve karakteristieken van zowel morfologische en functionele beeldvormingstechnieken te combineren werden ook gecombineerde apparaten ontwikkeld. Zo geven bijvoorbeeld zowel een PET als een CT-scan belangrijke aanvullende informatie over tumoren, vandaar dat beiden gecombineerd werden in één toestel: een PET/CT scanner. De combinatie van functionele (PET) en anatomische (CT) beeldvorming komt de interpretatie van resultaten ten goede (Review Schöder et al.,2003). 1.2
POSITRON EMISSION TOMOGRAPHY (PET)
1.2.1
Principe PET is een niet-invasieve functionele beeldvormingstechniek die toelaat bepaalde
biologische processen in het lichaam te visualiseren met behulp van toegediende radioactief gelabelde moleculen. Het gebruikte radio-isotoop dient een β+-verval te kennen: er moet een positron uitgestraald worden. Dat is het geval bij neutronendeficiënte radio-isotopen, die stabiliteit in de kern willen bereiken door het omzetten van een proton in een neutron, met vrijstelling van een positron (Review Townsend, 2004) (zie Figuur 1.1). Afhankelijk van de gebruikte β+-straler (vb.: 11C, 18F) zal het uitgestoten positron een typische maximale kinetische energie dragen (zie Tabel 1.1). Door interactie met de omliggende materie zal de energie afnemen, tot het positron annihileert met een elektron. Een zeer belangrijke eigenschap van dit proces, is dat er twee 510 keV annihilatie fotonen vrijkomen die een hoek van 180° ten opzichte van elkaar beschrijven. Wanneer een patiënt onderworpen wordt aan een PET-scan, zal hij in een detectorring geplaatst worden. Na toediening van de met een β+-straler gelabelde molecule, zal er in het lichaam β+-verval optreden en zullen bijgevolg door annihilatie fotonen vrijkomen. De fotonen geven aanleiding tot een detectorrespons in tegenoverstaande detectorblokken op hetzelfde tijdstip (zie Figuur 1.1). Dit heet coïncidentie detectie. Door het toepassen van complexe algoritmen op de waargenomen straling in tegenoverliggende detectorblokken van de detectorring, kan de precieze bron van de straling gereconstrueerd 2
worden in een interpreteerbaar beeld. De accumulatie van het radioactief gelabeld molecule kan in kaart gebracht worden. Een PET-scan geeft informatie in de drie ruimtelijke dimensies.
+
Figuur 1.1: β -verval geeft aanleiding tot positronemissie. Annihilatie met een elektron zorgt voor twee annihilatiefotonen die in een hoek van 180° t.o.v. elkaar uitgestraald worden. Een ring opgebouwd uit detectorblokken detecteert de gammastraling (figuur uit: review Townsend, 2004).
1.2.2
Het belang van PET in de geneeskunde PET kent onder andere toepassingen in farmacokinetische studies, neurologie en
oncologie. Vooral in de oncologie is PET de laatste jaren uitgegroeid tot een krachtig nietinvasief instrument voor diagnose, staging van tumoren en therapiemonitoring (Review Townsend, 2004). Het belangrijkste voordeel dat PET (i.t.t. SPECT) biedt, is de grote gevoeligheid van de techniek. De PET-detector kan bijna alle gammastraling vastleggen, terwijl dit voor SPECT niet zo is. Via PET kan dus een kwantitatieve bepaling gedaan worden van de hoeveelheid radioactiviteit in weefsel (Review Rahmim et al., 2008). PET kan zo een antwoord helpen bieden op volgende vragen in kankeronderzoek. Waar is de tumor precies gelokaliseerd? PET kan een aanvulling zijn op CT- en MRI-onderzoek. Het actieve gedeelte van de tumor kan gelokaliseerd worden. Dit is onder andere belangrijk bij het nemen van een representatief weefselstaal voor verder onderzoek. CT en MRI blijven dankzij hun hogere anatomische resolutie wel nog steeds belangrijk in de lokalisatie van tumoren.
3
Wat zijn de relevante biologische eigenschappen van een tumor? Verschillende PET-tracers kunnen verschillende biologische processen in kaart brengen, zoals: hypoxie, angiogenese, proliferatie en apoptose van tumorweefsel. Kennis van deze processen kan de kankertherapie helpen sturen. Wat is de tumorrespons op een bepaalde therapie? Er kan vastgesteld worden of de tumor bijvoorbeeld in volume krimpt of gelijk blijft. PET-beeldvorming is de laatste jaren mede hierdoor uitgegroeid tot een belangrijke techniek die aanvullende informatie kan verschaffen over het kankerproces. (Review Grosu et al., 2005). 1.3
PET-RADIOFARMACA
1.3.1
Algemeen Omdat PET gebaseerd is op de detectie van β+-straling, zijn slechts een beperkt aantal
radio-isotopen bruikbaar. Daarbij komt ook nog dat niet elke β+-straler in vivo kan gebruikt worden. Een eerste factor die hierin meespeelt is het halfleven van het radionuclide (zie Tabel 1.1). Indien de radioactief gelabelde molecule een bepaalde tijd nodig heeft om zich te verdelen in het lichaam, kan een te kort halfleven problemen geven om ‘trage’ biochemische pathways in beeld te brengen. Verder beperkt het halfleven ook de tijd die mag besteed worden aan de synthese van een radioactief gelabelde molecule. Een tweede factor die het in vivo gebruik van sommige β+-stralers beperkt, is de maximale energie van het uitgestoten positron. Om een optimale resolutie te bekomen mag het positron slechts een beperkte afstand afleggen in weefsel. Voor klinische toepassingen is vooral 18F een aantrekkelijk isotoop. Het relatief lange halfleven maakt het o.a. mogelijk om complexere radiochemische procedures uit te voeren. Verder heeft het positron afkomstig van 18F, dankzij zijn relatief lage kinetische energie, een beperkte lineaire range in weefsels; meer nog:
18
F geeft de beste resolutie van alle
positronstralers en maakt het zo mogelijk om aan hoge resolutiebeeldvorming te doen (Miller et al., 2008).
4
Tabel 1.1: De belangrijkste radionucliden (en hun eigenschappen) voor klinische toepassingen van PET (Review Townsend, 2004; IAEA, 2009)
Radio-isotoop (β+-straler) 11 C 13 N 15 O 18 F
Halfleven (minuten) 20,4 9,96 2,03 109,8
Maximale energie positron (MeV) 0,980 1,199 1,732 0,633
Wanneer een radio-isotoop ingebouwd wordt in geneesmiddelen, spreekt men van radiofarmaca. Zij worden intraveneus toegediend aan patiënten die een PET-scan dienen te ondergaan. Net als bij niet-radioactieve geneesmiddelen zal het radiofarmacon zich na verloop van tijd selectief beginnen opstapelen in bepaalde weefsels. Voor tumorvisualisatie is het dan wenselijk dat de PET-tracers zo lang mogelijk in of aan de tumorcel gebonden blijven. Ook is het nodig dat de opname van radiofarmacon in gezond weefsel zeer laag of onbestaande is. [18F]FDG
1.3.2
Het glucosederivaat 2-deoxy-2-[18F]fluoro-D-glucose ([18F]FDG) is momenteel het klinisch
meest
gebruikte
PET-radiofarmacon.
[18F]FDG
wordt
gebruikt
om
het
glucosemetabolisme in het lichaam via PET-beeldvorming in kaart te brengen. Het voornaamste toepassingsgebied is oncologie, maar de tracer wordt ook in neurologie en cardiologie gebruikt (Abouzied et al., 2005). Op een PET-scan met [18F]FDG worden weefsels onderling onderscheiden op basis van hun glucosemetabolisme. Het radiofarmacon treedt binnen in de cel door middel van de GLUT-1 transporter en wordt gefosforyleerd door hexokinase. Efflux uit de cel van deze sterk polaire verbinding wordt voldoende lang gehinderd om een goede PET-beeldvorming te bekomen. De GLUT-1 transporter, één van de transporters verantwoordelijk voor glucoseopname, bevindt zich overheen het hele menselijk lichaam. Op maligne tumorcellen komt GLUT-1 tot overexpressie. Zo wordt voldaan aan de verhoogde nood aan brandstof voor de snel delende tumorcellen. De mate waarin GLUT-1 tot expressie komt op tumorcellen kan
5
correleren met specifieke tumoreigenschappen en [18F]FDG speelt hierop in (Review Ganapathy et al., 2009). [18F]FDG heeft echter ook belangrijke tekortkomingen. Om te beginnen heeft niet elk type tumor een verhoogd glucoseverbruik. Verder zijn macrofagen en neutrofielen uit inflammatoire gebieden dan weer in staat om veel [18F]FDG op te nemen, wat zou kunnen leiden tot vals positieve tumorwaarnemingen (Kaim et al.,2002). Nog een ander probleem stelt zich bij de diagnose van tumoren in een omgeving waar er al een groot basaal glucosemetabolisme is. Hersenweefsel bijvoorbeeld verbruikt in tegenstelling tot ander weefsel in het lichaam bijna uitsluitend glucose. Indien een bepaald type tumor maar een licht of matig verhoogd glucoseverbruik kent, kan deze moeilijker onderscheiden worden van het basaal glucoseverbruik in gezond hersenweefsel (Olivero et al., 1995). In het geval van een hersentumor kan het dus noodzakelijk zijn om een selectiever, alternatief PETradiofarmacon te gebruiken, zoals bijvoorbeeld een radioactief gelabeld aminozuur. 1.3.3
Radioactief gelabelde aminozuren Radioactief gelabelde aminozuren worden reeds enige tijd onderzocht om een
antwoord te bieden op de problematiek van [18F]FDG. Er is reeds aangetoond dat ze verbeterde beeldvormingskarakteristieken hebben ten opzichte van [18F]FDG voor specifieke hersentumoren (Review McConathy et al., 2008). Er zijn verschillende voordelen verbonden aan het gebruik van radiogemerkte aminozuren. Ze worden in tegenstelling tot [18F]FDG niet opgenomen in inflammatoir weefsel. Vals positieve resultaten worden dus vermeden (Kaim et al., 2002). Verder worden zij weinig of niet opgenomen in gezond hersenweefsel. Dit komt de selectieve hersentumorbeeldvorming via PET ten goede. De prognostische waarde van aminozuur PET-beeldvorming staat ter discussie (Jager et al.,2001), terwijl voor [18F]FDG reeds aangetoond werd dat het de overlevingstijd van een patiënt kan voorspellen (Chen, 2007). Deze correlaties zijn moeilijk aan te tonen en vergen lange termijn studies. Desalniettemin zijn er reeds indicaties dat radiotherapieplanning op basis van aminozuur PET-beeldvorming zou leiden tot een betere overleving (Grosu et al., 2005).
6
Het radioactief gelabelde aminozuur dat momenteel meest klinisch aanvaard en gebruikt wordt, is O-(2-[18F]fluoroethyl)-L-tyrosine ([18F]FET) . [18F]FET blijkt superieur te zijn over [18F]FDG in het aantonen van de snelst prolifererende zone in een hersentumor (Pauleit et al., 2009). De molecule is bijzonder waardevol bij het nemen van representatieve biopsiestalen, planning van behandeling en differentiatie tussen terugkerende tumoren en post-therapeutische veranderingen bij cerebrale glioma’s (Langen et al., 2007). In perifere tumorweefsels konden de gelabelde aminozuren nog weinig of niet overtuigen (Pauleit et al., 2005). De focus bij dit type PET-tracers ligt momenteel dus nog vooral bij beeldvorming van hersentumoren. Er is dus nog steeds nood aan studies naar betere gelabelde aminozuurderivaten voor PET-onderzoek, die ook gebruikt kunnen worden voor detectie van perifere tumoren. 1.4
AMINOZUURTRANSPORT
1.4.1
Aminozuurtransport in een gezonde cel Aminozuren
worden
hoofdzakelijk
actief
opgenomen
via
specifieke
aminozuurtransporters. Deze proteïnen herkennen bepaalde klassen aminozuren (bvb.: neutrale, aromatische,…). Tussen aminozuren van eenzelfde klasse zal de transporter weinig of niet discrimineren. Eén transporter is dus niet selectief voor één enkel aminozuur. De verschillende types aminozuurtransporters en hun mechanismes werden reeds uitvoerig onderzocht (Christensen, 1990). Veel voorkomende transporters zijn: systeem A, ASC en L. Systeem A (Alanine preferring) is Na+-dependent en voornamelijk verantwoordelijk voor opname van kleine aminozuren. Ook systeem ASC (Alanine, Serine, Cysteïne preferring) is
Na+-dependent.
Systeem
L
(Leucine
preferring)
is
een
Na+-onafhankelijke
aminozuurtransporter die een voorkeur vertoont voor volumineuze aminozuren. Tot op heden zijn er 4 verschillende systeem L aminozuur transporters (LAT) ontdekt (Bodoy et al.,2005) : LAT-1, LAT-2, LAT-3, en LAT-4. LAT-1 en LAT-2 zijn obligatoire aminozuuruitwisselaars. Dit houdt in dat voor ieder extracellulair opgenomen aminozuur, er een intracellulair aminozuur voor in de plaats wordt uitgescheiden. LAT-1 vertoont een voorkeur voor volumineuze, vertakte of aromatische aminozuren zoals leucine, methionine, tryptofaan, tyrosine en fenylalanine.
7
Door de brede substraatselectiviteit van LAT-transporters werd voorgesteld dat niet enkel natuurlijk voorkomende aminozuren kunnen getransporteerd worden. Ook structureel gelijkaardige verbindingen aan fenylalanine of tyrosine hebben affiniteit voor LAT. Er werd vastgesteld dat net als de amino-en carboxylgroep, ook de aminozuurzijketen belangrijk is voor de herkenning door de bindingssite van LAT-1. Bij de binding van het substraat zijn de hydrofobe interacties tussen de aminozuurzijketen en de LAT-1 bindingssite van groot belang (Uchino et al., 2002) (zie Figuur 1.2).
Figuur 1.2: een voorstelling van de substraatbindingsplaats van de LAT-1 transporter. De hier weergegeven structuur is L-DOPA, een gekend substraat van LAT-1. Twee plaatsen zijn belangrijk: de plaats waar de carboxyl- en aminofunctie binden, en de hydrofobe plaats, verantwoordelijk voor interacties met grote hydrofobe groepen. Bron figuur: (Uchino et al., 2002).
1.4.2
Aminozuurtransport in een tumorcel
Een maligne tumorcel wordt gekarakteriseerd door een ongecontroleerde, snelle groei en proliferatie. Om deze versnelde groei toe te laten, moet de tumorcel voldoende aanbreng hebben van verschillende levensnoodzakelijke nutriënten. Er treedt daarom een upregulatie op van nutriënttransportmoleculen op de celmembraan. Heel concreet is de verhoogde behoefte aan aminozuren gewenst om bijvoorbeeld te incorporeren in proteïnen of te gebruiken om voldoende nucleotiden voor RNA en DNA aan te maken. Er zijn reeds verschillende aminozuurtransporters bekend die een verhoogde expressie hebben op tumorcellen. Eén ervan is LAT-1. Op onder andere hersen-, long-, huid- en coloncarcinoma komt de aminozuurtransporter significant meer voor. (Review Fuchs et al., 2005). Deze transporter zou een belangrijke rol spelen in de groei en proliferatie van een 8
brede waaier aan tumorcellen. Inhibitie van LAT-1 in non-small cell longkanker cellijnen bijvoorbeeld, vertoonde antitumorale activiteit (Imai et al., 2010). Samen met andere gelijkaardige vondsten heeft dit geleid tot de opvatting dat LAT-1 mogelijks een nieuwe target kan vormen voor toekomstige kankertherapie. 1.4.3
Transport van aminozuur PET-radiofarmaca De radioactief gemerkte aminozuren die momenteel in de belangstelling staan, maken
net als hun ongemerkte tegenhangers voor het grootste deel gebruik van de LAT-1 transporter op tumorcellen. Aangezien LAT-1 zoveel meer tot expressie komt op tumorcellen dan op gezonde cellen, is een selectieve beeldvorming van de tumor mogelijk. Onnatuurlijke aminozuren worden vervolgens niet geïncorporeerd in proteïnen. Enkel het transport ervan wordt dus weergegeven. Dit in tegenstelling tot sommige
11
C-gelabelde aminozuren. Zij
kunnen in feite volledig identiek aan het natuurlijk aminozuur zijn, op het radio-isotoop na. Niet enkel transport zal weergegeven worden, maar ook eiwitsynthese en diverse metabole pathways zoals transmethylaties (Ishiwata et al., 1996). Beeldvorming wordt hierdoor bemoeilijkt. 1.5
ONDERZOEK NAAR NIEUWE LAT-1 GETRANSPORTEERDE GELABELDE AMINOZUREN Een substraat vinden dat met een grote affiniteit kan binden op de LAT-1 transporter
zou twee zaken kunnen verwezenlijken. Ten eerste zou deze gelabelde molecule een uitstekend PET-radiofarmacon vormen, omdat de LAT-1 transporter sterk opgereguleerd is bij een brede waaier aan verschillende types tumorcellen, dit in tegenstelling tot het omringend weefsel. Ten tweede kan een zeer sterk gebonden substraat van de LAT-1 transporter mogelijks een rol spelen in kankertherapie. Blokkeren van deze transporter zou kunnen leiden tot een verminderde aminozuuropname, wat onontbeerlijk is voor snel delende tumorcellen. Een PET-radiofarmacon zou bijvoorbeeld deze therapie kunnen visualiseren. In eerdere studies werd reeds aangetoond dat 2-[125I]iodo-L-fenylalanine gebruik kan maken van het LAT-1 transportsysteem in tumorcellen (Mertens et al., 2004). Er werden ook experimenten gedaan waarbij jood vervangen werd door een groep die ongeveer hetzelfde volume inneemt als het relatief grote joodatoom.
Zo werd 2-[18F]fluoromethyl-L-
fenylalanine (2-[18F]FMLP) aangemaakt, getest in vivo op tumordragende ratten en
9
aangeduid als een potentieel nieuw PET-radiofarmacon (Kersemans et al., 2007). De 2[18F]FMLP-molecule bleek echter te onstabiel (Kersemans et al.,2008). Als alternatief werd het 4-analoog: 4-[18F]FMLP voorgesteld. Een andere onderzoek naar gefluoreerde fenylalaninederivaten deed een biologische evaluatie van o.a. 4-(2-[18F]fluoroethyl)-L-fenylalanine (4-[18F]FELP) (Wang et al., 2011). PETbeeldvorming van een tumor in ratten met behulp van 4-[18F]FELP werd vergeleken met het reeds klinisch in gebruik genomen [18F]FET. Deze studie wees uit dat 4-[18F]FELP vergelijkbaar was met [18F]FET en een voorkeur vertoonde voor de LAT-1 transporter, terwijl het transportmechanisme van [18F]FET onduidelijk blijft (Pauleit et al., 2005). De zoektocht naar een fenylalaninederivaat met een nog hogere affiniteit voor LAT-1 gaat onverminderd voort. Een in vitro Structure-Activity Relation (SAR)-studie wees uit dat vooral 2-(2-[18F]fluoroethyl)-L-fenylalanine (2-[18F]FELP) een zeer hoge affiniteit heeft voor LAT-1, zelfs nog hoger dan het natuurlijk substraat fenylalanine. Bij binding aan de receptor geeft 2-[18F]FELP ook minder aanleiding tot efflux van intracellulaire aminozuren. Dit geeft een indicatie dat 2-[18F]FELP mogelijks een blokker is van LAT-1. De retentie van deze molecule in tumorweefsel zou dus relatief sterk moeten zijn (Kersemans, 2011). SYNTHESE VAN 2-(2-[18F]FLUOROETHYL)-L-FENYLALANINE
1.6
verbinding 1
HO
verbinding 2
verbinding 3
O
O
O
O
verbinding 4
O O
NH Br
O
stap A O
NH Br
O
NH
stap B O
O
O
HO
stap C
NH
O O
O
stap D
HO
O
O
O O
18
18
F
F NH2
NH
verbinding 7
O
O
O
O NH
stap E
stap F O
S
O
O
O
verbinding 5
verbinding 6 18
18
Figuur 1.3: Reactieschema met voorgestelde te volgen stappen om 2-(2-[ F]fluoroethyl)-L-fenylalanine (2-[ F]FELP; verbinding 7) te bekomen. In de tabel met afkortingen staan de volledige chemische namen van de verbindingen.
10
1.6.1
Beschermingsreactie (Reactiestap A) In organische syntheses bestaat de uitdaging erin om zo selectief mogelijk het
eindproduct te bekomen. Dat betekent dat gepoogd moet worden om ongewenste reactiviteit zoveel mogelijk uit te sluiten. Functionele groepen zoals een amino- of carboxylgroep op een aminozuur zijn voorbeelden van groepen die ongewenst kunnen reageren en moeten daarom afgeschermd worden. Er bestaan verschillende beschermingsreacties voor aminozuren. Ze verschillen van elkaar in selectiviteit, reactieomstandigheden en ontschermingstijd. Deze laatste parameter speelt een belangrijke rol die verder geduid wordt in hoofdstuk 1.6.6 van de inleiding. Een goede beschermingsgroep heeft volgende eigenschappen: de groep moet eenvoudig op een functionele groep kunnen binden. Vervolgens moet deze bescherming zoveel mogelijk ongewenste reacties kunnen weerstaan. Tenslotte moet de beschermingsgroep ook weer eenvoudig afgesplitst kunnen worden (review Isidro-Llobet et al., 2009). Aminozuren worden vaak beschermd met een tert-butyl- en een boc-groep. Deze beschermen respectievelijk het carboxyl- en aminogedeelte van een aminozuur. 1.6.2
Vinylering via Stille reactie (Reactiestap B) Eenmaal de functionele groepen voldoende afgeschermd zijn, kan de eigenlijke
reactie beginnen. Om 2-(2-[18F]fluoroethyl)-L-fenylalanine aan te maken dienen er extra koolstofatomen op de benzylring van verbinding 2 geplaatst te worden. Introductie van een vinylgroep op verbinding 2 levert deze koolstofatomen. Een vinylgroep is een zeer veelzijdige groep in de organische chemie. De C-C dubbele binding is een goed vertrekpunt voor een grote verscheidenheid aan chemische reacties: oxidatieve reacties (vb.: epoxidatie) of reductieve reacties (vb.: hydroboratie). Eén van de methoden om een vinylgroep te introduceren in een molecule is de palladium gekatalyseerde cross-koppeling van een vinyldonor naar een arylhalide. Er bestaan veel vinyldonoren (review Denmark, 2009), zowel metalen als niet metalen. De best gekende en meest gebruikte vinylmetaaldonor is tri n-butylvinyltin (zie Figuur 1.4). Het reagens heeft een aantal voordelen over de andere vinyldonoren. Het product is lucht- en
11
vochtstabiel. Verder heeft de vinyltransfer een goed rendement. Een groot nadeel is de toxiciteit van het reagens en zijn nevenproducten.
Sn
Figuur 1.4: de structuur van vinyldonor tri n-butylvinyltin.
Figuur 1.5: Schematische weergave van de Stille reactie. De Pd-katalysator ondergaat oxidatieve additie van een halide IR (in dit geval: R= fenylalaninederivaat en I = Br). Na isomerisatie treedt de transmetallatie van de tri n-butyltindonor naar de katalysator op. Dit is de snelheidsbepalende stap. Na reorganisatie van het reactiecomplex treedt er reductieve eliminatie op, met herstel van de katalysator en koppeling van de koolstofatomen. Bron figuur: Casado et al., 1998.
Palladium gekatalyseerde cross-koppelingen kunnen meer dan enkel maar een vinylgroep introduceren. Met palladium als katalysator kan een brede waaier aan alkyleringsreacties ingezet worden, met als gevolg dat het vormen van derivaten van fenylalanine eenvoudig wordt. De reactie die hier gebruikt wordt, is de Stille reactie, vernoemd naar de ontdekker van de palladium gekatalyseerde cross-koppeling van tri nbutylvinyltin met een sp2-gehybridiseerd halide. Het schematisch verloop van deze reactie staat weergegeven in Figuur 1.5. 1.6.3
Hydroboratie-oxidatie (Reactiestap C) Conversie van een dubbele binding naar een alcohol is mogelijk door elektrofiele
additie van water of door hydroboratie-oxidatie. De eerste omvat zuur gekatalyseerde elektrofiele additie en oxymercuratie-demercuratie. Beiden leiden tot een Markovnikov-
12
alcohol. De hydroboratie-oxidatie reactie leidt echter tot een anti-Markovnikov alcohol (website met boek van prof. Neuman, 1992). De Markovnikov-regel (zie Figuur 1.6) zegt dat bij de hydratie van een alkeen de hydroxylgroep met voorkeur gebonden zal worden aan het koolstofatoom dat het meest gesubstitueerd is. Dit omdat het meest gesubstitueerd koolstofatoom aanleiding zal geven tot het stabielste carbokationintermediair. Markovnikov
OH
anti Markovnikov
OH Figuur 1.6: Het eindproduct van hydratie van een alkeen (2-methyl-1-propeen) kan verschillen naar gelang de reactieomstandigheden het Markovnikov of het anti-Markovnikov product prefereren.
In deze synthese is het anti-Markovnikov alcohol gewenst. Er dient dus gebruik te worden gemaakt van een hydroboratie-oxidatie reactie. Het eenvoudigste reagens om een hydroboratie te verrichten is BH3. Deze reactie is regioselectief in het bekomen van het antiMarkovnikov alcohol. Er wordt echter ook nog steeds wat Markovnikov alcohol gevormd. Een sterisch gehinderde boorverbinding, 9-borabicyclo[3.3.1]nonane (9-BBN), is veel regioselectiever dan BH3: er ontstaat veel minder ongewenst Markovnikov alcohol (zie Figuur 1.7). Het reactieschema met BH3 als reagens staat weergegeven in Figuur 1.8.
Figuur 1.7: Hier wordt de regioselectiviteit van verschillende boorverbindingen aangetoond in een hydroboratie-oxidatie van een alkeen. Diboraan is BH3 dat als een dimeer voorkomt: B2H6. Disiamyboraan is een ander sterisch gehinderd hydroboratiereagens. 9-BBN vertoont de hoogste regioselectiviteit van de drie. Bron: zie met een sterretje aangeduide zin (M.B. Smith).
13
Figuur 1.8: Het reactieschema van de hydroboratie-oxidatie van een alkeen. In gedeelte a (de hydroboratie) addeert BH3 aan de dubbele binding, waarbij het B-atoom op de anti-Markovnikov positie staat. Deze reactie gaat driemaal door in totaal zodat een centraal B-atoom bekomen wordt dat omgeven is door drie voormalige alkenen. In gedeelte b (de oxidatie) zal het nucleofiel HOO aanvallen op het B-atoom en voor een omlegging zorgen. Deze reactie treedt ook driemaal op. Een OH -molecule zal ook driemaal voor een omlegging zorgen, met vorming van drie equivalenten antiMarkovnikov alcohol voor elk equivalent BH3. (Bron figuur: MAHIEU,2007)
1.6.4
Tosylering (Reactiestap D) Om verbinding 4 efficiënt te labelen met
18
F in een SN2 reactie (zie 1.6.5) dient de
hydroxylfunctie omgezet te worden tot een betere leaving group. Een goede leaving group is de zwakke geconjugeerde base van een sterk zuur. Een frequent gebruikte goede leaving group is een tosylaat. 1.6.5
Labeling met 18F (Reactiestap E) Een 18F-atoom incorporeren in een molecule kan op twee verschillende manieren. De
indirecte fluorinatie berust op het gebruik van prostetische groepen en vergt een meerstapssynthese. Bij de directe fluorinatie zal het
18
F-atoom in één stap op de
targetmolecule gebracht worden. Er wordt hierin onderscheid gemaakt tussen nucleofiele en elektrofiele
18
F-fluorinaties. De voorkeur gaat uit naar nucleofiele
18
F-fluorinatie, omdat
deze reacties selectiever zijn en aanleiding kunnen geven tot een relatief hogere specifieke activiteit (Review Miller et al., 2008). 14
18
F is een radio-isotoop dat niet natuurlijk voorkomt. Het kan aangemaakt worden in
een cyclotron, vertrekkend van een H218O-molecule. Hierbij wordt een proton versneld in een elektrisch en magnetisch veld zodat het met een hoge kinetische energie invalt op het 18
O-atoom. Er treedt een (p,n) kernreactie op met ontstaan van het no-carrier-added
anion in waterig midden. Na opzuivering kan het
18
18
F-
F-anion in een labelingsreactie gebruikt
worden (IAEA, 2009). Het
18
F-anion kan als nucleofiel aanvallen in een SN2-reactie op verbinding 5. Een
probleem dat zich hierbij stelt is dat het sterk elektronegatieve 18F- heel goed gesolvateerd wordt door ionen en protische solventen zoals H2O. Dat vermindert de nucleofiele eigenschap van
18 -
F . Water moet dus absoluut verwijderd worden en kationen
gecomplexeerd. Kryptand-222 (K222) is door zijn kooistructuur in staat om ionen te complexeren, en wordt toegevoegd aan het reactiemedium (Review Miller et al., 2008). 1.6.6
Deprotectie (Reactiestap F) Het verwijderen van de beschermgroepen is kritisch voor het bekomen van een
molecule met de juiste biochemische activiteit. De tert-butylgroep en de Boc-groep moeten opnieuw afgesplitst worden van respectievelijk de carboxylgroep en de aminogroep. Dit kan gebeuren onder sterk zure omstandigheden: bijvoorbeeld met trifluorazijnzuur (TFA) in dichloormethaan (CH2Cl2). Er kan gezocht worden naar alternatieve deprotectiereagentia. De Europese Farmacopee (Ph. Eur. 7.7; hoofdstuk 5.4: “Residual solvents”) beschrijft immers strenge maximale spoorconcentraties van de toxische stoffen TFA en CH2Cl2. Door HCl als alternatief te gebruiken, kan deze problematiek omzeild worden. Verder moet de deprotectiestap zo snel mogelijk uitvoerbaar zijn, om zo veel mogelijk activiteit te behouden voor de PET-scan. 1.6.7
Geautomatiseerde radiosynthese Een automatisatie van een radiosynthese geeft aanleiding tot een verminderde
stralingsbelasting, want de operator kan vanop afstand de beschermde module aansturen. Een werkende module stelt radiofarmaceuten in staat om de radiosynthese van radiofarmaca te verrichten onder telkens quasi identieke reactieomstandigheden. De module kan zo geïmplementeerd worden in routine-onderzoek van patiënten.
15
2
OBJECTIEF
De laatste decennia is PET aan een opmars bezig op het gebied van tumorbeeldvorming. Wegens hun gunstigere eigenschappen t.o.v. huidige gouden standaard [18F]FDG voor tumorbeeldvorming, worden
18
F-gelabelde
aminozuren
momenteel
onderzocht. Succes met deze verbindingen bleef vooralsnog beperkt tot hoofd-en nektumoren.
2-(2-[18F]fluoroethyl)-L-fenylalanine
(2-[18F]FELP)
is
een
nieuw
PET-
radiofarmacon dat mogelijks ook voor detectie van perifere tumoren zou kunnen gebruikt worden. In deze masterproef zullen 2-[18F]FELP en O-(2-[18F]fluoroethyl)-L-tyrosine ([18F]FET) aangemaakt worden. Als precursormolecule voor 2-[18F]FELP wordt uitgegaan van (S)-2-tertbutoxycarbonylamino-3-(2-(2-tosyloxyethyl)fenyl)-propaanzuur
tert-butylester.
Deze
precursor zal in-house bereid worden vertrekkende van (S)-2-tert-butoxycarbonylamino-3(2-bromofenyl)-propaanzuur. Syntheseproducten worden opgezuiverd m.b.v. silicagel kolomchromatografie.
Kwaliteitscontrole
omvat
dunnelaagchromatografie
(TLC)
en
Nucleaire Magnetische Resonantie (NMR) De precursor voor [18F]FET, O-(2-tosyloxyethyl)-Ntrityl-L-tyrosine tert-butylester, zal aangekocht worden.
De manuele radiosynthese van zowel 2-[18F]FELP en [18F]FET, die een labeling met 18Fen een daarop volgende zure deprotectie omvat, zal geoptimaliseerd worden. Het effect van de reactietijd, reactietemperatuur en precursorconcentratie op het radiolabelingsrendement (bepaald via TLC) zal onderzocht worden. Om een optimaal deprotectierendement te bekomen, kan gekeken worden naar onder andere de deprotectietijd en de samenstelling van het deprotectiesolvent. Analyse van het deprotectierendement zal met High Performance Liquid Chromatography (HPLC) gedaan worden. Op basis van de resultaten kan een efficiëntere radiosynthese bekomen worden van deze twee PET-radiofarmaca. De radiosynthese van [18F]FET zal ook geautomatiseerd worden m.b.v. een customized Scintomics Hotbox3 systeem. Er zal nagegaan worden indien aanpassingen noodzakelijk zijn om de optimale radiosynthese van [18F]FET geautomatiseerd te laten doorgaan.
16
3
MATERIALEN EN METHODEN
3.1
REAGENTIA
Tabel 3.1: Tabel met de gebruikte reagentia en hun specificaties. Voor de precieze chemische naam wordt verwezen naar de lijst met afkortingen vooraan de masterproef.
Naam AcN 9-BBN BH3-THF complex oplossing CaCl2 CH2Cl2 Et3N
Specificatie HPLC; ≥99,5 %; max. 200 ppm water 0,5 M in THF 1,0 M in THF Anhydrous; min. 93,0 % HPLC; 99,8 %; max. 0,01 % water ≥99,5 %; max. 0,1 % water
EtOH Glaswol HCl
HPLC; ≥99,8 %; max. 0,02 % water ≥99,8 vol.% / 37 %
H2O2
30-31 %
K2CO3 K222 LiCl
99,7 % / Anhydrisch; ≥98;0% HPLC; ≥99,9 %; max. 0,05 % water 99 % ≥99,5 % 99,7 - 100,3 % >99 % 99 % 98 % 95+ %; max. 0,02 % water 0,0095 M PO499 % 97 % 230-400 mesh Poriëngrootte: 70.10-10m
EtOAc
MeOH MgSO4 NaCl NaHCO3 NaOH Na2SO4 NH4Ac n-hexaan PBS Pd(PPh3)4 P2O5 Silicagel (S)-2-tertbutoxycarbonylamino-3-(2bromofenyl)-propaanzuur tert-butyl 2,2,2trichloroacetimidaat TET THF
Producent Chemlab (Overijse, BE) Sigma-Aldrich (Bornem, BE) Sigma-Aldrich (Bornem, BE) Sigma-Aldrich (Bornem, BE) Lab-Scan (Hasselt, BE) Fluka analytical (Buchs, Zwitserland) Lab-Scan (Hasselt, BE) Chemlab (Overijse, BE) Supelco (Bellefonte, PA, USA) Sigma-Aldrich (Bornem, BE) Riedel—de Haën (Seelze, Duitsland) Sigma-Aldrich (Bornem, BE) ABX (Radeberg, Duitsland) Sigma-Aldrich (Bornem, BE) Lab-Scan (Hasselt, BE) Acros Organics (Geel, BE) Sigma-Aldrich (Bornem, BE) Sigma-Aldrich (Bornem, BE) Merck (Darmstadt, Duitsland) Sigma-Aldrich (Bornem, BE) Sigma-Aldrich (Bornem, BE) Chem-Lab (Overijse, BE) Lonza (Bazel, Zwitserland) Sigma-Aldrich (Bornem, BE) Sigma-Aldrich (Bornem, BE) Sigma-Aldrich (Bornem, BE)
/
Peptech (Bedford, MA, USA)
96 %
Sigma-Aldrich (Bornem, BE)
/ ≥99,9 %; max. 0,002 % water
ABX (Radeberg, Duitsland) Sigma-Aldrich (Bornem, BE)
17
TosCl Tri n-butylvinyltin Zeezand (SiO2) 3.2
APPARATUUR
3.2.1
Kolomchromatografie
≥99 % 97 % -50; +70 mesh
Sigma-Aldrich (Bornem, BE) Acros Organics (Geel, BE) Sigma-Aldrich (Bornem, BE)
Na aflopen van elke synthesestap dient het gewenste product gescheiden te worden van ongereageerde of ongewenste producten. Kolomchromatografie is een snelle, eenvoudige scheidingstechniek die berust op een selectieve vertraging van analyten in een vloeibare mobiele fase door een stationaire fase. De scheiding van de componenten gebeurt op basis van hun verschillende interactiesterkte. De stationaire fase kan normal phase (NP; polair) of reversed phase (RP; apolair) zijn. In tegenstelling tot High Performance Liquid Chromatography (HPLC; zie verder) wordt er geen druk aangebracht op de kolom. Voor elke scheiding werd een nieuwe kolom klaargemaakt. Een prop glaswol werd onderaan de kolom aangebracht, gevolgd door een laagje zand. Hierbovenop werd een slurry van ongeveer 33 gram silicagel (normal phase), gesuspendeerd in hexaan, aangebracht. Na volledig uitzakken van de silicagelpartikels werd een tweede laagje zand aangebracht, gevolgd door het te scheiden mengsel dat op zijn beurt weer werd afgedekt met een laagje zeezand (zie Figuur 3.1). Het te scheiden mengsel werd als een vaste stof geladen op de kolom. Dit gebeurde door na de reactie een hoeveelheid silicagel (2 gram) en CH2Cl2 (ongeveer 30 mL) toe te voegen aan de reactiekolf. De inhoud van de kolf werd uitgedampt m.b.v. een rotavapor (Büchi rotavapor R-114; New Castle, DE, USA) onder verlaagde druk (KNF NSE800 Vacuümpomp, Freiburg, Duitsland) tot een droog poeder bekomen werd. Als mobiele fase werd een mengsel van EtOAc in n-hexaan aangewend. Voor de precieze samenstelling voor elke reactiestap wordt verwezen naar de syntheseprotocols. Het door de kolom gelopen eluaat werd opgevangen in verschillende proefbuizen in fracties van ongeveer 10 mL per proefbuis.
18
Figuur 3.1: Schematische weergave van een chromatografisch proces m.b.v. een kolom. De gekleurde balkjes stellen verschillende analyten voor die selectief vertraagd worden door de stationaire fase.
3.2.2
Dunnelaag chromatografie (TLC) TLC is een scheidingstechniek waarbij analyten in een vloeibare mobiele fase selectief
vertraagd worden door een planaire stationaire fase, die polair of apolair kan zijn. Voordelen van TLC zijn het gebruiksgemak, de lage kostprijs en de relatief korte analysetijd (Poole, 1999). TLC werd in de verschillende synthesestappen aangewend als eerstelijns kwaliteitscontrole van de gesynthetiseerde producten. De platen (Macherey-Nagel; Düren, Duitsland) waren gecoat met een 0,20 mm dik laagje silica. Als mobiele fase werd 20 % EtOAc in n-hexaan gebruikt. Alle fracties werden na de kolomchromatografie gespot op een TLC-plaatje en bekeken onder een UV-lamp (254 nm; Spectroline ENF-260C/FE). Fracties die een gekleurde vlek voortbrachten onder UV-licht, werden vervolgens gespot op een TLCplaat, ontwikkeld en geanalyseerd onder de UV-lamp. Fracties die een spot met de gewenste Rf-waarde vertoonden, werden samengevoegd in een kolf en uitgedampt m.b.v. een rotavapor onder verlaagde druk. 3.2.3
Module voor de geautomatiseerde radiosynthese De geautomatiseerde radiosynthese van [18F]FET werd uitgevoerd m.b.v. een
gepersonaliseerd Scintomics Hotbox3 systeem (Scintomics, Fürstenfeldbruck, Duitsland). Aan het toestel werd een semi-preparatief HPLC-systeem gekoppeld, bestaande uit een Variopump LC1, VarioHPLC en Variodetect. De semi-preparatieve kolom was van het type
19
Grace Econosphere C18 (250 x 10,0 mm; 10 µm), met MF 1 (zie Tabel 3.2) als mobiele fase. Hoe de geautomatiseerde radiosynthese uitgevoerd werd, staat beschreven in 3.3.6. 3.2.4
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) HPLC is een vorm van vloeistofchromatografie. Deze techniek verschilt van
kolomchromatografie door het feit dat bij HPLC een vrij hoge druk (meestal ongeveer 100 bar) wordt aangebracht om de mobiele fase door de kolom te stuwen. In tegenstelling tot kolomchromatografie, bestaat de stationaire fase uit kleinere partikels (3-10 µm in de praktijk) en is de interne diameter van de kolom kleiner bij HPLC (< 10 mm) (Ph.Eur 7.7; hfdst. 2.2.29). Dit leidt tot een verhoogde scheidingsefficiëntie en resolutie. Tenzij uitdrukkelijk anders vermeld, werd enkel volgend (RP-)HPLC-systeem gebruikt: Tabel 3.2: Herkomst en eigenschappen van de verschillende onderdelen van het gebruikte HPLC-systeem. Het 18 absorptiemaximum (273 nm) van [ F]FET werd overgenomen uit een voorgaande thesis (Van Hoeve, 2012).
Onderdeel Kolom Pomp UV/VIS-detector
Geiger-Müller detector Integrator Mobiele fase 1 (MF 1)
Mobiele fase 2 (MF 2)
Mobiele fase 3 (MF 3)
Mobiele fase 4 (MF 4)
Loop Geinjecteerde hoeveelheid
Eigenschappen Apollo C18 250 x 4,6 mm, 5 µm 307 pomp; 1,0 ml/min 2487 Dual λ Absorbance detector 273 nm voor detectie 2-[18F]FELP en [18F]FET Model 2200 Scaler Ratemeter CR8A Chromatopac EtOH/H2O (5/95 v/v) 10 mM NH4Ac pH 5,5 AcN/MeOH/H2O (30/30/40 v/v) 10 mM NH4Ac pH 5,5 AcN/H2O (80/20 v/v) 10 mM NH4Ac pH 5,5 EtOH/H2O (20/80 v/v) 10 mM NH4Ac pH 5,5 100 µL Beschreven in hoofdstuk 4 20
Herkomst Grace, Deerfeeld, Illinois, VS Gilson, Den Haag, Nederland Waters, Zellik, België
Ludlum Measurements inc, Sweetwater, Texas, VS Shimadzu, ’s Hertogenbosh, Nederland
3.3
EXPERIMENTELE PROTOCOLS
3.3.1
Synthese van (S)-2-tert-butoxycarbonylamino-3-(2-bromofenyl)-propaanzuur tbutylester (verbinding 2; reactiestap A)
HO
O
O
O
NH
O
O
t butyl trichloroacetamide CH2Cl2
Br
24h
O O
NH
Br
Figuur 3.2: beschermingsreactie van verbinding 1 met vorming van verbinding 2
Het protocol was gebaseerd op een methode beschreven door J. Thierry et al., 1998. (S)-2-tert-butoxycarbonylamino-3-(2-bromofenyl)-propaanzuur (Verbinding 1; 0,86 g; 2,5 mmol) werd in 15 mL CH2Cl2 in een kolf opgelost. Er werd een hoeveelheid tert-butyl 2,2,2trichloroacetimidaat (1,64 g; 7,5 mmol) toegevoegd. De reactie ging 24 uur door bij kamertemperatuur onder constant roeren op een roerplaat. Na het aflopen van de reactie werd het mengsel onderworpen aan silicagel kolomchromatografie met als mobiele fase: 20% EtOAc in n-hexaan. 3.3.2
Synthese van (S)-2-tert-butoxycarbonylamino-3-(2-vinylfenyl)-propaanzuur tertbutylester (verbinding 3; reactiestap B)
O
O
NH Br
O O
tri n butyl vinyltin Pd(PPh3)4 LiCl THF
O
O
NH
O O
24h 80 °C
Figuur 3.3: Stille reactie van verbinding 2 met vorming van verbinding 3.
Het protocol was gebaseerd op een methode beschreven door B. Mahieu (2007). Verbinding 2 (972 mg; 2,4 mmol) uit reactiestap A werd opgelost in 10 mL THF. Zuurstof werd verwijderd uit de oplossing met behulp van een N 2-stroom. Vervolgens werd een hoeveelheid Pd(PPh3)4 (2 mol %; 63 mg) en LiCl (874 mg; 20,4 mmol) toegevoegd aan het reactievat. Dit mengsel werd gedurende 1 uur onder stikstofatmosfeer geroerd. Daarna
21
werd tri n-butylvinyltin (910 µL; 3,1 mmol) toegevoegd. Dit mengsel reageerde gedurende 24 uur bij 80°C op een verwarmde roerplaat. Na afkoelen van het reactiemengsel tot kamertemperatuur, werd het verdund met 50 mL EtOAc. Het LiCl-Pd(II)-complex werd verwijderd via filtratie. Het filtraat werd overgebracht in een scheitrechter, waarna het gewassen werd met 10 mL 4 M NaOH, en aangevuld tot 200 mL met ultrapuur water. De organische fase werd vervolgens nog driemaal gewassen met 200 mL ultrapuur water, gedroogd met behulp van Na2SO4 en opnieuw gefilterd. Het filtraat werd opgevangen in een kolf en uitgedampt. De inhoud van de kolf werd onderworpen aan silicagel kolomchromatografie. Er werd een gradiënt toegepast bij de mobiele fase: 0% -> 15% EtOAc in n-hexaan, in stappen van 5%. 3.3.3
Synthese van (S)-2-tert-butoxycarbonylamino-3-(2-(2-hydroxyethyl)fenyl)propaanzuur tert-butylester (verbinding 4; reactiestap C)
O
O
O
NH
O
A) 9 BBN B) NaOH,H2O2 HO THF
O
O
O
NH
O
A) 3h B) 3h
Figuur 3.4: hydroboratie/oxidatie van verbinding 3 met vorming van verbinding 4. Het anti-Markovnikov alcohol is het reactieproduct.
Het protocol was gebaseerd op een methode beschreven door L. Wang, 2011. Verbinding 3 (611 mg; 1,8 mmol) werd opgelost met 40 mL THF in een kolf die onder N2stroom geplaatst werd. Daaraan werd 3,0 equivalent 0,5 M 9-BBN druppelsgewijs toegevoegd. Het mengsel werd gedurende 3 uur bij kamertemperatuur geroerd. Vervolgens werd de kolf afgekoeld tot 0°C in een ijsbad. Eerst werd 25 mL 30 % H2O2 toegevoegd, daarna 25 mL 3 M NaOH. Het mengsel reageerde 3 uur verder bij kamertemperatuur. Na 3 uur werd er tweemaal 50 mL van een verzadigde Na2S2O3-oplossing voorzichtig in kleine porties toegevoegd. Alle vloeistof werd overgebracht in een scheitrechter en gespoeld met 50 mL EtOAc. Na verwerpen van de waterige fase werd gespoeld met 100 mL
22
pekel (verzadigde NaCl oplossing) en met 100 mL ultrapuur water. De organische fase werd gedroogd met behulp van MgSO4. De vaste stof werd vervolgens afgefilterd; het filtraat werd opgevangen in een kolf en uitgedampt. De inhoud van de kolf werd onderworpen aan silicagel chromatografie. Er werd een gradiënt toegepast bij de mobiele fase: 0 -> 50 % EtOAc in stappen van 10%. 3.3.4
Synthese van (S)-2-tert-butoxycarbonylamino-3-(2-(2-tosyloxyethyl)fenyl)propaanzuur tert-butylester (verbinding 5, reactiestap D)
O
O
O
HO NH
TsCl Et3N
O
O
S
O
O
O O
O NH
CH2Cl2
O
72h
Figuur 3.5: Tosylering van verbinding 4 met vorming van verbinding 5.
Het protocol was gebaseerd op een methode beschreven door L. Wang, 2011. Een hoeveelheid verbinding 4 (378 mg; 1,0 mmol) werd opgelost in 10 mL CH2Cl2, samen met 435 µL Et3N en TosCl (237 mg; 1,2 mmol). De reactie ging 72 uur door. Nadien werd aangelengd met CH2Cl2 tot 50 mL. De organische fase werd driemaal gewassen met 50 mL verzadigde NaHCO3-oplossing en vervolgens met 50 mL verzadigde NaCl-oplossing. De organische fase werd gedroogd m.b.v. MgSO4, gefilterd en uitgedampt in een kolf. De inhoud van de kolf werd onderworpen aan silicagel chromatografie. Er werd een gradiënt toegepast bij de mobiele fase: 0 -> 30 % EtOAc in stappen van 5 %. 3.3.5
Manuele radiosynthese van 2-[18F]FELP en [18F]FET
O
S
O
O
O
O O
O NH
18 -
F AcN
O
10 min 110°C
23
O
O
18
F NH
O
O
HO
O
O
1 M HCl H2O
18
F NH
O
O
18
F NH2
6 min 110 °C
18
18 -
Figuur 3.6: Een optimale radiosynthese van 2-[ F]FELP omvat de labeling van 10 mg verbinding 5 in 2,0 ml AcN met F 18 tot bekomen van (S)-2-tert-butoxycarbonylamino-3-(2-(2-[ F]fluoroethyl)fenyl)-propaanzuur tert-butylester (verbinding 6, reactiestap E), gevolgd door een deprotectie met 1 M HCl bij 110°C voor minstens 6 minuten tot bekomen van 18 2-(2-[ F]fluoroethyl)-L-fenylalanine (verbinding 7, reactiestap F).
O
O S
O
O
O O
F AcN
NH
O
O
O
18 -
18
F
NH
5 min 110 °C
O
O
1 M HCl H2O
O 18
F
NH
OH
O O 18
F
NH2
10 min 110 °C
18
18 -
Figuur 3.7: Een optimale radiosynthese van [ F]FET omvat de labeling van 2,0 mg TET-precursor in 2,0 ml AcN met F tot 18 bekomen van O-(2-[ F]fluoroethyl)-N-trityl-L-tyrosine tert-butylester, gevolgd door een deprotectie met 1 M HCl bij 18 110°C voor 10 minuten tot bekomen van O-(2-[ F]fluoroethyl)-L-tyrosine.
De stappen van de radiosynthese die leiden tot 2-[18F]FELP en [18F]FET, vertrekkende van hun precursoren, zijn gelijkaardig en worden daarom hier samen besproken. De radiosyntheseprotocols van 2-[18F]FELP en [18F]FET waren gebaseerd op methoden van respectievelijk L. Wang, 2011 en H-E. Wang, 2005. De precursor voor de radiosynthese van 2-[18F]FELP, (S)-2-tert-butoxycarbonylamino-3-(2-(2-tosyloxyethyl)fenyl)-propaanzuur tertbutylester (verbinding 5), werd in-house aangemaakt. De precursor voor de radiosynthese
24
van [18F]FET, O-(2-tosyloxyethyl)-N-trityl-L-tyrosine tert-butylester (TET), werd aangekocht bij ABX (zie Tabel 3.1). 3.3.5.1 Labelingsreactie met 18FBij de optimalisatie van de labelingsreactie zijn hoofdzakelijk 3 parameters van belang: de hoeveelheid precursor, de reactietijd en reactietemperatuur. Bij de optimalisatie van de radiolabeling werd dezelfde reactie meerdere keren uitgevoerd onder verschillende reactiecondities. Bij elke onderzochte parameter werden 5 datapunten genomen, terwijl de twee andere parameters constant gehouden werden. Het verder weergegeven protocol omvat een labelingsreactie waarbij deze 3 parameters niet concreet zijn ingevuld. In hoofdstuk 4.5 staan de exacte waarden van de 3 parameters die in elk experiment gebruikt werden. Voor de optimale condities: zie hoofdstuk 5, of Figuur 3.6 en Figuur 3.7. Op een QMA SEP-PAK kolom (Waters, geconditioneerd met 5 mL 0,01 M K2CO3 en 5 mL ultrapuur water) werd ongeveer 300 Mbq 18F--oplossing gebracht. Deze oplossing werd aangemaakt in het UZ Gent door een
18
O (p,n) 18F kernreactie m.b.v. een Cyclone 18 Twin
Cyclotron(IBA). Voor de exacte activiteit gebruikt in elke radiosynthese wordt verwezen naar hoofdstuk 4. 18F- werd van de kolom geëlueerd in een flesje m.b.v. 5 mL van een oplossing die 50 mg Kryptand-222 en 5 mg K2CO3 in AcN/H2O (90/10) bevatte. Van het eluens werd 400 µL overgebracht in een reactievial. Bij een temperatuur van 110 °C werd er 10 minuten uitgedampt in een verwarmd oliebad. Vervolgens werd de wand van de vial gespoeld met 400 µL AcN, waarna de vial onder dezelfde condities werd droog gedampt. Deze stap werd tweemaal uitgevoerd. Na 1 minuut afkoelen in een ijsbad, werd aan de vial een hoeveelheid precursor (0,5 mg -> 5,0 mg TET of verbinding 5), opgelost in 2,0 mL AcN, toegevoegd. Na sluiten van de vial werd geschud en verwarmd bij 40 -> 120°C voor 1 -> 15 minuten. De reactie werd gestopt door de vial gedurende 1 minuut in een ijsbad te plaatsen. Daarna werd een druppel reactiemengsel gespot op een in vakjes onderverdeeld TLCstrookje, waarna ontwikkeling volgde in een TLC-tank met als mobiele fase 40 % EtOAc in nhexaan. De verknipte vakjes van het TLC-strookje werden dan gecontroleerd op radioactiviteit m.b.v. een dosiscalibrator (Capintec CRC-15R; Capintec Instruments, USA). Op basis van de resultaten kon het rendement van de labelingsreactie van de precursor bekomen worden.
25
3.3.5.2 Deprotectie In de literatuur stond reeds beschreven dat O-(2-[18F]fluoroethyl)-N-trityl-L-tyrosine benzylester gedeprotecteerd kon worden met 1 M HCl bij 100°C voor 10 minuten (H-E Wang et al., 2005). Er werd nagegaan indien verbinding 6 en O-(2-[18F]fluoroethyl)-N-trityl-Ltyrosine tert-butylester onder analoge condities ook gedeprotecteerd werden en wat de optimale deprotectietijd was. Voor de deprotectiereacties werd na radiosynthese van verbinding 6 of O-(2[18F]fluoroethyl)-N-trityl-L-tyrosine tert-butylester 1,8 ml van het reactiemengsel (zie 3.3.5.1) over een Alumina N Plus SEP-PAK kolom (Waters, geconditioneerd met 5 mL AcN) gestuurd om sporen 18F- te verwijderen. Er werd vervolgens eerst een experiment uitgevoerd om na te gaan indien de deprotectie van O-(2-[18F]fluoroethyl)-N-trityl-L-tyrosine tert-butylester met 1 M HCl beïnvloed werd door een verschillende verhouding AcN/H2O solvent. Ook werd nagegaan indien O-(2-[18F]fluoroethyl)-N-trityl-L-tyrosine tert-butylester gedeprotecteerd kon worden nadat eerst alle AcN uit de voorgaande reactiestap (zie 3.3.5.1) verdampt werd. Voor deze proeven werden drie vials gevuld met 200 µL eluaat dat door de Alumina N Plus SEP-PAK kolom gelopen had na aflopen van de labelingsreactie. De inhoud van elke vial werd aan 1 M HCl blootgesteld bij 110°C voor 10 minuten (zie Tabel 3.3). Na de reactie werd de vial 2 minuten afgekoeld in een ijsbad, het zuur geneutraliseerd met een gepaste hoeveelheid 5 M NaOH en aangelengd met 200 µL PBS. 50 µL van deze oplossing werd geanalyseerd via HPLC met MF 2, waarna het deprotectierendement bepaald kon worden. 18
Tabel 3.3: Overzicht van de verschillende 1 M HCl deprotectiemilieus waaraan O-(2-[ F]fluoroethyl)-N-trityl-L-tyrosine 18 tert-butylester werd blootgesteld om [ F]FET te bekomen.
Deprotectiecondities AcN deprotectiemilieu
200 µL Alumina eluens (AcN) + 40 µL 6 M HCl
AcN/H2O deprotectiemilieu
200 µL Alumina eluens (AcN) + 200 µL H2O + 80 µL 6 M HCl
H2O deprotectiemilieu
200 µL Alumina eluens (AcN) verdampen + 200 µL 1 M HCl
26
Er werd ook een experiment uitgevoerd om, gebruik makend van 1 M HCl, de deprotectietijd van zowel verbinding 6 en O-(2-[18F]fluoroethyl)-N-trityl-L-tyrosine tertbutylester te optimaliseren. Het deprotectierendement werd geanalyseerd in functie van de deprotectietijd. De deprotectie werd 5 keer uitgevoerd met een oplopende deprotectietijd. Van het Alumina N Plus SEP-PAK kolom eluens werd 200 µL overgebracht in 5 vials. De vials werden vervolgens droog gedampt bij een temperatuur van 110°C voor 5 minuten. Er werd 200 µL 1 M HCl toegevoegd aan elke vial. Vervolgens werd deze gesloten en geschud, waarna de deprotectie doorging bij 110°C voor 2,4,6,8 of 10 minuten. Na de reactie koelde de vial 2 minuten af in een ijsbad, werd er 40 µL 5 M NaOH toegevoegd en aangelengd met 200 µL PBS. Van dit mengsel werd 50 µL via HPLC (met MF 2) geanalyseerd en het deprotectierendement werd tenslotte bepaald op basis van het bekomen chromatogram. 3.3.6
Geautomatiseerde radiosynthese van [18F]FET
18
Figuur 3.8: Schematische overzicht van de opstelling om [ F]FET geautomatiseerd aan te maken. Het systeem werd op druk gebracht (0,75 bar) met N2-gas. R1: 1,0 mL 90/10 (v/v) AcN/H2O mengsel dat 10,0 mg Kryptand-222 en 1,0 mg K2CO3 bevatte. R2: 2,0 mL AcN. R3: 2,0 mL AcN. R4: 2,0 mg TET-precursor in 2,0 mL AcN. R5: 1,0 mL 1 M HCl in 50/50 (v/v) AcN/H2O. Na de reactie werd de inhoud van de reactievial via N2-druk overgebracht naar de overloopvial. Deze vial was reeds op voorhand gevuld met 200 µL 5 M NaOH en 300 µL PBS. Het semi-preparatief HPLC-systeem was aangesloten om 18 [ F]FET op te vangen.
27
Het hierna volgende protocol geeft de geautomatiseerde radiosyntheseprocedure weer. Voor de wijzigingen om een optimaler protocol van de geautomatiseerde radiosynthese van [18F]FET te bekomen, wordt verwezen naar hoofdstuk 5 en Figuur 3.8. Hoe dit bekomen werd, staat beschreven in hoofdstuk 4.6. Op een QMA SEP-PAK kolom (Waters, geconditioneerd met 5 mL 0,01 M K2CO3 en 5 mL ultrapuur water) werd 370 MBq 18F- geladen. Elutie van de kolom gebeurde a.d.h.v.e. 1,0 mL 90/10 (v/v) AcN/H2O mengsel dat 10 mg Kryptand-222 en 1 mg K2CO3 bevatte. 18F- werd gedroogd bij 110°C voor 10 minuten. Vervolgens werd de reactievial met 2 maal 2,0 mL AcN gespoeld, waarna telkens azeotropisch gedroogd werd bij 110 °C voor 5 minuten. Van de precursor, TET, werd 2,0 mg in 2,0 mL AcN (1,48 mM) toegevoegd aan de reactievial. De labelingsreactie ging door voor 5 minuten bij 110°C. De daarop volgende deprotectiereactie met 1,0 mL 1 M HCl ging door voor 10 minuten bij 110 °C. Na de volledige radiosynthese werd de inhoud van de reactievial via N2-flow overgebracht naar de overloopvial, die reeds op voorhand gevuld was met 200 µL 5 M NaOH en 300 µL PBS (zie Figuur 3.8). Dit mengsel kon aan HPLC onderworpen worden. Het HPLCgedeelte van de geautomatiseerde radiosynthese kon wegens tijdsgebrek nog niet op punt gesteld worden. Het opvangen van de [18F]FET-piek kon dus voorlopig nog niet uitgevoerd worden. De bepaling van het radiolabelings-en deprotectierendement gebeurde met het HPLC-systeem beschreven in hoofdstuk 3.2.4.
28
4
RESULTATEN EN DISCUSSIE
4.1
BESCHERMINGSREACTIE (REACTIESTAP A)
4.1.1
Opzuivering De kolom werd geëlueerd met 20/80 (v/v) EtOAc/n-hexaan en het eluaat werd
opgevangen in fracties van ongeveer 10 mL. Fracties 7 t.e.m. 17 vertoonden lichte tot matige kleuring onder de UV-lamp. Deze fracties werden daarom gespot op een TLC-plaat en ontwikkeld (zie Figuur 4.1). Fracties 9 t.e.m. 12 vertoonden een gelijkaardige vlek qua intensiteit en Rf-waarde. De vlekken afkomstig van fracties 14 t.e.m. 17 hadden een afwijkende, lagere Rf-waarde, dichter aanleunend bij de Rf-waarde van het startproduct (verbinding 1) als referentie. Reactiestap A had tot gevolg dat verbinding 1 in een meer apolaire verbinding werd omgezet, verbinding 2. Op een polaire stationaire fase zoals het hier gebruikte silica zal deze verbinding minder tegengehouden worden, resulterend in een hogere Rf-waarde. Het omgekeerde geldt voor de meer polaire nevenproducten: er wordt daarom een lagere Rfwaarde bekomen. Op basis van dit feit werden fracties 10 t.e.m. 12 in een kolf verzameld en uitgedampt. Fractie 9 werden niet ingesloten omwille van een additionele vlek (zie Figuur 4.1)
Figuur 4.1: Ontwikkelde TLC-platen van de fracties die verkleuring vertoonden onder de UV-lamp. Fractie 9 werd een tweede maal gespot en ontwikkeld op een klein plaatje (zie links) en vertoonde afwijkende vlekken. Verbinding 1 diende als referentiestandaard R (Rf = 0,10). Enkel fracties 10 t.e.m. 12 (Rf = 0,54) werden samengevoegd en uitgedampt.
Na uitdampen van solventen werd een zeer viskeuze, doorzichtige vloeistof waargenomen, die na verloop van tijd bij kamertemperatuur uithardde onder de vorm van een witte, amorfe vaste stof.
29
4.1.2
Rendement
Tabel 4.1: Berekening van het rendement van de beschermingsreactie: bekomen van verbinding 2 (reactiestap A).
Stof Synthese 1 Synthese 2
Verbinding 1 Verbinding 2 Verbinding 1 Verbinding 2
MG (g/mol) 344,23 400,35 344,23 400,35
Aantal g
Aantal mmol
0,8764 0,9720 1,8263 1,4364
2,546 2,428 5,306 3,588
Rendement (%) 95,36% 67,63%
Synthese 1 bevestigt het hoge rendement dat kan bekomen worden bij de beschermingsreactie van een carboxylgroep van fenylalanine (99%, Kersemans et al., 2008). De tweede synthese had een beduidend lager rendement dan de eerste. Dit kon verklaard worden doordat een deel van verbinding 2 verloren gegaan is door overkoken bij het uitdampen van de reactiekolf voor chromatografische scheiding. 4.2
STILLE REACTIE (REACTIESTAP B)
4.2.1
Opzuivering De kolom werd geëlueerd en het eluaat werd opgevangen in fracties van ongeveer 10
mL. Fracties 12 t.e.m. 25 vertoonden kleuring onder de UV-lamp. Deze fracties werden daarom gespot op een TLC-plaat en ontwikkeld (zie Figuur 4.2). Vooral fracties 14 t.e.m. 18 vertoonden een zeer intense rode vlek, met een andere Rf-waarde dan verbinding 2 als referentie. Fracties 14 t.e.m. 18 werden daarom samengevoegd en uitgedampt.
Figuur 4.2: Ontwikkelde TLC-platen van de fracties die verkleuring vertoonden onder de UV-lamp. Verbinding 2 diende als referentiestandaard R (Rf = 0,71). Enkel fracties 14 t.e.m. 18 (Rf = 0,74) werden omwille van hun sterke fluorescentie samengevoegd en uitgedampt. Alle andere fracties vertoonden veel lichtere kleuring, met licht andere Rf-waarden.
30
Door de Stille reactie werd een vinylgroep geïntroduceerd op verbinding 2. Dit betekende een uitbreiding van het geconjugeerd systeem, leidend tot een bathochrome shift: de absorptiecoëfficiënt en het absorptiemaximum van de verbinding stijgen. Op TLC was dit zichtbaar: er waren zeer intense vlekken aanwezig onder UV-licht. Na uitdampen van solventen werd een viskeuze lichtgele olie bekomen. 4.2.2
Rendement
Tabel 4.2: Berekening van het rendement van de Stille-reactie: bekomen van verbinding 3 (reactiestap B).
Stof Synthese 1
Verbinding 2 Verbinding 3
MG (g/mol) 400,35 347,45
Aantal g
Aantal mmol
Rendement (%)
0,9720 0,6109
2,428 1,758
72,42
De reactie mag geslaagd beschouwd worden. Het rendement van de synthese (72,42 %) is vergelijkbaar met een eerder experiment (75 %; Mahieu,2007). 4.3
HYDROBORATIE-OXIDATIE (REACTIESTAP C)
4.3.1
Reactie met 9-BBN De kolom werd geëlueerd en het eluaat werd opgevangen in fracties van ongeveer 10
mL. Fracties 9 t.e.m. 15 vertoonden een zeer intense kleuring onder de UV-lamp. Deze fracties werden gespot op een TLC-plaat en ontwikkeld met verbinding 3 als referentie. Alle voornoemde fracties vertoonden dezelfde intense vlek onder de UV-lamp, met exact dezelfde Rf-waarde als de referentie (zie Figuur 4.3). Op basis van dit feit kon de veronderstelling gemaakt worden dat er geen reactie opgetreden was van verbinding 3. Fracties 9 t.e.m. 15 werden samengevoegd en uitgedampt tot bekomen van een lichtgele olie. Een NMR-spectrum toonde aan dat het bekomen product inderdaad verbinding 3 was: er was dus geen reactie opgetreden.
31
Figuur 4.3: TLC-plaat van de fracties die verkleuring onder UV-licht vertoonden. De Rf-waarden van de gespotte fracties 9 t.e.m. 15 (Rf = 0,65) komen volledig overeen met referentie R (Rf = 0,65) (verbinding 3).
In een tweede synthesepoging met een verse batch 9-BBN werd evenmin reactieproduct teruggevonden. Literatuur toonde echter aan dat met 9-BBN wel degelijk het anti-Markovnikov alcohol kan bekomen worden als de vinylgroep op de 4de positie staat van het fenylalaninederivaat (Wang et al., 2011). Dit zou mogelijks verklaard kunnen worden op basis van sterische factoren. Het hydroboronatiereagens 9-BBN (zie Figuur 4.4) is een sterisch gehinderd molecule dat moet aanvallen op een vinylgroep die in de 2-positie staat op een al even sterisch gehinderde verbinding 3. Mogelijks kan 9-BBN door deze hindering moeilijker aanvallen op de 2-positie, waardoor er geen reactie optreedt.
Figuur 4.4: De structuren van 9-BBN (links) en verbinding 3 (rechts). De verschillende mogelijke posities op de fenylgroep staan aangegeven met cijfers. Beide structuren zijn vrij volumineus, wat de hydroboratie-oxidatiereactie vermoedelijk bemoeilijkte.
4.3.2
Reactie met BH3 Verbinding 3 werd gerecupereerd en onderworpen aan een nieuwe hydroboratie-
oxidatie reactie, ditmaal met BH3 als hydroboratiereagens. BH3 is minder sterisch gehinderd en geeft preferentieel aanleiding tot het anti-Markovnikovalcohol. Hetzelfde protocol zoals beschreven in hoofdstuk 3.3.3 werd gebruikt voor synthese en opzuivering.
32
Bij de opzuivering door kolomchromatografie vertoonden fracties 11 t.e.m. 16 lichtrode kleuring onder UV-licht. Een TLC werd ontwikkeld van deze fracties (Figuur 4.5). Fracties 15 en 16 vertoonden een zuivere band, fractie 14 niet: deze werd opnieuw onderworpen aan een identieke kolomchromatografie. Uiteindelijk werden fracties 15, 16 en de opgezuiverde fractie 14 wegens hun sterkere retentie op silicagel uitgedampt tot bekomen van een kleurloze viskeuze vloeistof.
Figuur 4.5: TLC-plaat van synthese 1 met BH3. Als referentie R werd verbinding 3 gebruikt (Rf = 0,42). Alle vlekken waren veel minder intens van kleur dan de R-vlek. Dit is te wijten aan de afname in het geconjugeerd systeem door de hydroboratie-oxidatiereactie (de vinylgroep verdwijnt). Fracties 15 en 16 (Rf = 0,36) weren rechtstreeks gecollecteerd. Fractie 14 werd onderworpen aan een nieuwe, identieke scheiding en vervolgens bij fracties 15 en 16 gevoegd.
4.3.3
Rendement
Tabel 4.3: Berekening van het rendement van de hydroboratie-oxidatiereactie: bekomen van verbinding 4 (reactiestap C). “Verbinding 4” was in feite ongereageerde verbinding 3.
Stof Verbinding 3 Synthese (9-BBN) “Verbinding 4” Synthese 1 Verbinding 3 (BH3) Verbinding 4 Synthese 2 Verbinding 3 (BH3) Verbinding 4
MG (g/mol)
Aantal g
Aantal mmol
347,25 365,47
0,6109 0,6089 0,8834 0,4998 0,5861 0,3781
2,544 1,368 1,688 1,035
Rendement (%)
53,76 61,30
Verbinding 4 kon voorheen reeds aangemaakt worden met BH3 (22 % rendement; Mahieu, 2007). Dit lage rendement kon toen verklaard worden door een te korte reactietijd (2 + 1 uur reactie i.p.v. het hier gebruikte 3 + 3 uur reactie). Er werd geen representatief rendement gevonden in de literatuur voor de aanmaak van verbinding 4 met 9-BBN. Wel werd een rendement van 86% bekomen voor de hydroboratie-oxidatiereactie met 9-BBN van een analoog van verbinding 3, waarbij de vinylgroep in de 4de positie staat in plaats van
33
de 2de positie zoals hier het geval was (Wang et al., 2011). Vergeleken met deze waarde is het rendement van de synthesestap met BH3 laag. Het protocol werd nochtans zorgvuldig uitgevoerd onder N2-atmosfeer. De aanwezigheid van water in de hydroboratiereactie met BH3 is nefast en zou mogelijks tot een verlaagde opbrengst kunnen geleid hebben. Het glaswerk werd immers niet gevlamdroogd en het N2-gas werd niet gedroogd. Er werd een tweede synthese met BH3 uitgevoerd, waarbij het gebruikte glaswerk eerst gevlamdroogd werd. De N2-stroom werd door een pipet gestuurd, gevuld met het hygroscopische CaCl2 en P2O5. Deze ingreep leidde tot een rendementsstijging van ongeveer 8% (zie Tabel 4.3). Desalniettemin bleef het rendement niet al te hoog (61,30 %). Dit deed vermoeden dat de hydroboratie-oxidatie moeizamer doorgaat op een substituent in de 2positie van de fenylalaninering van verbinding 4. Ook
werd
vastgesteld
dat,
hoewel
BH3
niet
het
meest
regioselectief
hydroboronatiereagens is (zie Figuur 1.7), toch enkel maar het anti-Markovnikov alcohol bekomen werd. Een hydroboratie-oxidatie reactie met BH3 kon wegens de sterische hindering eigen aan verbinding 3 vermoedelijk enkel aanleiding geven tot het antiMarkovnikov alcohol. 4.4
TOSYLERING (REACTIESTAP D)
4.4.1
Opzuivering De kolom werd geëlueerd en het eluaat werd opgevangen in fracties van ongeveer 10
mL. Fracties 9 t.e.m. 14, 15 en 16, 22 t.e.m. 28 vertoonden kleuring onder de UV-lamp. Deze fracties werden daarom gespot op een TLC-plaat en ontwikkeld (zie Figuur 4.6). Introduceren van een sterk chromofore tosylgroep resulteerde in een intensere UV-spot. Fracties 22 t.e.m. 28 en fracties 15 en 16 vertoonden een andere Rf-waarde dan TsCl en verbinding 4 als referentie. Op basis van deze vaststellingen, werden fracties 22 t.e.m. 28 en fracties 15 en 16 gecollecteerd en uitgedampt. Na volledige verwijdering van het solvent van fracties 22 t.e.m. 28 werd een witte, kristallijne vaste stof bekomen. Er werd een testlabeling met
18 -
F
uitgevoerd op 2,0 mg van beide afgezonderde substanties bij 110°C voor 5 minuten. Enkel de stof bekomen uit fracties 22 t.e.m. 28 vertoonde een labelingsrendement, en kon bijgevolg als het correcte syntheseproduct beschouwd worden. Een NMR-spectrum bevestigde de correcte synthese van de precursormolecule van 2-[18F]FELP.
34
Figuur 4.6: TLC-plaat van de fracties die verkleuring vertoonden onder UV-licht. Fracties 9 t.e.m. 14 (Rf= 0,56) vertoonden een zeer intense rode kleur, net zoals het geval was voor de TsCl referentiespot (Rf = 0,53). De Rf-waarden zijn ook gelijkaardig. Als referentie werd verbinding 4 gebruikt (omcirkelde 4 op de figuur; Rf = 0,08). Fracties 15 t.e.m. 16 (Rf = 0,36) en fracties 22 t.e.m. 28 (Rf = 0,24) vertoonden afwijkende Rf-waarden dan die van de referentie. Deze werden afgezonderd en verder onderzocht.
4.4.2
Rendement
Tabel 4.4: Berekening van het rendement van de tosyleringsreactie: bekomen van verbinding 5 (reactiestap D).
Stof Synthese 1
Verbinding 4 Verbinding 5
MG (g/mol) 365,47 519,65
Aantal g
Aantal mmol
Rendement (%)
0,3781 0,4391
1,0346 0,8450
81,67
Het bekomen rendement was acceptabel (81,67 %) en sloot aan bij data die aantoonden dat de reactie goed doorgaat (100 %; K. Kersemans, 2011). 4.5
OPTIMALISATIE MANUELE RADIOSYNTHESE VAN [18F]FET EN 2-[18F]FELP
4.5.1
Optimalisatie bepaling van het radiolabelingsrendement Om een correcte optimalisatie te bekomen van de radiosynthese van 2-[18F]FELP en
[18F]FET, diende het rendement van de radiolabelingsstap op een betrouwbare manier bepaald te worden. Een SEP-PAK analyse wordt hier dikwijls voor gebruikt. Hierbij worden enkele druppels van het reactiemengsel na de labelingsreactie op een C18 SPE-kolommetje (Solid Phase Extraction) gebracht. Tijdens elutie van de kolom met een NaF-oplossing vertoont het gewenste syntheseproduct sterkere retentie op de stationaire fase dan eventueel ongereageerd
18 -
F . Door de activiteiten van eluens (18F-) en kolom (gewenst
product) te meten, kan uiteindelijk het rendement van de labelingsreactie bepaald worden.
35
Concreet werd in dit geval aanvankelijk gebruik gemaakt van een tC18 SEP-PAK kolom (Waters, voorgespoeld met 5 mL EtOH en 5 mL H2O). Na reeds enkele experimenten werd echter duidelijk dat er activiteit ongewenst achterbleef op de kolom. Ter controle werd de beladen tC18 kolom geëlueerd met 3 maal 5 mL van een verzadigde oplossing NaF. Alle 18Fzou op die manier zeker weggespoeld moeten zijn, terwijl het gewenste product (verbinding 6 of O-(2-[18F]fluoroethyl)-N-trityl-L-tyrosine tert-butylester) op de kolom bleef plakken. Het gewenste product werd vervolgens van de kolom gespoeld met een ruime hoeveelheid AcN (4 maal 5 mL). Bij het meten van de activiteit van deze volledig schoongespoelde kolom was er echter nog steeds een signaal merkbaar. Dit kon enkel maar te wijten zijn aan 18F- dat nog retentie vertoonde op de silicapartikels die de C18 –ketens dragen. Omdat een correct labelingsrendement niet meer gegarandeerd kon worden via de SEP-PAK-methode werd overgeschakeld naar spotten van het reactiemengsel op een TLCstrookje. Deze methode heeft als voordeel dat er geen activiteit verloren gaat. Met 40 % EtOAc in n-hexaan als mobiele fase, kon
18 -
F gescheiden worden van verbinding 6 of O-(2-
[18F]fluoroethyl)-N-trityl-L-tyrosine tert-butylester (zie Figuur 4.7).
18 -
Figuur 4.7: Schematische weergave van het scheidingsproces op TLC tussen F en het gelabelde aminozuurderivaat 18 18 (verbinding 6 of O-(2-[ F]fluoroethyl)-N-trityl-L-tyrosine tert-butylester). F vertoonde sterke retentie op een silica TLCplaatje, terwijl het meer apolaire gelabeld aminozuurderivaat verder migreerde. Met een Geiger-Müllerteller werd onderzocht waar de spots zich bevonden. Vervolgens werd het TLC-plaatje geknipt om de twee spots te scheiden van elkaar. Op basis van hun activiteit, kon het radiolabelingsrendement bepaald worden.
4.5.2
Optimalisatie radiosynthese [18F]FET
4.5.2.1 Concentratie precursor voor radiolabeling Na drogen van
18 -
F in 5 reactievials (38 MBq per vial bij de start van de
labelingsreactie), werden verschillende hoeveelheden (0,5; 1; 2; 3; 5 mg) TET (opgelost in 2,0 mL AcN) toegevoegd. De reactie ging 5 minuten bij 110°C door. Na afkoelen van de reactievial werd een kleine hoeveelheid reactiemengsel gespot op een silicagel TLC-plaatje. Het gewenste reactieproduct, O-(2-[18F]fluoroethyl)-N-trityl-L-tyrosine tert-butylester, migreerde verder dan 18F- bij 40 % EtOAc in n-hexaan.
36
Tabel 4.5: Rendement van de radiolabeling van TET in functie van de concentratie aan precursor. De reacties gingen door voor 5 minuten bij 110°C.
rendement radiolabeling (%)
Hoeveelheid Concentratie precursor in precursor 2,0 mL AcN (mM) (mg) 0,5 0,37 1,0 0,74 2,0 1,48 3,0 2,21 5,0 3,69
Activiteit 18 F (kBq) 35 33 10 9 3
Activiteit gewenst product (kBq) 10 31 40 44 52
Rendement radiolabeling (%) 22 48 79 84 95
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
concentratie TET (mM)
Figuur 4.8: Rendement van de radiolabeling in functie van de concentratie aan precursor (TET).
Wanneer 2,0 mg TET-precursor gebruikt werd, kon reeds een acceptabel labelingsrendement bekomen worden (79 %). Doorgaans wordt bij routinesyntheses echter een grotere hoeveelheid TET-precursor ingezet: 6 mg of meer (Bourdier et al., 2011), zodat het labelingsrendement dan bijna 100 % zal bedragen. 4.5.2.2 Reactietemperatuur radiolabeling Na drogen van
18 -
F in 5 reactievials (26 MBq per vial bij de start van de
labelingsreactie), werd 2,0 mg TET opgelost in 2,0 mL AcN toegevoegd, waarna de labelingsreactie doorging voor 5 minuten. De reactie werd in vijfvoud uitgevoerd, met oplopende temperaturen. Het datapunt voor labelingsreactie bij 110°C werd overgenomen uit het voorgaande experiment (zie Tabel 4.5).
37
Tabel 4.6: : Rendement van de radiolabeling van TET in functie van reactietemperatuur. De reacties met 2,0 mg precursor gingen door voor 5 minuten. Het datapunt van reactie bij 110°C is afkomstig van een voorgaand experiment (zie Tabel 4.5).
43 62 80 101 110 125
63 48 46 30 10 8
Rendement radiolabeling (%)
Reactietemperatuur (°C)
Activiteit 18 F (kBq)
Activiteit gewenst product (kBq) 2 4 9 14 40 34
Rendement radiolabeling (%) 3,4 7,1 16 32 79 81
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0
20
40
60
80
100
120
Reactietemperatuur (°C)
Figuur 4.9: Rendement van de radiolabeling in functie van de reactietemperatuur.
Op Figuur 4.9 was te zien dat het rendement van de radiolabeling een plateau bereikte vanaf een temperatuur van 110 °C. Een verdere stijging van de reactietemperatuur zal niet resulteren in een grote stijging van het rendement van de radiolabeling. Bovendien zou een temperatuur boven 120 °C kunnen resulteren in een gevaarlijke drukopbouw in de reactievial. 4.5.2.3 Reactietijd radiolabeling Na drogen van
18 -
F in 5 reactievials (21 MBq per vial bij de start van de
labelingsreactie), werd 2,0 mg TET opgelost in 2,0 mL AcN toegevoegd. De labelingsreactie ging door bij 110°C. De reactie werd in vijfvoud uitgevoerd, met oplopende reactietijden: 1, 2, 3, 10, 15 minuten. Het datapunt voor de 5 minuten durende labelingsreactie werd overgenomen uit het voorgaande experiment (zie Tabel 4.5).
38
rendement radiolabeling (%)
Tabel 4.7: Rendement van de radiolabeling van TET in functie van de reactietijd. De reacties met 2,0 mg precursor gingen door bij 110°C. Het datapunt van 5 minuten reactie is afkomstig van een voorgaand experiment (zie Tabel 4.5).
Reactietijd (minuten)
Activiteit 18 F (kBq)
1 2 3 5 10 15
26 20 9 10 4 1
Activiteit gewenst product (kBq) 16 20 17 40 30 35
Rendement radiolabeling (%) 38 50 67 79 89 97
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0
5
10
15
20
reactietijd (minuten)
Figuur 4.10: Rendement van de radiolabeling van TET in functie van de reactietijd.
Na 5 minuten reageren kon reeds een acceptabel radiolabelingsrendement (79 %) van TET bekomen worden. 4.5.2.4 Deprotectiecondities HPLC-analyse wees uit dat elk getest deprotectiemilieu (zie Tabel 3.3) aanleiding gaf tot 100 % deprotectie. De [18F]FET-piek die teruggevonden werd, had een retentietijd van 3,191 minuten. Om het toxische solvent AcN zoveel mogelijk te vermijden, werd verder gewerkt met het 100 % H2O-deprotectiemilieu, beschreven in Tabel 3.3 . 4.5.2.5 Deprotectietijd Nadat via een goede radiolabeling O-(2-[18F]fluoroethyl)-N-trityl-L-tyrosine tertbutylester bekomen was, werd 1,8 ml van het reactiemengsel over een Alumina N Plus SEPPAK kolom gestuurd. Van het eluens werd 200 µL in 5 vials overgebracht. Na uitdampen van het solvent, toevoegen van 200 µL 1 M HCl en de daarop volgende deprotectiereactie werd 39
het deprotectierendement onderzocht i.f.v. de deprotectietijd (2, 4, 6 ,8 of 10 minuten) via HPLC. Het gewenste product, [18F]FET, vertoonde een kortere retentie op een C18-kolom dan de half- of niet gedeprotecteerde nevenproducten. Er werd geen
18 -
F -piek opgemerkt;
deze zou voor de [18F]FET-piek moeten komen wegens een zeer korte retentie op een C18kolom. De Alumina N Plus SEP-PAK kolom was dus in staat om alle 18F- te verwijderen. Een voorbeeld van een bekomen radiochromatogram is Figuur 4.11. Het deprotectierendement werd bepaald aan de hand van de verhouding piekoppervlakte van [18F]FET over de totale piekoppervlakte, rekening houdend met het radioactief verval van de producten.
Figuur 4.11: Een voorbeeld van een radiochromatogram bekomen door injectie van 50 µL reactiemengsel na 6 minuten deprotectie op HPLC. Detectie gebeurde met een Geiger-Müllerteller. Na 4 minuten werd van MF 2 overgeschakeld naar 18 100 % AcN. De eerste piek (Tr = 3,140 min) was [ F]FET. De retentietijd was identiek aan deze van een FETreferentiestandaard. De volgende piek (Tr = 7,383 min) was afkomstig van een iets hydrofobere molecule, maar nog niet zo hydrofoob als de laatste piek (Tr = 15,014 min). De laatste piek was de nog volledig beschermde gelabelde molecule. De middelste piek was afkomstig van een half ontschermde gelabelde molecule.
Deprotectietijd (minuten) Deprotectierendement (%)
2 29
4 75
6 65
8 96
10 100
deprotectie rendement (%)
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0
2
4 6 8 Deprotectietijd (minuten) 18
10
12
Figuur 4.12: Tabel en grafiek die het deprotectierendement van O-(2-[ F]fluoroethyl)-N-trityl-L-tyrosine tert-butylester weergeven in functie van de deprotectietijd.
40
Na 10 minuten deprotectie met 1 M HCl bij 110°C werd enkel de [18F]FET-piek teruggevonden. Het deprotectierendement bedroeg onder deze reactiecondities 100 %. O(2-[18F]fluoroethyl)-N-trityl-L-tyrosine benzylester kon met 1 M HCl bij 100°C na 10 minuten volledig gedeprotecteerd worden (H-E Wang et al., 2005). Hetzelfde werd hier dus bewezen met het tert-butylesteranaloog bij 110°C. 4.5.3
Optimalisatie radiosynthese 2-[18F]FELP
4.5.3.1 Concentratie precursor voor radiolabeling Na drogen van
18 -
F in 6 reactievials (15 MBq per vial bij de start van de
labelingsreactie), werden verschillende hoeveelheden (0,5; 1; 2; 3; 5 en 10 mg) verbinding 5 (opgelost in 2,0 mL AcN) toegevoegd. De reactie ging 5 minuten bij 110°C door. Tabel 4.8: Rendement van de radiolabeling van verbinding 5 in functie van de concentratie aan precursor. De reacties gingen door voor 5 minuten bij 110°C.
rendement radiolabeling (%)
Hoeveelheid Concentratie precursor in precursor 2,0 mL AcN (mM) (mg) 0,5 0,48 1,0 0,96 2,0 1,92 3,0 2,89 5,0 4,81 10,0 9,62
Activiteit gewenst product (kBq) 4 6 28 13 13 13
Activiteit 18 F (kBq) 24 24 24 7 6 4
Rendement radiolabeling (%) 13 20 54 63 68 77
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
Concentratie verbinding 5 (mM)
Figuur 4.13: Rendement van de radiolabeling van verbinding 5 in functie van de concentratie aan precursor.
Indien dezelfde ideale hoeveelheid precursor genomen werd als bij de optimalisatie van de substraatconcentratie TET (2,0 mg in 2,0 mL AcN; 1,48 mM; zie 4.5.2.1), werd bij 41
diezelfde hoeveelheid verbinding 5 (2,0 mg in 2,0 mL AcN; 1,92 mM) slechts een labelingsrendement van 54 % bekomen. Om een even goed labelingsrendement te bekomen zoals met de optimale hoeveelheid TET het geval was (79 %), zou de hoeveelheid verbinding 5 in 2,0 mL AcN meer dan 10,0 mg moeten zijn. Hoewel de labelingsreactie van TET en verbinding 5 met 18F- in essentie vergelijkbaar was (SN2-reactie met een tosylfunctie als leaving group op een fenylalanine-analoog), ging de 18 -
F -labeling van verbinding 5 minder vlot door. Een mogelijke verklaring hiervoor was dat de
nucleofiele aanval van
18 -
F sterisch gehinderd werd omdat de tosyloxyethylgroep zich in
positie 2 van de aromatische ring van verbinding 5 bevond. Dit in tegenstelling tot TET, waarbij de tosyloxyethylgroep zich in de eenvoudiger te bereiken positie bevond. Er was geen data beschikbaar in de literatuur die de moeizamere
18 -
F -labeling van
verbinding 5 beschreef. Er werd wel aangetoond dat een analoog van verbinding 5, waarbij de tosyloxyethylgroep in positie 4 staat, efficiënt kon gelabeld worden met
18 -
F . Deze
succesvolle labeling van 5,0 mg precursor kon reeds gebeuren bij 80°C voor 5 minuten, terwijl de hier uitgevoerde labeling van 5,0 mg verbinding 5 bij een hogere temperatuur van 110°C voor 5 minuten maar een matig rendement (68 %) kende. Ook dit toonde aan dat de labeling van verbinding 5 moeizamer verloopt. 4.5.3.2 Reactietemperatuur radiolabeling De invloed van de reactietemperatuur op het labelingsrendement van verbinding 5 werd niet nagegaan, omdat de reactie gelijkaardig was aan de labeling van TET: dit is eveneens een SN2-reactie met een tosylfunctie als leaving group op een fenylalanineanaloog. Bij het verder opdrijven van de reactietemperatuur boven 120°C dient ook de vraag gesteld te worden als de lichte stijging in labelingsrendement opweegt tegen de thermolyse van de Boc-beschermgroep die dan kan optreden, of een mogelijks gevaarlijke drukopbouw in de reactievial. 4.5.3.3 Reactietijd radiolabeling Na drogen van
18 -
F in 5 reactievials (29 MBq per vial bij de start van de
labelingsreactie), werd 3,0 mg verbinding 5 opgelost in 2,0 mL AcN toegevoegd. De labelingsreactie ging door bij 110°C. De reactie werd in vijfvoud uitgevoerd, met oplopende
42
reactietijden: 10, 15, 20, 25 en 30 minuten. Het datapunt voor de 5 minuten durende labelingsreactie werd overgenomen uit het voorgaande experiment (zie Tabel 4.8). Tabel 4.9: Rendement van de radiolabeling van verbinding 5 in functie van de reactietijd. De reacties met 3,0 mg precursor gingen door bij 110°C. Het datapunt van 5 minuten reactie is afkomstig van een voorgaand experiment (zie Tabel 4.8).
Reactietijd (minuten)
Activiteit 18 F (kBq)
5 10 15 20 25 30
7 3 4 2 3 2
Activiteit gewenst product (kBq) 13 45 71 73 64 58
Rendement radiolabeling (%) 63 94 95 98 96 96
rendement radiolabeling (%)
120 100 80 60 40 20 0 0
10
20 reactietijd (minuten)
30
40
Na 10 minuten 18F-labeling van 3,0 mg precursor in 2,0 mL AcN bij 110°C werd geen extra stijging in labelingsrendement waargenomen. Verder toonde dit constante labelingsrendement aan dat er geen boc-thermolyse optrad na lange tijd reageren bij 110°C. 5 minuten reactie bleek te kort te zijn om een acceptabel labelingsrendement te bekomen. 4.5.3.4 Deprotectietijd Reeds na 6 minuten deprotectie met 1 M HCl werd geen andere significante piek gevonden in het radiochromatogram als die van 2-[18F]FELP (Tr = 3,226 minuten). Vergeleken met de deprotectie van O-(2-[18F]fluoroethyl)-N-trityl-L-tyrosine tert-butylester splitste verbinding 6 onder identieke deprotectie-omstandigheden sneller de beschermgroepen af.
43
4.5.3.5 Schatting specifieke activiteit 2-[18F]FELP Wegens tijdsgebrek kon geen experiment uitgevoerd worden waarbij de specifieke activiteit van 2-[18F]FELP bepaald werd bij de voorheen bekomen optimale parameters. Wang (2011) kon een hoge specifieke activiteit bekomen bij de synthese van 4-[18F]FELP (68 GBq/µmol). Verwacht wordt dat, gezien de synthese van 2-[18F]FELP zeer gelijkaardig is aan 4-[18F]FELP, vergelijkbare specifieke activiteiten haalbaar zijn. 4.6
GEAUTOMATISEERDE RADIOSYNTHESE VAN [18F]FET
4.6.1
Eerste synthese Na afloop van de geautomatiseerde radiosynthese van [18F]FET werd de activiteit
bepaald van de overloopvial en de reactievial (zie Figuur 3.8). Het reactiemengsel dat voorheen overgebracht werd in de overloopvial vertoonde een activiteit die lager was dan deze van de lege reactievial (resp. 94 MBq en 109 MBq). Mogelijks was dit te wijten aan het onvoldoende in oplossing gaan van de reactieproducten (O-(2-[18F]fluoroethyl)-N-trityl-Ltyrosine tert-butylester of [18F]FET) in 1,0 mL 1 M HCl in water oplossing (gebruikt voor deprotectie). Om na te gaan welke stof precies aan de lege reactievial bleef hangen, werd er 1,0 mL AcN aan toegevoegd, waarna 10 µL van deze vloeistof via het HPLC-systeem geanalyseerd werd. Mobiele fase 4 (MF 4) werd gebruikt voor 9 minuten, vervolgens werd overgeschakeld naar mobiele fase 3. Er werd slechts één piek bekomen. Op basis van de retentietijd kon besloten worden dat het om O-(2-[18F]fluoroethyl)-N-trityl-L-tyrosine tertbutylester ging. Om neerslag van deze verbinding te vermijden en een volledige deprotectie te bekomen, diende het deprotectiemengsel op de module aangepast te worden. Via HPLC-analyse werd het labelings-en deprotectierendement bepaald van deze eerste synthese van [18F]FET op de module. Rekening houdend met de hoeveelheid stof in zowel de overloopvial en de met AcN gevulde reactievial werd een labelingsrendement van 68 % bekomen. Dit rendement was, rekening houdend met wat verlies op de module, in lijn met het bekomen resultaat uit 4.5.2.1. Een manuele labeling van 2,0 mg TET bij 110°C voor 5 minuten gaf toen aanleiding tot een labelingsrendement van 79 %.
Het
deprotectierendement was echter niet goed: slechts 9,5 % van het gelabeld product was effectief ontschermd. Dit was te wijten aan het onvolledig in oplossing gaan van O-(2-
44
[18F]fluoroethyl)-N-trityl-L-tyrosine tert-butylester. Er werden pieken teruggevonden van zowel de laatst genoemde verbinding, alsook van de half ontschermde variant. 4.6.2
Tweede synthese Een analoog experiment werd uitgevoerd zoals beschreven in 3.3.6. Het
deprotectiereagens werd echter gewijzigd naar 1,0 mL 1 M HCl in 50/50 (v/v) AcN/H2O. Er werd voorheen aangetoond dat de deprotectie onder die omstandigheden even goed door ging (zie 4.5.2.4). Na afloop van de geautomatiseerde radiosynthese van [18F]FET werd de activiteit opnieuw bepaald van het opvangvat en het reactievat. Het reactievat vertoonde een verwaarloosbaar kleine activiteit. Dit wees erop dat de verandering van 100 % waterige fase naar een 50/50 AcN/H2O mengsel de voorheen geobserveerde neerslagvorming verhinderde. Via HPLC-analyse werd het labelings-en deprotectierendement bepaald. Een labelingsrendement van 51 % werd bekomen. Mogelijks lag een onvoldoende spoeling van de tubing van de module aan de basis voor dit lage rendement. Het deprotectierendement bedroeg 79 %. Er werd enkel een piek teruggevonden van half ontschermd O-(2[18F]fluoroethyl)-N-trityl-L-tyrosine tert-butylester. De omschakeling naar een gewijzigd deprotectiereagens had dus ook een positief effect op de ontscherming. Om het deprotectierendement nog op te drijven, kan een nog hogere zuurconcentratie aangewend worden. 4.6.3
Radiochemisch rendement van [18F]FET en 2-[18F]FELP Wegens tijdsgebrek kon geen volledige, optimale radiosynthese van [18F]FET en 2-
[18F]FELP uitgevoerd worden met de module. Het radiochemisch rendement kon dus voorlopig enkel geschat worden op basis van de bekomen rendementen onder optimale condities van de radiosyntheses. Rekening houdend met een synthesetijd van 60 minuten op de module, inclusief semi-preparatieve HPLC, werd het radiochemisch rendement van [18F]FET geschat op 54 %. Dit kwam overeen met data uit de literatuur (50 %; H-E Wang, 2005) Voor 2-[18F]FELP was dit >53 % (10 mg precursor, 10 minuten, 110°C). Dit was ongeveer vergelijkbaar met het radiochemisch rendement van een analoge verbinding, 2[18F]FMLP (4 mg, 5 minuten, 120°C; 40 %; Kersemans, 2008).
45
5
CONCLUSIE De beoogde precursormolecule voor de radiosynthese van 2-[18F]FELP, (S)-2-tert-
butoxycarbonylamino-3-(2-(2-tosyloxyethyl)fenyl)-propaanzuur
tert-butylester,
werd
succesvol bereid. De rendementen van de individuele synthesestappen waren acceptabel tot goed en sloten aan bij data uit de literatuur. Tabel 5.1: Bekomen rendementen van de uitgevoerde koude synthesestappen. Het totaal rendement bedroeg 34,57 %.
Beschermingsreactie Stille-koppeling
95,36 % Hydroboratie-oxidatie 72,42 % Tosylering
61,30 % 81,67 %
De belangrijkste parameters horend bij de manuele radiosynthese van 2-[18F]FELP en [18F]FET werden succesvol geoptimaliseerd. De labeling van TET-precursor met 18F- had reeds een goed rendement (79 %) wanneer een concentratie van 2,0 mg TET in 2,0 mL AcN (1,48 mM) aan een labelingsreactie werd onderworpen bij 110°C voor 5 minuten. De daarop volgende deprotectie was maximaal bij verwarmen tot 110 °C met 1 M HCl voor 10 minuten. Er werd tevens aangetoond dat de deprotectie tot bekomen van [18F]FET met 1 M HCl even goed doorging in een AcN-rijk, H2O-rijk en 50/50 (v/v) AcN/H2O milieu. Voor de manuele radiosynthese van 2-[18F]FELP werden volgende resultaten bekomen. De labeling van verbinding 5 met 18F- had pas een goed rendement (77%) wanneer een concentratie van meer dan 10,0 mg verbinding 5 in 2,0 mL AcN (9,62 mM) aan een labelingsreactie werd onderworpen bij 110°C voor 5 minuten. De reactietijd van deze synthesestap kan echter opgedreven worden naar 10 minuten om een hoger labelingsrendement te bekomen. Deze resultaten deden vermoeden dat verbinding 5 meer sterisch gehinderd was dan TET bij de radiolabeling. Maximale deprotectie van verbinding 6 met 1 M HCl tot vorming van 2-[18F]FELP trad reeds op na 6 minuten bij 110°C. De eerste stappen om de radiosynthese van [18F]FET te automatiseren m.b.v. een customized Scintomics Hotbox3 systeem werden gezet. De optimale condities voor het bekomen van [18F]FET golden hier ook. Er werd echter wel gedeprotecteerd met 1,0 mL 1 M HCl in 50/50 (v/v) AcN/H2O omwille van de oplosbaarheid van het beschermde tussenproduct. In de toekomst kan dit systeem ook gebruikt worden voor de routinesynthese van 2-[18F]FELP, mits additionele in vitro en vivo testen het gebruik van dit radiofarmacon bij tumorbeeldvorming verder ondersteunen.
46
6 LITERATUURLIJST Abouzied Mohei M., Crawford Elpida S., Nabi Hani Abdel; FDG imaging: pitfalls and artifacts; J. Nucl. Med. Technol. 2005; 33:145–155 Bodoy S, Martin L, Zorzano A, Palacin M, Estévez R, Bertran J; Identification of LAT4, a novel amino acid transporter with system L activity; Journal of Biological Chemistry; 2005; 280: 12002-12011 Bourdier T, Greguric I, Roselt P, Jackson T, Faragalla J, Katsifis A; Fully automated one-pot radiosynthesis of O-(2-[18F]fluoroethyl)-L-tyrosine on the TracerLab FXFN module; Nuclear Medicine and Biology; 2011; 38: 645-651 Casado AL, Espinet P; Mechanism of the Stille Reaction. 1. The transmetalation Step. Coupling of R1I and R2SnBu3 Catalyzed by trans-[PdR1IL2] (R1 = C6Cl2F3; R2 = Vinyl, 4Methoxyphenyl; L = AsPh3); J. Am. Chem. Soc.; 1998; 120:8978-8985 Chen W; Clinical applications of PET in brain tumors; J Nucl Med; 2007; 48:1468-1481 Christensen HN; Role of amino acid transport and countertransport in nutrition and metabolism; Physiological Reviews; 1990; 70:43-77 Denmark SE, Butler CR; Palladium- (and Nickel-) catalyzed vinylation of aryl halides; Chem. Commun.; 2009; p.20-33 Fuchs BC, Bode BP; Amino acid transporters ASCT2 and LAT1 in cancer: Partners in crime?; Seminars in Cancer Biology; 2005; 15:254-266 Ganapathy V, Thangaraju M, Prasad PD; Nutrient transporters in cancer: relevance to Warburg hypothesis and beyond; Pharmacology & Therapeutics; 2009; 121: 29-40 Grosu AL, Piert M, Weber WA, Jeremic B, Picchio M, Schratzenstaller U, Zimmermann FB, Schwaiger M, Molls M; Positron emission tomography for radiation treatment planning (review); Strahlentherapie und Onkologie; 2005;181:483–499 Grosu AL, Weber WA, Franz M, et al.; Reirradiation of recurrent high-grade gliomas using amino acid PET (SPECT)/CT/MRI image fusion to determine gross tumor volume for
47
stereotactic fractionated radiotherapy. Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys., 2005; 63: 511519 http://www.uicc.org/resources/tnm
(site
Union
for
International
Cancer
Control,
10/03/2013) http://web.chem.ucsb.edu/~neuman/orgchembyneuman.book/10%20AdditionReactions/10 FullChapt.pdf (auteur: prof. Robert C. Neuman Jr.; University of California; geraadpleegd 16/03/2013) IAEA (International Atomic Energy Agency); Cyclotron produced radionuclides: physical characteristics and production methods; 2009 (Vienna); Technical reports series n°.468 Ishiwata K, Enomoto K, Sasaki T, Elsinga PH, Senda M, Okazumi S, et al.; A feasibility study on L-[1-carbon-11]tyrosine and L-[methyl-carbon-11]methionine to assess liver protein synthesis by PET; Journal of Nuclear Medicine; 1996; 37:279-85 Isidro-Llobet A, Alvarez M, Albericio F; Amino acid-protecting groups; Chem. Rev.; 2009; 109:2455-2504 Imai H, Kaira K, Oriuchi N, Shimizu K et al.; Inhibition of L-type amino acid transporter 1 has antitumor activity in non-small cell lung cancer; Anticancer Research; 2010; 30: 4819-4828 Jager PL, Vaalburg W, Pruim J, de Vries EGE, Langen KJ, Piers DA; Radiolabeled amino acids: basic aspects and clinical applications in oncology; J Nucl Med; 2001; 42: 432-445 Kaim AH, Weber B, Kurrer MO, Westera G, Schweitzer A, Gottschalk J, von Schulthess GK, Buck A; 18F-FDG and 18F-FET uptake in experimental soft tissue infection; 2002; 29: 648-654 Kersemans K, Bauwens M, Lahoutte T, Bossuyt A, Mertens J; In vivo PET evaluation in tumour-bearing rats of 2-[18F]fluoromethyl-L-phenylalanine as a new potential tracer for molecular imaging of brain and extra-cranial tumours in humans with PET; Nuclear Instruments and Methods in Physics Reasearch A; 2007; 571: 151-154 Kersemans K, Bauwens M, Mertens J; Method for stabilizing non carrier added 2[18F]fluoromethyl-L-phenylalanine, a new tumour tracer, during radiosynthesis and radiopharmaceutical formulation; Nuclear Medicine and Biology; 2008; 35: 425-432
48
Kersemans K; Development of new radiofluorinated methylphenylalanine analogues for tumour imaging with PET; Proefschrift voorgelegd voor het behalen van de graad van Doctor in de wetenschappen; Vrije Universiteit Brussel; 2011 Kitson SL, Cuccurullo V, Ciarmiello A, Salvo D, Mansi L; Clinical applications of Positron Emission Tomography (PET Imaging in medicine: oncology, brain diseases and cardiology; Current Radiopharmaceuticals; 2009; 2: 224-253 Langen KJ, Floeth FW, Stoffels G, Hamacher K, Coenen HH, Pauleit D; Improved diagnostics of cerebral gliomas using FET PET. Z Med Phys 2007; 17: 237-41 Mahieu B; Synthesis of 2-hydroxyethyl-phenylalanine analogues through functionalized styrenes via the Stille reaction; thesis KHBO; 2007 Mertens J, Kersemans V, Bauwens M, Joos C, Lahoutte T, Bossuyt A, Slegers G; Synthesis, radiosynthesis and in vitro characterization of [125I]-2-iodo-L-phenylalanine in a R1M rhabdomyosarcoma cell model as a new potential tumor tracer for SPECT; Nuclear Medicine and Biology; 2004; 31:739-746 McConathy J, Goodman MM; Non-natural amino acids for tumor imaging using positron emission tomography and single photon emission computed tomography; Cancer Metastasis Rev; 2008; 27:555-573 Miller PW, Long NJ, Vilar R, Gee AD; Synthesis of 11C, 18F, 15O, and 13N radiolabels for positron emission tomography; Angewandte Chemie; 2008; 47:8998-9033 Olivero WC, Dulebohn SC, Lister JR; The use of PET in evaluating patients with primary brain tumours: is it useful?; 1995; 57:250-252 Pauleit D, Stoffels G, Schaden W, Hamacher K et al.; PET with O-(2-18F-fluoroethyl)-LTyrosine in peripheral tumors: first clinical results; J Nucl Med; 2005; 46: 411-416 Pauleit D, Stoffels G, Bachofner A, Foeth FW et al.; Comparison of 18F-FET and 18F-FDG PET in brain tumors; Nuclear Medicine and Biology; 2009; 36:779-787 Poole CF; Planar chromatography at the turn of the century; Journal of Chromatography A; 1999; 856: 399-427
49
Rahmim A, Zaidi H; PET versus SPECT: strengths, limitations and challenges; Nuclear Medicine Communications; 2008; 29:193-207 Schöder H, Erdi YE, Larson SM, Yeung HWD; PET/CT a new imaging technology in nuclear medicine; European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging 2003; 30: 14191437 Thierry J, Yue C, Potier P; Tetrahedron Lett. ; 1998; 39: 1557 Townsend DW; Physical principles and technology of clinical PET imaging.; Ann Acad Med Singapore 2004; 33: 133-145 Uchino H, Kanai Y, Kim DK, Wempe MF, Chairoungdua A, Morimoto E, Anders MW, Endou H; Transport of amino acid-related compounds mediated by L-type amino acid transporter 1 (LAT1): insights into the mechanisms of substrate recognition; Molecular Pharmacology; 2002; 61: 729-737 Van Hoeve C, Opzuivering en kwaliteitscontrole van [18F]FET en [18F]FAZA met behulp van RPHPLC; thesis radiofarmacie UGent; 2012 Wang H-E, Wu S-Y, Chang C-W, Liu R-S et al.: Evaluation of F-18-labeled amino acid derivatives and [18F]FDG as PET probes in a brain tumor-bearing animal model; Nuclear Medicine and Biology; 2005; 32:367-375 Wang L, Qu W, Liberman BP, Plössl K, Kung HF; Synthesis, uptake mechanism characterization and biological evaluation of 18F labeled fluoroalkyl phenylalanine analogs as potential PET imaging agents; Nuclear Medicine and Biology; 2011; 38: 53-62
50
ADDENDUM: samenvattingen van Internationalisation at Home (I@H) lezingen Biedt het Kiwi-model een oplossing voor de financiële problemen van de sociale zekerheid? (Dr. D. Van Duppen) Dokter Dirk Van Duppen staat al jaren kritisch tegenover de hoge prijs van bepaalde medicijnen die op de markt zijn. In zijn lezing brak hij een lans voor het zogenaamde Kiwimodel. Dit is een systeem waarbij de behoefte aan een type medicijn geanalyseerd wordt: op basis van objectieve wetenschappelijke criteria wordt vervolgens het “beste” geneesmiddel bepaald. Dat wordt dan in een grote hoeveelheid aangekocht door middel van een openbare aanbesteding met geld van de gemeenschap. Verschillende farmaceutische bedrijven die het bewuste geneesmiddel verkopen, kunnen elkaar beconcurreren om de aanbesteding te krijgen. Zo kan de prijs van een geneesmiddel sterk verlagen, wat de patiënt ook zal voelen in zijn portemonnee. Dokter Van Duppen weerlegde de kritieken van de farma-industrie op het Kiwi-model. Hij toonde aan dat de gemaakte winst van de farmabedrijven niet altijd voor tewerkstelling en onderzoek&ontwikkeling aangewend wordt. De winst verdwijnt volgens hem naar aandeelhouders. Vervolgens kwamen de bewezen voordelen van het Kiwi-model aan bod. Na aanhoudend protest tegen de hoge geneesmiddelprijzen, gaven sommige farmabedrijven toe, en verlaagden hun prijs. Het resultaat was de Kiwi-knik in 2005-2006: voor het eerst daalde de terugbetaling van geneesmiddelen door het Riziv. Ter illustratie, een daarop volgend succes: het HPV-vaccin daalde spectaculair in prijs van ongeveer € 375 naar € 50 voor drie inentingen! Door de lage kostprijs kon de overheid gratis aan meisjes uit het secundair onderwijs deze vaccinatie aanbieden. Dit voorbeeld, samen met de vele andere voorbeelden die aangehaald werden, heeft mij doen inzien dat het Kiwi-model wel degelijk een positieve invloed kan hebben op de gezondheidszorg in België. Registratie van nieuwe vaccins: geen eenvoudige klus in Europa (Dr. P. Neels) Pieter Neels is een lid van CHMP (Committee for Human Medicinal Products), dat instaat voor het leveren van advies aan de Europese Commissie over geneesmiddelen. Een van de taken van CHMP bestaat erin om vaccins te evalueren. Vaccins zijn biologische medicinale producten die antigenen bevatten om een specifieke en actieve immuniteit op te bouwen tegen een infecterend agens. Sinds het begin van de 20ste eeuw zit de vaccinontwikkeling in een stroomversnelling. Voor steeds meer en meer infecties worden er vaccins ontwikkeld, hoewel dit steeds moeilijker wordt. Er werd reeds veelvuldig aangetoond dat vaccinatie een sterk positieve invloed heeft op de volksgezondheid. In de lezing werden een aantal voorbeelden gegeven. Een ziekte zoals pokken kon in het verleden reeds volledig uitgeroeid worden. Ook mazelen, polio, difterie en andere konden zo reeds zwaar onderdrukt worden. Toch bestaat er een zogenaamde anti-vaccinlobby die het vaccineren van mensen, en in het bijzonder baby’s, afraadt. Meestal gebeurt dit op ongegronde basis. Een ideaal vaccin heeft een aantal eigenschappen die overlopen werden in de lezing. Eén van de kerneigenschappen is de onberispelijke kwaliteit en veiligheid die een vaccin moet Addendum
hebben. Het vaccin wordt immers meestal toegediend aan volledige gezonde mensen. Het is belangrijk om het voordelig effect te behouden, en eventuele neveneffecten zo laag mogelijk te houden. Mede daardoor is registratie van vaccins een moeilijke taak. Innovating for a better and sustainable healthcare (Dr. R. Pauwels) Dr. Rudi Pauwels kreeg op 22 maart 2013 een eredoctoraat van de UGent wegens zijn onderzoek naar anti-HIV-geneesmiddelen en algemene contributie tot het geneesmiddelonderzoek. In zijn lezing besprak hij het nieuwe tijdperk van gepersonaliseerde geneeskunde dat aanbreekt. Het zou een manier kunnen zijn om het behoud van onze gezondheidszorg te waarborgen. Momenteel kan de algemene aanpak van een ziekte met geneesmiddelen beschreven worden als “one size fits all”: één geneesmiddel dat voor elk individu van de gemeenschap zou moeten werken. In de praktijk is dit echter vaak niet zo. Er is nood aan het achterhalen van de karakteristieken van patiënten op moleculair niveau. De rol van biomarkermetingen wordt steeds belangrijker voor het stellen van een diagnose, en uiteindelijk ook de behandeling met geneesmiddelen. Het bepalen van die biomarkers in laboratoria is nog onderhevig aan bepaalde limieten. Een voorbeeld daarvan zijn de logistieke problemen die kunnen optreden met het versturen van een patiëntenstaal. Dr. Pauwels probeert met zijn bedrijf Biocartis hierop in te spelen. Er wordt namelijk gewerkt aan een mobiel analyseplatform, waarmee onder andere een PCR-analyse kan gebeuren. Verder besprak dr. Pauwels enkele waarden die belangrijk zijn voor een wetenschapper om aan innovatie te doen. Vooral dit stuk sprak mij wel aan, omdat in de masterproef ook redelijk wat op het eerste zicht onoplosbaar lijkt, maar met doorzettingsvermogen en positivisme kunnen de meeste problemen wel opgelost geraken. Current alternative methods to animal testing used in pharmaceutical and cosmetic industry (Dr. Philippe Vanparys) Reeds enkele decenia is er een evolutie op gang om in vivo proeven indien mogelijk te vervangen naar in vitro testen. In 2009 kwam er bijvoorbeeld een marketing ban voor cosmetica die op dieren werden getest. Janssen Pharmaceutica speelde een voortrekkersrol bij deze overgang naar meer in vitro proeven. De grote moeilijkheid hierbij is om de resultaten die bekomen worden via in vitro testen te extrapoleren naar het menselijk lichaam. Menselijke in vitro cellijnen bezitten niet dezelfde sterke organisatie zoals in vivo het geval is. De validatie van een nieuwe in vitro test vergt intensieve studies om aan te tonen dat deze test even goed toxiciteit kan aantonen van geneesmiddelen als in vivo modellen. Dr. Vanparys gaf vervolgens een uiteenzetting over de verschillende in vitro equivalenten van in vivo diermodellen om toxiciteit van geneesmiddelen op te sporen. Tot besluit gaf Dr. Vanparys een overzicht van de status inzake het ontwikkelen van in vitro alternatieve modellen. Een complete ban van proefdieren in de chemische industrie is nog niet aan de orde. Wel moet gestreefd worden naar Vervanging, Vermindering en Verfijning (3 V’s) van dierproeven.
Addendum
