OLEH: Feby Wulandari NIM:

i

UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK METANOL DAUN MAHKOTA DEWA (Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl.) TERHADAP LARVA Artemia salina Leach DENGAN METODE BRINE SHRIMP LETHALITY TEST (BSLT)

Laporan Penelitian ini ditulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA KEDOKTERAN

OLEH: Feby Wulandari NIM: 1111103000010

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA 1435 H/ 2014 M

LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Dengan ini saya menyatakan bahwa: 1. Laporan penelitian ini merupakan hasil karya asli saya yang diajukan untuk memenuhi salah satu persyaratan memperoleh gelar strata 1 di UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. 2. Semua sumber yang saya gunakan dalam penulisan ini telah saya cantumkan sesuai dengan ketentuan yang berlaku di UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. 3. Jika dikemudian hari terbukti bahwa karya ini bukan karya asli saya atau merupakan hasil jiplakan dari karya orang lain, maka saya bersedia menerima sa

Ciputat, 10 September 2014

Feby Wulandari

ii

UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK METANOL DAUN MAHKOTA DEWA (Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl.) TERHADAP LARVA Artemia salina Leach DENGAN METODE BRINE SHRIMP LETHALITY TEST (BSLT)

Laporan Penelitian Diajukan kepada Program Studi Pendidikan Dokter, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan untuk Memenuhi Persyaratan Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran (S.Ked)

Oleh Feby Wulandari NIM: 1111103000010

Pembimbing 1

Pembimbing 2

dr. Nurul Hiedayati, Ph.D

Zilhadia, M.Si, Apt

NIDN: 2028027101

NIDN: 2022087303

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA 1435 H/ 2014 M iii

PENGESAHAN PANITIA UJIAN

Laporan Penelitian ini berjudul UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK METANOL DAUN MAHKOTA DEWA (Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl.) TERHADAP LARVA Artemia salina Leach DENGAN METODE BRINE SHRIMP LETHALITY TEST (BSLT) yang diajukan oleh Feby Wulandari (NIM: 1111103000010), telah diujikan dalam sidang di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan pada 10 September 2014. Laporan penelitian ini telah diterima sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Kedokeran (S.Ked) pada Program Studi Pendidikan Dokter. Jakarta, 10 September 2014

DEWAN PENGUJI

Ketua Sidang

Pembimbing 1

Pembimbing 2

dr. Nurul Hiedayati, Ph.D

dr. Nurul Hiedayati, Ph.D

Zilhadia, M.Si, Apt

NIDN: 2028027101

NIDN: 2028027101

NIDN: 2022087303

Penguji 1

Penguji 2

dr. Flori Ratna Sari, Ph.D

drg. Laifa Annisa Hendarmin, Ph.D

NIP: 197707272006042001

NIDN: 2002047801 PIMPINAN FAKULTAS

Dekan FKIK UIN

Kaprodi PSPD FKIK UIN

Prof. Dr (hc). dr. MK. Tadjudin, Sp.And

dr. Witri Ardini, M.Gizi, Sp.GK NIP: 197110232011012 iv

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah memberikan nikmat iman, nikmat sehat dan nikmat Islam sehingga penulis dapat menyelesaikan laporan penelitian ini. Shalawat dan salam semoga selalu tercurahkan kepada Nabi Muhammad SAW. Penelitian ini dapat berjalan lancar dan terselesaikan pada waktunya karena adanya bimbingan, bantuan dan dukungan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada: 1.

Prof. Dr (hc). dr. MK Tadjudin, Sp.And selaku Dekan FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

2.

dr. Witri Ardini, M.Gizi, Sp.GK selaku Ketua Program Studi Pendidikan Dokter FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.

dr. Nurul Hiedayati, Ph.D selaku pembimbing 1 yang telah banyak meluangkan waktu, pikiran dan tenaga untuk membimbing penulis dalam melakukan penelitian dan menyusun laporan penelitian serta memberikan masukan judul penelitian dan memberikan izin penggunaan Laboratorium Farmakologi untuk kepentingan penelitian.

4.

Ibu Zilhadia, M.Si, Apt selaku pembimbing 2 yang telah banyak meluangkan waktu, pikiran dan tenaga untuk membimbing penulis dalam melakukan penelitian dan menyusun laporan penelitian.

5.

dr. Flori Ratna Sari, Ph.D selaku penanggung jawab modul riset yang selalu membimbing penulis selama modul riset berlangsung dan mengingatkan penulis untuk segera menyelesaikan penelitian.

6.

Ibu Puteri Amelia, M.Farm, Apt dan Bapak Supandi, M.Si, Apt selaku penanggung jawab Laboratorium Farmakognosi dan Fitofarmaka yang telah banyak meluangkan waktu, pikiran dan tenaga untuk

membimbing penulis

dalam melakukan penelitian serta memberikan izin penggunaan laboratorium untuk kepentingan penelitian. v

7.

Bapak Adrial dan Ibu Mariana selaku kedua orangtua penulis yang selalu mendoakan dan memberikan dukungan dalam bentuk materil atau non materil kepada penulis. Terima kasih atas segala kebaikan dan pelajaran hidup yang luar biasa hingga kini penulis beranjak dewasa.

8.

Linda Hayani, S.ST, Hengki Ramiko, SE dan Muhammad Daffa Abu Hanif selaku saudara kandung penulis yang selalu mendoakan dan memberikan dukungan kepada penulis.

9.

Mas Pandji, Mas Rachmadi, Mbak Ai, Mbak Rani dan Mbak Suryani selaku laboran yang telah membantu penulis dalam pengambilan data.

10. Akbar Sepada, Ayu Reskianingsih, Nur Zaki Hanifah dan Nurul Khafidz Subekti selaku teman satu kelompok penelitian penulis yang selalu bekerja sama dan saling memberikan dukungan selama melakukan penelitian. 11. Teman-teman di PSPD dan teman-teman lainnya yang penulis kenal namun tidak bisa penulis sebutkan satu persatu.

Ciputat, 10 September 2014

Penulis

vi

ABSTRAK Feby Wulandari. Program Studi Pendidikan Dokter. Uji Toksisitas Akut Ekstrak Metanol Daun Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl.) Terhadap Larva Artemia salina Leach Dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). 2014. Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. merupakan tanaman dari famili Thymeleceae yang digunakan sebagai obat herbal di Indonesia. Daun ini mengandung falerin dan asam galat. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui potensi aktivitas sitotoksik ekstrak metanol daun mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) yang ditunjukkan dengan nilai LC50. Penelitian eksperimental ini menggunakan 150 larva Artemia salina Leach untuk setiap kali perlakuan yang dibagi menjadi empat konsentrasi ekstrak dan satu kontrol negatif, masing-masing terdiri dari 10 larva dengan tiga kali replikasi. Konsentrasi ekstrak berurut-turut adalah 17,5 ppm, 12,5 ppm, 5 ppm dan 2,5 ppm. Dihitung total larva yang mati setelah 24 jam. Hasil dari analisis probit menunjukkan nilai LC50 ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa adalah 7,0550 µg/ml. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa memiliki potensi toksisitas akut terhadap larva Artemia salina Leach karena memiliki nilai LC50 <1000 ppm. Kata kunci: Phaleria macrocarpa, Artemia salina, uji toksisitas akut, BSLT, LC50

ABSTRACT Feby Wulandari. Medical Education Study Program. Acute Toxicity Test Of Methanol Leaf Extract from Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl.) Towards The Artemia salina Leach Larva Using The Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Method. 2014. Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. is a plant that includes in the Thymeleceae family which is known for its uses as the herbal medicine in Indonesia. The leaf of this plant contains phalerin and gallic acid. The purpose of this research is to know the cytotoxic activity of the methanol extract of the leaves from the mahkota dewa potential (Phaleria macrocarpa) towards Artemia salina Leach larva using the Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) method with the score LC50. This experimental research uses 150 Artemia salina Leach larva for each session that is divided into four concentration extract and one negative control, it consists of 10 larva's each with 3 times replication. The extract concentration are 17,5 ppm, 12,5 ppm, 5 ppm and 2,5 ppm. The dead larva are counted after 24 hours. The result from the probit analysis shows score LC50 of methanol extract Phaleria macrocarpa leaf is 7,0550 µg/ml. It means that Phaleria macrocarpa methanol leaf extract does have the acute toxicity potential toward Artemia salina Leach larva due to having the score LC50 <1000 ppm. Keyword: Phaleria macrocarpa, Artemia salina, acute toxicity test, BSLT, LC50 vii

DAFTAR ISI

LEMBAR JUDUL ......................................................................................

i

LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ...................................

ii

LEMBAR PERSETUJUAN PEMBIMBING ...........................................

iii

LEMBAR PENGESAHAN ........................................................................

iv

KATA PENGANTAR ................................................................................

v

ABSTRAK ..................................................................................................

vii

DAFTAR ISI ..............................................................................................

viii

DAFTAR TABEL ......................................................................................

xi

DAFTAR GAMBAR ..................................................................................

xii

DAFTAR LAMPIRAN ..............................................................................

xiv

BAB 1 PENDAHULUAN 1.1. Latar belakang ............................................................................. 1.2. Rumusan masalah ........................................................................ 1.3. Tujuan penelitian 1.3.1. Tujuan umum ...................................................................... 1.3.2. Tujuan khusus ..................................................................... 1.4. Manfaat penelitian 1.4.1. Bagi peneliti ........................................................................ 1.4.2. Bagi institusi ....................................................................... 1.4.3. Bagi masyarakat ..................................................................

1 2 2 3 3 3 3

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Landasan teori .............................................................................. 2.1.1. Obat tradisional Indonesia ................................................... 2.1.2. Tanaman Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. .................. 2.1.2.1. Deskripsi tanaman ................................................. 2.1.2.2. Studi fitokimia ...................................................... 2.1.2.2.1. Studi fitokimia kualitatif ........................ viii

4 4 6 6 7 7

2.1.2.2.2. Kuantifikasi isolasi fitokonstituen .......... 2.1.2.3. Bioaktivitas (aktivitas antikanker) ......................... 2.1.2.4. Uji toksisitas dan bioassay kanker ......................... 2.1.3. Toksikologi ......................................................................... 2.1.3.1. Kondisi efek toksik ................................................ 2.1.3.2. Mekanisme efek toksik .......................................... 2.1.3.3. Sifat efek toksik .................................................... 2.1.3.4. Uji toksikologi ...................................................... 2.1.4. Simplisia ............................................................................. 2.1.4.1. Jenis simplisia ....................................................... 2.1.4.2. Tahapan pembuatan ............................................... 2.1.5. Ekstraksi tanaman ............................................................... 2.1.5.1. Metode ekstraksi ................................................... 2.1.5.2. Tahapan pembuatan ............................................... 2.1.6. Brine shrimp lethality test ................................................... 2.1.6.1. Artemia salina Leach ............................................. 2.1.6.1.1. Spesies ekologi ........................................ 2.1.6.1.2. Siklus hidup ............................................. 2.1.6.2. Nilai LC50 .............................................................. 2.1.6.3. Pelarut metanol ..................................................... 2.1.6.4. Analisis probit ....................................................... 2.2. Kerangka konsep .......................................................................... 2.3. Definisi operasional .....................................................................

8 9 12 14 15 15 16 16 18 18 19 20 20 21 22 23 24 25 28 29 30 31 32

BAB 3 METODE PENELITIAN 3.1. Desain penelitian .......................................................................... 3.2. Lokasi dan waktu penelitian ......................................................... 3.3. Populasi dan sampel ..................................................................... 3.3.1. Populasi .............................................................................. 3.3.2. Sampel ................................................................................ 3.3.2.1. Kriteria inklusi ...................................................... 3.3.2.2. Kriteria ekslusi ...................................................... 3.3.2.3. Besar sampel ......................................................... 3.3.2.4. Cara pengambilan sampel ...................................... 3.4. Alat dan bahan penelitian ............................................................. 3.4.1. Alat penelitian ..................................................................... 3.4.2. Bahan penelitian ................................................................. 3.5. Cara kerja penelitian .................................................................... 3.5.1. Determinasi tanaman dan proses pembuatan simplisia ......... 3.5.2. Ekstraksi daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. dengan metode maserasi ..................................................... 3.5.3. Penyiapan larva Artemia salina Leach ................................. 3.5.4. Pembuatan konsentrasi ekstrak yang akan diuji ................... 3.5.5. Uji toksisitas akut dengan metode bslt ................................. 3.6. Alur penelitian ............................................................................. ix

33 33 33 33 33 33 33 33 33 34 34 34 34 34 34 35 35 36 37

3.7. Pengolahan dan analisis data ........................................................

38

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Determinasi tanaman dan proses pembuatan simplisia .................. 4.2. Ekstraksi daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. dengan metode maserasi ........................................................................... 4.3. Uji toksisitas akut dengan metode bslt ..........................................

39 39 41

BAB 5 SIMPULAN DAN SARAN 5.1. Simpulan ...................................................................................... 5.2. Saran ............................................................................................

48 48

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................

49

LAMPIRAN ...............................................................................................

53

x

DAFTAR TABEL

Tabel 2.1. Perbedaan obat tradisional/ obat herbal dengan obat modern .......

4

Tabel 2.2. Modalitas reproduksi Artemia salina ...........................................

25

Tabel 2.3. Tingkat nilai toksisitas LC50 ........................................................

28

Tabel 2.4. Sifat fisika dan kimia metanol .....................................................

30

Tabel 4.1. Pengaruh berbagai konsentrasi ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. terhadap kematian larva Artemia salina Leach ................................................................................

42

Tabel 4.2. Perhitungan nilai LC50 ekstrak metanol daun Phaleria macrocrpa [Scheff.] Boerl. menggunakan analisis probit ...............................

43

Tabel 6.1. Tabel transformasi persen probit ..................................................

61

xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1. Strategi untuk posisi pengembangan produk ...........................

5

Gambar 2.2. Deskripsi tanaman dari Phaleria macrocarpa menunjukkan (a) kuncup bunga, (b) daun berwarna hijau dengan bentuk runcing, (c) buah berwarna hijau yang belum matang dan (d) buah berwarna merah yang sudah matang .........................

7

Gambar 2.3. Fitokonstituen diisolasi dari Phaleria macrocarpa dengan masing-masing aktivitas biologis ...........................................

8

Gambar 2.4. Mekanisme efek pro-apoptosis asam galat dan falerin diisolasi dari ekstrak Phaleria macrocarpa. bcl-2: b-cell lymphoma 2 protein, bax: bcl-2 associated x proteins, cyt-c: cytochrome c, vdac: voltage dependent anion channels, pi3/ akt: phospoinositide 3/ jalur protein 3 kinase b .............................

11

Gambar 2.5. Individu dari Artemia salina ...................................................

24

Gambar 2.6. Siklus hidup Artemia salina ...................................................

26

Gambar 2.7. Karakteristik anatomi nauplia dari Artemia salina ..................

27

Gambar 2.8. Karakteristik anatomi dari Artemia salina dewasa ..................

28

Gambar 4.1. Grafik pengaruh berbagai konsentrasi ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. terhadap kematian larva Artemia salina Leach .............................................................

42

Gambar 4.2. Grafik regresi linier konsentrasi ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. terhadap nilai probit ....

45

Gambar 6.1. Hasil determinasi daun Phaleria macrocapa [Scheff.] Boerl. ..

57

Gambar 6.2. Sebanyak 1 kg serbuk simplisia halus daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. ..................................................

57

Gambar 6.3. Telur Artemia salina Leach ....................................................

57

Gambar 6.4. Destilasi pelarut metanol ........................................................ xii

57

Gambar 6.5. Maserasi menggunakan pelarut metanol .................................

57

Gambar 6.6. Filtrat yang dipisahkan dari ampasnya ....................................

58

Gambar 6.7. Evaporasi menggunakan rotatory evaporator .........................

58

Gambar 6.8. Sebanyak 169,7650 g ekstrak kental metanol daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. ..................................................

58

Gambar 6.9. Sebanyak 2000 mg ekstrak kental daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. ditimbang menggunakan neraca analitik ........

58

Gambar 6.10. Larutan induk konsentrasi 20000 ppm dihomogenkan menggunakan hot plate stirrer ...............................................

59

Gambar 6.11. Larutan uji konsentrasi 35 ppm, 25 ppm, 10 ppm dan 5 ppm ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. ..

59

Gambar 6.12. Mengukur pH air laut menggunakan pH indicator paper ........

59

Gambar 6.13. Penetasan larva Artemia salina Leach ....................................

59

Gambar 6.14. Hasil uji toksisitas akut dengan metode bslt ...........................

60

Gambar 6.15. Menghitung kematian larva menggunakan digital colony counter ..................................................................................

60

Gambar 6.16. Hasil determinasi larva Artemia salina Leach menggunakan mikroskop dengan perbesaran 10 x 10 ....................................

xiii

60

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Perhitungan konsentrasi ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. .....................................................

54

Lampiran 2. Hasil determinasi daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. ..

56

Lampiran 3. Proses penelitian ......................................................................

57

Lampiran 4. Tabel probit ..............................................................................

61

Lampiran 5. Daftar riwayat hidup ................................................................

64

xiv

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang Kanker merupakan salah satu penyebab utama kematian di seluruh dunia, dilaporkan 8,2 juta kematian pada tahun 2012. Lebih dari 60% dari total kasus baru tahunan di dunia terjadi di Afrika, Asia, Amerika Tengah dan Amerika Selatan. Wilayah tersebut menyumbang 70% dari kematian akibat kanker di dunia.[1] Kanker menempati urutan keenam penyebab kematian terbesar di Indonesia.[2] Saat ini usaha penyembuhan menggunakan obat kanker kurang memuaskan karena memiliki efek samping yang besar, harga yang mahal dan sulit diperoleh. Hal tersebut mendorong dilakukannya pencarian sumber baru senyawa antikanker dari alam.[3] Pengobatan herbal adalah penggunaan biji, buah, akar, daun, kulit batang, atau bunga tanaman untuk tujuan pengobatan. [7] Pengobatan herbal telah digunakan selama berabad-abad untuk mengobati berbagai kondisi kesehatan yang berbeda-beda. Pengobatan herbal merupakan salah satu yang paling umum digunakan untuk terapi komplementer dan alternatif oleh orang dengan kanker. Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa 6 dari 10 orang dengan kanker menggunakan obat herbal bersama pengobatan kanker konvensional.[8] Salah satu tanaman obat asli Indonesia adalah Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl., umumnya dikenal sebagai mahkota dewa. Ekstrak dari Phaleria macrocarpa memiliki sejumlah aktivitas farmakologi seperti antikanker,

antidiabetes,

antihiperlipidemia,

antiinflamasi,

antibakteri,

antijamur, antivirus, antioksidan dan efek vasorelaksan. Konstituen yang diisolasi dari bagian yang berbeda dari Phaleria macrocarpa termasuk falerin, asam galat, ikarisida C, magniferin, mahkosida A, asam dodekanoik, asam palmitat, desasetil flavikordin A, flavikordin A, flavikordin D, flavikordin A glukosida, etil stearat, lignan, alkaloid dan saponin. [9] 1

2

Berdasarkan uji toksisitas terhadap Artemia salina Leach, ekstrak etanol buah Phaleria macrocarpa memiliki nilai LC50 (lethal concentration) 30,42 ppm dan ekstrak etanol biji buah Phaleria macrocarpa memiliki nilai LC50 1,6 x 10-2 ppm.[3] Untuk uji toksisitas akut digunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) karena cukup praktis, cepat, mudah, murah dan akurat. Metode BSLT menggunakan hewan uji larva udang Artemia salina untuk pencarian senyawa antikanker baru yang berasal dari tanaman. [3] Artemia salina digunakan

karena

merupakan

organisme

zoologi

invertebrata

yang

sederhana.[31] Media yang digunakan yaitu air laut[3] dan pelarut yang digunakan yaitu metanol. Metode ini dilakukan dengan menentukan besarnya LC50 selama 24 jam.[3] Penelitian ini bertujuan sebagai uji pendahuluan aktivitas antikanker daun Phaleria macrocarpa dari daerah Ciputat. Dengan demikian dilakukan uji toksisitas akut ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa dengan metode BSLT.

1.2. Rumusan Masalah Apakah ekstrak metanol daun mahkota dewa (Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl.) memiliki toksisitas akut terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)?

1.3. Tujuan Penelitian 1.3.1. Tujuan Umum Diketahuinya potensi aktivitas sitotoksik ekstrak metanol daun mahkota dewa (Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl.) terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT).

3

1.3.2. Tujuan Khusus a. Diketahuinya persentase kematian larva Artemia salina Leach setelah pemberian ekstrak metanol daun mahkota dewa (Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl.). b. Diketahuinya nilai LC50 ekstrak metanol daun mahkota dewa (Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl.) dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT).

1.4. Manfaat Penelitian 1.4.1. Bagi Peneliti a. Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. b. Memperoleh pengalaman di bidang penelitian eksperimental terutama di bidang kesehatan.

1.4.2. Bagi Institusi a. Menambah jumlah dan jenis penelitian yang telah dilakukan di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. b. Menambah referensi penelitian untuk melakukan penelitian lebih lanjut bagi peneliti yang lain.

1.4.3. Bagi Masyarakat Menambah informasi tentang khasiat penggunaan mahkota dewa yang berpotensi sebagai tanaman obat dan sebagai terapi komplementer atau alternatif dalam pengobatan kanker.

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Landasan Teori 2.1.1. Obat Tradisional Indonesia Saat ini obat tradisional cukup banyak digunakan oleh masyarakat untuk mengobati diri sendiri (self-medication), namun profesi kesehatan atau dokter umumnya masih enggan untuk meresepkan atau menggunakannya karena bukti ilmiah mengenai khasiat dan keamanan obat tradisional pada manusia masih kurang.[13] Alasan masyarakat menggunakan obat tradisional yaitu lebih terjangkau, sesuai ideologi, meredakan kekhawatiran tentang efek samping obat kimia (sintetis) dan keinginan untuk perawatan kesehatan yang lebih personal. Penggunaan obat tradisional meningkat ketika pengobatan konvensional tidak efektif dalam mengobati penyakit, seperti kanker dan penyakit menular. [14] Tabel 2.1. Perbedaan obat tradisional/ obat herbal dengan obat modern

Kandungan senyawa kimia Zak aktif Kendali mutu Efektivitas dan keamanan

Obat modern Satu atau beberapa dimurnikan atau sintetik Jelas Relatif mudah Ada bukti ilmiah, uji klinik

Obat tradisional Campuran banyak senyawa alami Sering tidak diketahui/ tidak pasti Sangat sulit Umumnya belum ada bukti ilmiah/ uji klinik

Sumber: Dewoto, 2007

Pengobatan tradisional merupakan istilah komprehensif yang digunakan untuk sistem pengobatan tradisional seperti pengobatan tradisional Cina, Indian Aryuveda, pengobatan unani Arab dan berbagai bentuk pengobatan tradisional lainnya. Terapi pengobatan tradisional meliputi terapi medikasi (menggunakan obatobatan herbal, hewan dan/ atau mineral) dan terapi nonmedikasi (tanpa menggunakan obat-obatan, seperti pada akupuntur, terapi manual dan terapi spiritual). Di negara dengan sistem pelayanan kesehatan yang berdasarkan pada obat allophatic, atau di mana obat tradisional belum dimasukkan ke dalam sistem pelayanan kesehatan nasional, pengobatatan tradisional disebut pengobatan “komplementer”, “alternatif” atau “nonkonvesional”.[15] Menurut Permenkes RI No.3/ Menkes/ Per/ I/ 2010, obat 4

5

tradisional adalah bahan atau ramuan bahan yang berupa bahan tumbuhan, bahan hewan, bahan mineral, sedian sarian (galenik), atau campuran dari bahan tersebut yang secara turun temurun telah digunakan untuk pengobatan dan dapat diterapkan sesuai dengan norma yang berlaku di masyarakat. [16] Penggunaan obat tradisional di Indonesia merupakan bagian dari budidaya nasional dan telah di mulai berabad-abad yang lalu. Salah satu obat tradisional Indonesia adalah jamu, telah dinyatakan sebagai brand Indonesia oleh Susilo Bambang Yudhoyono, Presiden Republik Indonesia pada 27 Mei 2007 di Jakarta.[17] Jamu, umumnya campuran obat herbal, yaitu obat yang berasal dari tanaman. Bagian tanaman yang digunakan berupa akar, batang, daun, umbi atau seluruh bagian tanaman. Indonesia memiliki sekitar 25000-30000 spesies tanaman yang merupakan 80% dari jenis tanaman di dunia dan 90% dari jenis tanaman di Asia. [13] Di antara 30000 spesies tanaman di kepulauan Indonesia, diketahui sekurang-kurangnya 9600 spesies tanaman berkhasiat sebagai obat dan kurang lebih 300 spesies digunakan sebagai bahan obat tradisional oleh industri obat tradisional. [18] Berdasarkan tingkat pembuktian khasiat, persyaratan bahan baku yang digunakan dan pemanfaatannya, obat bahan alam Indonesia dikelompokkan menjadi jamu, obat herbal terstandar dan fitofarmaka. [13] Obat tradisional yang didasarkan pada “warisan” dan pendekatan empiris disebut jamu (obat herbal), sedangkan yang dihasilkan dari pendekatan ilmiah melalui uji pre-klinis disebut herbal terstandar. Bagi yang telah lulus uji klinis disebut fitofarmaka.[17]

Gambar 2.1. Strategi untuk posisi pengembangan produk Sumber: WHO

6

2.1.2. Tanaman Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl. 2.1.2.1. Deskripsi Tanaman Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl., umumnya dikenal sebagai God’s crown, mahkota dewa atau pau merupakan tanaman dari famili Thymeleceae yang tumbuh di daerah tropis pulau Papua. Phaleria macrocarpa merupakan tanaman yang sempurna, termasuk batang, daun, bunga dan buah (Gambar 2.2). Tinggi Phaleria macrocarpa sekitar 1-18 m dengan panjang akar 1 m, kulit kayu berwarna hijau kecoklatan dan kayu berwarna putih. Phaleria macrocarpa tumbuh 10-1200 m di atas permukaan laut dengan usia produktif sekitar 10-20 tahun. Daunnya berwarna hijau dan bentuknya lonjong dengan panjang 7-10 cm dan lebar 3-5 cm. Bunga Phaleria macrocarpa tersusun dari 2-4, berwarna hijau hingga merah marun. Bentuk bijinya bulat dan berwarna putih serta beracun. Buah berbentuk gerhana dengan diameter 3 cm, berwarna hijau saat belum matang dan menjadi merah saat matang. Benih 1-2 per buah, berwarna coklat, ovoid dan anatropous. Ekstrak Phaleria macrocarpa memiliki sejumlah aktivitas farmakologi yaitu sebagai antitumor, antihiperglikemia, antiinflamasi, antidiare, antioksidan, antivirus, antibakteri, antijamur dan vasodilator. Batangnya digunakan untuk mengobati kanker tulang; kulit dari benihnya untuk mengobati kanker payudara, kanker serviks, penyakit paru, hati dan jantung; daunnya untuk mengobati impotensi, penyakit darah, alergi, diabetes mellitus dan tumor.[9] Taksonomi tanaman Phaleria macrocarpa (Hutapea et al., 1999; Winarto et al., 2003):[19]  Kingdom

: Plantae

 Divisi

: Spermathophyta

 Subdivisi

: Angiospermae

 Kelas

: Dicotyledoneae

 Bangsa

: Thymelaeales

 Suku

: Thymelaeaceae

 Genus

: Phaleria

 Spesies

: Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.

7

Gambar 2.2. Deskripsi tanaman dari Phaleria macrocarpa menunjukkan (a) kuncup bunga, (b) daun berwarna hijau dengan bentuk runcing, (c) buah berwarna hijau yang belum matang dan (d) buah berwarna merah yang sudah matang Sumber: Altaf et al., 2013

2.1.2.2. Studi Fitokimia 2.1.2.2.1. Studi Fitokimia Kualitatif Berbagai kandungan kimia ditemukan pada Phaleria macrocarpa dengan berbagai konsentrasi yaitu mahkosida A, asam dodekanoik, asam palmitat, desasetil flavikordin A, flavikordin A, flavikordin D, flavikordin A glukosida, etil stearat, lignan dan sukrosa. Yang et al. mengisolasi mahkosida A untuk pertama kali dari biji Phaleria macrocarpa bersama dengan enam senyawa lainnya yaitu magniferin, kaempferol-3-o-β-D-glukosida, asam dodekanoik, asam palmitat, etil stearat dan sukrosa. Lignan diisolasi dari bagian berbeda Phaleria macrocarpa, ketika mengalami chiral column analysis, ditemukan pinoresinol, larikiresinol dan matairesinol. Kulit kayu dan buahnya kaya akan saponin, alkaloid, polifenol, fenol, flavonoid, lignan dan tanin. Senyawa yang diisolasi dari buah termasuk ikarisida C3, magniferin dan asam galat. Falerin pertama kali diisolasi dari daun Phaleria macrocarpa sebagai glikosida benzofenon (3,4,5, trihidroksi-4-metoksi-benzofenon3-O-β-D-glukosida) oleh Hartati et al. Senyawa yang sama diisolasi dari buah oleh Oshimi et al., namun struktur yang diusulkan (2,4‟,6, trihidroksi-4-metoksibenzofenon-3-O-β-D-glukosida) sedikit berbeda dari laporan sebelumnya. Perikarp

8

buah mengandung kaempferol, mirisetin, naringin dan rutin. Naringin dan quersitin ditemukan di mesokarp dan biji. Forboester, desasetil flavikordin A dan derivat 29norkukurbitasin diisolasi dari biji. Ekstrak Phaleria macrocarpa juga mengandung alkaloid dan saponin.[9]

Gambar 2.3. Fitokonstituen diisolasi dari Phaleria macrocarpa dengan masingmasing aktivitas biologis Sumber: Altaf et al., 2013

2.1.2.2.2. Kuantifikasi Isolasi Fitokonstituen Ekstrak Phaleria macrocarpa belum sepenuhnya terstandarisasi untuk memberikan rincian persen kuantitas dari senyawa yang diisolasi. Namun konsentrasi beberapa senyawanya dalam fraksi tertentu dari ekstrak Phaleria macrocarpa dilaporkan. Misalnya, ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa diekstrak dalam petroleum eter, kloroform, metanol dan air dilaporkan memiliki kandungan falerin hingga 9,52%. Pasta kasar (32 g) diperoleh dari 3,2 kg biji Phaleria macrocarpa

9

terdiri dari 9,1% mahkosida A, 0,21% kaempferol dan 0,1% magniferin, sedangkan 60% dari pasta kasar terdiri dari sukrosa.[9] Total kandungan fenolik dari mesokarp, perikarp dan biji masing-masing 60,5 ± 0,17, 59,2 ± 0,04 dan 47,7 ± 1,04 mg GAE/gDW (galic acid equivalent/gram of dry weight). Total kandungan flavonoid dari perikarp ditemukan maksimum (161,3 ± 1,58 mg RE (rutin equivalent)/gDW) ketika dibandingkan dengan mesokarp dan biji (masing-masing 131,7 ± 1,66 dan 35,9 ± 2,47 mg RE/gDW).[9] 2.1.2.3. Bioaktivitas (Aktivitas Antikanker) Daun dan buah Phaleria macrocarpa digunakan untuk mengobati berbagai jenis kanker terutama kanker payudara dan tumor otak. Suplementasi Phaleria macrocarpa

dengan

AC

(adriamycin

cyclosphamide)

dapat

mengurangi

pertumbuhan tumor pada sel payudara dengan menginduksi apoptosis, juga melindungi kerusakan hati dan ginjal yang disebabkan oleh AC. Falerin dan asam galat berkontribusi besar untuk sifat sitotoksiknya.[9] Ekstrak semipolar metanol Phaleria macrocarpa (sebagai DLBS1425) bertindak sebagai antiproliferasi, antiangiogenik dan menginduksi apoptosis pada sel kanker payudara. Ekstrak ini mengandung 20,26% falerin dan menginduksi apoptosis oleh fragmentasi DNA, aktivasi kaspase-9 dan diregulasi oleh Bcl-2 (B-cell lymphoma 2 protein) dan BAX (Bcl-2 associated X protein) pada tingkat mRNA. Bcl-2 merupakan protein anti-apoptosis yang dikode oleh gen Bcl-2 yang bertindak sebagai cek poin dalam regulasi apoptosis, sedangkan BAX merupakan protein proapoptosis dari famili gen Bcl-2. Falerin dan asam galat meningkatkan regulasi protein BAX dalam dose dependent manner dan menurunkan regulasi ekspresi Bcl-2 mRNA sehingga menyebabkan peningkatan berkelanjutan dari kalsium level di mitokondria. Hal ini menginduksi pembukaan VDAC (voltage dependent anion channel) dan menyebabkan pelepasan sejumlah kecil Cyt-c (Cytochrome-c, protein ruang antar membran) dari mitokondria (Gambar 2.4.). Cyt-c berinteraksi dengan reseptor inositol trifosfat pada retikulum endoplasma sehingga menyebabkan pelepasan kalsium retikulum endoplasma dan meningkatkan keseluruhan level ion kalsium, yang selanjutnya memicu pelepasan besar-besaran Cyt-c. Cyt-c mengikat

10

domain WD-40 dari C-terminus dari APAF-1 (apoptotic protease activating factor1) dan penghentian autoinhibisi domain ini, sementara dua domain lainnya dari APAF-1 sebagai CARD (caspase activation and recruitment domain) dan NB-ARC (nucleotide binding adaptor shared by APAF-1, R and CED-4) domain ATPase (adenosine tri phosphatase) tetap dalam keadaan autoinhibisi. Cyt-c mengikat APAF-1 memicu pengikatan stabil dari ATP/ dATP pada nucleotide binding site dari APAF-1. Di hadapan tujuh molekul Cyt-c dan tujuh protein APAF-1, oligomerisasi dari APAF-1 ke dalam wheel-like heptagonal structure terjadi dan menyebabkan aktivasi apoptosom. Apoptosom menyebabkan pembelahan dan perekrutan APAF-3 (inactive procaspase-9) untuk mengaktifkan molekul kaspase-9. Kaspase merupakan sistein-aspartat-protease yang terdiri dari kaspase inisiator seperti 2, 8, 9, 10 dan kaspase efektor seperti 3, 6 dan 7. Aktivasi kaspase-9 inisiator selanjutnya mengaktifkan kaspase efektor, yang memicu kaskade kaspase 3, 6 dan 7. Hal ini mengaktifkan DNAase untuk menyebabkan fragmentasi DNA sehingga menginduksi apoptosis.[9] DLBS1425 juga menekan ekspresi COX-2 (cyclo-oxygenase 2) mRNA dan ekspresi VGEF-C (vascular endothelial growth factor-C) mRNA sehingga menurunkan permeabilitas pembuluh darah yang selanjutnya mengurangi proliferasi dan migrasi sel endotel, sehingga menjadi antiangiogenesis. Protein kinase C juga dihambat oleh ekstrak ini menyebabkan penurunan regulasi faktor transkripsi sebagai activator

protein-1,

memberikan

kontribusi

lebih

lanjut

untuk

aktivitas

antiproliferasinya. Asam galat bekerja pada BAX dan gen Bcl-2, juga bekerja pada jalur PI3K/ Akt/ mTOR (mammalian target of rapamycin). Selain dua mekanisme pro-apoptosis, asam galat juga meningkatkan ROS (reactive oxygen species) pada lini sel kanker in vitro.[9]

11

Gambar 2.4. Mekanisme efek pro-apoptosis asam galat dan falerin diisolasi dari ekstrak Phaleria macrocarpa. Bcl-2: b-cell lymphoma 2 protein, bax: bcl-2 associated x proteins, cyt-c: cytochrome c, vdac: voltage dependent anion channels, pi3/ akt: phospoinositide 3/ jalur protein 3 kinase b Sumber: Altaf et al., 2013

PI3K (phosphatidyl-inositol-3-kinase) mengaktifkan Akt (protein kinase-B) yang meregulasi kelangsungan hidup sel. Hal ini selanjutnya mengaktifkan mTOR, yang meregulasi pertumbuhan sel dan proliferasi. Pada sel kanker, jalur ini menjadi terlalu aktif dan mengurangi apoptosis, yang memungkinkan proliferasi. Asam galat menggunakan efek antiproliferasinya dengan menurunkan regulasi kelangsungan hidup Akt/ mTOR. Asam galat juga menurunkan regulasi fosforilasi dari aktivasi Ras/ mitogen jalur protein kinase, sehingga menekan ADAM (a disintegrin and mettalloproteinase)-metallopeptidase domain 17 (tumor necrosis factor alpha converting enzyme), menurunkan invasi dan proliferasi sel. Asam galat berinteraksi dengan C-X-C chemokine reseptor type 4 dan C-X-C chemokine ligand-12 yang menghambat aktivasi PI3K sehingga menghambat fosforilasi Akt, akibatnya menurunkan regulasi VGEF pada kedua protein dan tingkat mRNA, menyerang perkembangan angiogenesis dan tumor. Asam galat juga menghambat pertumbuhan

12

HeLa (human cervical cell line) dan HUVEC (human umbilical vein endothelial cell) in vitro dengan nilai IC50 (median inhibitory concentration) 80 μM untuk HeLa dan 400 μM untuk HUVEC.[9] Ekstrak etanol daun Phaleria macrocarpa meningkatkan ekspresi NKG2D (type-II integral membran protein) dan CD-122 (subunit dari interleukin-2), molekul permukaan yang meningkatkan aktivitas killer triggering receptor pada NKC (natural killer cell) dari limpa sehingga meningkatkan aktivitas membunuh mereka. Hal ini meningkatkan produksi interferon-gamma, yang merupakan glikoprotein yang mengaktifkan sel imun, makrofag dan NKC, akhirnya meningkatkan pengenalan dari infeksi atau tumor dengan meningkatkan regulasi limfosit T. [9] 2.1.2.4. Uji Toksisitas dan Bioassay Kanker Meskipun sejumlah sifat obat diklaim dalam pengobatan tradisional untuk ekstrak Phaleria macrocarpa, diketahui ada kecenderungan beracun dari ekstrak Phaleria macrocarpa.[20] Memakan buah matang Phaleria macrocarpa dapat menyebabkan ulkus oral,[9] mati rasa di lidah, mabuk dan keracunan.[20] Konsumsi Phaleria macrocarpa pada dosis yang lebih tinggi (27 mg/kg) menunjukkan fetotoksisitas embrio pada tikus betina. Ekstrak butanol buah matang yang diberikan kepada tikus pada dosis yang lebih tinggi dari 85 mg/kg intraperitoneal menyebabkan nekrosis ringan tubulus konvoltus proksimal pada ginjal tikus. Ekstrak etanol Phaleria macrocarpa yang diberikan kepada burung puyuh Jawa pada dosis 50, 100 dan 200 mg/kg selama dua bulan menyebabkan hipertrofi hati ringan dan peningkatan aktivitas serum glutamat piruvat transaminase pada dosis 100 mg/kg. Literatur yang tersedia hingga saat ini tidak cukup untuk mengevaluasi profil beracun dari berbagai ekstrak tanaman obat ini sehingga menyebabkan keraguan tentang keberhasilan menggunakan ekstrak Phaleria macrocarpa dalam mengobati penyakit yang berbeda.[9] Studi pendahuluan melaporkan bahwa salah satu fraksi dari ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa menunjukkan aktivitas penghambatan moderat terhadap NS-1 (myeloma cell) dengan nilai IC50 81 ppm. Penelitian lebih lanjut menunjukkan ekstrak kloroform daun Phaleria macrocarpa memiliki sifat antiproliferatif terhadap

13

HeLa, HM3KO (melanoma skin cancer cell) dan MCF-7 (human breast cancer cell line) dengan nilai IC50 masing-masing 40,2 ppm, 62,9 ppm dan 70,8 ppm. Selain itu, ekstrak etil asetat kulit kayu Phaleria macrocarpa menunjukkan aktivitas sitotoksik yang kuat terhadap L1210 (mouse leukemia cell) dengan nilai IC50 10,2 ppm. Uji sitotoksisitas pada ekstrak etil asetat dan metanol daun Phaleria macrocarpa menunjukkan bahwa ekstrak tersebut memiliki efek sitotoksik rendah terhadap HepG2 (human hepatoma cell line) dengan nilai IC50 masing-masing 32,5 ppm dan 40 ppm. Semua bagian dari buah Phaleria macrocarpa memperlihatkan sifat sitotoksik yang kuat terhadap MCF-7 dan HeLa dengan nilai IC50 20-40 ppm.[21] Purwantini et al. menyatakan bahwa uji BSLT ekstrak etanol buah dan biji Phaleria macrocarpa masing-masing menunjukkan nilai LC50 30,42 ppm dan 1,6 x 10-2 ppm, kedua ekstrak bersifat toksik karena memiliki nilai LC50 kurang dari 1000 ppm.[22] Ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa memiliki nilai LC50 63,16 ppm.[10] Lisdayati melakukan uji ketoksikan terhadap ekstrak n-heksan, etil asetat dan metanol masing-masing menghasilkan nilai IC50 11,83 ppm, 10,99 ppm dan 2,46 ppm. Nilai ini dianggap toksik karena nilai IC50 <10 ppm bersifat sitotoksik terhadap sel kanker. Penelitian lebih lanjut, Lisdayati melakukan uji bioassay in vitro dengan sel leukemia L1210 dan dosis yang diuji adalah 12, 10, 5 dan 0 ppm. Ekstrak nheksan, etil asetat dan metanol masing-masing menghasilkan nilai IC50 5,35 ppm, 5,76 ppm dan 5,80 ppm. Dengan nilai IC50 <10 ppm, maka dapat menghambat pertumbuhan kanker 50% setelah inkubasi 48 jam.[22] Uji bioassay dilakukan terhadap HeLa oleh Sumastuti dan Sonlimar. Dosis ekstrak buah/ daun 1; 5; 10; 50; 100 dan 200 mg/ml dibandingkan dengan doksorubisin 0,5; 1; 5; 10; 20 dan 50 mg/ml menunjukkan bahwa ekstrak air buah Phaleria macrocarpa dapat menghambat pertumbuhan HeLa setelah inkubasi 24 jam. Ekstrak buah memiliki nilai IC50 196,74 mg/ml, sedangkan nilai IC50 daun 812,45 mg/ml dan nilai IC50 doksorubisin lebih kecil dari 1 mg/ml. Hal ini menunjukkan bahwa potensi penghambatan buah 4 kali lebih besar daripada daunnya.[22]

14

Pusparanti melakukan uji sitotoksik dari infus kulit batang Phaleria macrocarpa pada HeLa dengan menghitung persen kematian sel menggunakan biru tripan (0,5%), diperoleh nilai LC50 40,12 mg/ml dan dapat disimpulkan bahan uji ini tidak memiliki daya sitotoksik terhadap HeLa karena nilainya lebih besar dari 1000 ppm.[22] 2.1.3. Toksikologi Toksikologi adalah ilmu tentang aksi berbahaya zat kimia atas jaringan biologi dan dampaknya. Hal ini berarti bahwa dalam kondisi tertentu dalam jaringan biologi (tubuh), zat kimia dapat berinteraksi menimbulkan efek berbahaya dengan wujud dan sifat tertentu. Sedangkan ketoksikan atau toksisitas adalah kapasitas suatu zat kimia/ beracun (xenobiotik) untuk menimbulkan efek toksik tertentu pada manusia.[27] Menurut bapak toksikologi, Paracelcus, dosis dapat membedakan antara obat dengan racun atau zat yang bukan racun dengan racun. Hal ini berarti bahwa obat bukan racun karena penggunaan obat diberikan berdasarkan aturan dosis tertentu yang umumnya tidak menimbulkan efek toksik atau manfaatnya jauh lebih besar daripada efek yang merugikan.[27] Efek samping (side effect), efek merugikan (adverse effect) dan efek toksik (toxic effect) dapat ditimbulkan akibat efek yang tidak diinginkan yang berkaitan dengan dosis obat yang diberikan. Efek samping adalah efek yang tidak berbahaya atau merugikan dan dapat ditoleransi sehingga obat tetap bermanfaat sebagai pengobatan, seperti mulut kering atau sedasi karena pemakaian antihistamin. Namun efek merugikan dapat berbahaya, seperti diare yang terus menerus atau pada terapi jangka panjang dapat mempengaruhi organ seperti ginjal, hepar, jantung dan lambung. Kondisi tersebut membutuhkan pengaturan penggunaan obat, seperti pengurangan dosis, menggunakan obat pada waktu tertentu atau mengganti obat yang digunakan. Efek toksik atau keracunan adalah efek yang sangat berbahaya dan dapat mengancam kehidupan sehingga pemberian obat harus dihentikan dan diberi terapi suportif atau diberi antidotumnya. Pada dosis minimal sering timbul efek samping,

15

sedangkan pada dosis maksimal sering timbul efek merugikan. Pada dosis yang sangat tinggi (over dosis) dapat timbul efek toksik yang berakibat fatal. [27] 2.1.3.1. Kondisi Efek Toksik Masuknya zat kimia dalam tubuh diawali melalui intravaskular (injeksi IV, intrakardial, intraarteri) atau ekstravaskular (oral, inhalasi, injeksi intramuskular, rektal), kemudian zat tersebut masuk ke dalam sirkulasi sistemik dan didistribusikan keseluruh tubuh. Proses distribusi ini memungkinkan zat atau metabolitnya sampai pada tempat kerjanya (reseptor). Efek toksik dapat terjadi akibat interaksi zat kimia atau metabolitnya yang berlebihan. Selain itu, zat kimia dapat menjadi senyawa non aktif dan diekskresikan (eliminasi) sehingga dapat mengurangi jumlah zat kimia dalam sel sasarannya. Dengan demikian, timbulnya efek toksik dipengaruhi juga oleh selisih antara absorbsi dan distribusi, metabolisme dan ekskresinya. [27] 2.1.3.2. Mekanisme Efek Toksik Zat kimia yang terdapat dalam tubuh melalui interaksi secara langsung (toksik intrasel) dan secara tidak langsung (toksik ekstrasel) dapat menimbulkan efek toksik. Toksisitas yang diawali dengan interaksi langsung antara zat kimia atau metabolitnya dengan reseptornya sehingga menyebabkan gangguan sel atau organelnya

melalui

pendesakan,

pengikatan,

subtitusi

(antimetabolit)

atau

peroksidasi disebut toksik intrasel. Gangguan yang ditimbulkan akan direspon oleh sel untuk mengurangi dampaknya dan sel akan beradaptasi atau melakukan perbaikan. Namun efek toksik akan terjadi bila respon pertahanan tidak mampu mengeleminir gangguan yang ada, akibatnya terjadi perubahan biokimiawi, fungsional atau struktural yang bersifat reversibel atau irreversibel. Radikal bebas merupakan salah satu contoh zat yang bekerja langsung dalam menimbulkan efek toksik yang menyebabkan peroksidasi lipid atau protein sehingga fungsinya terganggu. Toksisitas ekstrasel terjadi secara tidak langsung dengan mempengaruhi lingkungan sel sasaran tetapi dapat berpengaruh pada sel sasaran. [27]

16

2.1.3.3. Sifat Efek Toksik Jenis sifat efek toksik, yaitu:[27] a. Terbalikkan (reversibel)  Efek toksik cepat kembali ke normal.  Reseptor kembali semula bila kadar racun dalam reseptor habis.  Ketoksikan tergantung dosis, kecepatan absorpsi, distribusi dan eleminasi zat racun. b. Tidak terbalikkan (irreversibel)  Kerusakan permanen.  Akumulasi efek toksik.  Paparan takaran kecil jangka panjang sama dengan takaran besar jangka pendek. 2.1.3.4. Uji Toksikologi Serangkaian uji harus dilakukan sebelum obat beredar dipasaran sehingga keamanan, efektivitas dan mutu obat terjamin. Uji tersebut dimulai dari skrining untuk mencari senyawa aktif, dilanjutkan uji efektivitas atau selektivitas dan mekanisme kerjanya pada hewan uji atau mikroba. Setelah diketahui memiliki aktivitas farmakologi, akan dilakukan serangkaian uji keamanan pada hewan uji, meliputi:[27] a. Uji toksisitas akut: Merupakan efek berbahaya yang terjadi setelah terpapar dosis tunggal atau berulang dalam waktu 24 jam untuk menentukan dosis letal median (LD50, LC50) dan dosis maksimal yang masih dapat ditoleransi hewan uji, lalu hasilnya akan ditransformasi pada manusia. Tujuan uji toksisitas akut, yaitu:  Menentukan interval dosis untuk uji berikutnya (uji farmakologi, toksisitas subakut dan toksisitas jangka panjang).  Mengklasifikasikan zat uji termasuk kategori toksik atau tidak toksik.  Mengidentifikasi kemungkinan target organ atau sistem fisiologi yang dipengaruhi.

17  Mengetahui hubungan antara dosis dengan timbulnya efek seperti perubahan perilaku, koma atau kematian.  Mengetahui gejala toksisitas akut untuk membantu diagnosis kasus keracunan.  Memenuhi persyaratan regulasi jika zat uji dikembangkan menjadi obat.  Mencari zat yang berpotensi sebagai antikanker.  Keperluan evaluasi bahaya suatu zat melalui data seperti nilai slope dari grafik hubungan antara log dosis versus respon.  Mengetahui pengaruh usia, jenis kelamin, cara pemberian dan faktor lingkungan terhadap toksisitas suatu zat.  Mengetahui variasi respon antar spesies dan antar strain (hewan, mikroba) serta menginformasikan reaktivitas suatu populasi hewan. b. Uji toksisitas subakut: Untuk menentukan organ sasaran (organ yang rentan) atau tempat kerjanya. Umumnya menggunakan tiga dosis, dilakukan selama 4 minggu hingga 3 bulan dan menggunakan dua spesies berbeda. c. Uji toksisitas kronik: Untuk memantau obat yang akan digunakan dalam waktu yang cukup lama. Tujuannya hampir sama dengan uji toksisitas subakut. Menggunakan hewan rodent dan non rodent (anjing) selama 6 bulan atau lebih. d. Uji efek pada organ reproduksi: Untuk melihat perilaku yang berkaitan dengan reproduksi (perilaku kawin), perkembangan janin, kelainan janin, proses kelahiran dan perkembangan setelah dilahirkan. e. Uji karsinogenik: Untuk mengetahui zat yang dipakai dalam jangka panjang akan menimbulkan kanker atau tidak. Dilakukan selama 2 tahun pada dua spesies hewan. Uji formulasi dilakukan jika zat pada obat dikatakan aman setelah dilakukan serangkaian uji keamanan, selanjutnya dilakukan uji klinik pada manusia, meliputi:[27] a. Uji klinik fase I: Dilakukan pada orang yang sehat untuk mengetahui keamanan zat aktif pada manusia, rentang dosis yang aman dan profil farmakokinetiknya. b. Uji klinik fase II: Dilakukan pada orang yang sakit dalam jumlah sedikit untuk mengetahi efektivitas zat aktif.

18

c. Uji klinik fase III: Dilakukan pada pasien dalam jumlah relatif besar secara random control dan double blind untuk melihat efektivitasnya dan kemungkinan timbul efek yang tidak diinginkan. d. Uji klinik fase IV: Post marketing surveillance untuk mengetahui efektivitasnya dan melihat efek yang tidak diinginkan setelah digunakan secara masal (pasien tidak ditentukan kriterianya) yang tidak terdeteksi pada uji klinik fase II. Dilakukan setelah obat mendapatkan izin edar sementara. 2.1.4. Simplisia Simplisia merupakan bahan yang belum mengalami perubahan apapun kecuali bahan alam yang dikeringkan. Sumber simplisia dapat diperoleh dari tanaman liar dan tanaman hasil budidaya (kultivasi). Mutu yang dihasilkan dari tanaman liar kurang baik untuk dijadikan sumber simplisia dibandingkan dengan tanaman hasil budidaya karena usia atau bagian tanaman yang diproses tidak tepat, jenis atau spesies tanaman yang dipanen tidak sama dan tempat tumbuh yang berbeda (kualitas tanah, kadar air, sinar matahari) sehingga menyebabkan perbedaan kandungan senyawa aktif. Faktor yang mempengaruhi kualitas simplisia yaitu bahan simplisia dan cara penanganannya, proses pengolahan simplisia serta cara pengemasan dan penyimpanan simplisia.[28] 2.1.4.1. Jenis Simplisia Simplisia dibedakan menjadi:[28] a. Simplisia nabati: Simplisia berupa tanaman utuh, bagian tanaman atau eksudat tanaman. b. Simplisia hewani: Simplisia berupa hewan utuh, bagian hewan atau zat berguna bukan berupa zat kimia murni yang dihasilkan hewan. c. Simplisia mineral (pelikan): Simplisia berupa bahan mineral atau pelikan yang belum diolah atau telah diolah secara sederhana tetapi bukan berupa zat kimia murni.

19

2.1.4.2. Tahapan pembuatan Proses pembuatan simplisia melalui beberapa tahap, yaitu: [28] a. Pengambilan bahan baku: Kadar bahan aktif dalam simplisia bergantung pada bagian tanaman yang digunakan, usia atau bagian tanaman saat panen, waktu panen dan lingkungan tumbuh. Misalnya daun, pengambilan dilakukan pada saat tanaman mengalami perubahan pertumbuhan dari vegetatif ke generatif karena pada saat itu penumpukan senyawa aktif berada dalam kondisi optimal sehingga memiliki mutu terbaik; atau dipetik satu per satu dari pucuk yang sudah tua atau muda. b. Sortasi basah: Untuk memisahkan bahan simplisia dari kotoran/ bahan asing lain. c. Pencucian: Dilakukan dengan air bersih yang bersumber dari sumur, PAM atau mata air. Pencucian dilakukan sesingkat mungkin jika simplisia mengandung zat yang mudah larut dalam air mengalir. d. Perajangan: Untuk menurunkan ukuran atau menghaluskan bahan tanaman secara mekanik dan mempermudah proses pengeringan, pengepakan dan penggilingan. Perajangan dapat dilakukan dengan pisau atau mesin perajang khusus (penggiling palu untuk memecah bongkahan bahan yang rapuh, penggiling geligi untuk menggiling biji-biji yang keras atau bahan yang sudah dipotong, dll). e. Pengeringan: Untuk menurunkan kadar air sehingga menghentikan reaksi enzimatik dan mencegah terjadinya penurunan mutu atau perusakan simplisia sehingga simplisia dapat disimpan dalam jangka waktu lama. Sebaiknya pengeringan dilakukan secara cepat pada suhu tidak terlalu tinggi (antara 3090°C, terbaik 60°C) agar tidak terjadi perubahan kimia kandungan senyawa aktif atau pengeringan menggunakan microwave untuk jangka pendek.

Risiko

kontaminasi mikrobiologi atau debu terjadi akibat pengeringan dengan panas matahari di alam terbuka, sedangkan tumbuhnya kapang pada simplisia terjadi akibat pengeringan dalam jangka panjang. f. Sortasi kering: Dilakukan sebelum pengemasan simplisia untuk memisahkan simplisia dari benda asing. g. Pengepakan dan penyimpanan: Simplisia dapat disimpan pada suhu kamar (1530°C), tempat sejuk (5-15°C) atau tempat dingin (0-5°C) bergantung sifat dan

20

ketahanan simplisia. Simplisia dapat rusak atau berubah mutunya karena sinar dengan panjang gelombang tertentu (menimbulkan perubahan kimia pada simplisia), pengaruh oksigen udara (terjadi oksidasi pada senyawa tertentu dalam simplisia), reaksi oleh enzim, kelembaban udara lebih rendah dari kadar air simplisia (simplisia kehilangan air sehingga menjadi keriput) dan pengotoran simplisia (debu, cangkang telur, kapang, dll). h. Pemeriksaan mutu: Dilakukan dengan membandingkan mutu simplisia saat masa panen atau pembelian dari pedagang dengan simplisia pembanding. 2.1.5. Ekstraksi Tanaman Ekstraksi adalah proses pemisahan kandungan kimia yang dapat larut dengan pelarut cair sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut, sedangkan ekstrak adalah sediaan kental hasil ekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati atau hewani. Faktor yang mempengaruhi pembuatan ekstrak yaitu jumlah simplisia, derajat kehalusan simplisia, pelarut yang digunakan, suhu dan lama waktu penyari serta proses ekstraksi.[29] 2.1.5.1. Metode Ekstraksi Ekstraksi menggunakan pelarut dibedakan menjadi: a. Cara dingin  Maserasi: Proses ekstraksi simplisia dengan merendam serbuk simplisia menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengadukan pada suhu kamar dan terlindung dari cahaya, lalu ekstrak dikeluarkan dan ampas hasil ekstraksi dicuci dengan pelarut yang segar sampai didapat berat yang sesuai. Cara ini merupakan cara penyarian sederhana dengan menggunakan peralatan yang sederhana tetapi waktu untuk mengekstraksi sampel cukup lama dan cairan penyari yang digunakan lebih banyak (Dinda, 2008) serta

tidak begitu

sempurna dalam menarik zat berkhasiat dari tanaman. Remaserasi merupakan pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat pertama, dst.[28,29,30]  Perkolasi: Proses ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai sempurna pada suhu kamar untuk menarik bahan berkhasiat dari tanaman secara total,

21

terdiri dari tahap pengembangan bahan, maserasi antara dan perkolasi sebenarnya hingga diperoleh perkolat (ekstrak) yang jumlahnya 1-5 kali bahan.[28, 29] b. Cara panas  Refluks: Proses ekstraksi dengan pelarut pada suhu titik didihnya selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik.[29]  Soxhlet: Proses ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru dan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik.[29]  Digesti: Proses maserasi kinetik (pengadukan terus-menerus) pada suhu 4050°C.[29]  Infus: Proses ekstraksi dengan pelarut air pada suhu penangas air (bejana infus dicelupkan dalam penangas air dengan suhu 96-98°C) selama 15-20 menit.[29]  Dekok: Proses infus dengan waktu yang lebih lama (≥30°C) dan suhu sampai titik didih air.[29] 2.1.5.2. Tahapan Pembuatan Proses pembuatan ekstrak melalui beberapa tahap, yaitu: [29] a. Pembuatan serbuk simplisia kering: Proses ekstraksi semakin efektif dan efisien jika serbuk simplisia semakin halus. b. Cairan pelarut: Sebaiknya menggunakan pelarut yang optimal untuk memisahkan senyawa kandungan berkhasiat dari senyawa kandungan lain. Pelarut yang dibolehkan yaitu air dan alkohol (eter) serta campurannya, sedangkan pelarut yang umumnya digunakan untuk tahap separasi dan fraksinasi (pemurnian) yaitu metanol, heksana, toluen, kloroform dan aseton. Faktor yang dipertimbangkan dalam pemilihan cairan penyari yaitu selektivitas, kemudahan bekerja dan proses dengan cairan tersebut, ekonomis, ramah lingkungan dan aman. c. Separasi dan pemurnian: Untuk memisahkan semaksimal mungkin senyawa yang tidak diinginkan sehingga dihasilkan ekstrak yang lebih murni, terdiri dari tahap pengendapan, pemisahan cairan tak campur, sentrifugasi, dekantasi, filtrasi serta proses adsorbsi dan penukar ion.

22

d. Pemekatan/ penguapan (vaporasi dan evaporasi): Untuk meningkatkan jumlah senyawa terlarut secara penguapan pelarut tanpa sampai menjadi kering (ekstrak menjadi kental/ pekat). e. Pengeringan ekstrak: Untuk mengilangkan pelarut dari bahan sehingga menghasilkan serbuk dengan cara pengeringan evaporasi, vaporasi, sublimasi, konveksi, kontak, radiasi atau dielektrik. f. Rendemen: Membandingkan ekstrak yang diperoleh dengan simplisia awal. 2.1.6. Brine Shrimp Lethality Test Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) merupakan bioassay spektrum luas yang mampu mendeteksi adanya efek sitotoksisitas dan senyawa bioaktif yang terdapat dalam ekstrak. Uji ini menggunakan larva Artemia salina Leach sebagai hewan uji karena merupakan organisme zoologi invertebrata yang sederhana. Pelarut yang umumnya digunakan untuk melarutkan bahan uji yaitu metanol, DMSO (dimetil sulfoksida), Tween 20, air dan etanol. [31] Selain itu, sebagai media uji digunakan air laut murni atau air laut buatan dengan melarutkan garam tidak beryodium ke dalam air.[32] Uji toksisitas dengan metode BSLT merupakan uji toksisitas akut, dimana efek toksik dari suatu senyawa ditentukan dalam waktu 24 jam setelah dosis uji diberikan.[33] Uji ini dilakukan dengan menentukan nilai LC50 setelah 24 jam masa inkubasi. Hewan uji dianggap mati jika tidak ada gerakan yang terdeteksi selama 10 detik pengamatan. Nilai LC50 dihitung menggunakan analisis probit. [31] Ekstrak bersifat toksik jika nilai LC50 <1000 ppm, sehingga dapat dilakukan penelitian lebih lanjut

untuk

mengisolasi

senyawa

sitotoksik

tanaman

sebagai

upaya

mengembangkan obat alternatif antikanker. [34] Sedangkan, bila nilai LC50 >1000 ppm, maka ekstrak tersebut bersifat tidak toksik, sehingga dapat dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui khasiat lainnya dengan menggunakan hewan uji seperti mencit atau tikus secara in vivo.[33] Metode BSLT memiliki beberapa keuntungan, yaitu: a. Metode penapisan farmakologi awal yang mudah dilakukan dan relatif tidak mahal serta tidak membutuhkan keahlian khusus dalam pelaksanaannya. [35]

23

b. Cepat waktu ujinya, sederhana (tanpa membutuhkan teknik aseptik), jumlah organisme banyak dan membutuhkan sedikit sampel uji. [32] c. Metode yang telah teruji hasilnya dengan tingkat kepercayaan 95% untuk mengamati toksisitas suatu senyawa di dalam ekstrak kasar tanaman. [35] d. Sering digunakan dalam tahap awal isolasi senyawa toksik yang terkandung di dalam ekstrak kasar tanaman.[35] e. Sering dikaitkan sebagai metode penapisan untuk penyarian senyawa antikanker dari tanaman.[35] f. Dapat mengevaluasi toksisitas logam berat, pestisida dan obat-obatan (terutama ekstrak tanaman alami).[30] 2.1.6.1. Artemia salina Leach Artemia salina Leach adalah arthropoda primitif air (danau garam) dari famili Artemiidae (Gambar 2.5). Ditemukan oleh seorang ahli geografi Iran untuk pertama kalinya pada tahun 982 di danau Urmia (Asem, 2008), lalu diberi nama Cýncer salinus oleh Linny (1758) dan diubah menjadi Artemia salina oleh Leach (1819).[11] Taksonomi Artemia salina:[11]  Kingdom

: Animalia

 Filum

: Arthropoda

 Subfilum

: Crustacea

 Kelas

: Branchiopoda

 Ordo

: Anostraca

 Famili

: Artemiidae

 Genus

: Artemia

 Spesies

: Artemia salina (Linnaeus, 1758)

Spesies Artemia salina merupakan salah satu organisme yang sesuai untuk mengetahui bioaktivitas senyawa melalui uji toksisitas karena: a. Artemia salina memiliki respon yang sama dengan mamalia sehingga senyawa maupun ekstrak yang memiliki aktivitas pada sistem tersebut dapat terdeteksi,

24

misalnya tipe DNA-dependent RNA polymerase pada Artemia salina serupa dengan ouabaine-sensitive Na+ dan K+ dependent ATPase pada mamalia (Solis et al., 1993). Jika RNA polymerase dihambat, maka DNA tidak dapat mensintesis RNA, akibatnya sintesis protein terhambat sehingga mengganggu metabolisme sel dan menyebabkan kematian sel.[42] b. Telur Artemia salina dapat hidup dalam kondisi kering selama beberapa tahun dan mudah menetas dalam 48 jam sehingga dihasilkan larva Artemia salina dalam jumlah banyak untuk diuji.[43] c. Larva Artemia salina memiliki toleransi yang tinggi terhadap selang salinitas air tawar hingga air yang memiliki garam jenuh, [44] mampu mengatasi perubahan tekanan osmotik dan regulasi ionik yang tinggi, [25] serta memiliki membran kulit yang tipis sehingga kematian larva akibat efek sitotoksik dari senyawa bioaktif dianalogikan dengan kematian sel dalam organisme. [24]

Gambar 2.5. Individu dari Artemia salina Sumber: Dumitrascu, 2011

2.1.6.1.1. Spesies Ekologi Artemia salina hanya hidup di danau dan kolam dengan salinitas tinggi (antara 60-300 ppt). Selain itu, Artemia salina dapat mentolerir garam hingga 300 g/l air dan dapat hidup dalam larutan seperti kalium permanganat dan perak nitrat dari air laut, sedangkan yodium berbahaya bagi spesies ini. Hewan ini mampu mengurangi tekanan osmotik hemolimf dengan ekskresi NaCl terhadap gradien konsentrasi sehingga dapat mempertahankan hemolimf hipotonik ekstrim pada media

25

salinitas yang ekstrim (Croghan, 1957). Artemia salina dapat bertahan hidup di air dengan defisiensi oksigen yang tinggi. Konsentrasi minimum oksigen untuk Artemia salina dewasa sangat rendah (0,5 mg/l) dan untuk nauplia <0,3 mg/l.[11] 2.1.6.1.2. Siklus Hidup Perkembangbiakan Artemia salina terbagi menjadi ovipar dan ovovivipar. Faktor lingkungan yang mempengaruhi cara reproduksi Artemia salina yaitu konsentrasi oksigen dalam air dan fluktuasinya, jenis makanan, salinitas, dll (Tabel 2.2).[11] Tabel 2.2. Modalitas reproduksi Artemia salina Perkembangbiakan Ovipar Ovovivipar Konten oksigen rendah (salinitas tinggi antara Konten oksigen tinggi (salinitas rendah <150 150-200 ppt) ppt) Oksigen kuat-fluktuasi Oksigen minor-fluktuasi Tinggi makanan Fe (seperti ganggang hijau) Rendah makanan Fe (seperti debris organik) Sumber: Dumitrascu, 2011

Pada perkembangbiakan ovipar, setelah kopulasi, telur (siste) yang dibuahi berkembang menjadi gastrula yang dikelilingi lapisan kulit keras berwarna coklat atau cangkang yang terdiri dari kitin, lipoprotein, dll[11] untuk melindungi dari pengaruh kekeringan, benturan keras, sinar ultraviolet dan mempermudah pengapungan.[42] Kista yang terbentuk dilepaskan ke dalam air. Kista menjadi larva bebas ketika proses pengeringan awal terjadi. [11] Pada perkembangbiakan ovovivipar, telur yang dibuahi berkembang menjadi gastrula, lalu gastrula berdiferensiasi menjadi nauplia. Nauplia merupakan larva betina bebas yang bersirip dan berwarna putih. Hidrasi dan oksigen dibutuhkan untuk perkembangan kista (0,2-0,3 mm) menjadi nauplia (0,45 mm) dalam waktu 2436 jam, lalu menjadi kista dewasa (maksimal 13 mm) dalam waktu 3 minggu tergantung ketersediaan pangan.[11]

26

Gambar 2.6. Siklus hidup Artemia salina Sumber: Dumitrascu, 2011

Kista dapat bertahan hidup pada kondisi ekstrim hingga 80°C, kondisi kering selama bertahun-tahun, kontak dengan cairan agresif, kekurangan oksigen dan pengaruh pestisida. Kista terhidrasi (berukuran 200-270 mikron dan berat 3,5 µg) mati pada suhu dibawah 0°C dan di atas 40°C. Kista tidak akan menetas jika salinitas tinggi dari 70 ppt (parts per thousand) karena gradien osmotik terlalu tinggi, sedangkan kista akan menetas pada salinitas <5 ppt tetapi hasil nauplia akan cepat mati.[11] Nauplia tumbuh optimal pada 28°C dan 35 ppt, sedangkan mati pada 0°C dan 37-38°C.[11] Nauplia memiliki dua antena yaitu sepasang antena I (sungut kecil) dan sepasang antena II (sungut besar). Dibagian antena II terdapat sepasang rahang kecil, sedangkan di bagian ventral terdapat labrum. [42] Nauplia berenang atau melalui kolom air (fototaksis) dan mengumpulkan makanan menggunakan antena, sedangkan rahang digunakan untuk menyaring air dan fitoplankton.[11] Nauplia mengalami 15 kali metamorfosis. Nauplia tingkat I disebut instar I, tingkat II disebut instar II, dst hingga tingkat XV disebut instar XV. Nauplia tingkat I warnanya kemerah-merahan karena mengadung banyak cadangan makanan sehingga belum membutuhkan makan. Setelah 24 jam menetas, instar II sudah mulai mencari makanan karena

27

memiliki saluran pencernaan yang sudah terbentuk lengkap. Nauplia hanya memiliki satu mata (fotoreseptor) yang kemudian berkembang menjadi 3 mata, [11] selain itu berangsung-angsur tumbuh tunas pada kakinya (torakopoda). Pada instar XV, nauplia memiliki 11 pasang kaki (Mudjiman, 1989). [42]

Gambar 2.7. Karakteristik anatomi nauplia dari Artemia salina Sumber: Dumitrascu, 2011

Artemia salina dewasa memiliki bentuk sempurna menyerupai udang[42] dan tidak bersifat fototaksis. Selain itu, Artemia salina dewasa memiliki satu mata dibagian tengah disertai dua mata dibagian lateral, panjang jantan 8-10 mm dan panjang betina 10-12 mm serta memiliki warna yang bervariasi tergantung pada konsentrasi garam dalam air dari green tored (merah pada konsentrasi tinggi). Darahnya mengandung pigmen hemoglobin.[11] Antena I pada Artemia salina dewasa jantan dan betina tetap berfungsi sebagai alat peraba. Antena II pada Artemia salina dewasa jantan berubah menjadi alat penjepit yang membesar dan berotot untuk berpegangan pada betina menjelang perkawinan, sedangkan antena II pada betina mengalami penyusutan sehingga menjadi alat peraba. Dibelakang kaki torakopoda pada Artemia salina dewasa jantan terdapat 2 organ reproduksi, sedangkan dibagian ventral pada betina memiliki 1 uterus yang mengandung hingga 200 telur.[11] Tubuh terdiri dari tiga segmen yaitu kepala, dada dan perut. Perbedaan morfologi utama antara jantan dan betina terletak pada jarak maksimum antara mata majemuk, panjang dari antena I, lebar dari segmen perut ketiga, panjang total, diameter dari mata majemuk dan panjang perut.[11]

28

Gambar 2.8. Karakteristik anatomi dari Artemia salina dewasa Sumber: Dumitrascu, 2011

2.1.6.2. Nilai LC50 Nilai LC (lethal concentration) mengacu pada konsentrasi bahan kimia di udara atau dalam air.[36] Konsentrasi yang diberikan sekali (tunggal) atau beberapa kali dalam 24 jam dari suatu zat yang secara statistik dapat mematikan 50% hewan uji disebut LC50.[27] LC50 digunakan untuk perlakuan secara inhalasi atau uji toksisitas dalam media air (Klaassen, 1986). Konsentrasi ini memiliki satuan yaitu ppm (parts per million), mg/m3 [36] atau µg/ml. Uji toksisitas dengan larva Artemia salina Leach yang hasilnya dihitung menggunakan metode LC50 yang mana kematian hewan uji terjadi setelah 6 jam pemaparan disebut LC 50 akut, sedangkan kematian hewan uji setelah 24 jam pemaparan disebut LC50 kronis. Namun LC50 setelah 24 jam lebih sering digunakan karena ekstrak yang sukar larut membutuhkan waktu yang lebih lama untuk larut. Nilai LC 50 dapat ditentukan dengan cara menggunakan grafik probit log konsentrasi atau perhitungan secara matematik. [30] Tabel 2.3. Tingkat nilai toksisitas LC50 Nilai LC50 (ppm)

Tingkat toksisitas

0-250

Sangat toksik

250-500

Toksik

500-750

Sedang

750-1000

Tidak toksik

Sumber : Aras, 2013

29

2.1.6.3. Pelarut Metanol Pelarut memiliki peran yang penting pada uji toksisitas dengan metode BSLT. Pelarut yang digunakan dapat memberikan hasil positif palsu pada uji yang dilakukan karena toksisitas pelarut itu sendiri. [38] Pelarut seperti DMSO (dimetil sulfoksida), metanol, etanol dan Tween 20 sering digunakan pada uji antimikrobial, aktivitas sitotoksisitas dan BSLT.[31] Nilai LC50 untuk DMSO, metanol, etanol dan Tween 20 masing-masing yaitu 8,5%, 6,4%, 3,4% dan 2,5%. Tingkat toksisitas pelarut diurutkan sebagai berikut: Tween 20 > etanol > metanol > DMSO. Hal ini menunjukkan bahwa DMSO memiliki efek sitotoksisitas terendah terhadap Artemia salina Leach, sedangkan Tween 20 memiliki efek sitotoksisitas tertinggi. Masing-masing pelarut memiliki konsentrasi toleransi maksimum untuk melarutkan sampel uji yaitu 1,25% untuk DMSO, metanol dan etanol serta 0,16% untuk Tween 20. Hal ini menunjukkan bahwa bekerja pada atau di bawah konsentrasi toleransi maksimum dengan pelarut tersebut tidak memberikan hasil positif palsu. [31] DMSO digunakan untuk melarutkan ekstrak tanaman, [31] senyawa polar dan non polar.[32] Tween 20 merupakan deterjen yang digunakan untuk melarutkan minyak esensial dan zat minyak lainnya pada ekstrak tanaman. Deterjen memiliki rantai alkil panjang yang mampu melarutkan senyawa hidrofobik sehingga disebut surface-acting agent. Tween 20 bersama deterjen lainnya (sodium dodecyl sulfate dan CHAPS) dapat mendenaturasi protein dan menghambat proses biologis. Oleh karena itu, Nikkol dapat digunakan sebagai pengganti Tween 20. Nikkol merupakan deterjen nonionik dengan toksisitas rendah. [38] Metanol dan etanol digunakan untuk melarutkan sejumlah besar kandungan kimia dalam produk alami, kecuali albumin, karet, lilin, sukrosa, lemak dan fixed oil.[31] Metanol (CH3OH) merupakan bentuk alkohol paling sederhana. [39] Nama lain metanol yaitu metil alkohol, metil hidrat, wood spirit atau metil hidroksida.[40] Metanol diproduksi secara alami oleh bakteri melalui metabolisme anaerobik sehingga menghasilkan uap metanol (dalam jumlah kecil) di udara. Beberapa hari kemudian uap tersebut akan teroksidasi oleh oksigen menjadi karbondioksida dan air

30

dengan bantuan sinar matahari. Dari proses tersebut diperoleh reaksi kimia metanol: 2 CH3OH + 3 O2 → 2 CO2 + 4 H2O.[39] Di dalam tubuh, metanol akan dimetabolisme di hati menjadi formaldehid oleh enzim alkohol dehidrogenase, lalu formaldehid yang terbentuk sangat cepat (waktu paruh 1-2 menit) akan diubah menjadi asam format oleh enzim formaldehid dehidrogenase. Selanjutnya diperlukan waktu kurang lebih 20 jam untuk mengoksidasi asam format menjadi karbondioksida dan air oleh enzim F-THF-S (10 formil tetrahidrofolat sintetase). Formaldehid dan asam format merupakan zat beracun bagi tubuh.[41] Tabel 2.4. Sifat fisika dan kimia metanol Cair, jernih, tidak berwarna Karakteristik bau alkohol sedang 12,8 kPa @ 20°C Larut sepenuhnya 1,105 @ 15°C -98,7°C 32,04 g/ mol 64,7°C @ 101,3 kPa 239,4°C Larut dalam semua alkohol, ester, keton, eter dan sebagian besar pelarut organik lainnya Sumber : Material Safety Data Sheet Penampilan Bau pH Tekanan uap Kelarutan Densitas uap Titik beku Berat molekul Titik didih Suhu kritis Kelarutan dalam cairan lain

2.1.6.4. Analisis Probit Analisis probit merupakan tipe regresi yang digunakan untuk menganalisis berbagai jenis dosis-respon atau respon binomial eksperimen pada berbagai bidang. Pada toksikologi, analisis probit umumnya digunakan untuk menentukan toksisitas relatif bahan kimia terhadap organisme hidup dengan menguji respon dari organisme pada berbagai konsentrasi bahan kimia. Variabel respon binomial mengacu pada dua hasil, misalnya mati atau tidak mati. Analisis probit dapat dilakukan menggunakan tabel probit, perhitungan tangan, koefisien regresi, interval keyakinan atau aplikasi statistik seperti SPSS.[23] Peningkatan dosis zat toksik yang diberikan pada sejumlah individu atau spesies yang homogen akan diikuti oleh peningkatan respon toksik sehingga

31 hubungan antara log dosis versus respon akan membentuk kurva sigmoid (∫) yang disebut kurva hubungan dosis-respon. Kurva sigmoid dapat dibuat linier dengan cara memprobitkan persen respon. Bagian yang relatif tidak lurus (respon kurang dari 16% atau lebih dari 84%) dapat diluruskan dengan memprobitkan. Bagian tengah kurva (16-84% respon) cukup proporsional (lurus) untuk memperkirakan efek hubungan dosis versus respon. Suatu zat relatif berbahaya jika zat tersebut membentuk kurva dosis-respon linier yang slopenya besar (relatif tegak) karena perubahan dosis yang kecil sudah dapat menimbulkan peningkatan respon toksik yang relatif besar.[27] Persamaan garis lurus hubungan antara nilai probit dengan log dosis yaitu Y = mX+ b. Dimana m dan b merupakan konstanta atau koefisien regresi linier sederhana atau parameter garis regresi linier sederhana, m sebagai slope coefficient yang menunjukkan kemiringan garis regresi terhadap sumbu X, b sebagai intercept coefficient yang menunjukkan jarak titik asal dengan titik potong garis regresi dengan sumbu Y.[6] Regresi bertujuan untuk membandingkan hubungan antara variabel respon atau variabel terikat (Y) dengan variabel bebas (X). [23] 2.2. Kerangka Konsep Ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl. Mengandung senyawa bioaktif Uji toksisitas akut dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Kematian larva Artemia salina Leach Nilai LC50

32

2.3. Definisi Operasional No. 1.

Variabel Konsentrasi ekstrak daun Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.

Definisi Konsentrasi larutan uji dalam ppm (1 µg/ml)

Cara ukur V1M1=V2M2

Alat ukur -

Skala ukur Numerik

2.

Persentase mortalitas larva Artemia salina Leach

Kematian larva dibagi total larva dikali 100%

-

Numerik

3.

LC50

Hasil perkalian rasio dengan 100% yaitu larva yang mati dibagi jumlah larva awal dikali 100% untuk tiap replikasi Konsentrasi yang diberikan sekali (tunggal) atau beberapa kali dalam 24 jam dari suatu zat yang secara statistik dapat mematikan 50% hewan uji

Menentukan persamaan garis lurus Y = mX + b dengan memasukan nilai 5 (probit dari 50% kematian hewan uji) pada nilai Y sehingga dihasilkan X sebagai nilai log konsentrasi dan anti log X sebagai nilai LC50

-

Kategorik

Hasil ukur 17,5 ppm 15 ppm 12,5 ppm 10 ppm 7,5 ppm 5 ppm 2,5 ppm Jumlah persentae kematian larva

LC50 <1000 ppm disebut toksik dan LC50 >1000 ppm disebut tidak toksik

BAB 3 METODE PENELITIAN 3.1. Desain penelitian Penelitian ini adalah penelitian eksperimental. 3.2. Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan pada Februari hingga Agustus 2014 di Laboratorium Penelitian 1, Laboratorium Farmakognosi dan Fitofarmaka serta Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 3.3. Populasi dan Sampel 3.3.1. Populasi Populasi pada penelitian ini adalah larva Artemia salina Leach. 3.3.2. Sampel 3.3.2.1. Kriteria Inklusi Kriteria inklusi pada penelitian ini adalah larva Artemia salina Leach yang berusia 48 jam. 3.3.2.2. Kriteria Ekslusi Kriteria ekslusi pada penelitian ini adalah larva Artemia salina Leach yang tidak menunjukkan aktivitas pergerakan sebelum perlakuan. 3.3.2.3. Besar Sampel Jumlah larva Artemia salina Leach yang digunakan adalah 10 larva untuk setiap konsentrasi ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. Pada penelitian ini terdapat empat konsentrasi dan satu kontrol negatif. Kemudian dilakukan tiga kali replikasi untuk setiap konsentrasi dan kontrol negatif. Jadi, jumlah total sampel yang diperlukan adalah 150 larva Artemia salina Leach untuk setiap kali perlakuan. 3.3.2.4. Cara Pengambilan Sampel Cara pengambilan sampel dengan purposive random sampling terhadap larva Artemia salina Leach karena anggota populasi telah bersifat homogen. Hal ini berarti sampel larva Artemia salina Leach dengan jenis 33

34

dan cara penyediaan yang sama memiliki kesempatan yang sama untuk diseleksi sebagai sampel.[4] 3.4. Alat dan Bahan Penelitian 3.4.1. Alat Penelitian Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah aerator, aluminium foil, baskom kecil, batang pengaduk, bejana kaca maserasi, cawan penguap, corong kaca, digital colony counter, erlenmeyer, gelas beker, gunting, hot plate stirrer, labu ukur, lakban hitam, lampu, mikropipet, neraca analitik, oven, pH indicator paper, pipet tetes, tabung reaksi, spatula, refrigerator, rotary evaporator, sterofoam, wadah plastik dan well plate. 3.4.2. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah air laut, aquades, kertas saring, pelarut metanol, serbuk simplisia daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. dan telur Artemia salina Leach. 3.5. Cara Kerja Penelitian 3.5.1. Determinasi Tanaman dan Proses Pembuatan Simplisia Determinasi tanaman dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor (Lampiran 2). Penyiapan daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. dilakukan dengan memetik satu per satu daun muda dan daun tua yang diperoleh dari kebun rumah warga di daerah Ciputat hingga mencapai 6 kg, kemudian daun dipisahkan dari kotoran/ bahan asing. Pencucian dan perajangan simplisia hingga menjadi 1 kg serbuk simplisia halus serta sortasi kering dan pengepakan dilakukan di Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (Balitro), Bogor. Selanjutnya serbuk simplisia disimpan pada suhu kamar (1530°C). 3.5.2. Ekstraksi Daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. Dengan Metode Maserasi Ekstraksi serbuk simplisia halus daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. menggunakan pelarut metanol dilakukan dengan cara maserasi. Maserasi dilakukan sebanyak 5 kali atau hingga warna pelarut menjadi agak pudar. Sebanyak 1 kg serbuk simplisia dimasukkan ke dalam bejana kaca

35

maserasi, lalu direndam menggunakan pelarut metanol yang telah di destilasi dengan rotatory evaporator. Dilakukan beberapa kali pengadukan dan didiamkan selama 24 jam.[34] Setelah 24 jam, rendaman disaring menggunakan kertas saring sehingga diperoleh filtrat (maserat) yang terpisah dari ampasnya. Kemudian filtrat dipekatkan menggunakan rotary evaporator pada suhu 45°C sehingga diperoleh ekstrak kental metanol daun Phaleria macrocarpa. Ekstrak kental dituang ke dalam cawan penguap dan diuapkan di dalam oven, lalu ditimbang menggunakan neraca analitik. Ampas hasil ekstraksi di remaserasi sehingga diperoleh filtrat ke-2, dst.[37] Ekstrak kental metanol daun Phaleria macrocarpa yang diperoleh dari 5 kali proses maserasi sebanyak 169,7650 g. 3.5.3. Penyiapan Larva Artemia salina Leach Penetasan telur Artemia salina Leach dilakukan dalam wadah plastik berisi air laut yang dipasang aerator. [34] Wadah plastik terbagi menjadi dua ruang, yaitu ruang gelap dan ruang terang yang dipisahkan oleh sekat. Sekat terbuat dari sterofoam yang dibagian bawahnya dibuat lubang dengan diameter 1 cm untuk jalan keluar telur yang telah menetas menuju ruang sebelahnya. Sebanyak 1 L air laut terlebih dahulu diukur pH-nya menggunakan pH indicator paper, diperoleh pH 8-9.[4] Air laut dimasukkan ke dalam wadah plastik hingga lubang pada sterofoam terendam. Kemudian 1 g telur Artemia salina dimasukkan ke dalam satu ruang, lalu sekeliling ruang tersebut ditutup menggunakan aluminium foil dan lakban hitam. Ruang lainnya dibiarkan terbuka dan disinari lampu selama 48 jam. Setelah 24 jam, telur akan menetas menjadi larva dan bergerak menuju ruang terang. Larva yang berusia 24 jam dipindahkan ke dalam wadah plastik lain hingga berusia 48 jam dan dipasang aerator. Larva yang berusia 48 jam digunakan sebagai hewan uji. 3.5.4. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak yang Akan Diuji Uji orientasi (trial) dilakukan terlebih dahulu dengan memilih rentang dosis 10-90% yang mematikan hewan uji. Setelah dilakukan uji orientasi, diperoleh konsentrasi larutan uji yang digunakan yaitu 35 ppm, 25 ppm, 10 ppm dan 5 ppm. Ekstrak kental metanol daun Phaleria macrocarpa

36

ditimbang menggunakan neraca analitik hingga mencapai 2000 mg, lalu dilakukan pengenceran dengan aquades hingga mencapai 100 ml. Larutan uji dihomogenkan menggunakan hot plate stirrer. Kemudian membuat larutan induk dengan konsentrasi 20000 ppm. Selanjutnya dilakukan pengenceran untuk membuat larutan uji dengan konsentrasi 35 ppm, 25 ppm, 10 ppm dan 5 ppm menggunakan rumus V1M1=V2M2. Setiap larutan uji dilakukan tiga kali replikasi. 3.5.5. Uji Toksisitas Akut Dengan Metode BSLT Pada masing-masing well plate dimasukkan 1 ml larutan uji dengan konsentrasi 35 ppm, 25 ppm, 10 ppm dan 5 ppm, lalu 10 larva Artemia salina dimasukkan ke dalam well plate bersama 1 ml air laut menggunakan mikropipet. Kemudian diperoleh konsentrasi ekstrak pada well plate yang berisi larva Artemia salina yaitu 17,5 ppm, 12,5 ppm, 5 ppm dan 2,5 ppm karena karena adanya penambahan 1 ml air laut pada larutan uji sehingga konsentrasi berubah menjadi setengah kalinya. Sedangkan kontrol negatif hanya well plate yang berisi 2 ml air laut dan 10 larva Artemia salina tanpa penambahan larutan uji. Kemudian didiamkan selama 24 jam dan masingmasing well plate dihitung total larva yang mati (tidak ada gerakan yang terdeteksi selama 10 detik pengamatan) menggunakan digital colony counter atau dibawah penerangan lampu. Dilakukan tiga kali replikasi pada setiap konsentrasi.

37

3.6. Alur Penelitian Determinasi tanaman 6 kg daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. 1 kg serbuk halus simplisia daun Phaleria macrocarpa 5 kali maserasi dengan pelarut metanol yang telah di destilasi 169,7650 g ekstrak kental metanol daun Phaleria macrocarpa Pengenceran 2000 mg ekstrak kental metanol daun Phaleria macrocarpa dengan aquades hingga mencapai 100 ml Larutan induk konsentrasi 20000 ppm ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa Uji orientasi dengan rentang dosis 10-90% yang mematikan hewan uji Larutan uji konsentrasi 35 ppm, 25 ppm, 10 ppm, dan 5 ppm 1 ml larutan uji dimasukkan ke dalam well plate dengan tiga kali replikasi 10 larva Artemia salina Leach berusia 48 jam dan 1 ml air laut dimasukkan ke dalam setiap well plate Total larva yang mati dalam setiap well plate dihitung setelah 24 jam Persentase kematian larva dihitung pada setiap konsentrasi Nilai LC50 dihitung menggunakan analisis probit

38

3.7. Pengolahan dan Analisis Data Nilai LC50 dapat ditentukan dengan cara menggunakan grafik probit log konsentrasi, perhitungan secara matematik[30] atau aplikasi seperti Microsoft Office Excel dan SPSS.[4] Langkah perhitungan nilai LC50 berdasarkan analisis probit, yaitu:[27] a. Memiliki tabel probit (Lampiran 4). b. Menentukan nilai probit dari persen kematian tiap kelompok hewan uji. c. Menentukan log dosis tiap-tiap kelompok. d. Menentukan persamaan garis lurus hubungan antara nilai probit dengan log dosis, Y = mX + b. e. Memasukkan nilai 5 (probit dari 50% kematian hewan uji) pada persamaan garis lurus pada nilai Y. Nilai LC50 dihitung dari nilai anti log X pada saat Y = 5. Keterangan:  Y: Variabel terikat  m: Slope = ∑(X)∑(Y) - n∑(XY) (∑(X))2 – n∑(X2)  X: Variabel bebas  b: Intercept = ∑(X)∑(XY) - ∑(X2)∑(Y) (∑(X))2 - n∑(X2) Mortalitas larva Artemia salina dihitung menggunakan rumus:[31] Tingkat kematian (%) = Kematian larva x 100% Total larva

39

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

2.4. Determinasi Tanaman dan Proses Pembuatan Simplisia Penelitian ini menggunakan sebanyak 6 kg daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. yang diperoleh dari kebun rumah warga di daerah Ciputat dengan cara memetik satu per satu daun muda dan daun tua. Hal ini dapat mempengaruhi mutu simplisia karena usia tanaman yang diproses tidak sama, sumber simplisia diperoleh bukan dari hasil budidaya dan tempat tumbuh yang berbeda (kualitas tanah, kadar air, sinar matahari) sehingga menyebabkan perbedaan kandungan senyawa aktif. [28] Selanjutnya dilakukan determinasi di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor untuk mengidentifikasi suku dan spesies tanaman yang akan diteliti, [5] sehingga menghindari adanya kesalahan dalam pengambilan tanaman.[4] Daun yang sudah dipisahkan dari kotoran/ bahan asing, selanjutnya dibawa ke Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (Balitro), Bogor dan diperoleh 1 kg serbuk simplisia halus sehingga proses ekstraksi semakin efektif dan efisien.[29] Semakin halus simplisia maka semakin luas permukaan yang kontak dengan cairan penyari sehingga kandungan kimia yang terlarut dalam proses penyarian lebih banyak dan penyarian berlangsung lebih sempurna. [42] Selanjutnya serbuk simplisia disimpan pada suhu kamar (15-30°C) agar mutunya tidak berubah.[28] 2.5. Ekstraksi Daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. Dengan Metode Maserasi Penelitian ini menggunakan metode ekstraksi dengan cara maserasi. Metode maserasi dipilih karena merupakan cara penyarian yang sederhana dengan menggunakan peralatan yang sederhana dan tanpa adanya tahap pemanasan sehingga menghindari terjadinya kerusakan kandungan senyawa aktif pada ekstrak. [37] Kekurangan metode maserasi yaitu waktu untuk mengekstraksi sampel cukup lama

39

40 dan cairan penyari yang digunakan lebih banyak. [30] Semakin halus ukuran simplisia maka keseimbangan maserasi semakin cepat tercapai. [28] Maserasi dilakukan dengan cara merendam sebanyak 1 kg serbuk simplisia daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. di dalam bejana kaca maserasi menggunakan pelarut metanol yang telah di destilasi (diuapkan) sehingga tidak memberikan hasil positif palsu pada uji yang dilakukan karena toksisitas pelarut itu sendiri.[38] Dilakukan beberapa kali pengadukan pada suhu kamar untuk meratakan konsentrasi larutan di luar serbuk simplisia. Penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif sehingga zat aktif menjadi larut karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan di dalam dan di luar sel. Larutan yang lebih pekat akan terdesak ke luar sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di dalam dan di luar sel. [42] Bejana kaca maserasi harus tertutup sempurna agar cairan penyari tidak menguap sehingga penyarian dapat maksimal[42] dan terlindung dari cahaya untuk mencegah reaksi yang dikatalisis cahaya atau terjadi perubahan warna.[34] Ekstrak kental metanol daun Phaleria macrocarpa diperoleh dari filtrat yang dipekatkan menggunakan rotatory evaporator, lalu dituang ke dalam cawan penguap dan diuapkan di dalam oven untuk menghilangkan pelarut yang masih tersisa sehingga diperoleh ekstrak kental dengan konsentrasi 100%. [33] Ampas hasil ekstraksi di remaserasi sehingga diperoleh filtrat ke-2, dst.[37] Sampel terekstraksi sempurna jika warna cairan penyari menjadi bening kembali. [33] Ekstrak kental metanol daun Phaleria macrocarpa yang diperoleh dari 5 kali proses maserasi sebanyak 169,7650 g. Pada penelitian ini tidak dilakukan uji parameter susut pengeringan, kadar air dan kadar abu. Pengukuran susut pengeringan untuk memberikan batasan maksimal (rentang) besarnya senyawa yang hilang pada proses pengeringan. Pengukuran kadar air untuk memberikan batasan minimal (rentang) besarnya kandungan air di dalam bahan. Pengukuran kadar abu untuk memberikan gambaran kandungan mineral internal dan eksternal dari proses awal pembuatan ekstrak hingga ekstrak terbentuk.[29]

41

2.6. Uji Toksisitas Akut Dengan Metode BSLT Penelitian ini menggunakan hewan uji larva Artemia salina Leach yang berusia 48 jam karena memiliki saluran pencernaan yang sudah terbentuk lengkap sehingga sensitif terhadap suatu zat yang dimasukkan[42] dan larva Artemia salina identik dengan sel kanker yang membelah secara mitosis. [26] Artemia salina memiliki respon yang sama dengan mamalia sehingga senyawa maupun ekstrak yang memiliki aktivitas pada sistem tersebut dapat terdeteksi, misalnya tipe DNA-dependent RNA polymerase pada Artemia salina serupa dengan ouabaine-sensitive Na+ dan K+ dependent ATPase pada mamalia (Solis et al., 1993). Proses penetasan telur menjadi larva membutuhkan aerasi menggunakan aerator sebagai sumber oksigen[42] dan lampu untuk merangsang proses penetasan sehingga larva bergerak menuju ruang terang karena larva bersifat fototaksis.[4] Untuk mencari nilai LC50 yang relatif tepat, perlu dipilih beberapa dosis yang mematikan sekitar 50%, lebih dari 50% (sekitar 90%) dan kurang dari 50% (sekitar 10%). Sering digunakan 4-5 kelompok dosis sehingga sekurang-kurangnya tiga dosis berada pada rentang dosis yang dapat mematikan 50% hewan uji.[27] Oleh karena itu, uji orientasi (trial) dilakukan terlebih dahulu untuk menentukan konsentrasi larutan uji yang akan digunakan. [34] Setelah dilakukan uji orientasi, diperoleh konsentrasi larutan uji yang digunakan pada penelitian yaitu 35 ppm, 25 ppm, 10 ppm dan 5 ppm serta satu kontrol negatif untuk menguji pengaruh lain di luar ekstrak uji seperti kondisi air laut yang menyebabkan kematian larva. Adanya penambahan 1 ml air laut pada larutan uji sehingga diperoleh konsentrasi ekstrak pada well plate yang berisi larva Artemia salina yang berubah menjadi setengah kalinya yaitu 17,5 ppm, 12,5 ppm, 5 ppm dan 2,5 ppm. Replikasi yang dilakukan sebanyak tiga kali pada setiap konsentrasi untuk mendapatkan data yang akurat dan baik.[4] Digunakan 10 larva untuk empat konsentrasi dan satu kontrol negatif sehingga total larva yang digunakan adalah 150 larva Artemia salina untuk setiap kali perlakuan. Walaupun larva Artemia salina dapat bertahan hidup di air dengan konsentrasi minimum oksigen <0,3 mg/l,[11] perlu diperhatikan cara pengambilan

42

larva pada saat ingin dimasukkan ke dalam well plate. Pada uji orientasi diperoleh kematian larva yang berbeda jauh antara well plate yang satu dengan well plate yang lain pada konsentrasi yang sama sehingga dapat memberikan hasil positif palsu pada uji yang dilakukan karena cara pengambilan larva itu sendiri. Hal ini terjadi karena larva kekurangan air laut akibat cara pengambilan larva yang salah, yaitu larva diambil dari wadah penampungan larva, lalu diletakkan di atas cawan penguap untuk diambil sebanyak 10 larva dengan mengurangi jumlah air laut menggunakan mikropipet hingga hanya terdapat larva saja yang mengakibatkan larva kekurangan oksigen. Selain itu, perhitungan kematian larva sebaiknya dilakukan oleh dua orang atau lebih untuk mendapatkan data kematian larva yang akurat. Total kematian dan persen kematian larva Artemia salina pada konsentrasi 17,5 ppm, 12,5 ppm, 5 ppm dan 2,5 ppm serta satu kontrol negatif ditunjukkan pada tabel 4.1 dan gambar 4.1. Tabel 4.1. Pengaruh berbagai konsentrasi ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. terhadap kematian larva Artemia salina Leach Konsentrasi (ppm)

Persen kematian (%)

0 2,5 5 12,5 17,5

Well plate 1 0 2 5 7 6

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Perlakuan Well Well plate 2 plate 3 0 0 2 1 5 2 6 7 9 9

Total kematian

Rata-rata kematian ± standar deviasi

Persen kematian (%)

0 5 12 20 24

0 1,66 ± 0,577 4 ± 1,732 6,66 ± 0,577 8 ± 1,732

0 16,66 40 66,66 80

80 66,66 40 Persen kematian (%) 16,66

2,5

5

12,5

17,5

Konsentrasi (ppm)

Gambar 4.1. Grafik pengaruh berbagai konsentrasi ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. terhadap kematian larva Artemia salina Leach

43

Berdasarkan tabel 4.1 dan gambar 4.1, diperoleh total kematian larva tertinggi terdapat pada konsentrasi 17,5 ppm, sedangkan total kematian larva terendah terdapat pada konsentrasi 2,5 ppm. Hal ini menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi ekstrak yang diberikan maka semakin tinggi pula total kematian larva yang menunjukkan semakin tinggi pula sifat toksiknya. [12] Setelah diperoleh persen kematian larva Artemia salina, selanjutnya dilakukan perhitungan nilai LC50 ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa (Tabel 4.2). Nilai LC50 dapat ditentukan menggunakan analisis probit yaitu menggunakan grafik probit log konsentrasi, perhitungan secara matematik (manual) [30] atau aplikasi seperti Microsoft Office Excel dan SPSS.[4] Tabel 4.2. Perhitungan nilai LC50 ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. menggunakan analisis probit Konsentrasi (ppm) 0 2,5 5 12,5 17,5 Jumlah (∑)

Log konsentrasi (X) 0 0,39 0,69 1,09 1,24 3,41

% mati

Probit (Y)

X2

Y2

XY

0 16,66 40 66,66 80

0 4,0299 4,7467 5,4289 5,8416 20,0471

0 0.0152 0,4761 1,1881 1,5376 3,217

0 16,2400 22,5311 29,4729 34,1242 102,3682

0 1,5716 3,2752 5,9175 7,2435 18,0007

Perhitungan nilai LC50 secara manual, yaitu:  Perhitungan nilai slope (m), menggunakan rumus: m = ∑(X)∑(Y) − n∑(XY) (∑(X))2 – n∑(X2) = (3,41) (20,0471) – 4 (18,0007) (3,41)2 – 4 (3,217) = 68,3606 – 72,0028 11,6281 – 12,868 = - 3,6421 -1,2399 = 2,9374

44  Perhitungan nilai intersept (b), menggunakan rumus: b = ∑(X)∑(XY) − ∑(X2)∑(Y) (∑(X))2 − n∑(X2) = (3,41) (18,0007) – (3,217) (20,0471) (3,41)2 – 4 (3,217) = 61,3823 – 64,4915 11,6281 – 12,868 = -3,1092 -1,2399 = 2,5076  Menentukan persamaan garis lurus hubungan antara nilai probit dengan log dosis (Y = mX + b) dengan memasukkan nilai 5 (nilai probit dari 50% kematian larva Artemia salina) pada nilai Y: Y = mX + b Y = 2,9374X + 2,5076 5 = 2,9374X + 2,5076 X = 5 – 2,5076 2,9374 = 2,4924 2,9374 = 0,8485  Nilai LC50 = Antilog X = antilog 0,8485 = 7,0550 ppm Untuk memastikan kebenaran perhitungan nilai LC50 secara manual, maka dilakukan perhitungan nilai LC50 menggunakan aplikasi Microsoft Office Excel dengan membuat persamaan garis lurus Y = mX + b. Pada gambar 4.2 terlihat slope coefficient (m) yang relatif tegak terhadap sumbu X. [6] Hal ini menunjukkan bahwa suatu zat relatif berbahaya jika zat tersebut membentuk kurva dosis-respon linier yang slopenya relatif tegak karena perubahan dosis yang kecil sudah dapat menimbulkan peningkatan respon toksik yang relatif besar. [27]

45

7 6

Y = 2,053X + 3,260 R² = 0,993

Nilai probit

5 4

−−−− Linier (Nilai probit)

3

♦

Nilai probit

2 1 0 0

0,5

1

1,5

Log konsentrasi

Gambar 4.2. Grafik regresi linier konsentrasi ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. terhadap nilai probit  Y = mX + b Y = 2,053X + 3,260 5 = 2,053X + 3,270 X = 5 – 3,270 2,053 = 1,73 2,053 = 0,8475  Nilai LC50 = Antilog X = Antilog 0,8475 = 7,0388 ppm Hasil perhitungan nilai LC50 secara manual dan menggunakan aplikasi Microsoft Office Excel diperoleh nilai LC50 ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa masing-masing yaitu 7,0550 ppm dan 7,0388 ppm. Hal ini menunjukkan bahwa tidak terdapat perbedaan nilai LC50 yang terlalu jauh bila menggunakan kedua metode perhitungan tersebut. Berdasarkan uji toksisitas akut ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) pada penelitian ini bersifat

46

toksik karena memiliki nilai LC50 <1000 ppm sehingga berpotensi sebagai antikanker.[34] Hal ini membuktikan penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Mae Sri Hartati Wahyuningsih yang memperoleh nilai LC50 ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa 63,16 ppm.[10] Namun penelitian ini memiliki perbedaan nilai LC50 yang cukup jauh dengan nilai LC50 yang dilakukan pada penelitian sebelumnya. Hal ini dapat terjadi karena berbagai faktor, yaitu: [29] a. Faktor biologi  Perbedaan lokasi asal tanaman yaitu lingkungan tumbuh (kualitas tanah, atmosfer) dimana tanaman berinteraksi berupa energi (cuaca, temperatur dan cahaya) dan materi (kadar air, senyawa organik dan anorganik).  Perbedaan periode pemanenan hasil tanaman.  Perbedaan usia dan bagian tanaman. b. Faktor kimia  Faktor internal yaitu jenis senyawa aktif dalam bahan, kadar total rata-rata senyawa aktif, komposisi kualitatif dan kuantitatif senyawa aktif.  Faktor eksternal yaitu ukuran, kekerasan dan kekeringan bahan serta pelarut yang digunakan. Selain berpotensi sebagai antikanker, ekstrak Phaleria macrocarpa juga memiliki

sejumlah

aktivitas

farmakologi

yaitu

sebagai

antihiperglikemia,

antiinflamasi, antidiare, antioksidan, antivirus, antibakteri, antijamur dan vasodilator. Berbagai kandungan kimia ditemukan pada bagian yang berbeda dari Phaleria macrocarpa yaitu mahkosida A, asam dodekanoik, asam palmitat, desasetil flavikordin A, flavikordin A, flavikordin D, flavikordin A glukosida, etil stearat, lignan, sukrosa, alkaloid, saponin, polifenolik, falerin, magniferin, ikarisida C, asam galat,

kaempferol,

mirisetin,

naringin,

rutin,

forboester

dan derivat

29-

norkukurbitasin. Kandungan kimia Phaleria macrocarpa yang berpotensi sebagai antikanker yaitu falerin dan asam galat.[9] Pada penelitian ini tidak dilakukan perbandingan aktivitas sitotoksik ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa dengan obat antikanker seperti metotreksat

47

sebagai kontrol positif dengan metode BSLT. Tujuan dilakukannya uji terhadap kontrol positif, yaitu:  Untuk mengetahui perbandingan aktivitas sitotoksik ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa dengan obat antikanker.  Untuk mengetahui perbandingan persentase kematian larva Artemia salina setelah pemberian ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa dan obat antikanker.  Untuk mengetahui perbandingan nilai LC50 ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa dengan obat antikanker.

BAB 5 SIMPULAN DAN SARAN

5.1. Simpulan Ekstrak metanol daun mahkota dewa (Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl.) memiliki potensi toksisitas akut terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) karena memiliki nilai LC50 <1000 ppm yaitu masing-masing 7,0550 ppm dan 7,0388 ppm berdasarkan perhitungan nilai LC50 secara manual dan aplikasi Microsoft Office Excel. 5.2. Saran 1. Dilakukan uji parameter susut pengeringan, kadar air dan kadar abu. 2. Perlu diperhatikan cara pengambilan larva pada saat ingin dimasukkan ke dalam well plate sehingga tidak memberikan hasil positif palsu pada uji karena cara pengambilan larva itu sendiri. 3. Perhitungan kematian larva dilakukan oleh dua orang atau lebih. 4. Dilakukan perbandingan aktivitas sitotoksik ekstrak metanol daun mahkota dewa (Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. dengan obat antikanker seperti metotreksat sebagai kontrol positif. 5. Dilakukan uji toksisitas akut ekstrak daun mahkota dewa (Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode BSLT menggunakan pelarut seperti DMSO (dimetil sulfoksida), Tween 20, dll.

48

49

DAFTAR PUSTAKA

1.

WHO. Cancer [Internet]. [updated 2014 Feb; cited 2014 Feb 18]. Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/

2.

Depkes. [Internet]. 2012 June 3

[cited 2014 Feb 18]. Available from:

http://www.depkes.go.id/index.php?vw=2&id=1937 3.

Purwantini I, Setyowati EP, Hertiani T. Uji toksisitas ekstrak etanol: Buah, biji, daun makutadewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.) terhadap Artemia salina Leach dan profil kromatografi lapis tipis ekstrak aktif. Majalah Farmasi Indonesia. 2002; 13(2): 101-106.

4.

Ajrina A. Uji toksisitas akut ekstrak metanol daun Garcinia bethami Pierre terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode brine shrimp lethality test (bslt) [Minithesis]. Jakarta: UIN Syarif Hidayatullah Jakarta; 2013.

5.

Rizqillah N. Uji toksisitas akut ekstrak n-heksan daun Garcinia benthami Pierre terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode brine shrimp lethality test (bslt) [Minithesis]. Jakarta: UIN Syarif Hidayatullah Jakarta; 2013.

6.

Regresi linier sederhana [Internet]. [cited 2014 Aug 4]. Available from: http://www.fp.unud.ac.id/ind/wpcontent/uploads/mk_ps_agribisnis/ekonomitrika/2_.%20%20Analisis%20Regres i%20Linier%20Sederhana.pdf

7.

Institute of Medicine of The National Academies. Complementary and alternative medicine in the United States. Washington: The National Academies Press; 2005.

8.

Cancer Research UK. Herbal medicine [Internet]. [updated 2013 Jan 25; cited 2013

Dec

7].

Available

from:

http://www.cancerresearchuk.org/cancer-

help/about-cancer/treatment/complementary-alternative/therapies/herbalmedicine 9.

Altaf R, Asmawi MZ, Dewa A, Sadikun A, Umar MI. Phytochemistry and medicinal properties of Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl. extracts. Pharmacognosy Review. 2013; 7(13): 73-80. doi: 10.4103/0973-7847.112853.

50

10. Wahyuningsih MSH, Mubarika S, Gandjar IG, Hamann MT, Rao K, Wahyuono S. Phalerin, glukosida benzofenon baru diisolasi dari ekstrak metanolik daun mahkota dewa [Phaleria macrocarpa (Scheff). Boerl.]. Majalah Farmasi Indonesia. 2005; 16(1): 51-57. 11. Dumitrascu M. Artemia salina. Balneo Research Journal. 2011; 29(4): 119-122. 12. Aprilia HA, Pringgenie D, Yudiati E. Uji toksisitas ekstrak kloroform cangkang dan duri landak (Diadema setosum) terhadap mortalitas nauplius Artemia sp. Journal of Marine Research. 2012; 1(1): 75-83. 13. Dewoto HR. 2007. Pengembangan obat tradisional Indonesia menjadi fitofarmaka. Majalah Kedokteran Indonesia. 2007 July; 57(7): 205-211. 14. Benzie IFF, Wachtel-Galor S. Herbal medicine: Biomolecular and clinical aspects. 2nd ed. Boca Raton: CRC Press; 2011. Chapter 1, Herbal medicine: An introduction to its history, usage, regulation, current trends, and research need. 15. WHO. WHO traditional medicine strategy 2002-2005. Geneva: WHO; 2002. 16. Depkes. Saintifikasi jamu dalam penelitian berbasis pelayanan kesehatan [Internet].

[cited

2014

Feb

20].

Available

from:

http://www.hukor.depkes.go.id/up_prod_permenkes/PMK%20No.003%20ttg%2 0Saintifikasi%20Jamu%20Dalam%20Penelitian%20Berbasis%20Pelayanan%20 Kesehatan.pdf 17. WHO. Traditional medicine in Republic of Indonesia [Internet]. [cited 2014 Feb 20].

Available

from:

http://herbalnet.healthrepository.org/bitstream/123456789/2288/4/03-p.2336.pdf 18. Depkes. Kebijakan obat tradisional Indonesia [Internet]. [cited 2014 Feb 20]. Available

from:

http://www.depkes.go.id/downloads/Kepmenkes/KEPMENKES%203812007%20KEBIJAKAN%20OBAT%20TRADISIONAL.pdf 19. Sugiwati S. 2005. Aktivitas antihiperglikemik dari ekstrak buah mahkota dewa [Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.] sebagai inhibitor alfa-glukosidase in vitro dan in vivo pada tikus putih [Thesis]. Bogor: Institut Pertanian Bogor; 2005.

51

20. Dewanti T, Wulan SN, Indira NC. Aktivitas antioksidan dan antibakteri produk kering, instan dan effervescent dari buah mahkota dewa [Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl]. Jurnal Teknologi Pertanian. 2005 Apr; 6(1): 29-36. 21. Atiqah SN, Basar N, Bohari SP. Cytotoxic activity of major compounds from Phaleria Macrocarpa (Scheff.) Boerl. fruits. Jurnal Teknologi. 2013 Sept 29; 64(2): 53-56. 22. Widowati L. Kajian hasil penelitian mahkota dewa. Jurnal Bahan Alam Indonesia. 2005 Jan; 4(1): 223-227. 23. Vincent K. Probit analysis [Internet]. [cited 2014 July 26]. Available from: http://userwww.sfsu.edu/efc/classes/biol710/probit/ProbitAnalysis.pdf 24. Fenton JJ. Toxicology: A case-oriented approach. Taylor and Francis; 2001. 25. Croghan PC. The osmotic and ionic regulation of Artemia salina. Journal of Experimental Biology. 1957 July 10; 35: 219-233. 26. Kurniawan H. Uji toksisitas akut ekstrak metanol daun kesum (Plygonum minus Huds) terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode brine shrimp lethality test (bslt) [Minithesis]. Pontianak: Universitas Tanjungpura; 2009. 27. Priyanto. Toksikologi: Mekanisme, terapi antidotum dan penilaian risiko. Depok: Lembaga Studi dan Konsultasi Farmakologi Indonesia; 2009. 28. Agoes G. Teknologi bahan alam. Bandung: Institut Teknologi Bandung; 2007. 29. Depkes. Parameter standar umum ekstrak tumbuhan obat. Jakarta: Depkes; 2000. 30. Aras TR. Uji toksisitas ekstrak teripang Holothuria scabra terhadap Artemia salina [Minithesis]. Makassar: Universitas Hassanudin; 2013. 31. Geethaa S, Thavamany PJ, Chiew SP, Thong OM. Interference from ordinarily used solvents in the outcomes of Artemia salina lethality test. Journal of Advanced Pharmaceutical Technology and Research. 2013 Oct-Dec; 4(4): 179– 182. doi: 10.4103/2231-4040.121411. 32. Sriwahyuni I. Uji fitokimia ekstrak tanaman anting-anting (Acalypha indica Linn) dengan variasi pelarut dan uji toksisitas menggunakan brine shrimp (Artemia salina Leach) [Minithesis]. Malang: UIN Maulana Malik Ibrahim; 2010.

52

33. Cahyadi R. Semarang. 2009. Uji toksisitas akut ekstrak etanol buah pare (Momordica charantia L.) terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode brine shrimp lethality test (bst) [Minithesis]. Semarang: Universitas Diponegoro; 2009. 34. Hendrawati AR. Uji toksisitas akut ekstrak etanol daun kemangi (Ocimum sanctum Linn.) terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode brine shrimp lethality test (bst) [Minithesis]. Semarang: Universitas Diponegoro; 2009. 35. Lisdawati V, Wiryowidagdo S, Kardono LB. Brine shrimp lethality test (bslt) dari berbagai fraksi ekstrak daging buah dan kulit biji mahkota dewa (Phaleria macrocarpa). Buletin Penelitian Kesehatan. 2006; 34(3): 111-118. 36. Canadian Centre for Occupational Health and Safety. What is a LD 50 and LC50 ? [Internet]. [updated 2013 Aug 28; cited 2014 Mar 1]. Available from: http://www.ccohs.ca/oshanswers/chemicals/ld50.html#_1_2 37. Ramdhini RN. Uji toksisitas terhadap Artemia salina Leach dan toksisitas akut komponen bioaktif Pandanus conoideus var. conoideus Lam. sebagai kandidat antikanker [Minithesis]. Surakarta: Universitas Sebelas Maret; 2010. 38. Wu C. An important player in brine shrimp lethality bioassay: The solvent. Journal of Advanced Pharmaceutical Technology and Research. 2014 Jan-Mar; 5(1): 57-58. 39. Hikmah MN, Zuliyana. Pembuatan metil ester (biodiesel) dari minyak dedak dan metanol dengan proses esterifikasi dan transesterifikasi [Minithesis]. Semarang: Universitas Diponegoro; 2010. 40. Methanex. Material safety data shet [Internet]. [cited 2014 July 22]. Available from: http://www.cen.iitb.ac.in/inventory/Chemical-MSDS/28_methanol.pdf 41. Keracunan akibat penyalahgunaan metanol [Internet]. [cited 2014 July 22]. Available

from:

http://www2.pom.go.id/public/siker/desc/produk/racunsalahmeta.pdf 42. Panjaitan RB. Uji toksisitas akut ekstrak kulit batang pulasari (Alyxiae cortex) dengan metode brine shrimp lethality test [Minithesis]. Yogyakarta: Universitas Sanata Dharma; 2011.

53

43. Kurniawan A. Aktivitas antioksidan dan potensi hayati dari kombinasi ekstrak empat jenis tanaman obat Indonesia [Minithesis]. Bogor: Institut Pertanian Bogor; 2011. 44. Diah SH. Pembenihan udang galah Macrobrahium rosenbergi de Man. Bandung: Institut Teknologi Bandung; 1991.

54

LAMPIRAN

Lampiran 1 Perhitungan konsentrasi ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. 1. Pembuatan larutan induk 20000 ppm, menggunakan rumus: Konsentrasi= Ekstrak metanol daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl. (µg) Volume aquades (ml) = 2000 mg 100 ml

= 2000000 µg 100 ml = 20000 µg/ml = 20000 ppm 2. Pembuatan larutan uji dengan konsentrasi 35 ppm, 25 ppm, 5 ppm dan 2,5 ppm menggunakan rumus pengenceran: V1M1 = V2M2 Keterangan:  VI: Volume awal  V2: Volume akhir  M1: Konsentrasi awal  M2: Konsentrasi akhir

a. Konsentrasi 35 ppm 20000 µg/ml x V1 = 35 µg/ml x 20 ml V1 =

700 µg 20000 µg/ml

= 0,035 ml = 35 µg/ml = 35 ppm

55

(lanjutan) Jadi, 35 ppm diambil dari konsentrasi 20000 ppm. b. Konsentrasi 25 ppm 35 µg/ml x V1 = 25 µg/ml x 4 ml V1 = 100 µg 35 µg/ml = 2,8571 ml = 2857,1 µg/ml = 2857,1 ppm Jadi, 2857,1 ppm diambil dari konsentrasi 35 ppm. c. Konsentrasi 10 ppm 35 µg/ml x V1 = 10 µg/ml x 4 ml V1 = 40 µg 35 µg/ml = 1,1428 ml = 1142,8 µg/ml = 1142,8 ppm Jadi, 1142,8 ppm diambil dari konsentrasi 35 ppm. d. Konsentrasi 5 ppm 35 µg/ml x V1 = 5 µg/ml x 4 ml V1 = 20 µg 35 µg/ml = 0,5714 ml = 571,4 µg/ml = 571,4 ppm Jadi, 571,4 ppm diambil dari konsentrasi 35 ppm.

56

Lampiran 2 Hasil determinasi tanaman

Gambar 6.1. Hasil determinasi daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl.

57

Lampiran 3 Proses penelitian

Gambar 6.2. Sebanyak 1 kg serbuk

Gambar 6.3. Telur Artemia salina Leach

simplisia halus daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl.

Gambar 6.4. Destilasi pelarut metanol

Gambar 6.5. Maserasi menggunakan pelarut metanol

58

(lanjutan)

Gambar 6.7. Evaporasi menggunakan rotatory evaporator Gambar 6.6. Filtrat yang dipisahkan dari ampasnya

Gambar 6.8. Sebanyak 169,7650 g

Gambar 6.9. Sebanyak 2000 mg ekstrak

ekstrak kental metanol daun Phaleria

kental daun Phaleria macrocarpa

macrocarpa [Scheff.] Boerl.

[Scheff.] Boerl. ditimbang menggunakan neraca analitik

59

(lanjutan)

Gambar 6.11. Larutan uji konsentrasi 35 ppm, 25 ppm, 10 ppm dan 5 ppm ekstrak Gambar 6.10. Larutan induk konsentrasi 20000 ppm dihomogenkan menggunakan

metanol daun Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl.

hot plate stirrer

Gambar 6.13. Penetasan larva Artemia salina Leach Gambar 6.12. Mengukur pH air laut menggunakan pH indicator paper

60

(lanjutan)

Gambar 6.14. Hasil uji toksisitas akut dengan metode BSLT Gambar 6.15. Menghitung kematian larva menggunakan digital colony counter

Gambar 6.16. Hasil determinasi larva Artemia salina Leach menggunakan mikroskop dengan perbesaran 10 x 10

61

Lampiran 4 Tabel probit Tabel 6.1. Tabel transformasi persen-probit % 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44

0,0 2,6737 2,9463 3,1192 3,2493 3,3351 3,4452 3,5242 3,5949 3,6692 3,7184 3,7735 3,8250 3,8736 3,9197 3,9636 4,0055 4,0458 4,0846 4,1221 4,1684 4,1936 4,2278 4,2612 4,2837 4,3255 4,3567 4,3872 4,4172 4,4466 4,4756 4,5041 4,5323 4,5601 4,5875 4,6147 4,6415 4,6681 4,6945 4,7207 4,7467 4,7725 4,7981 4,8230 4,8490

0,1 1,0098 2,7096 2,9665 3,1337 3,2608 3,3668 3,4536 3,5316 3,6016 3,6654 3,7241 3,7784 3,8300 3,8783 3,9242 3,9678 4,0096 4,0408 4,0884 4,1258 4,1019 4,1970 4,2312 4,2644 4,2969 4,3287 4,3597 4,3902 4,4201 4,4405 4,4785 4,5070 4,5351 4,5628 4,5903 4,6174 4,6442 4,6708 4,6971 4,7233 4,7402 4,7750 4,8007 4,8202 4,8516

0,2 2,1218 2,7429 2,9859 3,1478 3,2721 3,3742 3,4618 3,5380 3,6016 3,6715 3,7298 3,7840 3,8350 3,8830 3,9286 3,9721 4,0137 4,0537 4,0960 4,1331 4,1035 4,2005 4,2345 4,2677 4,3001 4,3318 4,3628 4,3932 4,4231 4,4524 4,4813 4,5098 4,5370 4,5656 4,5930 4,6201 4,6469 4,6734 4,6998 4,7259 4,7518 4,7776 4,8032 4,8287 4,8541

0,3 2,2522 2,7738 3,0646 3,1616 3,2831 3,3836 3,4694 3,5462 3,6148 3,6775 3,7354 3,7893 3,8399 3,8877 3,9331 3,9763 4,0178 4,0576 4,0960 4,1331 4,1690 4,2039 4,2379 4,2710 4,3033 4,3349 4,3659 4,3962 4,4260 4,4554 4,4842 4,5126 4,5407 4,5684 4,5957 4,6228 4,6495 4,6761 4,7024 4,7285 4,7544 4,7802 4,8058 4,8313 4,8566

0,4 2,3479 2,8027 3,0226 3,1750 3,2940 3,3028 3,4780 3,5534 3,6213 3,6835 3,7409 3,7945 3,8448 3,8923 3,9375 3,9800 4,0218 4,0615 4,0998 4,1367 4,1726 4,2074 4,2412 4,2743 4,3065 4,3380 4,3689 4,3992 4,4290 4,4583 4,4871 4,5155 4,5435 4,5711 4,5984 4,6255 4,6522 4,6787 4,7050 4,7311 4,7570 4,7827 4,8083 4,8338 4,8592

0,5 2,4242 2,8299 3,0400 3,1881 3,3046 3,4018 3,4850 3,5605 3,6278 3,6894 3,7464 3,7996 3,8497 3,8969 3,9419 3,9848 4,0259 4,0693 4,1035 4,1404 4,1761 4,2108 4,2446 4,2775 4,3097 4,3412 4,3720 4,4022 4,4319 4,4612 4,4899 4,5183 4,5462 4,5739 4,6011 4,6281 4,6549 4,6814 4,7078 4,7337 4,7595 4,7853 4,8109 4,8363 4,8617

0,6 2,4879 2,8556 3,0569 3,2009 3,3151 3,4107 3,4937 3,5675 3,6342 3,6953 3,7519 3,8048 3,8545 3,9015 3,9463 3,9890 4,0299 4,0693 4,1073 4,1440 4,1796 4,2142 4,2479 4,2808 4,3129 4,3443 4,3750 4,4052 4,4349 4,4641 4,4928 4,5211 4,5490 4,5766 4,6039 4,6308 4,6575 4,6840 4,7102 4,7363 4,7622 4,7879 4,8134 4,8389 4,8642

0,7 2,5427 2,8799 3,0732 3,2134 3,3253 3,4195 3,5015 3,5745 3,6405 3,7012 3,7574 3,8099 3,8503 3,9061 3,9506 3,9931 4,0339 4,0731 4,1110 4,1476 4,1831 4,2176 4,2512 4,2840 4,3160 4,3474 4,3781 4,4082 4,4378 4,4670 4,4956 4,5239 4,5518 4,5793 4,6066 4,6335 4,6602 4,6866 4,7129 4,7389 4,7647 4,7904 4,8160 4,8414 4,8668

0,8 2,5914 2,3031 3,0896 3,2256 3,3354 3,4282 3,5091 3,5813 3,6408 3,7070 3,7628 3,8150 3,8641 3,9107 3,9550 3,9973 4,0379 4,0770 4,1147 4,1512 4,1866 4,2210 4,2546 4,2872 4,3192 4,3505 4,3811 4,4112 4,4408 4,4698 4,4985 4,5267 4,5546 4,5821 4,6093 4,6362 4,6628 4,6893 4,7155 4,7415 4,7673 4,7930 4,8185 4,8440 4,8693

0,9 2,6344 2,9251 3,1043 3,2376 3,3454 3,4368 3,5167 3,5882 3,6427 3,7127 3,7681 3,8200 2,8689 3,9152 2,9593 4,0014 4,0410 4,0808 4,1184 4,1548 4,1901 4,2244 4,2579 4,2905 4,3224 4,3536 4,3842 4,4142 4,4437 4,4727 4,5013 4,5295 4,5573 4,5848 4,6120 4,6389 4,6655 4,6919 4,7181 4,7441 4,7699 4,7955 4,8211 4,8465 4,8718

62

(lanjutan) 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94

4,8743 4,8996 4,9247 4,9408 4,9740 5,0000 5,0251 5,0502 5,0753 5,1004 5,1257 5,1510 5,1764 5,2019 5,2275 5,2533 5,2793 5,3055 5,3319 5,3585 5,3853 5,4125 5,4399 5,4677 5,4959 5,5244 5,5534 5,5828 5,6128 5,6435 5,6745 5,7083 5,7388 5,7722 5,8834 5,8416 5,8779 5,9154 5,9542 5,9945 6,0634 6,0803 6,1264 6,1750 6,2205 6,2816 6,3408 6,4031 6,4758 6,8548

4,8769 4,9021 4,9272 4,9524 4,9774 5,0025 5,0276 5,0527 5,0778 5,1030 5,1282 5,1535 5,1789 5,2045 5,2301 5,2359 5,2819 5,3081 5,3345 5,3811 5.3380 5.4152 5.4427 5,4705 5,4987 5,5273 5,5563 5,5858 5,6158 5,6464 5,6776 5,7095 5,7424 5,7756 5,8099 5,8452 5,8816 5,9192 5,9581 5,9986 6,0407 6,0818 6,1311 6,1800 6,2319 6,2873 6,3469 6,4118 6,4833 6,5623

4,8704 4,9046 4,9298 4,9549 4,9799 5,0050 5,0301 5,0552 5.0803 5,1055 5,1307 5,1560 5,1815 5,2070 5,2327 5,2585 5,2845 5,3107 5,3372 5,3638 5,8007 5,4170 5,4454 5,4733 5,5015 5,5302 5,5592 5,5888 5,6189 5,6405 5,6808 5,7128 5,7454 5,7796 5,8134 5,8488 5,8853 5,9230 5,9624 6,0027 6,0450 6,0893 6,1359 6,1856 6,2372 6,2936 6,3532 6,4187 6,4909 6,5718

4,8819 4,9971 4,9323 4,9574 4,9825 5,0075 5,0326 5,0077 5,0828 5,1080 5,1332 5,1586 5,1840 5,2096 5,2353 5,2611 5,2871 5,3134 5,3398 5,3665 5,3934 5,4207 5,4482 5,4761 5,5044 5,5330 5,5622 5,5918 5,6219 5,6526 5,6840 5,7160 5,7488 5,7824 5,8169 5,8524 5,8890 5,9269 5,9661 6,0069 6,0494 6,0939 6,1407 6,1901 6,2426 6,2988 6,3595 6,4255 6,4985 6,5805

4,8844 4,9996 4,9348 4,9599 4,9850 5,0100 5,0351 5,0602 5,0853 5,1105 5,1358 5,1614 5,1866 5,2121 5,2378 5,2637 5,2808 5,3160 5,3425 5,3692 5,3961 5,4234 5.4510 5,4780 5,5072 5,5350 5,5651 5,5948 5,6250 5,6557 5,6871 5,7192 5,7521 5,7858 5,8204 5,8560 5,8927 5,9307 5,9701 6,0110 6,0537 6,0985 6,1455 6,1952 6,2481 6,3047 6,3658 6,4325 6,5063 6,5893

4,8870 4,9122 4,9373 4,9624 3,9876 5,0125 5,0376 5,0627 5,0878 5,1130 5,1383 5,1637 5,1801 5,2147 5,2404 5,2663 5,2024 5,3186 5,3451 5,3719 5,3980 5,4261 5,4538 5,4817 5,5101 5,5388 5,5681 5,5978 5,6280 5,6588 5,6903 5,7225 5,7554 5,7892 5,8239 5,8596 5,8965 5,9346 5,9741 6,0152 6,0581 6,1031 6,1503 6,2004 6,2536 6,3106 6,3722 6,4395 6,5141 6,5982

4,8895 4,9147 4,9308 4,9649 4,9900 5,0150 5,0401 5,0652 5,0904 5,1156 5,1408 5,1662 5,1917 5,2173 5,2430 5,2689 5,2050 5,3213 5,3478 5,3475 5,4016 5,4289 5,4565 5,4845 5,5129 5,5417 5,5710 5,6008 5,6311 5,6620 5,6935 5,7257 5,7588 5,7926 5,8274 5,8633 5,9002 5,9386 5,9782 6,0194 6,0625 6,1077 6,1552 6,2055 6,2591 6,3165 6,3787 6,4466 6,5220 6,6078

4,8920 4,9172 4,9423 4,9674 4,9925 5,0175 5,0426 5,0677 5,0929 5,1181 5,1434 5,1687 5,1942 5,2198 5,2468 5,2715 5,2976 5,3239 5,3505 5,3772 4,4043 5,4316 5,4593 5,4874 5,5158 5,5446 5,5740 5,6038 5,6341 5,6651 5,6967 5,7200 5,7621 5,7961 5,8310 5,8669 5,9040 5,9424 5,9822 6,0237 6,0669 6,1123 6,1601 6,2107 6,2646 6,3225 6,3852 6,4538 6,5201 6,6164

4,8945 4,9197 4,9448 4,9699 4,9950 5,0201 5,0451 5,0702 5,0954 5,1206 5,1459 5,1713 5,1968 5,2224 5,2482 5,2741 5,3002 5,3266 5,3531 5,3799 5,4070 5,4344 5,4621 5,4002 5,5187 5,5476 5,5760 5,6068 5,6372 5.6682 5,6998 5,7323 5,7666 5,7995 5,8345 5,8705 5,9078 5,9463 5,9863 6,0279 6,0714 6,1170 6,1650 6,2160 6,2702 6,3285 6,3917 6,4611 6,5382 6,6258

4,8970 4,9222 4,9473 4,9724 4,9975 5,0226 5,0476 5,0728 5,0729 5,1231 5,1484 5,1738 5,1993 5,2250 5,2508 5,2767 5,3029 5,3202 5,2658 5,3826 5,4087 5,4372 5,4649 5,4930 5,3215 5,6505 5,5799 5,6098 5,6403 5,6713 5,7031 5,7356 5,7688 5,8030 5,8381 5,8742 5,9116 5,9502 5,9904 6,0322 6,0758 6,1217 6,1700 6,2212 6,2750 6,3346 6,3984 6,4684 6,5464 6,6352

63

(lanjutan)

95 96 97

98,0 98,1 98,2 98,3 98,4 98,5 98,6 98,7 98,8 98,9 99,0 99,1 99,2 99,3 99,4 99,5 99,6 99,7 99,8 99,9

6,6849 105 6,7991

6,6449 97 6,7507 117 6,8808 140

6,6546 100 6,7624 120 6,8957 153

6,6646 101 6,7784 122 6,9110 158

6,6747 102 6,7608 125 6,9268 103

6,6954 106 6,8119 131 6,9600 174

6,7060 109 6,8260 134 6,9774 180

6,7169 109 6,8260 134 6,9954 187

6,7297 113 6,8522 141 7,0141 194

6,7302 116 6,8663 145 7,0335 202

7,0537 7,0749 7,0969 7,1204 7,1444 7,1701 7,1973 7,2262 7,2374 7,2904 7,3263 7,3656 7,4059 7,4373 7,5121 7,5758 7,6521 7,7478 7,8782 8,0902

7,0558 7,0770 7,0992 7,1224 7,1469 7,1727 7,2001 7,2292 7,2663 7,2938 7,3301 7,3698 7,4135 7,4624 7,5181 7,5828 7,6606 7,7589 7,8943 8,1214

7,0579 7,0792 7,1015 7,1248 7,1494 7,1754 7,2029 7,2322 7,2636 7,2973 7,3339 7,3739 7,4181 7,4677 7,5241 7,5890 7,6693 7,7703 7,9112 8,1550

169 7,0660 7,0621 7,0612 7,0814 7,0836 7,0858 7,1038 7,1061 7,1084 7,1272 7,1297 7,1321 7,1520 7,1545 7,1571 7,1781 7,1808 7,1835 7,2058 7,2086 7,2115 7,2353 7,2383 7,2414 7,2668 7,701 7,2734 7,3009 7,3044 7,3080 7,3378 7,3416 7,3455 7,3781 7,3824 7,3867 7,4228 7,4276 7,4324 7,4730 7,4783 7,4838 7,5302 7,5364 7,5427 7,5972 7,6045 7,6121 7,6783 7,6874 7,6968 7,7822 7,7944 7,8070 7,9299 7,9478 7,9677 8,1847 8,2380 8,2905 Sumber: Priyanto, 2009

7,0663 7,0880 7,1107 7,1345 7,1996 7,1862 7,2144 7,2445 7,2768 7,3116 7,3495 7,3911 7,4372 7,4893 7,5401 7,6107 7,7065 7,8202 7,9889 8,3528

7,0684 7,0902 7,1130 7,1370 7,1622 7,1890 7,2173 7,2476 7,2801 7,3152 7,3535 7,3954 7,4422 7,4940 7,5550 7,6276 7,7104 7,8338 8,0115 8,4316

7,0706 7,0924 7,1154 7,1384 7,1648 7,1917 7,2203 7,2508 7,2835 7,3189 7,3575 7,3999 7,4474 7,5006 7,5622 7,6356 7,7266 7,8480 8,0357 8,5401

7,0727 7,0947 7,1177 7,1419 7,1675 7,1945 7,2232 7,2539 7,2869 7,3226 7,3615 7,4044 7,4522 7,5063 7,5690 7,6437 7,7370 7,8027 8,0618 8,7190

128 6,9431

64

Lampiran 5 Daftar riwayat hidup Nama

: Feby Wulandari

Jenis kelamin

: Perempuan

Tempat, tanggal lahir : Rawa Bening, 17 Maret 1993 Agama

: Islam

Alamat

: Jalan Kampung Rawa Sawah No.1 RT.014/ RW.002, Kecamatan/ Kelurahan Johar Baru, Jakarta Pusat

No. HP

: +6281296089373

Email

: [email protected] atau [email protected]

Riwayat pendidikan : 1. TK „Aisyiyah Bustanul Athfal Rawa Bening (1997 - 1999) 2. SD Muhammadiyah Rawa Bening (1999 - 2001) 3. SDN Tanah Tinggi 10 Petang (2001 - 2005) 4. MTs Negeri 9 Jakarta (2005 - 2008) 5. MAN 3 Jakarta (2008 - 2011) 6. PSPD FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta (2011 - sekarang)