4.3.6. Vyšetření mozkomíšního moku Mozkomíšní mok (likvor, anglicky cerebrospinal fluid - zkratka CSF) je čirá, bezbarvá tekutina, vyskytující se v mozkových komorách , cisternách a v subarachnoidálních prostorech mozku a míchy. Objem CSF je u dospělého člověka 120 – 180 ml (u kojenců 40 – 60 ml) . Za 24 hodin se vytvoří 430-580 ml mozkomíšního moku s hustotou 1006 – 1009 kg . m-3. Ze 30 – 45 % se jedná o ultrafiltrát krevní plasmy a proto se většina analytů v likvoru porovnává s jejich hladinami v krvi. Funkce mozkomíšního moku Funkcí mozkomíšního moku je zajišťovat fyzikální ochranu mozku a míchy, udržovat konstantní nitrolební tlak, transportovat různé biomolekuly do mozku a odtud pak odstraňovat metabolity (CO2, laktát). Nezanedbatelná je i obrana vůči patogenním mikroorganismům. Odběr mozkomíšního moku: Mozkomíšní mok se získává pomocí lumbální punkce. K odběru se používá jehla s mandrénem.
Odběr likvoru Lumbální punkce
Místo vpichu je na spojnici vrcholů kostí kyčelních a křížení s páteří v místě L4
Mozkomíšní mok se zachytává do sterilních zkumavek. Množství odebraného likvoru u dospělého by mělo být do 10 – 15 ml. U dětí je minimální množství 0,5 ml. Při podezření na krvácení do likvorových cest se odebírá do tří zkumavek (u krvácení, které vzniklo náhodně při odběru, dochází k odbarvování tekutiny). Indikace vyšetření mozkomíšního moku: Vyšetření se provádí při podezření na akutní neuroinfekci (meningitidu, encefalitidu), subarachnoidální krvácení, které se nepodařilo prokázat pomocí zobrazovacích metod (počítačové tomografie nebo magnetická resonance), a při podezření na maligní infiltraci do
centrálního nervového systému (CNS). Dále se vyšetření mozkomíšního moku provádí u chronických zánětlivých onemocnění CNS a některých degenerativních onemocnění. Zpracování mozkomíšního moku: Po přijetí do laboratoře se likvor označí a provede se zápis o příjmu. Zápis musí obsahovat identifikaci pacienta (spolu s číselnou diagnózou a kódem zdravotní pojišťovny), identifikaci odesílajícího lékaře a čas příjmu likvoru do laboratoře. Dále je vhodné zaznamenat do knihy eventuelní manipulaci s mozkomíšním mokem (zda byl materiál odeslán i na jiná pracoviště), jestli byl do laboratoře dodán pouze likvor nebo likvor a krev (eventuelně nesrážlivá krev k vyšetření laktátu). Část likvoru se stočí pro biochemická vyšetření, část zůstává v nativním stavu pro cytologii. Základní vyšetření mozkomíšního moku Fyzikální vyšetření Fyzikálním vyšetřením se rozumí posouzení vzhledu a barvy mozkomíšního moku. Normální likvor je tekutina čirá, bezbarvá. Při krvácení do likvorových cest či při artificiální příměsi je likvor krvavý (sangvinolentrní), po starém krvácení je nažloutlý nebo žlutý (xantochromní). Zkalený likvor
bývá typicky u hnisavých neuroinfekcí, ale mírné zakalení vzorku může způsobit i bezvýznamná drobná příměs erytrocytů , přibližně do 1000 erytrocytů / 1 µl. Likvor tmavě hnědé barvy se označuje jako lakový . Vzniká při masivním krvácení do likvorových cest. Vzhled a barva se hodnotí před centrifugací a po centrifugaci. Základní biochemické vyšetření Celková bílkovina kvantitativně Analytické postupy: fotometrie , nefelometrie, turbidimetrie. Orientační referenční rozmezí: novorozenci do 1 týdne < 1,25 g/l; 1 rok – 60 let < 0,45 g/l; u starších než 60 let < 0,66 g/l. Význam: bílkovina se zvyšuje u zánětů, krvácení do likvorových cest, při nádorové infiltraci mozkových obalů nebo při poruše hematolikvorové bariéry. Glukosa Analytické postupy: fotometrie, ampérometrie s Clarkovou elektrodou. Referenční rozmezí: 2,2 – 4,2 mmol/l (měla by být vyšší než 40 % koncentrace v séru).
Význam: glukosa se snižuje zejména u purulentních (hnisavých) zánětů CNS. V iniciálním stadiu může dosahovat až nulových hodnot. Nižší hodnoty nalézáme také u krvácení do likvorových cest. Rovněž při hypoglykémii jsou hodnoty likvorové glukosy snížené, při hyperglykémii je naopak zvýšená. Z toho vyplývá, že stanovení glukosy je nutné provést paralelně v likvoru a v séru. Laktát Analytické postupy: enzymaticky, ampérometrie s laktátovou elektrodou. Referenční rozmezí: 1,2 – 2,1 mmol/l. Význam: laktát se zvyšuje zejména u purulentních (hnisavých) zánětů CNS. Pokles laktátu při kontrolním odběru odráží terapeutický úspěch. Vyšší hodnoty nalézáme také u maligní infiltrace mozkomíšních obalů, krvácení do likvorových cest, u cévních mozkových příhod a metabolických onemocnění. Laktát je zejména markerem saturace mozku kyslíkem. Albumin Analytické postupy: nefelometrie, ELISA, turbidimetrie, elektroimunodifuse. Referenční rozmezí: 120 – 300 mg/l. Význam: Tvorba albuminu probíhá mimo CNS a do likvorových cest se dostává přes hematolikvorovou bariéru. Zvýšení nad referenční rozmezí poukazuje na bariérovou poruchu a setkáváme se s ním u meningitid, encefalitid, tumorů a krvácení. Pro posouzení stavu hematolikvorové bariéry se používá poměr albumin v likvoru : albumin v séru, jinak také albuminový kvocient qALB. (orientační norma: qALB < 7,4 – kvocient je závislý na věku pacienta). Imunoglobuliny Analytické postupy: IgG, IgA – nefelometrie, ELISA, turbidimetrie, elektroimunodifuse; IgM – ELISA, nefelometrie s latexovými částicemi. Referenční rozmezí: IgG 12 – 40 mg/l, IgM 0,2 – 1,2 mg/l, IgA 0,2 – 2,1 g/l. Význam: Zvýšení imunoglobulinů v likvorových cestách může být způsobeno jednak jejich místní tvorbou nebo přestupem přes hematolikvorovou bariéru při zvýšené plasmatické hladině. K zjištění původu imunoglobulinů je třeba imunoglobulinový kvocient qIg (imunoglobulin v likvoru : imunoglobulin v séru). Reiberův graf Pokud známe albuminový a imunoglobulinový kvocient, jejich vzájemný vztah nám lépe ukáže na dění v likvorových cestách.
Schematický graf dle Reibera
Kvocient imunoglobulinu
Syntéza imunoglobulinů Porucha bariéry a syntéza imunoglobulinů
Porucha hematolikvorové bariéry
Normální nález
Kvocient Albuminu
Krevní barviva Analytické postupy: spektrofotometrie (v rozsahu 350 – 650 nm). Referenční rozmezí: negativní. Význam: V normálním likvoru se krevní barviva nevyskytují. Jejich přítomnost signalizuje krvácení do likvorových cest (úraz, cévní příhody mozkové a další krvácivé stavy). Při čerstvém krvácení prokazujeme oxyhemoglobin, pro starší krvácení je typická křivka oxyhemoglobinu s bilirubinem a nakonec převažuje pouze bilirubin.
SPEKTROFOTOMETRIE Absorbance
Absorbance
0,04
415 nm
0,02
Bilirubin
Oxyhemoglobin 450 - 460 nm 540 nm
575 nm
Vlnová délka
Normální nález
Vlnová délka
U silně ikterických pacientů může docházet k přestupu bilirubinu ze séra. K vyloučení artificiálního krvácení je třeba likvor zpracovat (centrifugovat a oddělit erytrocyty od supernatantu) do ½ h po odběru vzorku, jinak dochází k rozpadu erytrocytů ve zkumavce. Cytologie moku Kvantitativní cytologie Množství elementů a erytrocytů se počítá ve Fuchs – Rosenthalově komůrce, jejíž objem je 3,2 µl .V praxi se výsledek vyjadřuje jako číslo /3. Pro diferenciaci jaderných elementů je výhodnější zhotovit trvalý preparát.
Normální počet (v celé komůrce): 0/3 erytrocytů, < 10/3 elementů (oligocytosa) , v případě > 10/3 elementů se jedná o nález patologický (pleocytosa). Kvalitativní cytologie Trvalý preparát se vytvoří cytosedimentací nebo cytocentrifugací. Při cytosedimentaci jsou buňky lépe zachované, ale je třeba 600 µl likvoru. Při tvorbě preparátu pomocí cytocentrifugy je spotřeba okolo 200 µl, může zde docházet k deformaci buněk. Preparát se potom obarví buď pomocí Hemacolor (Merck) – rychlé barvení, nebo základním barvením dle Pappenheima (klasické hematologické barvení). Lipidy v makrofázích se prokazují olejovou červení O nebo sudanovou černí. K identifikaci bakterií se používá barvení dle Grama. Cytologické složení mozkomíšního moku V normálním likvoru se vyskytují pouze lymfocyty 60 – 80 % a monocyty 20 – 40 % (souhrnně se jim říká mononukleáry). Ostatní elementy, jako jsou neutrofilní granulocyty, eosinofilní granulocyty, aktivované lymfocyty, lymfoplasmocyty, plasmatické buňky, aktivované monocyty (z nich vznikající mikrofágy) a nádorové elementy poukazují na patologický proces v CNS. Elementům granulocytární řady (neutrofilní, eosinofilní a basofilní granulocyty) se souhrnně říká též polynukleáry.
Základní likvorové elementy Lymfocyt
Monocyt
Neutrofilní granulocyt
Lymfocyt Plasmocyt
Erytrocyt
Makrofágy jsou dále děleny podle fagocytovaného obsahu na lipofágy (speciálním barvením prokážeme přítomnost tukových kapének v cytoplasmě), erytrofágy (obsahují čerstvé nebo odbarvené erytrocyty), siderofágy (v cytoplasmě jsou granule hemosiderinu po rozpadlých erytrocytech), leuko- a lymfofágy (elementy s pohlcenými lymfocyty či granulocyty). Nejdůležitější likvorové nálezy Normální nález: Počet elementů < 10 /3, celková bílkovina, glukosa a laktát v normě, převažují klidové lymfocyty a monocyty
Nehnisavá zánětlivá reakce (virová encefalitida, borreliosa,…): počet elementů > 10 /3, celková bílkovina mírně zvýšená, glukosa a laktát v normě, převažují lymfocyty v různém stupni aktivace, lymfoplasmocyty až plazmatické buňky, mohou se vyskytnout i další jaderné elementy, jako monocyty, eventuelně i neutrofilní granulocyty, ale ty jsou v početní menšině (lymfocytární pleocytosa) Purulentní neuroinfekce – Počet elementů > 10 /3, celková bílkovina značně zvýšená, glukosa extrémně snížená a laktát značně zvýšený, převažují neutrofilní granulocyty, počtem > 1000, mohou se vyskytnout i další jaderné elementy, jako monocyty, eventuelně i lymfocyty, někdy jsou přítomny erytrocyty (polynukleární pleocytosa). Krvácení do likvorových cest – Počet elementů > 10 /3, celková bílkovina je závislá na intenzitě krvácení, glukosa normální nebo snížená, laktát normální nebo mírně zvýšený, převažují erytrocyty a aktivované monocyty (erytrofágy, siderofágy, erytrosiderofágy), mohou se vyskytnout i další jaderné elementy, jako neutrofilní granulocyty, eventuelně i lymfocyty. Nádorová infiltrace CNS – počet elementů může být jak normální tak různě zvýšený, glukosa normální nebo snížená, stejně tak laktát, jsou přítomny nádorové elementy. Souhrn Základní (statimová) vyšetření jsou: fyzikální posouzení likvoru, celková bílkovina a glukosa (likvor, sérum), laktát (likvor, plazma). Statimové cytologické vyšetření mozkomíšního moku se skládá ze stanovení celkového počtu elementů a erytrocytů ve FuchsRosenthalově komůrce. Okamžitě se musí připravit trvalý preparát pro kvalitativní vyšetření. Statimově se provede také spektrofotometrie likvoru. Doplňující vyšetření představuje stanovení albuminu, IgG, IgA, IgM a oligoklonálního IgG v likvoru a séru. Pro rozšíření diagnostiky lze vyšetřit volné lehké řetězce v likvoru a v séru, oligoklonální IgA, IgM, β2-mikroglobulin, specifické proteiny CNS (MBP = myelin basický protein, NSE = neuron specifická enolasa, protein S-100b), specifické protilátky (likvor, sérum) proti antigenům centrálního a periferního nervového systému. Mimo oblast klinické biochemie se provádí v likvoru mikrobiologické vyšetření, mykologické a parazitologické vyšetření, specifické protilátky proti infekčnímu agens (borrelie, leptospiry, treponemy, virus HIV, herpetické viry, virus klíšťové encefalitidy a další), průkaz nukleové kyseliny (PCR= polymerasová řetězová reakce) infekčního agens.
Literatura: 1.
Zima, T., Kazda, A., Průša, R. et al. Laboratorní diagnostika. Praha : Galén, 2002, 728 s., ISBN 80-7262-201-3.
2.
Glosová, L. Cytologický atlas mozkomíšního moku. Praha : Galén, 1998, 95 s., ISBN 80-85824-70-1.
3.
Adam, P., Táborský, L., Sobek, O., Kelbich, P. Cytology of cerebrospinal fluid. Praha : MJF, 2003, 215 s., ISBN 80-86284-35-2.
