THE WALL
Od Hooka k "atomic force microscopy"(F) (E) - izolovaný HGA(homogalakturonan) 400nm.
Simpson AG and Roger AJ (2004) The real 'kingdoms' of eukaryotes. Curr Biol 14:R693-6.
Čím jsme minule začínali; EVO-DEVO
Modes of (plant) cell growth isodiametric expansion polar growth
even cytokinesis can be viewed as a special case of „growth“
tip growth
Stěny I. a II. typu
Stěna 2004
Listový houbový parenchym
korunní plátek hledíku
tracheida = xylem
listový trichom
AGP spec. pro kortex
OVES kořen
AGP spec. pro vaskul.a epid.
zel.: Met-pektin žlut.:deesterif.pekt.
Barveno "odbarvenou"(pH11) anilinovou modří - kalosa
Metody chemické analýzy - mimořádně náročné
Dnes je velmi populární neinvazivní Fourierova transformační infračervená (FTIR) mikrospektroskopie, která je schopna kvantitativně detekovat řadu substituentů (př. karboxyl.kys., estery, fenoly, amidy…)
Zrození stěny
FRAGMOPLAST
Kalosa na počátku (i na konci) β-1,3-glukan
Kalosa syntázy a CesA bílkoviny
UGT - UDP-glukoso transferáza ANN - annexinu podobný protein Rop - Rho of plants SuSy - sacharoso syntáza; dodává substrát PRD - prolinem bohatá doména
Two major signaling mechanisms of eucaryotic cells
Molecular Biology of the Cell, 3rd edn, by B. Alberts, D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, and J.D. Watson
Rho GTPases • Classes: Rho, Rac, Cdc42, Rop (Rho of plants) • Functions (yeast and metazoa): budding, cell polarity, cell motility, actin organization • Functions (plants): – tip growth - pollen tubes, root hair initiation and elongation, actin organization – cell expansion – oxidative stress, auxin and ABA signaling • Mechanism: among others, actin nucleation?
Co všechno tam je?
Stavební kameny stěny
bio-Chemie cukrů
Mikrofibrila celulózy asi 3 nm silná je tvořena 30 až 36 individuálními řetězci a může při počtu 14 000 glc jednotek dosáhnout délky 7um.
Hypot. mech. synt. celulosy Je možné, že lipidická molekula (sistosterol) může fungovat jako začátekočko.
Celulosa syntázy 10+29xCSL u A.t. radial swelling (rsw1) - CesA1 procruste - CesA6 produkují méně celulosy a klesá anizotropie růstu mikrofibrily jsou disorganizovány, ale MT jako WT!
Vedle CesA podjednotek je důležitá pro syntézu celulózy také endoglukanasa/celuláza KORRIGAN
Kolokalizace MT s mikrofibrilou
mor1 - 215kDa MAP u ts mutanta se v restriktivní teplotě rozpadají kortikální MT a dochází ke ztrátě polarity, ale mikrofibrily orientovány jako u WT.
Xyloglukany (hemicelulosy) a pektiny
XG
(dříve hemicelulóza) – Xyloglukan endotransglykosylasy (XET – 33x u A.t.!) katalyzují „rekombinaci“ dvou molekul XG a tím rozvolnění stěny
(dříve hemicelulóza) oblasti se substitucí Ara - blok (lokálně) H můstky
Pektin RG-I
Pektin - RG-II borátový crosslink
Pektin - homogalacturonan Ca2+ cross-link
Pektiny
Perikarp rajčete JIM5 protilátka = deesterifikovaný pektin
Pektinová matrix ustavuje velikost „pórů“ ve stěně
Průduchy (u stěn I i II) mají zvýšený podíl fenoly esterifikovaných pektinů. po působení PME in vitro se zvětšuje apertura, zatím co feruolyl esteráza snižovala aperturu.
Rozdíly v metabolismu pektinů působí rozdíly tuhosti plodů
Galaktomanany slouží jako zásobní polysacharidy ve stěnách endospermu – př. luštěniny, datle
Stěnové strukturní bílkoviny
Většinou zakotveny GPI kotvou v membráně (modifikace probíhá v ER katalyzována transamidázou; po odštěpení peptidu na C-konci je připojena glykosylfosfatidylinositolová kotva
- inositolový ifosfolipid, s oligosacharidem substituovaným fosfoethanolaminem)
jako inhibitor vážící AGP Yariv reagent (β-D-gal)3 u BY-2 buněk indukuje PCD.
Odstranění arabinos z extensinu vede ke ztrátě tyčinkovitého tvaru.
!
GRP mohou tvořit β-list
Technika tkáňových otisků na nitrocelulosu
AGP kotví v membráně pomocí GPI
Michaël
Improved Fiber Quality in Transgenic Cotton Plants that Over-Express Xyloglucan Endotransglycosylase Teresa H. Burns1, Yoshihisa Kasukabe2, Koichi Fujisawa2, Susumu Nishiguchi2, Yoshihiko Maekawa2, Jeanie L. Heinen1, Mohamed Fokar1, Ginger G. Light1, Sundus A. Lodhi1, and Randy D. Allen1* 1Departments of Biological Sciences and Plant & Soil Sciences, Texas Tech University, Lubbock, TX 79409, USA 2Toyobo Research Institute1-1 Katata 2-Chome, Ohtsu, Shiga, 520-02, JAPAN Abstract Cotton is the mostly widely used textile fiber and production of cotton fibers produces over $100 billion in farm income worldwide. Cotton fibers are singlecelled trichomes that grow from the epidermis of the seed coat. Length is one of the most crucial factors in determining fiber quality and elongation during early phases of development results in mature fiber cells typically more than one inch (2.5 cm) in length. As in all plant cells, elongation of cotton fibers is driven by turgor pressure and limited by the resistance of the cell wall to expansion. To investigate the role of putative cell wall loosening enzymes in fiber elongation, transgenic plants were developed that over-express xyloglucan endotransglycosylase (XET). These plants have XET activity levels that are approximately twice those of wild-type plants. Fibers from primary transgenic plants (T0) grown in the greenhouse averaged 1.27 inches in length, compared to 1.07 inches for wild-type plants. After self-pollination, these plants produced seed that were grown in the field. Segregation of the XET transgene in these field-grown plants correlated with increased fiber length. Analysis of homozygous expressing and non-expressing segregant lines indicated that over-expression of XET led to the produced fibers that were consistently 15 to 20% longer than non-expressing plants without affecting other quality traits. This research demonstrates that XET is involved in regulating cell expansion and is a limiting factor in the elongation of cotton fibers.
Introduction Xyloglucan endotransglycosylase (XET) is able to transfer a high-molecular weight portion from a donor xyloglucan to a suitable acceptor such as a xyloglucan-derived nonasaccharide. Thus, XETs can cleave and rejoin intermicrofibrillar xyloglucan chains, causing reversible wall-loosening leading to cell expansion. XET activity has been detected in growing regions of virtually all plants tested and the levels of XET activity correlate well with the growth rate of the tissue. Further, XET expression responds to phytohormones that increase cell elongation and reduced expression of specific members of the XET gene family have been reported in acaulis mutants of Arabidopsis which have defects in internode elongation. Expression of XETs in elongating tissues, including cotton fibers, suggests that they could still play an important role in promoting cell wall extensibility. To test this hypothesis, a cDNA (designated KC22) that had strong sequence similarity to other plant XETs was isolated from a cotton ovule cDNA library. The KC22 cDNA was used to develop a gene construct designed to overexpress XET in cotton tissues. Analysis of the fiber from these plants indicated significant increases in fiber length, indicating that XET activity is one factor that limits fiber length.
10
EXT Activity
8 Coker 312 KC22-5 KC22-3 KC22-10
6 4 2
A BCDE F
A BCD
KC22-10
KC22-5
PCR Genotype
0
KC22-3
Genotype
Figure 1. Comparison of derived amino acid sequences for plant XETs. The a cDNA for the Gossyipium hirsutum XET was used to develop the 35S-KC22 transgene for expression in cotton.
Figure 2. Comparison of XET specific activity in extracts from seedlings of control and three independent transgenic cotton plants that express the 35S-KC22 gene cassette. XET activity in transgenic plant was approximately double that than in control plants.
Table I. Comparison of HVI-derived quality characteristics of fiber samples from greenhouse-grown T0 control (35S-GUS) and 35S-KC22-containing plants. Fiber quality data from greenhouseand field-grown T1 sibling lines from three independent transgenic cotton plants segregating for the 35S-KC22 gene construct are also included. HVI analysis of fiber from T0 plants was performed at the Toyobo Research Institute, Otsu, Japan. HVI analysis of fiber from T1 plants was performed at the International Textile Research Center, Lubbock, TX. Each value represents the mean of two separate assays for three independent KC22expressing or non-expressing lines. *Indicates significant differences between expressing and non-expressing plants (P<0.005). These results indicate that the KC22 transgene specifically affects fiber length.
Table II. Comparison of cotton fiber quality parameters measured by AFIS and stelometer (strength). Fiber samples were from fieldgrown T1 transgenic cotton plants transformed with the 35S-KC22 gene construct or a reporter gene construct (35-GUS). AFIS analysis was performed at the International Textile Research Center, Lubbock, TX. Each value represents the mean of two separate assays for three independent KC22-expressing or control lines. *Indicates significant differences between expressing and control plants (P<0.005). Mean fiber length and upper quartile length are significantly increased in 35S-KC22 expressing plants while short fiber content (SFC) in decreased. These results indicate that XET over-expression increases overall fiber length rather than affecting just the longest or shortest fibers.
Figure 3. Co-segregation of increased fiber length with the 35SKC22 transgene cassette T1 transgenic lines. Fiber length was determined by HVI was determined for individual field-grown T2 plants from three independently transformed lines segregating for the 35S-KC22 gene cassette. Inheritance of the 35S-KC22 cassette was assayed by PCR amplification. Plants that carry the 35S-KC22 cassette had fibers approximately 15 to 20% longer than those that did not inherit the cassette. These results indicate a direct relationship between XET over-expression and fiber length.
Generation: Plant ID: Genotype: Length:
17:6
Generation: T1 Plant ID: 10-49 Genotype: -/Length: 1.09 0:13
Generation
T0, Greenhouse
KC22 Transgene
_ (35SGUS)
+
T1, Greenhouse -
+
T1, Field -
+
HVI Length (inches)
1.07 ±0.06
1.27 ±0.01*
1.07 ±0.05
1.30 ±0.02*
1.06 ±0.07
1.30 ±0.03*
HVI Strength (g/tex)
22. 0 ±2.0
23.0 ±1.8
25.0 ±1.3
27.5 ±0.5
26.1 ±2.5
28.0 ±0.5
HVI Micronaire
n.d.
n.d.
4.4 ±0.01
4.6 ±0.6
4.6 ±0.5
4.3 ±0.7
Genotype
Length (inches)
UQL SFC Fineness Strength Maturity (inches) (%<0.5) (mTex) (g/Tex) Ratio
35S-GUS (Control)
1.04 ±0.04
1.21 ±0.07
5.8 ±1.1
189 ±11
22.0 ±2.1
0.95 ±0.02
35S-KC22 Expresser
1.25 ±0.02*
1.47 ±0.03*
4.6 ±0.6*
190 ±7.0
20.2 ±1.8
0.98 ±0.03
T0 10 +/1.33
Generation: T2 Genotype: -/Length (Avg): 1.07
Generation: T1 Plant ID: 10-173 Genotype: +/Length: 1.30 15:5
Generation: T2 Plant ID: 10-173-71 Genotype: +/Length 1.25
Generation: Plant ID: Genotype: Length:
T2 10-173-389 +/+ 1.24 21:0
Generation: T3 Genotype: +/+ Length (Avg): 1.25
Figure 4. Example pedigree for transgenic plant line derived from T0 plant 35S-KC22 #10. Offspring plants that inherit the transgene produced fibers between 1.25 and 1.30 inches in length while offspring that did not inherit the transgene produced fibers similar to nontransformed control plants (<1.10 inches). The 35S-KC22 transgene acts as a fully dominant fiber quality allele.
Impregnace - lignifikace a suberinizace
Model diferenciace xylemu in vitro u r. Zinnia
(c) Rajčata – perikarp
Barvení kyselým fuchsinem(A) a phloroglucinolem(B,C) na lignin.
Lignin
Phenylpropanoidní metabolismus vedoucí ke vzniku monolignolů – pkumaryl alkoholu, koniferyl alkoholu, a sinapyl alkoholu. Začíná se kyselinou skořicovou.
Stěnový cross-linking
Hydroxylové radikály (´OH) a H2O2 vznikající ve stěně činností PRX a O2 a NADH, Fentonovou reakcí (Fe2+ a H2O2 =ROS) či NOX v plasmalemě; H2O2 pak je využito k oxidativní tvorbě křížových vazeb peroxidasami.
U tabáku byla pomocí exprese spec. anti-mRNA blokována exprese kationtové isoformy stěnové PRX. Transformanti obsahovali až o 50% méně ligninu, aniž by byl narušen normální vývoj.
Lignifikace v obraně
Colletotrichum atakuje b. kukuřice obranná papila akum. kalosu a lignin.
Důležitá úloha aktinu!
Wall Apposition
Biologicky aktivní oligosacharidy spouštějí obrannou eakci.
Čím jsme minule začínali; EVO-DEVO
Evoluční perspektiva - G- a Slignin nahosemenné - jen tracheidy (cévice) bohaté na guaiacyl lignin (G - lignin) krytosemenné - vedle trachejí (céva) bohatých také na G-lignin, maji také vláknité sklerenchymatické podpůrné b. (libriformní, "fiber") se syringyl ligninem (S - lignin). U krytosemenných došlo k vytvoření druhého b. typu: specializovaných typů elementů - vláknité sklerenchymatické podpůrné b. s mechanickou fcí. užívají novou lignifikační dráhu přes syntézu sinapyl alkoholu.
Transkriptom tvorby dřeva topolu
Suberinizace Caspariho "prstýnky" v endodermis brambora…
Suberizované domény jsou tvořeny střídavě vrstvami polyalifatickými a polyaromatickými. Je možné, že suberinizace evolučně předcházela lignifikaci.
Vrstvy polyalifatické jsou tvořeny lipidy s dlouhými řetězci. Prekursorem polyaromatických je hydroxy-skořicová kyselina.
Kutikula
Jak kutikulární mutanty poznáme?
Origin of Leaf Hydrophobicity Cause: Waxy Outer Layer and Surface Roughness •Wax Crystals on Epidermal Cells :Crystal Density determines actual hydrophobicity. •Long hair like structures (trichomes) and bumpy protrusions induce surface roughness. Effect: Nature’s Self Cleaning Mechanism •Dirt particles (spores, disease fungi) adhere more strongly to water than the leaf and are consequently washed away. •Lack of water on surface prevents disease organisms from germinating and growing as they cannot survive.
C. graminicola
C
“Biological nano-indenter”
Pathogenic Attack On Plant Surfaces Issues: 1) Adsorption of pathogens 2) Mechanical resistance Adapted from Bechinger et al. Science (1999) 1896.
A closer look at the membrane . . . Epicuticular surface (coated with thin layer of lipids for waterproofing) CH3-(CH2)n-CH3; CH3-(CH2)n-CH2-OH; n ~ 30 ~ 6 µm thick
Biopolyester support (cutin) OH HO-CH2(CH2)5CH(CH2)8-COOH
(Side view, SEM of tomato fruit cuticle)
Removed cells (Pectin degraded)
(also some embedded lipids pre-dominantly fatty acids)
We examine a model system
tomato fruit cuticle (chemically simple)
1) Enymatically isolated to remove outer underlying plant cell 2) Investigate investigate influence of water on the surface and bulk rheology intact membrane isolated biopolymer support (lipids extracted)
Interfacial Structure…
Pea leaf – polysaccharide Bundles (~ 20 nm)
Crystalline lipids on Pea Leaf
Pea leaf provided courtesy W. Abraham, Monsanto
Agrochemical Delivery Importance • Agrochemical spray on leaves
Ways to enhance spreading • Temperature • Coating the surface • Addition of a surfactant ----> Surfactant enhanced spreading
Alex Couzis, CCNY
Delší čas lezení mšic u cer3 vedl k odhalení C30 alkoholu (triaconta nolu), jako repelentu
Někteří cer mutanti jsou sterilní
Jak to může fungovat všechno najedou?
Modes of (plant) cell growth isodiametric expansion polar growth
even cytokinesis can be viewed as a special case of „growth“
tip growth
Stěny I. a II. typu
Buňka reguluje složení nově ukládané stěny, ale také již starších vrstev.
(A) Orientace mikrofibril se ve stěně během ukládání dalších vrstev a růstu mění – pův. představa o pasivním natahování (B) během dlouživého růstu vzniká ve stěně velké tangenciální napětí (σt), které roste příp. až k několika stovkám MPa, při turgoru 1MPa (C) názorný model pružiny
Dominantní postavení má regulace "hemicelolóz" Glukanázy Endotransglykosylázy Expansiny Spec. LTP? reaktivní formy kyslíku?
XET a expansiny xyloglukan endotransglykosylasy
Nedávno byla biochemicky charakterizován stěnová bílkovina s lipid transferovou proteinovou (LTP) doménou, která působí podobně jako expanziny.
Stěnové hydrolázy - xyloglukanázy • Hydrolyzují nejen spojovací část, ale částečně i frakci vázanou na celulózu a mění chemické složení stěny. • Působí zvýšenou tuhost, sníženou viskoelasticitu při zachování podélné extensibility. • In vivo hypokotyly mají asi jen 36% XG přístupných hydrolýze XGnázou.
Stěnové XET – endotransglykozylázy • Nemění poměr mezi obsahem celulózy a XG. • Pevnost a roztažnost zůstávají zachovány. • Výrazný vzrůst moblity – posuvnosti složek stěny
a – kontrolní stěna cellul.+XG intaktní; b – po působení bakter. endoglukanázy tenké XG spoje mizí a randomizuje se struktura celul.; c – po půs. xyloglukanázy strukt. kolabuje a splývá ; d – po půs. XET jen reorganizace.
Antiintuitivní funkce stěnových enzymů. • Zdá se, že hlavní funkcí XG je udržovat mikrofibrily celulózy od sebe – aby nekolabovaly do velkých shluků. • XG působí tedy ve směru rozvolnění stěny. • Proto mohou glukanázy/hydrolázy zvyšovat!! pevnost/tuhost stěny, zatímco XET zvyšují viskoelasticitu při zachování mechanické pevnosti.
Komplementarita účinků expansinů a XET. • Expansiny oslabují uniaxiální pevnost, ale XET ne. • XET katalyzují roztahování/přeskupování stěnové sítě za konstantního bi-axiálního napětí, zatím co expansiny ne. • Proto často obě aktivity kolokalizují v místech růstu.
Hydroxylové radikály (´OH) vznikající ve stěně činností PRX a O2 a NADH, Fentonovou reakcí (Fe2+ a H2O2 =ROS) případně v NOX, mohou neenzymaticky štěpit stěnové polysacharidy – XG a pektiny.
Celulóza a kalóza se ukládají až za špičkou
Pylové láčky mají rostoucí špičku tvořenou převážně metylovanými pektiny. V oblasti pod špičkou dochází k deesterifikaci (demetylaci) a pektiny jsou křížově propojovány (cross-link) Ca2+.
Pylová láčka a metylace pektinů
JIM7
JIM5
JIM5
Lacka.avi
u g-i jsou pektiny na špičce demetylovány! přidáním PME
Stěna jako senzor mechanických poměrů v buňce a okolí "celulozoví" mutanti nejen hromadí kompenzačně pektiny, ale mají "signálně" aktivovánu dráhu ukládání ligninu.
WAKs
WAKs interagují s pektiny (HGA) za přítomnosti Ca2+
Lokus CLAVATA 1 kóduje receptorovou kinázu interagující s peptidem Clavata 3
Funkce askorbátu ve stěně úzce souvisí s tvorbou ROS (oxidative burst) Je hlavním antioxidantem stěny. Jeho redoxní stav reguluje askorbát oxidáza (AO) a podílí se tak na regulaci redoxních poměrů v apoplastu a tím modifikuje aktivity receptorů a přenos signálů.
Askorbát ve stěně MDHAR - monodehydroaskorbát reduktáza MDHA-monodehydroaskorbát
Zinnia elegans „růže“ z Mexika
Xylogenese – AGP-LTP XYLOGEN, polárně sekretovaný induktor xylogeneze
Purifikace na ConA koloně a N-terminální sekvenování po deglykosylaci.
2 – deglykosylovaný xylogen
Ke stimulaci mRNA stačí auxin, ale bílkovina žádá také cytokinin!
ZeXYP1 mRNA se hromadí v prokambiu a nezralém xylému. (pc – prokambium; ix – nez. xylem; xp – xylem. parenchym; te – cévy; se – floem)
Xylogen je lokalizován apikálně v mladých vznikajících cévách (n).
Dvojitý mutant Arabidopsis atxyp1/2 má narušený rozvoj venace listu a konektivity vodivých pletiv.
1. U Arabidopsis je znám mutant cotyledon vascular pattern1 (cvp1), který má narušenou funkci sterol metyltransferázy – enzymu účastnícího se tvorby mj. také sistosterolu. 2. Xylogen obsahuje v LTP dom. 8x cystein, který tvoří 4xdisulf. můstek. Vzpomeňme na redox regulaci askorbátem!
