Obsah Fermentační část .............................Chyba! Záložka není definována. BIOTECHNOLOGICKÉ KULTIVACE MIKROORGANISMŮ ...................... 4 Principy pilotní a průmyslové kultivace mikroorganismů............. 4 Bioreaktor ....................................................................................... 4 Klasifikace typů bioreaktorů ...................................................... 5 Kultivace SSC a SLC ..................................................................... 6 Ideální bioreaktor ....................................................................... 7 Submerzní kultivace v kapalném médiu .................................... 8 Speciální bioreaktory ................................................................. 8 Míchání bioreaktorů ...................................................................... 9 Pneumatické míchání bioreaktorů ............................................ 9 Bioreaktory s fluidním ložem ................................................... 10 Mechanicky míchané bioreaktory ........................................... 10 Základní typy míchadel ............................................................ 12 Přestup tepla ................................................................................ 13 Aerace a přestup kyslíku .............................................................. 14 Kultivační půdy – média ............................................................... 15 Příprava inokula ........................................................................... 16 Sterilizace u bioreaktorů .............................................................. 16 Hodnocení sterility ................................................................... 17 Sterilizace vzduchu a odplynů ................................................. 17 Inokulace ...................................................................................... 17 Základní typy kultivačních procesů.............................................. 18 2
Vsádková kultivace (batch) ...................................................... 18 Přítokovaná kultivace (fed-batch) ........................................... 20 Strategie řízení přítokování ..................................................... 20 Kontinuální kultivace ................................................................ 20 Optimalizace bioprocesu.............................................................. 21 Optimalizace složení média ..................................................... 21 Optimalizace kultivačních parametrů...................................... 22 Monitoring a automatizace...................................................... 22 Kultivace rekombinantních mikroorganismů .............................. 23 Prokaryotní expresní systém – E. coli ...................................... 23 Eukaryotní expresní systém - Pichia pastoris .......................... 23 Použité zdroje ............................................................................... 24 Doporučená literatura .................................................................. 24 Internetové zdroje ........................................................................ 25
3
BIOTECHNOLOGICKÉ KULTIVACE MIKROORGANISMŮ Principy pilotní a průmyslové kultivace mikroorganismů Základem pilotních a průmyslových biotechnologických procesů jsou kultivace a biotransformace v bioreaktorech. Jednoduchým bioreaktorem je jakýkoli uměle vymezený prostor, kde bioprocesy mohou probíhat. Například třepaná baňka je jednoduchým bioreaktorem.
Bioreaktor Bioreaktor je zařízení, kde probíhá růst buněk a tvorba produktů nebo konverze substrátu na jeden či více produktů. V moderním a širším slova smyslu není vždy nutné, aby se procesu zúčastnily buňky, i např. Enzymové biotransformační reaktory můžeme nazvat bioreaktory. Bioreaktory můžeme klasifikovat podle různých hledisek, ale výše zmíněná třepaná baňka zůstává prototypem transportních procesů, které jsou pro bioproces nezbytné (Obr. 3.1).
Obrázek 3.1. Transport živin a metabolitů.
Sj - substráty, Pj - produkty, ∆Hv - tepelná bilance, 1. mezifázové rozhraní plyn-kapalina, 2. transport v kapalině, 3. kapalina-pevná fáze, 4. transport aglomerátem, 5. transport přes biologické membrány.
4
Klasifikace typů bioreaktorů Bioreaktory rozdělujeme podle různých hledisek, základní dělení je podle fáze: Submerzní – nositelé bioprocesu (buňky, enzymy, agregáty, imobilizáty) se volně vznášejí v kapalné fázi živného média, Na pevné fázi – médium v tomto uspořádání tvoří pevný povrch a nositelé bioprocesu tvoří povlak čí nárůst; i tady se zpravidla tvoří mezistrukturní vrstvičky kapaliny, Imobilizované – nositelé procesu jsou nějakým způsobem ukotveni v pevné struktuře.
Obrázek 3.2. Některé typy submerzních bioreaktorů
1. mechanicky míchaný tank, 2. průtočný s nepohyblivou náplní, 3. kombinovaný pro bioplyn, 4. enzymový membránový, 5. pneumatický, 6. s pevnou fází
5
Jiné dělení může být podle objemu procesu: Měřítko: • • • •
Laboratorní (do 30 l) Čtvrtprovozní (do 100 l) Poloprovozní (do 5000 l) Provozní (nad 5000 l)
Charakter pohybu média i nositelů procesů zakládá dělení podle operačního módu: • • •
Vsádkový (batch) - všechny živiny jsou vloženy do procesu již na počátku, metabolity se hromadí (vyjma plynů), nejjednodušší typ procesu, Přítokovaný (fed-batch) – k základnímu objemu v bioreaktoru přitéká další médium s novými živinami, metabolity se opět hromadí, Kontinuální – existuje přítok i odtok, nositelé procesu jsou zadržováni, nebo odtékají.
Další základní dělení je na aerobní (za přístupu kyslíku), mikroaerobní (minimální přístup kyslíku, zpravidla množství, které se rozpustilo a absorbovalo před uzavřením reaktoru) a anearobní (přístup kyslíku je zamezen).
Neméně důležité dělení je podle konstrukce bioreaktorů, pro ilustraci Obr. 3.2: • • • • •
Míchání ▪ Mechanické, pneumatické nebo hydraulické Fluidní vrstva Náplňové Speciální Membránové, fotobioreaktory, reaktory pro kultivace na pevném substrátu, atd.
Kultivace SSC a SLC Tyto podivné zkratky znamenají dva základní typy kultivací v klasifikaci podle provedení, které mají zásadní vliv na typ použitého bioreaktoru. Jsou to kultivace na pevném substrátu (SSC – solid-solid-cultivation) a submerzní kultivace v kapalině (SLC – solid-liquid-cultivation). Toto pojmenování označuje pevnou fázi buňky versus pevnou nebo kapalnou fázi substrátu.
Mezi rozdíly mezi SSC a SLC patří: 6
! Gradient živin � U SSC přístup k povrchu buňky je omezen, živiny v bezprostředním okolí jsou vyčerpávány a další musí k buňkám difundovat. SLC – v ideálně míchaném reaktoru gradient neexistuje. ! Vrstva substrátu � SSC - pro omezený transport ve vlhkém, ale pevném prostředí nemá smysl používat silnou vrstvu substrátu. Kapalného média bývá přebytek. ! Limitace transportu tepla a živin � SSC - je dána omezenou difuzí, u SLC je přístup k buňkám dokonalý (pokud se jedná o volné buňky) a je dána transportními procesy přes buněčné stěny a membrány. ! Fáze � SSC - třífázový systém pevná – kapalina – plyn, SLC – pouze dvoufázová systém kapalina – plyn. ! Dodávka kyslíku � SSC - kyslík je dodáván hlavně z plynné fáze, což je problematičtější, SLC – rozpuštěný kyslík z kapaliny a zároveň mezifázový přechod kyslíku z plynu do kapaliny. ! Teplo � SSC – teplo se odvádí plynou fází, SLC – kapalina je chlazena externím médiem – nákladnější, ale mnohem účinnější. ! Sledování (monitoring) a řízení procesů � SSC – velmi obtížné až nemožné, SLC – standardní postupy. ! Charakter růstu � SSC – povrchový, SLC – submerzní. ! Koncentrace produktu � Zde významná výhoda SSC – zpravidla vyšší koncentrace produktu ve srovnání se SLC. ! Zvětšování měřítka procesu (scale-up) � U SSC špatně definovatelné, u SLC standardní metodika. Celkově spočívají výhody SSC pouze v jednoduchosti a nenáročnosti na strojní vybavení, ve vyšší objemové koncentraci produktů a tím efektivnější izolaci, jednodušší inokulaci a menším objemu odpadů. Dále v tom, že některé organismy se v submerzním prostředí kultivují obtížně, nebo netvoří žádané produkty (např. Některé vláknité mikroorganismy).
Ideální bioreaktor Ideální bioreaktor má rychlý přestup tepla, kyslíku a hmoty, rychlá homogenizace, nízké provozní náklady. Zpravidla se jedná o submerzní bioreaktor, ale to závisí na 7
charakteru nositele procesu a procesu samém. Bioreaktor je proto nutné vybírat, případně konstruovat, s přihlédnutím k těmto parametrům procesu: • • • • • • • • • • • • • • •
Přestup kyslíku Přestup tepla Přestup hmoty Požadavky na míchání Nároky na energie Citlivost kultury ke střižným silám Reologie kapaliny - viskozita média (míchání, přestup hmoty, přestup tepla, střižné síly) Minimalizace odparu kapaliny Tlaková odolnost Sterilita operace Čištění bioreaktoru Bezpečnost Účelová flexibilita a kompatibilita Cena zařízení a jeho provozu Přestup kyslíku a tepla jsou limitující faktory pro provoz bioreaktoru a scale-up
Submerzní kultivace v kapalném médiu Nadále se budeme věnovat submerzní kultivaci v kapalném médiu s volně pohyblivou pevnou fází, jakožto typickému příkladu bioreaktorových aplikací. Tyto kultivace se vyznačují několika charakteristickými parametry. Míchání – zajišťuje homogenitu vsádky, ideální přístup živin a odvod metabolitů, odvod tepla. Regulace teploty, pH a v případě aerobních procesů průtoku vzduchu nebo obohaceného vzduchu představují další základní parametry, které musí aerobní míchaný bioreaktor zajišťovat. Poslední parametr, ne vždy využitý, je přítokovací systém.
Speciální bioreaktory Mezi speciální bioreaktory řadíme například fotobioreaktory, zařízení různé konstrukce umožňující přístup světla k rostoucím fotosyntetizujícím kulturám, např. Jednobuněčným řasám, cyanobakteriím. Další velkou skupinou jsou bioreaktory pro kultivaci na pevné fázi, o které bylo stručně pojednáno výše. Konstrukce jsou opět různé, podle charakteru organismu a jeho růstu. K těmto reaktorům se řadí i zařízení pro povrchový nárůst na kapalných médiích. Bioreaktory pro kultivaci živočišných či rostlinných buněk – tkáňových kultur 8
přesahují rovněž rozsah tohoto textu.
Míchání bioreaktorů Nejčastějšími způsoby míchání bioreaktorů jsou pneumatické, s fluidním ložem a zejména mechanické.
Pneumatické míchání bioreaktorů Nejznámějšími zástupci jsou bublané kolony a air-lift reaktory. Charakterizovat je lze takto: ! Probublávané reaktory (kolony) � Cylindrická nádoba, poměr průměru k výšce 1:2 (kolona) � Rozdělovač plynu obvykle naspodu reaktoru � Nepřítomnost speciálních difuzorů a vestaveb � Přestup kyslíku a míchání – dáno rychlostí proudění vzduchu a rheologií kapaliny � Maximální rychlost míchání obvykle ≤ 0,1 m/s � Nevýhoda – obvykle malý přestup kyslíku • Relativně malé mezifázové rozhraní • Bubliny postupem vzhůru koaleskují (spojují se) ! Air-lift reaktory (s vestavbami) � Vestavby – zarážka, cirkulační trubka � Funkce vestaveb: • Dostatečná dispergace plynu – umožňuje obnovování mezifázového povrchu – zvyšuje přestup kyslíku • Organizování toku fází • Zvýšení doby prodlení plynu • Zvýšení mikroturbulence � Air-lift reaktory lze vybavit cirkulační trubkou nebo vnější cirkulací. Princip bublané kolony a air-lift reaktoru s centrální cirkulační trubkou je patrný na Obr. 3.3.
Obrázek 3.3. Pneumaticky míchané bioreaktory
9
a) bublaná kolona, b) air-lift reaktor s cirkulační trubkou.
Bioreaktory s fluidním ložem V reaktorech s fluidním ložem proudí kapalina směrem vzhůru a nadnáší – suspenduje částice pevné fáze. Jsou vhodné pro imobilizované či flokulované mikroorganismy nebo enzymy. V horní rozšířené části se snižuje rychlost proudění a tím i suspendace – dochází k separaci částic od kapaliny, která může opustit reaktor. Tyto reaktory mohou být i aerované, většinou probubláváním. Jsou vhodné pro imobilizované či flokulované mikroorganismy nebo enzymy. Samotné buňky jsou příliš lehké, špatně sedimentují a jsou nevhodné pro cirkulaci ve fluidním loži. Uspořádání je kontinuální, živiny proudí přes náplň, metabolity a produkty odváděny. Prostředí je nehomogenní, koncentrace živin se mění s výškou náplně, gradient pH, špatné promíchávání. Tyto reaktory se využívají např. Při inhibice produktem (rozdílná koncentrace produktu podél náplně).
Mechanicky míchané bioreaktory V mechanicky míchaných submerzních bioreaktorech se procesu opět účastní třífázový systém, plyn-kapalina-pevná fáze, kde plynem je zpravidla vzduch, kapalinou médium a pevnou fází nositelé procesu, buňky, flokuláty, aglutináty atd. Účelem míchání je opět homogenizace, transport živin a tepla a v aerobních procesech dispergace bublin aeračního plynu. Při míchání mechanickými míchadly vzniká střihové napětí, které způsobuje rozbíjení bublin a tím zvětšuje mezifázovou plochu. Střihové napětí však rovněž působí negativně na pevnou fázi, zvláště na nepevné struktury, například vláknité mikroorganismy. 10
Pro mechanicky míchané systémy je charakteristická vysoká turbulence a rychlý přestup látky a tepla. U kyslíkově nenáročných, pomalých procesů a střihově citlivých organismů se ale naopak používají nízké rychlosti otáčení, větší plochy míchadel a jejich speciální tvary omezující střižné síly. Mechanické míchání je vždy kompromis mezi maximální dodávkou kyslíku a homogenizací a velikostí střihových sil.
Obrázek 3.4. Aerovaný míchaný bioreaktor
1 - nádoba bioreaktoru 2 - plášť 3,4 - izolace 5 – přívod inokula 6 – porty pro pH elektrody 7 - míchadlo 8 – aerační věnec 9 – ucpávka 10 - převodovka 11 – motor 12 – vypouštěcí otvor 13 – chlazení pláště 14 – vzorkovací otvor s připojením páry 15 – prosklená plocha (pozorování obsahu) 16 – přívod roztoků na úpravu pH a odpěňovadla 17 – vstup vzduchu 18 – víko 19 – přívod média 20 – odvod vzduchu 21 – porty pro senzory 22 – rozbíječ pěny 23 – přívod páry 24 – tryska
Základním systémem pro malé rigidní buňky s vysokou spotřebou kyslíku (bakterie, kvasinky) je však mechanické míchadlo typu disková turbína, 4-6 listů, d (průměr míchadla) asi 0.3 dT (průměr nádoby). Aby docházelo k co největší dispergaci, je aerační věnec umístěn pod nejspodnějším míchadlem. Naopak, aby nedocházelo ke vzniku středového víru a zvýšila se turbulence, je nádoba bioreaktoru vybavena
11
míchacími narážkami, což jsou podélné obdélníkové vestavby, zpravidla umístěné pravidelných vzdálenostech po vnitřním obvodu nádoby. Narážky (zarážky) pro optimální promíchávání se umisťují v počtu 4-8, d (šířka narážky) asi 0.1 dT. Typická konstrukce aerovaného míchaného bioreaktoru (CSTR – continuous stirred tank reactor) je na Obr. 3.4.
Základní typy míchadel Základní typy míchadel jsou vrtulové, vyznačující se vysokou čerpací kapacitou, menšími střižnými sílami, axiálním tokem čerpané suspense a turbínové, kde vysoké střižné síly způsobují dispergaci vzduchových bublin a dělicí kotouč zabraňuje zkratovému toku vzduchu kolem hřídele. Čerpací kapacita je omezená. Na Obr. 3.5 a 3.6 jsou základní tvary míchadel. Obrázek 3.5. Turbínová míchadla s různým tvarem a sklonem lopatek.
Obrázek 3.6: Míchadla
a) vrtulové, b) diskové turbínové s narážkami, c) diskové turbínové bez narážek. 12
CSTR standardního tvaru je vybaven obvykle více míchadly na společném hřídeli, což výrazně zlepšuje homogenizace tanku, vzdálenost míchadel 1-1.5 D (průměr nádoby), nejčastější počet je tři. Rychlost míchání je často omezena pouze konstrukčním a materiálovým provedením bioreaktoru, avšak maximalizace otáček není efektivní ani pro homogenizaci a provzdušnění. Velikost míchadla se volí D/DT = 0.4-0.5 (průměr míchadla/průměr tanku), počet narážek je čtyři a jejich šíře 0.1 DT. Vzdušnění (aerace) podporuje míchání a snižuje míchací příkon. Poměr mezi příkonem aerovaného tanku (PG) a neaerovaného tanku (P) vyjadřuje vztah:
VG je průtok aeračního plynu, n otáčky míchadla a d jeho průměr. Příkon míchadel (P) je možno počítat pro newtonské kapaliny podle vztahů:
kde P0 – příkonové číslo, ρ – hustota, n – otáčky, d – průměr míchadla, µ – dynamická viskozita.
Přestup tepla V aerobních míchaných bioreaktorech vzniká teplo exotermickou činností mikroorganismů nebo exotermickými reakcemi, dále třením při míchání a aeraci. Množství uvolněného tepla u aerobních procesů je proporcionální spotřebovanému kyslíku, Q (kj/m3.s) = 0.12 . Ocr (mmol o2/m3.s)
kde Q – rychlost produkce tepla, OCR – rychlost spotřeby kyslíku 450 kJ tepla/mol utilizovaného O2. U submerzních kultur to bývá 3-15 kJ/m3.s. Odvod tepla je realizován prostřednictvím aktivního chlazení přes externí plášť či interní vestavby. Při zvětšování měřítka (scale-up) si přestup kyslíku a tepla zaslouží zvláštní pozornost - větší objem znamená menší chladicí plochu. 13
Aerace a přestup kyslíku Aktivní přísun vzduchu do bioreaktoru za současné účinné dispergace vyváří relativně velké mezifázové rozhraní. Hodnotí se pomocí tzv. Stupně dispergace a:
kde Db – průměr bublin (ideálně 2-3 mm), ε – plynová zádrž. Celkový průtok vzduchu bioreaktorem se nejčastěji klasifikuje jako hodnota vvm – volume/volume/minute:
Kde vg – průtok vzduchu (aeračního plynu), vr – objem reaktoru. Přestup kyslíku je základní parametr, který charakterizuje aerobní bioreaktor. Je obvykle vyjádřen koeficientem přestupu hmoty kla, který je konstantou úměrnosti mezi rychlostí přestupu kyslíku z plynné fáze do kapalné (OTR – oxygen transfer rate) a gradientem koncentrací:
kde C*,C – rovnovážná a aktuální koncentrace kyslíku. Rychlost spotřeby kyslíku mikroorganismy nebo biotransformační reakcí je charakterizována vztahem:
kde X – koncentrace biomasy, qo2 – specifická respirační rychlost, µ – specifická růstová rychlost, Yx/o – výtěžnost biomasy na kyslík. Rovnovážnou koncentraci kyslíku ovlivňují především fyzikální vlastnosti média - teplota, tlak a charakter kapaliny (koncentrace solí, viskozita). Aktuální koncentraci pak geometrie nádoby - průměr, kapacita, konfigurace a velikost míchadla, příkon, zarážky, aerace - velikost a umístění distributorů vzduchu, způsob operace, vlastnosti kapaliny (morfologie a koncentrace mikroorganismů, odpěňovací činidla). Ve velkých fermentorech (>5000 L) bývá OTR < 300 mmol/L.h. Zvyšování přestupu kyslíku (OTR) se provádí zvýšením průtoku vzduchu, zvýšením otáček míchadla, zvýšením tlaku v bioreaktoru, zvýšením obsahu kyslíku ve vzduchu. Je však třeba upozornit, že vzájemné závislosti jsou nelineární a jsou popisovány poměrně složitými modely.
14
Kultivační půdy – média Kultivační média jsou nezbytná pro kultivaci - růst a metabolismus mikroorganismů. Dále tvoří vnější prostředí, které ovlivňuje fyziologii a chování mikroorganismů a tím ovlivňují výtěžnost, rychlost tvorby produktu a složení produktu. Živiny obsažené v médiu jsou potřebné pro růst buněk, získávání energie pro syntézu produktů a zachování buněčné integrity. Pro technologické účely dělíme média na KOMPLEXNÍ a DEFINOVANÁ. Komplexní média obsahují zpravidla všechny potřebné živiny v ne zcela přesně definovaném složení, což je dáno jejich původem. Bývá to organický zdroj živin, např. Hydrolyzáty proteinů (peptony), extrakty masa, kvasnic, mléka, různé směsi rostlinných živin apod. Definovaná média mají přesně známé složení, obvykle roztoky minerálních solí, čisté esenciální živných komponent a jeden nebo více zdrojů uhlíku a energie. Médium představuje zdroj stavebního materiálu nebo prekurzorů pro syntézu nových buněčných součástí – sloučeniny, které se stanou součástí biomasy, dále zdroj energie - sloučeniny, které se nestávají přímo součástí biomasy, ale slouží k výrobě energie (jako donory nebo akceptory elektronů). Elementární složení všech mikrobiálních buněk je relativně podobné – možnost odhadu obecných požadavků mikroorganismů na živiny a návrh média – obsah hlavních prvků (C, H, N, O, S, P). Při návrhu složení média je nutno znát biochemii kultivace, jeho případný vliv na metabolismus a fyziologii buněčné populace, dále účel kultivace a průběh DSP. Cena média tvoří přes 50% ceny konečného produktu, je tedy třeba ji zohlednit. Důležitá je také stálost jeho složení. Formulace média je vždy kompromis mezi nutričními požadavky, cenou a dostupností složek. Elementární chemické složení média se určí ze složení biomasy a produktu, výtěžnostních koeficientů a doplňkových experimentů. Uhlíkatý substrát - část je oxidována na CO2 (disimilace), využití takto získané energie je na syntézu biomasy ze zbylé části (asimilace). Poměr asimilované a disimilované části je závislý na stupni redukce C-zdroje. Maximální výtěžnost substrátu čím více oxidovaný zdroj uhlíku, tím více je ho disimilováno a méně asimilováno odrazí se to v YX/S. Hlavní elementární složky médií jsou obvyklé biogenní prvky. Dalšími složkami jsou stopové prvky – Na, Mn, Co, Ni, Cu, růstové faktory - esenciální org. sloučeniny, které si buňka neumí sama syntetizovat, vitamíny – často kofaktory enzymů, Laminokyseliny – především glutamová, puriny a pyrimidiny - syntéza nukleových kyselin, VODA – pitná, deionizovaná, destilovaná, odpěňovadla – povrchové napětí, oleje, polyglykoly polymery (PPG). Při přípravě médií je nutno dbát na pH a iontovou rovnováhu. Ke stabilizaci pH se 15
užívají pufry (organické kyseliny, fosfáty, peptony, TRIS, HEPES). Regulace pH se provádí během kultivací, většinou pomocí NaOH, NH3, H3PO4, H2SO4. Iontová síla i redox potenciál také ovlivňují růst, produkci a produkty.
Příprava inokula Průmyslové kultivační procesy začínají stejně jako laboratorní, z čisté kultury produkčního kmene. Kmeny se uchovávají standardním způsobem, lyofilizované, hluboko zmrazené, nebo klasicky přeočkováváním na pevných, mnohdy selektivních půdách. Revitalizace se obvykle provádí v kapalném médiu. Abychom dosáhli potřebného kultivačního objemu, je zpravidla zapotřebí několika stupňů. Všem stupňům před produkčním se říká inokulační, objemový poměr pro převod je 1:10 až 1:20, může však být i mnohem vyšší; pak je třeba počítat s delší lag fází. V inokulačních stupních je důraz na růst, nikoli produkci, často se používají komplexní média. Stupňů by mělo být co nejméně, mohou způsobit změnu chování nebo charakteru kultury.
Sterilizace u bioreaktorů Řada produkčních procesů je aseptických. Sterilita znamená nepřítomnost živých organismů, tedy vyjma těch produkčních. Kultivačnímu procesu tedy předchází odstranění veškerých živých mikroorganismů ze zařízení a je nutné zabránit vstupu kontaminace po sterilaci. Provádí se tedy sterilizace bioreaktoru a veškerého dalšího zařízení a portů (potrubí, ventily, filtry, příchozí i odcházející vzduch, vzorkovací zařízení, senzory atd.).
Kontaminace způsobuje například: •
Produkci toxinů (bezpečnost produktu, inhibice produkčního kmene)
•
Produkci enzymů (degradace produktu)
•
Snížení výtěžnosti (spotřeba substrátu)
•
Produkci metabolitů (polysacharidy)
•
Spotřebu části substrátu (výtěžnost).
Vlastní sterilizace média a bioreaktoru se provádí: 16
• ostrou párou min 121ºC, 0.2 MPa • horkým vzduchem 150-180ºC • chemicky – ethanol, chlornan sodný, fenol, formaldehyd.... • UV, X-rays – většinou povrchy, prostory • ultrafiltrace – plyny, roztoky • velké bioreaktory in situ (SIP), malé v autoklávu
Hodnocení sterility Používá se tzv. D-hodnota – snížení počtu zárodků na 1/10, která závisí na odolnosti mikroorganismu.
kde n – počet živých zárodků, t – čas sterilizace, k - konstanta MO pro mokré/suché teplo.
Sterilizace vzduchu a odplynů ! Nutnost sterilizace velkých objemů: � Vzdušnění obvykle 1 VVM � 10 m3 reaktor – za 48 h 29 000 m3 vzduchu ! Koncentrace MO ve vzduchu – 1-10/L vzduchu ! Ultrafiltrace – splňuje všechny požadavky, používá se ke sterilizaci vzduchu, hydrofobní membránové filtry v patroně, póry 0.1 µm
Inokulace Inokulace je aseptické převedení inokula do bioreaktoru vyššího stupně. Je vhodné ji provádět pomocí sterilizovatelného potrubního spojení tanků a čerpat tlakem sterilního vzduchu. Také se používají sterilní inokulační jehly a septa v aperturách ve víku bioreaktoru. V tom případě se používají sterilní hadice a čerpání peristaltickými čerpadly - inokulum tak nepřichází do styku s čerpadlem. 17
Základní typy kultivačních procesů ! Vsádková (batch) � Uzavřený systém, není průběžný přítok živin ani odvod metabolitů ! Přítokovaná (fed-batch) � Přítok média ano, odvod média ne – objem reaktoru není konstantní ! Kontinuální (continuous cultivation) � Otevřený systém, plynulý přítok a odtok média, konstantní objem reaktoru �
Vsádková kultivace (batch) Jedná se o uzavřený systém, všechny živiny i inokulum jsou přivedeny na počátku kultivace a postupně spotřebovávány, dochází k akumulaci biomasy a metabolitů. Objem bioreaktoru je konstantní, zanedbává se změna objemu při úpravě pH, odpěňování, vzdušnění. Fáze vsádkové kultivace: •
Lag fáze
•
Exponenciální fáze
•
Stacionární fáze
•
Fáze odumírání
•
Mezi jednotlivými fázemi jsou tranzientní stavy
Snažíme se obvykle o minimalizaci lag fáze, prodloužení a exponenciální fáze. Při produkci ve stacionární fázi se prodlužuje tato. V exponenciální fázi probíhá intenzivní a pravidelný růst – lze ho sledovat jako koncentraci buněk nebo biomasy.
kde x je koncentrace biomasy, µ růstová rychlost, t čas, x0 počáteční koncentrace biomasy. Chceme-li proces urychlit (produkt je přímo spojen s růstem), maximalizujeme růstovou rychlost: •
Složení média, teplota, pH, DOT, koncentrace substrátů atd.
•
Množství vytvořené biomasy přímo úměrné množství spotřebované živiny
•
výtěžnost (yield): 18
•
Rychlost růstu úměrná rychlosti spotřeby živiny a naopak
•
Hodnota yx/s je za různých podmínek různá.
Typický průběh vsádkového procesu v exponenciální fázi ukazuje Obr. 3.7.
Obrázek 3.7. Vsádkový proces
s - substrát, O - rozpuštěný kyslík, P - produkt, X – biomasa, µ – růstová rychlost. Řízením vsádkového procesu se pokoušíme: •
Produkce biomasy – maximální délka exponenciální fáze růstu
•
Produkce primárního metabolitu – prodloužení exponenciální fáze růstu za současné produkce metabolitu
•
Produkce sekundárního metabolitu – krátká exponenciální fáze, prodloužená stacionární fáze.
19
Přítokovaná kultivace (fed-batch) Jedna nebo více živin dávkováno do bioreaktoru během kultivace, produkt zůstává v bioreaktoru, Vr není konstantní. Řízením rychlosti přítokování limitujícího substrátu lze ovlivnit rychlosti spotřeby substrátu řízení reakčních rychlostí a metabolismu. Výhodou je, že řízenou změnou koncentrace živin lze ovlivnit výtěžek nebo produktivitu. Živiny jsou dodávány během kultivace, neodvádí se médium - objem bioreaktoru roste.
Fed-batch kultivace se používá když nastává nebo je třeba: •
Substrátová inhibice (methanol, ethanol, kyselina octová, atd.)
•
Hustá kultura – vysoká koncentrace buněk
•
Glukosový efekt (over-flow metabolismus)
•
Katabolická represe – snadno metabolizovatelný zdroj (glukosa)
•
Optimalizace tvorby metabolitu – produkce ak, řízené udržování nízké koncentrace s
•
Prodloužení produkční fáze (oddělení produkční a růstové fáze) – sekundární metabolity
Strategie řízení přítokování Strategie řízení přítoků při fed-batch kultivacích jsou různé, např. Koncentrace substrátu se udržuje konstantní nebo se mění podle předem připraveného, či adaptivního algoritmu. Pomalý konstantní přítok média vede zpravidla k lineárnímu růstu celkové biomasy, exponenciální přítok média (a v něm limitujícího substrátu) by měl způsobit exponenciální růst. Možné je i přítokování média podle zvoleného parametru spojeného s růstem biomasy nebo produkcí (zpětnovazebná regulace). Přítokování podle předem daného schématu lze realizovat jako přerušovaný nástřik nebo kontinuálně dle vypočtené funkce. Pokud má přítokování reagovat na stav kultivace pak se využívá zpětná vazba je přímá, podle měření koncentrace substrátu v bioreaktoru, podle toho upraven nástřik nebo nepřímá – měření jiných parametrů, které jsou spjaté s metabolismem buňky – DOT, pH, CO2 a O2 v odplynech atd.
Kontinuální kultivace Kontinuální kultivace je otevřený systém, kde dochází k plynulému (nepřetržitému) dodávání živin (média) a zároveň k plynulému odběru média pozměněného metabolickou činností mikroorganismů i s částí biomasy. Rychlost přítoku je rovna rychlosti odtoku, objem bioreaktoru je konstantní. K rozmnožování 20
mikroorganismů dochází za podmínek blížících se optimu. Základním a nejméně náročným typem kontinuální kultivace je chemostat:
V chemostatu je konstantní rychlost přítoku média f a konstantní zřeďovací rychlost d, rychlost přítoku substrátu je tedy rovna rychlosti spotřeby substrátu a mikroorganismy si podle podmínek nastaví konstantní µ a konstantní X. Dalšími typy kontinuálních kultivací jsou např. Turbidistat, kde je konstantní turbidita (koncentrace biomasy) a mění se D (automatická regulace), nebo auxostat, kde je konstantní parametr spjatý s růstem – mění se D (nutristat: S=konst, oxistat: DOT=konst, CO2stat: CO2=konst).
Optimalizace bioprocesu Hlavní faktory, které určují kvalitativní i kvantitativní výsledky bioprocesů jsou: •
Konstrukce a/nebo selekce produkčního kmene
•
Optimalizace složení média
•
Výběr typu kultivace
•
Podle optimalizovaného parametru, technických možností a dalších kritérií
•
Optimalizace kultivačních parametrů (pH, teplota, aerace, míchání...)
Optimalizace složení média Prvním krokem je určení kvalitativního a semikvantitativního složení média. Za tím účelem se provádějí baňkové pokusy a ke snížení počtu experimentů se využívají optimalizační metody, např. Experimentální design odvozený od response surface methodology, optimal či central composition design. Velmi důležitá je ekonomika složení média, zvláště v produkčních stupních. Dalším krokem je určení kvantitativního složení média, kde se vychází z experimentů v laboratorním fermentoru a vhodného strukturovaného modelu s bilancí procesu. Matematický model procesu nebo zařízení zahrnuje vztahy popisující jeho chování v čase, je tvořen diferenciálními a nelineárními rovnicemi. Základem bývá bilance:
VSTUP + ZDROJ = VÝSTUP + AKUMULACE 21
Model procesu či zařízení je pro reálné použití třeba identifikovat, určit hodnotu konstant a parametrů. Používají se metody shody experimentu s předpovědí modelu, např. Aproximace empirických dat metodou nejmenších čtverců. Optimalizačními kritérii jsou pak extrémy funkcí, kritérium optimalizace nazýváme účelovou funkcí. Optimalizované proměnné jsou obvykle µ, π, YP/X, YP/S.
Optimalizace kultivačních parametrů Základními kultivačními parametry jsou: ! Teplota � Optimální růstová teplota kmene, lze využít pro změny rychlosti růstu a produkce ! pH � Optimální růstové pH kmene, lze omezit kontaminaci, vliv složení média, indikátor metabolismu ! Aerace (řízení DOT) � Podle metabolismu produkce, limitace kyslíkem v různých fázích, řízení dostupnosti energie, změny metabolismu
Monitoring a automatizace Prvky zajišťující monitoring a automatizační hardware a software jsou v dnešní době již konstrukčními součástmi bioreaktorů. Reaktory jsou vybaveny senzory a zařízeními pro měření základních stavových veličin, jako jsou pH, teplota, do, redox, dco2, odplyny, x, s, p a pro měření a řízení základních procesních parametrů, jako jsou otáčky míchadla, průtok vzduchu, tlak, přítoky. Ještě v nedávné době to bylo realizováno prostřednictvím analogových měřících a řídících jednotek, dnes je standardem ddc (direct digital control) realizované plc (procesními počítači. S nimi spolupracují nadřazené monitorovací, archivační a řídící systémy.
Základní regulace chodu bioreaktoru se dotýká: ! pH – automatizované dávkování H+ a OH! Teplota – dvojitý plášť, pára, tepelná média ! DO (koncentrace rozpuštěného kyslíku – � Otáčky míchadla – asynchronní elektromotory, frekvenční měniče � Průtok vzduchu - kompresory, turbodmychadla, škrtící regulace podle MS 22
(hmotová spektrometrie) měření � Tlak – tenzometrická čidla, regulace na výstupu podle SP (set-point, žádaná hodnota) ! Přítokování � Tlakové nebo peristaltické pumpy, měření nejpřesněji vážením reaktoru nebo zásobníku.
Kultivace rekombinantních mikroorganismů Prokaryotní expresní systém – E. coli Dosud nejvíce využívaný prokaryotní expresní systém, zejména pro enzymy a proteiny je prokaryotní expresní systém – E. coli. Produkce proteinů probíhá v cytoplasmě a periplasmatický prostor, k dispozici je mnoho expresních vektorů a promotorů. Nevýhodami jsou nestabilita vektorů, poruchy v iniciaci translace a elongace, nestabilita mRNA a toxicita produktů pro hostitelskou buňku. Kultivace rekombinantní E. coli má ale řadu výhod, lze kultivovat do vysoké hustoty (HCDC) – (fed-batch), lze využít konstitutivní i regulované exprese (regulace promotoru negativně represí nebo pozitivně – indukcí). Obvyklou kultivační strategií je v první fázi nárůst biomasy, v další indukce exprese. Rizikem je možná špatná konformace proteinů (folding), agregace za vzniku inkluzních částic. Obvykle se to řeší snížením kultivační teploty – redukce rychlosti syntézy proteinů, správné sbalení. Doba kultivace je závislá na kmeni a médiu, indukuje se často ve vrcholící exponenciální fázi, vetšinou se tak získá maximum biomasy. Jako strategie se užívá batch i fed-batch. Doba exprese je závislá na kmeni a médiu, v produkční fázi dochází ke zpomalení růstu – vliv nižší teploty a a probíhající exprese. Bývá nutné experimetální stanovení optimálního lineárního přítokování. Samovolné zvýšení růstové rychlosti často znamená ztrátu plasmidu. Kultivaci je třeba ukončit před přechodem k degradaci produktu. Obvyklá doba 12 – 40 hodin.
Eukaryotní expresní systém - Pichia pastoris Eukaryotní expresní systém je mladší generace, velmi populární, pracuje v methylotrofní kvasince pichia pastoris. Disponuje silným promoterem pro alkoholoxidasu AOX, výhodou je snadná indukce a regulace. Kvasinka má silně respirativní růst, kultivace se daří v hustých kulturách. Používá se pro expresi velkých proteinů (>50 kD). Výhodou je rovněž posttranslační modifikace – glykozylace, odstranění signálních peptidů, tvorba disulfidových můstků. 23
Kultivace rekombinantní P. pastoris je třístupňový proces, proto je zde nutnost optimalizace vyšší než jinde. První fází je batch na glycerolu, kdy se vyprodukuje biomasa za současné represe genové exprese. Následuje adaptační fáze – první fed-batch, kdy je glycerol přítokován rychlostí limitující růst a poslední je produkční fáze – druhý fed-batch, kdy je methanol (směs methanol+glycerol) přítokován v závislosti na fenotypu, dochází k indukce exprese.
Použité zdroje ! Kultivační techniky, sylabus ÚKCHB VŠCHT � http://www.vscht.cz/kch/kestazeni/sylaby/kultivtech.pdf ! Bioinženýrství kvasných procesů (Mojmír Rychtera a Jan Páca, VŠCHT Praha 1987) ! Fyziologie bakterií (František Kaprálek, SPN 1986) ! Bioinženýrství (František Kaštánek, Academia 2001)
Doporučená literatura Goering R.V.., H.M.Dockrel., M.Zuckerman., D.Wakelin., I.M.Roit., C.Mims., P.L. Chiodini. (2008) Medical Microbiology (4th Edition). Elsevier . USA. Ozturk. S. S., Wei-Shou Hu (eds.).(2008) Cell Culture Technology for Pharmaceutical and cell based therapies. Taylor, Francis Book, New York, London. S. Maulik., S.D. Patel (eds),(1997). Molecular Biotechnology – Therapeutic Applcations and Strategies. Wiley-Liss. USA. Arora, D.K., G.G. Khachatourians.(2004). Applied Mycology and Biotechnology (vol.4 Fungal genomics). Elsevier. Amsterdam.
A. Pischinger.(2007). The Extracellular Matrix and Ground Regulation. Basis for a Holistic Biological Medicine. North Atlantic books. Berkeley, Ca. Kultivační techniky. Sylabus ÚKCHB VŠCHB. 24
Kaprálek F. (1986) Fyziologie baktérií.SPN Praha.
Kaštánek F. (2001). Bioinženýrství. Academia (Praha). Rychtera, M., J.Páca.: Bioinženýrství kvasných procesů. Skripta VŠCHT Praha.
Internetové zdroje http://www.vscht.cz/kch/kestazeni/sylaby/kultivtech.pdf
25
