NYÚLEMBRIÓK ELŐÁLLÍTÁSA IN VITRO ÉS MIKROMANIPULÁCIÓS

SZENT ISTVÁN EGYETEM Állattenyésztés Tudományi Doktori Iskola

NYÚLEMBRIÓK ELŐÁLLÍTÁSA IN VITRO ÉS MIKROMANIPULÁCIÓS MÓDSZEREKKEL, VALAMINT EMBRIÓ MÉLYHŰTÉS FEJLESZTÉSE AZ ELŐBBI ELJÁRÁSOK TÁMOGATÁSÁRA

Doktori (PhD) értekezés

Polgár Zsuzsanna

Gödöllő 2012

A doktori iskola megnevezése:

Állattenyésztés-tudományi Doktori Iskola

tudományága:

Állattenyésztés-tudomány

vezetője:

Professzor Dr. Mézes Miklós D.Sc., akadémikus Tanszékvezető, egyetemi tanár, Szent István Egyetem Mezőgazdaság- és Környezettudományi Kar, Állattudományi Alapok Intézet, Takarmányozástani Tanszék

témavezető:

Professzor Dr. Dinnyés András D.Sc. Laboratóriumvezető, egyetemi tanár Szent István Egyetem Mezőgazdaság- és Környezettudományi Kar, Állattudományi Alapok Intézet, Molekuláris Állatbiotechnológiai Laboratórium

..…………………………………

….……………………………......

Az iskolavezető jóváhagyása

A témavezető jóváhagyása

II

TARTALOMJEGYZÉK

TARTALOMJEGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK ..........................................................................................................................................3 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ..................................................................................................................................5 1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉSEK ..................................................................................................................7 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS.................................................................................................................................9 2.1. A NYÚL BIOTECHNOLÓGIA MÉRFÖLDKÖVEI .....................................................................................................9 2.2. TESTI SEJTES KLÓNOZÁS .................................................................................................................................10 2.2.1. Fajok közötti testisejtes klónozás...........................................................................................................12 2.2.2. A klónozás technikai lépései ..................................................................................................................12 2.3. A RECIPIENS PETESEJT ....................................................................................................................................14 2.3.1. In vitro érlelt petesejt.............................................................................................................................14 2.3.2. In vivo érett petesejtek ...........................................................................................................................14 2.3.3. Az enukleáció .........................................................................................................................................15 2.4. A DONOR SEJT .................................................................................................................................................16 2.4.1. Donor sejt típusok..................................................................................................................................16 2.4.2. A sejtciklus hatása .................................................................................................................................17 2.4.3. Epigenetikai státusz (hiszton acetiláció, metiláció)..............................................................................18 2.5. FÚZIÓ ÉS AKTIVÁCIÓ.......................................................................................................................................19 2.6. EMBRIÓTENYÉSZTÉS .......................................................................................................................................20 2.7. EMBRIÓ MÉLYHŰTÉS ......................................................................................................................................21 2.8. EMBRIÓ BEÜLTETÉS ........................................................................................................................................22 2.9. VEMHESSÉG-KÖVETÉS ÉS UTÓDVIZSGÁLAT ...................................................................................................24 3. ANYAG ÉS MÓDSZER .....................................................................................................................................25 3.1. IN VITRO MATURÁCIÓ .....................................................................................................................................25 3.1.1. Az alkalmazott nyúlfajta ........................................................................................................................25 3.1.2. Petefészek- és petesejtgyűjtés ................................................................................................................25 3.1.3. Az In Vitro Maturációs (IVM) rendszer ................................................................................................26 3.1.3.1. A petefészek szállítása .....................................................................................................................................26 3.1.3.2. Az IVM inkubációs hőmérséklete ...................................................................................................................26 3.1.3.3. Az IVM médium kiegészítései.........................................................................................................................26

3.1.4. A petesejtek értékelése ...........................................................................................................................27 3.1.5. A petesejtek parthenogenetikus aktiválása............................................................................................28 3.1.6. Eredmények értékelése...........................................................................................................................28 3.2. TESTI SEJTES SEJTMAGÁTÜLTETÉS, KLÓNOZÁS ..............................................................................................29 3.2.1. Alkalmazott nyúlfajta és tartása ............................................................................................................29 3.2.2. Donor állatok szuperovulációja ............................................................................................................29 3.2.3. Petesejtgyűjtés........................................................................................................................................30 3.2.4. Petesejtek enukleációja..........................................................................................................................30 3.2.5. Donor sejt előkészítés ............................................................................................................................31 3.2.6. Sejtmagátültetés .....................................................................................................................................31 3.2.7. In vitro embriótenyésztés .......................................................................................................................32 3.2.8. Embrió beültetés, vemhesség követés és születés..................................................................................32 3.2.9. Állatkísérleti engedélyek........................................................................................................................33 3.2.10. Eredmények értékelése.........................................................................................................................33 3.3. EMBRIÓ MÉLYHŰTÉS ......................................................................................................................................34 3.3.1. In vivo embrió előállítás ........................................................................................................................34 3.3.2. In vitro embrió előállítás .......................................................................................................................34 3.3.3. Szilárd felszínű vitrifikációs (SSV) technika .........................................................................................35 3.3.4. Műszalmás vitrifikációs technika (VS3a) ..............................................................................................36 3.3.5. Eredmények értékelése...........................................................................................................................36 4. EREDMÉNYEK ..................................................................................................................................................37 4.1. IN VITRO MATURÁCIÓS EREDMÉNYEK ............................................................................................................37 4.1.1. A különböző tényezők együttes hatása a maturációra ..........................................................................37 4.1.2. Különböző maturációs médiumok hatása a petesejtérésre és a későbbi embriófejlődésre .................38

3

TARTALOMJEGYZÉK 4.1.3. Az in vitro maturáció dinamikája..........................................................................................................40 4.2. SEJTMAG-ÁTÜLTETÉSES KLÓNOZÁSI EREDMÉNYEK .......................................................................................41 4.2.1. A TSA-val kezelt klónozott embriók in vitro fejlődése ..........................................................................41 4.2.2. A TSA-val kezelt klónozott embriók in vivo fejlődése ...........................................................................41 4.2.3. Klónozott nyúlfiókák posztnatális fejlődése ..........................................................................................43 4.2.4. A Parthenogenetikus ko-transzfer hatása .............................................................................................48 4.3 EMBRIÓ MÉLYHŰTÉSI KÍSÉRLETEK EREDMÉNYEI ............................................................................................49 4.3.1. Két mélyhűtési technika összehasonlítása.............................................................................................49 4.3.2. Az in vitro és in vivo nyúlzigóták mélyhűtésének összehasonlítása......................................................50 5. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK .............................................................................................................53 6. EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE ÉS JAVASLATOK .............................................................................55 7. ÖSSZEFOGLALÁS ............................................................................................................................................62 8. SUMMARY ..........................................................................................................................................................64 9. MELLÉKLETEK................................................................................................................................................66 9.1. A FELHASZNÁLT OLDATOK .............................................................................................................................66 9.2. IRODALOMJEGYZÉK ........................................................................................................................................71 9.3. PUBLIKÁCIÓS LISTA ........................................................................................................................................92 9.3.1. A disszertáció témájához kapcsolódó publikációk................................................................................92 9.3.2. Nem a disszertáció témájához kapcsolódó publikációk........................................................................94 10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ..........................................................................................................................98

4

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE


BSA

Bovine Serum Albumin (szarvasmarha savó albumin)

cAMP

ciklikus Adenozin-MonoPhosfat

CHX

Cikloheximid

COC

Cumulus Oocyete Complex (kumulusz petesejt komplex)

CPA

Cryoprotective additive (Mélyhűtési védőanyag)

CR1aa

C. Rosenkrans médium (Rosenkrans et. al. 1993)

DACH

Hiszton deacetiláz

DMAP

6-dimetilaminopurin

DMEM

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium

DMSO

Dimetil szulfoxid

E2

Eostrogen (Ösztrogén)

EBSS

Earle’s Balanced Salt Solution

EDTA

Etiléndiamintetraacetik Acid

EG

Etilén glikol

EGF

Epidermal Growth Factor (epidermális növekedési faktor)

EGFP

Enhanced Green Fluorescens Protein (javított zöld fluorescens fehérje)

ESC

Embryonic Stem Cell (embrionális őssejt)

ET

Embryo Transfer (embrió átültetés)

FBS

Fetal Bovine Serum (úszülött szarvasmarha savó)

FCS

Fetal Calf Serum (újszülött borjú savó)

FSH

Follicular Stimulating Hormon (follikulus stimuláló hormon)

GnRH

Gonadotrop Releasing Hormon

GV

GerminalVesicle (germinális vezikulum)

GVB

Germinal Vesicle Breakdown (germinális vezikulum lebomlása)

hCG

Human Chorion Gonadotropin

HDAC

Histone Deacetylase (hiszton deacetiláz)

hpc

hours post coitum (párzás után eltelt órák)

IGF-I

Insulin-like Growth Factor-I

i.m.

Intra Muscular

IP3

Inositol 1, 4, 5-triphosphate

5


iSCNT

Interspecies Somatic Cell Nucleat Transfer (Fajok közötti testi sejtes sejtmag-átületés)

IU

International Unit (Nemzetközi Egység)

i.v.

Intra Venous

IVM

In Vitro Maturation (In vitro érleltetés)

IVMM

In Vitro Maturációs Médium

KSOM

Kalium Simplex Optimized Medium

LH

Luteinization Hormon

LN2

Liquid Nitrogen (folyékony nitrogén)

MAPK

Mitogen Activated Protein Kinase

MPF

Maturation Promoting Factor (érettséget elősegítő faktor)

NT

Nuclear Transfer (sejtmagátültetés)

OPS

Open Pulled Straw Vitrification (nyitott, húzott műszalmás mélyhűtési technika)

Pb

Polar body (sarki test)

PBS

Phosphate Buffered Saline

PDE

Phosphodiesterase

PG

Propilén glicol

PKA

Protein Kináz A

PMSG

Pregnant

Mare

Serum

Gonadotropin

(vemhes

kanca

gonadotropin) PRL

Prolaktin

PVA

Poli Vinil Alkohol

SCNT

Somatic Cell Nuclear Transfer (Testi sejtes sejtmag-átültetés)

SO

Superovulation (szuperovuláció)

SSV

Solid Surface Vitrification (szilárd felszínű vitrifikáció)

TSA

Trichostatin A

TCM 199

Tissue Culture Medium (szövettenyésztő médium)

UV

Ultra Violet

6

szérum

BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉSEK

1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉSEK A nyúl fontos modell állat, amely széles körben alkalmazható különböző emberi betegségek tanulmányozása során. Fizio-patológiás hasonlóságai miatt gyakran használják modellállatként szív és érrendszeri, légúti és fertőző, valamint rákos megbetegedések vizsgálatakor (Foote és Carney 2000). Régóta kulcsfontosságú szerepet tölt be a korai humán embrionális fejlődés kutatásában is, annak köszönhetően, hogy a nyúl ezen tulajdonságában közelebb áll a főemlősökhöz, mint a rágcsálókhoz. Olyan humán betegségek vizsgálatához, melynél ismert a genetikai probléma, előállíthatóak olyan genetikailag módosított (transzgénikus) állatok, amelyek alkalmasak a betegség modellezésére és gyógyszerek tesztelésére. Transzgénikus állatokban a genetikai örökítőanyagban hoznak létre változást egy új vagy megváltoztatott működésű gén bevitelével (transzgenezis), illetve egy jelen lévő gén helyspecifikus beépítésével vagy kicserélésével (knock in) vagy kiütésével, elrontásával (knock out). A transzgenezist általában úgy érik el, hogy az adott génkonstrukciót a zigóta előmagvába injektálják (mikroinjektálás), ez a technika azonban nem teszi lehetővé az irányított génbeépülést. Egy, az egér esetében már húsz éve alkalmazott, finomabb módszer az embrionális őssejt technológia, amellyel olyan genetikailag módosított állatok hozhatók létre, ahol a génbevitel homológ rekombináción alapul (knock out, knock in). Ez az eljárás nyúl esetében azonban még nem megoldott, és ennek hiánya komolyan akadályozza e modellállat teljes körű kihasználtságát. Más állatfajok, mint például sertés, juh vagy a szarvasmarha esetében, ahol szintén nem működik az embrionális őssejt technológia, genetikailag módosított testi sejteken alapuló sejtmag-átültetéses klónozás nyújt technikai megoldást erre a problémára. Tehát a szomatikus sejtes klónozásnak, mint technológiai rendszernek nagy jövője lehet a géntargetált transzgénikus nyúl hatékony létrehozásában. Munkám célja az volt, hogy a biotechnológiai alapmódszereket hatékonyan alkalmazzam és fejlesszem nyúlban, amivel új alap és alkalmazott kutatási lehetőségek nyílhatnak meg. A fejlesztés eredményeként kevesebb kísérleti állat felhasználásával, gazdaságosabban és állatvédelmi szempontból kedvezően lehet nyúl petesejteket és embriókat előállítani, illetve tárolni a biotechnológiai kísérletekhez. Munkám során vágóhídi petefészekből in vitro maturációval állítottam elő érett petesejteket. Vizsgálataim célja az in vitro nyúlpetesejt-érleltetés egy eredményes és hatásos módszerének kidolgozása volt. Az in vitro petesejtérlelés gyakorlati hasznosításának számos

7

BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉSEK

jelentősége lehet. Például a daganatos betegségekben szenvedő fiatal nők esetében a tartós kemoterápia és besugárzás előtt a betegek petefészkéből kinyert petesejtjeinek illetve petefészek graftjainak a mélyhűtéssel történő tárolását követően, a felolvasztás után, ahhoz hogy a petesejtek termékenyítésre alkalmas állapotba kerüljenek maturáltatni kell őket. A maturáció után termékenyített petesejt már alkalmas arra, hogy az anyába való beültetését követően gyermek fejlődjön belőle. A petesejtérlelésnek állatok esetében is fontos szerepe van. Veszélyeztetett állatfajok elpusztult nőstény egyedeiből a még időben eltávolított petefészket mélyhűtve tárolhatjuk, vagy pedig a belőlük kinyert petesejtekből génbankokat hozhatunk létre (ex situ génmegőrzés). Ha a későbbiekben a petesejtekből utódokat szeretnénk létrehozni, és recipiensként egy fajazonos nőstény, valamint elegendő mennyiségű fajazonos sperma is rendelkezésünkre áll, akkor a mélyhűtéssel tárolt petesejtek felolvasztása után, in vitro körülmények között érleltetjük a nőivarsejteket. Ezen érett petesejtek termékenyítéséből származó embriók beültetésével létrehozhatunk egy szaporulatot, amely ennek a veszélyeztetett állatfajnak az egyedszámbeli növekedését eredményezheti. Munkám során bekapcsolódtam a testi sejtes klónozás hatékonyságának növelésére irányuló kutatásokba. A kísérletek során a donor sejtek genetikai állományát kémiai úton megpróbáltuk hasonlóvá tenni a természetes zigótáéhoz. Habár sok esetben a klónozott embriók elkezdenek osztódni, de a beültetés után nem tapadnak meg, vagy egy idő után elhalnak. Ezt a problémát a klónozottak mellé parthenogenetikus embriók beültetésével kívántuk megoldani. További feladatom volt még, hogy mélyhűtési eljárásokat próbáljak ki korai nyúl embriókon és hasonlítsam össze hatásukat. A mélyhűtési eljárások általában hatékonyabbak fejlettebb, több sejtes embriókon, mert a nagyobb sejtszám és struktúra miatt jobb a mélyhűtés utáni túlélési esélyük. A nyúlnak a korai embriófejlődése sajátos, mert a petevezetőn végighaladó és fejlődő embrióra mucin réteg rakódik, ami segíti az embriót a méhben való beágyazódásban. In vitro körülmények közt előállított embriók esetében ez a mucin réteg hiányzik, ami megnehezítheti a későbbi preimplantációs embriók (blasztociszta) visszaültetését az anyaméhbe. A jobb vemhesülés érdekében korai embriókat (zigóta, 2-4 sejtes embrió) ültetnek vissza a petevezetőbe. A korai embriók mélyhűtve tárolása ezért nyúl esetében célszerű. Munkám során in vivo és in vitro előállított nyúl zigótákat mélyhűtöttem és vizsgáltam a felolvasztás utáni túlélésüket valamint in vitro fejlődésüket. Dolgozatom a nyúl petesejtek in vitro maturáltatását, testisejtes klónozást illetve korai nyúlembriók vitrifikációját és ezeken a területeken elért eredményeket mutatja be.

8

IRODALMI ÁTTEKINTÉS

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

2.1. A NYÚL BIOTECHNOLÓGIA MÉRFÖLDKÖVEI

Biotechnológiai módszereket már elég korán alkalmaztak nyúlon, az első sikeres nyúl embrió átültetés 1890-ben volt (Heape 1890). Ezek után a nyúl, mint reprodukciós modell állat használata jelentős fejlődésnek indult. Petevezetője és méhe alkalmasnak bizonyult más állatfajok embrióinak tenyésztésére és az in vitro kultiváció kifejlesztéséig egy egyszerű és olcsó megoldásnak bizonyult (Chang et al., 1971; Ellington et al., 1990; Totey et al., 1992; Petters és Wells, 1993). A nyúl szintén jó modell volt különböző mikromanipulációs technikák kipróbálására és fejlesztésére. Ilyenek voltak például transzgénikus nyúl előállítása előmagvas injektálással (Hammer et al., 1985), identikus ikrek előállítása embrió felezéssel (Yang és Foote, 1987), élő utód létrehozása intracitoplazmatikus sperma injektálással (ICSI) (Deng és Yang, 2001), kimérák készítése belső sejtcsomóból (ICM) származó sejtek (Giles et al., 1993) illetve embrionális őssejtek (Zakhartchenko et al., 2011) morulába vagy blasztocisztába történő injektálásával, sejtmag-átültetéses klónozás blasztomer (Stice és Robl, 1988), kumulusz (Chesné et al., 2002), fibroblaszt (Li S. et al., 2006), mezenchimális (Zakhartchenko et al., 2011) és embrionális őssejtek felhasználásával (Fang et al. 2006). Sok esetben bizonyos technikák nehezebben kivitelezhetőek nyúlon, mint más állatfajon, ennek ellenére számos biotechnológiai módszert sikerült adaptálni. Az embrionális őssejt (ESC) technológia egéren már három évtizede működik (Evans és Kaufman, 1981), s habár nyúlon is számos próbálkozás történt ESC alapításra (Cole et al., 1966; Graves és Moreadith, 1993; Schoonjans et al., 1996, Fang et al., 2006; Wang et al., 2006), klónozás utáni sikeres embrió fejlődés (Du et al., 1995) és élő klón utód (Fang et al. 2006), valamint élő kiméra utód embrionális őssejtből történő előállítása csak a közelmúltban vált sikeressé (Zakhartchenko et al., 2011).

9


2.2. TESTI SEJTES KLÓNOZÁS Néhány évvel az első, juhon végzett sikeres felnőtt szomatikus sejtmag-átültetés után (Campbell et al., 1996a; Wilmut et al., 1997), nagy előrelépés volt megfigyelhető a különböző fajokon. Magzati és/vagy felnőtt szomatikus sejtekből sikeresen klónoztak szarvasmarhát (Cibelli et al, 1998), kecskét (Baguisi et al., 1999; Keefer et al., 2001), egeret (Wakayama et al., 1998), sertést (Betthasuser et al., 2000; Onishi et al., 2000; Polejaeva et al., 2000), gaurt (Lanza et al., 2000), muflont (Loi et al., 2001), macskát (Shin et al., 2002), nyulat (Chesné et al., 2002), öszvért (Woods et al., 2003), lovat (Galli et al., 2003), patkányt (Zhou et al., 2003), vadmacskát (Gomez et al., 2004), kutyát (Lee et al., 2005), vadászgörényt (Li Z. et al., 2006), gímszarvast (Berg et al., 2007), vizibivalyt (Shi et al., 2007) és a közelmúltban kőszáli kecskét is (Folch et al., 2009). A klónozási folyamat hatékonysága azonban alacsony, azoknál a sikeres kísérleteknél is ahol élő utódok születtek (2.2. táblázat). Az eredményesség és a klónozáshoz kapcsolódó problémák eltérőek a fajok között. A szarvasmarha sejtmag-átültetéses klónozása eredményezte a legtöbb klónozott állatot és a legnagyobb hatékonyságot is ezen a fajon érték el. A sikert nagyban befolyásolják a részfolyamatok, az in vitro embrió-előállítás és az embrió transzfer hatékonysága. Bizonyos fajok esetében ezek a technológiák gyakran kevésbé fejlettek. A sertés klónozás kapcsán találhatjuk a legjobb példát arra, hogy egy fajra jellemző problémát milyen technológiai lépésekkel lehetett megoldani. A kutatók sorozatos sejtmagátültetést alkalmaztak (Polejaeva et al., 2000), a fejlődő klónozott zigóta előmagvát egy enukleált zigótába tették, és ezzel a technikai lépéssel sikeresen létrehozták az első klónozott sertést. Ugyancsak sikerrel jártak azok a próbálkozások, amikor megváltoztatták a manipulációs módszereket és a sejt fúzió helyett injektálást alkalmaztak (Onishi et al., 2000) vagy mikor hatékonyabb in vitro petesejt érlelési és aktiválási módszert használtak (Betthauser et al., 2000). E mellett nagyon fontos szempont az embrió-ültetésnél, hogy elengedhetetlen egy minimális számú magzat jelenléte a vemhesség megtartásához. Ez azonban sokszor nem megoldható és az alacsony életképességű klónozott embriók nem elegendőek a sikeres vehem kihordásához. Egy újszerű vemhesség-fenntartási technika segített feloldani ezt a problémát (De Sousa et al., 2002), amikor a vemhességi szignál erősítése céljából parthenogenetikus embriókat ültettek a klónozottak mellé.

10

2.2. táblázat Klónozási hatékonyság különböző állatfajok esetében (LesleyPaterson és a szerző kiegészítései)


11


2.2.1. Fajok közötti testisejtes klónozás Fajok közötti NT (iSCNT) esetében lehetőség van bizonyos fajok rendelkezésre álló petesejtjeit felhasználni más fajok genetikai anyagának befogadására. Az első ilyen módón létrehozott embrió előállításának közleménye óta számos publikáció jelent meg, melyekben a kutatók arról számoltak be, hogy ember (Chang et al., 2003), juh, sertés és majom sejtmagvakat ültettek szarvasmarha petesejtbe melyekből blasztociszta embriók fejlődtek (Dominko et al., 1999), és ugyancsak sikerrel jártak amikor Rhesus makákó nukleuszt ültettek nyúl petesejtbe (Yang et al 2003). Egzotikus fajokon is végeztek kísérleteket, például a macska petesejtbe ültetettek tigris nukleuszt (Hwang et al., 2001). Számos humán őssejtvonalat is alapítottak olyan embriókból, ahol nyúltól származott a recipiens petesejt (Chen et al., 2003). A legsikeresebb kísérlet (Lanza et al., 2000) egy olyan élve született gaur borjúról számolt be, ahol gaur sejtmagokat ültettek át enukleált szarvasmarha petesejtbe. A NT gaur borjú nem sokkal születés utáni halála azt jelzi, hogy a klónozási folyamat okozhatta a későbbi komplikációkat. Szarvasmarha és gaur viszonylag közeli rokonságban álló fajok, azonban a fajok közötti embrióátültetés is felelős lehetett a perinatális elhalálozásért, ahogy azt be is bizonyították amikor in vitro előállított gaur embriókat ültettek szarvasmarhába (Hammer et al., 2001). A technológia magában foglalja a fajok közötti mitokondriális DNS (mtDNS) kimérizmus (heteroplazmia) problémáját is, és a legtöbb faj-kombináció esetében az embriók fejlődése félbeszakadt néhány osztódás után (Jiang et al., 2005). A Bos indicus (zebu) és Bos taurus (európai szarvasmarha) NT kombináció esetében a donor sejt mtDNS mennyisége lecsökkent vagy teljesen eltűnt az NT embriók korai fejlődése során (Meirelles et al., 2001). Ugyanakkor számos publikációban rámutattak, egyéb tényezők mellett iSCNT embriók fejlődési rendellenességeire, ami nem annyira az embrionális genom aktiváció elromlásával (Bowles et al., 2007) mint inkább a sikertelen átprogramozásával és az embrionális gén aktiváció elindulásával magyarázható (Chung et al., 2009).

2.2.2. A klónozás technikai lépései A testi sejtes sejtmag-átültetési technológia lépései hasonlóak a különböző állatfajok esetében. A nyúlnál is, mint megannyi más háziállat esetében, szükség van egy recipiens enukleált petesejtre és egy szomatikus donor sejtre. (2.2.2. ábra). Ezt a két részt különböző

12


eljárássokkal lehet egyesíteni (fúzió, injektálás), majd a létrehozott „konstrukciót” osztódásra kell bírni (aktiváció). A sikeresen fejlődésnek indult embriót álvemhes recipiensbe ültetjük, hogy megtapadjon és ott folytathassa fejlődését. A technikai lépések adott faj sajátosságaihoz történő igazításával kónozott egyedek sikeres előállítása válik lehetővé. A következő fejezetekben a nyúlra vonatkozó speciális technikai lépések fejlődését mutatom be.

2.2.2. ábra A testi sejtes klónozás menete nyúlon

13


2.3. A RECIPIENS PETESEJT 2.3.1. In vitro érlelt petesejt Számos fajnál az in vitro érlelt petesejteket rutinszerűen használják testi sejtes klónozáshoz, (Lonergan et al., 2000; Kasinathan et al., 2001) de sajnos ez nyúl esetében nem olyan elterjedt (Park et al., 1998 Yin et al., 2002a). Pincus és Enzmann (1935) voltak az elsők, akiknek sikerült petefészekből kinyert nyúlpetesejteket in vitro körülmények között maturáltatni. Edwards számolt be hasonló eredményekről 30 évvel később egér, juh, szarvasmarha, sertés, makákó és ember esetében (Edwards 1965). Sok publikációt találni petesejtek in vitro maturáltatásról, azonban nyúlon viszonylag kevesen dolgoztak. Chung (Chung et al., 1974) különböző fehérje, aminósav és hormon kiegészítések hatásait vizsgálta nyúlpetesejtek in vitro maturációjára. Tanulmányában rámutatott a BSA neutrális hatására, viszont a teljes szérum használata esetén degradációt tapasztalt. A különböző aminósav kiegészítések vizsgálatakor a prolin és a glutaminsav volt a maturációra kedvező hatással. A hCG alkalmazásakor a maturációra gyakorolt pozitív hatást nem tapasztalt. Bae és Foote különböző osmolaritású maturációs médiumokat hasonlított össze (Bae and Foote 1980). A maturálódott petesejtek aránya a 250-310 mOsm oldatokban 60%körüli volt míg ezen értékek alatt illetve felett a maturációs ráta szigmifikánsan csökkent. Yoshimura és munkatársai különböző hormonok nyúlpetesejtek in vitro maturációjára kifejtett hatását vizsgálták (Yoshimura et al., 1989). Azt tapasztalták, hogy LH és FSH kiegészítéseken túl oestradiolt adva (E2 1µg/ml) a maturációs oldathoz a petesejtekből fejlődő morulák és blasztociszták aránya szignifikánsan nőtt. Prolaktin esetében ez az arány dózistól függően nőtt, de alacsonyabb maradt, mint E2 esetében. Lorenzo és munkatársai a petesejteket IGF-I-gyel kezelte (Lorenzo et al., 1997), így a germinális vezikulum lebomlása (GVBD) és a metafázis II. petesejtek aránya szignifikánsan megnövekedett.

2.3.2. In vivo érett petesejtek A legtöbb nyúl sejtmag-átültetéses kísérletben in vivo érlelt és ovulált petesejteket használnak, amelyeket általában a petevezető átmosásával nyernek ki és gyűjtenek össze (Maurer, 1978). Változatos szuperovulációs protokollokat lehet alkalmazni a petesejt termelés növelésére, és mintegy 30-40 ivarsejtet nyerhető ki egy anyanyúltól (Beatty, 1958; Kenelly és Foote, 1965; Maurer et al., 1968; Kauffman et al., 1998). A szuperovulációs kezelésekre a különböző fajták 14


eltérően reagálnak és a kinyert petesejtek száma és minősége is eltérő. A szuperovulációs protokollok befolyásolhatják a keletkező embriók minőségét, beleértve a sejtek számát, azok érzékenységét a mélyhűtésre és a későbbi vemhességi rátát (Carney és Foote, 1990; Kauffman et al., 1998). A petesejtek korának is fontos szerepe van a későbbi fejlődésre. A leghatékonyabb in vitro fejlődést 16 órával a hCG beadása utáni petesejtekkel érték el (Collas és Robl, 1990), mások 12 órás petesejtet használva kaptak élő utódot (Du et al., 2009). A fiatalabb petesejtek nagyobb arányban fuzionáltak és gyorsabban fejlődtek, mint a korábban ovuláltak (öregebb petesejtek), ugyanakkor utóbbiak könnyebben aktiválódtak (Cervera és Garcia-Ximénez 2003). A poszt-ovulációs kor mellett az öregedés feltételei is fontosak abból a szempontból, hogy a későbbi donor sejt fejlődését hogyan támogatják. A 19 órán át in vivo érlelt petesejtek citoplazmája megközelíti az interfázisos állapotot és ezzel csökkenti az aszinkronitást a donor sejt és a befogadó környezet között (Adenot et al., 1997). A petesejt donor fajtája is jelentős hatást gyakorol a nukleár-transzfer kimenetelére, amint ezt már korábban bebizonyították egér (Wakayama et al., 2001) és juh esetében (Dinnyés et al., 2001b). Eddig csak néhány nyúl fajtát vizsgáltak sejtmag-átültetéses kísérletekben (Chesne et al., 2002 [Új-Zélandi fehér x Fauve-de-Bourgogne F1]; Mitalipov et al., 1999, Dinnyés et al., 2001a, Yin et al., 2002a, b [Dutch belted]; Li S et al., 2006 [Új-Zélandi fehér]; Yang F. et al., 2007 [Zika], Zakhartchenko et al, 2011 [albínó Zika]; Meng et al., 2008 [Hycol hibrid]), és a petesejt - donor sejtek genetikai háttere közötti kölcsönhatásokat is érdemes lenne még tanulmányozni. Ezen változók vizsgálatával fény derülhet azokra a tényezőkre, amelyek felelősek lehetnek a klónozott embriók sikertelen fejlődéséért.

2.3.3. Az enukleáció A petesejt minősége mellett más körülmények is befolyásolják a sejtmag-átültetés hatékonyságát. A technológia egy bonyolult lépése a sejtmag eltávolítása (enukleáció). A nyúl petesejtek enukleációja során éles üveg pipettával távolítják el a sejtmagot, amely eljárás hasonló más fajokhoz. A zona pellucida és a sejtmembrán nem túl kemény, de se nem túl rugalmas így nem okoz technikai nehézségeket a mikromanipuláció során. A petesejt donor fajtájától függően a Nomarski optika általában láthatóvá teszi a metafázisos kromoszómákat a petesejtekben, és vizuális ellenőrzés mellett lehet végezni az eltávolításukat. A nyúl petesejtek morfológiai és minőségi változékonysága azonban gyakran csökkenti a mikromanipuláció

15


hatékonyságát. A citoplazma elszíneződése és granuláltsága megakadályozhatja a kromoszómák láthatóságát normál fénymikroszkóp használatakor, ebben az esetben szükségessé válhat epifluoreszcens festékek (DAPI, Hoecst) és UV-expozíció alkalmazása is (Dinnyés et al., 2001a). Mitalipov és munkatársai. (1999) beszámoltak arról, hogy a Dutch Belted sötét és homályos petesejtjeit nehezebb volt manipulálni, mint Új-Zéland fehéreket. Az enukleáció feltételei, különösen a médium összetétele, jelentős hatást gyakorol a további fejlődésre (Collas és Robl, 1990). Az enukleáció végrehajtható kémiai módszerekkel is. Ebben az esetben ionomycin és demekolcin alkalmazásával egy membrán kiemelkedést indukálunk, amely tartalmazza az összes anyai kromoszómát, amelyek így könnyen eltávolíthatóvá válnak. Az enukleáció általában a donor sejt behelyezése és a fúzió előtt történik, de jelent már meg úgynevezett késleltetett enukleációról szóló közlemény is, amikor a petesejt maganyagát 1-2 órával a fúzió után távolították el. Bár a módszer hatékonyabb volt és valamivel magasabb beültetési arányt értek el, a későbbiekben ez általánosan mégsem terjedt el (Yin et al., 2002b).

2.4. A DONOR SEJT A donor sejt típusa (embrionális vagy felnőtt testi sejt), osztódási fázisa (G0/G1 vagy S), tenyésztési körülményei (friss vagy kultúrában tartott) valamint behelyezése a recipiens petesejtbe (perivitellináris térbe vagy a citoplazmába) nagyon fontos, meghatározó részletek a sejtmag-átültetés folyamatában.

2.4.1. Donor sejt típusok A nyúl klónozás történetének kezdetén korai embrió blasztomerjeit használták donor sejtként (8 sejtes embrió: Stice és Robl, 1988; 8-16-32 sejtes embrió: Yang et al., 1990b; 8-16 sejtes embrió: Collas és Robl, 1990; morula: Yang et al., 1992). Az élő klónozott utódok előállítási hatékonysága 3-10% volt. Az 1990-es évek végétől felnőtt nyúl fibroblaszt (Mitalipov et al., 1999) és kumulusz sejteket (Yin et al., 2000) használtak fel, de 2002-ig nem kaptak élő utódot (2.4.1. kép). 2002-ben élő klónozott nyúl utódokat állítottak elő kumulusz (Chesne et al., 2002), majd 2006-ban felnőtt fibroblaszt sejtek (Li et al., 2006) felhasználásával.

16


2.4.1. kép Kultúrában tartott nyúl kumulusz (A) és nyúl embrionális fibroblaszt sejtek (B). (a szerző fotói)

Ezek a kísérleti eredmények összhangban állnak azzal az in vitro észrevétellel, hogy a kumulusz sejteket felhasználva nukleáris donor sejtként 27%-os, míg fibroblasztok esetében 3%-os hólyagcsíra fejlődési arány tapasztalható (Cervera és Garcia-Ximénez, 2003). Egér és nyúl esetében már sikeresen klónoztak ES sejtekből (Rideout et al., 2000; Fang et al. 2006) azonban gazdasági állatoknál ez a sejtforrás többnyire nem áll rendelkezésre. Mezenchimális és más szöveti őssejtekből viszont sikeresen klónoztak szarvasmarhát (Kato et al., 2004) egeret (Inoue et al., 2007) és nyulat is (Zakhartchenko et al., 2011). Transzgénikus nyulat is sikerült már klónozni transzfektált felnőtt fibroblasztból (Li S. et al., 2009) valamint EGFP-t expresszáló mezenchimális őssejtből (Zakhartchenko et al., 2011), sajnos ez utóbbi csak 17 napig élt.

2.4.2. A sejtciklus hatása Számos kutató tanulmányozta a donorsejt ciklusának nukleáris transzferre gyakorolt hatását különböző fajokon (Stice et al., 1993), beleértve a nyulat is. Collas és munkatársai (1992a) azt vizsgálták, hogy a donor sejtciklus fázisának milyen hatása van az NT embrió fejlődésére. A G1 (59%) és a korai S (32%) szakaszban lévő donorsejtekből létrehozott embriók jobb blasztociszta fejlődést mutattak, mint a kései S (3%) stádiumú sejtekből kialakult embriók. A késő S fázisban lévő donorsejtek esetében ezek az eredmények a metafázisos kromoszómák abnormalitásával magyarázhatóak, ahol nem volt teljes vagy hiányzott a magorsó kialakulása illetve a kromatin kondenzációja (Collas et al., 1992b). Wilmut és munkatársai a szomatikus sejtek ciklus-szinkronizálásának fontosságára hívták fel a figyelmet, különös tekintettel a G0-fázisban lévő sejtekre, amelyek kulcsszerepet játszottak 17


az első sikeres szomatikus sejt klónozási kísérletekben (Wilmut et al., 1997). A sejtciklust vegyszerekkel (nocodazol, Piotrowska et al., 2000) valamint a tenyésztési körülményekkel, például szérum megvonással/csökkentéssel vagy kontaktgátlással (konfluencia) lehet befolyásolni, és a legtöbb sejtet G0 vagy G1 fázisban lehet tartani ezekkel az eljárásokkal (Boquest et al., 1999; Dinnyés et al., 2001a). Ugyanakkor a sejt-ciklus hatásának pontos vizsgálata nehéz, mert az adott klónozási kísérletben használandó donor sejtet nem lehet pontosan elemezni. A nyúl esetében klónozott blasztocisztákat nyertek szérum megvonással tenyésztett, G0fázisban lévő felnőtt fibroblasztokból (Mitalipov et al., 1999) és G0/G1 fázisban lévő, csökkentett szérumban tenyésztett kumulusz sejtekből (Yin et al., 2000). Klónozott nyúl embriók in vitro blasztociszta fejlődési potenciálja nem különbözött, akár szérum-szegény körülmények között, akár kontaktgátlással tenyésztett fibroblaszt sejteket használtak donorsejtként (Dinnyés et al., 2001a;). Galat és munkatársai (1999) hasonló osztódási arányt figyeltek meg nyugalmi és osztódó magzati fibroblaszt donorsejtek használata esetén, ugyanakkor jobb blasztociszta fejlődést értek el a szérum-megvonással kezelt csoportban. Hasonló eredményeket kaptak Li és munkatársai (2006) felnőtt fibroblaszt sejtek használatakor és a szérum megvonásos csoportból élő utódot is sikerült előállítaniuk. Ugyanakkor friss, természetes nyugalmi szakaszban lévő kumulusz sejtekből szintén születtek élő utódok (Chesné et al., 2002; Meng et al., 2009)

2.4.3. Epigenetikai státusz (hiszton acetiláció, metiláció)

A legújabb vizsgálatok középpontjában a donorsejtek sejtciklus állapota mellett a DNS metiláció és a hiszton acetiláció állnak. A korai emlős embriófejlődés alatt drámai kromatinszerkezeti változások és nukleáris átrendeződések mennek végbe (Schultz et al., 1999). A preimplantációs fejlődés során a legtöbb emlős faj embriói aktív demetilációs és remetilációs folyamatokon esnek át (Santos és Dean, 2004). Szemben az egér, patkány, sertés és szarvasmarha embrióival a nyúl embrió egyformán magas teljes-genomi metilációs szintet mutat a zigótától a 16-sejtes állapotig, majd a 16-32 sejtes állapotban passzív demetileződés megy végbe (Telford et al., 1990 Shi et al., 2004). Az aktív demetilációs mechanizmusok hiánya magyarázat lehet a nyúl NT alacsony sikerességére vonatkozóan. Ezt a feltevést tovább erősíti a megfigyelés, hogy aberráns metilációs mintázat volt észlelhető nyúl NT

18


embriókon, ami zavarta a zigotikus génaktivációt és későbbi fejlődési rendellenességekhez, valamint embrió halálhoz vezetett (Chen et al., 2004). A donorsejt epigenetikus állapotát meghatározott hiszton acetilációs szinttel lehet jellemezni. A közelmúltban Yang és munkatársai (2007) kumulusz és fibroblaszt sejtek hiszton acetilációs szintjét, valamint azok klónozási eljárásra gyakorolt hatását vizsgálták. A tanulmány szerint a tenyésztett kumulusz sejtek acetilációs szintje magasabb a magzati fibroblasztokéhoz képest. Bár ez nem befolyásolta az in vitro fejlődés ütemét, de hozzájárulhatott a magasabb implantációs arány és a teljes kifejlődés eléréséhez. A donor sejteket nátrium-butiráttal (Nabu), egy hiszton deacetiláz (HDAC) gátlóval kezelték, hogy növeljék az acetilációs szintet. A kezelés sikeres volt és növelte a hólyagcsíra arányt, a vemhességi arány azonban még mindig alacsonyabb maradt és nem született utód ezekből a kísérletekből. Hasonlóképpen, a Tichosztatin-A (TSA) – egy másik HDAC inhibitor – kezelés hatására is javult a klónozás hatékonysága szarvasmarha (Enright et al., 2003) és egér esetében (Kishigami et al., 2006; Rybouchkin et al., 2006; Wang et al., 2007). Újabb publikációk szerint a TSA kezelés növelheti a klónozott nyúl blasztociszták sejtszámát (Xu et al., 2007) ill. a hólyagcsíra fejlődési rátáját (Shi et al. 2008a). Shi és munkatársainak kutatásai alapján (2008 b) TSA-val kezelt nyúl SCNT embriók hiszton acetilációs mintázata jobban hasonlít a normál embriókéhoz, mint a TSA kezelés nélkülieké.

2.5. FÚZIÓ ÉS AKTIVÁCIÓ Az aktiválás a testi sejtes sejtmag-átültetés egyik legfontosabb lépése. Természetes termékenyülés esetén a spermium behatolása ismétlődő kalcium ionszint emelkedést (oszcillációt) idéz elő a citoplazmában, ami csökkenti az érettségi fokot elősegítő faktor (MPF) szintjét (Fissore és Robl, 1994 Swan és Lai, 1997). Ezt a spermium által generált hatást sejtmag-átültetés estén a mesterséges aktiválás váltja ki (Fissore és Robl 1993). Az aktiválációt általában elektromos impulzussal és/vagy rövid expozíciót igénylő vegyi anyagokkal érik el (Adams et al., 1961 Lagutina et al., 2000 Escriba et al., 1999, 2000), de alkalmaztak spermium kivonatokat is petesejtek aktiválására (Stice és Robl, 1990). Ozil (1990) azt tapasztalta, hogy a többszöri elektromos impulzusok előnyösebbek, mint az egyszeri stimulus. Számos publikációban arról számoltak be, hogy a kalcium ion-oszcilláció mimikálására magas koncentrációjú inozitol 1, 4, 5-trifoszfátot (IP3) használtak, mellyel jobb

19


fejlődési rátát és beágyazódást lehetett elérni (Mitalipov et al., 1999; Inoue et al., 2002). A fúzió és elektromos aktiváció után alkalmazott citocalazin B kezelés ugyancsak javította az NT hatékonyságát, ez az inhibitor gátolja a mikrofilamentum függő citoszkeletális mechanizmusokat az aktiválás alatt (Yang et al., 1992, Li et al., 2002). Nyúl klónozás során használt 6-dimetil-aminopurin (6-DMAP) -egy kináz foszforiláció gátló- sikeresen indukálta az előmag képződést (Mitalipov et al., 1999, Dinnyés et al., 2001a). A fejlődési képesség növelése érdekében számos elektromos és kémiai aktivációs kezelést, illetve azok variációit alkalmazták már. Az aktiváció során használt cikloheximid (CHX), amely egy fehérjeszintézis gátló anyag, szintén javította az NT embriók fejlődéséi arányát és hatására élő utódokat is sikerült előállítani (Chesne et al., 2002, Liu et al., 2004).

2.6. EMBRIÓTENYÉSZTÉS Az elmúlt évtizedekhez képest (Kane és Foote, 1971; Maurer, 1978) jelentős előrelépés történt a nyúl embriók in vitro tenyésztésben. Együttes kultúrában (Carney et al., 1990), peritoneális folyadékban (Collas et al., 1991), nőstény nyúl szemének üvegtest folyadékában (Collas és Robl, 1991), vagy akár teljesen protein-mentes rendszerekben (Carney és Foote, 1991; Li et al., 1993; Giles és Foote, 1997) eltérő oxigén és széndioxid szint (Farrell és Foote, 1995) és ozmolaritás (Li és Foote, 1996) mellett is nagy arányú blasztocisztafejlődést értek el. Testi sejtes klónozással létrehozott nyulak esetében az embriók többféle különböző médiumban tenyészthetők (M199, PBS, EBSS, VH, RDH, B2), 37-39°C fokon, 5-10% CO2 és 95% páratartalom mellett, aktiválás után. Partenogenetikusan aktivált petesejtek blasztociszta állapotig történő fejlődéséhez az embriótranszfer előtt és az SCNT-hez (Chesné et al., 2002) is sikeresen alkalmazták a Menezo B2 médiumot (Ozil, 1990). Mind a TCM 199ben, mind a KSOM-ben jól fejlődtek a nyúl-embriók a klónozást követően (Chesné et al., 2001). Más kísérletek szerint csak egy rövid ideig tartó in vitro tenyésztést tanácsos beiktatni az embrió-transzfer sikerességének növeléséhez és élő utódok létrehozásához (Dinnyés et al., 2001b). Mitalipov és munkatársai (1999) azt tapasztalták, hogy az Earle’s balanced salt solution (EBSS) kiegészítve nem eszenciális aminosavakkal (MEM), L-glutaminnal, Napiruváttal és borjúsavóval (FBS), jobban elősegíti az aktivált petesejtek blasztocisztává történő fejlődését, mint a Dulbecco-val módosított Eagle medium (DMEM/RPMI), FBS, CR1aa, vagy FBS kiegészítésekkel. Testi sejtes klónozással előállított embriók esetében

20


szintén jó blasztociszta-fejlődési rátát (30%) értek el ennek a médiumnak az alkalmazásával. Hasonló eredményeket kaptak az EBSS rendszerrel Yin és munkatársai is (2000) (2.6. ábra).

2.6. ábra In vitro tenyészetett preimplantációs korú SCNT nyúlembriók (a szerző fotói)

2.7. EMBRIÓ MÉLYHŰTÉS A hagyományos lassú fagyasztás és vitrifikáció a leggyakrabban használt módszerek preimplantációs emlős embriók hosszú távú tárolására. Bár a hagyományos lassú fagyasztási eljárást sikeresen alkalmazzák nyúl embriók mélyhűtésére (Bank és Maurer, 1974; Renard et al., 1984; Kojima et al., 1987.; Vincente és Garcia-Ximenez, 1994.), a folyamat számos limitáló tényezőt rejt magában pl. hűtési sérülések, a külső és belső jégkristályok által okozott fizikai károsodás, zónasérülések, drága felszerelés, hosszadalmas hűtési eljárások. Az egyszerűsített vitrifikációs eljárást gyakran használják a nyúl embriológiai kutatásban is (Smorag et al., 1989; Kasai et al., 1992; Vincente és Garcia-Ximenez, 1994; Smorag és Gajda, 1998; Hochi et al., 2001; Papis et al., 2009; Lin et al., 2011). Az embriók a vitrifikációs eljárás során is sérülhetnek a magas koncentrációjú krioprotektánsok (CPA) toxicitása miatt, az extracelluláris jég okozta, valamint a káros ozmotikus hatásoktól (Kasai et al., 1996). Ugyanúgy, mint más fajoknál, a nyúlembriók mélyhűtés utáni túlélési aránya is függ a CPA-k minőségétől és mennyiségétől, az ekvilibráció idejétől és hőmérsékletétől, az alkalmazott mélyhűtési technikától, valamint az embrió fejlettségi stádiumától. A 2-sejtes, vagy morula stádiumban lévő nyúlembriók fagyasztásához és vitrifikációjához DMSO, PG valamint EG önmagukban vagy keverékként használatosak, mint krioprotektív anyagok. Egy korábbi tanulmányban közöltek szerint DMSO-ban fagyasztott nyúl morulák felolvasztást követően 72%-ban fejlődtek blasztocisztává in vitro (Kojima et al., 1987). Egy másik közleményben leírtak alapján 176 morulát vitrifikáltak csak EG-ben, vagy EG-DMSO

21


keverékében, és ebből 40% blasztocisztává fejlődött (Vincente és Garcia-Ximenez, 1994); míg 235 morula EG, fikol és szacharóz (EFS) keverékében történő vitrifikáció 89% blasztociszta fejlődési arányt eredményezett (Kasai et al., 1992). EFS-ben vitrifikált 2-sejtes nyúlembriók in vitro túlélési aránya 58% volt (Smorag és Gajda, 1998), a PG-ben fagyasztottak 89%-a fejlődött morulává (Renard, 1984). Ezzel ellentétben ugyanezek a kutatók azt is közölték, hogy ugyabban az EFS oldatban vitrifikált nyúl zigótáknak csak 18%-a fejlődött blasztocisztává. Tehát a nyúl zigótákat sokkal nehezebb mélyhűteni, mint a későbbi fejlődési stádiumú embriókat, bár azóta már olvashattunk arról, hogy megszületett az első, fagyasztott előmagvas embrióból származó nyúl utód (Hochi et al, 2001). A 90’ évek végén Vajta Gábor és munkatársai (Vajta et al., 1997) kifejlesztették az „Open Pulled Straw Vitrification” (OPS) technikát. Ez a módszer felgyorsítja a hűtés és felmelegítés folyamatát és bár sikerrel alkalmazták más fajok különböző fejlettségű embrióinál, csak a közelmúltban vált sikeres módszerré a nyúl embriók vitrifikációjában is (Naik et al., 2005; Lin et al., 2011). Hochi és munkatársai (2004) különböző technikákat (gel-loading tip (gélbetöltő hegy), Cryoloop (fagyasztó hurok), Cryotop (fagyasztó lapocska) és ekvilibrációs időket próbáltak ki nyúl zigótákon és a legjobb eredményt (51% blasztociszta arány) a 10 perces ekvilibrációs idővel és a Cryotop alkalmazásával érték el. A krioprezerváció nagy jelentőséggel bír különböző szelektált nyúl vonalak megőrzésében is. Vicente és munkatársai (Vicente et al., 2003) megpróbáltak két különböző nyúl vonalat konzerválni. Megfelelő vitrifikációs módszer választásával jó embrió visszanyerési eredményeket (72 vs. 55 %), és fertilitási arányt (81 vs. 43%) értek el. Mindegyik vonalból képesek voltak hím és nőivarú utódokat nyerni, amelyek segítségével biztosítani tudták ezek fennmaradását.

2.8. EMBRIÓ BEÜLTETÉS A nyúl embriókra a petevezetőn történő áthaladásuk során, egy mucin réteg rakódik, enélkül nagyon limitált az életképességük (Murakami és Imai, 1996). Bár sikeres utódfejlődésről számoltak be (Jin et al., 2000 Joung et al., 2004) in vitro tenyésztés és blasztociszta embriótranszfer után, a nyúl embriókat röviddel a mikromanipulációt követően be kell ültetni ahhoz, hogy nagyszámú utódot kapjunk. Az embriókat rendszerint sebészi úton juttatják be a petevezetőbe hasközépi laparotómiával (Yang és Foote, 1990). Az oviduktba történő laparoszkópos transzfer hatékony és gyors alternatíva a korai és a késői embrió beültetésére

22


(Besenfelder és Brem, 1993; Besenfelder et al., 1998). Késői embriók méhnyakon keresztüli sikeres méhbe ültetéséről szintén beszámoltak (Kidder et al., 1999). Nagyon fontos, hogy a recipiens petevezetője vagy méhe és a beültetendő embrió szinkronban legyenek (Chang, 1951), ezt a témát behatóan tanulmányozták in vitro tenyésztett embriókon. Az embrió és a recipiens közötti aszinkronban végzett transzfer különböző abnormalitásokat, és az embrió pusztulását eredményezheti. A nyúl blasztociszták sokkal érzékenyebbek az aszinkronitásra, mint a korábbi osztódási stádiumú embriók (Fisher, 1989). Az embrió korától függően a legjobb magzati fejlődést a szinkronizált, illetve az attól +/– 1 nappal eltérő aszinkronban lévő transzfer esetén lehet elérni (Tsunoda et al., 1982; Fisher, 1989; Yang és Foote, 1990). A vemhesség létrejöttéhez minimum két beültetett embrió szükséges (Adams, 1970), viszont ha túl sok embriót ültetnek be, az csökkentheti az embrió és magzati túlélést (Hafez, 1964). Ezt igazolta Besenfelder és Brem (1993), akik beszámoltak arról, hogy ha csak 10-20 embriót ültettek be, a magzatok túlélési aránya sokkal jobb volt, mint amikor 30-65 embriót juttattak be. Érdekes, hogy a klónozott embriókkal szinkronban lévő recipiensekbe való ültetések nem eredményeztek vemhességet, épp a viszonylag nagy aszinkronitás (22 óra) volt a siker fő tényezője az első testi sejtből klónozott nyúl létrejötte során (Chesné et al., 2002).

23


2.9. VEMHESSÉG-KÖVETÉS ÉS UTÓDVIZSGÁLAT A nyúl vemhessége a mesterséges termékenyítés után 10-14 nappal tapintással észlelhető (Harkness és Wagner 1995). A vemhesség bizonyos időszakaiban (a 23. nap körül) a magzat nagyon érzékeny, így a tapintás maga is abortuszt okozhat. Vemhességet és egészséges utódokat sikerült létrehozni blasztomerből klónozott embriókból (Stice és Robl, 1988; Collas és Robl, 1990; Heyman et al., 1990; Yang et al., 1992). A teljes kifejlődés azonban a sűrűn előforduló poszt-implantációs veszteségek miatt elég alacsony arányú (Heyman et al., 1990; Heyman és Renard, 1996), és beszámoltak abnormális utódok születéséről is (Park et al., 1998). A testi sejtes sejtmagátültetés gyakran okoz vetélést és különböző magzati és perinatális rendellenességeket, mint ahogy azt szarvasmarha és juh esetében is megfigyelték (Dinnyés et al., 2008). A rendellenességek gyakorisága sok tényező függvénye. A fajok közötti különbségek valószínűleg ezekhez a tényezőkhöz tartoznak, hiszen a kecske és sertés testi sejtes sejtmagátültetések azt mutatták, hogy az utódok többsége egészséges a vemhesség késői szakaszában és a születés után is (Polejaeva et al., 2000; Betthauser et al., 2000; Baguisi et al., 1999). Az első felnőtt testi sejtből klónozott nyúl alom egyedei morfológiailag normálisak voltak, és a 6 utódból 2 elvesztése azzal magyarázható, hogy a dajkaanya nem fogadta el azokat. A négy másik egyed normálisan fejlődött és kettő közülük bizonyítottan fertilis volt (Chesné et al., 2002). A fibroblaszt sejtekből származó utódok azonban nem élték meg a fertilis felnőttkort (Li et al., 2006), mint ahogyan a mezenchimális őssejtekből származóak sem (Zakhartchenko et al., 2011). Az ESC-ből létrehozott állatról nem közöltek élettartam adatot (Fang et al. 2006).

24

ANYAG ÉS MÓDSZER

3. ANYAG ÉS MÓDSZER

3.1. IN VITRO MATURÁCIÓ

3.1.1. Az alkalmazott nyúlfajta A

kísérletek

során

Hycole

hibrid

nyúlfajtát alkalmaztuk (3.1.1. kép). A négyvonalas hibrid tenyésztése 1975-ben, Franciaországban kezdődött. Középnehéz súlyú, zömök húsnyúlfajta, kifejlett

testsúlya

anyanyulakat

17

4-5

melynek kg.

hetesen

Az veszik

tenyésztésbe, az átlagos alomlétszámuk 9-10 közötti (Holdas és Szendrő, 2002).

3.1.1. kép Hycole hibrid fajtájú anyanyúl

3.1.2. Petefészek- és petesejtgyűjtés A kísérletekhez felhasznált nyúlpetefészkeket az Olívia Kft által üzemeltetett lajosmizsei nyúlvágóhídról szereztük be. A vágóhíd saját nyúltelepéről származó Hycole hibrid fajtájú,

selejt

(a

tenyésztésből

reprodukciós vagy egyéb okok miatt kivont)

anyanyulakból

származó

petefészkekkel dolgoztunk (3.1.2. képek). Alkalmanként 100 petefészket gyűjtöttünk a vágóhídról, amelyekből átlagosan 300 petesejtet nyertünk ki. A

laboratóriumba

való

3.1.2. kép Vágóhídi nyúlpetefészek

megérkezést

követően azonnal megkezdtük a petesejtek

kinyerését. A petesejtek gyűjtése a petefészken található 0,5 mm-nél nagyobb follikulusok aspirációjával történt (3.1.2. kép). Ehhez 26 G steril tűt és 2 ml-es fecskendőt használtunk. Gyűjtő médiumként 37ºC-os 20% FCS-sel kiegészített PBS-t alkalmaztunk. 25

ANYAG ÉS MÓDSZER

3.1.3. Az In Vitro Maturációs (IVM) rendszer A kezdeti vizsgálatok során az in vitro maturációs kísérletnek 3 paraméterét változtattuk meg, amelyek a következők: a nyúlpetefészkek szállítási hőmérséklete (a vágóhídtól a laboratóriumig), az IVM inkubációs hőmérséklete, a maturációs médium összetétele. A kísérleteket minimum háromszori ismétléssel végeztük el. 3.1.3.1. A petefészek szállítása A

petefészkeket

a

laboratóriumig

–

antibiotikum (100 µg/ml penicillin és 50 µg/ml

streptomicin)

kiegészítéses

PBS

oldatban - két különböző hőmérsékletet biztosító termoszban szállítottuk. Az egyik termosz 32ºC-on, míg a másik 37ºC-on tartotta a bennük elhelyezett petefészkeket. A két szállítóedénybe hozzávetőlegesen azonos számú ovárium került.

3.1.3. kép Állandó hőmérsékletű (37˚C) vízfürdő

3.1.3.2. Az IVM inkubációs hőmérséklete A gyűjtőmédiumban történő átmosást után a petesejteket háromszor mostuk 3x2 ml előinkubált IVM médiumban. A kinyerést követően a petesejteket két különböző hőmérsékleten inkubáltuk 37ºC-on és 38,5ºC-on, 98% pára- és 5% CO2 tartalom mellett 16 órán keresztül. 3.1.3.3. Az IVM médium kiegészítései Az első kísérletsorozat folyamán a TCM-199 alapú IVM médiumot a petesejtek egyik csoportjánál növekedési faktorokkal (IGF-I (50ng/ml) és EGF (10ng/ml)) és hormonokkal (hCG (5 IU/ml) és PMSG (5 IU/ml)) egészítettük ki, míg az ivarsejtek másik csoportjánál nem alkalmaztunk kiegészítést. A második kísérletsorozat esetében az előzőek mellé még 10% és 20% FCS tartalmú IVM 26

ANYAG ÉS MÓDSZER

csoportokat hoztunk létre (a részletes médiumösszetétel a mellékletben található).

3.1.4. A petesejtek értékelése A 16 órás maturációt követően a petesejtek felszínéről eltávolítottuk a maturációt segítő kumuluszsejteket. A denudálást 0,1%-os hialuronidáz

(200

segítségével

és

NE/ml)

oldat

mechanikus

pipettázással hajtottuk végre. A további élettani

kísérletekhez

(parthenogenetikus felhasználni

kívánt

aktiválás) petesejteket

szteretomikroszkóp alatt bíráltuk el, 3.1.4. kép Érett (MII) nyúl petesejt az első sarki testtel

azokat tekintettük érettnek, melyeken az első sarkitest kiválása megfigyelhető volt (3.1.4. kép).

A többi petesejtet a meiotikus állapot megítélése céljából fixáltuk (ecetsav etil alkohol 1:3 arányú keverékében 24 óráig) és 1%-os Orceinnel (45%-os ecetsavban, 3 perc) megfestettük, majd fáziskontraszt mikroszkóppal tanulmányoztuk a petesejtek nukleáris állapotát (3.1.4. ábra).

3.1.4.2. ábra A nyúl petesejt érési stádiumai A: Germinális vezikulum (GV), B: Lebomló germinális vezikulum (GVBD), C: Prometafázis I., D: Metafázis I., E: Anafázis I., F: Telofázis I.G: Metafázis II (Frontális nézet), H: Metafázis II. (Laterális nézet) (Pb=sarki test)

Az érés dinamikáját vizsgáló kísérletek folyamán, az inkubáció során 3 óránként mintát gyűjtöttünk és fixálás után Orcein-festéssel állapítottuk meg a sejtmag érettségi állapotát. 27

ANYAG ÉS MÓDSZER

3.1.5. A petesejtek parthenogenetikus aktiválása Az érett petesejtek életképességének funkcionális

vizsgálatához

parthenogenetikus

aktiválást

végeztünk. Az aktiválást ChallahJacques és munkatársai munkájának kisebb

módosításaival

végeztük

(Challah-Jacques et al., 2003). Az oocytákat egy perceig ekvilibráltattuk az

3.1.5 kép BTX elektro fúziós készülék

aktivációs

oldatban

(0,25M

szorbitol, 0.1 mM Ca(CH3COO)2, 0.5 mM Mg(CH3COO)2, 0,5 mM HEPES,

1mg/ml BSA) majd a fúziós kamra elektódjai közé helyezve elektromos impulzust (3 DC pulzus, 1,6 kV/cm, 20µs) alkalmaztunk BTX 200-as elektro fúziós készülékkel (Biotechnologies & Experimental Research Inc., San Diego, CA, USA) (3.1.5. kép). Ezután egy kémiai aktiválást követően (2 mM 6-DMAP, 30 perc) megint az elektromos aktiválás következett a fenti paraméterekkel, majd az aktiválást egy 2 órás 2mM 6-DMAP inkubációval fejeztük be. Az aktivált petesejteket in vitro kultivációs médiumba (kiegészített EBSS) tettük és embriótenyésztő inkubátorba helyeztük (38,5ºC, 98% pára- és 5% CO2 tartalom). Az osztódási rátát másnap, a fejlődő blasztociszták számát a hatodik napon regisztráltuk.

3.1.6. Eredmények értékelése Az adatok kiértékeléséhez GraphPad InStat szoftver χ² és ANOVA logisztikus regresszió analízisét alkalmaztuk. A 0,05-nél kisebb p érték esetén a különbséget szignifikánsnak tekintettük.

28

ANYAG ÉS MÓDSZER

3.2. TESTI SEJTES SEJTMAGÁTÜLTETÉS, KLÓNOZÁS

3.2.1. Alkalmazott nyúlfajta és tartása A Hycole hibrid fajtájú anyanyulak mesterséges

szellőztetéssel

ellátott

külön teremben, háromszintes fém rácsketrecekben

voltak

elhelyezve

(3.2.1. kép). A fényprogram 12 óra világos (reggel 7-től este 7 óráig), 12 óra sötét periódusra volt beállítva a kísérlet ideje alatt. Az állatszobában a hőmérséklet

17-20˚C

volt.

Vizet

3.2.1. kép Hycole hibrid anyanyúl és ketrece

szopókás önitatóból, takarmányt a kereskedelmi

forgalomban

kapható

hízónyúl tápot önetetőből, ad libitum kaptak.

3.2.2. Donor állatok szuperovulációja Ivarérett, 19-22 hetes Hycole hybrid nőstény nyulakat szuperovuláltattunk intramuszkulárisan

beadott

120

IU

PMSG (Folligon, International B.V., Boxmeer, Holland), majd 72 órával később fülvénába injektált 180 IU hCG alkalamazásával

(Choragon,

Ferring

GmbH, Kiel, Germany) (3.2.2. kép).

3.2.2. kép Fülvénás hCG injekció

29

ANYAG ÉS MÓDSZER

3.2.3. Petesejtgyűjtés A donor állatok életének humánus kioltása után, az érett petesejteket 13-14 órával a hCG beadása után kimostuk a petevezetőből 10%FCS tartalmú PBS-sel (3.2.3. kép). A petesejtekről a kumulusz sejteket egy 5 mg/ml

hialuronidázt

tartalmazó

M199-es

pipettázással

(Sigma

H3506)

oldatban,

gyengéd

távolítottuk

el.

Ezután

a

következő eljárásig a denudált petesejteket ekvilibrált tenyésztő médiumba (kiegészített 3.2.3. kép Petesejt gyűjtés

EBSS, Mitalipov és mtsai. 1999), 38,5°C-os inkubátorba helyeztük.

3.2.4. Petesejtek enukleációja A sejtmagátültetés folyamatát, kisebb módosításokat alkalmazva, Challah-Jacques és munkatársai által 2003-ban leírt módon hajtotta végre kollégám, Dr. Qinggang Meng. A denudált petesejteket mikromanipulátor segítségével enukleálta. A mikromanipulációhoz szükséges mikropipettákat - injektáló kapilláris és tartókapilláris - kapilláris húzó (Sutter Instrument Co.) és mikrohuta (Narishige) berendezések segítségével állította elő (3.2.4 kép). A petesejteket manipuláció előtt 20 percre 5μl/ml Hoechst 33342 tartalmú tenyésztő médiumban

(EBSS)

mikromanipulációt végezte

7.5

tartalmazó inverz

inkubálta.

szobahőmérsékeleten

μg/ml

cytochalasin

médiumban,

Olympus

mikroszkópra

A

szerelt

B-t IX71

Narishige

mikromanipulátor karokkal (3.2.6. kép). A

3.2.4. kép Kapillárishúzó és mikrohuta készülékek

petesejtekben rövid, 1-2 másodperces UV

megvilágítással láthatóvá tette a sejtmagot illetve a sarki testet majd, 18-20 μm átmérőjű mikrokapillárissal távolította el azokat. Az eljárás után az enulkeált pertesejteket 2 órára EBSS tenyésztőmédiumban hagyta pihenni. 30

ANYAG ÉS MÓDSZER

3.2.5. Donor sejt előkészítés A testi sejtes klónozáshoz donorsejteként a petesejteket körülvevő kumulusz sejtek szolgáltak. A petesejtek denudálását követően összegyűjtöttük a kumulusz sejteket, majd 3000 rpm-en, 1 percig centrifugáltuk őket. A pelletet 1ml 10% FCS-sel és Hepes-szel kiegészített M199 médiumban szuszpendáltuk, majd a sejteket az injektálásáig 4 °C-on tartottuk.

3.2.6. Sejtmagátültetés Az módszert Challah-Jacques és munkatársai által leírtak alapján és némi módosítássokkal végeztük (Challah-Jacques et al., 2003). Az eljárásban alkalmazott donor sejtet Dr. Qinggang Meng kollégám mikropipetta segítégével az enukleált petesejt perivitellináris részébe jutatta. Ezután a citoplaszt-sejt konstrukciót rövid ideig (kb 1 perc) aktivációs médiumban (0.25M Szorbitol, 0.5 mM Hepes, 0.1mM Ca(CH3COO)2, 0.5mM Mg(CH3COO)2 és 1 mg/ml BSA) ekvilibráltattuk. Ezt követően fúziós elektródok közt, megfelelő orientációban, három 20 µsos 3.2 kV/cm DC pulzussal fúzionáltattuk a konstrukciót. Egy óra elteltével a fúzionált sejteket azonos paraméterekkel aktiváltuk, majd egy órára 2 mM 6-DMAP-t és 5 μg/ml CHXt tartalmazó EBSS médiumba tettük. Ezután a klónozott embriókat EBSS tenyésztő médiumban, illetve 5nM TSA-t tartamazó EBBS médiumban tenyésztettük 10 órán keresztül.

3.2.6. kép Olympus IX71 inverz mikroszkóp és Narishige mikromanipulátorok

31

ANYAG ÉS MÓDSZER

3.2.7. In vitro embriótenyésztés A klónozott embriókat ásványi olaj alatt 20 µl-es EBSS medium cseppekben (3.2.7.1. kép) tenyészettük 5% CO2 és 98% páratartalom mellett, 38.5C-on. Az embriók egy részét 2, 4 sejtes állapotban recipiens nőstényekbe ültettük vissza, a másik részét hagytuk 5 napos korukig, blasztociszta stádiumig fejlődni. A blasztociszta (96h) fejlődést feljegyeztük, az embriókat Hoechst

33342-el

megfestettük

és

UV

megvilágítás mellett megszámoltuk az élő 3.2.7.1. kép In vitro tenyésztő cseppek és tenyésztőedény

sejteket (3.2.7.2. kép).

3.2.8. Embrió beültetés, vemhesség követés és születés 10-16 kettő-négy sejtes állapotú klónozott embriót laparoszkópos technikával ültettünk egyegy petevezetőbe, az infundibulumon keresztül (Besenfelder és Brem 1993). A recipiens nőstényeket 0.2 ml i.m. GnRH analóggal (Receptal®, Intervet) indukáltuk, 22 órával később, mint a klónozáshoz használt petesejt donor nőstényeket (22 órás aszinkron recipiens). A vemhesség a beültetést követő 10. napon Dr. Bucsy László, intézeti állatorvos, tapintással detektálta.

A

vemhes

nőstények

embrióbeültetést

követő

30-dik

az napon

császármetszésen estek át. A klónozott utódok placenta és születési súlya, valamint egyéb méretei

feljegyzére

kerültek,

majd

dajka

anyához tettük őket hasonló korú utódok mellé. Néhány recipienst hagytunk természetes úton 3.2.8. kép Laparoszkópos embrió beültetés

lefialni és felnevelni a fiókákat. A kisnyulakat naponta lemértük szoptatás előtt és után, és feljegyeztük a napi testtömeg-gyarapodásukat. 32

ANYAG ÉS MÓDSZER

A

B

3.2.7.2. kép Hoechst 33342-el festett nyúl embrió fény mikroszkópos (A) és 350 nm-es UV megvilágításos (B) képe

3.2.9. Állatkísérleti engedélyek A kísérletek a XXVIII/1998 törvény §25 és a 243/1998 (XII. 31) és 36/1999 (IV. 2) Kormányrendelet előírásainak figyelembe vételével zajlottak. Az állatkísérleteket a Mezőgazdasági

Biotechnológiai

Kutatóközpont

(767/002/2003)

és

a

BioTalentum

Tudásfejlesztő Kft (22.1/1970/003/2008) engedélyével végeztük.

3.2.10. Eredmények értékelése Az adatok kiértékeléséhez GraphPad InStat szoftver Welch-el korrigált páratlan t-próbáját, Mann-Whitney tesztjét és ANOVA analízisét használtuk. A 0,05-nél kisebb p érték esetén a különbséget szignifikánsnak tartottuk.

33

ANYAG ÉS MÓDSZER

3.3. EMBRIÓ MÉLYHŰTÉS 3.3.1. In vivo embrió előállítás Az in vivo embriókat a 3.2.2. fejezetben leírt módon szuperovuláltatott anyanyulak természetes termékenyítéséből nyertük. A hCG beadása után az anyát bakkal pároztattuk. A zigótákat a petesejtekhez hasonlóan mostuk ki (pc 14-16h). A mélyhűtési kísérletig az in vivo zigótákat EBSS-es tenyésztőmédiumban tartottuk.

3.3.2. In vitro embrió előállítás Az in vitro fertilizációt Zeng és munkatársai (Zeng et al 1999) által leírt módon hajtottuk végre. Az in vitro embriók előállításához a 3.2.2. fejezetben leírt módon szuperovuláltatott anyanyulak petesejtjeit és baknyulak spermáját használtuk. A bakokat anyára ugrattuk, az ondó levételéhez IMV műhüvelyt használtunk. A levett spermához 10 ml DM oldatot (lsd Melléklet) adtunk, majd 5 percig centrifugáltuk 2000g-vel, 24ºC-on. A pelletet felszuszpendáltuk 10 ml HIS (10 ml DM + 0,034 g NaCl) oldatban és 15 percre a termosztátba helyeztük. Egy ismételt fugálást követően a pelletet 100 μl DM oldatban szuszpendáltuk, majd 2 ml DM oldat aljára rétegeztük és visszatettük a termosztátba. 20 perc swim up (felúszás) után a cső tartalmának felső 1 ml-ét leszívtuk, és hozzáadtuk 5 ml DM oldathoz. Az így megtisztított, kihígított ondót egy 15 ml-es Falcon csőben 12 órán keresztül kapacitáltattuk a termosztátban. A fertilizációhoz 4 lyukú tenyésztőedényt (NUNC

TM

) használtunk. Minden lyukba

500 μl kapaciltált spermát és 5-6 db COCt tettünk, majd a tenyésztőedényeket 6-8 órára 38,5ºC-os, 5%-os CO2 és 98 %-os páratartalmú inkubátorba helyeztük. A fertilizáció

után

a

zigótákat

megtisztítottuk a spermiumoktól és a még fennmaradt

kumulusz

sejtektől.

A

mélyhűtési kísérletig az in vitro zigótákat

3.3.2. kép Nyúl IVF

EBSS-es tenyésztőmédiumban tartottuk.

34

ANYAG ÉS MÓDSZER

3.3.3. Szilárd felszínű vitrifikációs (SSV) technika A nyúl zigóták mélyhűtéséhez az egyik eljárás, amit alkalmaztunk, az úgynevezett SSV technika, melyet eredetileg Dinnyés és munkatársai írtak le 2000-ben szarvasmarhán. A vitrifikációs eljárás során 35% etilén glikol (EG, Sigma, E9129), 5% polivinil-pirrolidon (PVP; Sigma, PVP-40) és 0.4 M trehalóz (Sigma, T0167) védőanyag tartalmú CZB-H-t, vitrifikációs oldatot használtunk. A zigótákat 5-10 percig 4%-os EG oldatban ekvilibráltattuk szobahőmérsékleten. Majd 25-30 másodperc alatt az 5-10 zigótát tartalmazó csoportokat háromszor átmostuk vitrifikációs médium cseppekben, és 1-2 μl-es médium mennyiségben egy előre -150 --180°C –ra lehűtött fém doboz felszínére cseppentettük ki. A felület megfelelő hőmérsékletét a fémdoboz félig folyékony nitrogénbe való merítésével értük el. A hirtelen lehűlés hatására a médiumcseppek apró golyócskák formájában szilárdulnak meg, amelyeket lehűtött csipesszel egy folyékony nitrogénnel teli fagyasztócsőben gyűjtöttünk össze. Felolvasztáshoz az apró golyócskákat 37°C-os 0.3 M trehalóz tartalmú oldatba helyeztük 1 percre, majd 2-2 percre 0,15 M illetve 0.075M-os szacharóz oldatban mostuk át a zigótákat, folyamatosan kioldva ezzel a védőanyagot. Ezután CZB-H oldatba, majd végül tenyésztő médiumba kerültek az embriók. A túlélési arányt, az osztódási valamint a blasztociszta (96h) fejlődést feljegyeztük, az embriókat Hoechst 33342-el megfestettük és UV megvilágítás mellett megszámoltuk az élő sejteket.

Médium cseppek az embriókkal

Folyékony nitrogén

Fém doboz

Hungarocel doboz 3.3.3. ábra Az SSV technika eszközei. Folyékony nitrogénbe merülő fém doboz és az apró (1-2 μl-es) médium cseppek

35

ANYAG ÉS MÓDSZER

3.3.4. Műszalmás vitrifikációs technika (VS3a) A másik eljárás, amit a nyúl zigótákon alkalmaztunk, egy műszalmában történő mélyhűtési technika. Az eljárást Kasai és munkatársai által 1990-ben leírtak szerint végeztünk, kisebb módosításokkal. A vitrifikációs oldat 40% EG, 5% PVP és 0.4 M trehalózt tartalmazott (VS3a). Ebben az oldatban nem megy végbe jégformáció sem a hűtés, sem a felolvaszás alatt. Az eljárás során a zigóta állapotú embriókat 5-10 percre 4% EG-t tartalmazó oldatban ekvilibráltattuk szobahőmérsékleten. Ezután az előzetesen a 3.3.4. ábra szerint feltöltött 0,25ml-es műszalma VS3a védőanyagot (krioprotektánst) tartalmazó részébe töltöttük az embriókat. A műszalmát lezártuk és egy perc után nitrogén gőzébe (-180°C-ra) tettük. Három perccel később a műszalmát folyékony nitrogén alá süllyesztettük. Felolvasztás során a műszalmát 10 másodpercre kivettük a nitrogénből, majd 15-20 másodpercig 37°C-os vízfürdőbe merítettük. A felolvasztott szalmából az embriókat 1 percre 37°C-os, 0.3 M-os trehalóz oldatba tettük. A rehidratáció érdekében egyre csökkenő koncentrációjú trehalóz oldatban mostuk át a zigótákat, majd végül az SSV-hez hasonlóan tenyésztőmédiumba helyeztük őket. A túlélési arányt, az osztódási valamint a blasztociszta (96h) fejlődést feljegyeztük, az embriókat Hoechst 33342-el megfestettük és UV megvilágítás mellett megszámoltuk az élő sejteket. Levegő buborékok

0,3 M Trehalóz

Dugó

Embriók

Védőanyag

3.3.4. ábra A 0,25ml-es műszalma feltöltése és az embriók helyzete

3.3.5. Eredmények értékelése Az adatok kiértékeléséhez GraphPad InStat szoftver χ², Fisher teszt és ANOVA analízisét alkalmaztuk. A 0,05-nél kisebb p érték esetén a különbséget szignifikánsnak tekintettük.

36

EREDMÉNYEK

4. EREDMÉNYEK

4.1. IN VITRO MATURÁCIÓS EREDMÉNYEK

4.1.1. A különböző tényezők együttes hatása a maturációra A nyúlpetesejtek in vitro maturációjára számos külső tényező lehet hatással. Munkám során vágóhídi petefészekből in vitro maturációval állítottam elő érett petesejteket és a petefészek szállítási hőmérsékletének, a maturációs médium összetételének valamint az in vitro maturáció inkubációs hőmérsékletének hatását vizsgáltam. A kísérletek kezdetekor arra törekedtünk, hogy megtaláljuk az optimális körülményeket nyúl petesejtek érleltetésére. Az első kísérletsorozat alatt az irodalomban fellelhető információk alapján az in vitro maturációs paraméterek közül kiválasztottunk 2 eltérő nyúlpetefészkek szállítási és IVM inkubációs hőmérséklet-értéket, valamint teszteltük a különböző összetételű maturációs médiumok hatását is. A statisztikai számítások elvégzése után a következő eredményt kaptuk a különböző tényezők együttes hatását vizsgálva (4.1.1. táblázat). 4.1.1. táblázat A különböző tényezők együttes hatása a maturálódott petesejetk arányára Petefészek szállítási hőmérséklet

IVM médium

Maturálódott

hormon és

IVM inkubációs

Petesejtek

petesejtek

növ.faktor

hőmérséklet

száma

száma

kiegészítése +

32C -

+ 37C -

(%) 37C

97

43 (44,33%)a

38,5C

128

50 (39,06%)a

37C

87

34 (39,08%)a

38,5C

142

66 (46,48%)a

37C

74

5 (6,76%)c

38,5C

117

34 (29.06%)b

37C

92

12 (13,04%)c

38,5C

105

22 (20,95%)b

A különböző IVM médiumban érlelt petesejtek maturációs eredményei nem mutattak szignifikáns különbséget, tehát ebben a rendszerben nincs jelentős eltérés a hormonnal és

37

EREDMÉNYEK

növekedési faktorokkal kiegészített, illetve nem kiegészített maturációs médium petesejtérési rátái között (p0,05). A szállítási hőmérséklet és az inkubálási hőmérséklet változtatása, illetve e két paraméter interakciója viszont már szignifikáns különbséget eredményezett a maturálódott petesejtek arányában (p<0,05). A logisztikus regresszióval végzett statisztikai számítások szerint a szállítási hőmérséklet meghatározó tényező, mert a 32ºC-on szállított petefészkekből kinyert petesejtek jobb maturációs rátát mutattak -minden egyéb tényező változtatásakor is-, mint a 37ºC-on szállítottak. 37ºC-os szállítási hőmérséklet mellett már az inkubálási hőmérséklet is fontos tényezővé vált, ilyen körülmények között a 38,5ºC-on inkubált petesejtek maturációs eredményei jobbnak bizonyultak a 37ºC-on inkubáltakéhoz képest. Összességében megállapítható, hogy a legjobb eredményt a 32ºC-on szállított ováriumokból kinyert oocyták adták, tekintet nélkül arra, hogy milyen hőmérsékleten illetve milyen minőségű IVM médiumban inkubáltuk őket az in vitro maturáció során.

4.1.2. Különböző maturációs médiumok hatása a petesejtérésre és a későbbi embriófejlődésre Az első kísérletsorozat eredménye alapján 32˚C-on szállítottuk a petefészkeket és a továbbiakban az IVM médium összetételén változtattunk. A kinyert petesejteket 4 különböző IVM médiumba helyeztük, amelyek a következők voltak: M199 + 0,3 mg/ml BSA (IVM-) M199 + 0,3 mg/ml BSA, hormon (5 IU/ml PMSG, 5 IU/ml hCG) és növekedési faktor (50 ng/mL IGF-I, 10 ng/mL EGF)(IVM+) M199 + 10% FCS (IVM 10% FCS) és M199 + 20% FCS (IVM 20% FCS), majd 38,5˚C-on inkubáltuk 16 órán keresztül. A petesejtek egy részét festettük a többit parthenogenetikusan aktiváltuk. Fejlődési kontrollként in vivo érett petesejteket használtunk. Az in vitro érlelést követően a maturációs ráta eredményeiben nem mutatkozott szignifikáns különbség (p>0,05) a vizsgált csoportok között (4.1.2. táblázat).

38

EREDMÉNYEK

4.1.2. táblázat A maturációs médiumok hatása az érésre és a későbbi embriófejlődésre IVM medium csoportok IVM+ IVM 10%FCS IVM 20%FCS IVM In vivo

Petesejtek száma 378 406 325 470 354

Érett petesejtek száma (%) 339 (89.0) 370 (91.0) 290 (89.0) 435 (92.5) -

Osztódottak száma (%) 207/250 (82.8)a 226/276 (81.8)a 170/228 (74,6)b 337/382 (88.2)c 338/354 (95.4)d

Blasztociszták száma (%) 47/207 (22.7)a 47/226 (20.8)a 40/170 (23.5)a 49/337 (14.5)b 218/338 (64.5)c

A különböző betűkkel jelzett értékek (a,b,c és d) az oszlopon belül szignifikánsan eltérnek egymástól (p<0.05).

Parthenogenetikus aktiválást követően azonban különbséget tapasztaltunk a csoportok között az osztódási rátát illetően. A 20% FCS kiegészítést tartalmazó maturációs médiumban érlelődött petesejtek kevésbé voltak aktiválhatóak (74,6%), mint a 10%FCS-t (81,8%) illetve hormont és növekedési faktort tartalmazó (82,8%) médiumokban inkubált petesejt csoportok, de még utóbbiak aktiválhatósága is alul maradt a kiegészítés nélküli (IVM-) csoporthoz képest (88,2%). Az összes IVM petesejt aktiválhatósága alacsonyabb volt, mint az in vivo matrurálódott kontroll csoporté (95,4%). A korai embriófejlődés tekintetében a kiegészítést nem tartalmazó (IVM-) maturációs csoport mutatta a szignifikánsan legalacsonyabb blasztociszta százalékot (14,5%). A többi in vitro maturálódott csoport (IVM+ 22,7 %, IVM10%FCS 20,8%, IVM20%FCS 23,5%) blasztociszta százaléka ennél magasabbnak bizonyult, de nem érte el az in vivo csoportra jellemző értéket (64,5%).

39

EREDMÉNYEK

4.1.3. Az in vitro maturáció dinamikája Vizsgálataink célja az volt, hogy megfigyeljük, hogyan változik a petesejtek érési dinamikája az in vitro érlelés során alkalmazott különböző maturációs médiumok hatására.

GV, GVBD és MII %-a

100 80 60

GV,GVBD MII

40 20 0 0

3

6

9

12

15

18

IVM ideje (óra)

4.1.3.a ábra Nyúl petesejtek érési dinamikája 10%FCS-t tartalmazó IVM-ben

Vizsgálataink során a maturáció kezdetétől számított 3 órán belül egyik médium esetében sem találtunk érett, azaz MII-es stádiumú petesejtet. Az érés csak ez után indult el. A két kísérleti csoport között a hatodik óráig nem tapasztaltunk eltérést a maturálódott petesejtek arányát illetően (6h: 10%FCS 45,21% és 20%FCS 51,11%; p>0,05). A maturáció 9. és 12. órájában azonban szignifikánsan több (9h: 85,22% vs. 63,01% és 12h 75,2% vs. 63,74%; p<0,05) érett petesejt volt jelen a 10%FCS-t tartalmazó maturációs oldatban, mint a másikban

(20%FCS).

Az

érés ezt követő időszakában (12-18h) nem tapasztaltunk további különbségeket a maturációs rátában.

GV, GVBD és MII %-a

100 80 60 GV,GVBD MII

40 20 0 0

3

6

9

12

15

18

IVM ideje (óra)

4.1.3.b. ábra Nyúl petesejtek érési dinamikája 20%FCS-t tartalmazó IVM-ben

40

EREDMÉNYEK

4.2. SEJTMAG-ÁTÜLTETÉSES KLÓNOZÁSI EREDMÉNYEK 4.2.1. A TSA-val kezelt klónozott embriók in vitro fejlődése A testi sejtmag-átültetéses kísérletek során egy hiszton deacetiláz (HDAC) gátló anyaggal, TSA-val kezeltünk a klónozott nyúl embriókat és nyomon követtük in vitro illetve in vivo fejlődésüket. A klónozott embriók in vitro fejlődését az alábbi táblázat foglalja össze (4.2.1. táblázat). A TSA-val kezelt (TSA+) és kezeletlen (TSA-) csoportok között nem mutatkozott szignifikáns különbség az osztódási és blasztociszta arány tekintetében. A TSA kezelés hatására szignifikáns sejtszám-eltérés sem volt kimutatható (p>0,05). 4.2.1. táblázat A TSA-kezelés hatása a klónozott embriók in vitro fejlődésére Kezelési

Klónozott

Osztódott

Blasztociszta

Leszámolt

Blasztociszta

csoport

konstrukció

embrió szám

szám

blasztociszta

sejtszáma

szám

(%)

(%)

szám

±SD.

TSA+

87

66 (75.9)

52 (78.8)

42

202.9±41.0

TSA-

119

93 (78.2)

74 (79.6)

58

171.5±49.2

Az értékek nem mutattak szignifikáns eltérést (p>0,05).

4.2.2. A TSA-val kezelt klónozott embriók in vivo fejlődése A 4.2.2.a táblázat a TSA-val kezelt (TSA+) illetve nem kezelt (TSA-) klónozott embriók in vivo fejlődését mutatja be. Az embrió beültetést követően a kezeletlen csoportban a hétből négy (4/7), a TSA-val kezeltek közül pedig hatból kettő (2/6) recipiens maradt vemhes a 10. napi tapintás alapján.

4.2.2.a táblázat A TSA-kezelés hatása a vemhesülésre Kezelési csoportok

Beültetett embriók

Recipiensek

Vemhes recipiens

száma

száma

(%)

TSA+

153

6

2 (33.3)

TSA-

212

7

4 (57.1)

Az értékek nem mutattak szignifikáns eltérést (p>0,05).

41

EREDMÉNYEK

A kezeletlen csoportban egy anya a vemhesség 19. napján (4.2.2. kép A), míg a TSA-val kezelt csoportban szintén egy recipiens a beültetés utáni 23. napon abortált magzatokat (4.2.2. kép B).

A

B 4.2.2. kép

19 napos abortált klónozott magzat

23 napos abortált klónozott magzat

A kezeletlen csoportban megmaradt 3 vemhes recipiens 6 klónozott nyúl fiókának adott életet, míg a TSA-val kezelt csoportban a megmaradt anyától 7 újszülöttet kaptunk (4.2.2.b táblázat).

4.2.2.b táblázat A TSA-kezelés hatása a klónozott embriók posztnatális fejlődésére Kezelési csoportok

Halva születtetek

Élve születettek

Ivarérettséget elérő

száma

száma

egyedek

(%)

(%)

(%)

TSA+

4 (2.6)

7 (4.6)

0 (0)a

TSA-

8 (3.8)

6 (2.8)

4 (66.7)b

Az értékek szignifikáns eltérést mutattak (p0,05).

42

EREDMÉNYEK

4.2.3. Klónozott nyúlfiókák posztnatális fejlődése

A klónozott nyúlfiókák születési és élettartam adatait a 4.2.3. táblázat foglalja össze. 4.2.3. táblázat Klónozott kisnyulak születési és élettartam értékei

Kezelési csoportok

TSA+

TSA-

Születési

Placenta

Születési

testtömeg

tömege

testhossz

(g)

(g)

(mm)

TSA+1

56

4,1

110

1 óra

TSA+2

30

1,57

80

7 óra

TSA+3

67

4,78

115

3 nap

TSA+4

53

3,32

90

3 nap

TSA+5

61

5,06

105

9 nap

TSA+6

63

5,56

120

11 nap

TSA+7

55

3,81

95

19 nap

TSA-1

93

16,7

140

1 óra

TSA-2

73

n.ac

120

24 óra

TSA-3

68

n.ac

130

12 hónapa

TSA-4

73

n.ac

130

14 hónapa

TSA-5

61

n.ac

120

11 hónapa

TSA-6

90

11,99

110

22 hónapb

Utódok

Élettartam

a: A lábat és/vagy szemet érintő pastorellózisban pusztultak el b: A kísérletsorozat végén tanulmányozás céljára lett felhasználva c: természetes úton születtek, ezért nincs placenta tömeg adatunk

A TSA-val kezelt csoportban a fiókák átlagos születéskori testtömege 55±12,06g, a kezeletlen csoportban 73,5±15,15g volt, mely utóbbi szignifikánsan nagyobbnak bizonyult, akárcsak a placenták tömege (4.029±1.3g vs. 14±3,3g) (p<0,05). A TSA-val kezelt csoportban előfordult

43

EREDMÉNYEK

egy átlagon aluli, 30g-os, a kezeletlen csoportban pedig két átlagon felüli, 90 és 93g-os klónozott utód is. A TSA-val kezelt csoport mind a 7 utódja ismeretlen okból pusztult el a születést követő 1 óra illetve 19 napon belül. A TSA-val nem kezelt csoport 6 utódja közül egy a születés után egy órán belül kimúlt (TSA-1), míg egy másik a dajka anya által okozott sérülésektől pusztult el az első napon (TSA-2). A hat, TSA-val nem kezelt utód közül négy megélte az ivarérettséget és kettő, természetes pároztatás után egészséges utódoknak adott életet.

Újszülött klónozott nyúl

1 hetes klónozott nyúl 1,5 éves klónozott nyúl 4.2.3 kép Az első magyarországi klónozott nyúl posztnatális fejlődése

A legalább egy hétig életben maradt klónozott kisnyulak napi testtömegének alakulását a 4.2.3.a ábra mutatja be.

44

EREDMÉNYEK

600 500 TSA+5 testtömeg (g)

400

TSA+6 TSA+7 TSA-3

300

TSA-4 TSA-5

200

TSA-6 100 0 1

2 3

4

5 6

7 8

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 napok

4.2.3.a ábra A klónozott kisnyulak napi testtömeg alakulása

A grafikonon feltüntetett értékek a napi szoptatás előtti testtömeget mutatják. A TSA-val kezelt csoportból három (TSA+5, TSA+6, TSA+7) a kontroll csoportból négy (TSA-3, TSA4, TSA-5, TSA-6) kisnyúl adatai kerültek feldolgozásra. A TSA+5, TSA+6 és TSA+7-es kisnyulak a 9-, 11- és 19-napon elpusztultak, ezért a többi kontroll kisnyúl adatai csak eddig, a 19. napig vannak feltüntetve. Az első napi fogyástól eltekintve az összes kisnyúl testtömege nőtt az idő elteltével. Az első kilenc napot figyelembe véve a TSA+5-ös, a TSA+7-es és a TSA-6-os kisnyulak átlagos napi testtömeg-gyarapodása alul maradt a többiekéhez képest (p<0,01) (4.2.3.b ábra), azonban a két csoport között (TSA+ vs. TSA-) nem volt szignifikáns eltérés (p=0,096).

45

EREDMÉNYEK

Átlagos napi testtömeg gyarapodás (g)

30

25

20

15

10

5

0 TSA+5

TSA+6

TSA+7

TSA-3

TSA-4

TSA-5

4.2.3.b. ábra A klónozott kisnyulak átlagos napi testtömeg gyarapodása a 9. napig

46

TSA-6

EREDMÉNYEK

A klónozott kisnyulak átlagos testtömeg gyarapodási rátáit, melyet a testtömeg változás arányának százalékos értékéből számítunk, a 4.2.3.c ábra mutatja be. A TSA-val kezelt és a TSA –kezelés nélküli csoport között nem tapasztaltunk jelentősebb eltérést a testtömeg gyarapodási rátában. Szignifikáns különbség a TSA-3 és TSA-6 egyedek között volt látható (p<0,05).

Átlagos napi testtömeg gyarapodási ráta

14,0% 12,0% 10,0%

a

8,0%

ab

ab

ab

ab

ab 6,0%

b 4,0% 2,0% 0,0% TSA+5 n=8

∆ttm ráta =

TSA+6 n=10

TSA+7 n=18

TSA-3 n=18

TSA-4 n=18

n+1 nap testtömeg- n. nap testtömeg n. nap testtömeg

TSA-5 n=18

*100

4.2.3.c ábra A klónozott kisnyulak átlagos napi testtömeg gyarapodási rátája

47

TSA-6 n=18

EREDMÉNYEK

4.2.4. A Parthenogenetikus ko-transzfer hatása

Ebben a kísérletsorozatban felhasznált klónozott embriók a TSA-val nem kezelt (TSA-) csoportból kerültek ki. Egy-egy transzfer alkalmával 3-4 parthenogenetikus embriót ültettünk a 25-30 klónozott mellé. Az általunk mért összes paraméter esetében (vemhesülési ráta, összes újszülött aránya, élő utódok aránya) jobb eredményeket kaptunk, ha a klónozott embriók mellé parthenogenetikus embriók is kerültek (4.2.4.a és b táblázat).

4.2.4.a táblázat A parthenogenetikus embriók hatása a vemhesülésre Beültetett embriók

Recipiensek

száma

száma

92

3

1/3 (33.3)

120+15

4

3/4 (75.0)

Beültetett embriók

Vemhesültek (%)

SCNT SCNT+ PGA

A különböző értékek az oszlopon belül szignifikánsan nem térnek el egymástól (P>0.05)

Mindkét csoport esetén születtek élő utódok és a ko-transzfer ténye nem befolyásolta a későbbi egyedfejlődést. A ko-transzfer esetén az eredmények jobbak voltak, de az alacsony egyedszám miatt ez a pozitív hatás statisztikailag nem volt alátámasztható.

4.2.4.b táblázat A parthenogenetikus kotranszfer hatása a születési rátára Beültetett

Összes

Élők

Élők

Ivarérettséget

embriók

újszülött (%)

(élők/összes

(élők/összes

elérők (%)

újszülött%)

beültetett%)

3/92 (3.3)

2/3(66)

2/92(2.2)

1/2 (50)

11/120 (9.1)

4/11 (36)

4/120 (3.3)

3/4 (75)

SCNT SCNT + PGA

A különböző értékek az oszlopon belül szignifikánsan nem térnek el egymástól (P>0.05)

48

EREDMÉNYEK

4.3 EMBRIÓ MÉLYHŰTÉSI KÍSÉRLETEK EREDMÉNYEI

4.3.1. Két mélyhűtési technika összehasonlítása Elsőként a két mélyhűtési technika (SSV és VS3a) védő oldatainak toxikus hatását vizsgáltuk meg in vivo nyúl zigótákon. Kísérleteinkben toxicitás tesztet (tox) végeztünk, amelynek során az embriók átestek az ekvilibrációs lépéseken, de a hűtési lépésen nem. Ezzel a módszerrel megállapíthatóvá válik, hogy a mélyhűtéshez használt védőanyagok önmagukban milyen károsodásokat okoznak az embrióknak. A kontroll embriók kimosás után tenyésztő médiumba kerültek, ezeket nem kezeltük egyik mélyhűtő médiummal sem. Ahogyan a 4.3.1.a. táblázat mutatja, a túlélés tekintetében nem találtunk szignifikáns különbséget a két oldat toxikus hatása között (SSV 85% vs. VS3a 74%), azonban a kontrollhoz viszonyítva a VS3a rosszabb túlélési rátát mutatott (p<0.05). Az osztódási arány (SSV 79% vs. kontroll 95%), illetve morula százalék (SSV 90% vs. kontroll 79%) tekintetében az SSV oldat nem tért el a kontrolltól, viszont a VS3a rosszabb eredményeket mutatott (VS3a osztódási 64% és morula 62%, p<0.05). A blasztociszta fejlődési aránya mind három csoportban hasonlónak bizonyult (p>0,05). 4.3.1 .a táblázat A vitrifikációs oldatok toxikus hatása nyúlzigóták in vitro fejlődésére Kezelési csoportok Friss kontroll SSV oldat VS3a oldat

Kezelt zigóták

Túlélők (%)

Osztódottak (%)

Morulák (%)

Blasztociszták (%)

20 34 50

20/20 (100)a 29/34 (85)ab 37/50 (74)b

19/20 (95)a 27/34 (79)ab 32/50 (64)b

18/20 (90)a 27/34 (79)ab 31/50 (62)b

15/20 (75)a 25/34 (74)a 29/50 (58)a

A különböző betűkkel jelzett értékek (a,b) az oszlopon belül szignifikánsan eltérnek egymástól (p<0.05)

A következő kísérletekben a két embriómélyhűtési technikát hasonlítottuk össze, eredményeinket a 4.3.1.b. táblázat foglalja össze. A túlélési ráta tekintetében az SSV vitrifikációs módszer alkalmazása esetén nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget (kontroll 100% vs. SSV 95%) a kontrollhoz képest, míg a VS3a esetében alacsonyabb értékeket kaptunk (kontroll 100% vs. VS3a 85%). Az osztódási ráta mindkét módszernél alacsonyabb volt a kontrollnál (kontroll 93% vs SSV 58% és VS3a 48%). A későbbi in vitro embriófejlődést illetően viszont különbség mutatkozott a két technika között: az SSV módszer szignifikánsan jobbnak bizonyult (SSV 43% vs. VS3a 9%); azonban mindkét vitrifikációs

49

EREDMÉNYEK

eljárás alacsonyabb embriófejlődési arányokat eredményezett a kontrollhoz viszonyítva (80%). 4.3.1. b táblázat A vitrifikációs technikák hatása nyúlzigóták in vitro fejlődésére Kezelési csoportok Friss kontroll SSV VS3a

Kezelt zigóták

Túlélők (%)

Osztódottak (%)

Morulák (%)

Blasztociszták (%)

40 62 59

40/40 (100)a 59/62(95)a 50/59 (85)ab

37/40 (93)a 36/62 (58)b 28/59 (48)b

32/40 (80)a 33/62 (53)b 5/59 (9)c

32/40 (80)a 27/62 (43)b 5/59 (9)c

A különböző betűkkel jelzett értékek (a,b,c) az oszlopon belül szignifikánsan eltérnek egymástól (p<0.05).

4.3.2. Az in vitro és in vivo nyúlzigóták mélyhűtésének összehasonlítása A második kísérletsorozatban arra voltunk kíváncsiak, hogy van-e különbség az in vivo illetve in vitro előállított nyúlembriók mélyhűthetőségében. Ezekhez a kísérletekhez már csak az előzőekben jobb eredményeket mutató SSV vitrifikációs technikát alkalmaztuk. Az in vitro nyúlzigóták felolvasztás utáni in vitro fejlődési adatait a 4.3.2. a táblázat foglalja össze.

4.3.2.a táblázat Az in vitro termékenyült nyúlembriók mélyhűtés és felolvasztás utáni in vitro fejlődési adatai Csoportok IVF Friss kontroll IVF SSV IVF SSV tox

Zigóták száma (n)

Osztódottak (%)

50 33 23

48/50 (96)a 19/33 (57)b 23/23 (100)a

Blasztociszták Átlagos Aránya(%) sejtszáma±SD 38/50 (76)a 105±17,6a b 12/33 (36) 91±13,48b 23/22 (95)a 95,8±19,8b


A vitrifikált in vitro embriók (IVF SSV) osztódási (57%) és blasztociszta százaléka (36%) szignifikánsan alacsonyabbnak bizonyult a friss- (oszt. 96% és bl. 76%) vagy a toxicitásikontrollokhoz (oszt.100% és bl. 95%) képest. Eredményeink szerint mind a mélyhűtött (91±13,48) mind pedig a toxicitási-kontroll csoport embriói (95,8±19,8) átlagosan kevesebb sejtet tartalmaztak a friss, kontroll embriókhoz viszonyítva (105±17,6), a tapasztalt különbség szignifikánsnak tekinthető.

50

EREDMÉNYEK

Az in vivo embriók felolvasztás utáni in vitro fejlődési adatait a 4.3.2. b táblázat foglalja össze.

4.3.2.b táblázat Az in vivo termékenyült nyúlembriók mélyhűtés és felolvasztás utáni in vitro fejlődési adatai Csoportok Friss kontroll SSV SSV tox

Zigóták száma (n) 40 62 34

Blasztociszták Osztódottak Átlagos (%) Aránya (%) sejtszáma±SD 37/40 (93)a 32/40 (80)a 118,3±14a b b 36/62 (58) 27/62 (43) 97.9 ± 21,7b 27/34 (79)a 25/34 (74)a 118,7±8,8a


A vitrifikált in vivo embriók (SSV) osztódási százaléka (58%) szignifikánsan alacsonyabbnak bizonyult, mint a friss és a toxicitási-kontroll csoportokra jellemző százalék-értékek (Friss kontroll 93% és SSV tox 79%), és a blasztociszták aránya is jelentősen lecsökkent a kontrollokhoz képest (SSV 43% vs. Friss kontroll 80% és SSV tox 74%). A mélyhűtött in vivo blasztociszták átlagos sejtszáma szignifikánsan kevesebbnek bizonyult a kontrollokra jellemző sejtszám-értékhez viszonyítva (SSV 97,9±21,7 vs. Friss kontroll 118,3±14 és SSV tox 118,7±8,8).

51

EREDMÉNYEK

Az két csoport (in vivo és in vitro) eredményeit összehasonlítva megállapíthatjuk, hogy a vitrifikált csoportra meghatározott osztódási (in vivo 58% vs. in vitro 57%) és blasztociszta arányok (in vivo 43% vs. in vitro 36%) hasonló mértékű különbséget mutatnak a megfelelő kontroll csoportokhoz képest (in vivo 78% vs. in vitro 76%) (p>0.05). Eltérés csak a sejtszámkülönbözőségek tekintetében látható: az in vitro csoportban a mélyhűtött embriók mellett a toxicitási kontroll sejtszáma is lecsökken, míg az in vivo csoportban ilyen különbség nem tapasztalható (4.3.2. c. ábra).

140 120

Átlagos sejtszám

100 80

a

a

a

60

b

40

b

b

20 0 IVF Kontroll

IVF SSV

IVF Tox

Kontroll

SSV

Tox

4.3.2.c ábra Az in vivo és in vitro termékenyült nyúlembriók mélyhűtés és felolvasztás utáni átlagos blasztociszta sejtszám adatai

52

ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK

5. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK 1. Kifejlesztettem egy jól definiált in vitro maturációs oldatot, amelyben a nyúl petesejtek 89%-a érte el az MII stádiumot, parthenogenetikus aktiválás után 82%-uk osztódásnak indult és 22,7%-a blasztocisztává fejlődött. 2. Megállapítottam, hogy a nyúl petesejtek in vitro körülmények közt lezajló maturációja során eltérő érési dinamikát mutatnak 10 illetve 20%-os FCS tartalom mellett, ami hatást gyakorol a későbbi in vitro fejlődésre. 3. A világon elsőként alkalmaztam az SSV, illetve a VS3a vitrifikációs eljárásokat sikeresen nyúl zigóták mélyhűtésére. 4. Megállapítottam, hogy és in vitro termékenyült zigóták az in vivo termékenyültekkel megeggyező jó hatékonysággal mélyhűthetők az SSV technika alkalmazásával. 5. Laparoszkópos technika alkalmazásával klónozott nyúl embriókat ültettem be és sikerült élő utódokat előállítanom a Magyarországon elsőként végrehajtott sikeres nyúl felnőtt testi sejtmag-átültetéses kísérletek során.

53

ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK

54

EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE ÉS JAVASLATOK

6. EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE ÉS JAVASLATOK Számos publikáció számol be in vitro maturáltatott nyúl petesejtek használatáról, ám sokszor annak körülményeit igen homályosan írják le. Sok esetben hormon kezelt, laboratóriumi állatokat használnak petefészek donornak (Yin et al., 2002a; Grøndahl et al. 2003., Kanaya et al. 2007), amely állatok petefészke nem ekvivalens egy hormon kezelés nélküli vágóhídi állat ováriumával. Ezért ezeknek a publikációknak az eredményeit nem lehet összevetni azokéval, ahol nem történik külső hormonális stimulus. A vágóhídi állatok nagy százaléka reprodukciós problémák miatt kerül leselejtezésre, ezért is kihívás ezen állatok ováriumának használata. A nyúlpetesejtek in vitro maturációjára számos külső tényező lehet hatással, úgymint a donor állat tápláltsági állapota (Arias-Alvares et al., 2010), a follikulusok mérete (Smith et al.,1978) az in vitro maturációs médium összetétele (Armstrong et al. 1991, Lorenzo et al. 1996). Munkám során a petefészek szállítási hőmérsékletének, a maturációs médium összetételének valamint az in vitro maturáció inkubációs hőmérsékletének hatását vizsgáltam. Az első kísérletsorozatban (4.1.1. fejezet) az in vitro maturációs rendszer paramétereit optimalizáltuk. A petefészkek szállítási hőmérsékletét 32°C, illetve 37°C-ra állítottuk be, melyek közül, a maturációs ráta nagyságát figyelembe véve, az alacsonyabb hőmérsékleten történő petefészek szállítás bizonyult hatékonyabbnak. Ezalapján megállapíthatjuk, hogy az ováriumok közel testhőmérsékleten való szállítása során a petesejtek nagyobb mértékben károsodtak, mint alacsonyabb hőmérsékleten (32°C). Mindez azzal magyarázható, hogy a hosszabb (1-2 órás), közel testhőmérsékleten való tárolás elősegíti a különböző destruktív enzimatikus folyamatokat az ováriumokban. A különböző hőmérsékleten érlelődött petesejtek csak akkor mutattak szignifikáns maturációs különbséget, ha a petefészek szállítása 37°C-on történt, ilyenkor a 38,5°C-on történő inkubáció bizonyult hatékonyabbnak. Ez valószínűleg azzal magyarázható, hogy az alacsonyabb hőmérsékleten történő szállítás folyamán a petefészkekben levő petesejtek sokkal kevésbé károsodtak és nagyobb eséllyel tudtak a későbbiekben maturálódni, mint a közel testhőmérsékleten történő szállítást követően. Tehát az inkubáció hőmérséklete nincs akkora hatással a maturációra, mint a szállítás hőmérséklete. Mindezek az eredmények azt mutatják, hogy az általunk vizsgált külső tényezők közül a petefészkek szállítási hőmérséklete van a legnagyobb hatással a nyúlpetesejtek in vitro érlelésére. A hormon (hCG, PMSG) és növekedési faktor (EGF, IGF-I) kiegészítést tartalmazó

55


IVM médium (IVMM) és a kiegészítést nem tartalmazó oldat alkalmazása vizsgálati rendszerünkben nem eredményezett szignifikáns különbséget a petesejtérésre kifejtett hatását illetően. Ez megfelel az irodalmi adatoknak, miszerint a tüszőben lévő petesejt hormonális illetve növekedési faktorok hatására fejezi be a meiotikus osztódást (Yoshimura et al., 1989), valamint összhangban áll a Pincus és Enzmann (1935) által leírtakkal, mely szerint a petefészekből eltávolított petesejtek esetében a tüszőben lévő maturációt gátló anyagok hiányában a sejtmag maturációja spontán végbemegy. A petesejt érése egy összetett folyamat, a nukleáris érés mellet a citoplazmatikus érésnek is meg kell történnie, hogy a sejt a teljes funkcióját be tudja tölteni. Ezért a második kísérletsorozatban (4.1.2. fejezet) a petesejtek egy részét parthenogenetikusan aktiváltuk, hogy a nukleáris érés mellett megfigyelhessük azok fejlődési képességét is. Azért választottuk a parthenogenetikus aktiválást és nem az IVF-et, hogy ezzel is csökkentsük a kísérletek ismétlésekor

felmerülő

spermaminőségbeli

különbségek

által

okozott

eltéréseket.

Aktiválhatóság tekintetében eltéréseket tapasztaltunk a különböző maturációs médiumok között. A legkisebb hatékonysággal a 20% FCS-t tartalmazó IVMM-ban (74,6%) maturálódott petesejtek voltak aktiválhatók, míg a legjobban a kiegészítést nem tartalmazó csoport petesejtjei aktiválódtak (88,2%). A többi in vitro csoport aktiválhatósága (10%FCS (81.8%) és IVM+ (82,8%)) nem különbözött egymástól és az előbbiek között helyezkedett el, viszont az összes in vitro maturálódott csoport eredményessége az in vivo jellemző érték (95,4%) alatt maradt. Az embriófejlődés tekintetében a kiegészítést nem tartalmazó IVM (IVM-) csoport gyengébbnek mutatkozott (14,5%) a többi in vitro csoporthoz képest (IVM+ (22,7%), IVM10%FCS (20,8%), IVM20%FCS (23,5%). Ez valószínűleg azzal magyarázható, hogy bár a nukleáris érés sikeresen végbement és az első néhány osztódás rendben megtörtént, az elégtelen, vagy részleges citoplazmatikus érés a későbbi embriófejlődésben zavart okozhatott. Az FCS, illetve a különböző hormon és növekedési faktor kiegészítéseket tartalmazó IVMM használatakor hasonló embriófejlődési eredményeket értünk el (IVM+ 22,7% vs. IVM10%FCS 20,8% és IVM20%FCS 23,5%). Ez azért kedvező, mert így lehetőség nyílik arra, hogy egy jól definiált médiummal (IVM+) ugyanolyan hatékonyságot biztosítsunk, mint a szérum kiegészítéssel (IVM 10 és 20% FCS). A Fetal Calf Serum (FCS), a borjú vérszérumából különféle tisztítási folyamatok elvégzésével készül. A szérum a különböző fehérjék, zsírsavak, vitaminok, hormonok, növekedési faktorok és nyomelemek összetett és eltérő kombinációját tartalmazza. Az FCS gyártása során nagyobb mennyiséget állítanak elő egyszerre és a különböző „kiszerelések” között komoly eltérések lehetnek. A kísérletek 56


ismételhetősége és sikeressége érdekében fontos tudni a médiumok pontos összetételét. Ezért arra kell törekedni, hogy az ismeretlen faktorokat kizárjuk a rendszerből. Jelen esetben a szérum használata egy ilyen faktor volt, ezért megpróbáltuk helyettesíteni ezt az igen összetett, ugyanakkor lényeges komponenst. Eredményeink azt mutatják, hogy ezt sikerült elérni. Az első (4.1.1. fejezet) és második (4.1.2. fejezet) maturációs kísérletsorozatunk hatékonysága között igen nagy eltérés mutatkozott. Összehasonlítva a megegyező körülmények közötti (32˚C-on szállított, 38,5˚C-on inkubált, hormonnal és növekedési faktorokkal kiegészített IVMM) maturációs eredményeket az első kísérletsorozatban szignifikánsan alacsonyabb (39,06%) maturációs rátát kapunk, mint a második kísérletsorozat alatt (89%). Ez azzal magyarázható, hogy az első kísérletekre nyáron került sor, míg a második kísérletsorozatot télen és tavasszal végeztük. A házinyúlnak a nyári hónapokban csökken a szaporodóképessége, illetve ha a hőmérséklet 30˚C fölé emelkedik, akkor ez kedvezőtlenül hat a nemi működésére. Ezalapján az első kísérletsorozatnak a másodikhoz viszonyított alacsonyabb

maturációs rátái nagy

valószínűséggel a nyári időjárás

következményének tekinthetőek. A második kísérletsorozatban (4.1.2. fejezet) kapott eltérő aktiválhatósági értékekre is próbáltunk magyarázatot találni. A petesejt aktiválhatóságát számos tényező befolyásolja, és valószínűleg nagy jelentőséggel bír a sejt érésének időbelisége is. Ezért egy harmadik kísérletsorozatban (4.1.3. fejezet) megvizsgáltuk a különböző maturációs oldatokban érlelődő petesejtek érési állapotát különböző időpontokban. A maturációs oldatba helyezést követően 3 óránként gyűjtöttünk mintákat a különböző csoportokból. Eredményeink azt mutatták, hogy a 10%FCS-t tartalmazó oldatban a sejtek legnagyobb része (85,22%) már a maturáció 9. órájára elérte az MII-es stádiumot, míg ez a 20%FCS-es csoportban csak a 15. órára volt tehető (72,1%). Ezalapján tehát a különböző maturációs oldatokban más volt a petesejtek érési dinamikája, ami az aktivációs eredményekben is megmutatkozott. A hamarabb megérett petesejtekben (10%FCS csoport) már elkezdődhettek az öregedési folyamatok amikor a sejtek aktiválásra kerültek (16h), ezért könnyebben is aktiválódtak, mint a 20%FCS tartalmú csoportban vizsgált petesejtek (81,8% vs. 74,6%). A testi sejtmag-átültetéses munkáink során különböző kezelések klónozott nyúl embriókra gyakorolt in vitro és in vivo hatásait vizsgáltuk meg a technológia hatékonyságának fejlesztése céljából. Az első kísérletsorozat alatt egy hiszton deacetiláz (HDAC) gátló anyaggal, TSA-val kezeltünk a klónozott nyúl zigótákat és tanulmányoztuk in vitro valamint in vivo fejlődésüket. 57


In vitro eredményeink (4.2.1. fejezet) azt mutatták, hogy a TSA kezelés nem növeli a hólyagcsíra állapotú SCNT embriók arányát a kezeletlen csoporthoz képest. Ez a megfigyelés összhangban áll mások által is publikált eredményekkel (Xu et al., 2007). Kísérleteinkben a blasztociszta állapotú embriók sejtszámában szintén nem adódott különbség a kezelés hatására. Shi és munkatársai (2008b) legutóbbi munkájukban arra mutattak rá, hogy a TSAval kezelt SCNT nyúl embriók hiszton acetilációs mintázata jobban hasonlít a normál úton megtermékenyített embriókéra, mint a kezeletlen kontroll SCNT csoportéra. Szintén ez a jelenség volt megfigyelhető TSA-val kezelt egér SCNT embriók esetében (Wang et al., 2007), amely nagyobb in vitro fejlődési rátában mutatkozott meg a TSA-val kezelt csoportban. Ugyanakkor eredményeink nem erősítették meg azt a korábbi megfigyelést, miszerint a blasztociszta fejlődés aránya TSA-val kezelt nyúl SCNT embrióknál szignifikánsan javult volna (Shi et al., 2008b). Az egymásnak ellentmondó eredmények a különböző TSA kezelési idővel és koncentrációval magyarázhatóak, valamint a klónozási protokoll eltéréseiből, a donorsejt típusának és embrió tenyésztés körülményeinek különbözőségeiből adódhatnak. Hasonlóan ellentmondásos megfigyelésekről számoltak be szarvasmarha esetében is. Egyes kutatások szerint 50 nM TSA-val kezelt klónozott szarvasmarha embriók blasztociszta aránya magasabb volt, mint a kontroll embrióké (Iwamoto et al., 2007), továbbá a TSA kezelés csökkentette az SCNT embriók DNS-metilációs szintjét az IVF embriókhoz képest (Iwamoto et al., 2008; Wu et al., 2008.). Ugyanakkor más kutatások azt igazolták, hogy a TSA-kezelés nem befolyásolja a hólyagcsíra arányt, de növeli a teljes sejtszámot a klónozott szarvasmarha embrióknál (Akagi et al., 2007). Mások szintén nem észleltek javulást az osztódási és hólyagcsíra arány illetve a blasztociszta sejtszám tekintetében a TSA-val kezelt csoportokban a kontroll IVF csoporthoz képest (Iager et al., 2008), sőt alacsonyabb blasztociszta fejlődést is tapasztaltak TSA-kezelt csoportokban (Wu et al., 2008). Mindez arra utal, hogy a TSAkezelés hatása az SCNT embriók in vitro fejlődésére speciális kísérleti környezettel van összefüggésben és a kezelési feltételek további optimalizálása szükséges. Kísérleteink során a TSA-val kezelt (TSA+) és kezeletlen (TSA-) SCNT nyúl embriók in vivo fejlődését is tanulmányoztuk (4.2.2. fejezet). Eredményeink azt mutatták, hogy nincs különbség a vemhességi (TSA+ 33,3% vs. TSA- 57,1%) és a születési arány (TSA+ 4,6% vs. TSA- 2,8%) között a TSA-val kezelt és kezeletlen csoportok között, és minkét csoportban sikerült élő utódokat nyernünk (7 TSA+ és 6 TSA-) (4.2.2.a, b táblázat). Mind a hét TSA-val kezelt embrióból származó klónozott utód a születést követő 1 órától a 19. napig terjedő időszakon belül elpusztult, ugyanakkor a TSA kezelés nélküli csoportban a túlélési arány már szignifikánsan jobbnak bizonyult: itt négy klón maradt életben a hatból és érte el az ivarérett 58


kort. Hasonló korai halálozási eredményekről számoltak be Nabu-val -egy másik HDAC inhibitorral- kezelt fibroblasztokból klónozott nyúlutódok esetében is (Yang et al., 2007). Kísérleteinkben a klónozott utódok születési testtömege (TSA- 73,5±15g vs. TSA+ 55±12g) és placenta mérete (TSA- 14±3,3g vs. TSA+ 4.029±1.3g) a TSA kezelés nélküli csoportban szignifikánsan nagyobbnak adódott. Klónozott állatok esetében gyakran előfordul (40% feletti arányban) az úgynevezett óriási utód szindróma (LOS, large offspring syndrome), amely megnövekedett szervekben, vízfejűségben, apátiában és légzőszervi rendellenességekben nyilvánul meg. Sok esetben a placenta is megnövekszik és ödémás, ami a klónozásból adódó hibák kompenzációjaként jöhet létre (Constant et al. 2006; Fletcher et al. 2007, Loi et al 2006). Nyúl esetében is írtak le hasonló jelenséget és ezek az átlag feletti (90g, Chesné et al 2002; 96g Yang et al. 2007) illetve átlag alatti (30g Chesné et al 2002) utódok a születés után nem sokkal el is pusztultak. Li és munkatársai (2006), akik viszont fibroblaszt sejteket használtak donorként, normális, az átlagnak megfelelő születési testtömeget mértek (55±21g), és azt tapasztalták, hogy a császármetszéssel világrahozott újszülöttek nagyobb eséllyel éltek túl, mint a természetes úton világrajött utódok. Esetünkben ez nem igazolódott be, ugyanis mind császármetszésből (TSA-6), mind természetes születésekből (TSA-3,4,5) fejlődtek egészséges felnőtt egyedek. Kísérleteink során, nyomon követtük a legalább 19 napig életben maradt utódok testtömeggyarapodását is, a TSA-val kezelt és a kezeletlen csoportokban egyaránt (4.2.3. fejezet). Az első napi fogyástól eltekintve az összes kisnyúl testtömege nőtt az idő előrehaladtával. Egy átlagon aluli testtömegű (TSA+ 7-es) állat a 19. napon elpusztult, azonban az TSA- 6-os, szintén kis tömegű utód túlélt és fertilisnek bizonyult, a leghosszabb élettartamot produkálva az összes többi közt. Az első kilenc nap alatt mindkét csoportban volt átlag alatti egyed (TSA+7, TSA+5, TSA-6). Ezek alapján a TSA kezelésen átesett csoport tagjai nem a testtömeg gyarapodásukban szenvedtek hiányt és nem emiatt pusztultak el, tehát nem a kezdeti (első 3 heti) alacsonyabb testtömeg volt az akadályozó tényező a túlélésben és a későbbi egyedfejlődésben. További érdekes megfigyelésünk, hogy a legalább 19 napot megélt utódok között a sikeres túlélő TSA-6-os egyednek volt a legmagasabb születéskori testtömege (90g), majd lett a legalacsonyabb a 19. napra. A második kísérletsorozatunkban (4.2.4 fejezet) klónozott embriók mellé parthenogenetikus embriókat is ültettünk (ko-transzfer) a recipiensekbe és ennek hatását vizsgáltuk a vemhesség megtartására,

illetve

a

későbbi

egyedfejlődésre.

Korábbi

publikációk

szerint

a

parthenogenetikus embriók együttes ültetése hasznos a beágyazódás és a vemhesség megtartásában a klónozott sertés (De Sousa et al., 2002) és egér embriók esetében (Meng et 59


al., 2008b). A SCNT embriók in vivo fejlődésének parthenogenetikus embriókkal történő javítási mechanizmusa és az együttes ültetés jótékony hatásának pontos háttere még nem teljesen ismert. A természetes in vivo fejlődésnél a vemhesség kialakulásához, illetve fenntartásához szükség van az embrióból és a magzatburkokból származó szignálokra, valamint egy kölcsönös, az embrió és az endometrium közötti kölcsönhatásra (Spencer et al., 2004). Az trofoblaszt sejtek olyan fehérjéket szekretálnak (Lee et al., 1988; Linzer és Fisher 1999), amelyek hatnak az endometriumra és segítenek a vemhesség fenntartásában. Egy nemrégiben készült tanulmány kimutatta, hogy a beágyazódást követően az egér embrió képes szabályozni a méhnyálkahártya néhány specifikus génjének az expresszióját (Angpt1/2, Dtprp, G1p2 és Prlpa), továbbá bizonyos gének méhben való kifejeződése függ az egészséges embrió jelenlététől (Bany és Cross 2006). A SCNT állatoknál általában magas a placentahibák előfordulása (Hashizume et al., 2002; Hill et al., 2000b), ennek következményeként csökken a vemhesülés esélye. Ha nincs megfelelő minőségű és mennyiségű embrionális szignál az anya felé, a szervezet ivari ciklusa újraindul, és a már sikeresen megtapadt embriók is abortálódhatnak. A parthenogenetikus embriók in vitro fejlődési képessége jobb és gyorsabb, mint a klónozottaké (Liu et al., 2004). Korábbi publikációk alapján, ha klónozott embrióhoz természetes úton termékenyült embriókból származó blasztomereket aggregáltattak az javította a fejlődési képességüket és sikerült élő, klónozott kiméra utódokat előállítani (Matsuda et al., 2002; Skrzyszowska et al., 2006), illetve ha parthenogenetikus blasztomereket használtak, jobb eredményeket értek el, mint a normál úton termékenyült blasztomerek alkalmazása esetében (Yang et al., 2007). Ellentétben a normál embriókkal, a parthenogenetikus nyúl magzat csak 10-11 napig képes fejlődni (Ozil 1990, Ozil és Huneau 2001), ezáltal elkerülhető, hogy a beágyazódást követő későbbi fejlődés során kompetíció alakuljon ki a gyengébb klónok és a természetes magzatok között. Sertés esetében a természetesen termékenyített embriókkal végzett ko-transzfer során több száz SCNT embrióból csak egy született meg (Onishi et al., 2000; Verma et al., 2000). Második kísérletsorozatunkban

ezért

parthenogenetikus,

"segítő

embriókat"

használunk

a

természetesen termékenyültek helyett. Eredményeink alapján a vizsgált paraméterek beleértve a vemhesség megtartását, a magzatképződést és az élve születést - jobbnak bizonyultak a ko-transzfer csoportban a kontroll SCNT csoporthoz viszonyítva, azonban a különbséget statisztikailag nem lehetett megerősíteni. Az embrió mélyhűtési kísérleteknél először két különböző vitrifikációs technikát 60


hasonlítottunk össze (4.3.1. fejezet). Első lépésként a mélyhűtés során használt védőanyagok (CPA) toxikus hatását vetettük össze. A VS3a oldat alkalmazásakor a túlélési (74% vs. 100%), az osztódási (64% vs. 95%) és a morulák (62% vs. 90%) százalékos aránya alacsonyabb volt a kontrollhoz képest, de a blasztociszta aránynál tapasztalt különbség statisztikailag nem volt igazolható (p>0.05). Ebből arra lehet következtetni, hogy a VS3a-nál alkalmazott védőanyag koncentráció kis mértékben negatívan befolyásolja az embriók kezdeti növekedését, de ez a negatív hatás az embriófejlődés későbbi szakaszában már nem érvényesül, tehát a két vitrifikációs oldat hosszútávú hatása lényegesen nem különbözik egymástól. A két vitrifikációs eljárás összehasonlításakor (műszalma vs. kis térfogat) a túlélési és osztódási arány egyforma mértékben volt gyengébb a kontrollhoz képest (4.3.2. fejezet), jelezve, hogy mindkét mélyhűtési eljárás károsítja az embriókat, amelyeknek csak közel fele fejlődött tovább (SSV 58% és VS3a 48%). A későbbi embriófejlődés során már mutatkozott különbség a két vitrifikációs technika között: a VS3a csoportban a blasztociszta arány (9%) jóval alacsonyabbnak bizonyult az SSV csoportban tapasztaltakhoz képest (43%). Ebből arra következtethetünk, hogy a VS3a technika, amelyben műszalmát használunk a hűtés során, kevésbé alkalmas a nyúl zigóták mélyhűtésére, a kis térfogatban történő SSV vitrifikáció kielégítőbb eredményeket hozott. Az irodalomban kevés nyúl zigóta mélyhűtésről szóló publikáció található (Gajda and Smorag, 1993; Smorag és Gajda, 1998; Hochi et al., 2001, 2004; Lin et al., 2011), és egy kivételtől eltekintve (Hochi et al., 2004 (51%)) ezek is meglehetősen alacsony (5-18%-os) in vitro fejlődési adatokról számolnak be. Megállapíthatjuk, hogy az általunk alkalmazott eljárással megfelelő hatékonyságú mélyhűtési technikát sikerült beállítanunk. Módszerünket in vitro előállított zigótákon is kipróbáltuk (irodalomban erre nem található referencia) és hasonlóan jó (in vivo 43% és in vitro 36%) eredményeket értünk el. Különbséget csak a blasztociszta sejtszámok esetében tapasztaltunk, amikor az in vitro termékenyült embriók toxicitási kontroll csoportjának (95,8±19,8) hasonlóan lecsökkent a sejtszáma, mint a mélyhűtött-felolvasztott csoportban lévő embrióké (91±13,48). Az in vivo csoportban ez a különbség nem állt fenn, ez esetben a toxicitási kontroll csoportba tartozó embriók átlagos sejtszáma (118,3±14) hasonlóan alakult a kontroll csoport embrióiéhoz (118,7±8,8). Ezek alapján elmondható, hogy az in vitro előállított embriók érzékenyebbek voltak a mélyhűtés során alkalmazott CPA-ra, mint in vivo társaik, ami a toxicitási kontroll alacsonyabb blasztociszta sejtszámában mutatkozott meg.

61

ÖSSZEFOGLALÁS

7. ÖSSZEFOGLALÁS A nyúl széleskörűen használt és kutatott modell állat. Jelentősége igen sokrétű és a vele kapcsolatos kutatások szerteágazóak. Reprodukciós képességei és sajátosságai miatt szívesen alkalmazzák biotechnológiai kísérletekhez. Mérete és reprodukciós ideje megfelel a gazdaságos tartási feltételeknek ezért is fontos lehet ezen állatfaj használata. Feladatom volt, hogy az állatvédelmi szempontokat szem előtt tartva, kevesebb kísérleti állat felhasználásával,

gazdaságosabban

nyerjek

ki

nyúl

petesejteket

és

embriókat

a

biotechnológiai kísérletekhez. Munkám során vágóhídi petefészekből in vitro maturációval állítottunk elő érett petesejteket. Az in vitro maturációs rendszer paramétereit, úgymint a szállítási hőmérséklet, az in vitro maturációs médium-összetétel és az inkubációs hőmérséklet hatásait vizsgáltuk. A petefészkeket 32°C illetve 37°C-on szállítottuk melyek közül, a maturációs ráta értékét figyelembe véve, az alacsonyabb hőmérsékleten történő petefészek szállítás bizonyult hatékonyabbnak. A különböző inkubációs hőmérsékleten érlelődött petesejtek csak akkor mutattak szignifikáns különbséget maturációs rátájukban, ha a petefészkek szállítása 37°C-on történt, ilyenkor a 38,5°C-on történő inkubáció mutatkozott eredményesebbnek. Az in vitro maturációs médium összetételét illetően sikerült kifejlesztenünk egy jól definiált oldatot, melyben a petesejtek 89%-a megérett, parthenogenetikus aktiválás után 82%-uk osztódásnak indult és 22,7% blasztocisztává fejlődött. A különböző összetételű maturációs médiumokban eltérő petesejtérési dinamikát figyeltünk meg, ami befolyásolta a petesejtek aktiválhatóságát. A testi sejtmag-átültetéses kísérletek során egy hiszton deacetiláz (HDAC) gátló anyaggal, TSA-val kezeltünk a klónozott nyúl embriókat és nyomon követtük in vitro illetve in vivo fejlődésüket. In vitro eredményeink azt mutatták, hogy a TSA-kezelés nem befolyásolta a hólyagcsíra állapotú SCNT embriók arányát és sejtszámát sem. In vivo megfigyeléseink is hasonló eredményeket mutattak, nem találtunk eltérést a vemhességi és a születési arányok tekintetében. A klónozott utódok születési testtömege és placenta mérete azonban a TSAkezelés nélküli csoportban szignifikánsan nagyobbnak bizonyult. A két csoport posztnatális fejlődésének üteme nem tért el egymástól, viszont a TSA-kezelés hatást gyakorolt az élettartamra vonatkozóan, ugyanis egyetlen kezelt egyed sem élte meg az ivarérett kort, míg a kontroll klónozott csoport esetében hat egyedből négy legalább 11 hónapig túlélt. Mélyhűtési kísérleteink során in vivo nyúlembriókat vitrifikáltunk két különböző mélyhűtési

62

ÖSSZEFOGLALÁS

technika alkalmazásával (VS3a vs. SSV). Az egyik módszernél (VS3a) műszalmában, míg a másiknál (SSV) apró médiumcseppekben történt a vitrifikáció. A két mélyhűtési eljárás során használt védőanyagok (CPA) toxikus hatásának vizsgálatakor a VS3a oldat esetében a túlélési, osztódás és morula arány alacsonyabbnak bizonyult a kontrollhoz képest, de a blasztociszták arányában ez a különbség statisztikailag nem volt igazolható. A két vitrifikációs eljárás metodikájának összehasonlításában (műszalma vs. apró térfogatban való vitrifikálás) a túlélési és osztódási arány egyforma mértékben volt gyengébb a kontrollhoz viszonyítva, a későbbi embrió fejlődés során azonban különbséget tapasztaltunk a két eljárás okozta hatások között, ugyanis a VS3a csoportban a blasztociszta arány (9%) jóval alacsonyabbnak bizonyult az SSV csoportéhoz képest (43%). A kíméletesebbnek talált módszerünket (SSV) in vitro előállított zigótákon is kipróbáltuk - melyre vonatkozóan az irodalomban nem található utalás - és hasonlóan jó embriófejlődési eredményeket sikerült elérnünk (36%). Különbséget csak az in vitro termékenyült embriók toxicitási kontroll csoportjának alacsonyabb blasztociszta sejtszámában tapasztaltunk, amely az in vitro embriók krioprotektánsokkal szembeni nagyobb érzékenységére utal.

63

SUMMARY

8. SUMMARY The rabbit is a widely used and well-studied animal-model, playing a significant role as an experimental animal in a number of diverse researches. Its reproductive characteristics make it suitable for different biotechnological experiments. Due to the optimal size and the good reproduction time of the rabbit, it can also become an economical issue to use this species. My task was to collect oocytes economically; bearing in mind the animal welfare so as to fewer animals would be required for biotech experiments. In our study, in vitro matured oocytes were produced from slaughterhouse collected ovaries. The effect of in vitro maturation parameters, such as transport temperature, composition of in vitro maturation medium and different incubation temperatures, were studied. The ovaries were transported at either 32 °C or 37 °C, the lower temperature providing a higher maturation rate. Different incubation temperatures resulted in a significantly different maturation rate, and when the ovaries were transported at 37 °C, the 38.5 °C incubation temperature seemed to be more effective for the maturation. During our study, we successfully developed a well-defined in vitro maturation medium, resulting in 89% maturation rate, 82% dividing rate after parthenogenetic activation and blastocyst development with 22.7%. The dynamics of the oocyte maturation proved to be altered in different maturation media, which was reflected in variable oocyte activation rates. In our somatic cell nuclear transfer (SCNT) study, we investigated the effect of trichostatin A (TSA) treatment, as a histone deacetylase (HDAC) inhibitor, on the in vitro and in vivo development of the SCNT rabbit embryos. Based on the in vitro results, the blastocyst rate and the cell number were not affected by the TSA-treatment. The in vivo observations have been almost the same, as there were no differences in the gestation and birth rates. The newborn and placenta weight of the cloned offspring’s were significantly higher for the TSAfree group than for the TSA-treated ones. The postnatal developmental rate seemed to be similar; however, the TSA-treatment could have an impact on the longevity, as the litters in the TSA-treated group could not reach adulthood, while the untreated SCNT progenies reached puberty and 4 out of the 6 animals survived at least 11 month. In the embryo cryopreservation study, two vitrification techniques have been compared using in vivo pronuclear stage rabbit embryos (VS3a vs. SSV). The vitrification was performed in straws in case of the VS3a technique, and in small drops of vitrification medium when using the other method (SSV). Based on the toxicity-comparison of the two cryopreservation

64

SUMMARY

procedures, the survival, cleavage and morula rates seemed to be lower when using the VS3a method compared to the controls, but in the blastocyst ratio the difference was not significant. When the methodology of the two vitrification processes were compared (straw vs. small volume vitrification), the survival and cleavage rate proved to be almost equally lower in both cryopreserved groups, than in the control. During the embryonic development this difference between the effects of the two cryopreservation methods became obvious, as the blastocyst rate for the VS3a group (9%) was significantly lower compared to the SSV group (43%). The more suitable SSV method has also been applied using in vitro produced zygotes, as there is no available data for this in the literature, and similarly good results could be achieved using this cryopreservation method (43% in vivo and in vitro 36%). The only difference was found in the toxicity control group of in vitro fertilized embryos, where a lower number of cells could be determined in the blastocyst, suggesting the higher sensitivity of the in vitro derived embryos against the applied cryoprotectants.

65

MELLÉKLETEK

9. MELLÉKLETEK

9.1. A FELHASZNÁLT OLDATOK PBS KCl.........................................................................................................................20 mg KH2PO4 .................................................................................................................20 mg MgCl2(6XH2O).................................................................................................21,24 mg NaCl.....................................................................................................................800 mg Na2HPO4 ..............................................................................................................115 mg CaCl2(2xH2O)...................................................................................................13,25 mg MQ víz..................................................................................................................100 ml Petesejt mosó oldat FCS (Ca. No.: 10108-165, LOT: 06F1043F)..........................................................20 ml PBS.........................................................................................................................80 ml Pen/Strept (1000x törzsoldat).................................................................................l00 l IVM alap médium (100ml) M199 (Earls’s salt, L glutamin, NaHCO3 kiegészítéssel)....................................100 ml BSA (A3311)..........................................................................................................0.3 g Na piruvát (0.91 mM végső konc)..................................................................10.01 mg Pen/Strept (100x törzsoldat)..................................................................................l00 l Pen/Strep törzsoldat (1000x) Sztreptomicin szulfát.........................................................................................1000 mg Penicillin G kálium….......................................................................................632.9 mg MQ víz…................................................................................................................10 ml 66

MELLÉKLETEK

EGF (100x törzsoldat) (végső konc 10ng/ml) EGF .........................................................................................................................2 mg M199.....................................................................................................................200 ml IGF-I (100x törzsoldat) (végső konc 50 ng/ml) IGF-I.........................................................................................................................1 mg M199.....................................................................................................................200 ml hCG (20x törzsoldat) (végső konc 5 IU/ml) hCG.....................................................................................................................1000 IU M199.......................................................................................................................10 ml PMSG (20x törzsoldat) (végső konc 5 IU/ml) PMSG..................................................................................................................1000 IU M199.......................................................................................................................10 ml IVM IVM alap................................................................................................................9.7 ml EGF(törzsoldat)......................................................................................................100µl IGF (törzsoldat)......................................................................................................100µl hCG(törzsoldat)........................................................................................................50µl PMSG(törzsoldat).....................................................................................................50µl Orcein festő oldat Ecetsav…................................................................................................................55 ml Orcein..........................................................................................................................1 g MQ víz….................................................................................................................45 ml

67

MELLÉKLETEK

Mosó folyadék Orcein festéshez Ecetsav....................................................................................................................10 ml Glicerin....................................................................................................................10 ml MQ víz....................................................................................................................30 ml Fixáló Orcein festéshez 96% etanol.............................................................................................................30 ml Ecetsav…...............................................................................................................10 ml PMSG (119 IU/0,5 ml) SO-hoz PMSG..................................................................................................................5000 IU Fiziológiás sóoldat..................................................................................................21 ml hCG (178 IU/0,5 ml) SO-hoz hCG.....................................................................................................................1500 IU Fiziológiás sóoldat..................................................................................................4,2 ml 0.1% hialuronidáz törzsoldat Hialuronidáz…........................................................................................................30 mg PBS............................................................................................................................1ml Ca-Mg törzsoldat (100x) Kálcium acetát (402850).....................................................................................88,1 mg Magnézium acetát (M5661)...............................................................................536,3 mg HEPES(H6147).................................................................................................595,8 mg MQ víz....................................................................................................................50 ml

68

MELLÉKLETEK

Aktivációs oldat Sorbitol (S2889)……………….………………………………………………...911 mg Ca-Mg törzsoldat …………………………………………………………………200µl MQ víz…………………………………………………………………………….20ml BSA(A3311)……………………………………………………………………..20 mg DMAP törzsoldat (2,5mM végső konc.) 6-DMAP (D2629) ..................................................................................................10 mg RDH....................................................................................................................163,4 µl 100x CB törzsoldat (7,5 g/ml végső konc.) Citochalasin-B (Sigma C6762)..............................................................................75 mg MQ.........................................................................................................................100ml EBSS alap médium EBSS (E2888)…………………………..……………………………………......90 ml L-glutamin (G3126)…………………………...………………………….....…0.0146 g Na piruvát (P4562)…………………………………………………….….....…0.0044 g FBS…………………………………………………………………………......…10 ml EBSS kiegészített médium EBSS alap………………………………………………………………….....… 97 ml NEAA (M7145)…………………………………………………………….....…. 1 ml EAA (B6766)………………………………………………………………......… 2 ml Stock A (DM-hez) NaCl…………………………………….......................................................... 0,8618 g KCl ………………………………….….......................................................... 0,0394 g CaCl2 x2H2O …………………………............................................................ 0,0434 g NaH2PO4x2H2O ……………………….......................................................... 0,0168 g MgCl2x6H2O ………………………….…....................................................... 0,014 g 69

MELLÉKLETEK

Phenol red ……………………………….......................................................... 0,0002 g MQ víz……………………………………..........................................................100 ml Stock B (DM-hez) NaHCO3 ……………….…………...................................................................1,2935 g Phenol red …………..….………….................................................................... 0,002 g MQ víz……………………………………............................................................100 ml DM oldat Stock A ……………………………….…………………...............…………… 76 ml Strock B …………………………………………………...............…………… 24 ml D-glukóz ………………………….…………………........................………… 0,250g Na-piruvát ……………….….…..………………............................………… 0,0138 g Antibiotikum törzsoldat..…………………………..............…………………....100 l BSA ………………………………..….…………...................…………………… 1 g HIS DM DM ……………………………………………………………...…………….. 10 ml NaCl ………………………………………………………………………… 0,034g

70

MELLÉKLETEK

9.2. IRODALOMJEGYZÉK 1.Adams, C. E. (1970) Maintenance of pregnancy relative to the presence of few embryos in the rabbit. J. Endocrinol 48: 243-249.1. 2.Adams, C. E., Hay, M. F., and Lutwak-Mann, C. (1961) The action of various agents upon the rabbit embryo. J. Embryol. Exp. Morphol. 9: 468-491. 3. Adenot, P.G., Szöllösi, M.S., Chesné, P., Chastant, S. and Renard J.P., (1997) In vivo aging of oocytes influences the behavior of nuclei transferred to enucleated rabbit oocytes. Mol Reprod Dev. 46(3):325-336. 4.Akagi, S, K Fukunari, K Matsukawa, S Watanabe and S Takahashi (2007). Effect of Treatment with Trichostatin A on In Vitro Development of Bovine Nuclear-Transferred Embryos. Reprod Fertil Dev. 19, 130-131 5. Arias-Alvarez M, García-García RM, Torres-Rovira L, González-Bulnes A, Rebollar PG, Lorenzo PL.

(2010) Influence of leptin on in vitro maturation and steroidogenic

secretion of cumulus-oocyte complexes through JAK2/STAT3 and MEK 1/2 pathways in the rabbit model Reproduction;139(3):523-32 6. Armstrong DT, Zhang X, Vanderhyden BC and Khamsi F. (1991) Hormonal actions during oocyte maturation influence fertilization and early embryonic development Ann N Y Acad Sci. 1991;626:137-58 7. Bae IH. and Foote RH (1980) Maturation of rabbit follicular oocytes in defined medium of varied osmolarity J Reprod. Fertil. 59 11-13 8. Baguisi, A., Behboodi, E., Melican, D. T., Pollock, J. S., Destrempes, M. M., Cammuso, C., Williams, J. L., Nims, S. D., Porter, C. A., Midura, P., Palacios, M. J., Ayres, S. L., Denniston, R. S., Hayes, M. L., Ziomek, C. A., Meade, H. M., Godke, R. A., Gavin, W. G., Overstrom, E. W., and Echelard, Y. (1999) Production of goats by somatic cell nuclear transfer. Nat. Biotechnol. 17: 456-461. 9. Baguisi, A. and Overstöm, E.W. (2000) Induced enucleation in nuclear transfer procedures to produce cloned animals. Theriogenology 53(6), 209. 10. Bank H and Maurer RR. (1974). Survival of frozen rabbit embryos. Exp Cell Res 71

MELLÉKLETEK

89:188-196. 11. Bany, BM and JC Cross (2006). Post-implantation mouse conceptuses produce paracrine signals that regulate the uterine endometrium undergoing decidualization. Dev Biol. 294, 445-456 12. Beatty, R. A. (1958) Variation in the number of crpora lutea and in the number and size of 6-day blastocysts in rabbits subjected to superovulation treatment. J. Endocrinol. 17: 248-260 13. Berg DK, Li C, Asher G, Wells DN, Oback B. (2007) Red deer cloned from antler stem cells and their differentiated progeny. Biol Reprod.;77(3):384-94. 14. Besenfelder, U. and Brem, G. (1993) Laparoscopic embryo transfer in rabbits. J. Reprod. Fertil. 99: 53-56. 15. Besenfelder, U., Strouhal, C., and Brem, G. (1998) A method for endoscopic embryo collection and transfer in the rabbit. Zentralbl. Veterinarmed. A 45: 577-579. 16. Betthauser, J., Forsberg, E., Augenstein, M., Childs, L., Eilertsen, K., Enos, J., Forsythe, T., Golueke, P., Jurgella, G., Koppang, R., Lesmeister, T., Mallon, K., Mell, G., Misica, P., Pace, M., Pfister-Genskow, M., Strelchenko, N., Voelker, G., Watt, S., Thompson, S., and Bishop, M. (2000) Production of cloned pigs from in vitro systems. Nat. Biotechnol. 18: 1055-1059. 17. Boquest, A. C., Day, B. N., and Prather, R. S. (1999) Flow cytometric cell cycle analysis of cultured porcine fetal fibroblast cells. Bio. Reprod. 60: 1013-1019. 18. Bowles EJ, Lee JH, Alberio R, Lloyd RE, Stekel D, Campbell KH and St John JC. (2007) Contrasting effects of in vitro fertilization and nuclear transfer on the expression of mtDNA replication factors. Genetics 176: 1511–1526. 19. Campbell, K. H. S., McWhir, J., Ritchie, W. A., and Wilmut, I. (1996a) Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature 380: 64-66. 20. Carney, E. W. and Foote, R. H. (1990) Effects of superovulation, embryo recovery, culture system and embryo transfer on development of rabbit embryos in vivo and in vitro. J. Reprod. Fertil. 89: 543-551. 72

MELLÉKLETEK

21. Carney, E. W., Tobback, C., Ellington, J. E., and Foote, R. H. (1990) Co-culture of rabbit 2-cell embryos with rabbit oviduct epithelial cells and other somatic cells. Mol. Reprod. Dev. 27: 209-215. 22. Carney, E. W. and Foote, R. H. (1991) Improved development of rabbit one-cell embryos to the hatching blastocyst stage by culture in a defined, protein-free culture medium. J. Reprod. Fertil. 91: 113-123. 23. Cervera, R.P. and García-Ximénez F. (2003) Oocyte age and nuclear donor cell type affect the technical efficiency of somatic cloning in rabbits. Zygote 11(2):151-158 24. Challah-Jacques, M, P Chesne and JP Renard (2003). Production of Cloned Rabbits by Somatic Nuclear Transfer. Cloning Stem Cells. 5: 295-299. 25. Chang, M. C. (1951) Fertilization capacity of sperm deposited in the fallopian tube. Nature (Lond. ) 168: 697. 26. Chang, M. C., Casas, J. H., and Hunt, D. M. (1971) Development of ferret eggs after 2 to 3 days in the rabbit fallopian tube. J. Reprod. Fertil. 25: 129-131. 27. Chang KH, Lim JM, Kang SK, Lee BC, Moon SY and Hwang WS. (2003) Blastocyst formation, karyotype, and mitochondrial DNA of interspecies embryos derived from nuclear transfer of human cord fibroblasts into enucleated bovine oocytes.Fertil Steril 80: 1380–1387. 28. Chen, T., Zhang, Y.L., Jiang, Y., Liu S.Z., Schatten, H., Chen D.Y. and Sun Q.Y. (2004) The DNA methylation events in normal and cloned rabbit embryos. FEBS letter 578: 69-72. 29. Chen, Y., He, Z.X., Liu, A., Wang, K., Mao, W.W., Chu, J.X., Lu, Y., Fang, Z.F., Shi, Y.T., Yang, Q.Z., Chen da, Y., Wang, M.K., Li, J.S., Huang, S.L., Kong, X.Y., Shi, Y.Z., Wang, Z.Q., Xia, J.H., Long, Z.G., Xue, Z.G., Ding, W.X. and Sheng, H.Z.. (2003) Embryonic stem cells generated by nuclear transfer of human somatic nuclei into rabbit oocytes. Cell Res. 13(4):251-256 30. Chesné, P., Adenot, P., Boulanger, L., and Renard, J. P. (2001) Somatic nuclear trasnfer in the rabbit. Theriogenology 55: 260 (abst).

73

MELLÉKLETEK

31. Chesné, P., Adenot, P.G., Viglietta, C., Baratte, M., Boulanger, L. and Renard, J.P. (2002) Cloned rabbits produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nat Biotechnol. 20(4):366-369. 32. Chung SO, Bae IH, Cho WK J. (1974) The Maturation in Vitro of The Rabbit Oocytes I. Amino Acids Support the Maturation In Vitro of the Rabbit Oocytes. Yonsei Med 15:11-16 33. Chung Y, Bishop CE, Treff NR, Walker SJ, Sandler VM, Becker S, Klimanskaya I, Wun WS, Dunn R, Hall RM, Su J, Lu SJ, Maserati M, Choi YH, Scott R, Atala A, Dittman R and Lanza R. (2009) Reprogramming of human somatic cells using human and animal oocytes. Cloning Stem Cells 11: 213–223. 34. Cibelli, J. B., Stice, S. L., Golueke, P. J., Kane, J. J., Jerry, J., Blackwell, C., de Leon, F. A. P., and Robl, J. M. (1998) Cloned transgenic calves produced from nonquiescent fetal fibroblasts. Science 280, 1256-1258. 35. Cole R. J., Edwards R. G., and Paul J. (1966) Cytodifferentiation and embryogenesis in cell colonies and tissue cultures derived from ova and blastocyst of the rabbit. Dev Biol 13, 385–407. 36. Collas, P. and Robl, J. M. (1990) Factors affecting the efficiency of nuclear transplantation in the rabbit embryo. Biol. Reprod. 43, 877-884. 37. Collas, P. and Robl, J. M. (1991) Relationship between nuclear remodeling and development in nuclear transplant rabbit embryos. Biol. Reprod. 45, 455-465. 38. Collas, P., Duby, R. T., and Robl, J. M. (1991) In vitro development of rabbit pronuclear embryos in rabbit peritoneal fluid. Biol. Reprod. 44, 1100-1107. 39. Collas, P., Balise, J.J. and Robl, J.M. (1992a) Influence of cell cycle stage of the donor nucleus on development of nuclear transplant rabbit embryos. Biol Reprod. 46(3):492500. 40. Collas, P., Pinto-Correia, C., Ponce de Leon, F.A. and Robl JM. (1992b) Effect of donor cell cycle stage on chromatin and spindle morphology in nuclear transplant rabbit embryos. Biol Reprod. 46(3):501-511.

74

MELLÉKLETEK

41. Constant F, Guillomot M, Heyman Y, Vignon X, Laigre P, Servely JL, Renard JP, Chavatte-Palmer P. (2006) Large offspring or large placenta syndrome? Morphometric analysis of late gestation bovine placentomes from somatic nuclear transfer pregnancies complicated by hydrallantois. Biol Reprod.;75(1):122-30 42. Deng, M. and Yang, X. J. (2001) Full term development of rabbit oocytes fertilized by Intracytoplasmic sperm injection. Mol. Reprod. Dev. 59, 38-43. 43. De Sousa PA, Dobrinsky JR, Zhu J, Archibald AL, Ainslie A, Bosma W, Bowering J, Bracken J, Ferrier PM, Fletcher J, Gasparrini B, Harkness L, Johnston P, Ritchie M, Ritchie WA, Travers A, Albertini D, Dinnyes A, King TJ, Wilmut I. (2002) Somatic cell nuclear transfer in the pig: control of pronuclear formation and integration with improved

methods

for

activation

and

maintenance

of

pregnancy.

Biol

Reprod.;66(3):642-50. 44. Dinnyes, A., Dai, Y. P., Jiang, S., and Yang, X. Z. (2000) High developmental rates of vitrified bovine oocytes following parthenogenetic activation, in vitro fertilization, and somatic cell nuclear transfer. Biol. Reprod. 63, 513-518. 45. Dinnyes, A., Dai, Y., Barber, M., Liu, L., Xu, J., Zhou, P., and Yang, X. (2001a) Development of cloned embryos from adult rabbit fibroblasts: effect of activation treatment and donor cell preparation. Biol. Reprod. 64, 257-263. 46. Dinnyes, A., King, T., Wilmut, I., and De Sousa, P. A. (2001b) Sheep somatic cell nuclear transfer: effect of breed and culture system on embryonic and fetal development. Theriogenology 55, 264. 47. Dinnyes, A., Tian, X.C. and Yang, X (2008) Epigenetic Regulation of Foetal Development in Nuclear Transfer Animal Models. Reprod. Domestic Animals 43, 302309 48. Dominko T, Mitalipova M, Haley B, Beyhan Z, Memili E, McKusick B and First NL. (1999) Bovine oocyte cytoplasm supports development of embryos produced by nuclear transfer of somatic cell nuclei from various mammalian species. Biol Reprod 60:1496– 1502. 49. Du, F., Giles, J. R., Foote, R. H., Graves, K. H., Yang, X., and Moreadith, R. W. (1995)

75

MELLÉKLETEK

Nuclear transfer of putative rabbit embryonic stem cells leads to normal blastocyst development. J. Reprod. Fertil. 104, 219-223. 50. Du F, Xu J, Zhang J, Gao S, Carter MG, He C, Sung LY, Chaubal S, Fissore RA, Tian XC, Yang X, Chen YE. (2009) Beneficial effect of young oocytes for rabbit somatic cell nuclear transfer Cloning Stem Cells;11(1):131-40. 51. Edwards RG. (1965) Maturation in vitro of mouse, sheep, cow, pig, rhesus monkey and human ovarian oocytes. Nature; 208:349–351 52. Ellington, J. E., Farrell, P. B., Simkin, M. E., Foote, R. H., Goldman, E. E., and McGrath, A. B. (1990) Development and survival after transfer of cow embryos cultured from 1-2-cells to morulae or blastocysts in rabbit oviducts or in a simple medium with bovine oviduct epithelial cells. J. Reprod. Fertil. 89, 293-299. 53. Enright, BP, C Kubota, X Yang and XC Tian (2003) Epigenetic characteristics and development of embryos cloned from donor cells treated by trichostatin A or 5-aza-2'deoxycytidine. Biol Reprod. 69: 896-901. 54. Escriba, M. J. and Garcia-Ximenez, F. (1999) Electroactivation of rabbit oocytes in an hypotonic pulsing medium and parthenogenetic in vitro development without cytochalasin B- diploidizing pretreatment. Theriogenology 51, 963-973. 55. Escriba, M. J. and Garcia-Ximenez, F. (2000) Influence of sequence duration and number of electrical pulses upon rabbit oocyte activation and parthenogenetic in vitro development. Anim. Reprod. Sci. 59, 99-107. 56. Evans, M.J and Kaufman, M. (1981) Establishment in culture of pluripotencial stem cells from mouse embryos. Nature 292:151-156 57. Fang, Z.F., Gai, H., Huang, Y.Z., Li, S.G., Chen, X.J., Shi, J.J., Wu, L., Liu, A., Xu, P. and Sheng, H.Z. (2006) Rabbit embryonic stem cell lines derived from fertilized, parthenogenetic or somatic cell nuclear transfer embryos. Exp Cell Res.312(18):36693682. 58. Farrell, P. B. and Foote, R. H. (1995) Beneficial effects of culturing rabbit zygotes to blastocysts in 5% oxygen and 10% carbon dioxide. J. Reprod. Fertil. 103, 127-130.

76

MELLÉKLETEK

59. Fischer, B. (1989) Effects of asynchrony on rabbit blastocyst development. J. Reprod. Fertil. 86, 479-491. 60. Fissore, R. A. and Robl, J. M. (1993) Sperm, inositol trisphosphate, and thimerosalinduced intracellular Ca2+ elevations in rabbit eggs. Dev. Biol. 159, 122-130. 61. Fissore, R. A. and Robl, J. M. (1994) Mechanism of calcium oscillations in fertilized rabbit eggs. Dev. Biol. 166, 634-642. 62. Fletcher CJ, Roberts CT, Hartwich KM, Walker SK, McMillen IC. (2007) Somatic cell nuclear transfer in the sheep induces placental defects that likely precede fetal demise Reproduction;133(1):243-55 63. Folch J, Cocero MJ, Chesné P, Alabart JL, Domínguez V, Cognié Y, Roche A, Fernández-Arias A, Martí JI, Sánchez P, Echegoyen E, Beckers JF, Bonastre AS, Vignon X. (2009) First birth of an animal from an extinct subspecies (Capra pyrenaica pyrenaica) by cloning. Theriogenology;71(6):1026-34. 64. Foote, R. H. and Carney, E. W. (2000) The rabbit as a model for reproductive and developmental toxicity studies. Reprod. Toxicol. 14, 477-493. 65. Gajda B. and Smorag Z. (1993) Factors affecting the survival of one- and two-cell rabbit embryos cryopreserved by vitrification. Theriogenology;39(2):499-506 66. Galli C, Lagutina I, Crotti G, Colleoni S, Turini P, Ponderato N, Duchi R, Lazzari (2003) Pregnancy: a cloned horse born to its dam twin. Nature 424:635. 67. Galat, V. V., Lagutina, I. S., Mesina, M. N., Chernich, V. J., and Prokofiev, M. I. (1999) Developmental potential of rabbit nuclear transfer embryos derived from donor fetal fibroblast. Theriogenology 51, 203 (abst.)-203. 68. Giles, J. R. and Foote, R. H. (1997) Effects of gas atmosphere, platelet-derived growth factor and leukemia inhibitory factor on cell numbers of rabbit embryos cultured in a protein-free medium. Reprod. Nutr. Dev. 37: 97-104. 69. Giles, J. R., Yang, X., Mark, W., and Foote, R. H. (1993) Pluripotency of cultured rabbit inner cell mass cells detected by isozyme analysis and eye pigmentation of fetuses following injection into blastocysts or morulae. Mol. Reprod. Dev. 36:130-138. 77

MELLÉKLETEK

70. Gomez MC, Pope CE, Giraldo A, Lyons LA, Harris RF, King AL, Cole A, Godke RA, Dresser BL (2004) Birth of African Wildcat cloned kittens born from domestic cats. Cloning Stem Cells 6:247–258. 71. Graves, K.H. and Moreadith, R.W. (1993) Derivation and characterization of putative pluripotential embryonic stem cells from preimplantation rabbit embryos. Mol Reprod Dev. 36(4):424-33. 72. Grøndahl C, Breinholt J, Wahl P, Murray A, Hansen TH, Faerge I, Stidsen CE, Raun K, Hegele-Hartung C (2003) Physiology of meiosis-activating sterol: endogenous formation and mode of action Hum Reprod.;18(1):122-9 73. Hafez, E. S. E. (1964) Effects of over-crowding in utero on implantation and fetal development in the rabbit. J. Exp. Zool. 156: 269-288. 74. Hammer, C. J., Tyler, H. D., Loskutoff, N. M., Armstrong, D. L., Funk, D. J., Lindsey, B. R., and Simmons, L. G. (2001). Compromised development of calves (Bos gaurus) derived from in vitro- generated embryos and transferred interspecifically into domestic cattle (Bos taurus). Theriogenology 55, 1447-1455. 75. Hammer, R. E., Pursel, V. G., Rexroad, C. E., Wall, R. J., Bolt, D. J., Ebert, K. M., Palmiter, R. D., and Brinster, R. L. (1985) Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature 315: 680-683. 76. Hashizume K, Ishiwata H, Kizaki K, Yamada O, Takahashi T, Imai K, Patel OV, Akagi S, Shimizu M, Takahashi S, Katsuma S, Shiojima S, Hirasawa A, Tsujimoto G, Todoroki J, Izaike Y. (2002) Implantation and placental development in somatic cell clone recipient cows. Cloning Stem Cells.;4(3):197-209. 77. Harkness, J. E. and Wagner, J. E. (1995) The Biology and Medicine of Rabbits and Rodents. William and Wilkins, Baltimore. 78. Heape, W. (1890) Preliminary note on the transplantation and growth of mammalian ova within a uterine foster-mother. Proc. R. Soc. Lond. , B. Biol. Sci. 48: 457-459. 79. Heyman, Y., Chesne, P., and Renard, J. P. (1990) Reprogrammation complete de noyaux embryonnaires congeles apres transfert nucleaire chez le lapin. C. R. Acad. Sci.

78

MELLÉKLETEK

Paris 311: 321-326. 80. Heyman, Y. and Renard, J. P. (1996) Cloning of domestic species. Anim. Reprod. Sci. 42: 427-436. 81. Hill JR, Winger QA, Long CR, Looney CR, Thompson JA and Westhusin ME. (2000a) Development rates of male bovine nuclear transfer embryos derived from adult and fetal cells. Biol Reprod.;62(5):1135-40 82. Hill JR, Burghardt RC, Jones K, Long CR, Looney CR, Shin T, Spencer TE, Thompson JA, Winger QA, Westhusin ME. (2000b) Evidence for placental abnormality as the major cause of mortality in first-trimester somatic cell cloned bovine fetuses. Biol Reprod.;63(6):1787-94 83. Hochi S., Hirabayshi M., Hirao M., Kato M., Kobayashi T., Kimura K., Hirasawa K., Leibo S.P., and Ueda M. (2001) Effects of Cryopreservation of Pronuclear-Stage Rabbit Zygotes on the Morphological Survival, Blastocyst Formation, and Full-Term Development After DNA Microinjection. Mol Rep Dev.60:227-232 84. Hochi S, Terao T, Kamei M, Kato M, Hirabayashi M, Hirao M. (2004) Successful vitrification of pronuclear-stage rabbit zygotes by minimum volume cooling procedure. Theriogenology. Jan 15;61(2-3):267-75. 85. Holdas S. és Szendrő Zs. (2002): Gazdasági állataink- Fajtatan: Nyúl-Mezőgazda Kiadó, Budapest, 136 86. Hwang, W., Kim, K., Kim, G., Jin, Y., Chung, H., Yoon, T., Han, C., Eo, Y., and Lee, B. (2001). Interspecies somatic cell nuclear transfer for the production of endangered korean tiger (Panthera tigris altaica). Theriogenology 55, 271. 87. Iager, AE, Z Beyhan, PJ Ross, NP Ragina, K Cunniff, RM Rodriguez and JB Cibelli (2008). Effects of Trichostatin A Treatment on Bovine Somatic Cell Nuclear Transfer Embryos. Reprod Fertil Dev. 20, 99-99 88. Inoue, K., Ogonuki, N., Yamamoto, Y., Noguchi, Y., Takeiri, S., Nakata, K, Miki, H., Kurome, M., Nagashima, H. and Ogura, A. (2002) Improved postimplantation development of rabbit nuclear transfer embryos by activation with inositol 1,4,5-

79

MELLÉKLETEK

trisphosphate. Cloning Stem Cells.;4(4):311-317. 89. Inoue, K., Noda, S., Ogonuki, N., Miki, H., Inoue, S., Katayama, K., Mekada, K., Miyoshi, H. and Ogura, A. (2007) Differential developmental ability of embryos cloned from tissue-specific stem cells. Stem Cells 25, 1279–1285. 90. Iwamoto, D, K Saeki, S Kishigami, A Kasamatsu, A Tatemizo, Y Abe, S Ikeda, S Taniguchi, T Mitani, H Kato, K Matsumoto, Y Hosoi, T Wakayama and A Iritani (2007). Effects of Trichostatin A on Development of Bovine Somatic Cell Nuclear Transfer Embryos. Reprod Fertil Dev. 19, 142 91. Iwamoto, D, S Kishigami, S Taniguchi, Y Abe, T Matsui, A Kasamatsu, A Tatemizo, T Mitani, H Kato, K Matsumoto, Y Hosoi, T Wakayama, A Iritani and K Saeki (2008). Effects of Trichostatin A on DNA Methylation in Cloned Bovine Embryos. Reprod Fertil Dev. 20, 99-99. 92. Jiang, Y., Chen, T., Nan, C.L., Ouyang, Y.C., Sun, Q.Y. and Chen, D.Y. (2005) In vitro culture and mtDNA fate of ibex-rabbit nuclear transfer embryos. Zygote 13(3):233-240 93. Jin, D. I., Kim, D. K., Im, K. S., and Choi, W. S. (2000) Successful pregnancy after transfer of rabbit blastocysts grown in vitro from single-cell zygotes. Theriogenology 54: 1109-1116. 94. Joung, S.Y., Kim, H.J., Choi, W.S., Im, K.S., Lee, S.H., Park, C.S. and Jin, D.I. (2004) Effects of transferring in vitro-cultured rabbit embryos to recipient oviducts on mucin coat deposition, implantation and development. Zygote 12(3):215-9. 95. Kanaya H, Hashimoto S, Teramura T, Morimoto Y, Matsumoto K, Saeki K, Iritani A, Hosoi Y (2007) Mitochondrial dysfunction of in vitro grown rabbit oocytes results in preimplantation embryo arrest after activation J Reprod Dev.;53(3):631-7. 96. Kane, M. T. and Foote, R. H. (1971) Factors affecting blastocyst expansion of rabbit zygotes and young embryos in defined media. Biol. Reprod. 4: 41-47. 97. Kasai M, Komi JH, Takakamo A, Tsudera H, Sakurai T, and Machida T. 1990. A simple method for mouse embryo cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability. J Reprod Fertil. 89: 91-97.

80

MELLÉKLETEK

98. Kasai, M., Hamaguchi, Y., Zhu, S. E., Miyake, T., Sakurai, T., and Machida, T. (1992) High survival of rabbit morulae after vitrification in an ethylene glycol-based solution by a simple method. Biol. Reprod. 46: 1042-1046. 99. Kasai, M., Zhu, S.E., Pedro, P.B., Nakamura, K., Sakurai, T., Edashige, K., (1996). Fracture amage of embryos and its prevention during vitrification and warming. Cryobiology 33, 459–464. 100. Kasinathan, P., Knott, J. G., Moreira, P. N., Burnside, A. S., Joseph, J. D., and Robl, J. M. (2001) Effect of fibroblast donor cell age and cell cycle on development of bovine nuclear transfer embryos in vitro. Biol. Reprod. 64: 1487-1493. 101. Kato, Y., Tani, T., Sotomaru, Y., Kurokawa, K., Kato, J., Doguchi, H., Yasue, H., and Tsunoda, Y. (1998) Eight calves cloned from somatic cells of a single adult. Science 282: 2095-2098. 102. Kato Y, Tani T, Tsunoda Y. (2000) Cloning of calves from various somatic cell types of male and female adult, newborn and fetal cows. J Reprod Fertil.;120(2):231-7. 103. Kato, Y., Imabayashi, H., Mori, T., Tani, T., Taniguchi, M., Higashi, M., Matsumoto, M., Umezawa, A. and Tsunoda, Y. (2004) Nuclear transfer of adult bone marrow mesenchymal stem cells: developmental totipotency of tissue-specific stem cells from an adult mammal. Biol. Reprod. 70, 415–418. 104. Kauffman, R. D., Schmidt, P. M., Rall, W. F., and Hoeg, J. M. (1998).Superovulation of rabbits with FSH alters in vivo development of vitrified morulae. Theriogenology 50: 1081-1092. 105. Keefer CL, Keyston R, Bhatia B, Lazaris A, Begin I, Kafidi N, Bilodeau A, Wang B, Tao T, Laurin D, Zhou FJ, Downey B, Baldassarre H, Karatzas C. (2000) Efficient production of viable goat offspring following nuclear transfer using adult somatic cells. Biol Reprod; 62:192. 106. Keefer, C. L., Baldassarre, H., Keyston, R., Wang, B., Bhatia, B., Bilodeau, A. S., Zhou, J. F., Leduc, M., Downey, B. R., Lazaris, A., and Karatzas, C. N. (2001). Generation of dwarf goat (Capra hircus) clones following nuclear transfer with transfected and nontransfected fetal fibroblasts and in vitro-matured oocytes. Biol

81

MELLÉKLETEK

Reprod 64, 849-856. 107. Kenelly, J. J. and Foote, R. H. (1965) Superovulatory response of pre- and postpuberal rabbits to commercially available gonadotrophins. J. Reprod. Fertil. 9: 131-145. 108. Kidder, J. D., Roberts, P. J., Simkin, M. E., Foote, R. H., and Richmond, M. E. (1999) Nonsurgical collection and nonsurgical transfer of preimplantation embryos in the domestic rabbit (Oryctolagus cuniculus) and domestic ferret (Mustela putorius furo). J. Reprod. Fertil. 116: 235-242. 109. Kishi M, Itagaki Y, Takakura R, Imamura M, Sudo T, Yoshinari M, Tanimoto M, Yasue H and Kashima N. (2000) Nuclear transfer in cattle using colostrum-derived mammary

gland

epithelial

cells

and

ear-derived

fibroblast

cells

Theriogenology15;54(5):675-84 110. Kishigami, S, E Mizutani, H Ohta, T Hikichi, NV Thuan, S Wakayama, HT Bui and T Wakayama (2006) Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer. Biochem Biophys Res Commun. 340(1): 183-9. 111. Kojima T, Soma T, Oguri N. (1987). Effect of rapid addition and dilution of dimethyl sulfoxide and 37°C equilibration on viability of rabbit morulae thawed rapidly. Cryobiology 24:247-255. 112. Lagutina, I. S., Mezina, M. N., Chernikh, V. J., Prokofiev, M. I., and Galat, V. V. (2000) Developmental potential of rabbit nuclear transfer embryos produced by various fusion/activation protocols. Theriogenology 53: 230 (abst). 113. Lanza, R.P., Cibelli, J.B., Diaz, F., Moraes CT, Farin PW, Farin CE, Hammer CJ, West MD, Damiani P.: (2000) Cloning of an endangered species (Bos gaurus) using interspecies nuclear transfer. Cloning 2:79-91. 114. Lee BC, Kim MK, Jang G, Oh HJ, Yuda F, Kim HJ, Shamim MH, Kim JJ, Kang SK, Schatten G, Hwang WS (2005) Dogs cloned from adult somatic cells. Nature 436:641. 115. Lee, SJ, F Talamantes, E Wilder, DI Linzer and D Nathans (1988). Trophoblastic giant cells of the mouse placenta as the site of proliferin synthesis. Endocrinology. 122, 1761-

82

MELLÉKLETEK

1768 116. Li, G.P., Chen, D.Y., Lian, L., Han, Z.M., Zhu, Z.Y. and Seidel, G.E. Jr. (2002) Rabbit cloning: improved fusion rates using cytochalasin B in the fusion buffer. Mol Reprod Dev. 61(2):187-191. 117. Li, J. and Foote, R. H. (1996) Differential sensitivity of one-cell and two-cell rabbit embryos to sodium chloride and total osmolarity during culture into blastocysts. J. Reprod. Fertil. 108: 307-312. 118. Li, J., Foote, R. H., and Simkin, M. (1993) Development of rabbit zygotes cultured in protein-free medium with catalase, taurine, or superoxide dismutase. Biol. Reprod. 49: 33-37. 119. Li, S., Chen, X., Fang, Z., Shi, J. and Sheng, H.Z. (2006) Rabbits generated from fibroblasts through nuclear transfer. Reproduction, 131(6):1085-1090. 120. Li S, Guo Y, Shi J, Yin C, Xing F, Xu L, Zhang C, Liu T, Li Y, Li H, Du L, Chen X. (2009) Transgene expression of enhanced green fluorescent protein in cloned rabbits generated from in vitro-transfected adult fibroblasts. Transgenic Res.;18(2):227-35. 121. Li Z, Sun X, Chen J, Liu X, Wisely SM, Zhou Q, Renard JP, Leno GH, Engelhardt JF (2006) Cloned ferrets produced by somatic cell nuclear transfer. Dev Biol 293:439–448 122. Lin TA, Chen CH, Sung LY, Carter MG, Chen YE, Du F, Ju JC and Xu J. (2011) Open-pulled straw vitrification differentiates cryotolerance of in vitro cultured rabbit embryos at the eight-cell stage. Theriogenology;75(4):760-8. 123. Linzer, DI and SJ Fisher (1999). The placenta and the prolactin family of hormones: regulation of the physiology of pregnancy. Mol Endocrinol. 13, 837-740 124. Liu, J.L., Sung, L.Y., Du, F., Julian, M., Jiang, S., Barber, M., Xu, J., Tian X.C. and Yang X. (2004) Differential development of rabbit embryos derived from parthenogenesis and nuclear transfer. Mol Reprod Dev. 68(1):58-64. 125. Loi P, Ptak G, Barboni B, Fulka J, Jr, Cappai P, Clinton M (2001) Genetic rescue of an endangered mammal by cross-species nuclear transfer using post-mortem somatic cells. Nat Biotechnol 19:962–964. 83

MELLÉKLETEK

126. Loi P, Clinton M, Vackova I, Fulka J Jr, Feil R, Palmieri C, Della Salda L, Ptak G (2006) Placental abnormalities associated with post-natal mortality in sheep somatic cell clones Theriogenology;65(6):1110-21 127. Lonergan, P., Dinnyes, A., Fair, T., Yang, X., and Boland, M. (2000) Bovine oocyte and embryo development following meiotic inhibition with butyrolactone I. Mol. Reprod. Dev. 57: 204-209. 128. Lorenzo PL, Illera JC, Silvan G, Munro CJ, Illera MJ, Illera MJ (1997) Steroid-level response to insulin-like growth factor-1 in oocytes matured in vitro. Reprod Immunol. 35: 11-29. 129. Lorenzo PL, Rebollar PG, Illera MJ, Illera JC, Illera M, Alvarino JMR: (1996) Stimulatory effect of insulin-like growth factor I and epidermal growth factor on the maturation of rabbit oocytes in vitro Journal of Reproduction and Fertility 107, 109-117 130. Matsuda, J, S Takahashi, K Ohkoshi, K Kaminaka, S Kaminaka, C Nozaki, H Maeda and T Tokunaga (2002). Production of transgenic chimera rabbit fetuses using somatic cell nuclear transfer. Cloning Stem Cells. 4, 9-19. 131. Maurer, R. R., Hunt, W. L., Van Vleck, L. D., and Foote, R. H. (1968) Developmental potential of superovulated rabbit ova. J. Reprod. Fertil. 15: 171-175. 132. Maurer, R. R. (1978) Advances in Rabbit Embryo Culture. In “Methods in Mammalian Reproduction” (Daniel, J. C., Ed.), pp. 259-272, Academic Press, New York. 133. Meirelles, F. V., Bordignon, V., Watanabe, Y., Watanabe, M., Dayan, A., Lobo, R. B., Garcia, J. M., and Smith, L. C. (2001). Complete replacement of the mitochondrial genotype in a Bos indicus calf reconstructed by nuclear transfer to a Bos taurus oocyte. Genetics 158, 351-356. 134. Meng, Q., Polgar, Z., Liu, J., and Dinnyes, A. (2008a) Effect of Trichostatine A treatment on the term development of somatic cell nuclear transfer rabbit embryos Reprod. Fertil. Dev. 20(1): 103 135. Meng Q, Wang M, Stanca CA, Bodo S, Dinnyes A (2008b) Cotransfer of

84

MELLÉKLETEK

parthenogenetic embryos improves the pregnancy and implantation of nuclear transfer embryos in mouse Cloning Stem Cells. Dec;10(4):429-34 136. Meng, Q., Polgar, Z., Liu, J., and Dinnyes, A. (2009) Live Birth of Somatic CellCloned Rabbits following Trichostatin A Treatment and Cotransfer of Parthenogenetic Embryos. Cloning and Stem Cells, 11(1): 203-208 137. Mitalipov, S. M., White, K. L., Farrar, V. R., Morrey, J., and Reed, W. A. (1999) Development of nuclear transfer and parthenogenetic rabbit embryos activated with inositol 1,4,5-trisphosphate. Biol. Reprod. 60: 821-827. 138. Murakami, H. and Imai, H. (1996) Successful implantation of in vitro cultured rabbit embryos after uterine transfer: a role for mucin. Mol. Reprod. Dev. 43: 167-170. 139. Naik BR, Rao BS, Vagdevi R, Gnanprakash M, Amarnath D, Rao VH (2005) Conventional slow freezing, vitrification and open pulled straw (OPS) vitrification of rabbit embryos. Anim Reprod Sci.;86(3-4):329-38 140. Ogura A, Inoue K, Takano K, Wakayama T, Yanagimachi R. (2000) Birth of mice after nuclear transfer by electrofusion using tail tip cells. Mol Reprod Dev.;57(1):55-9. 141. Onishi, A., Iwamoto, M., Akita, T., Mikawa, S., Takeda, K., Awata, T., Hanada, H., and Perry, A. C. F. (2000) Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science 289: 1188-1190. 142. Ono Y, Shimozawa N, Ito M, Kono T. (2001) Cloned mice from fetal fibroblast cells arrested at metaphase by a serial nuclear transfer. Biol Reprod. Jan;64(1):44-50. 143. Ozil, J. P. (1990) The parthenogenetic development of rabbit oocytes after repetitive pulsatile electrical stimulation. Development 109: 117-127. 144. Ozil, J. P. and Huneau, D. (2001) Activation of rabbit oocytes: the impact of the Ca2+ signal regime on development. Development 128: 917-928. 145. Papis K, Korwin-Kossakowski M, Wenta-Muchalska E. (2009) Comparison of traditional and modified (VitMaster) methods of rabbit embryo vitrification. Acta Vet Hung.;57(3):411-6.

85

MELLÉKLETEK

146. Park, C. S., Jeon, B. G., Lee, K. M., Yin, X. J., Cho, S. K., Kong, I. K., Lee, H. J., and Choe, S. Y. (1998) Production of cloned rabbit embryos and offsprings by nuclear transplantation using in vitro matured oocytes. Theriogenology 49: 325 (abst). 147. Paterson, Lesley: http://www.mindfully.org/GE/GE3/Cloning-EfficiencyAug01.htm 148. Petters, R. M. és Wells, K. D. (1993) Culture of pig embryos. J. Reprod. Fertil. Suppl. 48: 61-73. 149. Pincus G and Enzmann EV (1935) The comparative behavior of mammalian eggs in vivo and in vitro. I. The activation of ovarian eggs. J Exp Med, 62, 655-675. 150. Piotrowska, K., Modlinski, J. A., Korwin-Kossakowski, M., and Karasiewicz, J. (2000) Effects of preactivation of ooplasts or synchronization of blastomere nuclei in G1 on preimplantation development of rabbit serial nuclear transfer embryos. Biol. Reprod. 63: 677-682. 151. Polejaeva, I. A., Chen, S. H., Vaught, T. D., Page, R. L., Mullins, J., Ball, S., Dai, Y. F., Boone, J., Walker, S., Ayares, D. L., Colman, A., and Campbell, K. H. S. (2000) Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature 407: 86-90. 152. Renard, J. P., Bui, X. N., and Garnier, V. (1984) Two-step freezing of two-cell rabbit embryos after partial dehydration at room temperature. J. Reprod. Fertil. 71: 573-580. 153. Rideout, W.M., Wakayama, T., Wutz, A., Eggan, K., Jackson-Grusby, L., Dausman, J., Yanagimachi, R. and Jaenisch, R. (2000) Generation of mice from wild-type and targeted ES cells by nuclear cloning. Nat Genet. 24(2):109-10. 154. Rosenkrans C.F.jr., Zeng G.Q., McNamara G.T., Schoff P.K. and First N.L. (1993) Development of Bovine Embryos In Vitro as Affected by Energy Substrates. Biol Reprod 49, 459-462 155. Rybouchkin, A, Y Kato and Y Tsunoda (2006) Role of histone acetylation in reprogramming of somatic nuclei following nuclear transfer. Biol Reprod. 74: 1083-9. 156. Santos, F. and Dean, W. (2004) Epigenetic reprogramming during early development in mammals. Reproduction 127: 643-651.

86

MELLÉKLETEK

157. Schnieke, A. E., Kind, A. J., Ritchie, W. A., Mycock, K., Scott, A. R., Ritchie, M., Wilmut, I., Colman, A., and Campbell, K. H. S. (1997) Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts. Science 278: 2130-2133. 158. Schoonjans, L., Albright, G.M., Li, J.L., Collen, D. and Moreadith, R.W. (1996) Pluripotential rabbit embryonic (ES) cells are capable of forming over coat color chimeras following injection into the blastocyst. Mol. Reprod. 45:439-443. 159. Schultz, R. M., Davis, W., Jr., Stein, P., and Svoboda, P. (1999) Reprogramming of gene expression during preimplantation development. J. Exp. Zool. 285: 276-282. 160. Shi D, Lu F, Wei Y, Cui K, Yang S, Wei J, Liu Q. (2007) Buffalos (Bubalus bubalis) cloned by nuclear transfer of somatic cells. Biol Reprod.;77(2):285-91. 161. Shi, W., Dirim, F., Wolf, E., Zakhartchenko, V. and Haaf, T. (2004) Methylation reprogramming and chromosomal aneuploidy in in vivo fertilized and cloned rabbit preimplantation embryos. Biol Reprod. 71(1):340-347. 162. Shi, L, Y Miao, Y Ouyang, J Huang, Z Lei, J Yang, Z Han, X Son, Q Sun and D Chen (2008 a) Trichostatin A (TSA) improves the development of rabbit-rabbit intraspecies cloned embryos, but not rabbit-human interspecies cloned embryos. Dev Dyn. 273: 640648. 163. Shi, L, J Ai, Y Ouyang, J Huang, Z Lei, Q Wang, S Yin, Z Han, Q Sun and D Chen (2008 b) Trichostatin A and nuclear reprogramming of cloned rabbit embryos. J Anim Sci. 86: 1106-1113. 164. Shiga, K., Fujita, T., Hirose, K., Sasae, Y., and Nagai, T. (1999) Production of calves by transfer of nuclei from cultured somatic cells obtained from Japanese black bulls. Theriogenology 52: 527-535. 165. Shin T, Kraemer D, Pryor J, Liu L, Rugila J, Howe L, Buck S, Murphy K, Lyons L, Westhusin M (2002) A cat cloned by nuclear transplantation. Nature 415:859. 166. Skrzyszowska, M, Z Smorag, R Slomski, L Katska-Ksiazkiewicz, R Kalak, E Michalak, K Wielgus, J Lehmann, D Lipinski, M Szalata, A Plawski, M Samiec, J Jura,

87

MELLÉKLETEK

B Gajda, B Rynska and M Pienkowski (2006). Generation of Transgenic Rabbits by the Novel Technique of Chimeric Somatic Cell Cloning. Biol Reprod. 74, 1114-1120. 167. Smith DM, Tyler JP, Erickson GF. (1978) Effects of medium composition and progesterone on maturation in vitro of rabbit oocytes from Graafian follicles of different sizes. J Reprod Fertil. 54(2):393-400 168. Smorag Z, Gajda B, Wieczorec B, Jura J. (1989). Stage-dependent viability of vitrifed rabbit embryos. Theriogenology 31:1227-1231 169. Smorag Z, Gajda B. (1998). In vitro and in vivo survival of rabbit embryos vitrifed in EFS medium and increased PBS salt concentration. Cryo-Lett 19:99-104. 170. Spencer, TE, RC Burghardt, GA Johnson and FW Bazer (2004). Conceptus signals for establishment and maintenance of pregnancy. Anim Reprod Sci. 82-83, 537-50 171. Stice, S. L. and Robl, J. M. (1988) Nuclear reprogramming in nuclear transplant rabbit embryos. Biol. Reprod. 39: 657-664. 172. Stice, S. L. and Robl, J. M. (1990) Activation of mammalian oocytes by a factor obtained from rabbit sperm. Mol. Reprod. Dev. 25: 272-280. 173. Stice, S. L., Keefer, C. L., Maki-Laurila, M., and Matthews, L. (1993) Donor blastomere cell cycle stage affects developmental competence of bovine nuclear transfer embryos. Theriogenology 39: 318 (abst). 174. Swann, K. and Lai, F. A. (1997) A novel signalling mechanism for generating Ca2+ oscillations at fertilization in mammals. Bioessays 19: 371-378. 175. Telford, N. A., Watson, A. J., and Schultz, G. A. (1990) Transition from maternal to embryonic control in early mammalian development: a comparison of several species. Mol. Reprod. Dev. 26: 90-100. 176. Totey, S. M., Singh, G., Taneja, M., Pawshe, C. H., and Talwar, G. P. (1992) In vitro maturation, fertilization and development of follicular oocytes from buffalo (Bubalus bubalis). J. Reprod. Fertil. 95: 597-607. 177. Tsunoda, Y., Soma, T., and Sugie, T. (1982) Effect of post-ovulatory age of recipient

88

MELLÉKLETEK

on survival of frozen-thawed rabbit morulae. J. Reprod. Fertil. 65: 483-487. 178. Vajta, G., Holm, P., Greve, T., Callesen, H., (1997). Vitrification of porcine embryos using the open pulled straw (OPS) method. Acta Vet. Scand. 38, 349–352. 179. Verma, PJ, ZT Du, L Crocker, R Faast, CG Grupen, SM McIlfatrick, RJ Ashman, IG Lyons and MB Nottle (2000). In vitro development of porcine nuclear transfer embryos constructed using fetal fibroblasts. Mol Reprod Dev. 57, 262-269. 180. Vincente JS, Garcia-Ximenez F. (1994). Osmotic and cryoprotective effects of mixture of DMSO and ethylene glycol on rabbit morulae. Theriogenology 42:12051215. 181. Vicente JS, Viudes-De-Castro MP, Garcia Mde L, Baselga M. (2003) Effect of rabbit line on a program of cryopreserved embryos by vitrification. Reprod Nutr Dev.;43(2):137-43 182. Wakayama, T., Perry, A. C. F., Zuccotti, M., Johnson, K. R., and Yanagimachi, R. (1998) Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature 394: 369-374. 183. Wakayama T. and Yanagimachi R. (1999) Cloning of male mice from adult tail-tip cells. Nat Genet.;22(2):127-8. 184. Wakayama, T. and Yanagimachi, R. (2001) Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type. Mol. Reprod. Dev. 58: 376-383. 185. Wang, F, Z Kou, Y Zhang and S Gao (2007) Dynamic Reprogramming of Histone Acetylation and Methylation in the First Cell Cycle of Cloned Mouse Embryos. Biol Reprod. 77: 1007-1016. 186. Wang, S., Tang, X., Niu, Y., Chen, H., Li, B., Li, T., Zhang, X., Hu, Z., Zhou, Q., Ji, W. (2006) Generation and characterization of rabbit embryonic stem cells. Stem Cells 25(2):481-489. 187. Wells DN, Misica PM and Tervit HR. (1999) Production of cloned calves following nuclear transfer with cultured adult mural granulosa cells. Biol Reprod.;60(4):996-1005

89

MELLÉKLETEK

188. Wilmut, I., Schnieke, A. E., McWhir, J., Kind, A. J., and Campbell, K. H. S. (1997) Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 385: 810-813. 189. Woods GL, White KL, Vanderwall DK, Li GP, Aston KI, Bunch TD, Meerdo N, Pate BJ (2003) A mule cloned from fetal cells by nuclear transfer. Science 301:1063. 190. Wu X, Li Y, Li GP, Yang D, Yue Y, Wang L, Li K, Xin P, Bou S, Yu H. (2008) Trichostatin A improved epigenetic modifications of transfected cells but did not improve subsequent cloned embryo development. Anim Biotechnol.;19(4):211-24. 191. Xu, J, L-Y Sung, J Zhang, X Tian, YE Chen, X Yang and F Du (2007) Trichostatin A Improved the Quality of Rabbit Nuclear Transfer Embryos. Reprod Fertil Dev. 19: 165. 192. Yang CX, Han ZM, Wen DC, Sun QY, Zhang KY, Zhang LS, Wu YQ, Kou ZH and Chen DY. (2003) In vitro development and mitochondrial fate of macaca-rabbit cloned embryos. Mol Reprod Dev 65: 396–401. 193. Yang, F., Hao. R., Kessler, B., Brem, G., Wolf, E. and Zakhartchenko, V. (2007) Rabbit somatic cell cloning: effects of donor cell type, histone acetylation status and chimeric embryo complementation. Reproduction. 133(1):219-230 194. Yang, X. Z. and Foote, R. H. (1987) Production of identical twin rabbits by micromanipulation of embryos. Biol. Reprod. 37: 1007-1014. 195. Yang, X. Z. and Foote, R. H. (1990a) Survival of bisected rabbit morulae transferred to synchronous and asynchronous recipients. Mol. Reprod. Dev. 26: 6-11. 196. Yang, X., Zhang, L., Kovacs, A., Tobback, C., and Foote, R. H. (1990b) Potential of hypertonic medium treatment for embryo micromanipulation: II. Assessment of nuclear transplantation methodology, isolation, subzona insertion, and electrofusion of blastomeres to intact or functionally enucleated oocytes in rabbits. Mol. Reprod. Dev. 27: 118-129. 197. Yang, X., Jiang, S., Kovacs, A., and Foote, R. H. (1992) Nuclear totipotency of cultured rabbit morulae to support full-term development following nuclear transfer. Biol. Reprod. 47: 636-643. 198. Yin, X. J., Tani, T., Kato, Y., and Tsunoda, Y. (2000) Development of rabbit 90

MELLÉKLETEK

parthenogenetic oocytes and nuclear-transferred oocytes receiving cultured cumulus cells. Theriogenology 54: 1469-1476. 199. Yin, X.J., Kato, Y. and Tsunoda, Y., (2002a) Effect of enucleation procedures and maturation conditions on the development of nuclear-transferred rabbit oocytes receiving male fibroblast cells. Reproduction 124(1):41-47 200. Yin, X.J., Kato, Y. and Tsunoda, Y. (2002b) Effect of delayed enucleation on the developmental potential of nuclear-transferred oocytes receiving adult and fetal fibroblast cells. Zygote 10(3):217-222. 201. Yoshimura Y, Hosoi Y, Iritani A, Nakamura Y, Atlas SJ and Wallach EE (1989) Developmental potential of rabbit oocyte matured in vitro: the possible contribution of prolactin. Biology of Reproduction 41: 26-33 202. Zakhartchenko, V., Alberio, R., Stojkovic, M., Prelle, K., Schernthaner, W., Stojkovic, P., Wenigerkind, H., Wanke, R., Duchler, M., Steinborn, R., Mueller, M., Brem, G. and Wolf, E. (1999) Adult cloning in cattle: Potential of nuclei from a permanent cell line and from primary cultures. Mol. Reprod. Dev. 54: 264-272. 203. Zakhartchenko V, Flisikowska T, Li S, Richter T, Wieland H, Durkovic M, Rottmann O, Kessler B, Gungor T, Brem G, Kind A, Wolf E, Schnieke A. (2011) Cell-mediated transgenesis in rabbits: chimeric and nuclear transfer animals. Biol Reprod.;84(2):22937. 204. Zeng SM, Zhu SE, Wang YS, Chen XJ, Zhang ZC, Chen YF(1999) An efficient method for in vitro fertilization in rabbits. Anim Biotechnol. 1999;10(1-2):15-23. 205. Zhou Q, Renard JP, Le Friec G, Brochard V, Beaujean N, Cherifi Y, Fraichard A, Cozzi J (2003) Generation of fertile cloned rats by regulating oocyte activation. Science 302:1179. 206. Zou X, Chen Y, Wang Y, Luo J, Zhang Q, Zhang X, Yang Y, Ju H, Shen Y, Lao W, Xu S, Du M. (2001) Production of cloned goats from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei or fused with cumulus cells. Cloning; 3:31–37.

91

MELLÉKLETEK

9.3. PUBLIKÁCIÓS LISTA

9.3.1. A disszertáció témájához kapcsolódó publikációk 9.3.1.1. Könyv fejezet Louis-Marie Houdebine and Jianglin Fan (2009) Rabbit Biotechnology: Rabbit Genomics, Transgenesis, Cloning and Models; Chapter 9, Rabbit Cloning: Dinnyes A., Polgar Z., and Meng Q.; Springer Dordrecht Heidelberg London New York; ISBN 978-90-481-2226-4 eISBN 978-90-481-2227-1 9.3.1.2. Nemzetközi lektorált szaklapokban megjelent közlemények Dinnyes A, Meng Q, Polgar Z, Boonkusol D, Somfai T: (2006) Cryopreservation of mammalian embryos. Acta Scientiae Veterinariae.. 34 (Suppl 1): 171-190 Polgar Z. and Dinnyes A. (2008) Transfert nucléaire et cellules souches embryonnaires chez le lapin Biofutur 27/287 pp: 32-35. (IF:0.026) Meng Q., Polgar Z, Jun L, Dinnyes A. (2009) Live Birth of Somatic Cell-Cloned Rabbits following Trichostatin A Treatment and Cotransfer of Parthenogenetic Embryos. Cloning and Stem Cells, 11(1): 203-208 (IF:2.692) 9.3.1.3. Nemzetközi impakt faktoros konferencia kiadványokban megjelenet absztraktok Polgar Z., Somfai T., Angeli V., Dinnyes A. (2006) Effect of different factors on in vitro maturation of rabbit oocytes. Reproduction in Domestical Animals, 41(4):306 (IF.: 1.503) ESDAR oral presentation Polgar Z., TSomfai., Angeli V., Tang XH., Ji W. and Dinnyes A. (2007) Effects of FCS, growth factor and hormone supplementation during in vitro maturation on Parthenogenetic activation and embryo development of follicular rabbit oocytes. Reprod Fertil Dev 19(1): 290-291 (IF.:2.805) IETS poster

92

MELLÉKLETEK

Meng Q., Polgar Z., Liu J., and Dinnyes A. (2008) Effect of Trichostatine A treatment on the term development of somatic cell nuclear transfer rabbit embryos Reprod. Fertil. Dev. 20(1) 103(IF.: 2.439) IETS poster Varga E; Polgar Z; Bodo S and Dinnyes A (2008) Increase of fertilization with frozen semen in laser-assisted rabbit IVF. Reproduction in Domestical Animals: 43: 138-139 Suppl. 3, (IF.:1.526) ICAR poster Polgar Z., Boonkusol D., Varga E. and Dinnyes A. (2010) In vitro development of vitrified in vivo and in vitro fertilized pronuclear-stage rabbit embryos Reproduction in Domestical Animals 45:69 Sup3.(IF.:1.606) ESDAR poster 9.3.1.4. Nemzetközi konferencia kiadványokban megjelent absztraktok, poszterek, előadások Polgar Z., Somfai T., Angeli V., Dinnyes A. (2006) Effect of different factors on in vitro maturation of rabbit oocytes. 13. Szaporodásbiológiai Találkozó, Budapest oral presentation Polgar Z. and Dinnyes A. (2011) Nuclear transfer technology in rabbits. Abstract book 49 p. 4th International Rabbit Biotechnology Meeting, oral presentation 9.3.1.4. Hazai lektorált szaklapokban megjelent közlemények Varga, E., Polgar, Z., Bodo, S. és Dinnyes, A. (2009) Lézer asszisztált in vitro fertilizáció fagyasztott spermával nyúl modellben. Magyar Állatorvosok Lapja 131évf 2009/9, 562-565 (IF:0,642) 9.3.1.5. Hazai konferencia kiadványokban megjelent absztraktok, poszterek, előadások Polgar Z., Somfai T., Angeli V., Dinnyes A (2006) Nyúl petesejtek in vitro maturáltatása. XII Ifjúsági Tudományos Fórum, Pannon Egyetem Georgikon Mezőgazdaságtudományi Kar, Keszthely 2006. április 20. előadás (CD kiadvány) Polgar Z., Somfai T., Angeli V., Dinnyes A (2006) Nyúl petesejtek in vitro maturációja.18. Nyúltenyésztési Tudományos Nap, Kaposvár, előadás 2006. május 24 (kiadvány 97-100. oldal)

93

MELLÉKLETEK

Polgár Z., Somfai T., Varga E.,. Savolainen K., Angeli V., Aladzsity I., és. Dinnyés A. (2007) Különböző maturációs környezet hatása nyúl petesejtek érési dinamikájára. VII. Magyar Genetikai Kongresszus, XIV. Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok, poszter Varga E, Polgár Z, Bodó S. és Dinnyés A. (2009) Lézer asszisztált in vitro fertilizáció fagyasztott spermával nyúl modellben 15. Szaporodásbiológiai Találkozó, előadás

9.3.2. Nem a disszertáció témájához kapcsolódó publikációk 9.3.2.1. Nemzetközi lektorált szaklapokban megjelent közlemények Mamo S, Bodo S, Kobolak J., Polgar Z, Tolgyesi G, Dinnyes A. (2006) Gene expression profiles of vitrified in vivo derived 8-cell stage mouse embryos detected by high density oligonucleotide microarrays. Molecular Reproduction and Development Volume 73(11): 1380-1392(IF: 2.379)

Mamo S, Baji Gal A., Polgar Z and Dinnyes A (2008) Expression profiles of POU5F1 and validation of reference genes in rabbit oocytes and preimplantation stage embryos. BMC Molecular Biology 9:67 (IF:2.81) Svarcova O., Dinnyes A., Polgar Z., Bodo S., Adorjan M., Meng Q. and Maddox-Hyttel P. (2009) Nucleolar re-activation is delayed in mouse embryos cloned from two different cell lines Molecular Reproduction and Development 76(2):132-41.(IF:2.041)

Kobolak J, Kiss K, Polgar Z, Mamo S, Rogel-Gaillard C, Tancos Z, Bock I, Baji Gal A, Tar K, Pirity MK and Dinnyes A. (2009) Promoter analysis of the rabbit POU5F1 gene and its expression in preimplantation stage embryos. BMC Molecular Biology 10:88 (IF:2.848) Bock I, Losonczi E, Mamo S, Polgar Z, Harnos A, Dinnyes A and Pribenszky C (2010) Stress tolerance and transcriptional response in mouse embryos treated with high hydrostatic pressure to enhance cryotolerance CryoLetters 31(5) 401-412 (IF:1,121) 94

MELLÉKLETEK

9.3.2.2. Nemzetközi impakt faktorosos konferencia kiadványokban megjelenet absztraktok Mamo S., Bodo S., Polgar Z and Dinnyes A. (2005) Gene Expression Profiles Of Vitrified Mouse Embryos Detected By Microarrays., Reprod Fertil Dev 18(1,2): 160 (IF: 1.515) IETS poster Tancos Z., Kobolak J., Baji Gal A., Polgár Z. and Dinnyes, A. (2006): Identification of Oct4 and nanog, the two pluripotency marker genes in rabbit preimplantation stage embryos., Reprod Fertil Dev. 18(2) 240-241 (IF.: 0.920 ) IETS poster Svarcova O., Dinnyes, Z. Polgar A., Bodo S., Adorjan M., Meng Q., Udupa R.,.Wang M. K, and Maddox-Hyttel P. (2008) Genom activation in mouse embryos of different origin, Reprod Fertil Dev 20(1) 109(IF.: 2.439) IETS poster Carstea A. C., Polgar Z. , Kovacs L. and Dinnyes A. (2011) The efficiency of intracytoplasmic sperm injection versus laser-assisted in vitro fertilization with frozen sperm for recovering transgenic C57BL/6 mouse strains. Reprod Fertil Dev 23(1) 240241.(IF2010.:2.553) IETS poster 9.3.2.3.. Nemzetközi konferencia kiadványokban megjelent absztraktok, poszterek, előadások Kobolak J., Horsch M., Schädler S., Balint B.L., Solomon M., Rungsiwiwatt R., Bodo S., Polgar Z., Nagy L., Beckers J. and Dinnyes A. (2007) Gene regulation in mouse ES cell lines derived from nuclear tranfer embryos with different donor cell types. ISSCR poster Svarcova, O., Dinnyes, A., Laurincik, J., Meng, Q., Wang, M.K., Kobolak, J., Polgar, Z., Udupa, R., Madox-Hyttel, P.: Nucleolar development in in vitro produced and nuclear transfer mouse embryo. Abstract Book p. 97, ICFAR poster Moawad AR, Fisher P, Polgar Z, Dinnyes A and Campbell KHS (2008) In vitro fertilisation of ovine oocytes vitrified by Solid Surface Vitrification (SSV) at germinal vesicle stage. Abstract Book p. 63 Society for Reproduction and Fertility Conference Polgar Z, Tar K, Rungarunlert Sa, Muenthaisong S, Bock I, Pirity, MK, Dinnyes A (2009)

95

MELLÉKLETEK

Improved derivation of embryonic stem cell lines from inbred C57BL/6J mouse strain. Abstract book 104 p. ISSCR, poster Dinnyés A., Polgár Z., Pribenszky C., Pirity MK (2010) Improved embryoid body cryopreservation and cardiomyocyte differentiation following high hydrostatic pressure treatment. Abstract book, group A, 7.p The 1st International Congress on Controversies in Cryopreservation of Stem Cells, Reproductive Cells, Tissue and Organs (CRYO) poster Varga, E., Nemes C., Klincumhom N., Polgar Z., Muenthaisong S., Ujhelly O., Pirity MK. and. Dinnyes A (2011). Generation of mouse induced pluripotent stem cells from different genetic backgrounds by excisable lentiviral system. Abstract book 190 p., ISSCR poster. Nemes C., Varga, E., Polgar, Z., Klincumhom, N., Pirity, M. K., Dinnyes, A. (2011) Generation of mouse induced pluripotent stem cells by protein transduction. Abstract book 181 p., ISSCR poster Dinnyes, A., Ujhelly O., Nemes C., Muenthaisong S., Rungarunlert S., Klincumhom N., Varga E., Polgar Z. and Pirity M. (2010). Pluripotent stem cells for drug testing and regenerative medicine. Proceedings of the Advances in Medical Biotechnology Conference, Pécs, Hungary, oral presentation 9.3.2.4. Hazai lektorált szaklapokban megjelent közlemények Polgár Z., Bodó S., Kobolák J., Mamo S., Táncos Z., Tóth S., Görhöny B., Dinnyés A. (2006) Egér kiméra utódok létrehozása injektált és mélyhűtött blasztocisztákból. Állattenyésztés és takarmányozás (2006. 55.5. 493-499.o) 9.3.2.5. Hazai konferencia kiadványokban megjelent absztraktok, poszterek, előadások Polgár Z., Bodó S., Kobolák J., Mamo S., Táncos Z., Tóth S., Görhöny B., Dinnyés A. (2005) Egér kiméra utódok létrehozása injektált és mélyhűtött blasztocisztákból. 12. Szaporodásbiológiai Találkozó, Hajdúszoboszló, (kiadvány 28. oldal) 2005. november 5. előadás

96

MELLÉKLETEK

Táncos Z, Kobolák J., Baji Gál Á., Polgár Z., Dinnyés A. (2005) Az oct-4 és nanog transzkripciós faktor gének azonosítása preimplantációs korú nyúl embriókban. 12. Szaporodásbiológiai Találkozó, Hajdúszoboszló, (kiadvány 34. oldal) PolgárZ, Tar K, Rungarunlert S, Muenthaisong S, Bock I, Pirity M and Dinnyés A.(2009) Generation of new C57Bl/6J mouse embryonic stem cell lines IX. Magyar Genetikai Kongresszus, XVI. Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok, poszter István Bock, Eszter Losonczi, Solomon Mamo, Zsuzsanna Polgár, András Dinnyés, Andrea Harnos and Csaba Pribenszky(2009) Transcriptional response and stress tolerance in high hydrostatic pressure treated mouse embryos IX. Magyar Genetikai Kongresszus, XVI. Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok, poszter Muenthaisong, S., O. Ujhelly, E. Varga, Z. Polgar, A. C. Carstea, Z. Ivics, M. Pirity and A. Dinnyes (2011). Induction of pluripotent stem (ips) cells by Sleeping Beauty Transposon mediated gene transfer. 3rd conference on "A Focus On Stem Cells", Debrecen. poster

97

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS A dolgozatom elkészítéséhez szükséges kísérleteket a Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont Mikromanipulációs és Genetikai Újraprogramozási csoportjában végeztem. Köszönöm Dr. Nagy Ferencnek az MBK volt igazgatójának, hogy lehetővé tette a dolgozatom elkészítését. Köszönettel tartozom témavezetőmnek Dr. Dinnyés Andrásnak a hosszúra nyúlt munkám során nyújtott folyamatos és nélkülözhetetlen támogatásáért. Szeretnék köszönetet mondani az Olívia Kft vezérigazatójának, Meinrad Odermatt úrnak és Kerepeczki Zoltán beszerzési vezetőnek hogy vizsgálataimhoz biztosították a nyúlpetefészkeket. Nagy köszönettel tartozom Dr. Somfai Tamásnak és Dr. Bodrogi Lillának a kezdetekkor nyújtott segítségekért. Hálával tartozom Dr. Qinggang Meng, Dr. Jun Liu és Dr. Xianghui Tang a klónozási kísérletekben nyújtott áldozatos munkájukért. Szeretném megköszönni Dr Duang Jai Boonkusol segítségét a krioprezervációs kísérletekben, valamint Angeli Vivien, Varga Eszter és Kaisa Savolainen munkáját az in vitro petesejt érleltetés során. Külön köszönetet szeretnék mondani Dr. Bősze Zsuzsannának a kezdeti embrió beültetéseknél nyújtott segítségéért. Szeretném továbbá megköszönni a kutató csoport többi tagjának: Dr. Bodó Szilárdnak, Dr. Kobolák Juliannának, Dr. Solomon Mamonak, Dr. Adorján Mártának, Kungl Györgyinek, Serbana Getanak, Marótiné Nardai Dorottyának és Marinka Balázsnak munkám során nyújtott segítségüket. Köszönöm az MBK munkatársainak, Dr. Bucsy László állatorvosnak, Lengyel Lászlóné, Basa Judit és Fülöp László állatgondozóknak a kísérleteim során használt állatok gondozásában nyújtott segítségüket. Köszönöm Dr. Fehér Anitának, hogy segített a dolgozatom összeállításában és átnézésében. Külön köszönettel tartozom szüleimnek és családomnak, akik végig mellettem álltak és bíztak abban, hogy eljutok idáig. Munkám anyagi fedezetét a Teamoholic (MEXT-2003-509582), MED-RAT (LSHGCT-2006-518240),

CLONET

(MRTN-CT-2006-035468),

Wellcome

Trust

(Grant

No.070246), Kínai-Magyar Bilaterális Project (TET CHN-28/04, CHN-41/05) RabPStem (PERG07-GA-2010-268422) pályázatok biztosították.

98

NYÚLEMBRIÓK ELŐÁLLÍTÁSA IN VITRO ÉS MIKROMANIPULÁCIÓS

Recommend Documents